ボツリヌス神経毒素

●総 説●
ボツリヌス神経毒素-無毒成分複合体の
構造と機能
井上
薫 ・藤永由佳子 ・横田憲治 ・小熊恵二
ボ ツ リヌス菌は,産 生す る神経 毒素の 抗原性か らA∼G型
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神経 毒素もそ の分子 量は約150Kで
に分類 される。 いずれの型 の
あ るが,培 養上 清中で は神経毒 素は無毒 成分と結合 し
て大 きな分子 サイズ(分 子量300K,500K,900K)のprogenitor
る。 これ らのprogenitor
toxinを 形 成 して い
toxinの 構造 を遺伝子の塩 基配列 と,精 製 したprogenitor
toxin
蛋 白質か ら解 析 した。無毒 成分 には血球 凝集(HA)活
性 を示す もの と示 さな いものがあ る
が,こ の血 球凝集 素は,経 口摂取され たprogenitor
toxinが 小 腸よ り吸収される際 に重 要
であ るこ とが 判明 した。
Key-words
は じめ に
【ボ ツ リヌ ス神 経 毒 素 】 【progenitor
ボ ツ リヌ ス 毒 素 は,ク
ロ ス トリジウム属 に
分 類 され る ボ ツ リヌ ス 菌(Clostridium
て の研 究 を進 め て い る 。 本 稿 で は,こ
botulinum)が
まず 説 明 し,次
産 生 す る強 力 な 神 経 毒 素 で あ る 。 こ の 毒 素 は分 子 量 約
150Kの
蛋 白質 で,食
toxin)【 赤 血 球 凝 集(素)】
genitor
れ まで の 報 告 を
い で 最 近 筆 者 らが 得 た ボ ツ リ ヌ スpro-
toxinの 構 造 と機 能 に つ い て 解 説 す る。
品 中 や菌 の培 養 上清 中で は無 毒
成 分 と結 合 して 複 合 体(progenitor
toxin)を
I. ボツ リヌス菌,ボ ツ リヌス中毒
形 成 して
存 在 して い る。 神 経 毒 素 は 末 梢 神 経 の 神 経-筋 接 合 部 に
作 用 し,神 経 伝 達 物 質 で あ る ア セ チ ル コ リ ン の 放 出 を
阻 害 す る こ とが 知 ら れ て い た 。1990年
ボ ツ リヌ ス 菌 は,グ
代 に入 っ て か ら
神 経 毒 素 の ア ミノ 酸 配 列 が 決 定 さ れ,こ
の蛋 白質 が プ
ラ ム 陽 性 ・偏 性 嫌 気 性 の 大 桿 菌
で あ り,芽 胞 を形 成 す る 。 芽 胞 は 海 ・湖 沼 底(水)や
土 壌 中 に 存 在 し て お り,こ
ロ テ ア ー ゼ 活 性 を 有 し,シ ナ プ ス 小 胞 が シ ナ プ ス 前 膜
実 の び ん 詰 め や 缶 詰,ハ
に 融 合 す る際 に必 要 な 蛋 白 質(SNAP-25,シ
botulusと
レ ビ ン,シ
ナ プ トブ
ン タ キ シ ン)を 分 解 す る こ と が 明 らか に さ
れ て き た 。 毒 素 の 作 用 機 構 が 解 明 さ れ る一 方 で,実
に経 口 摂 取 さ れ るprogenitor
toxinの 構 造,そ
の詳 細
近 年,筆
者 ら は ボ ツ リヌ スprogenitor
toxinの 無 毒
成 分 に着 目 し,そ の 遺 伝 子 お よ び 蛋 白 質 の 解 析 を 進 め
菌 は1897年,Van
Inoue,Yukako
[Department
Structure
of
and
Fujinaga,Kenji
Bacteriology,Okayama
Function
of
Clostridium
Yokota,Keiji
University
botulinum
Medical
Progenitor
テ ン語 で
toxinを 産 生 す る 。
Ermengemに
例 よ り最 初 に 分 離 さ れ た が,そ
よ りハ ム の 食 中 毒
の産生 す る神経 毒素 の
抗 原 性 の 違 い に よ りA∼G型
に 分 類 さ れ る。 こ れ まで
に ヒ トに は お も にA,B,E,F型
菌 が 中 毒 を きた して
い る。
て きた 。 さ ら に,現 在 筆 者 ら は無 毒 成 分 の 機 能 に つ い
Kaoru
ム や ソ ー セ ー ジ(ラ
菜 や果
名 の 語 源 で あ る)な どの 嫌 気 的 な 環
境 下 で 発 芽 ・増 殖 し,progenitor
際
な 吸 収 機 構 は ま だ 明 らか に さ れ て い な い 。
い い,菌
れ が 死 ん だ 動 物,野
食 品 中 で 増 殖 した 菌 が 産 生 したprogenitor
Oguma,岡
山 大 学 医 学 部 細 菌 学 教 室
School,Shikata-cho,Okayama
(〒700
toxinは
岡 山 市 鹿 田 町2-5-1)
700,Japan]
Toxins
2049
24
蛋 白質
核酸
酵素
Vol.42
No.13(1997)
経 口 摂 取 さ れ た あ と,胃
を通 過 し,小 腸 上 部 か ら吸 収
され,リ
ンパ 液 中 で 神 経 毒 素 と無 毒 成 分 に解 離 す る。 そ
の 後,神
経 毒 素 は胸 管 を 経 て 血 中 に 移 行 し,血 行 性 に
神 経-筋 接 合 部(end-plate)や
端 に 作 用 し,こ
自立神 経節 お よびそ の末
れ らの 部 位 で ア セ チ ル コ リ ンの 放 出 を
阻 害 す る と考 え ら れ て い る(図1のfood-borne
botu-
lism)a
II.
progenitor
toxinの
構 造 と機 能
前 述 した よ う に ボ ツ リヌ ス 神 経 毒 素 は 食 品 や 培 養 上
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清 中 で はprogenitor
toxinと
は19S毒
(500K),12S毒
素(300K)の3種
は3種
の毒 素,B,C,D型
E,F型
菌 は12S毒
図1
素 の み,G型
botulismと,乳
の ほ かwound
殖,毒
児 の 腸 管 内 で 起 こ るinfant
botulismが
botulismが
あ る 。 こ
類 が あ り,A型
素 と12S毒
菌 は16S毒
菌
素,
素 の み を産
素 は神 経 毒 素 と血 球 凝 集(hemag性 を示 さ な い 無 毒 成 分(筆 者 ら は
nontoxic-nonHAと
命 名 した)の 複 合 体 で あ り,19S毒
(HA)か
素 の 産 生 が 起 こ るfood-borne
素
glutination;HA)活
素 と16S毒
ボ ツ リ ヌ ス 中 毒 の 発 症 機 構
素(分 子 量900K),16S毒
菌 は16S毒
生 す る(図2)。12S毒
食 品 中 で 芽 胞 の 発 芽,増
し て 存 在 し て い る。pro-
genitor toxinに
16S毒
素 は,12S毒
素 とHA活
性 を示す無 毒成 分
ら構 成 さ れ て い る1)。 し た が っ て,19S毒
素 はHA活
性 を 示 す が,12S毒
素と
素 は示 さな い。
あ る 。
Progenitor
toxinはpH7.5
∼8で 神 経 毒 素(7S)と
無毒 成
分 に解 離 す る た め,ア
ルカ リ
条 件 下 で の 陰 イ オ ン交 換 ク ロ
マ トグ ラ フ ィー に よ り神 経 毒
素 を単 離 す るこ とが で き る。 単
離 され た神 経 毒 素 に比 べ て
progenitor
pHや
toxinは
胃液 の
消 化 管 の プ ロテ ア ー ゼ に
対 し て 強 い 抵 抗 力 を示 し,同
じ型 の 毒 素 で は分 子 量 の 大 き
い ほ ど経 口 毒 性 が 高 い こ とが
知 ら れ て い る(19S>16S>
12S>7S)2,3)。
これ ら の こ とか
ら,progenitor
toxinの 無 毒
成 分 は 経 口摂 取 さ れ た 際 に 神
図2
培 養 上 清 中 のprogenitor
培 養 上 清 中 のprogenitor
経 毒 素 を 胃 液 や 腸 液 か ら保 護
toxinの 構 造
toxinは 神 経 毒 素(neurotoxin)と
無 毒 成 分 に は血 球 凝 集 活 性 を示 す も の(HA)と
無 毒 成 分 蛋 白質 との 結 合 物 で あ る 。
示 さな い も の(nontoxic-nonHA)が
はサ ブ コ ン ポ ー ネ ン トか ら な る 。 各 成 分 の量 比 お よ び 結 合 部 位 に関 して は確 定 して い ない が(本
文 参 照),SDS-PAGEパ
2050
タ ー ンか ら考 察 さ れ た 各 毒 素 の 構 造 を模 式 的 に示 した 。
す る 役 割 を果 た して い る の で
あ り,HA
は な い か と考 え られ て い る 。
25
ボツリヌス神経毒素-無毒成分複合体の構造と機能
配 列 か ら,ど の 型 の 軽 鎖 に も
ヒ ス チ ジ ン残 基 に 富 ん だ 亜 鉛
結 合 モ チ ー フ が 存 在 し,毒 素
は こ こ に1分
子 の 亜 鉛 を結 合
した メ タ ロエ ン ドペ プ チ ダ ー
ゼ で あ る こ とが 明 ら か とな っ
た5∼12)。
神 経毒 素が シナ プス前膜 か
ら取 り込 まれ 作 用 す る ま で の
経 過 は以 下 の よ う に考 え られ
て い る13,14)(図4)。(1)毒 素 は
特 異 的 レ セ プ タ ー に重 鎖 のC
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末 端 で 結 合 す る。(2)レ セ プ タ
ー を 介 し た エ ン ドサ イ トー シ
ス に よ り神 経 細 胞 内 に 取 り込
まれ,被
膜 小 胞(coated
vesi-
cle),エ
ン ドソー ム,プ
レ リソ
ソー ム を形 成 す る。(3)酸 性 条
件 下 に な る と,毒 素 は レ セ プ
タ ー と解 離 し,毒 素 の 重 鎖 の
チ ャ ン ネ ル 形 成 ドメ イ ン に よ
りエ ン ド ソー ム や プ レ リ ソ ソ
ー ム の 膜 に孔 を形 成 し
,少 な
図3
く と も軽 鎖 は細 胞 質 内 に 移 行
神経 毒 素 の 構 造
(a)分 子 量 約150Kの
よ り約50Kの
神 経 毒 素 は,自 分 の産 生 す る酵 素 あ る いは トリプシ ン処 理 に よ り,N末
部 分 に切 れ 目が 入 り,軽 鎖,重 鎖 の2本
端
鎖 構 造 とな る。この とき,毒 素 は 完 全 活 性
化 の状 態 で あ る 。さ らに 長 時 間 ト リプ シ ン 処 理 をす る か,他 の プ ロ テ ア ー ゼ処 理 を す る と,重 鎖
が 二 分 さ れ る 。重 鎖 のC末
端 側,N末
端 側 は,そ れ ぞ れ 結 合 ドメ イ ン,チ ャ ン ネ ル 形 成 ドメ イ ン
で あ り,ま た 軽 鎖 は毒 性 ドメ イ ン と よ ばれ て い る 。(b)各
域 を ■ で,相
型 の 毒 素 間 で相 同 性 が 非 常 に高 い領
同 性 が 比 較 的 高 い 領 域 を □ で 示 す 。 軽 鎖 の 中央 部 分 の 相 同 性 が 非 常 に 高 い 領 域 に
あ る亜 鉛 結 合 モ チ ー フ(HEXXH)に1分
子 のZn2+が
結 合 し,エ
ン ドペ プチ ダ ー ゼ 活 性 を示 す 。
す る。(4)軽 鎖 は,シ
ナプス小
胞 が シ ナプ ス前膜 へ ドッキ ン
グ(docking)お
(fusion)す
よ び 融 合
る た め に必 要 な 蛋
白 質 群 で あ る シ ナ プ トブ レ ビ
ン,シ
ン タキ シ ン,SNAP-25
を 分 解 す る こ と に よ り神 経 伝
達 物 質 の放 出 を阻 害 す る。
III. 神経毒素の構造と機能
な お,最
近B型
毒 素 の レ セ プ タ ー と して,ガ
オ シ ド と シ ナ プ トタ グ ミ ン(synaptotagmin)が
神 経 毒 素 は菌 体 内 で は ジ ス ル フ ィ ド結 合 を少 な く と
も1個 は もつ1本
の 後,プ
(heavy
chain)と
あ る こ とが 報 告 さ れ て い る15)。
鎖 ポ リペ プ チ ド として 産 生 され る 。 そ
ロ テ ア ー ゼ を産 生 し て い る菌 で は,特
位 に切 れ 目(ニ
ング リ
重要 で
ッ ク)が
約50Kの
入 り,分 子 量 約100Kの
軽 鎖(light
定 の部
IV.
progenitor
toxin遺
伝 子 の構 造
重鎖
chain)の2本
これ まで の 研 究 か らA,B,E,F型
菌 毒素遺 伝 子 は
鎖 ポ リペ プ チ ド とな る4)(図3)。 ニ ッ クが 入 る こ と に よ
菌 の 染 色 体 に,C,D型
り毒 素 活 性 は100倍
は プ ラ ス ミ ドに存 在 す る こ とが 明 らか に され て い る16)(表
ほ ど上 昇 す る。
遺 伝 子 解 析 に よ り決 定 さ れ た 神 経 毒 素 の 全 ア ミノ 酸
1)。 先 に筆 者 らはC型
菌 は フ ァー ジDNAに,G型
菌
菌 の フ ァー ジゲ ノ ムか らprogeni2051
26
蛋 白質
核酸
酵素
Vol.42
No.13(1997)
リー に結 合 す る モ チ ー フ と して 知 られ て い るArg-GlyAsp(RGD)配
列 を も っ て い る こ と が 明 らか と な り,腸
管 細 胞 へ の 接 着,吸
収 過程 へ の関与 が 考 え られた 。
現 在 ま で にA∼G型
菌 の 神 経 毒 素18∼29),A,C,D型
菌 のnontoxic-nonHAとHA,B,G型
nonHAとHAの
菌 のnontoxic-
一 部,E,F型
菌 のnontoxic-nonHA
遺 伝 子 の塩 基 配 列 が 決 定 され て い る17,30∼43)(表1)。A
∼G型
菌progenitor
toxin遺 伝 子 の 構 成 を 図6に
た 。A,B,D,E,F型
菌progenitor
toxin遺
示 し
伝子 も
C型 菌 と同 様 に ク ラ ス タ ー を形 成 して 存 在 して い る。 し
か し,調
節 遺 伝 子 と考 え られ て い るorf-22(p-21)遺
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伝 子 の位 置 は,A,B型
た 。Eお
よびF型
菌 とC,D型
菌 で は異 な って い
菌 に はnontoxic-nonHA遺
伝 子 と神
経 毒 素遺 伝子 の みが 存在 してい た。最 近 の報 告 に よる
と,G型
HA遺
菌 はA,B型
菌 と 同 様 にorf-22遺
伝 子 とnontoxic-nonHA遺
い るが,そ
伝 子 の 問 に位 置 して
の 上 流 に はha-33遺
ha-70遺
伝 子 が
伝 子 で はな く,ha-17,
伝 子 が 存 在 し て い る(ha-33遺
伝子 の存 在 の
有 無 に つ い て は 不 明 で あ る)。 神 経 毒 素 の型 間 の相 同 性
図4
ボ ツ リ ヌ ス 神 経 毒 素 の 作 用 機 構(仮
ア セ チ ル コ リ ンの 放 出 は,ア
説)
は ア ミノ 酸 レベ ル で32∼60%で
あ る 。 これ に対 し て無
セ チ ル コ リン小 胞 が活 性 帯 に融 合 し
エ キ ソ サ イ トー シ ス で な され る。 ボ ツ リヌ ス 毒 素 は この 部 分 に 作
毒 成 分 の相 同 性 は35∼100%で
用 す る 。 毒 素 は重 鎖 のC末
比 較 的 高 い 値 を示 した。 と くにA,B型
端 側 部 分 で レ セ プ ター に 結 合 し,レ セ
プ タ ー を介 して 神 経 細 胞 内 に 取 り込 ま れ る。 次 いで,重
鎖 のN末
あ り,神 経 毒 素 間 よ りも
間,C,D型
間
の 無 毒 成 分 で そ れ ぞれ 高 い 相 同 性 が 認 め られた(図6)。
端 側 部 分 で エ ン ドソ ー ム ま た はプ レ リソ ソー ム の膜 に孔 を形 成 し,
細胞 質 に 移 行 し,軽 鎖 が 毒 作 用 を発 揮 す る と考 え ら れて い る 。 破
傷 風 毒 素 お よび ボ ツ リヌ スB,D,F,G型
毒 素の軽鎖 はシナプス
小胞 の 膜 に存 在 す る シ ナ プ トブ レ ビン を,ま た,ボ
型 毒 素 の軽 鎖 は,シ ナ プ ス 前 膜 に 存 在 す るSNAP-25を,C型
の 軽 鎖 はSNAP-25と
た 。 こ の た め,シ
V.
progenitor toxinの 詳細 な分 子 構 成
ツ リヌスA,E
毒素
シ ン タキ シ ン の両 方 を切 断 す る こ とが 判 明 し
ナ プ ス 小 胞 の 活 性 帯 へ の 融 合 が 阻 止 され,神
経
伝 達 物 質 放 出 の阻 害 が 起 こ る と考 え られ て い る。
1.
progenitor
構 成,配
toxinの 精 製
列 が 決 定 さ れ た これ ら の 遺 伝 子 か ら発 現 し
た 蛋 白 質 が どの よ うに会 合 してprogeniotor
成 し て い る の か を調 べ るた め に,progeniotor
tor toxin遺
伝 子 の ク ロ ー ニ ング を行 な い そ の 全 塩 基 配
列 を決 定 し た17)。そ の 結 果,以
た(図5)。(1)C型
nonHA遺
下 の こ とが 明 らか にな っ
伝 子(cnt),HA遺
伝 子(cha)は
cha-33,cha-17,cha-70の3つ
クラ スタ
伝 子(cha)群
のORF(読
枠)よ り構 成 され て い る 。(3)chaはctxやcntと
き に 転 写 さ れ る。(4)orf-22はHA遺
逆 方 向 のORFと
養 上 清 を60%飽
は
650M陽
菌(A-NIH株)の
培
ロ
除 いた の ち,SP-Toyopearl
イ オ ン交 換 カ ラ ム に よ りク ロ マ トグ ラ フ ィー を
行 な った 。NaClの
濃 度 勾 配 に よ り溶 出 した5つ の 蛋 白
み取 り
質 の ピー ク の う ち後 半 の2つ
は逆 向
が マ ウ ス に対 し て 致 死 活 性 を示 し た(図7)。
伝 子群 の 下流 に
toxinの
和 の 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム で 分 画 し,プ
タ ミ ン処 理 に よ りRNAを
神 経 毒 素 遺 伝 子(ctx),nontoxic-
ー を 形 成 し て 存 在 し て い る。(2)HA遺
精 製 を 試 み た44)。 ボ ツ リヌ スA型
toxinを 形
の ピー クの フラ ク シ ョン
一 方,各
フ ラ ク シ ョ ン に つ い て ヒ ト赤 血 球 を 用 い て凝 集 活 性 を
して 存 在 して い る。(5)cha-70の
塩基
配 列 か ら推 定 さ れ るア ミノ 酸 配 列 は,Clostridium
per-
HA活
性 が 認 め られ た 。 この結 果 か ら4番 目 の ピー クが
エ ン テ ロ トキ シ ンの 細 胞 侵 入 性 に か か わ る
HA活
性 を もつprogenitor
fyingensの
部 分 と相 同 性 が あ る こ と,さ
2052
らに イ ン テ グ ウ ン フ ァ ミ
調 べ た 結 果,3番
素),5番
目 と4番
目の ピ ー ク がHA活
目の ピ ー ク の フ ラ ク シ ョンに
toxin(16Sお
よび19S毒
性 を もた な いprogenitor
ボツリヌス神経毒素-無毒成分複合体の構造 と機能
ボ ツ リヌ ス神 経毒 素 お よ び無毒 成 分 の 構 造 遺伝 子
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表1
27
a)ア
ミノ 酸 残 基 数 は 、ORFの1番
b)分
子 量 はGENETYX-MAC(Software
c)論
文 に 菌 株 名 の 記 載 が な か っ た た め、GenBankに
toxin(12S毒
素)で
最 初 のMetか
らス トッ プ コ ドンの 手 前 ま で の塩 基 数 か ら推 定 さ れ る ア ミ ノ酸 残 基 の数 を記 した 。
Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)に
よ り計 算 した 。
Development
記 載 され て あ っ た菌 株 名 を記 した 。
あ る こ とが 予 想 さ れ た た め,そ
れ
ぞ れ の画 分 をゲ ル濾 過 に よ り精 製 した 。 さ らに,5∼20%
の シ ョ糖 密 度 勾 配 遠 心 を行 な い,16S毒
素 と19S毒
を分 離 し た。B,C,D型
菌 の 培 養 上 清 か ら も陽 イ オ ン
交 換 カ ラム ク ロ マ トグ ラ フ ィー とゲル 濾 過 に よ り16S毒
素
素 と12S毒
素 を精 製 した 。
2053
28
蛋白質
核酸
酵素
Vol.42
No.13(1997)
末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 解 析 し,
遺 伝 子 配 列 か ら推 定 さ れ る ア
ミ ノ 酸 配 列 と比 較 し た 結 果,
120Kの
バ ン ド はnontoxic-
nonHA,52K,35K,20
K,19K,15Kの
HAの
バ ン ドは
サ ブ コ ンポ ー ネ ン トで あ
る こ とが 判 明 した 。52Kと20
Kな
図5
ボ ツ リ ヌ スC型progenitor
最 上 段 にC型
22)遺
フ ァ ー ジ(c-st)の
伝 子 の 構 造 を,転
toxinの
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端 の 数 カ 所 とN末
訳 産 物(→)お
下 段 に 示 し た 。cha-70遺
端 か ら 約20Kの
い し19Kの
サ ブ コ ン ポー
ネ ン トは,C型
伝 子 の 構 成
神 経 毒 素(CtX),nontoxic-nonHA(cnt),HA(cha),ORF-22(orf-
写 の 方 向(→),翻
各 コ ン ポ ー ネ ン ト(￨-￨)を
な く と もN末
toxin遺
よ び プ ロ セ シ ン グ を 受 け たprogenitor
伝 子 が コ ー ドす る 蛋 白 質 は 翻 訳 後 少
部 分 で 切 断 さ れ てHA-53とHA-22∼23の2個
ha-70遺
菌 と同 様 に,
伝 子 が コー ドす る蛋
白 質 が 翻 訳 後 少 な くと もN末
端 の 数 カ 所 とN末
の サ ブ コ ン ポ ー ネ ン トと な る。
端 か ら約20
Kの 部 分 で 切 断 さ れ て生 成 す
る こ と が 明 らか に な っ た(図
5)。 次 に各 コ ン ポ ー ネ ン トの
SDS-PAGEに
お け るバ ン ド強
度 を デ ン シ トメ ー タ に よ り測
定 し,モ
ル 比 を 算 出 し た(表
2)。 この 結 果 は 測 定 に よ り数
値 の ば らっ き が み ら れ た が,
HA-52,HA-19∼20,HA15は 神 経 毒 素 を1.0と
合,一
貫 して1.5以
35は3.6以
した 場
上,HA-
上 の 値 を 示 した 。
し た が っ て,1分
子 の神 経 毒
素 に 対 し て 少 な く と も2分 子
以 上 のHAの
サ ブ コンポーネ
ン トが 結 合 し,そ
HA-35は
図6
progenitor
ボ ツ リ ヌ スA∼G型
を■
で,無
toxinの 遺伝 子 構 造 を模 式 的 に 示 した。 神 経 毒 素 遺 伝 子(tx)
毒 成 分 遺 伝 子 で 現 在 まで に 塩 基 配 列 が 決 定 され て い る もの を ■
いない もの を□
他 のHAサ
で,決
定 さ れて
で 示 し た。 最 下 段 に 全 型 間 で の ア ミ ノ酸 配 列 の 相 同 性 を示 し た。F(p)は
proteolytic F型 菌 を示 す 。 最 近F型 菌 に も他 の 菌 と同 様 のp-21遺 伝 子 と他 の 菌 とは 異 な るp47遺 伝 子 が 存在 して いる こ とが 明 らか に な っ た32)。nt:nontoxic-nonHA遺
伝 子,ha:HA遺
伝
子 を示す。
て16S毒
素 を形成 してい る と
思 わ れ た。 こ れ に 対 し て
nontoxic-nonHAは1分
神 経 毒 素 に対 し て1分
SDS-PAGEパ
16S毒 素 の 構 造
精 製 し たA型
PAGEパ
菌16S毒
素 の 還 元 条 件 下 のSDS-
タ ー ンは93Kと58Kの
神 経 毒 素 の 重 鎖,軽
鎖 のバ ン ドの ほか に120K,52K,35K,20K,19K,
15Kの
2054
子の
子 が結
合 して い る と考 えて い る 。
B,C,D型
2.
ブ コンポ
ー ネ ン ト よ り も多 量 に 結 合 し
toxin遺 伝 子 の 構 成
菌progenitor
の なか で も
バ ン ドを示 し た(図8)。
各 コ ン ポ ー ネ ン トのN
て い た が,各
い た(図9)。
タ ー ン はA型
菌16S毒
菌16S毒
素 の
素 に よ く類 似 し
コ ン ポ ー ネ ン トの分 子 量 は 多 少 異 な っ て
29
ボツ リヌス神経毒素-無毒成分複合体の構造と機能
S毒 素 は分 子 量 が900Kで
る こ と,HA活
あ
性 を有 す る こ
と以 外 は分 子 構 造 に 関 す る情
報 は得 られ てい なか った。 筆
者 らは 阪 口 らの 方 法 に 準 じて
19S毒
素 を 精 製 し,SDS-
PAGEを
行 な った 。 精 製 され
た19S毒
素 はす べて のバ ン ド
を16S毒
素 と同 じ位 置 に 示
し,そ れ らのN末
配 列 も16S毒
た(図8)。
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図7
A型 ボ ツ リ ヌ ス 菌 培 養 上 清 のSP-Toyopearl
650Mに
よ る イ オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ
フ ィーの 溶 出 パ ター ン
A型 ボ ツ リヌ ス菌 培 養 上 清 を硫 安 分 画 後,SP-Toyopearlに
を 行 な っ た。 ○:280nmに
お け る 吸 光 度,▲:HA活
よ る イ オ ン交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィー
性,---:NaCl濃
端 ア ミノ酸
素 と同 じで あ っ
こ の結 果 か ら19S
毒 素 は16S毒
素 と同 じ コ ン ポ
ー ネ ン トか ら構 成 さ れ て い る
こ とが 明 ら か に な っ た 。 デ ン
度。
シ トメ トリ ー に よ る 解 析 の 結
果 か ら算 出 さ れ た モ ル 比 で は,
19S毒
素 のnontoxic-
nonHA,HA-52,HA-19
∼20 ,HA-15は16S毒
素の
各 コ ン ポ ー ネ ン トと ほ ぼ 同 じ
値 を示 した が,HA-35は16S
毒 素 の約2倍
の 値 を 示 した(表
2)。 したが って 筆 者 らは,19S
毒 素 は16S毒
り,HA分
素 の2量 体 で あ
子 内 に組 み 込 まれ
て い な いHA-35が2個
の16S
毒 素 を架 橋 す る よ う な 形 で 存
在 して い る の で は な い か と考
え て い る(図2)。
4.
図8
精 製
19Sお
し た ボ ツ リ ヌ スA型
よ び16S毒
菌19S,16S,12S毒
素 のnontoxic-nonHA,12S毒
素 のSDS-PAGEパ
素 の106K,13Kコ
タ ー ン
ン ポ ー ネ ン トのN末
端 ア ミノ
酸 配 列 を右 に 示 した 。
12S毒
素の 構造
精 製A型
菌12S毒
タ ー ン は神 経
毒 素 の2本
のバ ン ドの ほか に,
106Kと13Kの
3.
19S毒
素の 構造
19S毒 素 はA型
で あ り,Lamannaら
子 量 約900Kの
た(図8)。
菌 の み が 産 生 す るprogenitor
が 最 初 に 酸 沈 殿 と塩 析 を用 い て分
結 晶 毒 素 と して 得 た45)。 そ の 後,阪
らが カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー,シ
を用 い てA型
toxin
菌 か ら19S毒
口
ョ糖 密 度 勾 配 遠 心
素 を精 製 した46)。 しか し19
この2本
さ れ,13Kコ
nonHAと
106Kコ
配 列 の145Phe以
素 のnontoxic-
端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 示 し た 。 一 方,
ン ポ ー ネ ン ト のN末
nontoxic-nonHAの
バ ン ドを示 し
の バ ン ドは 非 還 元 条 件 下 で も観 察
ン ポ ー ネ ン ト は16S毒
同 じN末
素 の
SDS-PAGEパ
端 ア ミ ノ 酸 配 列 は,
塩 基 配 列 か ら推 定 さ れ るア ミノ酸
降 に 一 致 し た 。 こ の結 果 か ら,12S毒
2055
30
蛋白質
表2
A型
核酸
酵素
Vol.42
ボ ツ リ ヌ ス 菌19Sお
No.13(1997)
よ び16S毒
素 の各 コンポーネ
ン トの モ ル 比
が,G型
菌 のnontoxic-nonHAは,2回
列 は 有 し て い る が,2回
(129∼141)で
の く り返 し配
目 の く り返 し配 列 を含 む 部 分
の ア ミ ノ酸 の 相 同 性 が 低 い こ とが 確 認 さ
れ た 。 した が っ て,(1)こ
の く り返 し構 造 を もつ こ とに
よ っ てnontoxic-nonHAが
プ ロ テ ア ー ゼ に よ る切 断 を
受 け や す くな る,(2)く
り返 し部 分 に切 断 が 起 こ る こ と
に よ り,HAが12S毒
は12S毒
素 に 結 合 で き な くな る,あ
素 とHAと
るい
の 結 合 が 解 離 す る,と い う こ とが
推察 された 。
5.
free-HA,free-HA-35
Database Center for Life Science Online Service
SP-Toyopear1650Mに
素 の 無 毒 成 分 は,16S毒
末 端 か ら140残
フ ィー でNaClの
素 のnontoxic-nonHAがN
基付 近 の部 位 で切 断 を受 けた結 果生 じ
よ るイ オ ン交 換 ク ロマ トグ ラ
濃 度 勾 配 に よ り溶 出 した2番
目 の ピ ー ク は,SDS-PAGEお
よ びN末
目 と3番
端 ア ミノ 酸 配
た 産 物 で あ る こ とが 明 らか に な った 。 同 様 の 結 果 がB,
列 の 解 析 の 結 果 か ら他 の蛋 白質 と結 合 して い ないHAや
C,D型
HA-35(free-HA,free-HA-35)で
Kの
菌 の12S毒
素 で も得 られ て い る36)。13Kと106
コ ン ポ ー ネ ン トは どち ら も12S毒
素 と して 会 合 し
た(図11)。SP-Toyopearl
て お り,こ れ らの コ ン ポ ー ネ ン ト と神 経 毒 素 は 互 い に
示 した よ う にfree-HAはHA活
非 共 有 結 合 で 結 び つ い て い る と考 え られ た 。
HA-35は
nontoxic-nonHAが
切 断 を 受 け るN末
基 付 近 の ア ミノ酸 配 列 をA∼G型
端 か ら140残
で比 較 した と ころ,興
清 中 に もfree-HAとfree-HA-33が
く り返 さ れ て い た(図10)。A,B,C,D型
菌12S毒
素 のnontoxic-nonHAの
量 はA,B型
切 断 は2回
菌 の培養 上
存 在 す る こ とが 確
認 さ れ た(筆 者 ら:投 稿 準 備 中)。D型
も わ ず か にfree-HA-33の
基 と135∼148残
基 で2回
性 を 示 した が,free-
活 性 を 示 さ な か った 。free-HA-35はHAの
性 を獲 得 す る の か も し れ な い 。 最 近,B型
基 の
ア ミノ 酸 か らな る配 列 が,97∼110残
溶 出 パ タ ー ンで も
他 の サ ブ コ ン ポ ー ネ ン トと結 合 す る こ とに よ ってHA活
味 深 い配 列 が 観 察 され た 。す なわ ちL-L/N-S-L-I/MS/T-T/S-A/T-I-P-F-P/L-Y/F-G/Aの14残
あ る こ とが 判 明 し
650Mの
菌 の培 養上 清 中 に
存 在 が 認 め られ た が,そ
の
菌 と比 較 す る とか な り微 量 で あ っ た 。
目 の くり
返 し配 列 の 内 部 で 認 め られ た 。
E,F型
菌 のnontoxic-
nonHAは
この2回
目の くり返
し配 列 を もた ず,こ
の付近 の
配 列 が 欠 失 し て い た 。 他 方,
E型 菌 か ら精 製 した12S毒
素
のnontoxic-nonHAのN末
端 ア ミノ酸 配 列47)は 遺 伝 子 の
配 列 か ら推 定 され るN末
端の
ア ミノ酸 配 列37)と 同 一 で あ っ
た た め,こ
の切 断 を受 け て い
な い こ とが 推 察 され た 。 また,
最 近16S毒
な い(12S毒
G型
素 の み しか 産 生 し
素 を産 生 し な い)
菌 のnontoxic-nonHA
の ア ミノ 酸 配 列 が 発 表 さ れ た
2056
図9
精 製 し たA,B,C,D型16S毒
A型 菌(NIH株),B型
た16S毒
た め,1本
菌(Okra株),C型
素 をSDS-PAGEに
素 のSDS-PAGEパ
菌(Stockholm株),D型
か け た 。B型 菌 の16S毒
鎖 ポ リペ プ チ ドの ま まのwholeの
ター ン
菌(CB-16株)か
ら精 製 し
素 の 神 経 毒 素 は ニ ッ キ ン グが 完 全 で は ない
神 経 毒 素 の バ ン ドが 観 察 され る。
ボツ リヌス神経毒素-無毒成分複合体の構 造と機能
31
の 血 球 凝 集 活 性 はN-ア
セチ
ル ノ イ ラ ミ ン酸 に よ っ て 阻 害
され た。
こ れ ら の こ と か ら,ボ
ヌ ス19Sお
よ び16S毒
ツリ
素 は赤
血 球 表 面 の 糖(鎖)を
認識 し
て 凝 集 活 性 を生 じ て い る こ と
が推 察 され た 。 そ の性 質 はA,
B型
問,C,D型
間でそれぞ
れ 類 似 し て い た が,A型
とB
型 で は 多 少 認 識 し て い る糖
(鎖)が 異 な っ て い る と思 わ れ
Database Center for Life Science Online Service
た。
図10
A30),B32),C34),D36),E37),F38),G39)型
菌nontoxic-nonHAのN末
端 部 分 の ア ミノ酸
配 列 の 比較 と切 断 部位
A∼G型
で,6種
つ い で,ボ
よび16S毒
以 上 の 型 間 で 相 同性 が 認 め られ た ア ミノ酸 を 太 字 で示 した。E,F型
め ら れ た 部 分 につ い て は,4種
で欠 損 が 認
以 上 の 型 で相 同性 が認 め られ た ア ミノ酸 を太 字 で 示 した。 く り返
し構 造 は 下 線 で 示 し た。A∼D型
菌 のnontoxic-nonHAの
切 断 部 位 を ▼ で 示 し て い る。
ツ リヌ ス19Sお
素 は,赤 血 球 表 面
の どの よ う な糖(鎖)を
認識
して 赤 血 球 を凝 集 させ る の か
を 解 析 し た 。 赤 血 球 か ら糖 脂
質 を抽 出 し,展 開 した 薄 層 プ レー ト上 で19Sお
VI.
progenitor
toxinの 性 状--A,B,C,D型
精 製 した16Sお よ び19S毒
素 のHA活
前 述 し た よ う に,19Sお
菌か ら
毒 素 と の結 合 を調 べ た(図12)。
よび16S
そ の 結 果,A,B型
菌
性 の性 質
よ び16S毒
素 は赤 血 球 凝 集
能 を 示 す こ とが 古 くか ら知 られ て いた 。 筆 者 らはA,B,
C,D型
HA活
菌 か ら16Sお
よ び19S毒
素 を精 製 し,そ れ らの
性 の 性 質 を調 べ た とこ ろ,以 下 の よ うな 結 果 が 得
られ た(筆 者 ら:投 稿 準 備 中)。
A型19S,16S毒
素,Cお
よ びD型16S毒
素はヒト
赤 血 球 に対 し て 凝 集 活 性 を 示 し た が,B型16S毒
素 は
活 性 を 示 さ な か っ た 。 ノ イ ラ ミニ ダ ー ゼ 処 理 に よ っ て
赤 血 球 表 面 の シ アル 酸 を除 いた 血 球 を用 いた場 合,Cお
よ びD型16S毒
お よ び16S毒
素 の 凝 集 活 性 は減 少 した が,A型19S
素 の凝 集 活 性 は ノ イ ラ ミニ ダ ー ゼ 処 理 に
よ る影 響 を 受 け な か っ た 。 ま た,B型16S毒
素 は ノイ
ラ ミニ ダ ー ゼ 処 理 し た 赤 血 球 に 対 し て の み凝 集 活 性 を
示 し た 。 他 方,い
toxinに
くつ か の 糖 の 共 存 下 でprogenitor
よ る 凝 集 を調 べ た とこ ろ,A,B型19Sお
16S毒 素 の 凝 集 活 性 はD-ガ ラ ク トー ス(Gal),N-ア
チ ル-D-ガ ラ ク トサ ミン(GalNAc),D-フ
ラ ク トー ス(Lac)に
セ
コー ス(Fuc),
よ り阻 害 さ れ た 。 阻 害 の 強 さ はA
型 でLac>Gal,GalNAc>Fuc,B型
Fuc>GalNAcの
よび
順 で あ っ た 。Cお
でLac,Gal>
よびD型16S毒
図11
素
19S毒
精 製 し た ボ ツ リ ヌ スA型
菌 神 経 毒 素,12S毒
素,free-HA,free-HA-35のSDS-PAGEパ
素,
ター ン
2057
Database Center for Life Science Online Service
32
蛋 白質
核酸
酵素
Vol.42
No.13(1997)
図13
図12
血 球 か ら抽 出 し た 糖 脂 質 へ のprogenitor
中 性 糖 脂 質 画 分(N),モ
画 分(D),ポ
ノ シ ア ロ 糖脂 質 画(M),ジ
リシ ア ロ糖 脂 質 画 分(P)を
グ ラ フ ィ ー で展 開 し,A(19S毒
(16S毒 素)型progenitor
toxinの 結 合
シア ロ糖 脂 質
それぞれ薄層 クロマ ト
素 と16S毒
素 の 混 合 物),B,C,D
ス タ ン ダ ー ド糖 脂 質 に 対 す るC型
お よ びD型16S毒
素 の結 合
SPG(シ
ア ロ シ ル パ ラ グ ロ ボ シ ド),各 種 ガ ン グ リオ シ ドを薄 層 ク
ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 展 開 し,C型
お よ びD型16S毒
素 との 結 合 を
調べた。
toxinと の 結 合 を 調 べ た 。
を ノ イ ラ ミニ ダー ゼ 処 理 した場 合 に は,16S毒
の19Sお
C,D型
よ び16S毒
菌 の16S毒
素 は赤 血 球 の 中 性 糖 脂 質 画 分 に,
素 は お も に赤 血 球 の 酸 性 糖 脂 質 画
は観 察 され な か っ た 。(3)16S毒
素の付着
素(1×105MLD)を
管 内 に投 与 し経 過 を 観 察 し た と こ ろ,モ
腸
ル モ ッ トは 約
分 に結 合 す る こ とが 明 ら か に な っ た 。 種 々 の ス タ ン ダ
6時 間 後 か らボ ツ リ ヌ ス 中 毒 特 有 の 症 状 を呈 した 。8時
ー ド糖 脂 質 を 用 い て 同 様 の 実 験 を行 な っ た と こ ろ
,C,
間 後 に血 液 を採 取 し て,マ
D型 菌 の16S毒
べ た 結 果,血
素 は ガ ン グ リオ シ ド,シ ア ロ シ ルパ ラ
ウ ス に対 す る 致 死 活 性 を 調
清 中 に約200MLD/mlの
毒 素 活性が検 出
グ ロ ボ シ ドな どの シア ル 酸 を含 む糖 脂 質 と結 合 し た が,
さ れ た 。 しか し,12Sあ
グ ロ ボ シ ドや ラ ク ト シル セ ラ ミ ドな どの 中 性 糖 脂 質 に
は,8時
は結 合 しなか った(図13)。A,B型
素 活 性 も検 出 す る こ どが で き な か っ た 。
菌 の19Sお
よび16S
毒 素 が ど の よ うな 糖 脂 質 と結 合 す る の か を 現 在 解 析 中
で あ る。
る い は7S毒
素 を 投 与 した 場 合
間 後 で も症 状 は ま った くみ られ ず,血
これ らの 結 果 か らC型16S毒
清 中の毒
素 は,分 子 内 のHA成
分 に よ り,小 腸 上 部 の 微 絨 毛 に シ ア ル 酸 を 介 して 付 着
前 述 し た よ う に ボ ツ リヌ スprogenitor
toxinは 分 子
し,こ
のHA成
分 を 利 用 す る こ と に よ り,神 経 毒 素 が
量 が 大 き い ほ ど強 い 経 口 毒 性 を示 す こ と が 知 られ て い
血 中 に 取 り込 ま れ や す くな っ て い る こ とが 明 らか に な
る。 そ こで,progenitor
った 。
toxin無
毒成 分 の役割 を明 ら
か に す る た め に,モ ル モ ッ トを用 い て,C型
genitor
菌 各 種pro-
toxinを 結 紮 した 腸 管 各 部 に 注 入 し た場 合 と,
固 定 し た 消 化 管 各 部 に添 加 した 場 合 の 毒 素 の 結 合 を調
おわ りに
べ た 。 さ ら に モ ル モ ッ トを 開 腹 し,毒 素 を 小 腸 内 に 注
リヌス神 経毒 素 が神 経終 末 に存在 す るシナ プス小 胞 の
入,縫
ドッキ ング-融合 に関与 す る蛋 白質群 を特 異的 に分解 す
合 後,8時
間 目 に 採 取 した 血 清 中 の 毒 素 活 性 を
強 力 な神 経伝 達物 質放 出 阻害 を起 こす ボツ
マ ウ ス を 用 いた バ イ オ ア ッセ イ に て測 定 した と ころ,以
るプ ロテ アーゼ で あ る ことが明 らか にな り,そ れ と同
下 の 結 果 が 得 られ た48)。(1)C型16S毒
時 に毒素 プロ テア ーゼ の基質 蛋 白質 の機 能 の解析 も進
微 絨 毛 に 結 合 し た が,胃
素 は小 腸 上 部 の
お よび大腸 の上 皮細 胞膜 には
展 して い る。
素 に は付 着 活
その 一方 で,神 経 毒素 と結 合 してい る無毒 成分 の生
性 は ま っ た くみ られ な か っ た 。(2)小 腸 上 部 の 組 織 切 片
体 内で の作 用が,最 近 の筆者 らの研 究 に よ り,少 しず
付 着 しなか っ た 。 一 方,12Sお
2058
よ び7S毒
ボツ リヌス神経毒素-無毒成分複合体の構造と機能
つ 明 らか に な っ て き て い る 。 しか し,赤 血 球 と小 腸 上
皮 細 胞 上 に 存 在 す る レ セ プ タ ー の 同 定,ま
た 巨大 な 毒
素 蛋 白 質 複 合 体 で あ るprogenitor
消化 管 に結
toxinが
合 し た あ と ど の よ う に 吸 収 さ れ て い くの か?と
い った
点 な ど は ま だ 未 解 決 で あ り,今 後 も こ れ ら の こ と を 中
心 に研 究 を 進 め る 予 定 で あ る。
筆者 らの研究 の一部 は北海道立衛 生研究所食 品微生物 科,東 京
農業 大学生物 産業 学部生物化 学教室,札 幌 医科大 学微 生物 学講
座 の方々お よび神戸市 看護大 学基礎 医学系 渡辺定 博博 士,大 阪
府立母 子保 健総合 医療 セ ンター 本 家孝一博 士 との共同実験 で あ
る。
Database Center for Life Science Online Service
文
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