シングルセル継代法 - Thermo Fisher Scientific

アプリケーションノート
Gibco RevitaCell™ Supplement
®
シングルセル継代法
イントロダクション
多能性幹細胞（PSC）は、基礎研究および再生医療、創薬お
よび 毒 性 評価を含む応用アプリケーションにおける基 本的
なツールです。フィーダーフリー培養系の出現により PSC の
スケーラビリティーは大きく改善されましたが、細胞塊の継
代 法（例えば、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、または EDTA
等の試薬を使用した方法）は多くの場合、高スループットの
スクリーニング、遺伝子 編集および 定 方向性 分 化 等のダウ
ンストリーム実験に適合しません。
シングルセル培養は、幹細胞研究において、標準化され広く
利用されている方法です。シングルセル継代方法の使用によ
り、ダウンストリームアプリケーション、クローン選択のため
の比 較、イメージング、セルソーティング、さらに細胞回収
率と細胞数の同定が重要である浮遊培養が可能となります。
™
™
Gibco ® RevitaCell Supplement は、Essential 8 培 地 と
の 使 用のために開発された培地添加物であり、シングルセ
ル継代において細胞生率を最 大限に高めます。市販の他社
™
製 品 と 異 なり、RevitaCell Supplement に は 従 来 の Rho
結 合キナーゼ（ROCK ）インヒビター（例えば、Y-27632 お
よびチアゾビビン）よりも選択性の高い ROCK インヒビター
が、抗酸化作用およびフリーラジカル捕捉作用を有する分子
と共に含まれています。この混合組成によりシングルセル継
代によるストレスの影響を最小限に抑え、細胞生率を大きく
改善します。
材料および方法
PSC の培養および増殖
H9 ヒト胚 性 幹 細 胞（hESC）およびヒト人 工多能 性 幹 細 胞
（hiPSC；エピソーマル ベクターを 使 用して作 製 ）をフィー
ダーフリーの 条 件下、ビトロネクチン（VTN-N）でコーティ
™
ングした培養プレートにおいて Essential 8 培地中で培養。
約 80% のコンフルエンスに到達するまで、hiPSC を 3 ∼ 5
日間毎に継代。
そ の 後、 細 胞 を Pipetman® P1000 で 5 ∼ 10 回 ピ ペ ッ
ティン グ し、 細 胞 を シ ン グ ル セ ル 化しました。 細 胞 懸 濁
™
液 を 3 mL の 新 鮮 な Essential 8 培 地 を 含 む コ ニ カ ル
チ ュ ーブ に 移 し、200 x g で 4 分 間 遠 心 し ま し た。 細 胞
ペ レ ット に 注 意 し な が ら 培 地 を 吸 引 し、 こ の 継 代 作 業
™
後 18 ∼ 24 時 間、 細 胞 を 1X の RevitaCell Supplement
™
を 含 む Essential 8 培 地 中 で 回 復 さ せ（ 図 2 お よ び 3
に 示した 細 胞 播 種 密 度 に お いて）
、そ の 後 の 培 養 期 間
™
に お い て は Essential 8 培 地 の み を 毎 日 フ ィ ー ド し ま
した。
表1．本実験に使用した製品
製品名
製品番号
Alexa Fluor® 488 goat anti–mouse lgG (H+L)
A11029
Alexa Fluor 594 goat anti–rabbit lgG (H+L)
A11012
DPBS, no calcium, no magnesium (10X)
14200-075
Essential 8 Medium
A1517001
Gibco RevitaCell Supplement (100X)
A2644501
Image-iT Fixation/Permeabilization Kit
R37602
Mouse anti-Tra-1-81 (cl.26)
41-1100
®
™
®
™
®
TrypLE Select Enzyme ま た は StemPro® Accutase® Cell
PSC Cryomedium
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。
販売店
を使用した、
のシングルセル継代
Dissociation
Reagent
hiPSC
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent
標準販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC
シングルセル継代実験においては（図 1 のフローチャートを参
For Research Use only.Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All
rights reserved.truncated recombinant human
Vitronectin,
照）
、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まない
DPBS
All trademarks
are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless
otherwise specified.
(VTN-N)
™
Essential 8 is a trademark of Cellular Dynamics International,
Inc. IncuCyte is a trademark of Essen Biosciences.
で洗浄後、
予め加温しておいた TrypLE Select Enzyme
（6 ウェ
Pipetman is a trademark of Gilson S.A.S. Printed in Japan. GIB060-B1503IH
TrypLE™ Select Enzyme, no phenol red (1X)
ルプレートの各ウェルに 1 mL）で処理しました。5%CO2 イン
サーモフィッシャーサイエンティフィック
キュベーター中、
37˚C で 5 分間細胞をインキュベートしました。
™
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
本社：〒108-0023　東京都港区芝浦 4-2-8
[email protected]　0120-477-392　テクニカルサポート
TEL：03-6832-6980　FAX：03-6832-9584
オーダーサポート
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A2644401
A11105-01
A14700
12563-029
PSC を Geltrex® ま た は ビ
トロネクチン プレ ート上 に
™
おいて、Essential 8 培 地
中で約 80% のコンフルエン
トまで増殖させます
カル シウム および マグ
ネ シ ウム を 含 ま な い
DPBS で洗浄します
PSC が 約 80% のコンフ
ルエン スに 達 するま で，
™
毎 日 Essential 8 培 地
のみを培地に添加します
™
Tr y p L E S e l e c t
Enzyme を 添 加 して
37˚C で 5 分 間 イ ン
キュベートします
細 胞 懸 濁 液 をピペッ
ティン グ し、 新 鮮 な
™
Essential 8 培 地 で
希釈します
RevitaCell Supplement を含 む Essential 8
培 地 中の PSC を Geltrex® またはビトロネクチ
™
™
ン基 質 でコーティングされたプレート上に播 種
し、細胞を 18 ∼ 24 時間回復させます。
細胞を 200 x g で 4 分
間沈降させます
培地を吸引し、細胞ペレット
™
を RevitaCell Supplement
™
を含 む Essential 8 培 地 中
に再懸濁させます。
ダ ウン ストリ ーム ア プ
リケ ー ション を 実 行し
ます
図1．RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用したシングルセル継代ワークフロー
増殖および形態評価
シングルセル継代後の細胞の増殖および形態変化を評価す
™
るために、IncuCyte ZOOM（EssenBiosciences 社）生 細
胞イメージングプラットフォームを使用した位相差顕微鏡法
により一定間隔で細胞イメージを取得しました。細胞のコン
フルエンス割合の経時変化の評価により、継代後の細胞 増
殖を測定することができました。
核型の評価
TrypLE Select Enzyme を 使 用 し て hiPSC お よ び H9
ESC を 継 代し、PSC Cryomedium を 使 用して 凍 結 保 存し
™
ま し た。 融 解 後、1X の RevitaCell Supplement を 含 む
™
Essential 8 培地を使用して細胞を 18 ∼ 24 時間回復させ、
細 胞 が 約 80% のコ ン フルエ ン ス に 達 するま で Essential
™
™
8 培地のみをフィードしました。その 後、細 胞を TrypLE
Select Enzyme で 合 計 30 回 継 代しました。各 継 代 後には
™
™
正常な多能性評価
1X の RevitaCell Supplement を 含 む Essential 8 培 地
™
TrypLE Select Enzyme を使用して hiPSC および H9 ESC を使 用して 18 ∼ 24 時間回復させ、その後の各培養 期間中
を継代し、PSC Cryomedium を使用して凍結保存しました。 は Essential 8 ™ 培地のみをフィードしました。30 回目の 継
™
融 解 後、1X の RevitaCell Supplement を 含 む Essential
代 にお いて、細 胞を G バ ンド 核 型 解 析 のために Cell Line
™
8 培地を使用して細胞を 18 ∼ 24 時間回復させ、細胞が約 Genetics に送付しました。
™
80% のコンフルエンスに達するまで Essential 8 培地のみ
™
™
を毎日フィードしました。そ の 後、細 胞は TrypLE Select
RevitaCell Supplement に含まれる生存 促 進性低 分 子 の
Enzyme を 使 用して合 計 10 回シングル セ ル 継 代 さ れ、各 キナーゼプロファイリング
™
™
継 代 後 に 1X の RevitaCell Supplement を 含 む Essential
RevitaCell Supplement 中に含 まれる低 分 子 化合 物 の 標
™
8 培地を使用して 18 ∼ 24 時間回復させ、それ以降の各培 的 とな る重 要 な 経 路 を、従 来 の ROCK インヒビターと 比
™
養 期間中は Essential 8 培地のみをフィードしました。10
較して決 定 するために、Select Screen® Kinase Profiling
®
回 目 の 継 代 後、Image-iT Fixation/Permeabilization Kit
Services を使 用して以下の濃 度において低 分 子のスクリー
ニングを行いました：10 µM Y-27632、2 µM チアゾビビン、
を 使 用して 細 胞 を 固 定 透 過 処 理し（Nanog 染 色 の み に 必
™
要）
、ブロッキングしました。続いて細胞を、マウス抗 TRAおよび RevitaCell Supplement 中に含 まれる生 存 促 進 性
1-81（1：100）およびウサ ギ 抗 Nanog（D73G4）（1：400； 低分子の 1X 最終濃度。319 種類のキナーゼの阻害割合を解
Cell Signaling Technology 社）の 一次 抗体溶 液で処 理し、 析し、80% を超える阻害を示すキナーゼを図 6 に示しました。
Alexa Fluor® 488 ヤギ抗マウス IgG（H + L）（1 : 1,000）お
よび、
（1 : 1,000）
Alexa Fluor® 594 ヤギ抗ウサギ IgG（H + L）
を含む蛍光色素をコンジュゲートした二次抗体で染色しまし
™
た。その後 IncuCyte ZOOM プラットフォームを使用してイ
メージングを行いました。
™
Essential 8™ 培地 +
RevitaCell™ Supplement
コンフルエンス
（%）
100 O hours
24 hours
48 hours
72 hours
96 hours
114 hours
80 60 40 20 0 Essential 8™培地のみ
0 20 40 60 80 100 120 140 継代後の時間
（時間）
図 2 ．RevitaCell™ Supplement は、TrypLE ™ Select Enzyme を使用し
たシングルセル継代に有用性を示します。エピソーマルベクターを使 用
して作製したiPSC を、TrypLE ™ Select Enzyme を使用して継代し、1Xの
RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8™ 培地中で、ビトロネクチン
をコーティングした培養プレート上に 25,000 生 細胞 /cm 2 の密度で播 種
しました。24 時間回復させた後、培養期間中はiPSCにEssential 8 ™ 培地
のみをフィードしました。
図 3．RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用したシ
ングルセル継代後において、正常な形態が保持されています。エピソー
マルベクターを使用して作製したiPSC を、TrypLE ™ Select Enzyme を
使用して継代し、1Xの RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8 ™ 培
地中で、ビトロネクチンをコーティングした培 養プレート上に12,500 生
細胞 /cm 2 の密度で播 種しました。24 時間回復させた後、培 養 期間中は
iPSCにEssential 8™ 培地のみをフィードしました。
Nanog/Phase-contrast
TRA-1-81
TRA-1-81/Phase-contrast
結果
™
エピソーマルベクターで作製した iPSC を、TrypLE Select
Enzyme を使用してシングルセルとして継代しました。継代
™
後、1X の RevitaCell Supplement を含むまたは 含まない
™
Essential 8 培地中において細胞を約 24 時間回復させ、そ
™
の後、Essential 8 培地のみを毎日フィードしました。位相
差顕微鏡法を使用して継代後のコンフルエンスをモニターす
ることによって、iPSC の回復を確認しました。継代後 18 ∼
™
24 時 間にわたり RevitaCell Supplement を 使 用すること
により、iPSC の細胞生率および回復が大きく改善されまし
™
た（図 2 の緑色三角）。反対に、Essential 8 培地のみで培
養した iPSC は良好な回復を示しませんでした（図 2 の赤色
™
™
縁円）。1X の RevitaCell Supplement を含む Essential 8
培地中で約 24 時間培養した iPSC の典型的な形態を図 3 は
示しています。継代 24 時間後、細胞は細長い形態を示しま
すが、その 後は正常なコロニー 形態に回復しました。PSC
Cryomedium を使 用して凍結保存 後、図 1 に示すワークフ
ローに従って培養した iPSC は、正常な形態および多能性を
保持していました（図 3 および図 4）。多能性 細胞マーカー
Nanog および TRA-1-81 のいずれの発現も、iPSC は保持し
ていました。さらに、図 1 に示したワークフローに従った 30
回のシングルセル継代後において、PSC は正常な核型を維
持していたことから、PSC の長 期間の培養における、本 継
代方法の有用性が示されました（図 5）。
iPSCs
H9ESCs
Nanog
図 4 ．RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用したシ
ングルセル 継 代 後において、正常な多能 性が保 持されています。iPSC
および H9 ESC を、Tr ypLE ™ Select Enzyme を使 用して継代し、PSC
Cryomedium を使 用して凍結保存しました。融 解後、1X の RevitaCell ™
Supplementを含む Essential 8™ 培地を使用して細胞を18 ∼24 時間回復
させ、細胞が約 80% のコンフルエンスに達するまで Essential 8 ™ 培地の
みをフィードしました。細胞はTrypLE ™ Select Enzyme を使用して合計
10 回継代し、各継代後1X の RevitaCell ™ Supplementを含む Essential
培養期間中は
8 ™ 培 地 を 使 用して
18 ∼ 2 4 時 間 回 復 さ せ、そ の 後
Caseの
name:各
CLG-18273
Case name: CLG-18157
Patient
Cell
Linename:
Name: SCP P32 H9 ESCs 10
p91 回目
Patient
Linename:
Name: SCP P30 Gepi p30
培地のみをフィードしました。
形態および多能性は
Essential 8 ™Cell
の継代後に評価しました。
シングルセル継代30世代目の
エピソーマルiPSC
シングルセル継代30世代目の
H9 ESC
Result: 46,XX
Result: 46,XX
Result:
Result:
Case: CLG-18157
Slide: 1
Cell: 12
Case: CLG-18273
Slide: 3
Cell: 14
図 5．RevitaCell Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用したシン
グルセル継代後において、30 世代の各世代において融解後、正常な核型
が保持されています。iPSC および H9 ESC を、TrypLE ™ Select Enzyme
を使用して継代し、PSC Cryomediumを使用して凍結保存しました。融
解後、1X の RevitaCell™ Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用し
て細胞を18 ∼24 時間回復させ、細胞が約 80% のコンフルエンスに達する
まで Essential 8 ™ 培地のみをフィードしました。細胞はTrypLE ™ Select
Enzyme を 使 用して合 計 30 回 継代され、各 継代 後に 1X の RevitaCell ™
Supplementを含む Essential 8 ™ 培地を使用して18 ∼24 時間回復させ、
その後の各培養期間中は Essential 8 ™ 培地のみをフィードしました。核
型は 30 回目の継代後に評価しました。
™
RevitaCell Supplement には 細 胞 の 生 存 を 促 進 する低 分
™
子 化合 物が、抗酸化およびフリーラジカル捕捉作用を有す
™
る分子と共に含まれています。RevitaCell Supplement の
混 合 組 成 に含 まれて い る細 胞 生 存 促 進 性 低 分 子 に関して
SelectScreen® Kinase Profiling を行い、従来の ROCK イ
ンヒビター（10 µM Y-27632 および 2 µM チアゾビビン；図 6）
™
と比較しました。RevitaCell Supplement に含まれる細胞
生存促進性低分子は、ROCK インヒビターでもあります。さ
™
らに、RevitaCell Supplement に含まれる本低分子が 7 種
類のキナーゼに対してのみ 80% を超える阻害を示し、その
一方で、80% を超える阻害がチアゾビビンでは 16 種類のキ
ナーゼに、Y-27632 では 25 種類のキナーゼに対して示され
™
ることから、RevitaCell Supplement に含まれる本低分子
はより選 択性の高い ROCK インヒビターであることが 明ら
かになりました。
CDK8/CycC
CSF1R
PRKG1
BRSK1
MLCK
DYRK3
GSK3a
MKNK2
SGK2
GSG2
GSK3b
SKG
SGKL RPS6KB1
RPS6KA4
STK17L
PRKACA
RPS6KA5
DMPK
PRKG2
ROCK1
ROCK2
PRKX
PKN1
PKC eta
MKNK2
CLK4
RPS6KA1
2 µM thiazovivin
PKC delta
LRRK2
RPS6KA2
10 µM Y-27632
図 6 ．RevitaCell ™ Supplement 中の細胞生存促 進性低 分子の
K i n a s e P r o f i l i n g の 結 果 、従 来 の R O C K イン ヒビタ ー と 比 較 して
RevitaCell™ Supplement がより選択的であることが示されました。低
分子化合物の試験は 319 種類のキナーゼのパネルに対して行いました。
80% を超える阻害を示したキナーゼが示されています。
結論
RevitaCell Supplement は、PSC の凍結融解後の回復を改善し、融解後 24 時間におけるアポトーシスおよびネクローシ
™
™
スを最小限に抑えるために開発されました。RevitaCell Supplement は Essential 8 培地中における PSC のルーチンなシ
™
ングルセル継代にも使用することが可能であり、正常な形態、多能性および核型を維持しながら効率的な回復を提供します。
™
さらに、RevitaCell Supplement に含まれる細胞生存促進性の低分子化合物は、選択性の高い ROCK インヒビターである
ことが示され、標的以外の経路への影響が最小限に抑えられています。このため、本システムは、高スループットスクリーニ
ングおよび PSC の様々な細胞型への分化、ならびに遺伝子編集アプリケーションを含む多くのダウンストリーム実験の基
盤となる可能性を有しています。
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
標準販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC
For Research Use only.Not for use in diagnostic procedures. © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.
All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.
Essential 8 is a trademark of Cellular Dynamics International, Inc. IncuCyte is a trademark of Essen Biosciences.
Pipetman is a trademark of Gilson S.A.S. Printed in Japan. GIB060-B1503IH
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