ウイルス発癌蛋白質と細胞蛋白質PDZド メインとの結合 パピローマ

ウイルス発癌蛋白質と細胞蛋白質PDZド メインとの結合
パピローマウイルスE6蛋 白質の新しい機能を中心に
平岩厚郎 ・石橋正英
ヒトパピローマウイルス(human
papilloma virus;HPV)は 現在70種 以上の型が知
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られているが,そ のなかでも16型などのある特定の型のみがヒトの子宮頸癌などのいくつ
かの癌の発症に深くかかわっていることが,疫 学的 ・分子生物学的研究から明らかになっ
てきた。HPVの 遺伝子群のなかでも発癌性を担うE6遺 伝子とその産物であるE6蛋 白質に
注目して筆者らは研究を続けてきたが,E6の 細胞側標的候補として従来知られているp53
蛋白質以外の新たな蛋白質を筆者らは最近同定している。本稿では,そのなかでもPDZド
メインをもつ候補について詳述した。
【HPV】
【E6】 【hDLZ】
【PDZド
は じめ に
ヒ トパ ピ ロー マ ウ イル ス の な か で も16型
どの 約20種
類 の ウ イ ル ス は,子 宮 頸 癌 な どの 要 因 で あ
る こ とが 知 られ,そ
の 初 期 遺 伝 子 産 物 で あ るE6お
な
う トラ ン ス フ ォー ム す る こ とが 報 じ られ て い た が,実
は これ らのE6の
端 の ア ミノ酸 配 列 モ チー フ
を必 須 と す る こ とが 明 ら か に な っ た 。 この こ とは,E6
よび
のC末
白 質 が 宿 主 細 胞 の 癌 抑 制 遺 伝 子 産 物p53お
Rb蛋
白 質 の そ れ ぞ れ の機 能 を阻 害 す る こ とで,宿 主 細
端 の ア ミノ 酸 配 列 モ チ ー フ を介 した 反 応 が 発 癌
に も関 与 して い る こ と を強 く示 唆 して い る。 また,E6
胞 の 癌 化 に 関 与 し て い る こ と に疑 い の 余 地 が ほ と ん ど
白 質 がp53機
活 性 はC末
よび
E7蛋
な い。 し か し,E6蛋
メ イ ン】 【Tax】
蛋 白 質 の 場 合 と同 じ よ うに,Tax蛋
能 を 阻 害 す る機 構 と
白 血 病 ウ イ ル ス1型
白質(ヒ
トT細
胞
の 発 癌 蛋 白質)や,E40RF1蛋
白
は別 機 構 を 介 して も細 胞 の 癌 化 に関 与 し て い る可 能 性
質(げ
っ 歯 類 に実 験 的 に 乳 癌 を誘 導 す る ア デ ノ ウ イ ル
に注 目 した 研 究 も続 け られ て きた。 そ して,最
ス9型
の発 癌 蛋 白質)のC末
蛋 白質 が そ のC末
端 に大 腸 癌 関 連 のAPC蛋
近,E6
モ チ ー フ が 存 在 し,同
白質 な ど と
端 に もE6蛋
白 質 と同 様 の
じ よ うな 実 験 結 果 が 報 じ ら れ て
同 様 の ア ミノ酸 配 列 モ チ ー フ を保 ち,こ れ を介 して,シ
い る。 こ の よ うな 状 況 か ら判 断 す る と,こ の モ チ ー フ
ョウ ジ ョウバ エ 癌 抑 制 蛋 白質 の ヒ トホモロ グであ るhDLG
を介 した 反 応 は,ウ
蛋 白 質 な どのPDZド
の発 生 に際 しての細胞 蛋 白質 問の反 応 に も関与 してい
メ イ ン と結 合 す る こ とが 明 らか に
され た 。E6蛋
白 質 が げ っ歯 類 繊 維 芽 細 胞 由来 の株 化 培
養 細 胞 を,培
養 器 中 で形 態 的 に トラ ンス フ ォ ー ム した
る可 能 性(た
イ ル ス を 要 因 と し な い他 の ヒ ト癌
とえ ば大 腸 癌)も
あ り,広
く ヒ ト癌 の 発
生 機 構 の解 明 に も新 た な視 点 を加 え る もの と思 わ れ る。
り,ヌ ー ドマ ウ ス に 接 種 し た場 合 に腫 瘍 を 形 成 す る よ
Atsuro
versity
Hiraiwa,名
School
Masahide
Research
Binding
古 屋 大 学 医 学 部 皮 膚 科(〒466-8550
Ishibashi,(財)阪
Foundation
of
名 古 屋 市 昭 和 区 鶴 舞 町65）[Department
of Medicine,Tsuruma-cho,Shouwa-ku,Nagoya
Viral
for
Oncogenic
大 微 生 物 病 研 究 会 観 音 寺 研 究 所(〒768-0061香
Microbial
Proteins
PDZ
Dermatology,Nagoya
川 県 観 音 寺 市 八 幡 町2-9-41)[Kannonji
Diseases,Hachiman-cho,Kannonji,Kagawa
and
of
Uni-
466-8550,Japan]
Domains
of
Cellular
Institute,The
768-0061,Japan]
Proteins
237
36
蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.43
No.3(1998)
頸 癌 な どの い くつ か の ヒ ト癌 か ら高 率 に 検 出 さ れ,1
1.HPVに
ついて
れ らの 癌 の 発 症 に深 くか か わ っ て い る こ と が ほ ぼ 疑い
の 余 地 の な い もの とな っ た3・4)。
本 稿 で は,こ
1.HPVと
は
HPVの
病 変 か ら検 出 さ れ るHPVの
う ち,皮
膚 や 粘 膜 の い ぼ を誘 発 す る もの は 古
わ りが 深 いHPV-16に
れ ら悪性
な か で も子 宮 頸 癌 との かか
つ い て 詳 述 す る。
くか ら知 られ て お り,パ ポ ー バ 科 のパ ピロー マ 属 の1グ
ル ー プ と して 分 類 さ れ て い る。 そ して,ウ
イル ス ゲ ノ
ム として,約8,000塩
鎖DNAを
基 対 よ りなる環 状2本
有 し て い る1)。HPVは
底 細 胞 に感 染 して,基
トの 上 皮 基
底 細 胞 の 過 剰 な 増 殖 を促 しつ つ,
ウ イ ル ス ゲ ノ ム は一 連 の 初 期 遺 伝 子 群(E1,
E2,E4,E6,E7蛋
白 質 な ど の構 造 遺 伝 子)と
伝 子 群(L1,L2蛋
が,以
白 質 の 構 造 遺 伝 子)を
下 の ① ∼ ③ な どか らHPVに
後期 遺
担っている
よ る 発 癌 に関 係 し
て い る の はE6とE7の2つ
の 遺 伝 子 で あ る と考 え られ
持 す る よ う に 増 や し て い る と推 定 さ れ て い る。 そ し て,
て い る5)。①HPVDNAが
子 宮 頸 癌 な どか ら検 出 され
分 化 した 上 皮 細 胞 で の み大 量 の ウイ ルス のRNA,蛋
る場 合 に は そ の 全DNAで
は な く,E6やE7な
自身 のDNAを
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よ る 培 養 細 胞 の トラ ン ス フ ォー メ ー シ ョ ン
HPVの
ほ か の パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス と同
様 に 種 特 異 性 お よ び臓 器 特 異 性 が 高 く,ヒ
2.HPVに
質,DNAの
も基 底 細 胞 あ た り約100分
子 程度 に維
白
合 成 が 行 な わ れ て 子 孫 とな る ウイ ル ス粒 子
どの 一
部 の初 期 遺 伝 子 のみ が宿 主 細 胞DNAに
組 み 込 まれた 形
が 大 量 に 形 成 され る。 培 養 器 内 で上 皮 細 胞 を分 化 させ
で み つ か る場 合 が か な りあ る が,E6お
よびE7遺
る こ と は通 常 の 培 養 技 術 で は 不 可 能 で あ る た め,培
が 欠 損 した 例 は認 め られな い こ と。 ② 研 究 初 期 にHPV-
養
伝子
器 内 で は ウ イ ル ス を増 や す こ と は 実 用 レベ ル で は不 可
16の 各 遺 伝 子 を マ ウ ス の培 養 細 胞 に導 入 して その トラ
能 で あ る。 し た が っ て,い
ン ス フ ォー ム 活 性*1を 比 較 検 討 した と こ ろ,E6お
わ ゆ る中和抗 体 を用 いた ウ
イ ル ス の 血 清 型 分 類 が 実 際 的 に は不 可 能 で あ る。 そ こ
で,こ
れ に 代 わ っ て,大 腸 菌 な ど で 増 や し ク ロ ー ン 化
した ウ イ ル スDNAの
相 同 性 を も とに型 分 け が行 な わ れ
て い る 。 そ れ に よ る と,同
ぼ(尋
常 性疣 贅)か
どが,扁
が,ま
平 な い ぼ(扁
じ い ぼ で も皮 膚 の普 通 の い
らはHPV-3,10な
た 粘 膜 の い ぼ(尖 圭 コ ンジ ロー ム)か
6,11が
伝 子 の み に トラ ン ス フ ォ ー ム 活 性 が 認 め られ た こ
と。 ③HPVDNAが
組 み 込 まれ て い る子 宮 頸 癌 由 来 培
養 細 胞 株 にE6やE7の
ア ン チ セ ン スRNAを
る と,癌 由 来 細 胞 と して の 特 性(足
や ヌ ー ドマ ウ ス で の 造 腫 瘍 性)を
ら は2型(HPV-2)やHPV-4な
平疣 贅)か
E7遺
ど
ら はHPV-
検 出 さ れ るな ど,ウ イル ス の 型 とそ の ウ イル ス
よび
そ し て,両
結 果,次
発 現 させ
場 非依 存性 増 殖能
失 う こ と。
遺伝 子 につ いて の さま ざ まな機能 解析 の
の よ う な こ とが わ か っ て き た 。
①E6かE7遺
伝 子の いずれか をげっ歯類 由来の培 養
が 検 出 さ れ る病 変 との 間 に は 強 い 相 関 が 認 め られ る2)。
細 胞 に 導 入 して 発 現 さ せ て も,細 胞 は形 態 変 化,足
組 換 えDNA技
非 依 存 性 増 殖,あ
術 が樹 立 さ れ る 以 前,電
子顕微 鏡 を用
い た 検 索 で は ヒ トの 癌 組 織 に は ウ イ ル ス 粒 子 が 認 め ら
れ な い こ とか らHPVと
た が,の
癌 との か か わ りは 否 定 的 で あ っ
ち にHPV-16,18と
名 づ け られ るHPVDNA
の 一 部 が 子 宮 頸 癌 か ら検 出 さ れ た こ と か ら,改
HPVと
ヒ ト癌 と の か か わ りが 注 目 され た3)。 さ らに 広
範 な分 子 疫 学 的 研 究 の 結 果,現
類 さ れ て い るHPVの
在 で は70種
な か で も,ゲ ノ ムDNA上
配 列 の 点 で類 似 性 が 高 い一 群 のHPVの
*1一
般 的 に は,あ
類 以上 に分
の塩 基
みが ヒ トの 子 宮
る 因子 を細 胞 に入 れ る こ とで,そ
る い は ヌ ー ドマ ウ ス で の 造 腫 瘍 性 を
獲 得 す るな どの ト ラ ン ス フ ォー ム 活 性 を 示 す 。
②E6やE7の
はE6とE7が
めて
場
各 々 が 単 独 に,あ
一 緒 に,あ
るいは細胞 によって
る い はRasな
どの ほか の 発 癌
遺 伝 子 産 物 と一 緒 に 発 現 した 場 合,げ
っ 歯 類 や ヒ ト由
来 の初 代 培 養 細 胞 は 不 死 化 す る。
③ ①,②
で 述 べ た 実 験 系 の な か の い くつ か で は,同
様 の変 化 がE6の
代 わ り に変 異 型p53蛋
p53が 既 存 の 野 生 型p53蛋
白 質(変
異型
白 質 と重 合 して 不 活 化 す る,
の 細 胞 の 形 質 の一 部 に 一定 の 変 化 を 与 え る場 合,そ
の因 子 に は トラ ンス フ ォー ム
活 性 が あ る とい う。 し か し,腫 瘍 ウ イ ル ス 学 の 領 域 で は もっ ぱ ら細 胞 の増 殖 様 式 を 左 右 す る活性 を指 す。 た とえ ば,本 来 シ ャー レ
内 で培 養 す る と単 層 で しか 増 殖 で き な い3Y1細
胞(ラ ッ ト繊 維 芽 細 胞 株)にHPV-16E6遺
増 殖 し,渦 巻 き状 の細 胞 配 列 を呈 す る よ うに トラ ン ス フ ォ ー ム す る。 ま た,ア
とでCREF細
胞(ラ
ッ ト培 養 細 胞 株)は 重 層 して 増 殖 し一 部 が 盛 りあが る(フ
増 殖 して コ ロニ ー を形 成 す る(足 場 非 依 存 性 増 殖)。
238
伝 子 を導 入 す る こ とで細 胞 は重 層 して
デ ノ ウ イル ス9型E4遺
伝 子 のORF1を
導入す るこ
ォー カ ス 形 成)。 こ の細 胞 は軟 寒 天 培 地 内 で も分 裂
ウイルス発癌蛋白質と細胞蛋 白質PDZド メイ ンとの結合
37
す な わ ち ド ミナ ン トネ ガ テ ィ ブ に働 く)を 発 現 さ せ る
こ とで も認 め られ る。 また,E6蛋
そ れ ぞれp53蛋
白 質 やRbフ
白 質 やE7蛋
白質 が
II.PDZド
た め に 必 須 の 部 位 に 変 異 を加 え る と,実 験 系 に よ っ て
PDZド
∼100ア
は トラ ン ス フ ォ ー ム活 性 が減 少 あ る い は 消 失 す る。
④E6蛋
白 質 がp53蛋
白 質 と結 合 す る と,p53蛋
メ イ ン はG-L-G-Fの
ア ミノ 酸 配 列 を 含 む80
ミ ノ酸 配 列 か ら な り(図2A参
照) ,一 種 の 窪
み を蛋 白質 分 子 内 に形 成 す る。 そ して,C末
白質
端 にX-S/
は ユ ビ キ チ ン依 存 性 の 分 解 系 で 処 理 され る。 ま た,E7
T-X-Vの
蛋 白 質 はRbフ
末 端 が こ れ に挿 入 さ れ る よ う に結 合 す る こ とがX線
ァ ミ リー 蛋 白質 と結 合 す る こ とでRbフ
ァ ミ リ ー 蛋 白 質 とE2Fフ
ァ ミ リー 蛋 白質 な ど との 結 合
95(mammalian
こ れ ら ① ∼ ④ の研 究 成 果 の集 積 か ら,E6お
よ びE7
蛋 白質 は そ れ ぞ れ 癌 抑 制 遺 伝 子 産 物 で あ るp53お
Rb蛋
ア ミノ酸 配 列 モ チ ー フ を もつ 別 の 蛋 白質 のC
postsynaptic
(Drosophila
density protein),DLG
discs large tumor
ZO-1(mammalian
よび
白 質 の 機 能 をin vivoで 阻 害 す る こ とで 子 宮 頸 癌
suppressor
tight junction
め られ る こ とか ら,こ れ ら の3種
の 発 症 に 関 与 し て い る と考 え られ る に 至 っ た5)。
初 の 英 文 字 を つ な げ てPDZド
くつ か の 系 で
ち な み に,DLG蛋
は これ らの トラ ンス フ ォー ム 活 性 がE6の
か わ りに ド ミ
の 上 皮 細 胞 のseptatejunction(動
な い 例6)や,す
で に正 常 なp53の
胞 系7)で もE6を
導 入 し て も認 め られ
に相 当)に
機 能 が 失 わ れ て い る細
ら れ て い る 。 ま た,DLGの
PDZド
p53蛋
coli gene product)のC末
白 質 分 解 に必 要 なE6蛋
白 質 の部 位 に変 異 を加 え
白質 を発 現 させ て も細 胞 の不 死 化 にか か わ るテ
そ こで,筆
者 らはp53蛋
白 質 以 外 に もE6蛋
癌 抑 制 蛋 白 質 と考 え
ヒ トホ モ ロ グ(hDLG)の
白 質(adenomatous
polyposis
端 が 結 合 す る こ とか ら,APC
白質 との 結 合 の 障 害 が ヒ ト大 腸 癌 の
発 癌 機 構 に 関 与 す る可 能 性 も想 定 さ れ て い る13)。
母
Ⅲ
.E6とPDZド
メイ ン
どの 方 法 を用 いて この細 胞 側 標 的 を
1.E6とhDLGと
検 索 し た と こ ろ,数 種 の 未 知 の 遺 伝 子 を 候 補 と し て ク
ロ ー ニ ン グ す る こ とが で き た11)。そ の ひ とつ に,PDZ
ドメ イ ンを もっ 蛋 白質 が あ り,わ れ わ れ はE6蛋
PDZド
物 細 胞 の タ イ ト結 合
白 質 の細
胞 側 標 的 蛋 白質 が 存 在 す る 可 能 性 が 高 い と考 え,酵
two-hybrid法*3な
メ イ ンにAPC蛋
蛋 白質 とhDLG蛋
ロ メ ラ ー ゼ 活 性*2が 新 た に 誘 導 され る例10)も あ る。
どで認
存 在 し,そ れ に 変 異 が 起 こ る と上 皮 細 胞 が
転 写 活 性 の 促 進9)な ど の 生 物 活 性 が 認 め られ る 例 や,
たE6蛋
protein)な
の 蛋 白質 の名称 の最
白質 は シ ョウ ジ ョ ウバ エ の 成 虫 原 基
異 常 増 殖 す る こ とな どか らDLGは
導 入 す る と トラ ンス フ ォー ム 活 性8)や
protein),
メ イ ン と よ ば れ て い る。
しか し,前 述 の 実 験 系 の な か で も,い
ナ ン トネ ガ テ ィ ブ な変 異 型p53を
結
晶 解 析 の 結 果 か ら知 られ てい る12)。この ドメイ ンがPSD-
を 阻 害 す る。
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メイ ンに つ いて
ァ ミリー 蛋 白 質 と結 合 す る
の結 合
前 述 の よ う に 筆 者 らがE6の
白質 と
two-hybrid法
メ イ ン を 有 す る蛋 白 質 との 関 係 に着 目 した 。
にPDZド
細 胞 側 標 的候 補 として
を用 い て ク ロー ニ ン グ した 蛋 白 質 の な か
メ イ ン を も つ も の が あ り,こ の 蛋 白 質 とE6
蛋 白 質 との結 合 が こ のPDZド
メ イ ン を介 し て行 な わ れ
て い る可 能 性 を検 討 し よ う と した。 驚 い た こ とに,種
のHPVのE6蛋
*2真
白 質 のC末
々
端 ア ミ ノ 酸 配 列 を比 較 す
核 細 胞 の 染 色 体 末 端 部 には テロメア反 復 配 列 とよばれ る特 異 な くり返 し配 列 が 存 在 する。 生 殖 細 胞 以 外 の正 常 細 胞 で は染 色 体DNA
が 複 製 す る こ とに テ ロ メ ア反 復 配 列 が 一 定 の長 さず つ 短 くな り,あ
停 止 し て死 を む か え る と考 え られ て い る。 一 方,癌
ア 反 復 配 列 を伸 長 させ(テ
*3E6蛋
ロ メ ラ ーゼ 活 性),そ
る一 定 の長 さ よ りテ ロメ ア反 復 配 列 が短 くな る と細 胞 は分 裂 を
細 胞 や 生 殖 細 胞 で はRNAと
の結 果,テ
蛋 白質 か らな る テ ロ メ ラ ーゼ が 発 現 して,テ
ロメ
ロ メ ア 反 復 配 列 が あ る長 さ以 下 に な ら な い ら しい 。
白質 に結 合 す る ヒ ト細 胞 な ど標 的 蛋 白 質 を検 索 す る場 合 を例 に とる。 酵 母 菌 の特 定 の 転 写 活 性 化 蛋 白質 をDNA結
合 ドメ イ ン
と転 写 因 子 結 合 ドメ イ ン に分 割 し て,前 者 とE6蛋 白 質 との 雑 種(hybrid)蛋
白 質 をつ く る。 次 い で,後 者 と ヒ ト細 胞 の 蛋 白質 の
一 つ(Xと
よぶ)と の 間 で 第2の 雑 種 蛋 白質 を つ くる。2つ の雑 種 蛋 白質 は各 々 独 立 で は元 の 転 写 活 性 化 能 を示 さ な い が,XがE6
と結 合 で き る 蛋 白質 で あ る と き の み,共 存 させ る と,元
の転 写 活 性 化 能 を回 復 す る。 転 写 活 性 化 の 結 果 は,酵 母 菌 の 糖 分 解 酵 素 や
ア ミノ 酸 合 成 酵 素 の上 昇 な どの 形 質 と して 捉 え る。 実 際 に は 酵 母 菌 内 で こ の よ う な状 況 が 起 こ る よ うに遺 伝 子 レベ ル で操 作 を行 な
う。Xと
っ た,多
して は ヒ ト細 胞 のcDNAラ
イ ブ ラ リー が 用 い られ,数
万 以 上 の 候 補 蛋 白質 の検 索 が 酵 母 菌 の ア ミノ 酸 要 求 性 の 解 消 と い
数 の 候 補 を簡 便 に 選 択 で きる 方 法 で 代 行 さ れ る こ と とな る。
239
38
蛋 白質 核 酸 酵 素 図1粘
C末
膜 の 悪 性 型HPVに
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白質
チーフ
白 質 の構 造 を模 式 図 で 示 した。 各 数 字 はア ミノ 酸
配 列 の位 置 番 号 を,ZF1お
め られ るZnフ
16のE6蛋
No.3(1998)
お い て 保 存 さ れ て い るE6蛋
端 のX-S/T-X-V/Lモ
HPV-16のE6蛋
Vo1.43
よ びZF2はE6蛋
白質 のな か に2カ 所 認
ィ ンガ ー ドメ イ ン構 造 の 位 置 を示 して い る。HPV-
白 質 を も と に種 々のHPVのE6蛋
の 相 同 性 を 比 較 検 討 し,そ のC末
白 質 の ア ミノ酸 配 列
端 部 分 を表 示 した 。 下 線 部 は 実
験 に用 い た ポ リペ プ チ ドの ア ミノ 酸 配 列 を,ま た 各 ア ミノ 酸 配 列
の 左 端 の数 字 は そ れ ぞ れ のHPVの
型 番 号 を示 して い る。(文 献14
図2hDLG蛋
白 質 の な か でHPV-16のE6蛋
白質 との 結 合
に必須 な 部位 の 特 定
(A)hDLG蛋
白質 と そ の種 々 の部 位 を欠 損 さ せ た変 異 蛋 白質 の 構
造 を模 式 図 で 示 し た。R1,R2,R3はPDZド
と相 同 性 をも つ部 位,GKは
位 であ る。(B)大
メ イ ン,SH3はSrc
グ アニ ル 酸 キ ナ ー ゼ と相 同 性 をもつ 部
腸 菌 で グル タチ オ ンS-ト ラ ンス フェラ ーゼ(GST)
と の融 合 蛋 白 質 と して作 製 した一 部 ドメ イ ン欠 損hDLG蛋
よ り転 載)
白 質 と,
無 細胞 系 でア イ ソ トー プ標 識 し合 成 したHPV-16のE6蛋
る と,HPV-16を
知 の17種
は じ め,粘 膜 型 の 悪 性 型 に属 す る既
類 のHPVのE6蛋
白質 のC末
前 述 の モ チ ー フX-S/T-X-Vと
(X-S/T-X-V/L)を
端 はいずれ も
類 似 の ア ミノ酸 配 列
結 合 能 を示 す 。(C)大
腸 菌 で 麦芽 糖 結 合 蛋 白 質 との 融 合 蛋 白 質 と
して作 製 したHPV-16のE6蛋
白 質 と,無 細 胞 系 で ア イ ソ トープ標
識 し合 成 した一 部 ドメ イ ン 欠 損hDLG蛋
(文 献14よ
白 質 との
白質 との結合能 を示す。
り転 載)
呈 し て い る が,粘 膜 の 良 性 型 に属
す るHPV-11のE6や
皮 膚 癌 に 関 与 す るHPV-5のC
末 端 は類 似 の 配 列 を呈 し て い な か っ た(図1)。
そ こ で,ま
ず,無 細 胞 系 で 合 成 したhDLG蛋
大 腸 菌 で 麦 芽 糖 結 合 蛋 白 質(maltose-binding
と の 融 合 蛋 白 質(fused
のHPVのE6蛋
して作 製 した種 々
白質 との 結 合 性 を試 験 管 内 で 調 べ た 。
そ の結 果,粘
はhDLGに
protein)と
白質 と
protein)
膜 型 の悪 性 型 に属 す るHPV-16,18のE6
結 合 したが,HPV-5やHPV-11のE6は
合 しな か った 。 次 に,hDLGの
結
どの部 分 にE6蛋
白質が
結 合 す る か を明 ら か に す る た め,一 部 の ドメ イ ン を欠
損 し たhDLG蛋
HPV-16のE6蛋
白 質 を 作 製(図2A)し
て,こ
れ と
白 質 との 結 合 性 を 無 細 胞 系 で 調 べ た
(図2B,C)。
結 果 はR2,す
在 す る 中 央 のPDZド
なわ ち,3個
メ イ ンにE6蛋
白質 が結 合 す るこ
とが わ か っ た14)。ち な み に,hDLGがAPC蛋
合 す る場 合 も,R2を
胞 融 解 物 でE6と
く り返 して 存
白質が免 疫 共 沈す る こ
とか ら細 胞 内 で 両 者 が 結 合 す る 可 能 性 も示 さ れ た 。
さ らに,こ れ らの 結 合 の特 異 性 は,HPV-16のE6蛋
白 質 のC末
240
端 の ア ミノ酸 残 基(L)を
白 質 との 結 合 に お け るHPVE6蛋
白 質 のC末
端 の役 割
大 腸 菌 でGSTと
の 融 合 蛋 白 質 と して作 製 したhDLG蛋
細 胞 系 で ア イ ソ トー プ 標 識 し合 成 したHPV-16の
異E6蛋
白質 との 結 合 能 を示 す。(文 献14よ
白 質 と,無
種 々 のC末
端変
り転 載)
白質 に結
介 して 結 合 す る。 さ らに,COS細
サ ル のDLG蛋
図3hDLG蛋
保 存 的 に 変 異(類
似 性 の 高 い ア ミノ 酸,た
と え ばVや1に
も こ の 結 合 に は影 響 が な い が,非
え ば,ア
ミノ酸 残 基 の欠 損,類
置 換)さ せ た 蛋 白質 はhDLG蛋
くな る(図3)こ
置 換)さ せ て
保 存 的 に変 異(た
と
似 性 の低 い ア ミノ酸Pに
白 質 との 結 合 が で き な
とで 確 認 さ れ た14)。 さ ら に,粘
膜 の悪
ウイルス発癌蛋白質と細胞蛋 白質PDZド メイ ンとの結合
39
筋 な どの 分 裂 し な い 細 胞 や 表
皮 の 有 棘 細 胞 の よ う な分 化 し
て い く細 胞 で 盛 ん で,一
方,
表皮 の基 底細 胞 の よ うな分裂
能 を もつ細 胞 で は乏 しい こと16)
か ら,ヒ
トで もDLGは
細胞の
分 裂 増 殖 を抑 制 す る の に何 ら
か の 重 要 な 役 割 を果 た し て い
る も の と 注 目 さ れ る。 こ れ ら
a)3Y1細
て+は
とE6蛋
胞 につ い て+は 線 維 肉 腫 様 の うず ま き型 の 形 態 変 化 を示 した も の 。Psi-2細 胞 につ い
ヌ ー ドマ ウ ス 皮下 へ 注 入 後36日
以 内 に5mm以
白 質 が 結 合 す る ことで
その増 殖抑 制 が解 除 され る と
上 の腫 瘍 を形 成 し た もの 。
n.t.:未 検 定。
した ら,そ の 機 構 を介 してE6
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が 培 養 細 胞 の トラ ン ス フ ォ ー
性 型 に 属 す るHPV-31,33,51,52,58のE6蛋
末 端12ア
白質 のC
ミ ノ 酸 配 列 か ら な る オ リ ゴペ プ チ ド(図1)
を化 学 合 成 して,そ れ ぞれ を,APC蛋
端 でhDLG蛋
白 質 の第2PDZド
メ ー シ ョ ンや 発 癌 に 関 与 し て い る こ とが 十 分 考 え ら れ
る。
白質 が そ のC末
メ イ ン と反 応 す る 系 に
しか し,い
まで はPDZド
メイ ンを有す る蛋 白質が多
種 知 られ て お り,前 述 の3Y1お
よ びPsi-2細
胞 におけ
添 加 す る と,両 蛋 白質 の 結 合 を特 異 的 に 阻 止 す る こ と
る トラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン を含 め て,い
も示 さ れ た14)。
白 質 との か か わ りの み で は 説 明 不 可 能 で あ っ た 種 々 の
ま までp53蛋
2.E6C末
の候 補 はhDLG蛋
トラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン にか か わ るE6蛋
端 と トラ ン ス フ ォ ー メー シ ョン
HPV-16のE6蛋
白 質 を ラ ッ ト3Y1細
胞 で発 現 させ
E6がp53非
白 質 の標 的
白 質 以 外 に も考 え られ る。 た とえ ば,
依 存 性 に も ア ポ トー シ ス を 抑 制 す る こ と17)
る と認 め られ る細 胞 形 態 と配 列 の 仕 方 と を トラ ン ス フ
か ら考 え る と,ア ポ トー シス関 連 蛋 白質PTPbas/FAP-
ォ ー ム す る こ と はp53非
118)も そ の 候 補 の ひ とつ か も しれ な い。 そ こで筆 者 らは
依 存 性 の現 象 で あ る こ と は す
で に示 さ れ て い た7,8)が,こ の 現 象 は前 述 の保 存 的 変 異
現 在,ま
E6蛋
メ ー シ ョ ン にhDLGが
か か わ っ て い る可 能 性 を明 らか
に す る た め に,3Y1お
よ びPsi-2細
白質 で は誘 導 で き るが,非 保 存 的 な変 異 蛋 白 質 で
は誘 導 で きな い こ とか ら,こ の現 象 がE6蛋
白 質 のC末
端 に 依 存 す る現 象 で あ る と結 論 さ れ た14）(表1)。 さ ら
に,HPV-16のE6蛋
白質 をPsi-2細
胞 で発 現 させ る こ
と で細 胞 は ヌ ー ドマ ウ ス で の 造 腫 瘍 性 を獲 得 す る こ と
も知 られ て い た15)が,こ
の 現 象 もE6C末
端 の活 性 に
ず 手 始 め と し て,前
記2種
の トラ ン ス フ ォ ー
胞 に 種 々 のhDLG
変 異 蛋 白質 を導 入 して そ の 変 化 を 検 討 して い る。
一方
,C末
端 にX-S/T-X-Vモ
チ ー フ を有 す る蛋 白
質 とPDZド
メ イ ン を もつ 蛋 白 質 の結 合 能 に は蛋 白質 ご
との 特 異 性 が 認 め ら れ,結
合 効 率 に は 差 が あ る こ とが
依 存 す る 現 象 で あ る こ と を前 述 の 一 連 の 変 異 蛋 白 質 を
明 ら か に な りつ つ あ る19)。した が っ て,E6蛋
用 い た 実 験 で 解 明 した14)(表1)(し
い て も種 々 のPDZド
実 験 で,同E6蛋
か し,同
じよ うな
白質 に よ る ヒ ト乳 腺 上 皮 細 胞 の 不 死 化
誘 導 の 現 象 はC末
端 に は依 存 し な い 現 象 で あ る ら しい
比 較 検 討 す る こ とが 必 要 で あ るが,オ
イ ブ ラ リー を用 い たPDZド
合 能 を広 範 に 比 較 検 討 した 結 果19)は,間
どのE6蛋
蛋 白質 がhDLGを
白 質 はhDLG蛋
白 質 と無 細 胞 系 で 結 合 す る
胞 内 で もhDLGな
どのPDZド
メイ ン
含 め た 限 られ た 蛋 白 質 との み 結 合 す
PDZド
ョ ン を促 し て い る こ とが う か が わ れ る。 さ ら に,最
る限 られ た 蛋 白 質 とE6蛋
DLGの
新 た な ヒ トホ モ ロ グ(NE-dlg)が
され た が,そ
クロー ニ ング
の 蛋 白質 の ヒ ト組 織 で の 発 現 が 神 経 や 心
接 的 なが らE6
る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 こ の こ と か ら,筆
を もつ 蛋 白 質 と結 合 して 細 胞 の トラ ン ス フ ォ ー メ ー シ
近
リゴ ペ プ チ ドラ
メ イ ン を もつ 蛋 白質 との 結
こ とが 示 さ れ た)。 以 上 の よ うな結 果 か ら,HPV-16な
に と ど ま らず,細
白質 につ
メ イ ン を もつ 蛋 白 質 との 結 合 能 を
メ イ ンを もっ 蛋 白 質 の な か で もhDLGな
者 ら は,
どの あ
白 質 が 結 合 す る こ とで 癌 化 に
関 与 し て い る もの と考 え て,現
在 さ ら に 研 究 を続 け て
いる。
241
40
蛋 白質
表2ア
核酸
酵素
Vol.43
デ ノ ウ イ ル スE40RFIC末
No.3(1998)
端 変 異 蛋 白 質 のhDLG結
合 能 とCREF細
胞 にお ける
トラ ン ス フ ォ ー ム 活 性20・24)
ス で あ り,細 胞 へ の 感 染 は プ
ロ ウ イ ル スDNAの
染 色 体DNAへ
宿 主細胞
の組 み込 み に
よ って 成 立 す る。HTLV-1が
白血 病 細 胞 で 染 色 体DNAに
組 み 込 まれ る 部 位 がATL患
者 ご と に異 な る こ とか ら,inSertiOnalmutagenesisし
a)Aは
フ ォ ー カ ス 形 成 能 で あ り,5+は
多 数 の 大 き な コ ロ ニ ー 形 成,2+は
少 しの 小 さ な コロニ
ー形 成 ,+は
わ ず か に小 さな コ ロニ ー形 成 。Bは 足 場 非 依 存 性 増 殖 能(培 養 器 の 内 底 な どに付 着
で き な い 状 況,た
と えば 軟 寒 天 培 地 中 で も増 殖 で き る能 力)で
中程 度 増 殖,+は
わ ず か に増 殖 。Cは
高 い 肉腫 形 成,2+は
あ り,5+は
広 範 に増 殖,4+は
ヌ ー ドマ ウ ス で の造 腫 瘍 能 で あ り,5+は
小 さ な悪 性 度 の 高 い 肉 腫 形 成,+は
大 きな悪1生度 の
小 さ な悪 性 度 の低 い 肉腫 形 成 。
てい
る と は 考 え に くい 。 と ころで,
その遺 伝 子 産物 の ひ とつで あ
るTaxはRat-1細
胞 な どの
げ っ 歯 類 繊 維 芽 細 胞 株 に足 場
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非 依 存 性 増 殖 能 や ヌ ー ドマ ウ
ス で の 造 腫 瘍 性 を,T細
Ⅳ
.E40RF1蛋
白質 やTax蛋
白質 のhDLG蛋
白 質 との 結
在 下 で 不 死 化 能 を 付 与 す る能 力 を 有 して い る。 さ らに,
Tax蛋
合 につ いて
白 質 は 少 な くと も3種 類 の エ ンハ ン サ ー(CRE,
NFxB,CArGボ
1.E40RF1蛋
白質 とTax蛋
以 上HPVとhDLGに
白質 とは
つ い て 述 べ た が,最
の 腫 瘍 ウ イ ル ス とhDLGと
近,ほ
か
の 関 連 を 示 す研 究 が 報 告 さ
れ た20)。そ の腫 瘍 ウ イ ル ス と は ヒ トア デ ノ ウ イ ル ス とヒ
トT細
胞 白血 病 ウ イ ル ス(human
virus type1;HTLV-1)で
T-cell
leukemia
胞 に は イ ン タ ー ロ イ キ ン2存
ック ス)を 介 し て転 写 活 性 化 能 を有 す
る こ とが 知 られ て い る22)。ま た,種
々 のTax変
質 を 用 い た 実 験 結 果 か ら,Taxの
トラ ンス フ ォー ム 活
性 と転 写 活 性 化 活 性 が 相 関 す る こ と(た とえ ば,NFxB
依 存 性 転 写 活 性 化 能 欠 損 変 異Tax蛋
白 質 をRat-1細
胞 で 発 現 さ せ て も,足 場 非 依 存 性 増 殖 能 を獲 得 しな い)
あ る。 ヒ トア デ ノ ウ イ ル
が 示 さ れ て い る。 一 方,損
傷 を受 け た 細 胞 の核 に は 小
ス は ヒ トの 呼 吸 器 や 眼 の 感 染 症 の 原 因 ウ イ ル ス の ひ と
核 が観 察 さ れ る こ とが 知 られ て い るが,HTLV-1感
つ で,6群(A∼F群)に
細 胞 も同 様 の 変 化 が 認 め られ,人
分 類 さ れ て い る。Aお
異蛋白
よ びB
群 の ウ イ ル ス を げ っ 歯 類 の 動 物 に 接 種 す る と未 分 化 肉
COS細
工 的 にTax蛋
染
白質 を
胞 で 発 現 させ る と こ の 小 核 が 観 察 され る こ とか
腫 を 形 成 す る な ど の 実 験 発 癌 能 を 示 す こ と か ら腫 瘍 ウ
ら,こ の 小 染 色 体 形 成 に もTax蛋
白 質 が 深 くか か わ っ
イ ル ス と も よ ば れ る が,分
て い る もの と思 わ れ る23)。ま た,種
々 のTax変
子 疫 学 的 研 究 の 結 果,こ
の
ウ イ ル ス の 自然 宿 主 で あ る ヒ トの癌 との か か わ り は否
質 を作 製 して 検 討 した 結 果,種
定 さ れ て い る。 し か し,細 胞 癌 化 の 基 礎 研 究 の 対 象 と
活 性 に はC末
して用 い られ,そ の 結 果,そ
は そ のC末
のEIAお
よびElB遺
伝子
に お もな トラ ン ス フ ォー ム 活 性 が あ る こ と,ま たEIA
蛋 白質 がRb蛋
白質 と,EIB55K蛋
白 質 がp53蛋
な っ て い る23)。
と結 合 す る こ とな どが 明 らか とな って い る 。 一 方,F群
2.E40RF1蛋
つ いて
ラ ッ トに 接 種 す る とエ ス トロ
ゲ ン依 存 性 に 乳 腺 繊 維 腫 を形 成 し,そ れ に はEIAと
のORF1が
伝 子(7つ
の読 み 取 り枠,ORFを
胞 白血 病(adult
る21)。
T-cell leukemia;ATL)
の原 因 ウ イ ル ス で あ るHTLV-1はC型
242
白質 が
トラ ンス フ ォー ム
(足場 非 依 存 性 増 殖 能 や 造 腫 瘍 性 の 獲 得)す
成 人T細
と
有 して い る)
必 須 で あ る。 また この9型ORF1蛋
発 現 した ラ ッ ト培 養 細 胞 株CREFは
核 を形 成 す る た め に
ミノ 酸 が 必 要 で あ る こ とが 明 らか と
白質
(ア デ ノ ウ イ ル ス9型)を
もにE4遺
々 の トラ ンス フ ォー ム
端 は不 要22)だ が,小
端16ア
異蛋白
の レ トロ ウ イル
白 質 やTax蛋
白 質 とhDLG蛋
最 近 ア デ ノ ウ イ ル ス9型E40RF1蛋
(A-T-L-V)にX-S/T-X-Vモ
系 お よ びCREF細
E40RF1蛋
白質 に
白 質 のC末
端
チ ー フが あ り,無 細 胞
胞 融 解 産 物 を 用 い た 実 験 で9型
白 質 はhDLG蛋
白 質 とPDZド
メ イ ンを介 し
て 結 合 す る こ とが 示 さ れ た20)。 また,9型E40RF1蛋
白質 の種 々 のC末
端 変 異 蛋 白 質 を用 い て そ のhDLG蛋
白 質 との 結 合 能 とCREF細
胞 で の トラ ンス フ ォー ム 活
ウイル ス発癌蛋 白質 と細胞蛋 白質PDZド メインとの結合
性 が 比 較 検 討 さ れ た20,24)(表2)。 種 々 のC末
白質 の な か でC末
端 ア ミノ酸 配 列 がX-S/T-X-Vモ
ー フ に一 致 す る も の はhDLG蛋
想 定 され るが,実
端 変異 蛋
目(mutⅢ-Dの
場 合P)の
ア ミノ
酸 に つ い て は 何 で も よ い の で は な く特 定 の ア ミノ 酸 で
あ る こ とが,hDLG蛋
白 質 と の 結 合 に必 須 で あ る の か
も しれ な い 。 ま た,hDLG蛋
Dに
白質 と結 合 しな いmutⅢ-
も弱 い な が ら も トラ ン ス フ ォー ム 活 性 が 認 め られ
た こ と,野 生 型 と同 程 度 にhDLG蛋
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mutⅢ-Cの
うなhDLG蛋
白 質 と結 合 す る
白質 で 認 め られ た よ
白 質 との結 合 能 とげ っ歯 類 培 養 細 胞 で の
トラ ン ス フ ォー ム 活 性 との正 の 相 関 は9型E40RF1蛋
白質 の 場 合 は認 め ら れ な か った 。 これ らの 結 果 か ら,こ
れ らの トラ ン ス フ ォ ー ム 活 性 の な か で も フ ォ ー カ ス 形
成 と腫 瘍 原 性 に はhDLG蛋
が,そ
白 質 との結 合 が 必 要 で あ る
れ の み で は 充 分 で は な く,他 の 蛋 白 質 との 結 合
も必 要 で あ る と推 定 され る。 さ らにTax蛋
岩 厚 郎
4)川
名 5)Zur
新 医 学,52,2554-2558
端(E-T-E-V)に
もX-S/T-X-Vモ
チ ー フがあ り,無
細 胞 系 でhDLG蛋
白質 と結 合 す る こ とが 明 らか とな っ
・石 橋 正 英:CRC,2,533-543(1993)
尚::Molecular
Medicine,33,288-296(1996)
Hausen,H.:Biochim.Biophys.Acta,1288,
F55-F78(1996)
6)Sedman,S.A.etal.:J.Virol.,66,4201-4208
(1992)
7)Kiyono,T.,Hiraiwa,A.,Ishi,S.,Takahashi,T.,
Ishibashi,M.:J.Virol.,68,4656-4661(1994)
8)Hiraiwa,A.,Kiyono,T.,Segawa,K.,Utsumi,K.,
0hashi,M.,Ishibashi,M.:Virology,192,102-111
(1993)
9)Akutsu,N.,Shirasawa,H.,Asano,T.,Isono,K.,
Simizu,B.:J.General Virology,77,459-463(1996)
10)Klingelhutz,A.J.etal.:Nature,380,79-82(1996)
--}Kiyono,T.,Fujita,M.,Hayashi,Y.,Ishibashi,
M.:Biochim.Biophys.Acta,1307,31-34(1996)
12)Cabral,J.H.,Petosa,C.,Sutcliffe,M.J.,Raza,S.,
Byron,O.,Poy,F.,Marfatia,S.M.,Chishti,A.H.,
Liddinigton,R.C.:Nature,382,649-652(1996)
13)Matsumine,A.etal.:Science,272,1020-1022
白質 のC末
た20)。 こ の こ と と小 核 を形 成 す るた め に はTax蛋
岩 厚 郎 ・安 立 あ ゆ み:最
3)平
トラ ン ス フ ォ ー ム 活 性 が 野 生 型 に比 べ て か
な り弱 い こ とか ら,HPVのE6蛋
白質 核 酸 酵 素,37,2355-
(1997)
結 合 しない とい う予 想 に反 し
チ ー フ の3番
橋 正 英 ・平 岩 厚 郎:蛋
2360(1992)
2)平
端 がA-T-P-Vで
た 結 果 が 認 め られ た 。こ の こ とか ら考 え る とX-S/TX-Vモ
献
1)石
白質 と結 合 す る こ とが
際 の 実 験 で はC末
あ るmutⅢ-DがhDLGと
チ
文
41
(1996)
14)Kiyono,T.,Hiraiwa,A.,Fujita,M.,Hatashi,Y.,
Akiyama,T.,Ishibashi,M.:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,94,11612-11616(1997)
白質
15)Inoue,T.,Kyo,S.,Kiyono,T.,Ishibashi,M.,Ishi-
のC末
端16ア
ミノ 酸 が 必 要 で あ る こ と23)との 間 に相 関
watari,H.,Hwang,Y.-L,Yutsudo,M.,Hakura,
が あ る と思 わ れ る 。
A.:Jpn.J:CancerRes.,85,357-363(1994)
16)Makino,K.etal.:Oncogene,14,2425-2433(1997)
17)Pan,H.,Griep,A.E.:GenesDev.,9,2157-2169
(1995)
お わ りに
一 時,E6の
発 癌 との かか わ りがp53と
係 の み で 説 明 さ れ つ つ あ っ た 状 態 の な か で,本
介 した 筆 者 らのHPVE6蛋
白 質 とhDLG蛋
の関
18)Sato,T.,Irie,S.,Kitada,S.,Reed,J.C.:Science,
稿 で紹
白質 の 研 究
268,411-415(1995)
19)Songyang,Z.etal.:Science,275,73-77(1997)
20)Lee,S.S.,Weiss,R.S.,Javier,R.T.:Proc.Natl.
成 果 に加 え て,ア
HTLV-1のTax蛋
デ ノ ウ イ ル ス のE40RF1蛋
白 質 のC末
端 に もE6蛋
末 端 と同 様 の モ チ ー フが 存 在 しPDZド
白質 や
白 質 のC
Acad.Sci.USA,94,6670-6675(1997)
)澤 21 田 幸 治
メ イ ン を もつ 蛋
白質 と結 合 す る ら し い こ とか ら推 測 す る と,子 宮 頸 癌
・山 下 利 春
・藤 永
意:蛋
白 質
核 酸
酵
素,42,1618-1625(1997)
22)藤
澤 順 一:蛋
白 質
核 酸
酵 素,42,1532-1540(1997)
23)Semmins,O.J.,Majone,F.,Cantemir,C.,Tur-
関 連 のHPVの
癌 化 能 に はPDZド
メイ ン を有 す る 蛋 白
質 が か か わ っ て い る 可 能 性 が あ る。 この こ とは,APC
とhDLGの
関 係 と同 様 に,広
明 にPDZド
メ イ ン を有 す る 蛋 白 質 とい う新 しい 視 点 を
くヒ ト癌 の 発 生 機 構 の 解
chetto,L.,Hjelle,B.,Jeang,K.一T.:Virology,217,
373-379(1996)
24)Weiss,R.S.,Gold,M.0.,Vogel,H.,Javier,R.
T.:J.Virol.,71,4385-4394(1997)
与 え る も の と筆 者 ら は 考 え て い る。
243