蛋白質核酸酵素:異物排出トランスポーターの結晶構造, ついに決まる

ShortReview
異物排 出 トランスポー ターの結晶構造,
ついに決 まる
村上 聡 ・山口明人
む
大 腸 菌 の 異 物 排 出 トラ ン ス ポー ターAcrBの
結 晶 構 造 が3.5Aの
解 像 度 で 解 か れ た.プ ロ トン共
役 型 トラ ン ス ポ ー ター で は初 め て の結 晶 構 造 決 定 で あ る.AcrBは1,049ア
る単 量 体 が3つ
結 合 した3量 体 で あ り,70Aペ
ミ ノ酸 残 基 か らな
リプ ラ ズ ム に 突 き 出 した頭 部 と,単 量 体 あ た り
12本 の 膜 貫 通 ヘ リ ック ス をも つ 膜 貫 通 部 か らな っ て い た,異 物 は,細 胞 質 側 か らだ け で な く,
ペ リプ ラ ズ ム に 向 か って 開 口 した 頭 部 下 端 側 面 の 入 り口 か らも 取 り入 れ られ,内 部 の 空 洞 に 集
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め られ た の ち,頭 部 中央 の ボ ア の 開 閉 に よ り,先 端 の ロー ト状 開 口 部 か ら,AcrBに
膜 チ ャネ ルT61C内
直 結 した 外
部 へ と輸 送 さ れ る と考 え られ る.
トラ ン スポー タ ー結 晶 構 造
AcrB
異 物 排 出蛋 白質
多 剤 耐性
多剤 排 出蛋 白質
は じめ に
一般 に
,グ
ラ ム 陰 性 細 菌 は グ ラ ム 陽性 細 菌 よ りも抗 生
物 質 に 対 し て 抵 抗 性 が あ る1).10年
ほ ど 前 ま で は,こ
よ う な 抗 生 物 質 自 然 抵 抗 性 の 原 因 は,グ
の
ラム 陰 性 細 菌 に
存 在 す る 外 膜 の 透 過 障 壁 の た め で あ る と信 じ ら れ て き
た.と
こ ろ が,大
腸 菌 のAcrAB*1お
の ホ モ ロ グ で あ るMexABと
に よ り,外
よび そ の 緑 膿 菌 で
い う多 剤 排 出 蛋 白質 の 発 見
膜 透 過 障 壁 説 は 崩 れ た2∼4).αc融 β 遺 伝 子 欠
損 大 腸 菌,〃 鷹Aβ
欠 損 緑 膿 菌 は,多
感 受 性 を 示 し た.す
自 然 抵 抗 性 は,大
な わ ち,グ
くの 薬 剤 に 対 し超
ラム 陰 性 細 菌 の 抗 生 物 質
腸菌 が も ともともっている多剤排 出蛋
白 質 が 原 因 だ っ た の で あ る5，6).AcrABは,RND*2フ
ァ ミ リ ー7)に 属 す る 細 胞 質 膜 蛋 白 質AcrBと,膜
融 合 蛋
図1AcrAB-TolC複
白 質 フ ァ ミ リ ー8)に 属 す る ペ リ プ ラ ズ ム 性 リ ボ 蛋 白 質
AcrAか
ら な る.そ
共 同 し て,プ
し て,外
ロ ト ン(H+)駆
合 体構 造推 定モ デ ル
両 親 媒 性 基 質 は,細 胞 質 側 とペ リプ ラ ズ ム 側 両 方 か らAcrBに
取
り込 ま れ る デ ュア ル エ ン トラ ン ス モ デ ル が 想 定 さ れ て い る14),ま
膜 チ ャ ネ ル 蛋 白 質TolC9)と
た,細 胞 質 側 か らの基 質 の取 り込 み は,い っ た ん 細 胞 質 膜 内 層 に
動 力 を エ ネ ル ギ ー 源 と して
分 配 され て か ら取 り込 ま れ る とい う考 え方 も あ る12,13),
異 物 を 菌 体 外 に 直 接 排 出 す る10,11).
AcrABが
っ て お り,主
と し て 脂 溶 性 ・両 親 媒 性 の 化 合 物 を 排 出 す
と も 共 通 性 が あ る.し
か し,中
structure
蛋 白質
核酸
of bacterial
異 性 が 広 い1).こ の よ う に広 い 基 質 特 異 性 を もつ に もか
か わ らず,有 用 な 物 質 を誤 っ て 排 出 し な い 仕 組 み と して
性 ・塩 基 性 の 化 合 物 だ け
は,排 出 す る基 質 を細 胞 質膜 の 脂 質 二 重 層 か ら取 り入 れ
SatoshiMurakami,AkihitoYamaguchi,大
Crystal
らに 基 質 特
蛋 白 質)
る 点 で,動 物 細 胞 の 多 剤 排 出 蛋 白 質MDR*3(P糖
26
で な く酸 性 の化 合 物 を も排 出 で き る点 で,さ
排 出 す る 薬 物 ・毒 物 は き わ め て 多 岐 に わ た
阪 大 学 産 業 科 学 研 究 所 生 体 情 報 制 御 学 研 究 分 野E-mail:[email protected]
multidrug
酵 素Vol.48No,1(2003)
efflux transporter
AcrB
る と い う,バ キ ュ ー ム ク リ ー ナ ー 説 が 考 え ら れ て い
で 囲 ま れ た チ ュ ー ブ で で き て い た.全
る12，13).ま た,ペ
長 の 一様 な 筒 状 で あ っ た.一
リプ ラ ズ ム に 作 用 点 を もつ 細 胞 壁 合 成
阻 害 剤 で あ る ペ ニ シ リ ン系 抗 生 物 質 を も排 出 す る と い う
る と,AcrAは
点 が 大 き な 特 徴 で あ る.こ
200A程
の こ と か ら,AcrAB-TolC
シ ス テ ム は 細 胞 質(細 胞 質 膜 内 層)か ら だ け で な く,ペ
プ ラ ズ ム(細 胞 質 膜 外 層)か
リ
ら も異 物 を 取 り 入 れ て 排 出 す
る と い う デ ュ ア ル エ ン トラ ン ス 説 が 唱 え ら れ て い る14}.
外 膜 チ ャ ネ ルTolCの
構i造 は2000年
に よ っ て 決 定 さ れ た15>.ホ
す る40A厚
モ3量
体 で あ り,外
の ポ リ ン様 βバ レ ル 構 造 か ら さ らに ペ リ プ
ラ ズ ム に 向 か っ て100A突
度 に も 達 す る と さ れ,ペ
の研 究 に よ
径 は
リ プ ラ ズ ム を横 切 っ て
内 膜 と外 膜 を つ な ぐこ と が で きる と 考 え ら れ て い
る16・17).こ の よ う な 事 実 か ら,AcrAB-TolC複
合体 の構
リ プ ラ ズ ム に 突 き 出 たTolCとAcrBの
ド ッ キ ン グ をAcrAが
膜 を貫 通
方,Nikaidoら
き わ め て 細 長 い 蛋 白 質 で あ り,長
造 と し て は,ペ
にKoronakisら
体 の 構 造 は140A
推 定 さ れ る(図1).こ
側 面 か ら 補 強 す る と い う構 造 が
の 複 合 体 の 中 で,基
質 の 認 識 とエ
ネ ル ギ ー 共 役 を 担 当 す る エ ン ジ ン はAcrBで
あ る が,そ
の 構 造 に 関 し て は こ れ ま で ま っ た く知 見 が 得 られ て い な
き 出 し た αヘ リ ッ ク ス12本
か っ た.
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AcrB構 造決 定
acAB-acrRを
含 む染 色 体 上
の遺 伝 子 座 を マ ル チ コ ピー ベ ク
タ ーpUC118に
ク ロー ニ ング す
る こ と に よ り,ネ
イテ ィ ブ プ ロ
モ ー タ ー 支 配 下 でAcrABの
大
量 産 生 系 が 構 築 で き た18).転
写
調 節 遺 伝 子acrRを
が,と
含 んで い る
くに転写 誘導 しな くと も
大 量 発 現 し た.な
C末
お,AcrBの
端 に はHisタ
い る.菌
グ を付 加 して
体 を 破 砕 し,細 胞 膜 を
調 製 し て2%ド
デ シルマ ル ト
シ ド(DDM)で
可 溶 化 し,ニ
ッ
ケ ル キ レー トカ ラ ム で 精 製 後,
シ ッ テ ィ ン グ ドロ ッ プ 法 に よ り
AcrBの
結 晶 を 得 た.SPring-8
の 阪 大 蛋 白 研 ラ イ ンBL44XU
で 放 射 光 を 照 射 し,回
た.一
方,水
銀,プ
折像 を得
ラ チ ナ,オ
ス ミウ ム な ど の重 金 属 で 置 換 し
図2AcrB結
晶構 造
(a)側 面 か ら見 た 図.(b)上
方 か ら見 た 図,(c)膜
み で ス ライ ス した 図.(文 献19よ
*1AcrB:大
*2RND:薬
貫 通 領 域 ペ リプ ラ ズ ム側 部 分 を23A程
度の 厚
り許 可 を得 て 転 載)
腸 菌 主 要 異 物 排 出 トラ ン ス ポ ー タ ー.ア
剤 耐 性(resistance),根
示 す 一 群 の 蛋 白 質 フ ァ ミ リ ー.機
た も の か ら位 相 を 決 定 し た.さ
ら に,セ
ク リ フ ラ ビ ン(Acrinavine)耐
粒 形 成(nodulation),細
胞 分 裂(celldivision)に
能 に 共 通 性 が あ る か ど う か は 不 明,薬
レ ノ メ チ オ ニ ン置 換
性 因 子 の 細 胞 質 膜 成 分 と し て 発 見 さ れ た.
関 与 す る蛋 自質 の 中 に 見 いだ され る ホモ ロジー を
物 耐 性 に 関 与 す る も の は,マ
ル チ コ ン ポ ー ネ ン ト型 排 出 蛋 白
質 の 細 胞 質 膜 成 分.
*3MDR:multidrugresistanceの
略.動
物 細 胞 多 剤 排 出 蛋 白 質(P糖
蛋 白 質)の
別 称.MDR1,2,3な
ど が 知 ら れ て い る.ABCト
ラン
ス ポ ー タ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る,
蛋白質 核酸
酵 素Vol.48No.1(2003)
27
AcrBの
結 晶 か ら差 フ ー リ エ 法 で セ レ ニ ウ ム 原 子 の 位 置
を 決 め,分
子 モ デ リ ン グ の 際 の 指 標 と し て 用 い た.最
的 に は,3.5Aの
終
解 像 度 で 分 子 モ デ リ ン グ に 成 功 し た19).
ボ ア ドメ イ ン と名 づ け られ た.
頭 部 の特 徴 的 な構 造 と し て は,35Aに
深 く挿 入 さ れ て い る.ま
端 ハ ー フ側 か らN末
AcrB結 晶 全 体構 造
が1),決
こ れ まで 単 量 体 で 機 能 す る と推 定 さ れ て き た
定 さ れ た 結 晶 構 造 は3量
た り12本
Aペ
体 で あ っ た.単
の 膜 貫 通 ヘ リ ッ ク ス か ら な る 膜 貫 通 部 と,70
リプ ラ ズ ム に 突 き 出 した 頭 部 か らな る ク ラ ゲ の よ う
な 形 を し て い た(図2a).頭
お り,そ
の 奥 に3本
る(図2b).頭
頂 部 は ロ ー ト状 に 開 口 し て
の αヘ リ ッ ク ス か ら な る ボ ア が あ
部 は 横 か ら 見 る と2段
重 ね に な っ て い て,
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上 部 は ロ ー ト状 開 口 部 の あ る 部 分 で あ る.こ
TolC下
イ ン ター ロ ック構 造 に よ っ て,3つ
い て 緊 密 に 一体 化 され て い る.
一 方 ,膜 貫 通 領 域 を 見 る と,12本
ス か らな る各 単 量 体 は,比
の膜 貫通 ヘ リ ック
較 的 独 立 に 膜 に 挿 入 さ れ,あ
た か も3本 足 の よ う に見 え る.単 量 体 間 の接 触 は膜 貫 通
ヘ リ ッ ク ス1(TM1)と8(TM8)の
2c)。3本
間 に 限 ら れ て い る(図
足 で 囲 まれ た 中 央 に は 直 径35Aに
達 す る大 き
な空 洞 が あ り,膜 を貫 通 して い る.こ の よ うに 大 き な空
洞 が,生 体 膜 の 中 で 水 で 満 た され た空 洞 と して 存 在 して
ッ キ ン グ ド メ イ ン と 名 づ け ら れ た.下
図3AcrB単
部 は
こ が 基 質 の 透 過 経 路 と 考 え ら れ,
い る とは 考 え に くい.お そ ら く,リ ン脂 質 二 重 層 で 満 た
さ れ て い る と考 え るべ きで あ ろ う.単 量 体 の12本
の膜
量体 の構 造
末 端 八 ー フは 疑 似2回 対 称 性 を示 し,細 胞 質 側 の 膜 面 に平 行 な1本 の αヘ リ ック ス(1α)が 両 者 をつ な いで い る.膜 貫 通 ヘ リ ッ
クス は6本 ず つ の束 に分 け られ,TM1-2間
2個 ず つ,4個
とTM7-8間
の ポ リペ プ チ ド鎖 に よ り頭 部 が 構 成 さ れ て い る.ボ ア ドメ イ ン はN,C両
の サ プ ドメ イ ン(PN1,PN2,PC1,PC2)よ
ドイ ッチ構 造 で あ り,4本
トで あ る,4本
ハー フに
りな る,そ の 基 本 構 造 は α一β一αが2回 く り返 され 入 れ 子 に な っ た α一βサ ン
の βス トラ ン ドか らな る ア ン チパ ラ レル βシー トの 前 に2本 の αヘ リ ック ス が斜 め に置 かれ た形 に な る.PN1,
は これ に も う1本 の βス トラ ン ドが 隣 の ハ ー フ か ら借 用 さ れ る,一 方,PN2,PC2で
グ ドメ イ ンを構 成 す るペ プ チ ド鎖 が挟 ま っ て いる.TolCド
は α一β一αの く り返 しの 間 にTolCド
ッキ ン
ッキ ン グ ドメ イ ンの 基 盤 構 造 は4本 の βス トラ ン ドか らな る2個 の 混 合 βシー
の βス トラン ドの うち2本 は隣 の 単量 体 また は 隣 のハ ー フか らの借 り物 で あ る.こ の 貸借 が,イ ン タ ー ロ ッ ク構 造 を形 成 し
て い る.こ の 基 盤 の 上 に,垂 直 に立 った2個 の ヘ ア ピ ン構 造 が あ る,(b)AcrB単
じ,DN,DC,PN1,PN2,PC1,PC2は
28
の 単 量 体 は頭 部 にお
端 と 直 接 ド ッキ ン グ し て い る と 推 定 さ れ る た
中 央 に ボ ア が あ り,こ
(a)N,C両
ン ター お よび イ ン トラ単 量 体 ・
の 開 口部 は
め,TolCド
PG1で
量体 あ
た,同 一 単 量 体 の 中 で も,C末
端 ハ ー フ側へ ヘ ア ピ ンの挿 入が見
られ る.こ の よ う な,イ
AcrBは
お よぶ 長 い ヘ ア
ピ ン構 造 が,各 単 量 体 か ら隣 の単 量 体 に 向 か っ て水 平 に
サ プ ドメ イ ン名,(文 献19よ
蛋 白質 核 酸 酵 素VoL48No.1(2003)
量体 の 立 体 構 造,サ
り許可 を得 て 転 載)
ブ ドメ イ ン こ との 色 分 け は(a)と 同
図5AcrB内
部構 造
3量 体 の 手 前 の 単 量 体1個 を取 り除 い た 表 面 構 造 ス テ レ オ 図.ボ
図4膜
貫 通 領 域TM4,TM10に
(文献19よ
存 在 す る イ オ ンペ ァ
アヘ リ ック ス構 成 残基 を黄色 で 、TM7,8,9構
り許 可 を得 て 転 載)
して い る.破 線 は 推 定 膜表 面 を示 す.(文
成 残 基 を緑 色 で 表 示
献19よ
り許 可 を 得 て 転
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載)
貫 通 ヘ リ ッ ク ス の う ち,TM4とTM10は
中 心 に あ り,
他 の10本
のヘ リックス
の 膜 貫 通 ヘ リ ッ ク ス は そ の2本
を 囲 む よ う に 配 置 さ れ て い る.
TolC底
面 の α タ ー ン-α 構 造 と か み 合 っ てAcrBと
TolCは
直 接 ド ッ キ ン グ す る.
子 構 造 を 構 成 す る2次 構 造 要 素 に は 見 事 な 規
則 性 が 見 い だ され る(図3a).N末
端 ハ ー フ とC末 端 ハ
ー フ は 疑 似2回 対 称 性 が あ り,細 胞 質 側 膜 面 に 平 行 な
αヘ リ ッ ク ス(1α)が 両 ハ ー フ を つ な い で い る.膜 貫 通
領 域 は6本
の 角 の よ う に 垂 直 の ヘ ア ピ ン構
造 が あ る.後 述 す る よ う に,こ の 垂 直 の ヘ ア ピ ン構 造 が,
単量体の詳細構造およびTolCと の ドッキング
AcrB分
単 量 体 の 頂 点 に は2本
ず つ の αヘ リ ッ ク ス か ら な り,ボ ア ドメ イ
ン は2個 ず つ の サ ブ ドメ イ ンで 構 成 さ れ る.TolC結
合
ドメ イ ンに は 隣 の 単 量 体 お よび 隣 の ハ ー フ との 間 にヘ ア
AcrB内 部構 造
AcrBの
体1個
内 部 を 見 る こ とが で き る よ う に,手
を取 り除 い た 表 面 構 造 モ デ ル が 図5で
前の 単量
あ る.手 前
の単 量 体 に挿 入 され る長 い ヘ ア ピ ンが 腕 の よ う に手 前 に
向 か って 伸 び て い る.一 方,右
上 部 に は手 前 の 単 量 体 か
ピ ン構 造 の 貸 借 が あ り,こ れ が イ ンタ ー ロ ッ ク構 造 を構
らの ヘ ア ピ ンが 挿 入 され て い た 孔 が 見 え る.頭 頂 部 は ロ
ー ト状 に大 き く開 口 してお り,そ の 下 に ボ アが あ る.こ
成 して い る.3量
の ボ ア は 閉 じて い る.実 際 に基 質 が 輸 送 され る と きは こ
た の が 図3bで
体 を構 成 す る 単 量 体1個
を外 側 か ら見
あ る.膜 貫 通 領 域 で は,TM2が
こ え て 上 方 に 伸 び,逆
にTM4とTM10は
い る こ とが わ か る.TM4とTM10は
下方 に伸 びて
膜 貫通ヘ リ ックス
束 の 中 央 に 位 置 す る ヘ リ ッ クス で あ るが,そ
中 央 付 近 に,Asp407,408とLys940が
成 して い る(図4).こ
膜表面 を
の膜貫通部
イ オ ンペ ア を形
の ボ ア の 開 閉 が 行 なわ れ る と考 え られ る.ボ
膜 面 の 間 に 高 さ15A,径20A程
アの下端 と
度 の 空 洞(キ ャ ビテ ィ)
が あ る.こ の 空 洞 か ら は,後 方 に 向 か っ て 窓 が 開 口 して
い る.こ
の 窓 は,ペ
リ プ ラ ズ ム に 向 か っ て 開 い て お り,
なか ば 細 胞 質 膜 外 層 に埋 もれ て い る.図5で
は後 方 の 窓
れ らの 荷 電 残 基 は,部 位 特 異 的 変
しか 見 え な い が,実 際 に は手 前 の 単 量 体 との 間 に も窓 は
異 導 入 に よっ て,異 物 排 出 輸 送 活 性 に必 須 な残 基 で あ る
存 在 す る の で,側 方 に は3個 の 窓 が 開 口 して い る.細 胞
こ とが 確 認 され て お り20),お そ ら く,プ ロ トン透 過 経 路
質 膜 ペ リ プ ラ ズ ム 側 外 層 に溶 け 込 ん だ 両 親 媒 性 物 質 は,
を構 成 して い る と推 定 さ れ る.
こ の 窓 を 通 っ て,AcrBの
ボ ア ド メ イ ン で は,PC1とPC2の
て お り,そ の 底 にPC1の
間 に縦 に 溝 が 走 っ
非 対 称 構 造 で あ る短 い ヘ ア ピ
る.
一方
中 に 取 り込 ま れ る と推 定 され
,膜 貫 通 ヘ リ ッ ク スTM7とTM8の
間 は,ペ
リ
ンが ス トッパ ー の よ う に して横 た わ っ て い る.こ の 構 造
プ ラ ズ ムへ 向 か っ て だ ん だ ん 深 く な る 溝 が 側 面 に あ る
は,AcrAの
(図5緑
細 長 い 分 子 が側 面 に結 合 す る場 所 を示 して
い る の で は な い か と推 定 さ れ る.
色 の 部 分).こ
の 溝 か ら は,TM8上
方 の構 造 が
消 え て い る部 分 を通 っ て 中央 の 空 洞 へ と通 路 が あ る.こ
蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.48No.1(2003)
29
れ まで,ラ
は,頭
ン ダ ム 変 異 に よ り得 ら れ た 基 質 認 識 変 異 体
部 下 端 の こ の 通 路 付 近 に 集 中 す る傾 向 が み ら れ,
ら の 測 定 に よ れ ば,170∼200Aに
あ っ て16),そ
の 形 状 か ら 考 え て,AcrB-TolC複
この あ た りが 基 質認 識 に 大 き くか か わ っ て い る可 能性 が
側 面 に 沿 っ て 結 合 し,両
高 い.い
考 え る の が 妥 当 で あ ろ う.
っ た ん 細 胞 質膜 内 層 に溶 け 込 ん だ 異 物 が,フ
ッ プ-フ ロ ッ プ様 式 で 膜 輸 送 さ れ る な らば,膜
側 面 のTM7とTM8の
リ
貫 通領 域
間 にあ る溝 が輸 送 経路 にな って
も達 す る 細 長 い 分 子 で
合 体 の
者 の ド ッキ ン グ を助 け て い る と
こ こ で 考 慮 し な け れ ば な ら な い の は,こ
の よ うな 複 合
体 は 常 時 形 成 さ れ て い る わ け で は な い と い う こ とで あ
い る 蓋 然 性 は 高 い と思 わ れ る.い ず れ に して も,頭 部 と
る.TolCを
は異 な り,膜 を通 る輸 送 は そ れ ぞ れ の 単 量 体 を介 して 行
い.ヘ
な わ れ る と考 え られ る.
る こ と は よ く 知 ら れ て い る し21),筆 者 ら が ク ロ ー ニ ン グ
必 要 と す る 内 膜 輸 送 系 はAcrBだ
モ リ シ ン 分 泌 系HlyABCDがTolC依
し た 大 腸 菌 異 物 排 出 系 の な か で も,少
AcrAB-TolC複
排 出 系 はTolC依
合体 推 定構 造 と膜 輸 送機 構
存 性 を 示 し た22).す
け で はな
存 の系 であ
な く と も8種
類 の
な わ ち,TolCは
か な り広 範 な 細 胞 質 膜 排 出 トラ ン ス ポ ー タ ー に と っ て 共
AcrB頭
頂 部 とTolC下
端 は 直 径 が 等 し く互 い に ぴ っ
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た り合 致 す る 構 造 を し て い る.両
たAcrB-TolC複
部 の6個
者 が 直接 ドッキ ン グ し
合 体 構 造 を 図6Aに
示 す.AcrB頭
の 垂 直 ヘ ア ピ ン 構 造 と,TolC3量
頂
体 底 面 の6
通 の 外 膜 孔 と し て 利 用 さ れ て い る の で あ り,排
結 合 し た と き だ け,TolCと
れ て い る1・23).一 方,ペ
の複合 体 形 成が 起 こる とさ
リプ ラ ズ ム に は 中 間 に ペ プ チ ド
グ リ カ ン の 網 目構 造 が 存 在 す る.To1Cは
個 の α タ ー ンーα構 造 は 互 い に ぴ っ た り と か み 合 っ て い
に 突 き 出 し た 長 さ か ら 考 え て,お
る.両
中 で 固 定 さ れ て い る だ ろ う.す
方 の ペ リ プ ラ ズ ム 領 域 の 合 計 長 は170Aに
ほ ぼ ペ リ プ ラ ズ ム の 厚 み に 匹 敵 す る.AcrAは,二
図6AAcrAB-TolC複
合体 推定 構造 モ デル
TolC立 体 構 造 はKoronakisら
の 論 文 に よ る.(文
を得 て 転 載)
な り,
り許 可
蛋白質 核酸
そ ら く こ の 網 目構 造 の
る と,基
中 央 の 空洞 に集 め られ て か ら ボ ア を 経 てToICチ
酵 素Vol.48No.1(2003)
質 を結 合 し た
ス テム に よ る異物 排 出輸 送 機構 のモ
排 出 基 質 は,細 胞 質 膜 内 層 お よ び外 層 か らAGrBに
送 り込 まれ る,(文 献19よ
30
ペ リプラ ズム
階堂
図6BAcrAB-TolCシ
デル
献19よ
出基 質が
り許 可 を 得 て転 載)
取 り込 ま れ,
ューブの中へと
い が,異 物 は 一 般 に脂 質 二 重 層
に い っ た ん 溶 け 込 み,単 純 拡 散
あ る い は フ リ ッ プ-フ ロ ップ に
よ っ て細 胞 質 に 侵 入 す る.異 物
排 出 蛋 白 質 は,脂 質 二 重 層 か ら
排 出 基 質 を 取 り入 れ る とす れ
ば,異 物 を か な りの 精 度 で 選 別
で きる(図7).異
物排 出蛋 白 質
が 脂 質二 重 層 か ら基 質 を取 り入
れ て い る と い う こ と は,細 菌 の
多 剤 排 出 蛋 白 質LmrPに
おい
て も実 験 的 証 拠 が あ る13).ま
た,ABCト
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図7AcrABが
異 物 を 結 合 してTolCと
複 合 体 を 形 成 し,異 物 を 排 出 す る ま で の 推 定 機
構 モデル
TolCは お そ ら くペ プ チ ドグ リカ ン の 網 目 構 造 に 固 定 さ れ て い る,AcrABは
TolCを
探 して ドッキ ン グ し,排 出す る.異 物 のAcrBへ
AcrB膜
貫 通 ドメ イ ンを 通 過 し,AcrB内
み られ る よ う に,異 物 の排 出 輸
送体 と 同 じ仲 間 に脂 質 な どの ブ
異物を結合す ると
の 取 り込 ま れ 方 と して は2通 りあ る.
輸 送 経 路1は 細 胞 質 か らの 排 出.異 物 は 内膜 内 層 か らお そ らく フ リ ッ プ-ロ
リ ッパ ー ゼ が あ る と い う こ と
ッ プ様 の 機 構 で
も24),両 者 の排 出 メ カニ ズ ム の
部 の 中 央 空 洞 に 入 る.輸 送 経 路2は ペ リ プ ラズ ム か ら
類 似 性 を 強 く示 唆 して い る.
の排 出,内 膜外 層 に溶 け 込ん だ 異 物 は,AcrB頭
部側 方 の窓 か ら直 接 中央 空 洞 に入 る.そ の 後,
エ ネル ギ ー と共 役 した ボ アの 開 閉 に よ り,頭 部 上端 の 開 口部 か らToicチ ュー ブ内 へ と送 り込 ま
れ る,AcrAは
細 長 い 分 子 であ り,上 方 に伸 張 した状 態 で はAorBと
AcrBの
と も にペ プ チ ドグ リカ ンの
い る か は現 在 の と こ ろ不 明 で あ る が,TolCを
構 造 は,こ の よ う な 従
来 の 推 定 を構 造 の面 か ら初 め て
下 を移 動 す る こ と は む ず か しい と考 え ら れ る.折 りた た ま れ て い る か,図 に示 す よ うに 倒 れ て
AcrAとTolCの
ラ ン ス ポ ー ター に
強 力 に裏 づ け る もの で あ る.側
見 つ け て ドッキ ン グ す る とき に 上 方 に 伸 張 し,
相 互作 用 を 補強 す る も の と考 え られ る
方 へ の 窓 は細 胞 質膜 外 層 に な か
ば埋 もれ て お り,外 層 に 分 配 さ
AcrBの
ほ う が,TolCを
求 め て ペ プチ ドグ リカ ンの網
目 の 下 を 滑 っ て 移 動 す る こ と に な る(図7).こ
AcrAは
ど う な っ て い る の か,た
る.AcrAB二
者 複 合 体 と,AcrAB-TolC三
は,AcrAは
の と き
い へ ん に興 味 が もた れ
者複合 体 で
ダイ ナ ミ ック に構 造 を変 え て い る 可 能 性 が
あ る.
れ た 基 質 の取 り込 み を 示 唆 す る.ま
造 は フ リ ップーフ ロ ップ様 の 膜 透 過 様 式 を示 唆 してい る。
多 剤 認 識 の も う1つ の 側 面 は,こ
造 は,能
動 的 排 出 が 膜 外 の頭 部 中 央 ボ ア の 開
閉 に よ っ て 起 こ る こ と を 強 く 示 唆 し て い る.一
方,エ
ネ
の よ う に 多様 な基 質
を 同 時 に 認 識 し結 合 す る 仕 組 み で あ る.こ れ まで に構 造
決 定 さ れ た 多 剤 結 合 型 転 写 因子BmrR25),QacR26)な
知 見 に よ れ ば,①
AcrB構
た,膜 貫 通 領 域 の構
ほ ど け,基
基 質 の 結 合 に よ り2次 構 造 の 一 部 が
質 の 多 様 な 形 に 対 応 す る,②
位 の 存 在,な
どの
マ ルチ結 合 部
ど が 示 され て い る.AcrBに
も これ らの 機
ル ギ ー 源 で あ る プ ロ トン駆 動 力 を捕 捉 す る プ ロ トン透 過
構 が あ る か ど う か は,今
経 路 は,膜
造 が 解 け れ ば 明 らか に な る もの と期 待 され る.AcrBで
貫 通 領 域 に あ る こ と は 間 違 い な い(図6B)。
し た が っ て,両
者 の 共 役 は 遠 隔 コ ン ポ メ ー シ ョ ン変 化 に
よ ら ね ば な ら な い.こ
の 共 役 機 構 に もた い へ ん 興 味 が も
よ る 膜 輸 送 の 最 大 の 問 題 は,そ
構 で あ る,こ
の 問 題 に は2つ
の多剤 認識機
の 側 面 が あ る.ま
と 有 用 物 質 の 区 別 を ど う つ け て い る か.こ
は,バ
ず,異
物
結晶構
ら に複 数 の輸 送 経 路 の存 在 が 明
回 決 定 さ れ たAcrB構
造 に よ り,
と い う二 階 堂 らの デ ュ ア ル エ ン トラ ンス モ デ ルが 裏 づ け
られ た.
れ に 対 して
キ ュ ー ム ク リー ナ ー 説 が 提 唱 さ れ て い る こ と は前
述 し た12，13).有 用 物 質 は 対 応 す る 特 異 的 膜 輸 送 体 に よ っ
て 輸 送 さ れ る の で,脂
らか で あ る(図7).今
質 結 合 型AcrBの
ペ リプ ラ ズ ム と細 胞 質 の 両 方 に基 質 の取 り込 み 口が あ る
た れ る と こ ろ で あ る.
AcrBに
は,こ れ ら に加 え て,さ
後,基
質二重層 に直接接触 す ることはな
お わ りに
AcrBの
年3月
結 晶 が 最 初 に 得 ら れ た の は2年
の こ と だ っ た.す
蛋白質
核酸
ぐ にSPring-8で
酵 素Vol.48No.1(2003)
半 前 の2000
回 折 を 測 定 し,
31
2.4Aの
11)
12)
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回 折 点 を 含 む 回 折 像 が 得 られ た.し か し,そ れ
か らが苦 難 の 連 続 だ っ た.高 解 像 度 の 完 全 な デ ー タセ ッ
トを得 る こ と,よ い 位 相 をつ け る こ とが 非 常 に む ず か し
8)
9)
か っ た.よ うや く,お ぼ ろ げ な 電 子 雲 が 解 け た の が2001
年 の 夏.初
め て トラ ンス ポ ー タ ー の 分 子 構 造 が 見 え た 感
動 の 一 瞬 だ っ た.そ れ か ら さ らに,つ
デ リ ング と電 子 雲 改 良 の1年
Aの 解 像 度 でAcrB構
ら いつ らい 分 子 モ
を経 て,2002年5月
造 の 論 文 をNatureに
に3.5
投稿でき
た.そ の 間,強 力 な コ ンペ テ ィ タ ー の い る こ とが判 明 し
た り して,最
10)
後 は 薄氷 を踏 む 思 い だ っ た.し か し,な ん
とか 先 着 す る こ と が で き た.今 回 の構 造 決 定 に よ り,異
物 排 出 蛋 白質 お よ び プ ロ トン共 役 型 トラ ン スポ ー タ ー の
14)
15)
膜 輸 送 機 構 が 初 め て分 子 構 造 を基 に議 論 す る こ とが 可 能
Database Center for Life Science Online Service
に な っ た.し
か し,こ れ は ま だ 異 物 排 出機 構 の 理 解 と克
服 に 向 け た研 究 の 第 一 歩 にす ぎな い.今
結 晶,AcrAB-TolC複
16)
後,基 質 結 合 型
合 体 結 晶 な どの 構 造 を 解 く と と
17)
も に,解 像 度 を 上 げ,異 物 排 出 に よ る多 剤 耐性 を克 服 す
るた め の 阻 害 剤 ・回 避 剤 の 分 子 設 計 な どに も貢 献 した い
と考 え て い る.
18)
19)
本研 究 は大 阪 大 学 蛋 白質 研 究 所 月原 冨 武 教 授 の 支 援 と協 力 に よ
り可 能 とな っ た もの で す.深
く感 謝 の 意 を捧 げ ます.ま た,中 島
良 介 君 は ボ ス ドク と して 結 晶 改 良 に 多 大 の 貢 献 を し て くれ ま し
た.山 下 栄樹 さ ん はSPring-8でAcrB結
れ ま した.2人
晶構 造 を と もに解 い て く
20)
21)
22)
は本 研 究 の共 同研 究 者 で す.本 研 究 は全 員 の 不 眠
不 休 の が ん ば り とチ ー ム ワー クに よ って 初 め て 可 能 とな っ た もの
23)
です.本 稿 の著 者 と して これ らの人 た ち に深 く感 謝 い た し ます.
24)
25)
26)
1)
2)
3)
4)
5)
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山 口明 人
略 歴:1977年
東 京 大 学 薬 学 系 大 学 院 博 士 課 程 修 了.理
研 究 所 流 動 研 究 員,千
員,千
葉 大 学 薬 学 部 助 教 授 を 経 て,1996年
業 科 学 研 究 所 教 授.研
よ り大阪 大学産
究 テ ー マ:排 出 膜 輸 送 体 の 構 造 と機
能 お よ び そ の 生 理 的 役 割.関
くが モ ッ トー で す,蛋
化学
葉 大 学 助 手,米 国 工 ー ル 大 学 博 士研 究
心 事 ・抱 負:徹
底 的 に や り抜
白 質 丸 こと 部 位 特 異 変 異 導 入 し,大 腸
菌 の 異 物 排 出 遺 伝 子 全 部 ク ロ ー ニ ン グ し,今 回,異 物 排 出蛋
白 質 構 造 を 決 定 しま した.構 造 を 徹 底 的 に や った あ と は,異
物 で はな い 新 しい 排 出 輸送 体 を 徹 底 的 に 探 した い と 思 っ て い
ま す.