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湿式プロセスを用いた生体材料用チタン・ チタン合金の表面
湿式プロセスを用いた生体材料用チタン・ チタン合金の表面改質に関する研究 山 本 大 目次 第１章 序 1. 1. 論 ................................................................................................................ 1 生体用金属材料としての Ti ........................................................................ 1 1. 1. 1. 生体用金属材料の歴史とその特徴 ...................................................... 1 1. 1. 2. 硬組織代替材料としての Ti 材料 ........................................................ 3 1. 2. インプラント‐骨界面の性質 ..................................................................... 6 1. 3. Ti の表面改質プロセス ................................................................................ 8 1. 3. 1. 表面形態の制御 ...................................................................................... 9 1. 3. 2. 表面改質層の形成 .................................................................................11 1. 3. 2. 1. リン酸カルシウム系化合物薄膜 ....................................................11 1. 3. 2. 2. TiO2 薄膜 ........................................................................................... 12 1. 3. 2. 3. 生体機能性表面の創製 ................................................................... 14 1. 3. 3. 表面性状の影響 .................................................................................... 14 1. 4. 本研究の目的 ............................................................................................... 16 1. 5. 本論文の構成 ............................................................................................... 17 第２章 陽極酸化法による成膜原理と in vivo 試験による骨伝導性評価 ............. 29 2. 1. 陽極酸化皮膜の作製原理 ........................................................................... 29 2. 1. 1. 陽極酸化法の概要 ................................................................................ 29 2. 1. 1. 1. 陽極酸化の原理 ............................................................................... 30 2. 1. 1. 2. 陽極酸化皮膜の成長機構 ............................................................... 31 2. 1. 1. 3. 電解方式 ........................................................................................... 34 2. 1. 2. Ti の陽極酸化皮膜の成長機構 ........................................................... 34 -i- 2. 2. 1. 1. 電流－電圧応答 ............................................................................... 34 2. 2. 1. 2. 酸化物の結晶構造 ........................................................................... 35 2. 2. 1. 3. 酸化皮膜の膜色 ............................................................................... 36 2. 1. 1. 4. 電解液の種類・濃度の影響 ........................................................... 37 2. 2. 骨伝導性評価方法 ....................................................................................... 39 2. 2. 1. 試験条件の選定 .................................................................................... 39 2. 2. 2. 実験方法 ................................................................................................ 41 第３章 ミクロレベルの表面粗さが骨伝導性におよぼす影響 .............................. 44 3. 1. 緒言 ............................................................................................................... 44 3. 2. 実験方法 ....................................................................................................... 45 3. 2. 1. 前処理 .................................................................................................... 45 3. 2. 2. 陽極酸化処理 ........................................................................................ 45 3. 2. 3. 表面分析 ................................................................................................ 45 3. 3. 結果および考察 ........................................................................................... 46 3. 3. 1. 酸化皮膜の性質 .................................................................................... 46 3. 3. 2. 骨伝導性評価 ........................................................................................ 51 3. 4. 小括 ............................................................................................................... 53 第４章 表面改質層に混入する溶質イオン種の影響 .............................................. 57 4. 1. 緒言 ............................................................................................................... 57 4. 2. 実験方法 ....................................................................................................... 58 4. 2. 1. 前処理 .................................................................................................... 58 4. 2. 2. 陽極酸化処理 ........................................................................................ 58 - ii - 4. 2. 3. 4. 3. 表面分析 ................................................................................................ 60 結果および考察 ........................................................................................... 60 4. 3. 1. 酸化皮膜の性質 .................................................................................... 60 4. 3. 2. 表面親水性 ............................................................................................ 66 4. 3. 3. 骨伝導性評価 ........................................................................................ 69 4. 4. 小括 ............................................................................................................... 72 第５章 陽極酸化皮膜中のリン酸イオン濃度の影響 .............................................. 74 5. 1. 緒言 ............................................................................................................... 74 5. 2. 実験方法 ....................................................................................................... 75 5. 2. 1. 前処理 .................................................................................................... 75 5. 2. 2. 陽極酸化処理 ........................................................................................ 75 5. 2. 3. 表面分析 ................................................................................................ 75 5. 3. 結果および考察 ........................................................................................... 76 5. 3. 1. 水溶液中 H3PO4 濃度および印加電圧の影響 ................................... 76 5. 3. 2. 骨伝導性評価 ........................................................................................ 81 5. 3. 3. 表面親水性の影響 ................................................................................ 85 5. 4. 小括 ............................................................................................................... 87 第６章 水熱処理および試料保存方法の影響 .......................................................... 90 6. 1. 緒言 ............................................................................................................... 90 6. 2. 実験方法 ....................................................................................................... 90 6. 2. 1. 陽極酸化処理 ........................................................................................ 90 6. 2. 2. 水熱処理 ................................................................................................ 91 - iii - 6. 2. 3. 試料の保存方法 .................................................................................... 92 6. 2. 4. 表面分析 ................................................................................................ 92 6. 3. 結果および考察 ........................................................................................... 93 6. 3. 1. 水熱処理の効果 .................................................................................... 93 6. 3. 2. 表面処理後の保存環境の影響 ............................................................ 97 6. 3. 3. 骨伝導性評価 ...................................................................................... 101 6. 4. 小括 ............................................................................................................. 103 第７章 TiO2 皮膜作製プロセスの影響 .................................................................... 106 7. 1. 緒言 ............................................................................................................. 106 7. 2. 実験方法 ..................................................................................................... 106 7. 2. 1. 前処理 .................................................................................................. 106 7. 2. 2. TiO2 皮膜の作製 ................................................................................. 107 7. 2. 2. 1. 陽極酸化処理 ................................................................................. 107 7. 2. 2. 2. 高温酸化処理 ................................................................................. 107 7. 2. 2. 3. 陽極酸化‐高温酸化二段階処理 ................................................. 107 7. 2. 3. 7. 3. 表面分析 .............................................................................................. 108 結果および考察 ......................................................................................... 108 7. 3. 1. 酸化皮膜の性質 .................................................................................. 108 7. 3. 2. 骨伝導性評価 .......................................................................................113 7. 4. 小括 ..............................................................................................................116 第８章 各種 Ti 合金への陽極酸化処理および水熱処理 ........................................118 8. 1. 緒言 ..............................................................................................................118 - iv - 8. 2. 実験方法 ......................................................................................................118 8. 2. 1. 前処理 ...................................................................................................118 8. 2. 2. 表面処理 ...............................................................................................119 8. 2. 2. 1. 陽極酸化処理 ..................................................................................119 8. 2. 2. 2. 水熱処理および PBS(-)保存 ..........................................................119 8. 2. 3. 8. 3. 表面分析 .............................................................................................. 120 結果および考察 ......................................................................................... 120 8. 3. 1. 希薄水溶液中の陽極酸化処理 .......................................................... 120 8. 3. 1. 1. 単体金属の陽極酸化 ..................................................................... 120 8. 3. 1. 2. Ti 合金の陽極酸化 ......................................................................... 123 8. 3. 1. 3. 酸化皮膜の表面親水性 ................................................................. 130 8. 3. 1. 4. 骨伝導性評価 ................................................................................. 134 8. 3. 2. 濃厚水溶液中での陽極酸化処理 ...................................................... 134 8. 3. 2. 1. 酸化皮膜の性質 ............................................................................. 134 8. 3. 2. 2. 骨伝導性評価 ................................................................................. 142 8. 3. 3. 8. 4. 水熱処理の効果 .................................................................................. 145 小括 ............................................................................................................. 149 第９章 将来展望 ........................................................................................................ 153 第１０章 総 括 ........................................................................................................ 155 研究業績 ...................................................................................................................... 160 -v- 謝辞 .............................................................................................................................. 165 - vi - 第１章 序 論 1. 1. 生体用金属材料としての Ti 1. 1. 1. 生体用金属材料の歴史とその特徴 老化，疾病，事故によって失われた人体機能の再建には多くの材料が使用さ れてきた．その歴史は今から数千年前にまで遡り，古書によれば，創の縫合に 麻が用いられたり，歯の治療に金が用いられたことが記されている[1-1]．その中 で金属材料が果たしてきた役割は非常に大きい．Table 1. 1 に生体用金属材料の 歴史を示す[1-2]．最初に使用された金属は金である．その後，金属の製錬技術の 進歩によって，銀，アマルガム，青銅，鉄などが使用できるようになり，1900 年代には現在でも使用されている Co-Cr 合金，ステンレス鋼，Ti などが登場す るようになった．デバイス自体の機構は時代とともに複雑なものになる一方で， その用途に関しては，歯科用器具あるいは骨折部固定・置換用器具であり，数 千年前からほとんど変化はない．近年になってようやくステントや塞栓コイル などの新しい用途に使用されるようになったが，いずれにしても金属材料は生 体内で構造材料として使用されている．現在，生体用に使用されている材料の 素材は，Table 1. 2 に示すように，金属材料，セラミックス材料，および高分子 材料の 3 つに大別されているが，生体内での過酷な力学的負荷に耐えうる力学 的強度を有する素材は金属材料だけである．近年，整形外科や歯科領域に用い られている手術用金属材料を，吸収性高分子材料がとって替わろうとしている が，未だ高荷重に耐える吸収性高分子材料の開発には成功しておらず，力学的 信頼性の高い金属材料の需要は当分の間はなくならないものと予想される． -1- Table 1. 1 Year (A.C.) History of metallic materials as biomaterials. Material Application Location Around BC700 Au band plate Dental bridge Partial denture base Eritrea Around BC500 Au wire Dental restorative material Egypt, Phoenicia Around BC400 Au band plate Au wire Dental crown, bridge Bone fixation material Rome Greek 695 Amalgam Dental restorative material China (Tang) Around 1480 Au foil Dental filling restorative material Italy After 1500 Au, Ag wire Joint for prosthetic tooth Europe 1562 Au plate Restorative palate Europe After 1600 Au, Fe, Bronze wire Suture material for laceration Europe After 1700 Fe, Ag, Bronze wire Sn Bone fixation material Dental filling restorative material Europe France After 1800 Ag amalgam Dental filling restorative material France 1886 Ni-coated steel plate Bone fixation plate, Screw U.K. 1896 Ag-Sn amalgam Dental filling restorative material U.S.A. 1910 Ag Clip for interruption of blood flow 1920 V steel Bone fixation plate, Screw U.S.A. 1926 Au alloy Dental cast restorative material U.S.A. Around 1926 SUS302 Bone fixation material U.S.A. 1929 Co-Cr alloy Partial denture base U.S.A. Late 1930s SUS316, Co-Cr alloy Bone fixation material U.S.A. 1956 SUS316L, Co-Cr alloy Artificial hip joint U.S.A. 1960 Co-Cr alloy Bone head part of artificial hip joint U.S.A. 1966 Stainless steel Aneurysm clip 1960s Ti Artificial joint 1970s Ti-6Al-4V alloy Artificial joint, Bone fixation 1982 Ti Dental casting material Japan 1986 Stainless steel Stent U.S.A. 1995 Ti Aneurysm clip -2- material for cleft Sweden Table 1. 2 Material Advantages and disadvantages of biomaterials. Examples Advantages Disadvantages Metal Stainless steel, Co-Cr alloy, Ti alloy High strength, Ductility, Elasticity, Electrical conductivity Low corrosion, High specific gravity Ceramics Alumina, Zirconia, Hydroxyapatite, Crystallized glass High strength, Anti-corrosion, Durability, Nondissolution Brittleness, Low workability Synthetic Polymer Polymethylmethacrylate, Silicon, Polyethylene, Polyethylene telephthalate Flexibility, Good workability, Light, Low elasticity Low strength, Low rigidity, Degradation Natural Polymer Collagen, Gelatin, Starch, Chitin Polymer 金属の腐食によって溶出したイオンが生体内で毒性を示すことから，生体用 金属材料には耐食性は必須であり，Au，Ag 合金，Pt などの貴金属に加え，非貴 金属合金ではステンレス鋼，Co-Cr 合金，および Ti・Ti 合金などがある[1-3]．い ずれの金属材料も生体との親和性は良好であるが，非貴金属合金の中では Ti が 最も耐食性が高く，ヤング率などの力学的特性も優れている．整形外科用金属 インプラントの米国での使用材料内訳は，SUS316 系が 75%，Co-Cr 合金が 20%， Ti 系が 5%と報告されているが，Ti 系は増加傾向にある[1-2]． 1. 1. 2. 硬組織代替材料としての Ti 材料 Ti が医療用に検討され始めたのは，ステンレス鋼や Co-Cr 合金よりも遅く， 1940 年に Bothe らは，バイタリウムやステンレス鋼と同様に Ti 表面に骨が密着 して成長し，生体適合性が良好であることを初めて示した．1952 年に Brånemark らによって Ti と骨が光学顕微鏡レベルで直接結合すること（オッセオインテグ -3- レーション）が見出されたことによって，長期間にわたって埋入され続けるこ とが想定される生体部位へは Ti の使用が有効であることが示された[1-5]．実際に， 現在市販されている人工歯根の素材のほぼ 100%が Ti または Ti 合金である[1-6]． Ti 材料は構成相により α 型，α+β 型，β 型に分類される．α 型は純 Ti のように 室温でも α 単相が安定相である組成である．α+β 型は室温で α+β 二相が安定相 であるが，マルテンサイト変態開始温度が室温以上である組成の合金である．β 型は室温で α+β 二相が安定相でマルテンサイト変態開始温度が室温以下である 組成の合金である．Ti は多くの元素の溶解度が大きいため，酸素や窒素などの 侵入型固溶元素まで含めた多彩な合金設計・プロセス設計を可能としている． Ti 材料の合金元素には，Al, O, N, C などの α 安定化元素，H, Nb, Ta, Mo, V, Fe な どの β 安定化元素がある．Zr や Sn は中性的であり，単独では特定の相の安定化 への寄与は小さい． Table 1. 3 にインプラント用として ASTM および JIS に登録されている Ti 材料 を示す[1-6]．純 Ti は，Ti の生体応用初期からプレート，スクリュー，ワイヤーな どとして用いられており，現在も，大きな強度を必要としない部位や耐食性が 重視される部位に応用されている[1-6]．しかし，これまでに，ボーンプレートや 骨ねじなどの破損例が報告されている[1-7]．そのため，人工関節や骨折固定器具 のように比較的大きな強度が必要とされる生体部位には，1970 年代より α+β 型 Ti 合金が使用されている[1-6]．Ti-6Al-4V 合金は生体用に開発されたわけではない が，優れた強度―延性バランスを有しており，現在，生体用として最も広く使 用されている α+β 型 Ti 合金である．純 Ti や Ti-6Al-4V 合金の弾性率は，90～100 GPa であり，ステンレス鋼や Co-Cr 合金の 200 GPa と比較すると低いが，生体 -4- Table 1. 3 Structure α type α+β type Ti-based implants registered for ASTM and JIS. Materials CP-Ti ASTM F67-06 T 7401-1 Type 2 Grade 3 Type 3 Grade 4 Type 4 F1108-04 (Cast) F1472-02 (Wrought) Ti-6Al-4V ELI F136-02 (Wrought) T 7401-2 Ti-6Al-2Nb-1Ta T 7401-3 Ti-15Zr-4Nb-4Ta T 7401-4 F1295-05 Ti-3Al-2.5V F2146-01 Near β type Ti-13Nb-13Zr F1713-03 β type Ti-15Mo-5Zr-3Al T 7401-5 T 7401-6 Ti-12Mo-6Zr-2Fe F1813-01 Ti-15Mo F2066-01 Ti-35Nb-7Zr-5Ta In review（WK438） Ti-45Nb In review（WK440） NiTi (Ni:54.5 ～ F2063-05 57.0) -5- Type 1 Type 1 ELI Grade 2 Ti-6Al-4V Ti-6Al-7Nb Intermetallic compound Grade 1 JIS Cell Protein Protein Adsorption Fig. 1. 1 Cell Approaching Contact Cell Adhesion A model of first stage of osteoconduction on an implant material. 骨の力学的強度を担っている皮質骨の 30 GPa よりは圧倒的に高い[1-6]．インプラ ントの弾性率が，埋入部位の骨の弾性率よりも著しく高い場合，運動などによ る力学的荷重のほとんどをインプラントが受け止めてしまい，骨に生理的な荷 重がかからないという応力遮蔽効果（ストレスシールディング）によって，骨 吸収が生じるという問題がある[1-8]．材料の低弾性率化は，ストレスシールディ ングによる骨吸収や骨のリモデリングに対して有効であると考えられているた め，β 型 Ti 合金において低弾性率化が図られている[1-9]．近年，種々の生体用 β 型 Ti 合金が開発され，40～60 GPa の弾性率が得られている[1-9][1-10]． 1. 2. インプラント‐骨界面の性質 材料を生体骨内に埋植後，材料と骨界面で骨伝導過程が進行する．その過程 を Fig. 1. 1 に模式的に示す．Schwartz らによると，骨伝導過程は，①たんぱく質 吸着，②細胞誘引，③材料表面での細胞接着および増殖，④細胞外基質形成， ⑤骨リモデリングの 5 段階であると考えられている[1-11]．材料を生体内に埋植し た時に最初に材料表面に接触するたんぱく質の種類は未だ明らかではないが， 吸着するたんぱく質の種類によって細胞の接着挙動は異なる．例えば，フィブ -6- ロネクチンの吸着した表面には骨芽細胞の接着性は良好であるが，アルブミン の吸着した表面には骨芽細胞は接着しにくい[1-12]．そのため，材料の骨伝導性向 上には，細胞接着性たんぱく質および骨芽細胞が積極的に吸着する表面を創製 することが必要である．また，材料表面に接着した骨芽細胞は，周囲に基質を 産生し，基質にリン酸カルシウムが沈着することで骨組織が形成される．この とき，材料表面のカルシウムやリン成分がアパタイトの析出に寄与するとの報 告もある[1-13][1-14]．このように，医療用インプラントに対する生体組織の反応を 制御する上で，材料表面の性質は非常に重要な役割を担っている． Ti 自体は非常に活性の高い金属種であるため，その表面は通常，空気中の水 分と反応して TiO2 を主成分とする薄い自然酸化皮膜に覆われている[1-15][1-16][1-17]． この酸化皮膜が Ti と生体組織との直接的な接触を防ぐため，活性金属であるに もかかわらず，Ti は良好な硬組織適合性を有する．実際に，生体内に埋植した Ti と骨が強固な結合を呈することが示されている[1-5]．人工股関節や人工膝関節 などの硬組織代替材料に対しては，迅速かつ確実な骨形成が望まれる一方で， Ti 材料表面での新生骨形成には時間がかかるという問題がある．そのため，骨 欠損部などに Ti 材料を埋入した場合，Ti 表面に新生骨が形成し，従来骨との間 で十分な接着強度を獲得するまでに多大な時間を要する．そこで，表面処理に よって金属表面の物理化学的性質を変化させ，新生骨の形成を促進させる試み がなされている．表面処理には，材料全体の力学的性質を変えることなく，表 面の化学的耐久性や機械的耐久性を向上させることができるというメリットが ある． -7- 1. 3. Ti の表面改質プロセス 表面改質は， （１）ドライプロセスと（２）ハイドロプロセスに分けられる． 現在使用されている主なプロセスを Table 1. 4 に示す．一般的なドライプロセス は，主にイオンビームを利用した成膜法であり，蒸着[1-18]，イオンプレーティン グ[1-19][1-20]，スパッタリング[1-21][1-22]などがある．それらのプロセスでは，材料表 面にイオンを衝突させ，表面への付着，スパッタリング，表面への注入のいず れかを起こすことで，原子・分子レベルでの薄膜形成や加工を行うものである． 硬組織適合性向上を目指す場合には，プラズマ溶射による Ti 合金表面へのハイ Table 1. 4 Category Surface modification method for biomaterials. Used process Plasma spray HAp Ti, Ti alloys Hard tissue compatibility Tissue bonding Ion plating HAp Hard tissue compatibility Pulsed laser coating HAp Hard tissue compatibility Sputter deposition TiN TiO2 Corrosion resistance, Abrasion resistance Corrosion resistance Ion implantation Nitrogen Noble metal Ca He Abrasion resistance Corrosion resistance Hard tissue compatibility Blood compatibility Ion mixing Ca CaTiO3 Hard tissue compatibility Hard tissue compatibility Dry process Hydro process Property to improve Anodizing Hard tissue compatibility, Corrosion resistance, Tissue compatibility Deposition of HAp Hard tissue compatibility, Tissue bonding Immersion in alkaline solution Hard tissue compatibility Immersion in H2O2 Hard tissue compatibility Hydrothermal treatment Hard tissue compatibility -8- ドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2, Hydroxyapatite: HAp）の被覆が主流とな っている[1-23][1-24]．また，グロー放電によって得られる低温プラズマを材料表面 に照射することで，自然酸化皮膜ならびに表面汚染物質の除去による表面清浄 化や，炭化物薄膜，窒化物薄膜の形成などの効果が期待できる[1-25][1-26]．ただし， ドライプロセスで使用する装置は，比較的高価なものが多く，また複雑形状材 への適用が難しい場合が多い． 一方，ハイドロプロセスは，水溶液中で行う処理であり，大掛かりな設備投 資を必要とせず，廉価な処理方法である．基本的には水溶液への基材の浸漬， あるいは水溶液中での通電による表面処理法であり，水溶液の組成，pH，温度， 電位，電流密度などを変化させることで多くの方法が考案されている．金属と 水溶液との化学反応を利用した処理方法としては，化成処理[1-27][1-28]，酸エッチ ング[1-29]-[1-33]，過酸化水素浸漬[1-34][1-35]，あるいはアルカリ水溶液中浸漬（＋加熱） [1-36]-[1-38] などがある．水熱処理は，圧力容器内での高温の水蒸気あるいは熱水を 利用したプロセスであり，HAp や TiO2 の合成や結晶化[1-39][1-40]，滅菌処理[1-41]， 有機物の分解・除去[1-42]などに利用される．電気化学的手法としては，陽極酸化 法[1-43]-[1-45]や，カソード電解法[1-46]などが研究されている． 1. 3. 1. 表面形態の制御 材料表面に形成された表面凹凸が材料の生体活性に影響を与えることが報告 されている[1-47]．材料表面に凹凸を導入するための表面処理法として，サンドブ ラスト処理[1-29]-[1-33][1-48]-[1-50]，プラズマスプレー法[1-29]-[1-32][1-49]-[1-51]，酸エッチン グ法[1-29]-[1-33][1-50][1-52][1-53]などがある．材料の表面形態の違いは，表面粗さによっ て定量的に表現される．表面粗さは，JIS によって数種類の表面形状パラメータ が規定されており，定義の仕方によって算術平均粗さ Ra，最大高さ Ry，十点平 均粗さ Rz などがある[1-54]．生体材料の表面形状を表す場合は，局部的な表面凹 -9- 凸よりも表面全体の平均的な粗度が問題となることから，算術平均粗さ Ra が使 用されることが多い． 材料表面に mm オーダーのマクロな表面凹凸が存在すると，材料と骨が機械 的に嵌合し，材料と骨との結合強度が高まることが知られている．また，生体 組織は孔の中に入り込み，溝に配向しやすい[1-55]．これらの表面形状を積極的に 導入するために，プラズマスプレー法を利用したビーズ吹き付けなどが行われ ているが[1-56]，複雑形状を有する材料には全面に均一被覆することが困難なため， 近年では，多孔性表面を作製する手法として，高電圧の陽極酸化による Ti 表面 への多孔性酸化皮膜の形成も行われている[1-57][1-58]．一方で，これらの表面に存 在する μm オーダー以下のミクロな表面凹凸が，生体組織の生物学的反応に影響 することが報告されている．例えば，表面粗さの異なる Ti の陽極酸化皮膜上で は，平滑表面よりも粗雑表面にて多くの細胞が接着することが報告されている [1-59] ．Bigerelle らは，表面凹凸と細胞サイズの大小関係で粗さに対する細胞の挙 動が異なることを報告している[1-60]．すなわち，表面凹凸が細胞サイズより大き い場合，表面凹凸の大きい表面ほど細胞の接着・伸展が良好であり，一方で表 面凹凸が細胞サイズより小さい場合，表面凹凸の小さい表面ほど良好であると されている．In vivo 試験においては，埋植 Ti の粗雑表面には骨が形成するもの の，平滑表面は繊維組織に包まれるという報告がある[1-61][1-62]．このように，表 面粗さと細胞挙動・骨伝導性の関係については多くの報告例があるが，研究者 間で認識が異なっている．この理由の一つには，研究者間で使用する表面形状 パラメータや分析範囲が異なるために，提示されるデータの比較ができず，定 性的な比較に留まっていることが挙げられる．また，表面粗さを付与するため の表面処理によって材料表面の組成が変化するなど，表面性状のみが適切に制 御されていないために，粗さ以外の因子も細胞挙動に影響をおよぼしたことが - 10 - 考えられる． 1. 3. 2. 表面改質層の形成 生体用金属材料に対する表面改質法を，その処理目的ごとに分類したものを Fig. 1. 2 に示す．硬組織適合性を改善するための表面改質層としては，HAp 薄膜 を形成させる場合と，それ以外の硬組織適合表面を形成させる場合で大別でき る． 1. 3. 2. 1. リン酸カルシウム系化合物薄膜 リン酸カルシウム系化合物薄膜の被覆は最も研究されている方法である．リ ン酸カルシウム系化合物は，その Ca/P 比によって種々の塩が存在し，生体用に 用いられる材料としては，HAp，β 型リン酸三カルシウムなどがある．特に，HAp は実用化されており，金属材料表面に HAp をコーティングすると，HAp と生体 の骨組織が容易に結合することが知られている[1-63]．アパタイトの成膜法として Anti-corrosion Chemical Conversion Anodizing Implantation of Noble Metal Ion Wear resistance Formation of TiN Thin Film Implantation of N Ion Hard tissue formation Apatite Coating Immersion Electrochemical Process Mechanical Press Plasma Spray Ion Plating Sputtering Immersion in Alkaline Solution and Heating Immersion in Ca-Containing Solution Implantation of Ca Ion Sputtering Ca and Implantation of Ar Ion Sputtering CaTiO3 and Implantation of Ar Ion Non-Apatite Coating Fig. 1. 2 Surface modifications for metallic biomaterials. - 11 - は，プラズマ溶射法[1-23][1-24]，イオンビームによる手法[1-22][1-64]，水溶液浸漬法[1-65]， 電気化学的手法[1-66][1-67]，機械的圧入法[1-68]などがあり，特にプラズマ溶射法が 工業的には広く用いられている．HAp 薄膜の成膜は，組成の制御が容易である 反面，HAp と金属基材との境界が明瞭であり，結合強度が小さいために界面破 壊の可能性が残るという問題がある[1-69]．さらに，靱性が小さいために，アパタ イト層内での破壊の可能性もある[1-70]．そのため，基材 Ti との密着性の低い HAp 薄膜の代わりに，基材 Ti と密着性の高い陽極酸化 TiO2 皮膜を使用することが検 討されている[1-71]． 1. 3. 2. 2. TiO2 薄膜 Ti は表面を自然酸化皮膜によって覆われているため良好な耐食性を示すが， 生体内の強い腐食環境下では，自然酸化皮膜だけでは十分な耐食性を確保でき ない場合がある[1-72][1-73]．そのため，陽極酸化や大気中高温酸化などの酸化処理 による TiO2 成膜は耐食性向上を目的として行われる場合が多い[1-74][1-75]．一方で， Ti 表面に成膜した TiO2 皮膜の高生体活性化に寄与することから[1-76]，TiO2 皮膜 表面の化学的性質が注目されている． Ti 表面への TiO2 成膜プロセスは，①基材 Ti の一部を TiO2 へと変化させる酸 化法と②基材上に TiO2 を積層させる堆積法に分類でき，前者としては酸化性水 溶液浸漬法[1-35][1-77]，陽極酸化法[1-78]-[1-81]，大気中高温酸化法[1-82]-[1-84]など，後者 としてはゾル‐ゲル法[1-85]，スパッタリング法[1-21][1-22]などがある． Ti 表面に形成する TiO2 皮膜は，その成膜条件によって異なる表面形態・組成， 結晶相を有する．TiO2 の結晶構造は，アナターゼ型，ルチル型，およびブルカ イト型の 3 形態をとりうるが，通常の成膜過程で得られる結晶構造は，アモル ファス状，アナターゼ型，およびルチル型の単相あるいは混合相である[1-86]．Ueda らは，酸化性水溶液中浸漬にて Ti 表面にアモルファス状 TiO2 を形成し，それに - 12 - 水熱処理を施すとことでアナターゼ型 TiO2 を得ている[1-39][1-87]．また，陽極酸化 TiO2 の結晶構造は，印加電圧の上昇に伴いアモルファス状からアナターゼ型， ルチル型へと変化することが知られている[1-86]．これらの結晶構造の違いが，擬 似体液中での HAp 形成能に差を与えることが報告されている[1-88][1-89]．陽極酸化 では，絶縁破壊が生じると，表面形状が顕著に変化し粗雑化する．ゾル‐ゲル 法では，溶液への基材の浸漬時間やその後の加熱温度等にもよるが，膜厚 1 μm 程度の比較的厚く粗い皮膜が形成することが報告されている[1-90]．Das らは，陽 極酸化 TiO2 の形成によって粗雑化した表面において，研磨ままの Ti 表面よりも 細胞の接着性が良好であることを報告している[1-59]．また，TiO2 皮膜の表面組成 は，水溶液からのイオンの取り込み[1-40][1-44][1-78][1-91]，あるいは真空中でのイオン の注入[1-92]によって変化することが知られている．陽極酸化では，形成する TiO2 皮膜中に水溶液中のイオンが混入するため，水溶液としてリン酸や酢酸カルシ ウム溶液などを用い，TiO2 皮膜中にリンやカルシウム取り込むことで．擬似体 液浸漬においてリン酸カルシウムの析出が促進されることが報告されている [1-40][1-44] ．このように，形成する TiO2 皮膜の材料特性がその生体活性に強く影響 する． 生体材料用 Ti への添加元素である Nb，Ta，および Zr などの金属単体は，Ti と同様に，酸化処理により表面に酸化皮膜が形成する[1-93]-[1-95]．Ti 合金に TiO2 を成膜する場合，堆積法では生成する皮膜の性質は基材の影響を受けにくいが， 直接酸化法では合金中の Ti 以外の元素も同時に酸化されて皮膜中に残存する可 能性があり，形成する酸化皮膜の表面性状への影響が懸念される [1-96]-[1-99] ． Kobayashi らは，Ti 表面を Zr で被覆した場合，骨形成が阻害される可能性があ ることを報告している[1-100]．合金元素を含む TiO2 皮膜上において，擬似体液中 で HAp が析出することや[1-101][1-102]，細胞との親和性が良好であることが報告さ - 13 - れているものの[1-99]，これらの報告では粗さやその他の表面組成など種々の生体 活性影響因子が同時に変化しているため，合金成分が実質的に生体におよぼす 影響は明らかではない．一方で，合金の化学組成を利用した TiO2 成膜法も開発 されている．Ni によるアレルギー反応が懸念される Ti-Ni 合金にアノード電解 処理を施すと，Ni が溶液中に優先溶出するため，表面から Ni を除去した TiO2 皮膜を形成することができる[1-103]． このことは，適切な条件を選択することで， 酸化処理を利用した多彩な表面設計が可能であることを示唆している． 1. 3. 2. 3. 生体機能性表面の創製 生体機能性表面の創製は，細胞の機能，接着，分化，リモデリングなどに関 する生化学的知見を元に行われている．表面にペプチド，たんぱく質，あるい は成長因子などを固定化することにより，特定の細胞や組織との反応を促すこ とを目的としている． 材料表面と細胞などの生体組織との親和性を高めるための処理として，生体 活性分子からなる極薄層の形成が行われており，シランコーティング[1-104][1-105]， 光触媒作用 [1-106] ，自己組織化単分子膜 [1-107] ，ならびにたんぱく質の固定化 [1-108][1-109] などの方法がある．これらの手法では，van der Waals 力，疎水性相互作 用，静電引力などの物理吸着現象や，化学結合を利用して材料表面への修飾が 行われている． 1. 3. 3. 表面性状の影響 インプラントの表面性状は，使用される材料の種類，表面組成，結晶構造， 誘電率など，種々の物理化学的性質の影響を複合的に受け，これらのバランス によってその性質が決まる．目的の生体組織への主影響因子のみを最適化する ことが理想的ではあるが，通常の表面処理では特定のパラメータのみを変化さ せることは非常に困難であり，同時並行的に変化する他の影響因子による影響 - 14 - を常に考慮する必要がある．そのため，濡れ性や表面電位などによって表面性 状を包括的に評価されており，特に有機系生体材料の組織適合性には材料の濡 れ性が強く影響することが知られている．ただし，金属材料に対する同様の研 究はあまり進展していない． 有機系生体材料の濡れ性は，一般的に，材料表面に水滴を滴下したときの静 的水滴接触角によって評価されている．濡れ性の異なるポリマー表面における 細胞接着試験結果から，従来は細胞接着には 40～70 (deg.)程度の接触角を示す表 面が最適であると考えられてきた[1-110]-[1-113]．しかし，接触角の程度だけでなく， 官能基の種類も細胞接着性に影響することや [1-114]，基材の影響があることが報 告されており，必ずしも上記の接触角範囲で細胞接着が促進されるわけではな いことが明らかとなってきた．また，たんぱく質の吸着性については，たんぱ く質の種類によって最適な濡れ性が異なること [1-115]，単一種のたんぱく質吸着 と複数のたんぱく質による競争吸着では異なる吸着挙動を示すことなどが示さ れている[1-114][1-116]． 金属 Ti 表面においては，細胞接着性たんぱく質であるフィブロネクチンと細 胞非接着性たんぱく質であるアルブミンの競争吸着において，親水性表面では フィブロネクチンが優位に吸着し，疎水性表面では逆にアルブミンが優位に吸 着することを Wei らは示している[1-116]．動物内埋植試験においても，親水性の 高い表面を有する Ti 材料は，高い骨伝導性を示すことが報告されている [1-117]-[1-119] ．ただし，従来の研究では親水化の過程で表面形状や表面生成物も同 時に変化することから，濡れ性以外の因子が骨伝導性の向上に寄与した可能性 を否定できていない． また，表面改質後の材料表面の性質は，材料の保存環境や取扱い方法によっ て，表面改質処理直後とは異なる表面性状を示す場合がある．生体材料で特に - 15 - 問題となるのが，親水性表面の経時劣化現象である．Att らは，表面処理を施し た Ti において，表面処理後の時間経過とともに，大気中での表面汚染によって 骨伝導性が低下することを報告している [1-120]．表面劣化現象は，インプラント の実用上，重要な問題であるが，今日の研究では専ら，表面改質直後の表面性 状への関心が高く，作製した表面性状を長期間維持する方法についての研究報 告例は多くない[1-53][1-121]． 1. 4. 本研究の目的 前節までに示してきた通り，現在，生体用 Ti 材料のさらなる高生体活性化を 目指した研究・開発が活発に行われている．特に，従来主流であった HAp を形 成させる方法に加え，硬組織に適合するような表面層を形成する方法が検討さ れている．そのためには，生体にとっての異物であるインプラントと生体組織 との良好な界面を創製することが重要であり，生体側の生物学的反応とインプ ラント側の材料特性をマッチさせる必要がある．近年，どのような材料特性が 骨伝導性を促進する効果があるのか，徐々に明らかになりつつあるが，依然と して，材料の表面特性とそれに誘起される生体反応の相互関係には不明な点が 多く，生体活性を制御するための表面設計の指針は定かではない．そのため， 近年，機械的性質に優れた新しい生体用 Ti 合金が続々と開発されている一方で， 個々の材料に適した表面処理法の開発は極めて遅れていると言わざるを得ない． また，生体活性の評価には，実際に生体内に材料を埋植すること（in vivo 試 験）が最も望ましいが，現実的には動物実験の可能な施設が少ないことや，費 用が高いこと，試験が長期間に及びやすいこと，動物愛護などの理由から，よ り簡便な細胞培養やたんぱく吸着試験などの生体外試験（in vitro 試験）に頼る ところが大きい．しかし，現在までに行われてきた in vitro 試験では，in vivo 試 - 16 - 験の結果と必ずしも整合性が得られておらず，生体外評価の方法は確立されて いない． こうした現状を踏まえ，本研究では種々の表面処理を Ti 材料に施し，その表 面形状・性状を制御することで骨伝導に最適な表面の創製を試みた．表面改質 プロセスとして，生体内に近い水溶液環境で複雑形状材にも適用可能な低温プ ロセスであること，ならびに処理条件の選択性が広いことを考慮し，主に陽極 酸化法，水熱処理法を選定した．また，生成する TiO2 皮膜の骨伝導性におよぼ す表面形状・性状の影響が十分に明らかではないことから，表面粗さ，表面組 成，表面親水性などのパラメータを用いて骨伝導性を評価し，骨伝導性におよ ぼす各種表面特性の影響について検討した．これらの工学的評価と in vivo 試験 による生物学的評価を融合し，その結果を表面処理へとフィードバックするこ とで，表面形状・性状の最適化を試みた． 1. 5. 本論文の構成 本論文は 10 章からなり，それぞれの章で取り上げている内容を以下に簡単に 示す． 第１章では，序論であり本論文で取り扱う研究の位置づけを記した． 第２章では，陽極酸化法による表面改質層の作製原理，ならびに本研究で行 った in vivo 試験の概要について述べる． 第３章では，表面改質層の骨伝導性におよぼすミクロレベルの表面粗さの影 響について述べる．表面粗さの異なる陽極酸化 TiO2 皮膜を成膜した Ti 基材を in vivo 試験に供し，表面粗さと硬組織生成量の関係を定量的に評価する．また，陽 - 17 - 極酸化に使用する水溶液種の違いが各陽極酸化皮膜の骨伝導性におよぼす影響 についても検討する． 第４章では，第３章で水溶液種の違いが骨伝導性に影響したことを受けて， 陽極酸化皮膜中に混入する電解質イオン種の違いが骨伝導性におよぼす影響に ついて述べる．異なる電解質イオンを含む種々の水溶液中で Ti に陽極酸化処理 を施すことで，異なるイオン種を酸化皮膜中に導入し，皮膜中に混入する電解 質イオン種の違いが表面親水性および骨伝導性におよぼす影響について検討し つつ，表面親水性と骨伝導性の関係について考察する． 第５章では，皮膜中に混入する電解質イオンの濃度が骨伝導性におよぼす影 響について述べる．リン酸イオンを用いて，電解条件と皮膜中リン酸イオン量 の関係について検討し，皮膜中リン酸イオン量が骨伝導性におよぼす影響につ いて考察する． 第６章では，第４章で考察した表面親水性と骨伝導性の関係を，より広い親 水性領域へと拡張して検討する．超親水性表面を作製するための方法として， 水熱処理を試みるとともに，表面処理後の保存方法を検討し，表面の超親水化 およびその維持に最適な条件を検討する． 第７章では，酸化方法の違いが TiO2 皮膜の骨伝導性におよぼす影響について 述べる．特に TiO2 表面の表面性状に注目し，陽極酸化法と高温酸化法で作製す る TiO2 皮膜の表面組成ならびに表面親水性の違いについて検討し，その違いが 骨伝導性におよぼす影響を明らかにしつつ，骨伝導性の向上に最適な酸化方法 について検討する． 第８章では，使用する基材を純 Ti から Ti 合金へと拡張し，先行して行われた 純 Ti の表面処理が Ti 合金にも適用可能かどうか検討するとともに，純 Ti との 相違点について考察する． - 18 - 第９章では，硬組織適合性制御のための表面改質処理について，本研究で検 討したプロセスの将来展望について述べる． 第１０章では，本論文の結論を述べる． - 19 - 【第１章の参考文献】 [1-1] 角田方衛，筏義人，立石哲也：金属系バイオマテリアルの基礎と応用，ア イシーピー(2000), p. 1. 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Jennissen: Material-wissenschaft und Werkstofftechnik, 41 (2010) 1035-1039. - 28 - 第２章 陽極酸化法による成膜原理と in vivo 試験による 骨伝導性評価 本章では，本論文中での Ti の表面改質に主として用いる陽極酸化法について， 皮膜作製原理と，生成する皮膜の特徴について 2. 1 節で概説する．また，本論 文で行った in vivo 試験の概要ならびに骨伝導性評価方法について 2. 2 節で述べ ている． 2. 1. 陽極酸化皮膜の作製原理 2. 1. 1. 陽極酸化法の概要 陽極酸化法は，金属基材をアノードとして水溶液中で電気分解を行い，金属 表面に酸化皮膜を作製する方法である．陽極酸化に使用する水溶液の種類，濃 度，pH，温度，印加電圧などを変化させることで，形成する酸化皮膜の表面形 態，表面組成，ならびに相の制御が可能である．特に，形成する皮膜内部に水 溶液中のイオンが取り込まれることや，高印加電圧条件では皮膜の絶縁破壊に ともなうスパークが発生することなどの特徴があり，これらを利用した成膜法 が研究されている．陽極酸化法は，ハイドロプロセスであるため，ドライプロ セスとは異なり生体内と似た水溶液環境で比較的安価に成膜できること，基材 と密着性の高い皮膜が作製できること，表面構造と化学的性質がとも変化させ られることなどの利点が挙げられる．ここでは，陽極酸化に関する一般的な説 明と，Ti に対する陽極酸化処理の特徴を概説する． - 29 - 2. 1. 1. 1. 陽極酸化の原理 陽極酸化処理に使用される装置外観を Fig. 2. 1 に示す．外部回路を通じてアノ ード側電極材料（図では Ti）とカソード側電極材料（図では Pt コイル）が電気 的に接続され，ポテンショ・ガルバノスタットによって電圧・電流が制御され る．このとき，必要に応じて参照電極を使用する．電解液は，電極間の電荷移 動経路としての役割があり，水溶液中のイオンが電荷担体となる．スパークが 発生するときは，電解中の浴温を一定に保つために，電解液の入ったビーカー を恒温槽中に浸漬した状態で電解される． 金属表面に陽極酸化皮膜が成長するためには，酸化皮膜内部の電子伝導がほ とんどゼロで，イオン伝導が優先的に起こる必要がある．Al, Ti, Nb, Ta, Zr など Function generator Thermometer Potentiostat Pyrex Beaker Aqueous Solution Epoxy Resin Water Bath W.E. : Ti Fig. 2. 1 Stirring rod C.E. : Pt coil Experimental apparatus for anodizing. - 30 - の第一種バルブメタルの酸化物は電子伝導性がほとんどゼロであり，比較的厚 く酸化皮膜が形成する．一方，Zn, Mo, Cr, Ni などの第二種バルブメタルでは酸 化皮膜は生成するものの，そのイオン伝導性だけでなく電子伝導性も大きいた め，厚く成長しない． 2. 1. 1. 2. 陽極酸化皮膜の成長機構 金属 M にアノード電圧を印加すると，以下の酸化還元反応が生じる． 金属／酸化皮膜界面 酸化皮膜／水溶液界面 （酸性・中性） （アルカリ性） M → M 𝑥+ + 𝑥e (1) 2H2 O → 2O2− + 4H + (2) 2H2 O → O2 + 4H + + 4e (3) OH − → O2− + H + (4) 2OH − → O2 + 2H + + 4e (5) 酸化皮膜内部あるいは表面でM 𝑥+ とO2− が結合すると，酸化物M𝑥 O𝑦 が形成し， 酸化皮膜が成長する． 2M 𝑥+ + 𝑦O2− → 2M𝑥 O𝑦 + 2𝑦H + + 2𝑦e (6) Fig. 2. 2 に陽極酸化による酸化皮膜の成長モデルを示す．生成した酸化皮膜は印 加電圧に対して抵抗膜として働くため，印加電圧の大部分は酸化皮膜両端に印 加され，このとき生じる電場が酸化皮膜成長の駆動力となる．たとえば，Al の 酸化皮膜の成長に必要な電場は 107 V cm-1 程度であると言われている[2-1]．皮膜 内部の電場がイオンを移動させるに十分高くなると，皮膜内部を電流が流れ， 新しく酸化物層が形成される．そのため，酸化皮膜の膜厚は印加電圧の上昇と - 31 - Pure Oxide layer Anion rich layer OHO2- H+ M SO42Mx+ PO43- Electrode metal Fig. 2. 2 Oxide Film Electrolyte Growth model of anodized film. ともに増大する．酸化皮膜／水溶液界面では，O2-だけでなく，その他の電解質 イオンが混入する場合があるため，生成する酸化皮膜は電解質イオンを含む外 層と含まない内層の二層構造を呈する．また，電圧印加中は(2)～(5)式に示すよ うに電極表面で H+が生成しているため，酸化皮膜／水溶液界面では局所的に pH が著しく低下した領域が形成され，H+が皮膜中に侵入するものと考えられてい る[2-2]． 印加電圧をさらに上昇させると，酸化皮膜が高い電圧を支えきれなくなり， 絶縁破壊（ブレークダウン）と呼ばれる皮膜の破壊が生じる．絶縁破壊のモー ドには，破壊伝播型と自己修復型がある．破壊伝播型の場合は破壊が急速に広 がり，大きな破壊痕を残すが，自己修復型の場合は小さな絶縁破壊が生じても すぐに電解作用によって修復され，新しい酸化皮膜が生成するため，大きな破 - 32 - 壊痕は残らない．一旦絶縁破壊が生じると，皮膜内部に生じた欠陥部を電子が 移動するため，(3)式に示すように酸素が発生しやすくなるとともに，基板表面 でスパークが発生するようになり，定電流および定電圧条件下では，酸化皮膜 はそれ以上成長しなくなる．絶縁破壊の生じる電圧は金属ごとに異なり，溶液 の種類および濃度にも大きく依存する．Ikonopisov の研究によれば，絶縁破壊発 生電位 Eb は溶液の比抵抗（ρ）の対数と直線関係にあり，ρ の増大により上昇す る[2-3]． 𝐸b = 𝑎 + 𝑏 log 𝜌 （𝑎, 𝑏は定数） (7) Al，Ti，Nb，Ta などの電極に絶縁破壊発生電圧以上の高電圧を印加すると，電 極表面でスパーク放電が発生し，絶縁破壊前の陽極酸化皮膜とは性質の大きく 異なる皮膜が生成する．発生したスパークは一瞬（10-4－10-3 s）で消滅するが， 放電内部では局所的に温度が 103－104 K，圧力が 102－103 MPa にまで到達し， 特殊なプラズマ反応場が形成され，溶融・急冷によって高温酸化物あるいは複 雑な化合物が生成することが報告されている[2-4]．常温・常圧条件でプラズマ反 応場を形成できることから，陽極酸化におけるスパーク放電を積極的に利用し た処理法が考案されている．スパーク放電を利用した陽極酸化を，英語では特 に Spark anodizing, Micro arc oxidation (MAO), あ る い は Plasma electrolytic oxidation (PEO)と呼ぶことがある．スパーク放電の発生頻度および激しさが増す につれて表面凹凸が激しくなるとともに，皮膜内部にボイドが発生してポーラ ス状の皮膜となる．また，スパーク放電を利用して作製した陽極酸化皮膜は， スパーク放電なしの陽極酸化皮膜と比べて，基材との密着性が向上することが 報告されている[2-5]． - 33 - 2. 1. 1. 3. 電解方式 一般的な電解方式としては，①定電流電解法，②定電位電解法，③昇圧法が ある．定電流電解では，アノード電場を一定に保つように印加される電圧およ び膜厚が時間に比例して増大する．定電圧電解では，皮膜が成長すると皮膜抵 抗の増大により電場が減少するため，電流値は指数関数的に減少し，極めて小 さな値となる．電流値が微小になると実質的には膜厚の増加は停止するため， 最終的な膜厚はアノード電位に比例し，その値は 1.3～1.7 nm V-1 程度であると 言われている[2-6]．昇圧法は，目的の電圧まで一定速度で印加電圧を上昇させる 方法である．定電流あるいは定電圧電解では，急激に電圧が上昇し皮膜が急速 に形成されるため，生成する酸化皮膜の表面が粗雑化しやすいが，昇圧法では 任意の速度で皮膜の形成が可能であるため，表面形状を制御しやすいという利 点がある． 2. 1. 2. Ti の陽極酸化皮膜の成長機構 2. 2. 1. 1. 電流－電圧応答 陽極酸化によって形成される酸化皮膜の膜厚は，電解液の種類や濃度，温度 にもよるが，主として印加電圧の大きさによって決まり[2-7]，電流密度に依存し ないことが知られている．Ti を陽極酸化したときの電流‐電圧応答の一例とし て，Fig. 2. 3 に 0.1 M (= mol dm-3) NaOH 水溶液中に Ti 電極を浸漬し，一定速度 で電圧を上昇させたときの分極曲線を示す．アノードの電圧印加直後は Ti の活 性溶解が生じ，電流密度が上昇すると同時に以下の総括反応により Ti 表面に TiO2 皮膜が形成する． Ti + 2H2 O → TiO2 + 4H + + 4e - 34 - (8) Fig. 2. 3 Current-voltage response in case of anodizing Ti in 0.1 M NaOH aq. at increasing rate of 0.1 V s-1. 電圧印加中は電解液による溶解作用を受けつつ，酸化皮膜の補修および成長が 進行し，膜厚が増加する．10～20 V 付近から，電極表面から酸素が発生し始め るため，電流密度が急激に上昇し始める．これは結晶化に伴って皮膜内部に生 じた微細な割れによるものと考えられている[2-1]．さらに印加電圧を上昇させる と，170 V 付近から皮膜の絶縁破壊にともなうスパーク放電と，電解液による皮 膜の補修作用が交互に生じるため，電流値の振動が観測される．Ti の絶縁破壊 開始電圧は，Al や Ta などの絶縁破壊開始電圧よりも低く，300 V 以下で絶縁破 壊が生じる[2-2]． 2. 2. 1. 2. 酸化物の結晶構造 陽極酸化で生成する TiO2 の結晶構造は，印加電圧の大きさによって変化する． 0 V から電圧を上昇させる場合，最初に生成する TiO2 はアモルファスであり， - 35 - 5 mm Fig. 2. 4 Film colors of Ti samples after anodizing in 0.1 M H2SO4 aq. at the voltage of 10, 20, 40, 60, and 100 V (from left to right). 10 V 以下の電圧でアモルファスから結晶性酸化物への遷移が始まることが一般 的に知られている[2-8]．多くの研究において，印加電圧の上昇とともに，アモル ファス，アナターゼ，ルチルの順に結晶構造が変化することが示されている [2-9]-[2-13] ．このとき生成するアナターゼおよびルチルは皮膜中で微結晶として存 在することが指摘されている[2-2][2-14]．スパーク放電を伴う陽極酸化では，TiO2 の高温安定相であるルチルが生成しやすいが，水溶液の種類ならびに印加電圧 によってはチタン酸カルシウムやチタン酸アルミニウムが生成することが報告 されており，水溶液成分との化合物を作製することも可能なことが示唆されて いる[2-15][2-16]． 2. 2. 1. 3. 酸化皮膜の膜色 Ti の陽極酸化皮膜を目視によって観察した色彩は，スパーク発生電圧以下の 電圧では光の干渉作用にもとづくゴールド，青，赤紫，緑などの色彩を呈し， それ以上の電圧で電解した場合は灰色系となる[2-2]．Fig. 2. 4 に干渉色を呈する 酸化皮膜の表面写真を示す．この色調は膜厚の上昇に伴って変化するため，印 加電圧を制御することで色彩の制御が可能であり，例えば Table 2. 1 に示すよう - 36 - Table 2. 1 Relationship between anodizing voltage, film thickness, and film color of TiO2 [2-7]. Anodizing voltage / V Film thickness / nm Color 10 32.7 ± 1.0 Gold 15 42.5 ± 0.8 Copper 20 51.3 ± 0.6 Blue-purple 30 82.0 ± 0.7 Blue 40 97.1 ± 1.3 Light blue 50 109.3 ± 2.8 Green 60 121.1 ± 2.7 Yellow 80 134.0 ± 2.5 Rose に変化する[2-7]．皮膜の膜色と印加電圧に相関関係があることから，膜色から膜 厚をある程度推定することが可能である． 2. 1. 1. 4. 電解液の種類・濃度の影響 Ti の陽極酸化に使用する電解液としては，酸性，アルカリ性水溶液がよく使 用 さ れ て い る ． 酸 性 水 溶 液 と し て は ， H2SO4[2-18][2-19] ， H3PO4[2-18][2-19][2-20] ， CH3COOH[2-18][2-19]，あるいはこれらの塩類を主成分とした水溶液[2-22][2-23]，アル カリ性水溶液としては，NaOH[2-24]などが多く使用されており，使用される水溶 液のアニオン・カチオンが皮膜中に混入することが報告されている．また，フ ッ化物イオンを含む水溶液を用いた場合は，通常の緻密なバリヤー型酸化皮膜 ではなく，ナノチューブ型酸化皮膜が成長し，そのチューブ長さは水溶液の pH に依存することが報告されている[2-22][2-25]．ただし，表面形状は異なっても，Fig. - 37 - Electrode potential, E / V vs. SHE 2.0 b 1.0 TiO2 a 0 -1.0 Ti2+ Ti2O3 TiO Ti -2.0 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 pH Fig. 2. 5 Potential-pH equilibrium diagram for titanium at 298 K, [Ti2+] = 1.0×10-6 [M].[2-17] 2. 5 に示す Ti の電位‐pH 図[2-17]からも分かるように，基本的にはどの pH にお いても Ti 表面には TiO2 が形成する．使用する水溶液の濃度については，pH に 関わらず濃度が高いほど酸化皮膜の形成速度が低下することが報告されている [2-26][2-27] ．絶縁破壊開始電圧は水溶液中のアニオンの種類，濃度，温度，および 水溶液の pH に依存することが知られている[2-28]．同じ種類および濃度の水溶液 を使用しても，印加電圧の大きさによって酸化皮膜中に混入する電解質イオン の量は異なり，その量はスパーク放電発生電圧以上で急激に増加することが報 - 38 - 告されている[2-29]． 2. 2. 骨伝導性評価方法 2. 2. 1. 試験条件の選定 骨伝導過程は，第１章で述べたように，①たんぱく質吸着，②細胞誘引，③ 材料表面での細胞接着および増殖，④細胞外基質形成，⑤骨リモデリングの順 に進行するものと考えられている．たんぱく吸着や細胞接着過程の評価には， 細胞培養などの in vitro 試験が行われ，実際の生体内での骨形成反応まで評価す るには，in vivo 試験が行われる．表面改質の効果は，骨形成の初期段階に対し て，すなわちたんぱく質吸着，細胞接着，新生骨の形成などの生体反応に対し て適用され，それ以降の骨成長過程への寄与は少ないものと考えられる．本研 究では，Ti 材料に対する表面改質が，新生骨の形成しやすさにおよぼす影響を 解明するために，比較的短い埋植期間での in vivo 試験によって骨伝導性評価を 行った． In vivo 試験では，対象動物種やその年齢，埋入部位，さらには定量化の手法 も多岐にわたる．試験物質の臨床応用までの過程として，まずは小型のマウス やラットなどでの試験が行われ，徐々にビーグル犬などの大型動物へと試験段 階が移行し，最終的にはそれまでの試験結果を踏まえて，ヒトへの臨床応用が 行われる．また，埋植部位によって骨組織およびインプラントへの力学的負荷 は異なる．本研究は基礎研究の段階であること，Ti の表面処理材が人工股関節 や人工膝関節など，比較的負荷の高い箇所に使用されることを踏まえ，実験動 物としてラットを選定し，その脛骨骨幹部に埋植することとした．過去の研究 にて 14 d の埋植で骨伝導性を評価するに十分な量の骨が形成することがわかっ ているため[2-30]，埋植期間としては 14 d を選定した． - 39 - (a) (b) Ti substrate Ti substrate 100 μm Fig. 2. 6 Cross-sectional light microscope images of (a) Ti-implanted bone part and (b) bone-implant interface (enclosed area with red broken line in (a)) at 14 d after implantation. 評価方法としては，組織観察による生物学的評価と，引抜き試験，ねじり試 験などの力学的評価の 2 種類があるが，力学的評価では皮質骨部と海綿骨部を 分けて評価できないために，本研究では組織観察によって評価した．Fig. 2. 6 に， 光学顕微鏡による骨‐インプラント界面の組織観察写真を示す．骨は硬組織と 軟組織で形成されているが，硬組織生成量が骨伝導性の指標となるため，イン プラントと骨の接触部位における硬組織の割合，すなわち「骨‐インプラント 接触比（RB-I）」を， 𝑅B−I (%) = Total length of Hard Tissue Contact × 100 Total length of Bone Contact (9) と定義し，RB-I の値を用いて骨伝導性を評価した．RB-I が高いほど，骨伝導性が - 40 - 良好であることを意味している． 2. 2. 2. 実験方法 本研究の in vivo 試験は，いずれも以下の要領に従って行った． 埋植用基材としては，丸棒材（2×5 mm）を用い，その側面に表面処理を施 し，試料作製後 1 週間以内に埋植を行った．施した表面処理については，各章 にて詳述する．すべての試料を蒸留水で洗浄し，グルコン酸クロルヘキシジン 溶液に浸漬させて消毒した．被検体には 10 週齢の雄性の Sprague-Dawley ラット （日本チャールス・リバー（株））を用いた．まず，脛骨骨幹部において，低速 回転ドリルにて骨を貫通しないように試料の直径よりわずかに大きい穴を開け， 試料を皮質骨と海綿骨に接触するように挿入し，皮下組織および皮膚を縫合し た後，消毒した．埋植 14 d 後，埋植した試料をその周辺の組織ごと取り出し， 10%中性緩衝ホルマリン液に固定し，エタノールにて脱水処理後，メチルメタク リレートにて包埋した．その後，各試料を骨の長軸方向に 20 μm の厚さまで切 断・研磨後，トルイジンブルーにて組織染色を行ったものを組織観察用の標本 とした． 作製した標本の骨‐インプラント界面の観察には光学顕微鏡を用いた．(7)式 にて定義した RB-I を皮質骨部，海綿骨部に分けて算出した．骨‐インプラント接 触率の有意差は，多群間検定に使用できる Tukey-Kramer 検定[2-31]を用いて統計 的に分析し，p < 0.05 で判定した．本動物実験は，すべて AAALAC インターナ ショナル（国際実験動物管理公認協会）の施設にて行った． - 41 - 【第２章の参考文献】 [2-1] 春山志郎：表面技術者のための電気化学 [2-2] （社）表面技術協会編：表面技術便覧 第 2 版，丸善 (2005) p. 270. 初版，日刊工業新聞社 1998. 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Kramer: Biometrics 12 (1956) 307-310. - 43 - 第３章 ミクロレベルの表面粗さが骨伝導性におよぼす影響 3. 1. 緒言 Ti は優れた耐食性および生体適合性を有することから，歯科用・外科用イン プラント材として広く使用されており，上顎や股関節での長期間の使用にも十 分耐え得ることが報告されている[3-1][3-2]．しかし，埋植部位の骨質が低下してい る場合，インプラント材表面に骨が生成しにくく，固定した部位に緩みが生じ ることがあることから[3-3][3-4]，骨生成能力の低い患者においても，短い期間で十 分な量の骨がインプラント材表面に生成するように，様々な表面処理法が検討 されている．酸化処理によって Ti 表面に生成する TiO2 皮膜は，耐食性向上に寄 与するだけでなく，生体内環境において骨類似アパタイトの生成を促進する性 質を有しており[3-5]，その化学的性質が生体活性におよぼす影響が注目されてい る．また，表面改質層の化学的性質とは別に，マクロおよびミクロな表面凹凸 が材料の生体活性に影響し，特にミクロな表面凹凸は細胞の接着，伸展，分化 など，骨伝導の初期過程に影響することが知られている[3-6]-[3-9]．一方で，成膜し た TiO2 皮膜の化学的性質および表面形状が骨伝導性におよぼす影響について， その相互関係は十分に明らかとはなっていない．そこで本章では，陽極酸化法 を用いて，Ti 表面にミクロレベルで表面粗さを制御した TiO2 コーティングを作 製し，ラット脛骨における埋植試験の結果を元にして，ミクロレベルの表面粗 さが TiO2 コーティング材の骨伝導性に与える影響を評価した． - 44 - 3. 2. 実験方法 3. 2. 1. 前処理 工業用 Ti（cp-Ti）の板材（表面積 1.13 cm2）および棒材（2×5 mm）を，そ れぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．SiC エメリー紙 （#120, #220, #440）による機械研磨および粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いたバ フ研磨によって，基材の表面粗さを制御した．in vivo 試験用の基材は，基材の 長軸方向に研磨処理を施した．研磨後は，基材表面を蒸留水で洗浄し，エタノ ールで脱脂した後，表面の水溶液と接する部分以外をエポキシ樹脂あるいはシ リコーンシーラントで被覆し，陽極酸化処理に供した． 3. 2. 2. 陽極酸化処理 Ti 基材を作用極，Pt コイルを対極とし，2 極法で陽極酸化処理を施した．水 溶液には，一般的に Ti の陽極酸化に用いられている 0.1 M H2SO4, 0.1 M H3PO4 および 0.1 M NaOH 水溶液を用いた[3-10][3-11]．電圧印加中は，一定速度にて水溶 液を撹拌し，恒温槽中にて 298 K 一定に保持した．電圧を急速に印加すると， 皮膜の表面粗さを制御することが困難なため，本研究では，0.1 V s-1 にて電圧を 印加し，最大 200 V まで印加した．作製した試料は，いずれも 394 K で 20 min. オ ートクレーブ滅菌処理を施した後，各種分析ならびに in vivo 試験に供した． 3. 2. 3. 表面分析 走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000，日本電子および S-4800， HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し，薄膜 X 線回折装置（XRD；XRD6100， 島津製作所）および X 線光電子分光装置（XPS；ESCA-3300，島津製作所）に て，皮膜の同定および表面分析を行った．共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500，オ リンパス）を用いて表面粗さ（分析範囲 150 μm×112 μm）を測定し，局所的な - 45 - 傷の影響を受けにくい算術平均粗さ Ra にて評価した． 3. 3. 結果および考察 3. 3. 1. 酸化皮膜の性質 陽極酸化前後の Ti 基板の表面 SEM 写真を Fig. 3. 1 に示す．バフ研磨を施した 基板表面には研磨傷は認められず，表面粗さ Ra/μm = 0.057 であったが（Fig. 3. 1(a)），#400 のエメリー紙で研磨した基板表面には一定方向への研磨傷が観察さ れ，Ra/μm = 0.225 であった（Fig. 3. 1(b)）． 0.1 M H2SO4 水溶液中で陽極酸化を施すと，基材の表面粗さに関係なく，TiO2 皮膜が生成した（Fig. 3. 2(a)）．印加電圧が 100 V 以下の場合，基材表面にアナ ターゼが生成し，その皮膜中には SO42-が含まれていた（Fig. 3. 3(a)）．作製した 皮膜は，黄色の干渉色を呈し，膜厚は約 120 nm と推定された[3-12]．バフ研磨を 施した Ti 試料を陽極酸化した場合，表面の大部分が研磨ままの Ti 試料と同等の 平滑表面を維持していたものの，所々小さな凹凸が存在し，Ra/μm は 0.057 から 0.084 へとわずかに上昇した．#400 研磨を施した Ti 試料を陽極酸化した場合， 研磨ままの Ti 試料と同様の研磨傷が表面に存在し，陽極酸化の前後で Ra はほ とんど変化しなかった．これは印加電圧が 100 V 以下の場合には，初期表面形 状を維持したまま TiO2 の成膜が可能であることを意味する．一方，バフ研磨お よび#400 研磨を施した Ti 試料に 200 V まで電圧を印加すると，いずれの試料に おいても膜厚が増加し，陽極酸化前後で表面形状が変化した．すなわち，バフ 研磨を施した試料を 200V まで電圧を印加すると，100 V 印加時に所々存在して いた凹凸の量が増加するとともに，微小な孔が生じ，Ra/μm は 0.110 まで上昇し た．#400 研磨を施した試料に 200 V まで電圧を印加すると，研磨傷は確認でき - 46 - (a) (1) 2 μm (2) Ra/μm = 0.057 (4) 0.084 (3) 0.082 (5) 0.110 (b) (1) (2) 0.225 (6) (7) 0.114 (4) 0.177 (3) 0.130 (6) 0.200 (5) 0.211 0.092 0.258 (7) 0.251 0.284 Fig. 3. 1 SEM images of a substrate surface of an as-polished Ti sample, and after anodizing with surface roughness of Ra: (a) buffed sample, (b) polished with grid number = #400, (1) as-polished, (2) anodized in H2SO4 at 100 V, (3) anodized in H2SO4 at 200 V, (4) anodized in H3PO4 at 100 V, (5) anodized in H3PO4 at 200 V, (6) anodized in NaOH at 80 V, and (7) anodized in NaOH at 200 V. - 47 - (a) anatase 8000 6000 rutile 200 V 4000 100 V 2000 0 Intensity (cps) (b) anatase 800 600 rutile 200 V 400 100 V 200 0 (c) anatase 10000 rutile 200 V 5000 0 24 80 V 25 26 27 2θ (degree, CuKa) 28 29 Fig. 3. 2 XRD patterns of Ti substrates after anodizing at room temperature in (a) 0.1 M H2SO4, (b) 0.1 M H3PO4, and (c) 0.1 M NaOH aq. - 48 - S 2p Intensity (a.u.) (a) 175 (b) 170 165 160 135 130 125 Intensity (a.u.) P 2p 140 (c) Intensity (a.u.) Na 1s 1080 1075 1070 Binding energy, Eb /eV 1065 Fig. 3. 3 High-resolution XPS spectra of the titanium substrate anodized at 100 V in: (a) 0.1 M H2SO4, (b) 0.1 M H3PO4, and (c) 0.1 M NaOH aq. - 49 - Current density, i/A cm-2 10 0 NaOH 10 -1 10 H2 SO4 -2 H3 PO4 10 -3 10 -4 0 100 Anodizing voltage, E/V 200 Fig. 3. 4 Change in current density with applied voltage to Ti substrates in 0.1 M H2SO4, 0.1 M H3PO4, and 0.1 M NaOH aq. at 298 K. なくなるが，皮膜全体に微小な孔が生じ，Ra は上昇した．これらの皮膜表面の 変化は，いずれも電圧上昇にともなう絶縁破壊の発生によるものと考えられる． Fig. 3. 4 に皮膜作製時の印加電圧と電流密度の関係を示す．170 V 以上の電圧 を印加すると，比較的高い電流密度領域において，絶縁破壊の発生による電流 値の変動が認められ，さらに印加電圧を上昇させるとアナターゼのピークが高 くなり，わずかにルチルが生成することが分かる（Fig. 3. 2(a)）． 0.1 M H3PO4 および 0.1 M NaOH 水溶液中でそれぞれ 100 V および 80 V まで電 圧を印加すると，0.1 M H2SO4 水溶液中で陽極酸化した場合と同様に，いずれも 黄色の干渉色を呈するアナターゼ型 TiO2 皮膜が生成し，研磨ままの Ti 試料と同 程度の表面粗さを示した．これらの皮膜中には，水溶液中のアニオンおよびカ チオンがそれぞれ含まれていた（Fig. 3. 3(b), (c)）．200 V まで電圧を印加すると， - 50 - 0.1 M H2SO4 水溶液で陽極酸化した時と同様に，表面に孔が生じ，初期表面形状 を維持することができなかった．また，本研究と同様に，H2SO4 および H3PO4 水溶液を用いた陽極酸化にて同様の酸化皮膜が得られることが，Cui ら[3-13] や Kuromoto ら[3-14]によって報告されている． 以上の結果から，印加電圧を変化させることで，TiO2 コーティング材の表面 粗さおよび表面形状を制御できることが分かる．すなわち，100 V 程度まで電圧 を印加した場合には，初期表面粗さに関係なく，陽極酸化前後で表面形状およ び表面粗さはほとんど変化しないが，200 V まで電圧を印加した場合には，どの 水溶液種を用いても，陽極酸化前後で表面形状は大きく変化し，初期表面粗さ を維持することはできなかった． 一般的に，TiO2 皮膜のアパタイト形成能および骨伝導性に影響を与える因子 として，TiO2 皮膜の膜厚や結晶構造が挙げられる[3-11][3-13][3-15]．そこで，膜厚お よび結晶の影響を除外するために，in vivo 試験に供する陽極酸化試料は，すべ て膜厚約 120 nm とし，アナターゼ型 TiO2 を成膜し，表面粗さならびに含有イオ ン種のみ変化させることとした．以上の点を考慮し，in vivo 試験への供試材と しては，表面粗さの異なる研磨ままの Ti 試料，ならびにそれらを 0.1 M H2SO4 および 0.1 M H3PO4 水溶液中にて 100 V まで，0.1 M NaOH 水溶液中にて 80 V ま で陽極酸化したものを選定した． 3. 3. 2. 骨伝導性評価 Fig. 3. 5 に表面粗さ Ra と骨‐インプラント接触率 RB-I の関係を示す．皮質骨 部(1)では，Ra の値に関係なく，研磨ままの Ti 試料はいずれも 20%以下の低い RB-I 値を示した． 0.1 M H2SO4 水溶液中陽極酸化材の場合，Ra/μm > 0.3 では表面 粗さが増加しても RB-I 値はほとんど変化せず，20%程度であったが，Ra/μm < 0.3 - 51 - n= (1) 5 6 6 4 3 6 5 6 * * 40 Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) (2) 6 4 3 6 * 5 4 5 5 * * * 20 0 * 40 in natural bone 20 0 0 0.5 1.0 1.5 Average roughness, Ra/μm Fig. 3. 5 Influence of the surface roughness, Ra, on the bone-implant contact ratio, RB-I: (1) cortical bone part, and (2) cancellous bone part. Key: = as-polished, anodized in 0.1 M H3PO4, and = 0.1 M H2SO4, = = 0.1 M NaOH, sample volume (n) = 3～6, *: p < 0.05. - 52 - では 40%程度の高い RB-I 値を示した．この結果は，0.1 M H2SO4 を電解液として 用いた場合だけではなく，0.1 M H3PO4 および 0.1 M NaOH 水溶液を用いた場合 でも同様の傾向が認められた．さらに海綿骨部においても，皮質骨部と同様に， 平滑表面（Ra/μm < 0.3）にて TiO2 コーティングを施した場合のみ RB-I 値が増加 する傾向が認められた．ただし，使用した水溶液種によって Ra/μm < 0.3 の TiO2 皮膜の RB-I 値は異なり，NaOH を使用した場合の RB-I 値は，皮質骨部，海綿骨部 ともに H2SO4 および H3PO4 を使用した場合よりも低い傾向が認められた． Kuroda ら[3-16]によると，針状結晶で構成された HAp コーティング材の皮質骨 部における RB-I 値は 34%であり，本研究で作製した Ra/μm < 0.3 の TiO2 コーティ ング材は，これと同等の高い骨伝導性を有することが分かる．また，海綿骨に おける RB-I の健常値は，海綿骨内部の硬組織生成量の測定から約 30%であると 推定したが，0.1 M H2SO4，0.1 M H3PO4 水溶液中で作製した Ra/μm < 0.3 の平滑 な TiO2 コーティング材の RB-I 値は 30%以上であり，海綿骨部においても十分な 量の硬組織が生成していることが分かる．このように，ミクロレベルの表面粗 さが TiO2 コーティング材の骨伝導性に影響することが明らかとなり，骨形成に 最適な表面処理を行うには，粗雑な TiO2 表面よりも平滑な TiO2 表面の方が有効 であることが，本研究の結果から十分推察できる．ただし，この in vivo 試験の 結果を十分に説明しうる in vitro 結果を示していないため，本質的な原因は明確 にはなっていない． 3. 4. 小括 本章では，ミクロレベルの表面粗さが陽極酸化処理を施した Ti の骨伝導性に 与える影響について考察し，以下の知見が得られた． - 53 - 1) Ti 基材を 0.1 M H2SO4 および 0.1 M H3PO4 水溶液中で 100 V まで，0.1 M NaOH 水溶液中で 80 V まで電圧を印加すると，いずれもアナターゼ型の TiO2 皮膜 が生成した．これらの陽極酸化皮膜の表面粗さおよび表面形状は，陽極酸化 前後でほとんど変化せず，研磨ままの Ti 試料と同程度であった． 2) Ra/μm < 0.3 の平滑表面を有する場合，陽極酸化を用いて TiO2 コーティング を施すことで，Ti 試料の骨伝導性は大きく向上した． 3) Ra/μm > 0.3 の粗雑表面を有する場合，TiO2 コーティングを施しても Ti 試料 の骨伝導性は向上せず，研磨ままの Ti 試料と同程度の低い骨伝導性を示し た． - 54 - 【第３章の参考文献】 [3-1] R. 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Ichino and M Okido: Materials Transactions, 47 (2006) 1391-1394. - 56 - 第４章 表面改質層に混入する溶質イオン種の影響 4. 1. 緒言 陽極酸化法にて Ti 基板上に TiO2 を成膜する場合，酸化皮膜の成長とともに皮 膜内部に種々の溶質イオンが混入することが知られている[4-1][4-2]．第３章におい て，陽極酸化に使用する水溶液種が異なる場合，表面粗さ，膜厚，結晶構造の 同じ陽極酸化 TiO2 が成膜される場合においても，その骨伝導性に差が認められ ることから，TiO2 皮膜中に混入する溶質イオン種の違いが骨伝導性に影響する ことが懸念された． これらのイオンが皮膜の最外層に存在する場合，溶質イオンの種類によって そのサイズ，荷電状態などが異なるため，皮膜は異なる親水性を示す可能性が ある．材料表面の親水性は，第１章でも述べたように，骨伝導過程においてき わめて重要なたんぱく吸着・細胞接着に影響するものと言われている．その一 方で，材料表面の親水性と in vivo 試験での硬組織生成量の関係を調べた例は多 くなく，表面親水性と骨伝導性との定量的関係は未だ明らかではない．そこで 本章では，異なる溶質イオン種を含有する種々の水溶液中で Ti を陽極酸化する ことで，選択的に溶質イオンを皮膜中に取り込み，骨伝導におよぼす影響を検 討するとともに，溶質イオンの混入が表面親水性におよぼす影響ついて検討し， 表面親水性と骨伝導性の関係を定量的に評価した． - 57 - 4. 2. 実験方法 4. 2. 1. 前処理 工業用 Ti（cp-Ti）の板材（表面積 1.13 cm2）および丸棒材（2×5 mm）を， それぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．これらを SiC エメリー紙で一定方向に湿式研磨した後，粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いてバ フ研磨を行い，基材の表面粗さを一定とした．研磨後は，基材表面を蒸留水で 洗浄し，エタノールで脱脂した後，表面以外をエポキシ樹脂あるいはシリコー ンシーラントで被覆し，陽極酸化処理に供した． 4. 2. 2. 陽極酸化処理 Ti 基材を作用極，Pt コイルを対極とした 2 極法にて陽極酸化処理を施した． 陽極酸化処理に使用した水溶液種，ならびにその他の陽極酸化条件を Table 4. 1 に示す．印加電圧を 0 V から 0.1 Vs-1 にて上昇させ，所定の電圧に到達した後， ただちに水溶液中から試料を取り出し，蒸留水にて洗浄し，エアブロワーにて 表面の水滴を除去した．表面の化学的性質に対する膜厚の影響を除外するため に，すべての水溶液種において，黄色の干渉色を呈する膜厚 120 nm 程度の陽極 酸化皮膜となるように最終印加電圧を決定した．電圧印加中は一定速度にて水 溶液を撹拌し，恒温槽中にて 298 K 一定に保持した．作製した全ての試料をオ ートクレーブ滅菌器内で 394 K にて 20 min.滅菌処理した後，各種分析評価なら びに in vivo 試験に供した．以降，各陽極酸化処理材は，使用した水溶液の種類 によって Table 4. 1 に示す略称で記す．また，以降の図中で使用するアルファベ ット記号は，Table 4. 1 におけるアルファベット記号と対応させている． - 58 - Table 4. 1 Anodizing conditions of the Ti substrates for forming anatase-type TiO2 films with a thickness of ca.120 nm. Anodizing conditions Denotation Electrolyte Concentration /M pH Applied voltage /V (a) SA H2SO4 0.1 1.0 100 (b) PA H3PO4 0.1 1.6 100 (c) LA CH3CH(OH)COOH 0.1 2.3 70 (d) SaA C6H4(OH)COOH 0.013 2.6 75 (e) AA CH3COOH 0.1 2.9 70 (f) NS Na2SO4 0.1 6.3 65 (g) NP Na2HPO4 0.1 9.0 70 (h) MO Mg(OH)2 0.0002 10.1 150 (i) NH NH3 0.1 11.1 80 (j) CO Ca(OH)2 0.02 12.2 70 (k) KO KOH 0.1 12.8 80 (l) NO NaOH 0.1 13.3 80 - 59 - 4. 2. 3. 表面分析 走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000，日本電子および S-4800， HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し，薄膜 X 線回折装置（XRD；XRD6100， 島津製作所）にて生成物の結晶構造の同定を行い，さらに X 線光電子分光装置 （XPS；ESCA-3300，島津製作所）にて皮膜表面の定性および定量分析を行った． 共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500，オリンパス）を用いて算術平均表面粗さ Ra （分析範囲 150 μm×112 μm）を測定した．表面の親水性については，動的接触 角計（FTA100B，ジャスコインターナショナル）を用いた静的水滴接触角測定 により評価した．オートクレーブ滅菌の 24 h 後に，1 つの試料につき 3 ヶ所に おいて 2 μL の水滴と試料との接触角を測定し，その平均値を静的水滴接触角と して使用した． 4. 3. 結果および考察 4. 3. 1. 酸化皮膜の性質 Fig. 4. 1 に陽極酸化試料の XRD パターンを示す．陽極酸化前後の試料表面の SEM 像を Fig. 4. 2 に示す．Fig. 4. 3 では，無機水溶液中陽極酸化試料について， 陽極酸化に使用した水溶液中のアニオン・カチオンの主要構成元素の XPS スペ クトルを示す．Fig. 4. 4 に，有機酸性水溶液中で陽極酸化した試料の FT-IR スペ クトルを示す．これらのデータに加えて，TiO2 の結晶構造，膜色，Ra，ならび に XRD パターン中の 2θ = 25.2 (deg.)におけるアナターゼに起因するピークの半 値幅（以下，単に「半値幅」と称する）を Table 4. 2 に示す． 最終印加電圧は，陽極酸化処理に使用した水溶液種によって異なるが，いず れの水溶液を使用した場合でも膜厚の等しい陽極酸化皮膜が生成した．これら - 60 - (a) Intensity (a. u.) (e) (g) (j) 20 30 40 2θ (deg., CuKα) 50 60 Fig. 4. 1 XRD patterns of :(a) Specimen SA, (e) Specimen AA, (g) Specimen NP, and (j) Specimen CO. Key: O = αTi, and = anatase. - 61 - Table 4. 2 Surface roughness, Ra, and FWHM values of the anodized specimens. (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) (l) SA PA LA SaA AA NS NP MO NH CO KO NO Crystal structure Anatase-type TiO2 Denotation Film color Ra/μm FWHM /deg. Yellow (film thickness: c.a.120 nm) Film preoperties 0.08 0.08 0.10 0.10 0.11 0.08 0.08 0.08 0.10 0.10 0.10 0.09 0.98 1.14 0.92 1.07 1.06 1.15 1.00 0.92 1.04 0.95 0.99 0.86 - 62 - (a) (c) (e) (i) (l) 5 mm (f) (m) Fig. 4. 2 Surface SEM images of: (a) Specimen SA, (c) Specimen LA, (f) Specimen AA, (f) Specimen NS, (i) Specimen NH, (l) Specimen NO, and (m) an as-polished Ti specimen. - 63 - (a) (b) Intensity (a.u.) S 2p 170 160 140 Binding energy, Eb / eV (f) 1070 (g) 1060 170 160 P 2p Na 1s 1080 140 1070 (j) Mg 2s (h) 60 50 130 Ca 2p 360 40 (l) K 2p 300 130 S 2p Na 1s 1080 (k) P 2p 290 350 Na 1s 1080 1070 1060 Fig. 4. 3 XPS spectra of: (a) Specimen SA, (b) Specimen PA, (f) Specimen NS, (g) Specimen NP, (h) Specimen MO, (j) Specimen CO, (k) Specimen KO, and (l) Specimen NO. - 64 - Transmittance (%) (c) 90 (d) 80 (e) 2000 1800 1600 1400 1200 Wavenumber, K / cm Fig. 4. 4 1000 -1 FT-IR spectra of: (c) Specimen LA, (d) Specimen SA, and (e) Specimen AA. の陽極酸化皮膜は，使用した水溶液種に依存せず，いずれもアナターゼ単相の 酸化皮膜であり（Fig. 4. 1），その半値幅はほぼ同程度を示した（Table 4. 2）．こ れらの陽極酸化皮膜の表面粗さは Ra/μm = 0.1 程度であり，陽極酸化処理後も研 磨まま材と同様の平滑表面を維持することがわかる（Table 4. 2, Fig. 4. 2）．SO42あるいは PO43-を含む無機酸性水溶液（Fig. 4. 3(a)および(b)）あるいは中性水溶 液中（Fig. 4. 3(f)および(g)）で Ti を陽極酸化した試料を XPS にて分析すると， 水溶液中のアニオンに起因する S 2p ピークあるいは P 2p ピークが検出され，皮 膜中に各水溶液中のアニオンが含有されていることが確認された．また，陽極 酸化時の中性水溶液（Fig. 4. 3(f)および(g)），あるいはアルカリ性水溶液中（Fig. 4. 3(h), (j), (k)および(l)）に Mg2+, Ca2+, K+, あるいは Na+が含まれている場合にも， 各陽極酸化試料の XPS スペクトルから，皮膜中に各カチオンが含まれているこ とが確認された．Yamamoto と Baba によれば[4-4]，IR バンドにおいてカルボキシ ル基の吸収は 1560 cm-1 および 1460 cm-1 付近で認められており，本研究で分析し - 65 - た有機酸中陽極酸化試料の中では，SaA 試料のみカルボキシル基の IR 吸収が認 められ，皮膜中にアニオンが含まれていることが確認された．ただし，使用し た水溶液種によって皮膜中へのアニオン・カチオンの混入しやすさは異なるも のと考えられるが，各陽極酸化皮膜の膜厚および表面粗さが一定となるように 酸化条件を決定しているため，本研究で作製した皮膜中のアニオン・カチオン 濃度については制御しておらず，その影響については議論できない． 4. 3. 2. 表面親水性 Fig. 4. 5(1)に，各陽極酸化試料における静的水滴接触角を示す．各試料表面に おける水滴接触角は，陽極酸化処理に使用した水溶液種ごとに異なる値を示し た．ただし，いずれの試料においても，測定点ごとの接触角の誤差は± 6 (deg.) 以内と小さく，以降の議論に影響するものではなかった．陽極酸化処理に使用 した水溶液の pH によって試料表面での接触角は異なり，pH < 3 の酸性水溶液を 使用した場合は pH が低くなるほど，pH > 12 のアルカリ性水溶液を使用した場 合は pH が高くなるほど，それぞれ陽極酸化後の接触角は低下する傾向を示した． ただし，3 < pH < 12 の中性水溶液を使用した場合，pH に関係なく，接触角は一 定の値を示した．陽極酸化試料の中で，SA, PA,および NO がその他の陽極酸化 試料よりも低い接触角を有することから，これらの試料の陽極酸化皮膜中に含 まれる溶質イオン（SO42-, PO43-, Na+）が接触角に強く影響したことが推測される． しかし，SO42-および Na+の両方を皮膜中に含有するにもかかわらず，NS 試料表 面における接触角は，SO42-のみを含有する SA および Na+のみを含有する NO よ りも高い値を示した．このことは，NP においても当てはまる．さらに，SA あ るいは PA 以外の陽極酸化試料の接触角は，皮膜中に含まれる溶質イオン種に関 係なくいずれも高い値を示すことから，これらの皮膜中に存在する溶質イオン - 66 - Water contact angle, θ (deg.) (1) (2) 100 80 e d a f i j 20 k l b 0 50 Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) h 40 a 40 (3) g c 60 ** * * * * * ** *** * * * * * b 30 l 20 k c f e 10 g h i j d 0 40 a 30 b c d f e 20 g h jk 10 0 l i 0 5 10 pH Fig. 4. 5 Relationship between (1) pH and WCA, (2) pH and RB-I values in the cortical bone part and (3) in the cancellous bone part. The RB-I values of healthy cancellous bone and an as-polished Ti specimen are shown as the dashed-dotted line and dotted lines, respectively. *p < 0.05. - 67 - (1) 4 Intensity ratio of (H2O)/(TiO2) (deg.) 3 Intensity ratio of (-OH)/(TiO2) (deg.) (2) Intensity ratio of (C-H)/(TiO2) (deg.) (3) i l 2 a c g j k 1 e d b h f 0 0.8 a 0.6 g b j 0.4 l k d h f e i 0.2 c 0 d f 0.4 k 0.3 a b l 0.2 h g j e c 0.1 0 i 20 30 40 50 60 Water contact angle, θ (deg.) 70 Fig. 4. 6 The intensity ratio of (1) adsorbed water molecule (H2O), (2) OH group binding to Ti atom, and (3) adsorbed hydrocarbon (C-H) on the surface of anodized specimens, against TiO2. The intensities of adsorbed H2O, OH group, C-H, and TiO2 were calculated from O1s, C1s, and Ti2p XPS spectra, respectively. - 68 - は，表面の親水性にほとんど影響しないことがわかる．ただし，上述のように 皮膜中の溶質イオン濃度は試料ごとに異なるため，その影響は明らかではない． 表面に存在する化学種の中で，表面 OH 基は接触角の低下に寄与するものと 考えられる．それとは反対に，大気中からコンタミネーションとして表面に吸 着した炭化水素は，接触角を増大させることが知られている[4-5]．そこで， XPS にて分析した O 1s および C 1s スペクトルを，過去の報告[4-6][4-7]をもとにピーク 分離し，試料表面への吸着水分子，表面 OH 基，ならびに炭化水素の吸着量を 算出した結果を Fig. 4. 6 に示す．SA, PA, NS, および NP については，硫酸イオ ンあるいはリン酸イオンに起因するピークと OH 基に起因するピークの分離が 困難なため，各イオンも含んだ値として表面 OH 基量を算出した．表面には水 分子が吸着するが，その吸着量と水滴接触角は相関関係にないことから，吸着 水分子中の OH 基による表面親水性への寄与は少ないものと考えられる（Fig 4. 6(1)）．一方で，水滴接触角の低い SA および PA の表面には多くの表面 OH 基が 存在しており，表面 OH 基量が高くても吸着炭化水素量も高い NP の水滴接触角 は高い傾向が認められる（Fig. 4. 6(2)）．ただし，SaA における高い C-H 量は， 吸着した炭化水素よりもむしろ皮膜中の含有有機アニオンによるものと考えら れるが，その有機アニオンを含有しても接触角が顕著に増大する傾向は認めら れなかった．以上の結果は，表面 OH 基および吸着炭化水素が，陽極酸化 TiO2 の水滴接触角に強く影響する傾向が認められた． 4. 3. 3. 骨伝導性評価 各水溶液中で作製した陽極酸化試料の骨‐インプラント接触率（RB-I）を，皮 質骨部，海綿骨部に分け，それぞれ Fig. 4. 5(2)および(3)に示す．その結果，皮質 骨部，海綿骨部ともに同様の傾向を示すが，皮質骨部の方が試料ごとの RB-I 値の 違いがより顕著であった．これは，海綿骨の骨代謝周期が皮質骨よりも速く， - 69 - 14 日間の埋植期間ではすでに十分な量の骨が形成されており，埋植初期の硬組 織生成量，すなわち陽極酸化皮膜表面の効果を必ずしも表していないためと考 えられる．それゆえ，以降の議論では皮質骨部の結果を用い，表面の化学的性 質が骨伝導性に与える影響を考察した． Fig. 4. 5(2)は，RB-I 値が水溶液の pH に依存して変化することを示している．こ こで Fig. 4. 5(2)と Fig. 4. 5(1)を比較すると，pH に対する RB-I 値の変化と水滴接触 角の変化が対応していることがわかる．そこで，水滴接触角と皮質骨部におけ る RB-I 値の関係を Fig. 4. 7(1)に示す．RB-I 値が水滴接触角に依存して変化し，水 滴接触角が 55 (deg.)程度でその傾向が変化することがわかる．接触角が 55 (deg.) 以下の表面を有する試料については，水滴接触角の低下とともに RB-I 値が増大す る傾向が認められた．骨形成の初期段階ではフィブロネクチンなどのたんぱく 質を介して硬組織が形成されることを考えると，親水性の高い表面で高い RB-I 値を示した本研究の結果は，親水性表面では細胞非接着性たんぱく質であるア ルブミンよりも細胞接着性たんぱく質であるフィブロネクチンの方が積極的に 表面に吸着するという Wei らの報告と一致する[4-8]．反対に，接触角が 55 (deg.) 以上の表面を有する試料については，接触角の増大とともに RB-I 値は増大した． この傾向は，過去のいずれの in vitro 試験結果[4-9][4-10]とも一致せず，その原因を 明らかにすることはできなかった．水滴接触角が表面化学種の影響を強く受け る一方で，RB-I 値が表面 OH 基量，あるいは吸着炭化水素量に依存する傾向は認 められなかった（Fig. 4. 7(2)および(3)）．すなわち，陽極酸化 TiO2 皮膜の骨伝導 性は水滴接触角によって整理することができ，本質的には TiO2 皮膜表面に存在 する OH 基と吸着炭化水素のバランスに左右されることが示された． - 70 - (2) Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) (1) 50 a 40 b 30 l 20 k j f 10 h c e i g d 0 20 30 40 50 60 Water contact angle, θ (deg.) 70 50 (3) a 40 a b b 30 l 20 10 0 0.2 l c k i f e 0.4 h j d 0.6 g i 0.8 0.2 Intensity ratio of (-OH)/(TiO2) (deg.) Fig. 4. 7 c e j k f d g 0.3 Intensity ratio of (C-H)/(TiO2) (deg.) Relationship between RB-I values in the cortical bone part and (1) WCA, (2) the XPS spectrum intensity ratio of OH group against TiO2, and (3) the XPS spectrum intensity ratio of adsorbed hydrocarbon against TiO2. - 71 - h 0.4 4. 4. 小括 本章では，皮膜中への溶質イオンの取り込みを念頭に，異なる溶質イオン種 を含有する種々の水溶液中で Ti を陽極酸化し，生成する TiO2 皮膜の親水性およ び骨伝導性への効果を検討するとともに，表面親水性と骨伝導性の量的関係に ついて考察し，以下の知見が得られた． 1) いずれの水溶液中で Ti を陽極酸化した場合も，表面が平滑で，膜厚の等し いアナターゼ単相の陽極酸化皮膜の成膜に成功した．陽極酸化皮膜中には， 水溶液中のアニオン・カチオンが取り込まれたが，これらの含有溶質イオン による表面親水性への影響は認められなかった． 2) 陽極酸化皮膜の表面親水性は，陽極酸化処理に使用した水溶液の pH に強く 依存して変化した． 3) TiO2 被覆した試料表面における硬組織生成量は，試料表面での水滴接触角に 依存して変化し，水滴接触角が 55 (deg.)以下の表面を有する試料については， 接触角の低下とともに RB-I 値が増大する傾向が認められた．それとは反対に， 接触角が 55 (deg.)以上の表面を有する試料については，接触角の増大ととも に RB-I 値は増大した． - 72 - 【第４章の参考文献】 [4-1] H. S. Ryu, W. -H. Song and S. -H. Hong: Surface and Coatings Technology, 202 (2008) 1853-1858. [4-2] J. -H. Lee, S. -E. Kim, Y. -J. Kim, C. -S. Chi and H. -J. Oh: Materials Chemistry and Physics, 98 (2006) 39-43. [4-3] C. Y. Kramer: Biometrics, 12 (1956) 307-310. [4-4] Y. Yamamoto and N. Baba: Thin Solid Films, 101(1983) 329-338. [4-5] W. Att, N. Hori, M. Takeuchi, J. Ouyang, Y. Yang, M. Anpo and T. Ogawa: Biomaterials, 30 (2009) 5352-5363. [4-6] Y. Tanaka, M. Nakai, T. Akahori, M. Niinomi, Y. Tsutsumi, H. Doi and T. Hanawa: Corrossion Science, 50 (2008) 2111-2116. [4-7] Y. Shibata, D. Suzuki, S. Omori, R. Tanaka, A. Murakami, Y. Kataoka, K. Baba, R. Kamijo and T. Miyazaki: Biomaterials, 31 (2010) 8546-8555. [4-8] J. Wei, T. Igarashi, N. Okumori, T. Igarashi, T. Maetani, B. Liu and M. Yoshinari: Biomedical Materials, 4 (2009) 045002. [4-9] Y. Tamada and Y. Ikeda: Polymer, 34 (1993) 2208-2212. [4-10] P. B. van Wachem, T. Beugeling, J. Feijen, A. Bantjes, J. P. Detmers and W. G. van Aken: Biomaterials, 6 (1985) 403-408. - 73 - 第５章 陽極酸化皮膜中のリン酸イオン濃度の影響 5. 1. 緒言 第４章までに，希薄水溶液中での陽極酸化時に酸化皮膜中に混入する電解質 イオン種について，特定のイオン種による骨伝導性への影響は認められないこ とを示した．一方で，皮膜中に混入するイオン量と骨伝導性の関係については 十分に議論されていない．Lee らは，0.9 M 以下の H3PO4 を含む水溶液中で金属 Ti を陽極酸化した場合，陽極酸化時の水溶液中の H3PO4 濃度の上昇とともに， 皮膜中のリン酸イオン含有量が増加するために，SBF 浸漬試験においてより多 くの Ca-P 化合物が生成することを報告している[5-1]．このように，陽極酸化皮膜 中に存在する電解質イオンの量が，陽極酸化 TiO2 の骨伝導性に影響を及ぼす可 能性が懸念される． 水溶液中のイオン濃度が高ければ，電極／水溶液界面でのイオン濃度が高い ために，より多くのイオンが皮膜中に混入するものと考えられる．しかし，通 常の陽極酸化処理では 1 M 以下の水溶液中で十分に酸化皮膜が形成されるため， 実用上のコスト・環境面への影響を考えて希薄水溶液を使用するのが普通であ り，高濃度水溶液中での陽極酸化挙動についての知見は多くない．そこで本研 究では，0.1～11 M H3PO4，なかでもこれまでに陽極酸化による Ti 表面への TiO2 コーティングが報告されていない 3 M 以上の H3PO4 水溶液中での陽極酸化に注 目し，皮膜中のリン酸イオン含有量の異なる TiO2 皮膜の作製を試み，リン酸イ オン含有量と骨伝導性との関係について検討した． - 74 - 5. 2. 実験方法 5. 2. 1. 前処理 工業用 Ti（cp-Ti）の板材（表面積 1.13 cm2）および丸棒材（2×5 mm）を，そ れぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．これらを SiC エ メリー紙で一定方向に湿式研磨した後，粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いてバフ 研磨を行い，基材の表面粗さを一定とした．研磨後は，基材表面を蒸留水で洗 浄し，エタノールで脱脂した後，表面以外をエポキシ樹脂あるいはシリコーン シーラントで被覆し，陽極酸化処理に供した． 5. 2. 2. 陽極酸化処理 Ti 基材を作用極，Pt コイルを対極とした 2 極法にて陽極酸化処理を施した． 電圧印加中は，一定速度にて水溶液を撹拌し，恒温槽中にて 298 K 一定に保持 した．水溶液として，0.1～11 M の H3PO4 水溶液を用いた．印加電圧は，0 V か ら 0.1 Vs-1 にて上昇させ，最大 200 V まで印加した後，ただちに水溶液中から試 料を取り出し，蒸留水にて洗浄し，エアブロワーにて表面の水滴を除去した． 作製した全ての試料をオートクレーブ滅菌器内で 394 K にて 20 分間滅菌処理し た後，各種分析評価ならびに in vivo 試験に供した． 5. 2. 3. 表面分析 走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000，日本電子および S-4800， HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し，薄膜 X 線回折装置（XRD；XRD6100， 島津製作所）および電子線回折装置にて生成物の結晶構造の同定を行い，さら に X 線光電子分光装置（XPS；ESCA-3300，島津製作所）にて皮膜表面の定性 および定量分析を行った．共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500，オリンパス）を用 いて算術平均表面粗さ Ra（分析範囲 150 μm×112 μm）を測定した．表面の親水 - 75 - 性については，動的接触角計（FTA100B，ジャスコインターナショナル）を用 いた静的水滴接触角測定により評価した．オートクレーブ滅菌の 24 h 後に，1 つの試料につき 3 ヶ所において 2 μL の水滴と試料との接触角を測定し，その平 均値を静的水滴接触角として使用した． 5. 3. 結果および考察 5. 3. 1. 水溶液中 H3PO4 濃度および印加電圧の影響 Ti 試料に対し，0.1～9 M H3PO4 水溶液中で，0.1 Vs-1 の昇圧速度で 200 V まで 電圧を印加したときの XRD パターン，ならびに 7.3 M H3PO4 水溶液中で最大印 加電圧を 100～200 V まで変化させたときの XRD パターンを，Fig. 5. 1 に示す． 水溶液中の H3PO4 濃度ならびに印加電圧を変化させた時の，Fig. 5. 1 の XRD パ ターンにおけるアナターゼのメインピーク（2θ = 25.2（deg.））の半値幅の変化 を，Fig. 5. 2 に示す．また，XPS にて測定した P 2p および Ti 2p の各スペクトル の面積強度比から，酸化皮膜中のリン酸イオンの相対的な存在比を算出し，そ の変化量と水溶液中の H3PO4 濃度の関係を Fig. 5. 3 に示す．Fig. 5. 4 は，9 M H3PO4 水溶液中にて 200 V まで電圧を印加した時に生成した酸化皮膜断面の明 視野像ならびに電子線回折像である．また，陽極酸化前後の表面 SEM 像を Fig. 5. 5 に示す． Fig. 5. 1(1)より，いずれの条件で作製した場合もアナターゼの回折角にてピー クが検出されたが，陽極酸化に用いた水溶液中の H3PO4 濃度によって，その半 値幅が大きく異なることがわかった．すなわち，水溶液中の H3PO4 濃度が 1 M 以下のときには，半値幅は 1 (deg.)程度で，結晶性の高いアナターゼが生成して いる．H3PO4 濃度を 2 M まで増加させると，半値幅は 1 (deg.)から 6 (deg.)へと増 - 76 - 大し，さらに 4 M まで増加させると，半値幅は 8 (deg.)まで増大し，それ以上の 濃度では半値幅は一定となった（Fig. 5. 2(a)）．半値幅が 8 (deg.)程度のアナター ゼ皮膜の結晶構造を電子線回折にて分析したところ，皮膜内部にナノ結晶相が 部分的に存在し，その周囲にアモルファス相が存在することが明らかとなった （Fig. 5. 4(b)）（以下，アモルファス相とアナターゼナノ結晶相の複合体を「ア ナターゼライクアモルファス」と称する）．また，298 K において，0.1 Vs-1 の昇 圧速度で 200 V まで印加電圧を上昇させる場合，2 M 以上の H3PO4 水溶液を用い (1) (a) anatase (2) anatase (B) Intensity (a. u.) Intensity (a. u.) (b) (A) (c) (d) (C) (D) (e) 20 30 25 2θ (deg.,CuKα) (f) 20 30 25 2θ (deg.,CuKα) Fig. 5. 1 XRD patterns of Ti (1) anodized up to 200 V in (a) 0.1 M, (b) 1 M, (c) 3 M, (d) 4 M, (e) 5 M, and (f) 9 M H3PO4 aq. (298 K), and (2) anodized in 7.3 M H3PO4 aq. (298 K) up to (A) 100 V, (B) 160 V, (C) 180 V, and (D) 200 V at a rate of 0.1 V s-1. - 77 - Full width at half maximum (deg.) 10 (a) (b) 8 6 4 2 00 Fig. 5. 2 2 4 6 8 10 H3PO4 content in the bath, C / M 0 100 Applied voltage，E / V 200 Relationship between full width of half maximum of anatase peak in XRD pattern located at 2 (deg) = 25.2 and (a) H3PO4 content in the bath anodized up to 200 V or (b) applied voltage in 7.3 M H3PO4 aq., classified with the crystal phase of TiO2 (○: crystallized anatase and ●: anatase-like amorphous). ると，昇圧途中において基板表面でスパークが発生した．このため，生成した アナターゼライクアモルファス皮膜表面には多数の孔が形成され，その表面粗 さ Ra は，研磨ままの Ti よりも大きく上昇した（Fig. 5. 5）．一方，H3PO4 濃度が 1 M 以下の場合でも，200 V まで電圧を上昇させると表面粗さは増大する傾向に あるが， 2 M 以上 H3PO4 使用時のような急激な表面粗雑化は認められなかった． 水溶液中の H3PO4 濃度による皮膜生成への影響を調べた XPS スペクトルから， すべての酸化皮膜中にリン酸イオンが含まれており，その含有量は，陽極酸化 時の水溶液中の H3PO4 濃度に依存して変化することがわかった．すなわち， H3PO4 濃度が 3 M 未満の場合，H3PO4 濃度を変化させても皮膜中のリン酸イオン - 78 - Intensity ratio of P 2p / Ti 2p (a.u.) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 8 10 H3PO4 content in the bath, C / M Fig. 5. 3 Relationship between H3PO4 content in the bath and the amount of PO43- contained in the coatings during anodizing up to 200 V at a rate of 0.1 V s-1 in H3PO4 aq. (298 K) (○: crystallized anatase and ●: anatase-like amorphous). (a) (b) TiO2 Ti Amorphous 2μm Amorphous + Nanocrystal Fig. 5. 4 (a) Cross-sectional bright field image by TEM and (b) ED patterns of Ti anodized in 9 M H3PO4 aq. (298 K) up to 200 V at a rate of 0.1 V s-1. - 79 - (a) 10 mm (b) (c) Ra/mm = 0.057 0.114 (e) (d) (f) 0.321 (g) 0.246 0.467 (h) 0.568 Fig. 5. 5 0.150 0.730 Surface SEM images of (a) as-polished Ti, anodized Ti in (b) 0.1 M, (c) 1 M, (d) 3 M, (e) 4 M, (f) 5 M, (g) 7.3 M, and (h) 9 M H3PO4 aq. up to 200 V at a rate of 0.1 V s-1. - 80 - 含有量はほとんど変化しないが，3 M まで増加させるとその含有量は急激に増加 する．一方，4 M 以上ではリン酸イオン含有量は一定値を示した．このことから， 皮膜中のリン酸イオン含有量は，水溶液中の H3PO4 濃度に対して，半値幅と同 様に変化することがわかる．すなわち，アナターゼライクアモルファス皮膜の 生成は，アナターゼの結晶格子中に多量のリン酸イオンが含まれることにより， Ti 原子と O 原子の規則的な配列が乱れることに起因するものと考えられる．た だし，4 M 以上の H3PO4 水溶液中で陽極酸化を施した場合には，アモルファス 相中にそれ以上リン酸イオンは取り込まれず一定となるために，水溶液中の H3PO4 濃度に関係なく，半値幅は一定となるものと考えられる． 次に，アナターゼライクアモルファス生成への印加電圧（スパークの有無） の影響を調べた．一例として，7.3 M H3PO4 水溶液中にて，スパークの発生しな い低い印加電圧で陽極酸化を施すと，水溶液中に多量のリン酸イオンが存在す るにもかかわらず，アモルファス相は生成せず（Fig. 5. 1(2)(A)），スパークが発 生するまで印加電圧を上昇させることでアモルファス相が生成した．このこと は，スパークの発生が，アナターゼライクアモルファスが生成するための必要 条件であることを示唆している．以上の議論をもとに，水溶液中の H3PO4 濃度 ならびに印加電圧にてアナターゼの結晶性を整理すると，Fig. 5. 6 に示すように 2 つのグループに分類することができる．この図から，アナターゼライクアモル ファスが生成するためには，水溶液中の H3PO4 濃度を高くするとともに，印加 電圧を上昇させ，スパークを発生させる必要があることがわかる． 5. 3. 2. 骨伝導性評価 5. 3. 1.で述べたように，皮膜中のリン酸イオン含有量と半値幅が相関関係に あることから，ここでは骨‐インプラント接触率（RB-I）を半値幅にて整理し， - 81 - Applied voltage，E / V 200 150 100 0 Fig. 5. 6 5 10 H3PO4 content in the bath, C / M Classified crystal phase of TiO2 in relation to H3PO4 content in the bath and applied voltage (○: crystallized anatase and ●: anatase-like amorphous). 皮質骨部と海綿骨部に分けて Fig. 5. 7 に示した．陽極酸化試料は，その半値幅に 関係なく，皮質骨部，海綿骨部ともに研磨まま材よりも高い RB-I 値を示した．陽 極酸化試料の RB-I 値は，生成する TiO2 の結晶性によって異なり，半値幅が 6 (deg.) 以上の試料（黒棒，5 M および 9 M H3PO4 水溶液中にて陽極酸化）は，半値幅が 1 (deg.)以下の試料（灰棒，0.1 M および 1 M H3PO4 水溶液中にて陽極酸化）より も，皮質骨部，海綿骨部ともに高い RB-I 値を示す傾向が認められた． TiO2 コーティング材の骨形成能は，皮膜の性質（表面粗さ，結晶構造[5-2][5-3]， 皮膜中の電解質イオン種[5-4]，など）が強く影響するものと言われており，本章 で作製した TiO2 皮膜の場合，水溶液中の H3PO4 濃度および印加電圧に応じて表 面粗さは 0.05 < Ra/μm < 0.80 の範囲で大きく異なり，またリン酸イオンの混入に - 82 - n= 3 4 5 5 4 (1) 2 * 60 * (e) (f) (e) (f) (b) (a) 0 (d) 20 * 60 * * * 0 (d) 40 (b) (c) * 20 Fig. 5. 7 (c) 40 (a) (2) Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) * 0 2 4 6 Full width at half maximum (deg.) Bone-implant contact ratio, RB-I of the specimens (a) as-polished, anodized up to 100 V in (b) 0.1 M H3PO4 aq., and up to 200 V in (c) 0.1 M H3PO4 aq., (d) 1 M H3PO4 aq., (e) 5 M H3PO4, and (f) 9 M H3PO4 aq. when implanted in (1) cortical bone part and (2) cancellous bone part : sample volume (n) = 3 ～5, *p < 0.05. - 83 - 8 Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 60 b c d 40 a 20 0 0 0.5 1.0 Average roughness, Ra/μm Fig. 5. 8 Relationship between RB-I in the cortical bone part and surface roughness of as-polished and anodized Ti. Symbols: ○ = as-polished, ■= anodized in 0.1 M H3PO4 up to 100 V, and ■ = anodized in (a) 0.1, (b) 1, (c) 5, and (d) 9 M H3PO4 aq. up to 200 V. ともなう結晶構造の変化が認められる．表面粗さの影響に注目すると，表面の 粗雑な陽極酸化試料（0.47 < Ra/μm < 0.73）は，表面の平滑な陽極酸化試料（Ra/μm < 0.10）よりも高い RB-I 値を示し，第３章にて示した結果とは異なる傾向を示す （Fig. 5. 8）．それに対し，RB-I 値が，表面粗さに関係なく，半値幅の変化に対応 して変化することが Fig. 5. 7 よりわかる．ただし，半値幅の変化と皮膜中へのリ ン酸イオン混入量が従属関係にあるため，硬組織生成量の増加が，結晶構造に 起因するものか，あるいはリン酸イオン量混入による化学的性質の変化に起因 - 84 - Water contact angle, θ (deg.) 80 60 a c b d 40 20 0 0 0.5 1.0 Average roughness, Ra/μm Fig. 5. 9 The variation of WCA by the change of surface roughness on Ti samples coated with the same anodized films. Symbols: ●: anodized in 0.1 M H3PO4 aq. up to 100 V, ■: anodized in (a) 0.1, (b) 1, (c) 5, and (d) 9 M H3PO4 aq. up to 200 V, ○: anodized in 0.1 M H2SO4 aq. up to 100 V, ● : anodized in 0.1 M NaOH aq. up to 80 V. するものかを本章で十分に検討することはできないが，結晶構造の影響につい て第７章において考察する． 5. 3. 3. 表面親水性の影響 第４章において，Ra/μm < 0.1 の平滑表面を有する陽極酸化 TiO2 の RB-I が水滴 接触角によって整理できることを示している．そこで，本章で作製した高濃度 H3PO4 水溶液中陽極酸化試料についても水滴接触角を測定した．ただし，先に述 べたように，本章で作製した試料の表面粗さは，第４章までとは異なり Ra/μm < - 85 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 60 d c 40 b a 20 0 20 40 60 80 Water contact angle, θ (deg.) Fig. 5. 10 anodized Ti. Relationship between RB-I in the cortical bone part and WCA of Symbols: ○: 0.05 < Ra/μm < 0.10, ●■: 0.10 < Ra/μm < 0.30, ●■: 0.30 < Ra/μm < 0.80, ●: 0.80 < Ra/μm < 1.30, ○●●●: Anodized in 0.1 M H3PO4, 0.1 M H2SO4, and 0.1 M NaOH aq. up to 100 or 80 V (used in chapters 3 and 4), ■■: Anodized in (a) 0.1, (b) 1, (c) 5, and (d) 9 M H3PO4 aq. up to 200 V. 0.1 に統一されておらず，表面粗さの違いが水滴接触角に影響することが考えら れたため，第３章にて作製した表面粗さの異なる陽極酸化 TiO2 の水滴接触角も 同時に測定し，表面粗さとの対応関係を Fig. 5. 9 に，皮質骨部における RB-I との 対応関係を Fig. 5. 10 に示した． 同じ陽極酸化条件（0.1 M H3PO4, 100 V）で作製した TiO2 皮膜であっても，表 面粗さの異なる場合には水滴接触角も異なり，0.05 < Ra/μm < 1.10 の範囲では - 86 - Ra の増加とともに水滴接触角が増大する傾向が認められた（Fig. 5. 9）．しかし， 作製した陽極酸化 TiO2 の RB-I は，0.05 < Ra/μm < 1.10 の範囲では表面粗さに関係 なく，水滴接触角に依存して変化し，Fig. 5. 10 に示す近似曲線に従うことがわ かる．一方で，濃厚 H3PO4 水溶液中あるいは高印加電圧下で作製した陽極酸化 試料の表面粗さは，3 章で検討した表面粗さの範囲内（0.05 < Ra/μm < 1.10）に あるが，特に皮膜中のリン酸イオン含有量の高い試料（Fig. 5. 10(c)(d)）の RB-I は，近似曲線から大きく逸脱する傾向を示した．すなわち，皮膜中リン酸イオ ン量の高い試料の RB-I は，水滴接触角では整理できないことがわかる．このこと は，アナターゼライクアモルファスに起因する結晶構造あるいは皮膜中リン酸 イオンの存在が，表面親水性よりも強く骨伝導性に影響したことを示唆してい る． 5. 4. 小括 本章では，H3PO4 水溶液の濃度および印加電圧を変化させることで，陽極酸化 皮膜中に取り込むリン酸イオンの量を変化させ，そのときに生成する酸化皮膜 の性質ならびに骨伝導性を評価し，以下の知見が得られた． 1) 水溶液中の H3PO4 濃度に関係なく，陽極酸化によって金属 Ti 表面にアナタ ーゼ単相の陽極酸化皮膜が形成されたが，その結晶性は水溶液中の H3PO4 濃度ならびに印加電圧によって大きく変化した．特に，4 M 以上の高濃度 H3PO4 水溶液中でスパークが発生するまで印加電圧を上昇させると，皮膜中 に多くのリン酸イオンを含有したアナターゼライクアモルファスが生成し た． 2) Ti 表面にアナターゼライクアモルファス皮膜が形成した場合，表面粗雑化 - 87 - による骨伝導阻害作用よりも，アナターゼの結晶性低下，あるいはリン酸 イオン含有による骨伝導促進作用の方が強く影響し，皮質骨部，海綿骨部 ともに高い骨伝導性を示した． - 88 - 【第５章の参考文献】 [5-1] J. -H. Lee, S. -E. Kim, Y. -J. Kim, C. -S. Chi and H. -J. Oh: Materials Chemistry and Physics, 98 (2006) 39-43. [5-2] B. Yang, M. Uchida, H.- M. Kim, X. Zhang and T. Kokubo: Biomaterials, 25 (2004) 1003-1010. [5-3] X. Cui, H. -M. Kim, M. Kawashita, L. Wang, T. Xiong, T. Kokubo and T. Nakamura: Dental Materials, 25 (2009) 80-86. [5-4] D. Wei, Y. Zhou, D. Jia and Y. Wang: Surface and Coatings Technology, 201 (2007) 8723-8729. - 89 - 第６章 水熱処理および試料保存方法の影響 6. 1. 緒言 第４章にて，生成する TiO2 皮膜の表面親水性が高いほど，硬組織形成量が増 加することを述べた．その中で，異なる水溶液中で陽極酸化を施すことで，表 面親水性の異なる TiO2 皮膜の作製が可能であることを示したが，表面粗さや膜 厚などに関する条件制約下では，20 (deg.)から 80 (deg.)程度の接触角範囲しか実 現できていない．そのため本章では，さらなる親水化処理として水熱処理を試 み，表面親水性と骨伝導性の関係について，超親水性表面まで拡張して検討す ることを目的とした．また，親水性の高い表面は，作製後の保存期間中に大気 雰囲気下での表面汚染によって親水性が大きく低下することが報告されている [6-1] ．そこで，作製した親水性表面を長期間に渡って維持する方法についても同 時に検討することとした． 6. 2. 実験方法 6. 2. 1. 陽極酸化処理 工業用 Ti（cp-Ti）の板材（表面積 1.13 cm2）および丸棒材（2×5 mm）を， それぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．これらを SiC エメリー紙で一定方向に湿式研磨した後，粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いてバ フ研磨を行い，基材の表面粗さを一定とした．研磨後は，基材表面を蒸留水で 洗浄し，エタノールで脱脂した後，表面以外をエポキシ樹脂あるいはシリコー ンシーラントで被覆し，陽極酸化処理に供した． - 90 - Table 6. 1 Chemical composition of PBS(-). Chemicals used for preparation NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 Diethyl dicarbonate Concentration (g L-1) 8.0 0.2 1.44 0.24 < 0.1 陽極酸化処理は，Ti 基材を作用極，Pt コイルを対極とした 2 極法にて行った． 0.1 M H2SO4 水溶液中で印加電圧を 0 V から 0.1 Vs-1 にて上昇させ，100 V に到達 した後，ただちに水溶液中から試料を取り出し，蒸留水にて洗浄し，エアブロ ワーにて表面の水滴を除去した．電圧印加中は一定速度にて水溶液を撹拌し， 恒温槽中にて 298 K 一定に保持した．陽極酸化処理後，すべての試料にオート クレーブ装置内で滅菌処理（394 K，20 min.）を施した後，以降の処理に供した． 6. 2. 2. 水熱処理 陽極酸化まま Ti を蒸留水の入ったビーカーに浸漬させ，ビーカーごとオート クレーブ容器内に設置した．すべての水熱処理は，滅菌に使用したオートクレ ーブ装置とは別のオートクレーブ装置を用いて行った．室温（298 K）から 4 K min.-1 にて昇温させ，ビーカー内の温度が 393 K あるいは 453 K に達した後，そ のままの温度で最大 180 min.保持した．水熱処理後は，オートクレーブ装置内か ら速やかにビーカーごと試料を取り出し，ビーカー内で室温まで自然冷却させ た後，試料を取り出し，エアブロワーにて表面の水滴を除去した．陽極酸化処 理を施した試料にのみ水熱処理を施したため，陽極酸化後に水熱処理を施した 試料を，以降の文章中では単純に「水熱処理 Ti」と称する． - 91 - 6. 2. 3. 試料の保存方法 各試料は，表面処理，水熱処理を施した後，ただちに①大気中，②蒸留水中， ③リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Salline, PBS(-)，以降 x1 PBS(-)と略 す）中，あるいは④5 倍濃縮したリン酸緩衝生理食塩水（以降，x5 PBS(-)と略す） 中のいずれかの雰囲気中に保存した． PBS のマイナス記号は，水溶液中にマグ ネシウムおよびカルシウムを含まないことを意味する．x1 PBS(-)の組成を Table 6. 1 に示す．各保存雰囲気中で最長 170 h 保存した後，水溶液から取り出した試 料の表面を蒸留水で洗浄し，エアブロワーにて水滴を除去し，各種分析評価な らびに in vivo 試験に供した． 6. 2. 4. 表面分析 作製した全ての試料を滅菌用のオートクレーブ装置内で 394 K にて 20 分間滅 菌処理した後，各種分析評価に供した．走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000，日本電子および S-4800，HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し， 薄膜 X 線回折装置（XRD；XRD6100，島津製作所）にて生成物の結晶構造の同 定を行い，さらに X 線光電子分光装置（XPS；WSCA-3300，島津製作所）にて 皮膜表面の定性および定量分析を行った．共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500，オ リンパス）を用いて算術平均表面粗さ Ra（分析範囲 150 μm×112 μm）を測定し た．表面の親水性については，動的接触角計（FTA100B，ジャスコインターナ ショナル）を用いた静的水滴接触角測定により評価した．オートクレーブ滅菌 処理の 24 h 後に，1 つの試料につき 3 ヶ所において 2 μL の水滴と試料との接触 角を測定し，その平均値を静的水滴接触角として使用した． - 92 - 6. 3. 結果および考察 6. 3. 1. 水熱処理の効果 Fig. 6. 1 に水熱処理前後の XRD パターンを，Fig. 6. 2 に各処理前後の試料表面 の表面 SEM 像を，Fig. 6. 3 に異なる温度で水熱処理を施した時の，水熱処理直 後の水滴接触角におよぼす処理時間の影響を示す．陽極酸化まま Ti 表面に生成 した酸化皮膜からは，アナターゼに起因する回折ピークのみ検出された（Fig. 6. 1(a)）．これに水熱処理を施すと，水熱処理温度が高いほどアナターゼが成長す るが，その他の化合物は検出されなかった（Fig. 6. 1(b), (c)）．陽極酸化および水 熱処理のいずれも表面を粗雑化させず，研磨まま Ti の平滑表面（Ra/μm < 0.1） を維持したままの成膜が可能であった（Fig. 6. 2）．一方で，水滴接触角は，陽極 酸化処理によって 71 (deg.)から 28 (deg.)まで低下し，水熱処理によってさらに 13 (deg.)まで低下した（Fig. 6. 3）．また，水熱処理温度が高いほど，急速に水滴 接触角が 13 (deg.)まで低下することがわかる．Takebe らは，使用した試料の表 面粗さは本研究とは異なるものの，水熱処理によって同程度の接触角が得られ ることを報告している[6-2]． 研磨まま Ti，陽極酸化まま Ti，および 453 K における水熱処理 Ti の表面組成 を XPS にて分析したところ，いずれの試料表面においても C，O，および Ti の 3 元素が検出された．第４章で述べたように，水滴接触角は表面に存在する化学 種の影響を強く受けることが知られている．例えば，酸化物表面に直接結合し た OH 基や，大気中からのコンタミネーションとして表面に吸着する炭化水素 分子があり，これらは水滴接触角に対して対照的に作用することが知られてい る[6-1][6-3]．そこで，研磨まま Ti，陽極酸化まま Ti，および水熱処理 Ti について， XPS スペクトルにおけるピークの面積強度から，表面 OH 基および吸着炭化水 - 93 - Intensity (a. u.) anatase (c) (b) (a) 23 Fig. 6. 1 24 25 26 27 2θ (deg., CuKα) 28 29 XRD patterns of Ti samples processed with different surface modification methods: (a) as-anodized; (b) hydrothermally treated at 393 K for 180 min. in distilled water; and (c) hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water. (a) 5 mm Ra/μm = 0.084 Fig. 6. 2 (b) (c) 0.087 (d) 0.086 0.057 Surface morphology and surface roughness (Ra) of Ti samples processed with different surface modification methods: (a) as-anodized; (b) hydrothermally treated at 393 K for 180 min. in distilled water; (c) hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water; and (d) as-polished. - 94 - 素分子の量を算出した結果を Fig. 6. 4 に示す．陽極酸化処理によって（1(d)）， 研磨まま Ti（1(b)）よりも表面 OH 基量が減少することが認められた．これは， 第２章の 2. 2. 1. 1 節で述べたように，電圧印加中は皮膜の形成が進行する Ti 基 板近傍での pH が著しく低下するために，基板近傍での水溶液中 OH 量が低下し たことに起因するものと考えられる．しかし，水熱処理（1(g)）を施しても表面 OH 基量は変化せず，陽極酸化まま Ti と同程度であった．このことは，水熱処 理では表面 OH 基量は増加しないことを示唆している．一方で，吸着炭化水素 の量は，陽極酸化処理（2(d)）を施しても変化しないが，水熱処理を施すと減少 することがわかった（2(g)）．このことは，水熱処理によって TiO2 表面から一部 Water contact angle, θ (deg.) の吸着炭化水素分子が除去され，表面が清浄化されたことを意味する．水熱処 Fig. 6. 3 30 20 10 0 0 50 100 150 Processed time, t / min. 200 The relationship between WCA and the processing time for the hydrothermal treatment on as-anodized Ti in distilled water at 393 K (○) and at 453 K (●). - 95 - (2) Intensity ratio of [-OH]/[TiO2] (deg.) Intensity ratio of [C-H]/[TiO2] (deg.) (1) 0.6 0.5 a 0.4 j 0.3 i f gc h d e 0.2 0.1 0 0.3 h 0.2 e d j f a b c g i 0.1 Anodizing 0 0 20 40 60 Water contact angle, θ (deg.) Hydrothermal treatment 80 Storage Atmosphere Period (h) (a) ― air (i.e. as-polished) (b) (c) 0.1 M H2SO4-1 (d) 100 ― air V (0.1 V s ) (e) (f) (g) air 0.1 M H Distilled water, 2SO4-1 (h) 100 V (0.1 V s ) 453 K, 180 min. (i) Distilled water (j) x5 PBS(-) Fig. 6. 4 b 0 24 0 24 168 0 24 168 24 24 Symbol a b c d e f g h i j The relationship between WCA and (1) the number of OH group and (2) the amount of adsorbed hydrocarbon on the Ti samples processed with different surface modifications and different storage methods, as listed in the table. The concentrations of [–OH], [C-H], and [TiO2] were calculated from O 1s, C 1s, and Ti 2p spectra obtained with XPS. - 96 - 理 Ti は，研磨まま Ti よりも表面 OH 基量が少ないにもかかわらず，より高い親 水性を示した．このことは，表面 OH 基の減少よりも吸着炭化水素分子の減少 の方が親水性に強く影響し，水滴接触角を低下させたことを示唆している． このように，水熱処理には，表面処理を施した Ti 表面から吸着炭化水素分子を 除去し，親水化させる効果があることが見出された．水熱処理温度が 393－453 K の範囲では，その処理温度によって到達接触角は変化しないことから，以降の 実験では，すべて 453 K で 180 min.水熱処理を施したものを水熱処理 Ti として 使用した． 6. 3. 2. 表面処理後の保存環境の影響 陽極酸化まま Ti および水熱処理 Ti を，4 つの異なる雰囲気下で保存したとき の水滴接触角の経時変化を Fig. 6. 5 に示す．各試料の水滴接触角は，保存環境な らびに保存期間にしたがって変化した．水熱処理の有無にかかわらず，大気中 保存では時間経過とともに接触角は上昇し続け，168 h 後にはすべての試料間で 接触角の差は認められなくなった（Fig. 6. 5(a)）．蒸留水中保存では，大気中保 存ほどではないが，時間経過とともにわずかに接触角は上昇した（Fig. 6. 5(b)）． しかし，PBS(-)中に保存した場合，同様の湿潤環境である蒸留水中保存の場合と は異なり，陽極酸化まま Ti の水滴接触角は低下した（Fig. 6. 5 (c), (d)の○）．PBS(-) 保存後の水滴接触角は，陽極酸化まま Ti よりも水熱処理 Ti の方が低く，PBS(-) の濃度が高いほど保存後の接触角は低下する傾向が認められた（Fig. 6. 5 (c), (d) における●） ． 各保存環境下における水滴接触角の経時変化は，表面化学種の影響を強く受 けるものと考えられる．すなわち，作製直後に高い表面親水性を示す試料を大 気中に保存すると，保存期間が 168 h を経過しても表面 OH 基量は変化しないが， - 97 - Water contact angle, θ (deg.) 60 30 (a) 50 40 (c) 20 30 20 10 10 0 0 30 100 Period for storage in air, t / h 200 0 0 20 40 60 80 Period for storage in x1 PBS(-) solution, t / h 30 (b) 20 20 10 10 0 0 20 40 60 80 Period for storage in distilled water, t / h Fig. 6. 5 (d) 0 0 20 40 60 80 Period for storage in x5 PBS(-) solution, t / h Temporal changes in WCA on the Ti samples processed with different surface modifications ( ○ : as-anodized; ● : hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water) and then stored under different conditions for different periods: (a) in air; (b) in distilled water; (c) in x1 PBS(-) solution; and (d) in x5 PBS(-) solution. - 98 - (a) Intensity (a.u.) (c) 1080 1070 1060 Binding energy, Eb / eV (b) 210 Fig. 6. 6 140 130 (d) 200 190 300 290 XPS spectra of (a) Na 1s, (b) Cl 2p, (c) P 2p, and (d) K 2p, detected in Ti samples hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water and then stored in x5 PBS(-) solution for a period of 170 h. 吸着炭化水素分子の量は時間とともに増加し，それにともなって接触角が増大 することが認められた（Fig. 6. 4 (1)(2) (c)→(d)→(e), (f)→(g)→(h)）．これと同様の 現象はこれまでにも報告されている[6-1][6-4]．一方で，作製直後でも比較的疎水性 寄りの表面を有する研磨まま Ti を大気中に保存した場合，吸着炭化水素分子の 量は時間が経過しても変化しなかった．このことから，もともと高い水滴接触 角を示す表面には，さらなる炭化水素分子の吸着は起きにくいものと考えられ る．一方で，蒸留水中に保存することで，水熱処理 Ti 表面への炭化水素分子の - 99 - Table 6. 2 WCA values of Ti samples hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water and then stored for a period of 24 h in different aqueous solutions. Storage solution WCA (deg.) x5 PBS(-) 3 0.79 M NaOH 3 0.70 M HCl 4 59 mM H3PO4 3 22 mM KOH 4 吸着は抑えられた（Fig. 6. 4(2)(i)）．これにより，72 h 経過後であっても，大気 中保存時と比べて低い水滴接触角を維持することが可能であった（Fig. 6. 5 (b)）． 蒸留水中に保存した場合と比較して，水熱処理 Ti を PBS(-)中に保存すると， 吸着炭化水素分子の量は増加するにもかかわらず，水滴接触角は減少した（Fig. 6. 4 (2)(g)）．PBS(-)中に保存した試料を XPS にて分析すると，その表面には，C， O，Ti に加えて，Na および Cl が検出された（Fig. 6. 6）．同様の研究として，PBS 成分の塩を付着させることで，親水性表面の維持が可能なことが報告されてい る[6-4]．そこで，PBS(-)の構成成分が試料表面の親水性におよぼす影響について 明らかにするために，x5 PBS(-)とイオン濃度の等しい 0.79 M NaOH (pH 13.6), 22 mM KOH (pH 12.2), 59 mM H3PO4 (pH 1.8), および 0.70 M HCl (pH 0.5)水溶液中 に， それぞれ水熱処理 Ti を 24 h 浸漬した後の水滴接触角を測定した（Table 6. 2）． イオン種や水溶液の pH に関係なく，水溶液中に含まれる Na+，K+，PO43-， Cl-は各水熱処理 Ti 表面に吸着し，いずれも x5 PBS(-)中保存後とほぼ同程度の 3 - 100 - (deg.)まで接触角が低下することがわかった．したがって，PBS(-)中に存在する どの溶質イオン種が吸着しても，水滴接触角は同程度まで低下するが，試料を x5 PBS(-)中で保存した場合，保存浴中のナトリウムおよび塩化物イオンの濃度 が高いことから，特に Na+および Cl-が試料表面に多く吸着したものと考えられ る．それゆえ，x5 PBS(-)中に試料を保存した場合，炭化水素分子の吸着よりも， x5 PBS(-)中の溶質イオンの吸着の方が TiO2 表面の親水性に強く影響し，超親水 性表面を安定的に形成することがわかった．以上のことを踏まえると，x5 PBS(-) 中に試料を保存することで，超親水性表面を長時間維持可能であることがわか った． 6. 3. 3. 骨伝導性評価 水滴接触角が 20 (deg.)以下の親水性表面を有する試料の，皮質骨部における RB-I 値を調べるために，本研究では，①蒸留水中に保存した水熱処理 Ti，および ②x5 PBS(-)中に保存した水熱処理 Ti の 2 種類の試料を in vivo 試験に供した．そ の結果を Fig. 6. 7 にプロットし，水滴接触角と皮質骨部における RB-I 値の関係を 示した．また，第４章までの結果を踏まえ，20 (deg.)以上の接触角を示す平滑 TiO2 表面（Ra/μm < 0.1）における RB-I 値も同様に Fig. 6. 7 にプロットした．各水 熱処理材（接触角：16 (deg.)および 3 (deg.)）の RB-I 値は，それぞれ 48%および 58%と高い値を示した．特に x5 PBS(-)中で保存した水熱処理 Ti の RB-I 値は，研 磨まま Ti の RB-I 値の約 4 倍高く，骨伝導性が大きく向上したことが明らかであ る．また，接触角が 55 (deg.)以下の場合，接触角が低下するとともに最大 58% まで RB-I 値が増大する傾向が認められた．表面に吸着した Na+および Cl-自体が， 硬組織の形成を積極的に促進するとは第４章の議論から考えにくいが，少なく ともこれらのイオンが超親水性表面の形成に寄与したことは明らかである．作 - 101 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 80 * * 60 * 0.1 M H2SO4 100 V 40 20 0 0 20 40 60 80 Water contact angle, θ (deg.) Fig. 6. 7 Relationship between WCA and RB-I in the cortical bone part of Ti samples processed with different oxidizing processes and subsequent storage methods. Symbols: ○ = anodized in various aqueous solutions (Ra/μm < 0.1); ■= hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water and then stored in distilled water; ◆: hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water and then stored in x5 PBS(-) solution; and ●: as-polished. *p < 0.05. - 102 - 製した超親水性表面は，x5 PBS(-)中に試料を保存することで，その超親水性表 面は少なくとも 720 h は維持することが可能であった．これは，インプラントを 使用する外科手術において，x5 PBS(-)中にインプラントを保存しておくだけで， 埋植直前まで高い親水性を維持することが可能なことを示唆している．また， 高い親水性を示す水熱処理 Ti を大気中で保存した場合，Fig. 6. 5(a)に示すように 168 h 後には大きく疎水化するものの，再度 453 K にて 180 min.蒸留水中で水熱 処理を施すと，大気中保存前の高い親水性が得られた．このことは，作製直後 の表面が高い親水性を示す限り，大気中保存時のコンタミネーションは，再度 水熱処理を施すことで除去可能であることを示唆している．以上の結果を要約 すると，表面への吸着炭化水素濃度を減少させた陽極酸化 TiO2 表面を x5 PBS(-) 中に保存することで，高い親水性を長期間維持することができ，それにともな って高い骨伝導性を有することが示された． 6. 4. 小括 本章では，Ti の陽極酸化皮膜に対するさらなる親水化処理として水熱処理の 効果を検討し，超親水性表面における骨伝導性について調査するとともに，作 製した親水性表面を長期間に渡って維持する方法について検討した．得られた 知見を以下に示す。 1) 陽極酸化 TiO2 皮膜に水熱処理を施すことで，親水性が向上し，水滴接触角 は 13 (deg.)程度まで低下した．水熱処理温度が高くなると，短い水熱処理時 間で表面が親水化するが，最終的に得られる水滴接触角は変化しなかった． 2) 作製した試料を大気中あるいは蒸留水中で保存した場合，時間経過とともに 炭化水素の吸着によって表面が汚染されるため，接触角は増大する傾向を示 - 103 - した．しかし，PBS(-)中に保存した場合，試料表面に PBS(-)の構成成分がイ オンとして吸着するため，接触角は低下し，超親水性を示した．また，この 保存方法では，高い表面親水性を長期間維持することが可能であった． 3) Ti 表面に成膜した TiO2 皮膜において，接触角が低下するほど，硬組織形成 量は増加し，RB-I 値は最大で 58%を示した． - 104 - 【第６章の参考文献】 [6-1] W. Att, N. Hori, M. Takeuchi, J. Ouyang, Y. Yang, M. Anpo and T. Ogawa: Biomaterials, 30 (2009) 5352-5363. [6-2] J. Takebe, S. Ito, S. Miura, K. Miyata and K. Ishibashi: Materials Science and Engineering: C, 32 (2012) 55-60. [6-3] S. Takeda and M. Fukawa: Thin Solid Films, 444 (2003) 153-157. [6-4] H. P. Jennissen: Material-wissenschaft und Werkstofftechnik, 41 (2010) 1035-1039. - 105 - 第７章 TiO2 皮膜作製プロセスの影響 7. 1. 緒言 これまでに，Ti の酸化プロセスとして陽極酸化法を選定し，成膜される TiO2 の表面特性が骨伝導性におよぼす影響を議論してきた．酸化プロセスとしては， 陽極酸化法の他にも酸化性水溶液浸漬法[7-1]，アルカリ浸漬法[7-1]-[7-4]，高温酸化 法[7-5]などがあり，それぞれの手法で成膜された TiO2 に対して生体活性評価が行 われているが[7-6][7-7]-[7-10]，酸化プロセスの違いが TiO2 の生体活性におよぼす影響 は明らかではない．一般的に，Ti あるいは Ti 合金の相を調整する目的で熱処理 が施されるが，その過程で表面に形成される高温酸化 TiO2 の生体活性は高くな いことが報告されている．そこで，陽極酸化法および高温酸化法にて Ti 表面に TiO2 皮膜を作製し，その皮膜特性の評価ならびに in vivo 試験による骨伝導性評 価を行った．これらの結果に基づき，酸化プロセスの違いが骨伝導性におよぼ す影響について考察した． 7. 2. 実験方法 7. 2. 1. 前処理 工業用 Ti（cp-Ti）の板材（表面積 1.13 cm2）および丸棒材（2×5 mm）を，そ れぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．これらを SiC エ メリー紙で一定方向に湿式研磨した後，粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いてバフ 研磨を行い，基材の表面粗さを一定とした．研磨後は，基材表面を蒸留水で洗 浄し，エタノールで脱脂した後，高温酸化処理ではそのままの試料を，陽極酸 - 106 - 化処理では表面以外をエポキシ樹脂あるいはシリコーンシーラントで被覆した ものを使用した． 7. 2. 2. TiO2 皮膜の作製 以下の 3 つの方法を用いて Ti 表面への TiO2 成膜を行った．膜厚の違いに起因 する骨伝導性への影響を除外するために，各酸化処理において酸化条件を調整 し，膜厚を統一した．作製した試料は，いずれも 394 K で 20 min.オートクレー ブ滅菌処理を施した後，各種分析ならびに in vivo 試験に供した． 7. 2. 2. 1. 陽極酸化処理 Ti 基材を作用極，Pt コイルを対極とし，2 極法で陽極酸化処理を施した．0.1 M H3PO4 水溶液を使用する場合は 100 V まで，0.1 M NaOH 水溶液を使用する場合 は 80 V まで 0.1 V s-1 にて電圧を上昇させた後，試料を水溶液から取り出し，蒸 留水にて洗浄し，エアブロワーにて表面の水滴を除去した．電圧印加中は，一 定速度にて水溶液を撹拌し，恒温槽中にて 298 K 一定に保持した． 図中では陽 極酸化処理を「AZ treatment」と表記した． 7. 2. 2. 2. 高温酸化処理 Ti 試料を電気炉の炉底にセットし，大気雰囲気で 4 K min.-1 にて昇温させた． 炉底温度が 673 K に到達後，その温度で 2 h 保持した後，そのままの雰囲気で炉 冷した． 図中では高温酸化処理を「TO treatment」と表記した． 7. 2. 2. 3. 陽極酸化‐高温酸化二段階処理 本手法では，まず初めに陽極酸化を施した後，高温酸化を施し，所定の膜厚 の酸化皮膜を作製した．陽極酸化では，H3PO4 水溶液を使用する場合は 70 V ま で，NaOH 水溶液を使用する場合は 50 V まで 0.1 V s-1 にて電圧を上昇させた． その後，陽極酸化試料を電気炉の炉底にセットし，大気雰囲気で 4 K min.-1 にて 昇温させた．炉底温度が 673 K に到達後，その温度で 2 h 保持した後，そのまま - 107 - の雰囲気で炉冷した．図中ではこの二段階処理を「AZ-TO treatment」と表記し た． 7. 2. 3. 表面分析 作製した全ての試料をオートクレーブ滅菌器内で 394 K にて 20 分間滅菌処理 した後，各種分析評価に供した．走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000， 日本電子および S-4800，HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し，薄膜 X 線回 折装置（XRD；XRD6100，島津製作所）にて生成物の結晶構造の同定を行い， さらに X 線光電子分光装置（XPS；ESCA-3300，島津製作所）にて皮膜表面の 定性および定量分析を行った．共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500，オリンパス） を用いて算術平均表面粗さ Ra（分析範囲 150 μm×112 μm）を測定した．表面の 親水性については，動的接触角計（FTA100B，ジャスコインターナショナル） を用いた静的水滴接触角測定により評価した．オートクレーブ滅菌処理の 24 h 後に， 1 つの試料につき 3 ヶ所において 2 μL の水滴と試料との接触角を測定し， その平均値を静的水滴接触角として使用した． 7. 3. 結果および考察 7. 3. 1. 酸化皮膜の性質 作製した試料の表面形状および表面粗さを Fig. 7. 1 に示す．Fig. 7. 2 は，陽極 酸化処理（(a) 0.1 M H3PO4 100 V，(b) 0.1 M NaOH 80 V）, (c)高温酸化処理，およ び陽極酸化+高温酸化処理（(d) H3PO4，(e) NaOH）を施した Ti 試料の XRD パタ ーンをそれぞれ示す．Fig. 7. 3 は各処理を施した Ti 試料の XPS スペクトル（(1) O 1s，(2) P 2p，および(3) Na 1s）を示す．いずれの酸化プロセスを用いた場合も， 酸化後の Ti 試料表面は，研磨まま Ti と同様に平滑（Ra/μm <0.1）であり，膜厚 - 108 - (a) (c) (b) 3 μm Ra/μm = 0.082 (d) (e) (f) 0.098 0.057 0.087 Oxidizing process Treatment 0.092 0.090 Anodizing Thermal Oxidation 673 K, 2 h, Air 80 V ― 50 V 673 K, 2 h, Air 0.082 28 0.090 65 0.092 38 0.098 63 (b) AZ-TO (c) AZ (d) AZ-TO (e) TO ― 673 K, 2 h, Air rutile 0.087 66 (f) as-polished ― ― ― 0.057 71 Fig. 7. 1 70 V WCA (deg.) AZ NaOH ― Ra (μm) (a) H3PO4 100 V Crystal structure of TiO2 anatase The surface SEM images, surface roughness Ra, and WCA of the samples prepared in this study. - 109 - (a) anatase rutile (b) Intensity (a. u.) (c) (d) (e) 24 25 26 27 28 29 2θ (deg., CuKα) Fig. 7. 2 The XRD patterns of the surface coatings on samples treated by (a) AZ treatment up to 100 V in 0.1 M H3PO4 aq., (b) AZ-TO treatment (anodized in H3PO4 aq.), (c) AZ treatment up to 80 V in 0.1 M NaOH aq., (d) AZ-TO treatment (anodized in NaOH aq.), and (e) TO treatment. 120 nm 程度の TiO2 皮膜が形成していたが，使用した酸化プロセスによって TiO2 は異なる結晶構造を示した．陽極酸化処理では，水溶液として H3PO4 を使用し た場合は PO43-を，NaOH を使用した場合は Na+をそれぞれ皮膜中に含むアナタ ーゼが生成した．一方で，高温酸化処理では，ルチルが生成した．二段階処理 では，陽極酸化のみの場合と同様にアナターゼが生成し，高温酸化を施したの にもかかわらずルチルは生成しなかった． - 110 - (1) (a) OH - and/or PO4 3- O2- (2) (a) PO4 3- H2O (b) (b) H2O O2- Intensity (a.u.) (c) O2- 140 OH - 130 H2O (3) (d) (c) Na + H2O O2- (d) (e) H2O (f) O2- OH - O2- 1080 1070 H2O 535 530 Binding Energy, Eb / eV Fig. 7. 3 The (1) O1s, (2) P2p, and (3) Na1s XPS surface spectra of samples treated by (a) AZ treatment up 100 V in 0.1 M H3PO4 aq., (b) AZ-TO treatment (anodized in H3PO4 aq.), (c) AZ treatment up to 80 V in 0.1 M NaOH aq., (d) AZ-TO treatment (anodized in NaOH aq.), and (e) TO treatment. - 111 - 作製した各 Ti 試料の表面状態を調べるために XPS にて酸素の結合状態を分析 したところ，酸化プロセスによって異なる O 1s スペクトルを示し，研磨まま Ti の O 1s スペクトルは，O2- (530.1 eV），OH 基(531.5 eV)，および吸着水分子(532.5 eV)に起因する 3 つのピークで構成されていることがわかった（Fig. 7. 3(1)(f)）． これら 3 つのピークは，陽極酸化処理を施した Ti 表面にも同様にも存在するこ とが確認された（Fig. 7. 3(1)(a), (1)(c)）．ただし，H3PO4 水溶液中で陽極酸化した Ti 試料の O 1s スペクトルの 531.5 eV におけるピークは OH 基およびリン酸イオ ンの両方に起因すると考えられるが，これを 2 つのピークに分離することはで きなかった（Fig. 7. 3(1)(a)）．一方で，Fig. 7. 3(1)(b), (1)(d), (1)(e)に示すように， 研磨まま Ti および陽極酸化 Ti のいずれの試料においても，高温酸化処理を施す と表面から OH 基に起因するピークが消滅し，代わりに吸着水分子に起因する ピークが増大した．このように，高温酸化によって表面 OH 基が消滅すること は Zhao らの報告と一致している[7-9]．また，陽極酸化のみを施した Ti 試料表面 に存在していた PO43-および Na+は，二段階処理を施した Ti 試料表面からは検出 されなかった．この結果は，高温酸化によって Ti 原子が外方拡散し，酸化皮膜 が成長するという Kumar らの研究結果を裏付けている[7-12]．図には示していな いが，いずれの試料表面にも，表面汚染として表面に吸着した炭化水素が同程 度検出された． 各酸化試料は，酸化プロセスの違いに応じて異なる表面親水性を示した．Fig. 7. 1 に示すように，陽極酸化処理を施した場合，使用した水溶液種に関係なく， 研磨まま Ti 試料よりも低い水滴接触角を示した．しかし，高温酸化処理ならび に二段階処理を施した場合，いずれの場合においても研磨まま Ti 試料と同程度 の高い水滴接触角を示した．このような表面親水性の違いについては，表面 OH 基および吸着炭化水素の影響が考えられるが，陽極酸化処理を施しても，表面 - 112 - OH 基および吸着炭化水素の量はほとんど変化しなかった．陽極酸化皮膜表面に は，使用した水溶液に含まれる溶質イオンが存在するものの，これらのイオン は親水性にほとんど影響しないことは第４章にて示されている．一方で，高温 酸化を経て生成した TiO2 表面では，陽極酸化だけで生成した TiO2 とは異なり， 高い接触角を示した．高温酸化のみを施した Ti 試料と二段階処理を施した Ti 試料では，生成する TiO2 の結晶構造が異なるにもかかわらず，いずれも高い接 触角を示した．このことから，TiO2 の結晶構造が水滴接触角におよぼす影響に おいて，アナターゼとルチルでは差がないことがわかる．また，TiO2 皮膜表面 への吸着水分子量が増加しても，水滴接触角は低下しなかった．以上の結果を 踏まえると，高温酸化試料および二段階処理試料の接触角が高い理由として， 表面 OH 基が欠乏することが考えられる．したがって，TiO2 作製プロセスとし て陽極酸化法を用いると，表面 OH 基を有する TiO2 皮膜が生成するために表面 親水性は大きく向上するが，高温酸化処理では表面 OH 基の欠乏した TiO2 皮膜 が生成するために，表面親水性は向上しないことが示唆された． 7. 3. 2. 骨伝導性評価 各酸化プロセスにて作製した Ti 試料をラット脛骨に 14 d 埋植した後の，(1) 皮質骨部および(2)海綿骨部における骨‐インプラント接触率（RB-I）を Fig. 7. 4 に示す．海綿骨部では，どの作製プロセスを用いた場合も 30%に近い RB-I を示 し，試料間で有意差が認められなかったため，これ以降では皮質骨部における 硬組織形成に焦点を絞って議論することとする． 各試料の RB-I 値は，使用した酸化プロセスによって大きく異なった．陽極酸化 試料は，いずれも研磨まま材よりも高い RB-I 値を示した．それとは対照的に，高 - 113 - n= 50 (1) (2) Bone-Implant contact ratio, RB-I(%) 40 5 4 4 5 4 * * * * 3 * 30 20 10 0 40 in healthy bone 30 20 10 0 Fig. 7. 4 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Bone-implant contact ratio, RB-I, of Ti samples in both (1) the cortical bone part and (2) the cancellous bone part: sample volume (n) = 3～5, *p < 0.05. The alphabet symbols in the figure correspond to the letters in Fig. 7. 1. - 114 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) Fig. 7. 5 50 40 a 30 b c 20 e d 10 0 20 30 40 50 60 Water contact angle, θ (deg.) 70 Relationship between the WCA and RB-I values in the cortical bone part. The symbols in closed circle correspond to the letters in Fig. 7. 1. Open circles represent the data for the TiO2-coated sample with the surface roughness of Ra/μm < 0.1, shown in previous chapters. 温酸化を経由して作製した試料は，いずれも研磨まま材と同程度の低い RB-I 値を 示した．二段階処理を施した試料の RB-I 値が低いことから，陽極酸化 TiO2 皮膜 の形成によって一旦 RB-I 値は増大するものの，それに高温酸化処理を施すことで 著しく RB-I 値が低下したことがわかる．すなわち，高温酸化処理で生成する TiO2 皮膜の骨伝導性は低いことを示している．また，TiO2 の結晶構造の違いは骨伝 導性にほとんど影響しないことがわかる．第５章において，結晶性が骨伝導性 におよぼす影響について十分に議論されていないが，Fig. 7. 2 と Fig. 7. 4 の(a)と (b)，あるいは(c)と(d)を比較すると，少なくとも，アナターゼの結晶性が低いこ とは RB-I 値を低下させる要因ではないことがわかる．さらに，高温酸化処理およ - 115 - び二段階処理にて生成した骨伝導性の低い TiO2 皮膜は，いずれも水滴接触角は 60－70 (deg.)程度と高く，Fig. 7. 5 に示すように第６章までに示した結果とよく 一致する．すなわち，陽極酸化法と高温酸化法では，生成する TiO2 の表面親水 性が異なることに起因して骨伝導性に差を生じるものと言える．以上の結果よ り，成膜される物質の種類や結晶構造，およびその作製プロセスよりも，水滴 接触角や OH 基量などの表面の性質が骨伝導性に強く影響するものと考えられ る． 7. 4. 小括 本章では，陽極酸化および高温酸化にて作製した TiO2 皮膜の性質を調査し， in vivo 試験にて骨伝導性を評価した．これらの結果に基づき，酸化プロセスの 違いが骨伝導性におよぼす影響について検討し，以下の知見が得られた． 1) 酸化プロセスによって生成する TiO2 の結晶構造が異なり，陽極酸化法では アナターゼ，高温酸化法ではルチルが得られたが，陽極酸化法で生成したア ナターゼを本実験条件で高温酸化しても，アナターゼのままであった．ただ し，これらの結晶構造の違いによる骨伝導性への影響は認められなかった． 2) 陽極酸化 TiO2 皮膜は高い親水性を示すが，高温酸化 TiO2 皮膜は表面 OH 基 が少ないために，陽極酸化 TiO2 皮膜ほど高い親水性を示さなかった． 3) 高温酸化を経由せず，陽極酸化だけで TiO2 皮膜を作製することで，Ti の骨 伝導性を大きく向上させることが示された． - 116 - 【第７章の参考文献】 [7-1] X. Wang, S. Hayakawa, K. Tsuru and A. Osaka: Biomaterials, 23 (2002) 1353-1357. [7-2] B. H. Lee, Y. D. Kim, J. H. Shin and K. H. Lee: Journal of Biomedical Materials Research, 61 (2002) 466-473. [7-3] S. Nishiguchi, T. Nakamura, M. Kobayashi, H. M. Kim, F. Miyaji and T. Kokubo: Biomaterials, 20 (1999) 491-500. [7-4] T. Kokubo, H. M. Kim and M. Kawashita: Biomaterials. 24 (2003) 2161-2175. [7-5] S. Fujibayashi, M. Neo, H. -M. Kim, T. Kokubo and T. Nakamura: Biomaterials, 25 (2004) 443-450. [7-6] B. Yang, M. Uchida, H.- M. Kim, X. Zhang and T. Kokubo: Biomaterials, 25 (2004) 1003-1010. [7-7] K. Das, S. Bose and A. Bandyopadhyay: Acta Biomaterialia, 3 (2007) 573-585. [7-8] P. S. Vanzillotta, M. S. Sader, I. N. Bastos and G. A. Soares: Dental Materials, 22 (2006) 275-282. [7-9] Y. Zhao, T. Xiong and W. Huang: Applied Surface Science, 256 (2010) 3073-3076. [7-10] B. Feng, J. Weng, B. C. Yang, S. X. Qu and X. D. Zhang: Biomaterials, 24 (2003) 4663-4670. [7-11] Y. Tanaka, M. Nakai, T. Akahori, M. Niinomi, Y. Tsutsumi, H. Doi and T. Hanawa: Corrosion Science, 50 (2008) 2111-2116. [7-12] S. Kumar, T. S. N. S. Narayanan, S. G. S. Raman and S. K. Seshadri: Materials Chemistry and Physics, 119 (2010) 337-349. - 117 - 第８章 各種 Ti 合金への陽極酸化処理および水熱処理 8. 1. 緒言 前章までに，種々の表面処理によって純 Ti 表面に成膜した TiO2 の骨伝導性へ の影響因子を検討し，生成する TiO2 皮膜の表面粗さおよび表面親水性が骨伝導 性に強く影響することが示された．その方法としては，H2SO4 あるいは H3PO4 水溶液中での陽極酸化処理や，それらに水熱処理を組み合わせた手法が有効で あることを述べた． 第１章でも述べたが，人工股関節や人工膝関節など，強度を必要とする部位 では純 Ti よりも機械的強度に優れた α+β 型 Ti 合金が多く使用されている．また， ストレスシールディングによる骨吸収を軽減するために，皮質骨と弾性率の近 い β 型 Ti 合金の開発が盛んに行われている．これらの Ti 合金では，相制御のた めに様々な金属元素が添加されている．一方で，硬組織適合性向上のための表 面処理として，これらの Ti 合金に陽極酸化処理を施す場合，合金元素の影響は 十分に明らかではない．そこで，本章では 4 種類の Ti 合金を取り上げ，純 Ti の表面処理に関して得られた知見をもとに各 Ti 合金に表面処理を施し，合金元 素の影響を明らかにし，Ti 合金の骨伝導性向上に有効な表面処理を検討する． 8. 2. 実験方法 8. 2. 1. 前処理 試料には，α+β 型 Ti 合金の Ti-6Al-4V ELI (Ti64)および Ti-6Al-7Nb (Ti67)と，β 型 Ti 合金の Ti-29Nb-13Ta-4.6Zr (TNTZ)および Ti-13Cr-1Fe-3Al (TCFA)の 4 種類の - 118 - 合金を用いた．いずれの合金試料に対しても，合金組成は mass%で表している． 各合金のディスク状板材（表面積 1.13 cm2）および丸棒材（2×5 mm）を，そ れぞれ皮膜分析用ならびに in vivo 試験用の基材として用いた．また，各合金の 構成元素単体（Ti, Al, V, Nb, Ta, Zr, Cr, Fe）のディスク状板材（表面積 0.79 cm2 （Ti のみ 1.13 cm2））を比較分析用に使用した．これらを SiC エメリー紙で一定 方向に湿式研磨した後，粒径 0.05 μm の Al2O3 粉末を用いてバフ研磨を行い，基 材の表面粗さを一定とした．研磨後は，基材表面を蒸留水で洗浄し，エタノー ルで脱脂した後，表面以外をエポキシ樹脂あるいはシリコーンシーラントで被 覆し，以降の表面処理に供した． 8. 2. 2. 表面処理 8. 2. 2. 1. 陽極酸化処理 陽極酸化処理は，各合金あるいは単体金属基材を作用極，Pt コイルを対極と した 2 極法にて行った．①0.1 M H3PO4 あるいは 0.1 M H2SO4 の希薄水溶液中で， および②1～9 M H3PO4 の濃厚水溶液中で陽極酸化処理を施した．印加電圧は 0 V から 0.1 Vs-1 にて上昇させ，最大 200 V まで印加した．その後，ただちに水溶液 中から試料を取り出し，蒸留水にて洗浄し，エアブロワーにて表面の水滴を除 去した．電圧印加中は一定速度にて水溶液を撹拌し，恒温槽中にて 298 K 一定 に保持した．陽極酸化処理後，すべての試料はオートクレーブ滅菌容器内で滅 菌処理（394 K，20 min.）を施した後，以降の各種分析ならびに in vivo 試験に供 するか，あるいは以降の処理に供した． 8. 2. 2. 2. 水熱処理および PBS(-)保存 水熱処理は，研磨まま TNTZ および 0.1 M H2SO4 100 V 陽極酸化 TNTZ に対し て行った．これらの基材を蒸留水の入ったビーカーに浸漬させ，ビーカーごと オートクレーブ容器内に設置した．すべての水熱処理は，滅菌に使用したオー - 119 - トクレーブ容器とは別のオートクレーブ容器を用いて行った．室温（298 K）か ら 4 K min.-1 にて昇温させ，ビーカー内の温度が 393 K あるいは 453 K に達した 後，最大 180 min.そのままの温度で保持した．水熱処理後は，オートクレーブ容 器内から速やかにビーカーごと試料を取り出し，ビーカー内で室温まで自然冷 却させた後，試料を取り出し，エアブロワーにて表面の水滴を除去し，大気中 あるいは x5 PBS(-)中に浸漬して保存した．その後，各種分析ならびに in vivo 試 験に供した． 8. 2. 3. 表面分析 走査型電子顕微鏡（SEM；NeoScope JCM-5000，日本電子および S-4800， HITACHI）にて皮膜の表面形態を観察し，薄膜 X 線回折装置（XRD；XRD6100， 島津製作所）および電子線回折装置にて生成物の結晶構造の同定を行い，さら に X 線光電子分光装置（XPS；ESCA-3300，島津製作所）にて皮膜表面の定性 および定量分析を行った．オージェ電子分光装置（AES；PHI 700 Xi，ULVAC-PHI） を用いて皮膜の深さ方向の組成分析を行った．共焦点レーザー顕微鏡（OLS3500， オリンパス）を用いて算術平均表面粗さ Ra（分析範囲 150 μm×112 μm）を測定 した．表面の親水性については，動的接触角計（FTA100B，ジャスコインター ナショナル）を用いた静的水滴接触角測定により評価した．オートクレーブ滅 菌処理の 24 h 後に，1 つの試料につき 3 ヶ所において 2 μL の水滴と試料との接 触角を測定し，その平均値を静的水滴接触角として使用した． 8. 3. 結果および考察 8. 3. 1. 希薄水溶液中の陽極酸化処理 8. 3. 1. 1. 単体金属の陽極酸化 Fig. 8. 1 に Ti, Al, Nb, Ta, Zr, Cr, Fe の単体金属の 0.1 M H3PO4 水溶液中における - 120 - Nb Nb Al 0.1 M H3 PO4 200 V 0.1 M H3 PO4 200 V 20 30 40 50 60 20 Ta Ta 30 Intensity (a.u.) 0.1 M H3 PO4 100 V 50 0.1 M H3 PO4 50 V 40 Zr 40 60 Cr 0.1 M H3 PO4 200 V 20 30 Al 50 60 20 30 Cr 40 60 Fe Fe Zr 50 0.1 M H3 PO4 50 V ZrO2 20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 2θ (deg., CuKα) Fig. 8. 1 XRD pattern of single metals of Nb, Ta, Zr, Al, Cr, and Fe after anodizing in 0.1 M H3PO4 aq. up to 200 V. アノード分極曲線を示す．また Fig. 8. 2 に陽極酸化後の各種単体金属の XRD パ ターンを示す．金属の種類によってアノード分極挙動が大きく異なった．Nb, Ta, Zr の単体金属は，Ti の単体金属と同様に，いずれも印加電圧の上昇とともに酸 化皮膜が成長し，200 V まで電圧を印加しても絶縁破壊は生じず，電圧印加前の 平滑表面を維持していた．Zr の場合，100 V 程度の比較的低い印加電圧で ZrO2 の鋭い回折ピーク（◇）が検出され，結晶性酸化物が生成しやすいことが示唆 - 121 - Fig. 8. 2 Current-voltage response in case of anodizing single metals of Ti, Al, V, Nb, Ta, Zr, Cr, and Fe in 0.1 M H3PO4 aq. at increasing rate of 0.1 V s-1. された．一方で，Nb および Ta の場合は 200 V まで電圧を印加しても結晶性酸化 物の存在は確認できず，アモルファス状の酸化物が生成しているものと考えら れる．Al の単体金属にアノードの電圧を印加すると，印加電圧の上昇とともに 酸化皮膜が成長するが，180 V 近傍で絶縁破壊が生じた．以上のように，第一種 バルブメタルである Nb, Ta, Zr, Al 表面には，200 V 以下の範囲で印加電圧を上昇 させた場合に酸化皮膜が成長することが認められた． 一方で，Cr，Fe，および V の単体金属は，アノード電圧を印加すると，5 V 程度までは酸化皮膜が成長するが，それ以上電圧を上昇させると基板表面から 大量の気体が発生すると同時に表面は粗雑化した．このとき，水溶液中に各金 属のイオンが水溶液中に溶出することが ICP 発光分光分析にて確認された．こ - 122 - Fig. 8. 3 Current-voltage response in case of anodizing Ti alloys of Ti64, Ti67, TNTZ, and TCFA and also single metal of Ti in 0.1 M H3PO4 aq. at increasing rate of 0.1 V s-1. のように，第二種バルブ金属である Cr と，バルブ金属でない V および Fe は同 様の電解挙動を示すことが認められた． 8. 3. 1. 2. Ti 合金の陽極酸化 Fig. 8. 3 に各 Ti 合金に対する 0.1 M H3PO4 水溶液中でのアノード分極曲線を示 す． また生成する酸化物の表面 SEM 像および XRD パターンをそれぞれ Fig. 8. 4， Fig. 8. 5 に示す．いずれの合金種においても，印加電圧の低い場合には，電流は ほとんど流れず，絶縁破壊が生じていないことから，表面は平滑であった．陽 極酸化の初期段階で生成する酸化物がアモルファスであることから，Fig. 8. 5 に - 123 - (0) (1) (2) 10 μm (a) Ra/μm = 0.069 0.087 0.111 0.065 0.094 0.123 0.065 0.092 0.081 0.050 0.084 0.234 0.057 0.082 0.114 (b) (c) (d) (e) Fig. 8. 4 Surface SEM images of (a) Ti64, (b) Ti67, (c) TNTZ, (d) TCFA, and (e) pure Ti which were (0) as-polished and (1) anodized up to 100 V (65 V only for TCFA) and (2) 200 V in 0.1 M H3PO4 aq. (298 K), operated at 0.1 V s-1. - 124 - (a) (1) (b) anatase (c) (1) (1) (2) (2) Intensity (a.u.) rutile (2) 20 25 30 20 2θ (deg., CuKα) 25 30 20 (e) (d) (1) (1) (2) (2) 20 Fig. 8. 5 25 25 30 20 25 30 XRD patterns of (a) Ti64, (b) Ti67, (c) TCFA, (d) TNTZ, and (e) pure Ti after anodizing up to (1) 100 V (65 V only for TCFA) and (2) 200 V in 0.1 M H3PO4 aq. (298 K), operated at 0.1 V s-1. - 125 - 30 おいて酸化物の回折ピークの検出されない Ti64 ((a)(1))，Ti67 ((b)(1))の 100 V 陽 極酸化材，および TCFA ((d)(1))の 65 V 陽極酸化材では，アモルファス状の酸化 物が生成しているものと考えられる．TNTZ ((c)(1))の 100 V 陽極酸化材について は，アナターゼの回折角を中心としたブロードピークが検出されることから， 結晶配列がアナターゼと近いアモルファスとして存在しているものと考えられ る．印加電圧を上昇させると，Ti64, Ti67, TCFA はいずれも表面が粗雑化し，150 V 以上でアナターゼが生成した (Fig. 8. 5(a)(2), 5(b)(2), 5(c)(2))．特に，TCFA で は分極曲線(Fig. 8. 3)において気体の発生による電流値の上昇が認められること から，絶縁破壊が生じたことが示唆され，表面は著しく粗雑化した (Fig. 8. 4 (d)(2))． 一方で，TNTZ の場合，印加電圧を 200 V まで上昇させても平滑表面を維持し ており，また X 線回折においても結晶性酸化物の生成は認められなかった．し かし，0.1 M H3PO4 の代わりに 0.1 M H2SO4 水溶液中を使用して陽極酸化を施す と，150 V にてアナターゼが生成し，表面粗さは増大した．このことから，Ti64, Ti67, TNTZ, TCFA のいずれの Ti 合金を用いても，酸化条件を制御することで結 晶性 TiO2 の生成が可能であることが示された．ただし，第３章で述べたように， 表面改質層の化学的性質よりも表面粗さが骨伝導性に強く影響することを考慮 し，以降の分析用試料としては平滑表面を維持するために，Ti64, Ti67, TNTZ で は 0.1 M H3PO4 100 V 陽極酸化材，TCFA では 0.1 M H3PO4 65 V 陽極酸化材を使 用した． 純 Ti では，同じ 0.1 M H3PO4 水溶液中で陽極酸化した場合でも，100 V ですで にアナターゼの回折ピークが確認されることから，Ti に合金元素を添加するこ とで TiO2 が結晶化しにくくなるものと推察される．そこで，酸化皮膜の組成を - 126 - 100 80 (a) (b) O O Molar content / mol% 60 40 Ti 20 P 00 100 80 Ti V 10 Al 20 0 30 40 20 00 Fig. 8. 6 10 O P 20 30 40 (d) (c) 60 Nb Al P Ti O Zr Ta 20 Ti Nb P 40 60 0 10 Sputtering Time, t / min. Cr Fe Al 20 30 Depth profile of (a) anodized Ti64 in 0.1 M H3PO4 aq. up to the voltage of 100 V, (b) anodized Ti67 in 0.1 M H3PO4 aq. up to the voltage of 100 V, (c) anodized TNTZ in 0.1 M H3PO4 aq. up to the voltage of 100 V, and (d) anodized TCFA in 0.1 M H3PO4 aq. up to the voltage of 100 V. 調べるために，AES にて深さ方向の元素分析ならびに表面の XPS 分析を行い， その結果を Fig. 8. 6，Fig. 8. 7 に示す．いずれの合金種においても，水溶液とし て H3PO4 を使用した場合には，表面にリンの混入が確認された．酸化皮膜内部 では金属元素としては Ti が最も多く存在することがわかる．(a) Ti64, (b) Ti67 で は皮膜内部の O/Ti モル比が 2 に近いことから，TiO2 が主に生成するものと考え - 127 - Intensity (a.u.) (a) Ti 2p Al 2p Ti4+ 470 Al3+ 460 Binding energy, E/eV 70 Al 2p Ti 2p (b) 80 Nb 3d 470 460 80 210 70 Nb 3d Ti 2p Nb5+ Al3+ Ti4+ 200 Ta 4f Nb5+ O 2s Ta4+ Ti4+ (c) Ta5+ Ta2+ 470 210 460 Ti 2p 30 200 Cr 2p Al 2p Cr3+ 20 Al3+ Ti4+ (d) 470 Fig. 8. 7 460 590 580 80 70 XPS spectra of (a) Ti64, (b) Ti67, (c) TNTZ, and (d) TCFA anodized up to 100 V (65 V only for TCFA) in 0.1 M H3PO4 aq. (298 K), operated at 0.1 V s-1. - 128 - Table 8. 1 Relationship between molar ratio of alloy element against Ti in Ti64, Ti67, TNTZ, and TCFA, and tendency whether alloy elements are contained in the anodized film or not. Type of Ti Alloy Molar ratio in alloy Existense in the film (a) Ti64 (b) Ti67 (c) TNTZ (d) TCFA Al/Ti V/Ti Al/Ti Nb/Ti Nb/Ti Ta/Ti Zr/Ti Cr/Ti Fe/Ti Al/Ti 0.12 0.04 0.12 0.04 0.28 0.06 0.05 0.14 0.01 0.06 × × × × ○ × × ○ × × られる．XPS にて V は皮膜中に検出されず，一方で Al, Nb は検出されるが，Fig. 8. 6(a)からもわかるように皮膜中の存在量はわずかであった．(d) TCFA の場合も， 皮膜内部では TiO2 が主に生成するものと考えられるが，表面近傍では Ti よりも Cr の方が多く検出された．XPS にて Cr の価数を調べたところ，3 価として存在 していることから，皮膜の最表面には Cr2O3 リッチな層が存在することが示唆さ れたが（Fig. 8. 7(d)），XRD 分析では Cr の化合物に起因するピークは検出されな かった（Fig. 8. 5(d)）．Al および Fe は皮膜中にはほとんど含まれていなかった． (c) TNTZ の場合，酸化皮膜内部の金属元素として，Ti に加えて Nb も多く検出 されたが，Ta および Zr は皮膜中にほとんど含まれていなかった． （Fig. 8. 6(c)）． XPS にて Nb の価数を調べたところ，5 価として存在することがわかった（Fig. 8. 7(c)）．そこで，Fig. 8. 6 において TNTZ の陽極酸化皮膜内部に存在する Ti およ び Nb の平均モル分率を算出すると，それぞれ 0.23，0.08 であった．そこでこの - 129 - 値を用い，皮膜中に TiO2 と Nb2O5 が存在するものと仮定して O の理論モル分率 を計算すると 0.69 であり，実際の皮膜内部における O の平均モル分率である 0.68 に極めて近い値を示した． 以上の皮膜内部の組成分析結果をもとに，Ti 合金中の Ti に対する各合金元素 の mol 比と，皮膜中への各合金元素の混入しやすさを Table 8. 1 にまとめた．少 量あるいはほとんど存在しないものを×，皮膜中に多く存在するものを○とし て示している．合金元素の種類によって皮膜中への混入しやすさは異なるもの と考えられるが，合金中の合金元素の濃度が低い場合に皮膜中に混入しにくい 傾向が認められる．Nb は Ti67 および TNTZ の両方に含まれているが，合金中の Ti との mol 比によって皮膜への混入しやすさは大きく異なることがわかる．ま た，TNTZ における Nb と TCFA における Cr はいずれも陽極酸化皮膜中に多く 混入するものの，Nb は深さ方向に均一に分布するのに対し，Cr は水溶液との界 面近傍に局所的に存在しており，皮膜内部での分布形態が異なった．これは， Cr 単体の陽極酸化において酸化皮膜が厚く生成せず，高印加電圧下では水溶液 中に溶出することから，TCFA の陽極酸化時にも，皮膜中から一旦溶出した Cr が TiO2 の形成時に取り込まれるために，水溶液側界面に局在化するものと考え られる． 8. 3. 1. 3. 酸化皮膜の表面親水性 Fig. 8. 8 に各 Ti 合金およびそれらの構成元素の単体金属の陽極酸化前後の水 滴接触角を示す．単体金属の陽極酸化材は，各合金の陽極酸化材と同じ電圧で 処理した試料を使用した．第 4 章でも述べたとおり，H3PO4 水溶液中で陽極酸化 した場合，Ti 表面に生成する酸化皮膜は 20 (deg.)程度の低い水滴接触角を示す が，Ti および Al 以外の単体金属は，陽極酸化後，いずれも 60 (deg.)以上の高い - 130 - Water contact angle, θ (deg.) 80 As-polished Anodized (a) 60 40 (c) N/A 20 0 Ti64 Ti Al V TNTZ Ti Nb Ta Zr Ti Cr Fe Al 80 (b) (d) 60 40 20 0 Fig. 8. 8 Ti67 Ti Al Nb TCFA Water contat angle of each metals anodized in 0.1 M H3PO4 aq. : (a) Ti64 and their components, applied voltage; 100 V, (b) Ti67 and their components, applied voltage; 100 V, (c) TNTZ and their components, applied voltage; 100 V, and (d) TCFA and their components, applied voltage; 65 V. - 131 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) Fig. 8. 9 60 As-polished Anodized 50 40 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 30 20 10 0 (a) (b) (c) (d) (e) Bone-Implant contact ratio, RB-I, of (a) Ti64, (b) Ti67, (c) TCFA, (d) TNTZ, and (e) pure ,anodized up to 100 V (65 V only for -1 TCFA) in 0.1 M H3PO4 aq. (298 K) operated at 0.1 V s , *p < 0.05. 水滴接触角を示した． Ti 合金の場合，研磨ままではいずれの Ti 合金も純 Ti と同様に 60 (deg.)程度の 高い水滴接触角を示した．しかし，これらの Ti 合金に陽極酸化を施すと，合金 の種類によって陽極酸化後の接触角は大きく異なった．Ti64 および Ti67 では水 滴接触角は 20 (deg.)程度まで大きく低下し，純 Ti の陽極酸化皮膜とほぼ同程度 であった．これは，Ti64 および Ti67 表面に生成した TiO2 皮膜が，純 Ti 上に生 成した TiO2 とほとんど同様のものであることを示唆している，一方で，TNTZ に おいては，陽極酸化後の水滴接触角は 50 (deg.)以上であり，純 Ti の陽極酸化材 とは異なる一方で，Nb 単体の陽極酸化材に近い値を示した．皮膜の組成分析の 結果を考慮すると，TNTZ の陽極酸化皮膜中に Nb2O5 の結晶相が存在し，この相 - 132 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 60 40 20 0 0 20 40 80 60 Water contact angle, θ (deg.) Treatment Type of Metals Electrolyte Voltage (V) Symbol Ti64 As-polished Ti67 TNTZ TCFA Ti Correspond to data in Fig. 6. 7. Ti64 Ti67 Anodized TNTZ 100 0.1 M H3PO4 TCFA Fig. 8. 10 100 100 65 Relationship between the WCA and RB-I values in the cortical bone part. - 133 - が表面親水性に強く影響したことが示唆される．TCFA においても TNTZ の場合 と同様に，陽極酸化後の水滴接触角は 50 (deg.)以上であり，皮膜表面に局在する Cr2O3 の結晶相が表面親水性に強く影響したものと考えられる． 8. 3. 1. 4. 骨伝導性評価 Fig. 8. 9 に，皮質骨部における各種 Ti 合金の RB-I 値を示す．いずれの Ti 合金 も，研磨ままでは RB-I 値は 10～20%程度であり，その骨伝導性は高くない．親 水性の高い Ti64 および Ti67 の陽極酸化材は，40%程度の高い RB-I 値を示すのに 対し，より親水性に劣る TNTZ および TCFA の陽極酸化材は，研磨まま材と同 程度の低い RB-I 値を示した．そこで，これらの試料における水滴接触角と皮質骨 部の RB-I 値の対応関係を，前章までで示した純 Ti における対応関係と併せて Fig. 8. 10 に図示したところ，Fig. 8. 10 上に示す線上にほぼ一致した．このことから， 使用した Ti 合金の骨伝導性は，酸化皮膜の組成は関係なく，水滴接触角によっ て整理できることが示された． 8. 3. 2. 濃厚水溶液中での陽極酸化処理 8. 3. 2. 1. 酸化皮膜の性質 希薄水溶液中での陽極酸化処理では骨伝導性の向上が認められなかった TNTZ および TCFA に対して，濃厚水溶液中で陽極酸化を施し，皮膜中へのリン 酸イオンの取り込みを検討した．Fig. 8. 11 に 0.1～5 M 水溶液中における TNTZ および TCFA の分極曲線を示した．各濃度の H3PO4 水溶液中で 200 V まで電圧 を印加した時の XRD パターン，表面 SEM 像，および皮膜中へのリン酸イオン 混入量をそれぞれ Fig. 8. 12，Fig. 8. 13，および Fig. 8. 14 に示す． TNTZ では，H3PO4 濃度が 0.1 M のときには，200 V まで電圧を印加してもス パークは生じず，平滑表面が維持された（Fig. 8. 13(c)(1)）．3 M 以上の H3PO4 を - 134 - Fig. 8. 12 Current-voltage response in case of anodizing (c) TNTZ and (d) TCFA in 0.1, 3, and 5 M H3PO4 aq. at increasing rate of 0.1 V s-1. (c) (e) (d) 3M anatase Intensity (a.u.) 0.1 M 5M 20 25 30 20 25 20 25 30 2θ (deg., CuKα) Fig. 8. 11 XRD pattern of (c) TNTZ, (d) TCFA, and (e) Ti which were anodized up to the voltage of 200 V in 0.1, 3, and 5 M H3PO4 aq. at increasing rate of 0.1 V s-1. - 135 - (c) (d) (e) (0) Ra/μm = 0.065 0.050 0.057 0.081 0.234 0.114 0.188 0.289 0.321 0.360 0.320 0.467 20 mm (1) (2) (3) Fig. 8. 13 Surface SEM images and surface roughness of (c) TNTZ, (d) TCFA, and (e) Ti which were (0) as-polished or anodized in (1) 0.1 M, (2) 3 M, and (3) 5 M H3PO4 aq. (298 K) up to 200 V at a rate of 0.1 Vs-1. - 136 - (P 2p / Ti 2p) ratio in XPS spectrum 1.5 Ti TNTZ 1.0 TCFA 0.5 0 0 2 4 6 8 10 H3PO4 concentration in bath, C / M Fig. 8. 14 Relative concentration of P against Ti at the surface of ○: Ti, ■: TNTZ, and ▲: TCFA which were anodized in different concentrations of H3PO4 aq. up to the voltage of 200 V. 用いた場合，印加電圧を 100 V まで上昇させるとスパークが発生し，さらに印 加電圧を上昇させると，スパーク発生時の電流密度が大きく上昇するとともに （Fig. 8. 11(c)），表面粗さは大きく増大した（Fig. 8. 13(c)(2)）．さらなる H3PO4 濃度の上昇によっても同様の現象が確認され，5 M H3PO4 水溶液中で 200 V まで 印加電圧を上昇させると，皮膜表面はスパークによって溶融したような形状を 呈していた（Fig. 8. 13(c)(3)）．いずれの濃度の H3PO4 を用いても皮膜中にリン酸 イオンが混入するが，特に 2 M 以上ではその混入量が急激に増大し，純 Ti の場 合と同様に，皮膜中への混入量は飽和値に達し，水溶液中の H3PO4 濃度を増加 させてもそれ以上リン酸イオンは皮膜中に取り込まれなかった（Fig. 8. 14 の■）． このことに加え，3 M 以上の H3PO4 水溶液中で陽極酸化したときの XRD パター - 137 - ンにて，アナターゼの回折角である θ = 25.2 (deg.)近傍を中心としたブロードな 回折ピークが得られることから，アナターゼライクアモルファスが生成したも のと考えられる（Fig. 8. 12(c)）．ただし，皮膜中リン酸イオン濃度の低い 0.1 M で 陽極酸化を施した試料においても，ブロードな回折ピークを示すことから（Fig. 8. 12(c)），第４章で純 Ti において認められたような半値幅とリン酸イオン混入 量の相互関係は認められなかった． TCFA の場合，H3PO4 濃度が 0.1 M のときにはスパークの発生は確認できない が， 3 M 以上では 65 V 程度から 200 V まで断続的にスパークが発生し続け Fig. 8. 14，アナターゼライクアモルファスが生成した．しかし，TNTZ の場合と比較し てスパーク発生時の電流値は低く，スパークの発生によって表面は粗雑化する ものの，H3PO4 濃度が増加しても TNTZ ほど表面形状は大きく変化しなかった． いずれの濃度において 200 V まで電圧を印加した場合も，XPS 分析結果から高 い P/Ti 強度比を有することがわかるが（Fig. 8. 14），0.1 M H3PO4 使用時には皮 膜表面での Ti 濃度が低いことから，実質的には 3 M 以上の H3PO4 水溶液中で成 膜した酸化皮膜の方が表面 P 濃度の高いことがわかる． H3PO4 濃度を 0.1～5 M まで変化させたときの，皮膜表面の合金元素濃度の変 化を Fig. 8. 15 に示す．合金元素濃度は，XPS スペクトルにおける各合金元素の ピークと Ti のピークの面積強度比として算出した値を用い，Ti との相対的な濃 度として評価した．H3PO4 濃度が 0.1 M のときには，TNTZ の酸化皮膜表面にお ける Nb, Ta, Zr の濃度は，基材内部よりも低く，相対的に Ti 濃度の高い表面と なっている．しかし，H3PO4 濃度が 1 M 以上のときには，いずれの合金元素の 表面濃度も大きく増大し，相対的に Ti の表面濃度は減少した．すなわち，TNTZ を 1 M 以上の高濃度 H3PO4 水溶液中で陽極酸化すると，表面合金元素濃度の高 い酸化皮膜が生成することがわかる．TCFA の場合には，H3PO4 濃度が 0.1 M の - 138 - 10 1.5 Nb 3d 1 6 in the substrate 4 0.5 (X / Ti 2p) ratio in XPS spectrum Cr 2p 8 2 0 0 Al 2p Ta 4f 1 0.2 0.5 0.1 0 0 Fe 2p Zr 3d 0.2 0.2 0.1 0 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 H3PO4 concentration, C / M Fig. 8. 15 Relative concentrations of (a) Nb, Ta, and Zr against Ti at the surface of TNTZ, and (b) Cr, Al, and Fe against Ti at the surface of TCFA, both of which were anodized in different concentrations of H3PO4 aq. up to the voltage of 200 V. ときに Cr の表面濃度が最も高くなるが，H3PO4 濃度の増加とともに Cr の表面濃 度は単調減少し，5 M では Cr はほとんど検出されなかった．また，Al と Fe は いずれの H3PO4 濃度においても検出されなかった． 次に，印加電圧の影響を調べるために，5 M H3PO4 水溶液中で 200 V 以下の電 - 139 - (a) 1.0 0.5 0 0 100 200 (Cr 2p / Ti 2p) ratio in XPS spectrum (P 2p / Ti 2p) ratio in XPS spectrum 1.5 (b) 8 6 4 2 0 0 Applied voltage, E / V 100 Applied voltage, E / V 200 Fig. 8. 16 Relative concentration of (a) P and (b) Cr against Ti at the surface of TCFA anodized in ○: 0.1 M H3PO4 and ●: 5 M H3PO4 aq. at different voltages. (a) 20 μm (b) (c) Ra/μm = 0.250 0.351 0.320 Fig. 8. 17 Surface SEM images and surface roughness of TCFA anodized in 5 M H3PO4 aq. at the voltages of (a) 65 V, (b) 150 V, and (c) 200 V. - 140 - Intensity (a.u.) (a) anatase (b) (c) 20 25 2θ (deg., CuKα) 30 Fig. 8. 18 XRD patterns of TCFA anodized up to the voltage of (a) 65 V, (b) 150 V, and (c) 200 V in 5 M H3PO4 aq. 圧で TCFA を陽極酸化したときの，皮膜表面におけるリン酸イオン濃度および Cr 濃度を Fig. 8. 16 に，表面 SEM 像を Fig. 8. 17 に，XRD パターンを Fig. 8. 18 にそれぞれ示す．印加電圧が 65 V のときにすでに Fig. 8. 14 で示した飽和値に近 い量のリン酸イオンが皮膜中に取り込まれているものの表面 Cr 濃度は高く，150 V 以上に印加電圧を上昇させると Cr はほとんど検出されない程度に減少し（Fig. 8. 16），表面が粗雑化するとともにアナターゼライクアモルファスが生成するこ とが認められた（Figs. 8. 17, 8. 18）． 以上の結果より，TNTZ, TCFA ともに高濃度 H3PO4 水溶液中で陽極酸化するこ とで，純 Ti と同様に皮膜表面に多量のリン酸イオンが導入され，アナターゼラ - 141 - イクアモルファスが生成する一方で，H3PO4 濃度および印加電圧を変化させても， TNTZ の陽極酸化皮膜表面には合金元素が残存するが，TCFA の場合，条件によ っては表面合金元素濃度の著しく低い陽極酸化皮膜の成膜が可能であることが わかった．そこで，in vivo 試験に供する試料として，TNTZ では比較的高い表面 合金元素濃度の酸化皮膜が生成する 3 M H3PO4 200 V 陽極酸化材，および TCFA では表面合金元素濃度の最も低い 5 M H3PO4 150 V 陽極酸化材を選定した． 8. 3. 2. 2. 骨伝導性評価 Fig. 8. 19 に皮質骨部における各試料の RB-I 値を示す．TNTZ の 3 M H3PO4 200 V 陽極酸化材は，TNTZ の研磨まま材と比較するとわずかに RB-I 値は増加している ものの，有意差は認められなかった．一方で，TCFA の 5 M H3PO4 150 V 陽極酸 化材においては，純 Ti の高濃度 H3PO4 陽極酸化材と同程度の高い RB-I 値を示し， TCFA の研磨まま材との有意差が認められ，骨伝導性が大きく向上したことが認 められた． いずれの合金の高濃度 H3PO4 陽極酸化材も Ra/μm > 0.1 の粗い表面を有するこ とから，表面粗雑化による RB-I 値への影響に差はないことがわかる．また，TNTZ を 0.1 M H3PO4 水溶液中で陽極酸化した場合にもアナターゼライクアモルファ スが生成するが，その RB-I 値が低いことから，アナターゼライクアモルファスの 結晶構造自体が骨伝導性の向上に寄与するわけではないことがわかる．一方で， Fig. 8. 16 に示したように，基材の合金種によって皮膜表面の合金元素濃度は異 なり，TNTZ の皮膜表面にのみ，その合金元素である Nb, Ta, Zr の存在が認めら れた． 各合金の高濃度 H3PO4 陽極酸化材の水滴接触角と RB-I の対応関係をプロット した結果を Fig. 8. 20 に示す．TCFA（▼）の場合，水滴接触角が 60 (deg.)を示す ものの高い RB-I 値を示し，近似曲線で示されるような水滴接触角と RB-I の対応関 - 142 - 係には従わなかった．一方で，TNTZ の場合（◆）は，純 Ti あるいは TCFA の 場合とは異なり，近似曲線近傍にプロットされていることから，その骨伝導性 が皮膜の表面親水性を強く反映している可能性が示唆された．この結果は，皮 膜中の合金元素が表面親水性に強く影響するという 8. 3. 1 節の結果と一致して おり，皮膜表面に合金元素が残存する場合には骨伝導性は向上しないことを示 唆している． 4 5 6 3 4 (F) 4 (e) (E) n= 3 (d) 60 * 40 (D) (A) (C) 0 (B) 20 (A) Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) (c) Fig. 8. 19 The RB-I of (c) TNTZ, (d) TCFA, and (e) Ti, which were (A) as-polished, anodized in 0.1 M H3PO4 aqueous solution up to the voltage of (B) 100 V and (C) 65 V, (D) anodized in 3 M H3PO4 aqueous solution up to the voltage of 200 V, and anodized in 5 M H3PO4 aq. up to the voltage of (E) 150 V and (F) 200 V. p* < 0.05. - 143 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Water contact angle, θ (deg.) Fig. 8. 20 Relationship between RB-I in the cortical bone part and WCA of TNTZ and TCFA samples anodized in concentrated H3PO4 aq. Symbols: ◆: TNTZ sample anodized in 0.1 M H3PO4 aq. up to 100 V (shown in Fig. 8. 10), ◆: TNTZ sample anodized in 3 M H3PO4 aq. up to 200 V, ▼: TCFA sample anodized in 0.1 M H3PO4 aq. up to 65 V (shown in Fig. 8. 10), ▼: TCFA sample anodized in 5 M H3PO4 aq. up to 150 V, ●: TiO2-coated samples with Ra/μm < 0.1 (shown in Fig. 6. 7), and ●: Ti samples anodized in 0.1-9 M H3PO4 aq. (shown in Fig. 5. 10). - 144 - Table 8.2 8. 3. 3. WCA of surface modified TNTZ with different processes. Surface treatment applied for TNTZ Water contact angle (deg.) As-polished 71 Anodizing 47 Hydrothermal treatment 24 Anodizing and hydrothermal treatment 16 水熱処理の効果 Fig. 8. 21，Fig. 8. 22，および Table 8. 2 に水熱処理前後の研磨まま TNTZ およ び陽極酸化 TNTZ（0.1 M H2SO4 水溶液中にて 150 V まで電圧印加）の表面 SEM 像，XRD パターン，ならびに水滴接触角を示す．いずれの試料においても，水 熱処理による表面粗さの変化は認められなかった．研磨まま材に水熱処理を施 すと，酸化皮膜は成長するものの，XRD では酸化物に起因するピークは検出さ れなかった．また，陽極酸化 TNTZ においては，水熱処理による結晶構造の変 化は認められなかった．処理直後の水滴接触角は表面処理ごとに異なり，陽極 酸化処理のみでは研磨直後の 71 (deg.)から 47 (deg.)まで低下し，水熱処理のみで は 24 (deg.)まで，陽極酸化後に水熱処理を施すと 16 (deg.)まで低下した．このこ とから，TNTZ においても純 Ti と同様に，水熱処理を施すことで親水性の大幅 な向上が可能であること，ならびに陽極酸化処理と水熱処理を組み合わせるこ とで，さらに高い親水性表面が形成されることがわかった．このことから，Nb, Ta, Zr などの合金成分が表面に存在していても，親水性表面の形成が可能である ことがわかる． - 145 - (a) (b) 5 mm Ra/μm = 0.07 (c) 0.14 (d) 0.03 0.14 Fig. 8. 21 Surface SEM images and surface roughness, Ra, of TNTZ, which were (a) as-polished, (b) anodized in 0.1 M H2SO4 aq. up to the voltage of 150 V, (c) hydrothermally treated in distilled water at the temperature of 453 K for 180 min., and (d) hydrothermally treated in distilled water at the temperature of 453 K for 180 min.after anodized in 0.1 M H2SO4 aq. up to the voltage of 150 V. - 146 - Intensity (a.u.) (a) (b) (c) 20 30 40 50 60 2θ (deg., CuKα) Fig. 8. 22 XRD patterns of TNTZ which were (a) anodized in 0.1 M H2SO4 aq. up to the voltage of 150 V, (b) hydrothermally treated in distilled water at the temperature of 453 K for 180 min., and (c) hydrothermally treated in distilled water at the temperature of 453 K for 180 min.after anodized in 0.1 M H2SO4 aq. up to the voltage of 150 V. Symbols: ●= anatase, ○= α-Ti. - 147 - Water contact angle, θ (deg.) 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 Storing period in each of the atmosphere, t /h Fig. 8. 23 Temporal changes in WCA of TNTZ which was hydrothermally treated at 453 K for 180 min. in distilled water and then stored in ○:air or ●: x5 PBS(-) solution. 水熱処理のみを施した試料を空気中あるいは x5 PBS(-)中に保存したときの保 存期間による水滴接触角の変化を Fig. 8. 23 に示す．空気中保存では，時間経過 とともに水滴接触角は単調増加するのに対し，x5 PBS(-)中保存では，純 Ti と同 様に 24 h 後に 5 (deg.)以下まで低下し，それ以降，接触角は増大せず，超親水性 表面の維持が可能であった．そこで，TNTZ に水熱処理のみを施し，x5 PBS(-) 中に保存した試料を in vivo 試験に供したところ，Fig. 8. 24 に示すように 50%程 度の高い RB-I 値を示した．このことは，TNTZ 表面に存在する合金成分に骨形成 を阻害する作用があるわけではなく，純 Ti と同様に，親水性表面を形成するこ - 148 - Bone-Implant contact ratio, RB-I (%) 60 40 20 0 0 20 40 60 Water contact angle, θ (deg.) 80 Fig. 8. 24 Relationship between the WCA and RB-I values in the cortical bone part. Symols: ▲●■= TNTZ, ●◆= Ti, ▲= as-polished, ●●= anodized, ■= hydrothermally-treated followed by storing in x5 PBS(-), and ◆ = anodized and then hydrothermally-treated followed by storing in distilled water or x5 PBS(-). とで骨伝導が促進されることを意味している．実際にインプラントとして生体 内に埋入する場合には，耐食性も必要であることから，陽極酸化処理と水熱処 理を組み合わせることで，高い親水性と耐食性を獲得することが可能なものと 考えられる． 8. 4. 小括 本章では，4 種類の Ti 合金を取り上げ，Ti への表面処理の結果をもとに，Ti - 149 - 合金に適用する表面処理条件を選定した．陽極酸化処理では，各 Ti 合金の構成 元素単体と，それに対応する Ti 合金の陽極酸化挙動を比較し，合金元素が Ti 合金表面に生成する陽極酸化皮膜の化学的性質ならびに骨伝導性におよぼす影 響を検討した．その結果をもとに，皮膜中へのリン酸イオンの添加，ならびに 表面親水化の効果を確認した．以下に得られた知見を示す． 1) 合金元素単体を陽極酸化すると，印加電圧の上昇とともに Al, Nb, Ta, Zr は皮 膜が成長するが，Cr, Fe, V は水溶液中への金属イオンの溶出が生じた． 2) 合金種によって陽極酸化皮膜の組成が異なり，Ti64 および Ti67 では含有合 金元素量の少ない TiO2 皮膜が生成するが，TNTZ では TiO2 と Nb2O5 の混合 皮膜が生成し，TCFA では主成分は TiO2 であるが皮膜表面に局所的に Cr2O3 の生成する陽極酸化皮膜が生成した． 3) 各合金の陽極酸化皮膜の骨伝導性は，その表面親水性に強く依存し，親水性 の高い Ti64 および Ti67 の陽極酸化材の RB-I 値は高く，親水性の低い TNTZ および TCFA の陽極酸化材の RB-I 値は低かった． 4) 高濃度 H3PO4 水溶液中で TNTZ および TCFA を陽極酸化すると，純 Ti と同 様にいずれの合金中にも，希薄 H3PO4 水溶液中で陽極酸化したときよりも高 濃度のリン酸イオンが導入され，アナターゼライクアモルファスが生成した． ただし，TNTZ の陽極酸化皮膜表面には，陽極酸化時の H3PO4 濃度や印加電 圧を変化させても合金成分が残存し，その表面での硬組織生成量は低いが， TCFA の陽極酸化皮膜表面には，3 M 以上を用いて 200 V まで電圧を印加し た場合，合金成分はほとんど存在せず，その骨伝導性は純 Ti と同様に大き く向上することが認められた． 5) TNTZ に陽極酸化処理を施しても水滴接触角を 40 (deg.)以下まで低下させる - 150 - ことはできなかったが，水熱処理のみで，あるいは陽極酸化処理後に水熱処 理を施すことで，水滴接触角が 15～25 (deg.)の親水性表面の形成が可能であ り，さらに水熱処理後に x5 PBS(-)中に保存することで，水滴接触角が 5 (deg.) 以下まで低下した超親水性表面を形成することが示された．また，基材とし て TNTZ を使用しても，超親水性表面を形成することで純 Ti と同様に高い 骨伝導性（RB-I > 50%）を示すことが明らかとなった． - 151 - 【第８章の参考文献】 [8-1] 成島尚之：金属，77 (2007) 4-9. [8-2] M. Niinomi, T. Hattori, K. Morikawa, T. Kasuga, A. Suzuki, H. Fukui and S. Niwa: Materials Transactions, 43 (2002) 2970-2977. [8-3] H. Matsumoto, S. Watanabe and S. Hanada: Materials Transactions, 46 (2005) 1070-1078. - 152 - 第９章 将来展望 本研究では，Ti 系インプラント材の骨伝導性におよぼす材料側の影響因子を 明らかにすべく，Ti 表面に成膜する TiO2 の表面形状・表面性状を制御し，表面 粗さおよび表面親水性が骨伝導性におよぼす影響を明らかにしてきた．その中 で，コーティング物質としては TiO2 で同一であるにもかかわらず，その作製条 件によって骨伝導性は大きく異なり，表面形状および表面性状に強く影響を受 けることが示された． 特に，TiO2 表面の親水性によってその骨伝導性が整理で きることが見出され，親水性領域における濡れ性と骨伝導性の対応関係が定量 的に明らかとなった．一方で，疎水性表面においても骨が生成する傾向が見出 されているものの，疎水性表面における濡れ性と骨伝導性の対応関係について， いまだ十分な知見は得られていない．より広い範囲で「水滴接触角―硬組織生 成量」の定量関係を明らかにすることで，表面処理だけで骨伝導性を制御でき る可能性がある．本研究では特に骨伝導促進を目的とした表面改質法を検討し たが，逆に骨形成を忌避すべき生体部位への表面処理として応用することも考 えられ，今後の研究の進展が期待される． 人工歯根や人工股関節などへの硬組織代替材料としては，主に Ti 系材料が使 用されているが，インプラント材料に求められる要求をすべて満たしているわ けではない．たとえば磁化率が高いために核磁気共鳴画像法（MRI）などの磁場 を用いる診療では，Ti インプラント周囲にノイズが発生するために患部の情報 が欠落するアーチファクトという現象が生じることが知られており，非磁性金 属の使用が検討されている，そのため，Ti 以外の金属材料についても表面親水 - 153 - 性と骨伝導性との関係を明らかにすることで，硬組織代替材料に対する材料選 択の幅が広がることが予想される． また，本研究では超親水化ならびにその維持に関する工学的手法の開発に成 功したが，これらの研究成果はいずれもラットを使用した試験結果に基づいて おり，ラボレベルでの研究にとどまっている．今後は大型の動物を使用した同 様の試験を経て，ヒトへの臨床応用が期待されるが，研究施設や費用の問題だ けでなく，法令の十分な整備，ヒトへの臨床応用時の倫理的な問題の解決，医 療用具としての認可期間の短縮など，数え切れないほどの障壁が存在しており， 単一研究室レベルでは間に合わない．そのため，医工連携や産学連携など，よ り大規模での研究へとステップアップする必要があり，そうした研究を支援す るための制度作りにも期待される． - 154 - 第１０章 総 括 本論文の総括として，各章の要約を述べる． 第 1 章では，緒言として，金属バイオマテリアルの特徴，現状の表面改質法 とその問題点，本研究の目的について述べた． 第 2 章では，本研究での表面処理に主として用いた陽極酸化法の原理および 生物学的評価として用いた in vivo 試験の概要について述べた． 第 3 章では，ミクロレベルの表面粗さが陽極酸化処理を施した Ti の骨伝導性 に与える影響について考察した．Ti 基材を 0.1 M H2SO4 および 0.1 M H3PO4 水溶 液中で 100 V まで，0.1 M NaOH 水溶液中で 80 V まで電圧を印加すると，いずれ もアナターゼ型の TiO2 皮膜が生成した．これらの陽極酸化皮膜の表面粗さおよ び表面形状は，陽極酸化前後でほとんど変化せず，研磨ままの Ti 試料と同程度 であった．Ra/μm < 0.3 の平滑表面を有する場合，陽極酸化を用いて TiO2 コーテ ィングを施すことで，Ti 試料の骨伝導性は大きく向上した．Ra/μm > 0.3 の粗雑 表面を有する場合，TiO2 コーティングを施しても Ti 試料の骨伝導性は向上せず， 研磨ままの Ti 試料と同程度の低い骨伝導性を示した．したがって，ミクロレベ ルでは平滑で，マクロレベルでは表面凹凸の存在する表面形状が，迅速かつ確 実な骨形成には有利であることが示唆された． - 155 - 第 4 章では，異なる溶質イオン種を含有する種々の水溶液中で Ti を陽極酸化 することで，生成する TiO2 皮膜中に溶質イオンを取り込み，表面親水性および 骨伝導性におよぼす影響を検討し，さらにその表面親水性と骨伝導性の相互関 係を定量的に評価した．いずれの水溶液中で Ti を陽極酸化した場合も，表面が 平滑で，膜厚の等しいアナターゼ単相の陽極酸化皮膜の成膜に成功した．陽極 酸化皮膜中には，水溶液中のアニオン・カチオンが取り込まれたが，これらの 含有溶質イオンによる表面親水性への影響は認められなかった．陽極酸化皮膜 の表面親水性は，陽極酸化処理に使用した水溶液の pH に強く依存し，強酸（pH < 3）あるいは強アルカリ（pH > 12）の水溶液中で陽極酸化した試料は，高い表 面親水性を示す傾向が認められた．作製した TiO2 コーティング材において，硬 組織生成量と水滴接触角は相関関係にあり，水滴接触角が 55 (deg.)以下の表面を 有する試料については，接触角の低下とともに RB-I 値が増大する傾向が認められ た．それとは反対に，接触角が 55 (deg.)以上の表面を有する試料については，接 触角の増大とともに RB-I 値は増大することも見出された． 第 5 章では，H3PO4 水溶液の濃度および印加電圧を変化させることで，陽極酸 化皮膜中に取り込むリン酸イオンの量を変化させ，そのときに生成する酸化皮 膜の性質ならびに骨伝導性を評価した．水溶液中の H3PO4 濃度に関係なく，陽 極酸化によって金属 Ti 表面にアナターゼが形成されたが，その結晶性は水溶液 中の H3PO4 濃度ならびに印加電圧によって大きく変化した．特に，4 M 以上の 高濃度 H3PO4 水溶液中でスパークが発生するまで印加電圧を上昇させると，皮 膜中に多くのリン酸イオンを含有したアナターゼライクアモルファスが生成し た．Ti 表面にアナターゼライクアモルファス皮膜が形成した場合，表面粗雑化 による骨伝導阻害作用よりも，アナターゼの結晶性低下，あるいはリン酸イオ - 156 - ン含有による骨伝導促進作用の方が強く影響し，皮質骨部，海綿骨部ともに高 い骨伝導性を示した． 第 6 章では，Ti の陽極酸化皮膜に対するさらなる親水化処理として水熱処理 の効果を検討し，超親水性表面における骨伝導性について調査するとともに， 作製した親水性表面を長期間に渡って維持することが可能な手法について検討 した．陽極酸化 TiO2 皮膜に水熱処理を施すことで，親水性が向上し，水滴接触 角は 13 (deg.)程度まで低下した．水熱処理温度が高くなると，短い水熱処理時間 で表面が親水化するが，最終的に得られる水滴接触角は変化しなかった．作製 した試料を大気中あるいは蒸留水中で保存した場合，時間経過とともに炭化水 素の吸着によって表面が汚染されるため，接触角は増大する傾向を示した．し かし，PBS(-)中に保存した場合，試料表面に PBS(-)の構成成分がイオンとして吸 着するため，水滴接触角は 5 (deg.)程度まで低下し，超親水性を示した．また， この保存方法では，超親水性表面を 1 ヶ月以上もの長期間維持することが可能 であった．Ti 表面に成膜した TiO2 皮膜において，水滴接触角が低下するほど， 硬組織形成量は増加し，RB-I 値は最大で 58%を示した． 第 7 章では，陽極酸化および高温酸化にて作製した TiO2 皮膜の性質を調査し， in vivo 試験にて骨伝導性を評価した．これらの結果に基づき，酸化プロセスの 違いが骨伝導性におよぼす影響について検討した．酸化プロセスによって生成 する TiO2 の結晶構造が異なり，陽極酸化法ではアナターゼ型 TiO2，高温酸化法 ではルチルが得られたが，陽極酸化法で生成したアナターゼを本実験条件で高 温酸化しても，アナターゼのままであった．ただし，これらの結晶構造の違い による骨伝導性への影響は認められなかった．陽極酸化 TiO2 皮膜は高い親水性 - 157 - を示すが，高温酸化 TiO2 皮膜は表面 OH 基が少ないために，陽極酸化 TiO2 皮膜 ほど高い親水性を示さなかった．高温酸化を経由せず，陽極酸化だけで TiO2 皮 膜を作製することで，Ti の骨伝導性を大きく向上させることが示された． 第 8 章では，4 種類の Ti 合金を取り上げ，Ti への表面処理の結果をもとに， Ti 合金に適用する表面処理条件を選定した．陽極酸化処理では，各 Ti 合金の構 成元素単体と，それに対応する Ti 合金の陽極酸化挙動を比較し，合金元素が Ti 合金表面に生成する陽極酸化皮膜の化学的性質ならびに骨伝導性におよぼす影 響を検討した．その結果をもとに，皮膜中へのリン酸イオンの添加，ならびに 表面親水化の効果を確認した．合金元素単体を陽極酸化すると，印加電圧の上 昇にともない Al, Nb, Ta, Zr 表面には酸化皮膜が成長するが，Cr, Fe, V は水溶液 中への金属イオンの溶出が生じた．合金種によって陽極酸化皮膜の組成が異な り，Ti64 および Ti67 では含有合金元素量の少ない TiO2 皮膜が生成するが，TNTZ では TiO2 と Nb2O5 の混合皮膜が生成し，TCFA では主成分は TiO2 であるものの 皮膜表面に局所的に Cr2O3 の生成する陽極酸化皮膜が生成した．各合金の陽極酸 化皮膜の骨伝導性は，その表面親水性に強く依存し，親水性の高い Ti64 および Ti67 の陽極酸化材の RB-I 値は高く，親水性の低い TNTZ および TCFA の陽極酸 化材の RB-I 値は低かった．高濃度 H3PO4 水溶液中で TNTZ および TCFA を陽極 酸化すると，純 Ti と同様にいずれの合金中にも，希薄 H3PO4 水溶液中で陽極酸 化したときよりも高濃度のリン酸イオンが導入され，アナターゼライクアモル ファスが生成した．ただし，TNTZ の陽極酸化皮膜表面には，陽極酸化時の H3PO4 濃度や印加電圧を変化させても合金成分が残存し，その表面での硬組織生成量 は低いが，TCFA の陽極酸化皮膜表面には，3 M 以上を用いて 200 V まで電圧を 印加した場合，合金成分はほとんど存在せず，その骨伝導性は純 Ti と同様に大 - 158 - きく向上することが認められた．TNTZ に陽極酸化処理を施しても水滴接触角を 40 (deg.)以下まで低下させることはできなかったが，水熱処理のみで，あるいは 陽極酸化処理後に水熱処理を施すことで，水滴接触角が 15～25 (deg.)の親水性表 面の形成が可能であり，さらに水熱処理後に x5 PBS(-)中に保存することで，水 滴接触角が 5 (deg.)以下まで低下した超親水性表面を形成することが示された． また，基材として TNTZ を使用しても，超親水性表面を形成することで純 Ti と 同様に高い骨伝導性（RB-I > 50%）を示すことが明らかとなった． 第 9 章では，本研究の将来展望について，硬組織適合性向上を目指した材料 開発における本研究の役割を確認するとともに，ヒトへの実用化までの道程に ついて言及した． 第 10 章（本章）は，本論文の総括である． - 159 - 研究業績 【学術論文】 〔第３章〕 Dai Yamamoto, Kensuke Kuroda, Ryoichi Ichino, Masazumi Okido and Azusa Seki: “Osteoconductivity of Anodized Titanium with Controlled Micron-Level Surface Roughness”, Materials Transactions, Vol. 52, No. 8 (2011) pp.1650-1654. 山本大，河合一輝，黒田健介，市野良一，興戸正純，関あずさ：「チタン表 面へのミクロレベルの表面粗さを制御した陽極酸化皮膜の作製と骨伝導性」， 日本金属学会誌，76 巻，5 号 (2012) pp. 283-288． 〔第４章〕 Dai Yamamoto, Takanori Iida, Kazushi Arii, Kensuke Kuroda, Ryoichi Ichino, Masazumi Okido and Azusa Seki: “Surface Hydrophilicity and Osteoconductivity of Anodized Ti in Aqueous Solutions with Various Solute Ions”, Materials Transactions, Vol. 53, No. 11 (2012) pp. 1956-1961. 〔第５章〕 Dai Yamamoto, Takanori Iida, Kensuke Kuroda, Ryoichi Ichino, Masazumi Okido and Azusa Seki: “Formation of Amorphous TiO2 Film on Ti Using Anodizing in Concentrated H3PO4 Aqueous Solution and its Osteoconductivity”, Materials Transactions, Vol. 53, No. 3 (2012) pp. 508-512. 〔第６章〕 Dai Yamamoto, Kazushi Arii, Kensuke Kuroda, Ryoichi Ichino, Masazumi Okido and Azusa Seki: “Osteoconductivity of Superhydrophilic Anodized TiO2 Coatings on Ti Treated with Hydrothermal Processes”, Journal of Biomaterials - 160 - Nanobiotechnology, accepted. 〔第７章〕 Dai Yamamoto, Ikki Kawai, Kensuke Kuroda, Ryoichi Ichino, Masazumi Okido and Azusa Seki: “Osteoconductivity and Hydrophilicity of TiO2 Coatings on Ti Substrates Prepared by Different Oxidizing Processes”, Bioinorganic Chemistry and Applications, Vol. 2012, (2012) doi: 10.1155/2012/495218. 【国際会議】 D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Surface Properties of Anodized Titanium Alloys and the Osteoconductivity”, 2010 International Symposium on Micro-Nano Mechatronics and Human Science, Digests of Research Associates’ Activities pp. 57-58 (Nagoya, Japan, 7-10 Nov. 2010). D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Surface Treatment on Ti for the Fabrication of Bone-Compatible Materials”, Abstract of The Korea-Japan Symposium on Surface Technology, Abstract pp. 298-299, (Incheon, Korea, 25-26 Nov. 2010). X. J. Lu, D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Formation of Anatase Film Coated on Beta-Type Ti Alloy Substrates with Anodizing Treatment”, International Symposium on Biomimetic Materials Processing, Abstract p. 31, (Nagoya, Japan, 25-28 Jan. 2011). D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Anodic Oxide Coatings on Ti Alloys and their Osteoconductivity”, Thermec’ 2011 International Conference on Processing & Manufacturing of Advanced Materials, Abstract p.565, (Quebec, Canada, 1-5 Aug. 2011). - 161 - D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Formation of Oxide Coatings on Beta-Ti Alloys using Anodizing in Concentrated Phosphoric Acid and their Osteoconductivity”, 2011 International Symposium on Micro-Nano Mechatronics and Human Science, Digests of Research Associates’ Activities pp. 45-46, (Nagoya, Japan, 6-9 Nov. 2011). D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Formation of Hydrophilic and Hydrophobic Anodized Films on Ti and In Vivo Evaluation”, International union of material research societies - International conference on electronic materials 2012, CD-ROM, (Yokohama, Japan, 23-28 Sep. 2012). D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Hydrophilicity and Osteoconductivity of Ti Anodized in Various Aqueous Solutions”, Pacific Rim Meeting on Electro-chemical and Solid-State Science 2012, CD-ROM, (Honolulu, USA, 7-12 Oct. 2012). D. Yamamoto, K. Kuroda, R. Ichino and M. Okido, “Osteoconductivity of Anodized TiO2 Films with Different Hydrophilicity Formed in Aqueous Solutions of Different Solute Ions”, 2012 International Symposium on Micro-Nano Mechatronics and Human Science, Digests of Research Associates’ Activities pp. 3-4, (Nagoya, Japan , 4-7 Nov. 2012). 【国内会議】 山本大，黒田健介，興戸正純，市野良一，赤堀俊和，新家光雄，上田正人， 池田勝彦，小柳禎彦，小川道治，清水哲也：「リン酸水溶液中陽極酸化を施 したα+βおよびβ型チタン合金の骨伝導性」，軽金属学会第 118 回春期大会， 講演概要集，pp.249-250，大阪，2010 年 5 月． - 162 - 山本大，黒田健介，市野良一，興戸正純：「骨となじみやすいチタン製イン プラント材料の開発」，第 41 回中部科学関係学協会支部連合秋季大会，講演 概要集，p.71，豊橋，2010 年 11 月． 山本大，黒田健介，興戸正純，市野良一，赤堀俊和，新家光雄，上田正人， 池田勝彦，小柳禎彦： 「高濃度リン酸水溶液中陽極酸化によるβ型 Ti 合金上 へのチタニアコーティングと骨伝導性」，軽金属学会第 120 回春期大会，講 演概要集，pp.23-24，名古屋，2011 年 5 月． 魯暁京，山本大，黒田健介，興戸正純，市野良一，赤堀俊和，新家光雄，上 田正人，池田勝彦，小柳禎彦：「硫酸水溶液中陽極酸化によるβ型チタン合 金上へのチタニアコーティング」，軽金属学会第 120 回春期大会，講演概要 集，p.429-430，名古屋，2011 年 5 月． 山本大，黒田健介，市野良一，興戸正純：「陽極酸化によるチタン表面への チタニアコーティングとその骨伝導性」，腐食防食協会第 58 回材料と環境討 論会講演集，pp.363-364，名古屋，2011 年 9 月． 山本大，興戸正純： 「Ti 合金への陽極酸化処理と骨伝導性評価」，軽金属学会 創立 60 周年記念 東海支部 特別講演会およびポスター講演会，概要集， p.35，名古屋，2011 年 10 月． 魯暁京，山本大，黒田健介，興戸正純，市野良一，赤堀俊和，新家光雄，上 田正人，池田勝彦，小柳禎彦： 「硫酸水溶液中陽極酸化による β 型 Ti 合金表 面への TiO2 コーティングとその骨伝導性の評価」，日本金属学会 2011 年秋 季大会（第 149 回）大会，講演概要集，p.41，沖縄，2011 年 11 月． 榊原正男，山本大，黒田健介，市野良一，興戸正純：「硝酸イオンを含有す る水溶液中での Ti の陽極酸化と骨伝導性評価」，第 25 回歯科チタン学会学 術講演会，講演プログラム p. 54，名古屋，2012 年 2 月． - 163 - 黒田健介，有井一志，山本大，市野良一，興戸正純：「有機酸水溶液中での 陽極酸化 TiO2 の作製と表面親・疎水性ならびに骨伝導性」，第 25 回歯科チ タン学会学術講演会，講演プログラム p. 55，名古屋，2012 年 2 月． 山本大，魯暁京，黒田健介，市野良一，興戸正純：「β 型 Ti 合金の硫酸水溶 液中陽極酸化と骨伝導性」，第 25 回歯科チタン学会学術講演会，講演プログ ラム p. 56，名古屋，2012 年 2 月． 山本大，有井一志，黒田健介，市野良一，興戸正純：「親・疎水性の異なる チタンの陽極酸化皮膜の骨伝導性」，表面技術協会第 125 回講演大会，講演 要旨集，p. 193，東京，2012 年 3 月． 有井一志，山本大，黒田健介，興戸正純，市野良一：「チタン表面に作製し たチタニア皮膜の親水性・疎水性と骨伝導性」，日本金属学会 2012 年春期（第 150 回）大会，講演概要 CD-ROM，横浜，2012 年 3 月． 山本大，黒田健介，市野良一，興戸正純： 「生体材料用 Ti 合金 TNTZ の骨伝 導性におよぼす合金成分の影響と表面親・疎水性」，日本金属学会 2012 年春 期（第 150 回）大会，講演概要 CD-ROM，横浜，2012 年 3 月． - 164 - 謝辞 本研究の遂行ならびに本論文の作成にあたり，現在に至るまで終始，懇篤な るご指導ご鞭撻を賜りました名古屋大学エコトピア科学研究所 教授，興戸正純 先生に深甚なる謝意を表します． 本論文の作成にあたり，有益なご助言とご鞭撻を賜りました名古屋大学大学 院工学研究科 教授，大槻主税先生，松永克志先生，ならびに名古屋大学エコト ピア科学研究所 教授，市野良一先生に深く感謝いたします． 本研究を遂行するにあたり，現在に至るまで終始，懇篤なるご指導と有益な ご討論を賜りました名古屋大学エコトピア科学研究所 准教授，黒田健介先生に 深甚なる謝意を表します． 本研究を遂行するにあたり，機器分析装置の取り扱いでご指導を賜りました 技術職員，高井章治様，川出義之様，鈴木綾子様に深く感謝いたします． 本研究を共に遂行していただきました，河合一輝，國枝真一，飯田崇史，有 井一志，魯暁京，脇淳の諸兄に心より感謝の意を表します． 研究生活全般にわたって，ご援助下さいました名古屋大学エコトピア科学研 究所 助教，神本祐樹先生，同研究員，サラ・サルマン氏をはじめ，名古屋大学 大学院工学研究科マテリアル理工学専攻 興戸研究室の卒業生ならびに在校生 の皆様に感謝の意を表します． 最後に，今日に至るまで終始，本研究の遂行を温かく見守ってくれた両親・ 祖父母に深く感謝いたします． - 165 -