Title コムギおよびライムギにおけるベンゾキサジノン生合成 酵素の動態

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コムギおよびライムギにおけるベンゾキサジノン生合成
酵素の動態と性状解析( Dissertation_全文 )
須恵, 雅之
Kyoto University (京都大学)
2000-03-23
https://doi.org/10.11501/3167385
Right
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Thesis or Dissertation
author
Kyoto University
)
み
コムギおよびライムギにおけるベンゾキサジノン生合成酵素
の動態と性状解析
2000年
須恵雅之
目次
3
序論
第一章
コムギ芽生えにおける HBOAおよび、インドール水酸化酵素の動態と性状解析
6
. 序論
-1
1
。。口
. 実験方法
1・2
. 植物材料および Hx類の調製
21
1
・
δQd
. ミクロソーム画分の調製
2
2
1
. 酵素活性の測定
3
2
1
. 結果
3
1
0活性の経時変化
5
4
. コムギ芽生えにおける P
2
3
1
. 考察
4
1
第二章
ハU 1 i q u
i
i
i
句
可
可
. コムギ芽生えにおけ る水酸化酵素活性
-1
3
1
コムギ芽生えにおけるグルコシルトランスフエラーゼ‘の精製と性状解析
5
1
. 序論
-1
2
. 実験方法
2
2
. 植物材料および Hx類の調製
-1
3
2
7
1
. コムギ芽生えにおけるグルコシルトラ ンス フエラーゼの経時変化測定
2
3
2
7
1
の精製
. グルコシルトランスフエラーゼ、
3
3
2
8
1
. 酵素活性の測定
4
3
2
8
1
. 電気泳動
5
3
2
9
1
3. 結果
2
. コムギ芽生えにおけるグツレコシルトランスフエラーゼ活性の経時変化
-1
3
2
0
2
. コムギ芽生えからのグルコシルトランスフエラーゼの精製
2
3
2
1
2
. グルコシルトランスフエラーゼの特性
3
3
2
3
2
26
. 考察
4
2
第三章
コムギ芽生えにおける βグルコシダーゼの精 製と性状解析
9
2
. 序論
-1
3
. 実験方法
2
3
-1-
111
qJ?dqJ
. Hx類の調製
21
3
・
. 植物材料
2
2
3
-グルコシダーゼの精製
s
U
. 酵素活性測定
4
2
3
2 3つ
っ
、
.
3
2
3
u
i
. 電気泳動および N 末端アミノ酸配列の解析
-5
2
3
. 結果
3
3
序論
口パノイドやテルペンなど様々な二次代謝産物をその体内に蓄積してお
植物はフェニルフ。
り、その構造や蓄積量などは植物種 ・生育時期・部位なと、により異なっている。これら 二次
代謝物は植物体内に おいて多様な生理的 役割を担っているが 、病害抵抗性発現に 関わる機
能などはその代表的 なものである。傷害 や感染などに対する 植物の抵抗反応は、 細胞壁の
4 5802
3 3
344
. グルコシダーゼ、活'性のコムギ、芽生えにおける動態
-1
3
3
. コムギ芽生えからのグルコシダーゼの精製
3・3・2
. グルコシダーゼの基 質特異性
3
3
3
. グルコシダーゼ、アイソザ、イムの品種 ・種による発現パターンの比較
4
33
強化 なと、といった物理的抵抗と抗菌物質の分泌なと、による化学的抵抗の二つに大別すること
ができる。このよう な植物の抵抗反応に おいて、二次代謝産 物は細胞壁の強化因 子や情報
伝達のためのシグナ ル物質となるだけで なく、それ自身が抗 菌活性等を示し抵抗 性発現に寄
与する場合も多い。
4. 考察
3
ユズダマ・ハマ
コムギ ・トウモ ロコ シ ・ライムギなどの主要穀物をはじめ、ダンチク・ジ、
mic
roxa
chyd
li
yc
c
ニンニク ・モロコシなど多くのイネ科植物 に見られる環状ヒドロ キサム酸類 (
ルコシダーゼの精製 と性状解析
ライムギ芽生えにおける βク♂
第四章
. 序論
-1
4
4-benzoxazin-3-one (ベンゾキサジノン)を基本 構造にもち、これら植 物 の化
，
:Hx)は 1
d
i
c
a
5
4
. 実験方法
2
4
6A性6 A6
Ad
21. Hx類の調製
4
・
忌避活性、 他の植物 に対する生育阻害活 性 、さらにはトリアジン系農薬の解毒活性やオーキ
-グルコシダーゼの精製
s
シンレセプターへの関与などが知られている。
A
斗
.
3
2
4
Hx類の生理活性としては、カビやバクテリアなどに対する抗菌活性、昆虫などに対する日交害
斗
. 植物材料
2
24
] (双子葉植物ではハアザ、ミでのみ報告がある)。
8
8
9
r1
学的抵抗性に関与している [Niemeye
7 7
d-d
4. 酵素活性測定
24-
4
1，
ho巧 -met
勾ー 7
o
r
hyd
i
d
4)および 2，
DIBOA
4-benzox辺 in-3-one(
，
勾ー 1
o
r
hyd
i
d
4
物 は 2，
3. 結 果
4-
. ライムギ芽生えからの βグルコシダー ゼ の精製
2
3
4
. ライムギグルコシダーゼの性状解析
3
3
4-
)の 2種 の Hxである。これら Hx類は通常植物体内 では化学的
DIMBOA
nふ one(
i
z
a
x
o
z
n
e
b
8
5
56
53
40
HxGlc) および HxGlcグルコシ
. 環状 ヒドロキサム酸配糖体 (
-1
3
4夕、ーゼのライムギ芽生えにおける 動態
るが、この中で最も多量かつ普遍 的に存在し、これら植 物 の耐病性を考える上で重要な化合
守
5. 電気泳動および N-末端アミノ線配列の解 析
24-
Hx類縁体としては次の表に示したような種々の置換 パターンを持つ化合物が知られてい
4・4. 考察
-グル コース配 糖体として存在しており、傷害や感染時における
O
s
に安定 な (不活性な) 2
組織 の物理的破壊の 際にクPルコシダーゼ、の 働きにより加水分解され、活性本体であるアグリ
]0先にも述べたとおり Hx類
8
8
9
r1
ye
nandHofmanova1971，Nieme
a
n
r
f
o
H
コンが 遊離する [
の生理活性については様々なものが知られているが、 細胞 内レベルでの作用点に関する報告
は細 胞膜上の H二ATPase、ミトコンドリアやクロロフラストの電子伝達系など少数があるのみ
原著論文および関連 論文
78
2b
9
Fb F
O
p
謝辞
b
総括
引用文献
]。しかし、いず れ に対しても阻害活性発現に
4
9
9
l1
.
ta
l1997，Massardoe
.
ta
ee
b
e
i
r
F
である [
必要とされる濃度は m Mレベルであるため 、実際の感染防御反応においての作用点として機
能 しているかどうかは議論の余地 が残るところである。
円
ー
2-
これら Hx類は他 の多くの二次代謝物 と同様に、植物 の品種や生育時期、 そして組織部
-3-
位によりその蓄積濃度が異なる [
K
l
u
nandRobinson1969，
Zunigae
ta
.
l1
9
8
3
]。そこで、様々
これまでに、コムギの発芽直後の時期において DIBOA-Glcや DIMBOA-Glc等の Hx配
な植物を用いてその体内 Hx濃度とアブラムシやアワノメイガなどに対する耐性との関連を調
糖体が感染や傷害などとは無関係に非常に高濃度で存在することが見いだされ、従属栄養期
査した結果、 Hx濃度と植物の耐病性 の聞には正の相関が 見いだされた仏rgandonae
ta
.
l
における耐病性との関係が示唆されてきた [
E
b
i
s
u
ie
ta
.
l1998，Nakagawae
ta
.
l1
9
9
5
]。この
1980，KlunandRobinson1
9
6
9
]。このため、育種学的手法により植物中の Hx発現量を上昇
ようなHx類の発現機構を明らかにすることは、従属栄養期という植物の生活環のごく限られ
させることが可能となれば、植物の抵抗性向上、そして農作物の収量増加につながると思わ
た時期における防御機構の角平明だけでなく、独立栄養期も含めたイネ科植物全般の耐病性の
れる。しかし、これまでの多くの試みにも関わらず現在のところはそれほどの成果は報告され
解明にもつながると考えられる。これまでの Hxに関する研究の多くは、独立栄養期のトウモ
ていない。今後のさらなる進展のためにはHx類発現の酵素・遺伝子レベルでの制御機構の
ロコシを植物材料としたものがほとんどであり、コムギやライムギ、特にそれらの従属栄養期
解明など、より詳細な情報が必要とされる。
における研究はほとんどなされていない。そこで本研究では、従属栄養期イネ科植物におけ
る耐病性の発現機構解明の一環として、コムギ、およびライムギ、の Hx類生合成酵素に関する
R1
R2
R3
詳細な知見を得ることを目的とした。そのため、発芽直後の時期においての Hx類生合成酵
H
y
d
r
o
x
a
r
n
i
ca
c
i
d
s
(
4
・H
y
d
r
o
x
y
l，
4
-b巴nzo
x
a
z
i
n
3
o
ne
)
，
なγ
R
O
NH
H
H
Glc
H
H
H
なo
t
H
N
1ヘ
ク
h〆
千J¥〆
DIBOA
Glc
MeO
H
Glc
H
H
MeO
MeO
Gl
c
MeO
MeO
H
DIM2BOA
OH
H
H
TRIBOA
Glc
H
H
H
MeO
H
Glc
MeO
日
H
MeO
MeO
Glc
MeO
MeO
H
OH
H
Glc
グルコシダーゼと UDP
-G
l
c
:Hxグルコシルトランスフエラーゼの精製 ・性状解析を行った。
DIBOA
MeO
L
ac
t
a
r
n
s
(
l，
4b
enz
o
x
a
z
i
n
ふ o
n
e
)
H
H
R
素の動態を明らかにし、さらに Hx発現に最も直接的に関与している 2つの酵素、 HxGlc-s・D-
DIMBOA
Glc
DIMBOA
DIM
G
lc
2BOA-
HBOA-Glc
HBOA
HMBOA-Glc
HMBOA
HM
G
lc
2BOAHM
2BOA
DHBOA-Glc
Methylde
r
i
vat
i
ve
工
(
4
-Metho
可
MeO
M 回 目 oxa
z
i
n
3
-o皿 l
H
Glc
HDMBOAGlc
O
NMe
Benzo
x
a
zo
l
i
n
ones
R
な〉o
H
H
BOA
MeO
H
MBOA
MeO
MeO
M2BOA
-4-
ー
5-
第一章
コムギ芽生えにおける HBOAおよび、インドール水酸化酵素の動態と性状解析
00
1
1
. 序論
先にも述 べたとお りコムギ・トウモロコシ・ライムギなどのイネ科植物には、病害虫に対
する耐病性因子として 2，
4-dihydro勾ー 1，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
nふ one (DIBOA) や 2，
4-dihydroxy-7・
metho
勾r
1，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
nふ one (DT
h
1BOA) のグルコース配糖体 (HxGlc) が蓄積されてい
る [Niemeyer1
9
8
8
]0Hx類の生合成経路はアントラニル酸を初発物質とし、インドールを分
岐点としてトリフ。
トファン生合成経路と Hx生合成経路に分かれると考えられている [
D
e
s
a
ie
t
。
1
.1996]
0 DIBOAはインドールに 4つの酸素原子が導入されることにより生合成されるが(図
"'0
ス…
/
されてきた [
G
l
a
w
i
s
c
h
n
i
ge
ta
.
l1997]0 さらに、 N-4-ヒドロキシ基もチトクローム P-450の働き
1，
4
ーb
e
n
z
o
x
a
z
i
n
・3
・o
ne
FJ?
叱XT
(
江
沢
H3
により導入されることが示されている [
B
a
i
l
e
yandLarson1
9
9
1
;Leightone
ta
.
l1994]。近年、
rc
工H
トウモロコシの芽生えにおいて高レベルで発現しているチトクローム P-450遺伝子が Freyらに
よりcDNAライブラリーより単離され [Freye
ta
.
l1995]、これらの遺伝子がインドールから
i
n
d
o
l
i
r
ト2
-one，3
h
y
d
r
o
勾r
i
n
d
o
l
i
n
2
o
n
e，HBOAを経由した DIBOA生合成酵素をコードしてい
るということが明 らかにされた [Freye
ta
.
l1997]。しかし、以上の研究はすべてトウモロコシ
においてのものであ り、コムギやライムギなどの他の植物に関する報告は数少ない 。
コムギおよびトウモロコシの発芽直後の時期に、傷害などとは無関係に HxGlcおよびそ
のグルコシダーゼが高濃度で発現していることが知られており、この時期における植物の耐
αL
。
:
:
ズ
1
1
)、これら炭素原子と結合している 4つの酸素原子がいずれも分子状酸素由来であること
から、イ ンドールか ら DIBOAへの反応はチトクローム P-450酵素によるものであることが示唆
α
N
工
o
αェ
1
)
:
工
VU
3
病性発現への関与が示唆されている[Nakagawae
ta
.
l1995;E
b
i
s
u
ie
ta
.
l1998J。また、同時
期の植物に投与した
CC]アントラニル酸が効率よくHx類に取り込まれることから[Nakagawa
4
e
ta
.
l1995]、このような Hx類の発現は denovo合成によるものであることと考えられる。そこ
図小 1
.
Hx
類の代謝経路
で第一章では、Hx代謝経路上のインドール以降の水酸化反応(一酸素原子付加反応 )に注
目し、その経路上で最初と最後に相当する酵素活性を測定することにより、酵素レベルで Hx
類発現に関する知見を得ることを目的とした。
-6-
o
n
e
ー
7-
1
・2
. 実験方法
沈殿を少量の抽出液に再懸濁したものをミクロソーム画分として用いた。
1
2
-1
. 植物材料および Hx類の調製
コムギ (
T
r
i
t
i
c
u
ma
e
s
t
i
v
u
mL
.
) (品種:アサカゼコムギ)の生育は、湿らせたペーパー
タオルの上に播種後、 日長 1
2時間、 25 Cで、インキュベートすることにより行った。
1
2
3
. 酵素活性 の測定
酵素活性は、 200ほ の タンパク質を最終液量 1mlの反応液 (
50m MT
r
i
s
H
C
l、0
.
2m M
0
DIBOAおよびその配糖体 DIBOA-Glcは播種後 3日のライムギ (
S
e
c
a
l
ec
e
r
e
a
l
eL
.) (
品
種:春一番)茎葉部より単離した。配糖体は、植物体を液体窒素で凍結後、磨砕し、新鮮
重の 5倍量のメタノールで抽出した。その後、抽出物を 1
2，
0
0
0gで遠心分離し、得られた上
清を減圧濃縮した。さらに穣紙を用いで漉過した後、ヘキサンに対して分液し 、得られたメタ
ノール層を減圧濃縮した。その後、 5
0% (
v
/
v
)メタノールに溶解し、 ODSゲル (ODS-AM
1
2
0
S
5
0
;YMCC
o
.，Kyoto，
]
a
p
a
n
) を加えて撹祥し、疎水性の不純物をゲル担体に吸着させ
ることにより除去した。漉液を 5-10mlまで濃縮し 、高速液体クロマトグラフィー (
HPLC)
分取により最終的な精製を行った [
カラ
ム
，W
a
k
o
s
i
lI
I5C18HG(
2
0x250mm);溶出溶媒，
基質、 0.
4m MNADPH、2m MDTT、pH7
.
5
) に添加し、 35 Cで適当時間インキユベート
0
することにより行った。また、インキュベート中は酸素供給のため、撹枠を行った (
4
0
0rpm) 1N
0
塩酸を 100μl添加することにより反応を停止した後、反応生成物を 3mlの酢酸エチルにより
抽出した。この抽出液を減圧下で乾国後、 500μlのメタノールに溶解させ、その溶解液中の
反応生成物を HPLCを用 いて分析した [
カラム， W
a
k
o
s
i
lI
I5C18HG(
4
.
6x150mm);溶出溶
媒
， 7.5%(
v
/
v
)アセトニトリル /0.
1% (
v
/
v
)酢酸水溶液;流速， 0
.
8mVm
i
n
;カラム温度， 40 C
;
0
検出， 280nm]。また、生成物の同定には、 LC-MSを使用 した。タンパク質量はウシ血清ア
ルブミンを標準として用い、 B
r
a
d
f
o
r
daradford1
9
7
6
]の方法に従い測定した。
24%(
v
/
v
)メタノール /0
.
1% (
v
/
v
)酢酸水溶液;流速， 1
0mVmin;カラム温度 ，40C
;検出，
0
280nm]。アグリコンは、精製 した配糖体を 50m M酢酸ナトリウム緩衝液 (
pH5
.
5)中、コム
ギより調製したグルコシダーゼ粗酵素液により室温で 1時間加水分解し、 配糖体と同 条件で
の HPLC精製を行うことにより得た。DIMBOAおよび DIMBOA-Glcの調製は 、播種後 3-4
日のトウモロコシ (
Z
e
amaysL
.) (品種:スノーデント 1
0
8
) 茎葉部を材料とし、 DIBOAもし
くは DIBOA-Glcと同様の方法により行った。 2H
y
d
r
o
x
y
1，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
o
n
e(HBOA)およ
び 2h
yむ0勾 7
m
e
t
h
o
勾r
1，
4
-b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3・one(HMBOA)は Honkanenら (
1
9
6
0
)の方法に
従い合成した。また、その配糖体、 HBOA-Glcおよび
、 HMBOA-Glcはそれぞれ DIBOA-Glc
および DIMBOA-Glcを還元することにより得た [HonkanenandV
i
r
t
a
n
e
n1
9
6
0
]。
1，
4-Benzox辺 i
n
e
3
o
n
eおよび i
n
d
o
l
i
n
2
・
・o
neは市販のものを使用した (SIGMA)。
122
. ミクロソーム画分の調製
以下の作業はすべて、 4 Cで行った。ミクロソーム画分の調製は、おもに B
a
i
l
e
yら (
1
9
9
1
)
0
の方法に従って調製した。植物体を新鮮 重の 3倍量の抽出液 (
0
.
3M スクロース、 5r
n
MDTT、
3%(
w/
v
)P
o
l
y
c
a
l
rAT、50m MHEPES、pH7
.
5)中、乳鉢を用 いて破砕 した。つづいて、
懸濁液を 2
6，
0
0
0gで 15分間遠心分離後、その上清をさらに 1
9
0，
0
0
0gで 45分間遠心分離 し
た。そこで得られた沈殿を先の抽出液に懸濁した後、再度 1
9
0，
0
0
0gで 45分間遠心分離後、
-8-
-9-
1
3
. 結果
B
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
r
o
u
ax
n
eに対する K
値はインド
m値は他の 2つの基質のおよそ 2倍程度であり、 V
ールのおよそ1/
4程度であった。
1
3
-1
. コムギ芽生えに おける水酸化酵 素活性
本研究における 植物生育条件下 では、使用した コムギは播種後 約 1
6-20時間で発芽を
開始した。また、 Hxが発芽間もない 時期(播種後 36-48時間)に特に茎 葉部において高
いレベルで発現していることが知られていることから [Nakagawae
ta
.
l1
9
9
5
]、ここでは、播種
表 1・2. コムギ茎葉部( 播種後 48時間)より i
調製したミクロソーム
画分のヒドロキシラーゼ活性(基質特異性)
基質
Km(
いM
)
後 48時間のコムギ茎葉部よりミクロソーム画分を調製し、 Hx生合成経路に含まれていると考
えられる水酸化酵素活性(酸素原子付加反応)を測定した。その結果、 HBOAから DIBOA、
そしてインドールから i
n
d
o
l
i
n
2
o
n
eへの反応は、基質とミクロソーム画分を 30分インキュベ
R
e
l
a
t
i
v
eVm
a
x
(%)
HBOA
I
n
d
o
l
e
1，
4-Benzox
泣 i
nふ one
100
29
8
.
2
83
90
155
一卜することにより検出することが出来た。また、 pH5
.
5-9.5の問での反応の 至適 pHを測
定したところ、両酵素反応とも pH7
.
5で最大の活性を示した。 しかし、 7
-メトキシ類縁体であ
る HMBOAを基質とした場合には、基質濃度 2mMで 1
2時間反応を行っても、予想しうる
反応生成物を検出することはで、きなかった。。
チトクローム P
-450による水酸化反応には分子状酸素が必要とされ、また、 その活性は
一酸化炭素により阻害されることが知られている。そこで、次に酵素反応における酸素および
一酸化炭素の効 果を検討した。 反応液に一酸化炭素を吹き込むことにより反応液中の酸素を
表 1
1. コムギ茎葉部( 播種後 48時間)より調製したミクロソーム
画分の水酸化酵 素活性
基質
HBOA
I
n
d
o
l
e
1，
4
・ Benzoxazin・
3・
one
生成物
DIBOA
I
n
d
o
l
i
n
2・one
HBOA
一酸化炭素で置 換したところ、 上で検出することのできた酵素反応はすべて完 全に 阻害され
た。また、反応液への酸素供給を行わず、に反応を行ったところ、酵素活性の著しい低下が見
酵素活性
(
p
k
a
t
/mgp
r
o
t
e
i
n
}
0.
47
0.
1
1
0.
021
られた (
d
a
t
an
o
tshown)。 この結果から、以上の水酸化反応はチトクローム P-450によるも
のであることが示唆された。
1
3
2
. コムギ芽生えにおける P-450活性の経時変化
コムギ芽生えに おいてHx類の 植物体内濃度は 播種後 36-48時間をピークとして経時
トウモロコシより調製したミクロソーム画分を用いた場合、 l，
4b
e
n
z
o
x
a
z
i
n3
o
n
eを基質と
して DIBOAが生成することが報告されている [Kum
紅 e
ta
.
l1
9
9
4
]。しかし 、 この化合物が実
際の植物中におけるHx前駆体であるかは議論の余地が残るところである [
F
r
e
ye
ta
.
l1
9
9
7
]。
そこで今回は、 この 1
，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
o
n
eを基質とした場合の酵素活性も測定した。その結
果
、 1
，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
o
n
eより HBOAへの活性が検出 された。しかし 、その活性は他 の基質
と比べて低いものであり、 HBOAを基質とした場合の約1/
20程度の活性であ った(表 1
1)。
HBOA、イ ンドールおよび 1，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
o
n
eに対する V
r
u
a
x値および K川値を表 1
2に
示す。 これら 3つの基質の中では、 HBOAに対する活性 が最も高いものであった。 1
，
4
・
-1
0-
的に変化することが知られている[Nakagawae
ta
.
l1995]。そこで、同時期における Hx生合
成酵素群の活性変化を測定するため、 コムギの茎業部 ・根部それぞれ よりミクロソーム画分
を調製し、前節において活性を測定した水酸化酵素活性を経時的に測定した。
DIBOAの直前の前駆体 である HBOAを基質とした場 合の活性は、茎 葉部・根部とも 播
種 後 36時間においてす でにかなりの活 性が認められた 。そして、播種 後 48時間に最大とな
った後(茎葉部 :7
.
5pkat
/
gFW、根部:0
.
6pkat
/
gFW) 次第に減少 し、最終的には 検出不可
能なレベルにまで低下した(図 1
2
)。茎葉部での活 性は、根部での 活性のおよそ 1
0倍程度
大きかった。インドールに対する活性も、 HBOAの場合よりは活 性が低いものの 同様の経時
変化を示し、播 種後 4
8時間で最大となった(図 1
2
c
)0 1，
4
B
e
n
z
o
x
a
z
i
nふ oneに対する活性
-1
1-
もまた、 HBOAやインドールに対する活性と同調して経時的に変化 していた。 しかし、 その活
1
4
. 考察
性は HBOAやインドールに比べ非常に低いもので、
あった(最大値で 0
.
1
9pka
t
/
gFW)。
これまでにもHx生合成に関与する水酸化酵素の報告はあるが、 それらはすべてトウモロ
0.8
8.
0
e
i
g
h
t
o
nらは、 ミクロソーム画分の HBOA-N-水酸化
コシを用いて行ったものである。また、L
b
酵素活性はトウモロコ シのみで観察され、 コムギおよびライムギではその活性は検出されな
﹀﹀比四¥百三
かったと報告している[Le
i
g
h
t
o
ne
ta
.
l1994]。 しかし、本研究においては、 コムギ芽生えの茎
~ 0.
6
6.0
葉部および根部より調製したミクロソーム画分の両方において、 N-水酸化酵素活性を検出す
L
ム
σ
3
言 0.
4
4.
0
e
i
g
h
t
o
nらのものとほぼ同時期(播種後 2
ることができた。 今回使用した植物の生育時期 は L
よ
，
c
0
.
.
-4日) であるため、今回異なった結果が得られた原因としては、抽出条件や反応条件の違
0
.
2
2.0
0
24 36 48
いなどが考え得る。 しかし、現段階ではそれに対する明確な回答は得られていない。
N-水酸化酵素活性の測定において、 HMBOAを基質とした場合は反応時間を延長しても
0
60
72
24 36 48
84
Hoursa
f
t
e
rseeding
60
72
84
Hoursa
f
t
e
rseeding
全く酵素活性を検出することができなかった。 このことから Hx生合成経路における DIMBOA
の前駆体は HMBOAではな いということが示唆された。そのため、 N
-ヒドロキシ基の導入は 7・
1.2
メトキシ基の導入に先立って行われると推察されるが、 DIBOA-DIMBOA問の酵素活性につ
c
d
いて は未だ報告はされていな い
。
0
.
2
﹀﹀比四¥芯主
また、本研究において、 N-水酸化酵素活性と併せてイ ンドール水酸化酵素活性も測定す
~
0.8
ることができた。この酵素活性については、トウモロコシより単離したチトクローム P-450cDNA
LL
0)
を酵母において発現させたものがあるのみである [
F
r
e
ye
ta
.
l1997]。しかし、 今回インタクト
豆
0
.
1
0
.
.
な植物より調製した酵素液においてもこの活性が測定されたことから、実際の植物体内 におい
0.
4
門J﹄
内u
u
円、u
るE
n
7.￨
，
G
e
e
U
ハ
円。﹁
F
a
a
e
VE'
8 a、・
HU
O
A・ S
ハ
O
84
0
24
qu Mハ
Au
2md
e
i--
vz'
e
心"
﹄E
，
VE'
H
8a
HU
A﹃ 円 、 u
o
quUH
。
円
0
24
てもこの酵素が機能していることが示唆された。
Kumarらは、トウモロコシ由来ミクロソーム画分を用い、 1，
4
b
e
n
z
o
x
辺 i
n
3
o
n
eから DIBOA
84
への水酸化酵素活性を測定し、この化合物が Hxの前駆体であるとした [Kum
紅 e
ta
.
l1
9
9
4
]0
また、 コムギを材料として用いた本研究においても同様の酵素活性を検出することができた。
図1
・2
コムギ芽生えより調製したミクロソーム画分における水酸化酵素活性の経時変化
a
;茎葉部における HBOAに対する活性。 b
;根部における HBOAに対する活性。 c
;
茎葉部におけるインドールに対する活性。 d
;茎葉部における 1
，
4
b
e
n
z
o
x
a
z
i
n3
o
ne
に対する活性。
しかし、最近トウモロコシを用いた研究において、 この反応はHx生合成経路上 のチトクロー
ム P-450酵素、 BX3による副反応であることが示され [
G
l
a
w
i
s
c
h
n
i
ge
ta
.
l1999]、植物体内 に
おける実際の前駆体 (
HBOAの前駆体)は 3
h
yd
r
o
河川 n
d
o
l
i
n
2
o
n
eであることが明らかにさ
れている [
F
r
e
ye
ta
l
.1
9
9
7
;G
l
a
w
i
s
c
h
n
i
ge
ta.
l1999]。
Hx生合成における複数の水酸化反応のうち、最初と最後に位置すると考えられる i
n
d
o
l
e
水酸化酵素活性および、HBOA-N-水酸化酵 素活性が、茎葉部 ・根部の両方において播種後
48時間で最大とな り、その後植物が独立栄養期に 移行していくに従って減少 していった。
-1
2-
-1
3-
.
.
"
.
.
」一
の酵素活性の経時変化は、同時期のHx類の経時変化のパターンとよく一致するもので、ある
。このことから、コムギ芽生えにおける Hx類の一過的な発現は、インドー
lJ
.
ta
[Nakagawae
ル以降の Hx生合成経路全体が活性化していることに起因している。 Hx生合成経路上のチト
第二章
コムギ芽生えにおける UDP-Glc:Hxダルコシルトランスフエラーゼの精製と
性状解析
. 序論
2・1
0酵素やインドール合成酵素をコードする mRNAが、トウモロコシにおける発芽
5
4
クローム P
t
;Melansone
5
9
9
l1
.
ta
ye
e
r
F
直後の時期に高いレベルで発現していることが知られている [
動物・植物は、その体内に様々な種類、の配糖体を持っている。配糖体は一般に、糖の
J。本研究で得られた結果は、これらトウ モロコシでの結果と一致するものであり、トウ
7
9
9
l1
.
α
アノメリック水酸基とアルコール・フェノール・カルボン酸がグリコシド結合により結合した化
モロコシおよびコムギにおける Hx発現調節機構の類似性を示唆するものと考えられる。
-グリコシ
-グリコシド .N-グリコシド .s
合物であり、アノマー炭素が結合している原子により 0
-グリコシド等に分類される 。N-グリコシドは広く動物界に存在し、糖ヌクレオチドや糖蛋
ド.c
白質など重要な生理的役割を果たしている。一方で 0・グリコシドは主に植物において様々な
かたちで広く見られ、糖と脂肪族化合物・芳香族化合物・ステロイド・アルカ口イドあるいは
多糖が結合した形で存在する。
植物体内には、オーキシン・ジベレリン・サイトカイニンなどの植物ホルモンやフラボノイ
) など、非常に多岐にわたる低分子生理活
x
H
ド・シアン含有化合物・環状ヒドロキサム酸 (
性化合物がグルコース配糖体として存在する。多くの場合、これら配糖体は活性本体である
アグリコンの貯蔵形態として機能し、アグリコンー配糖体問の反応(糖の転移および加水分解)
はこれらの化合物の 生理活性発現や化学 的安定性に大きな影 響を及ぼす。このよ うな配糖体
生合成における糖転移反応はグルコシルトランスフエラーゼの働きによるもので、この酵素は
糖ヌクレオチドなどの糖供与体(特に UDP-Glc) からアグリコンへの糖の転移を触媒する。グ
ルコシルトランスフエラーゼは、一般的にグルコシダーゼなどと比べて基質特異性が高いとさ
なと、広い特
ルコシルトランスフエラーゼ、
れているが、例えばアントシアニン生合成に関わるク守
t
;Khoe
b
8
7
9
.1978aand1
l
ta
;Kamsteege
b
6
7
9
l1976aand1
.
ta
he
e
l
a
S
異性を示すものある [
J。
6
8
9
l1
.
ta
;Teusche
4
8
9
l1
.
ta
ne
o
s
s
n
o
;]
8
7
9
l1
.
a
コムギ・ライムギ・トウモロコシなどのイネ科植物に含まれる耐病性因子 Hxは、通常植
J、これ
8
8
9
) として存在しており [Niemeyer1
c
l
-グルコシド(HxG
s
0
物体内では不活性な 2
ら配糖体は UDP-Glc:Hxグルコシルトランスフエラーゼにより生合成される。コムギやトウモロ
cは一過的に高濃度で発現しており、この時期に
l
コシの発芽直後の時期においてこれらHxG
l1995]、第一章におい
.
ta
kagawae
おける植物耐病性発 現への寄与が示唆さ れているが[Na
) が同時期に活性
0
5
4
、 Hx類、の生合成経路上にある複数の水酸化酵素(チトクローム P
て
化されていることが示された。そこで、この章にお いては、 HxGlc生合成経路の最終反 応を
ー
41
5-1
っかさどり、 Hx活性の発現調節に関与する酵素、 UDP-Glc:Hxグルコシルトランスフエラーゼ
. 実験方法
1
2
のコムギ芽生えにおける活性変化について検討することにした。また、このグルコシルトランス
フエラーゼについては、これまでにトウモロコシとライムギについては部分精製酵素を用いた
性状解析が報告されているが、コムギについては粗抽出物での活性が報告されているのみで
. 1994]。そこで、活性の経時変化測定と併せて
l
ta
ne
o
t
h
g
i
e
;L
9
8
9
yandLarson1
e
l
i
a
B
ある [
他植物における酵素との比
グルコシルトランスフエラーゼの精製を試み、その性状解析および、
. 植物材料および Hx類の調製
1
2
2
1節)で述
2
1
) (品種:アサカゼコムギ)は、第一章 (
.
コムギ (TriticumaestivumL
べたのと同様の方法により播種し、生育させた。
DIBOA-Glcおよび DIMBOA-Glcは、それぞ れ矯種後 3日目のライムギ (Secalecereale
1節)と同様 の方法を用
2
1
L.)およびトウモロコシ (Zω maysL.)の茎葉部より、第一章 (
較を行った。
いて抽出、精製した。また、 DIBOAおよび DIMBOAはそれらの配糖体をグルコシダーゼ(組
酵素液)により加水分解した後、 HPLCで精製することにより得た(第 一章参照)。
R'CC~X:H
ー
エ
c
]の方法に従い合成し、
0
6
9
n1
e
n
a
t
r
i
e(HMBOA)は Honkanenら [HonkanenandV
n
o
3
e
s
a
d
i
s
o
c
u
l
G
HBOA-Glcおよび HMBOA-Glcはそれぞれ DIBOA..Glc、DIMBOA-Glcを還元することによ り
DIBOA-Glc
R=H :
R=MeO:DIMBOA-Glc
DIBOA
R=H :
R=MeO:DIMBOA
n
i
z
a
x
o
z
n
e
b
4
1，
勾r
-metho
勾ー 7
o
r
d
y
h
e(HBOA)および 2
n
o
3
n
i
z
a
x
o
z
n
e
b
4
1，
巧r
2-Hydro
]。
0
6
9
n1
e
n
a
t
r
i
調製した [HonkanenandV
. コムギ芽生えにおけるグルコシルトランスフエ.ラーゼの経時変化測定
2
2・2
播種後一定時間経過したコムギの茎葉部・根部をそれぞれ切り取り、秤量した後、液体
-メルカプト
l、4m M2
C
H
s
i
r
0m MT
5
窒素を用いて凍結、磨砕した。続いてこれに抽出液 (
5分間遠心分 離 した。ここで
000gで 1
2，
) を添加して懸濁し、懸濁液を 1
5
.
エタノール、 pH7
0を用いて脱塩後(内在性基質の除去)、得られた溶液を組酵素
1
n
o
c
o
r
c
i
得られた上清を m
液として用いた。また、種子中における酵素の抽出は、種子を長軸に垂直な面で二分し、腔
を含む部分と含まない部分(怪乳側)それぞれについて上と同様の方法で行 った。
)
5
.
-メルカフトエタノール、 pH7
l、4m M2
C
H
s
i
r
0m MT
5
酵素活性の測定は、反応液 (
2m M基質 (DIBOAまたは DIMBOA)および適当量の組酵素液を
.
5m MUDP-Glc、0
に 0.
0量
1
/
添加し、 35 Cで適当時間インキュベー卜することにより行った。反応停止は反応液の 1
0
の 1N塩酸を添加することにより行った。生成した配糖体量は HPLCにより定量した[(DIBOA
)酢酸水溶液、 B
v
/
v
0mm);溶出溶媒， A液:0.1%(
5
1
x
6
.
4
l5C18HG(
i
s
o
k
a
の定量)カラム， W
.0
0-25%B液;流速， 1
:1
n
i
0-25m
、 1
:3-10%B液
n
i
0m
液:メタノール;溶出条件， 0-1
l5C18HG
i
s
o
k
a
mVmin;カラム温度， 40 C;検出， 280nm;(DIMBOAの定量)カラム， W
0
)酢酸水溶液、 B液:メタノール;溶出条件， 0-4
v
/
v
c(
/
lo
.
0mm);溶出溶媒， A液:O
5
1
x
6
.
4
(
:20%B液;流速，1.0mVmin;カラ
n
i
、 25-30m
0-20%B液
:1
n
i
、 4-25m
:10%B液
n
i
m
6-1
7-1
ム温度， 4
0C
;検出， 280nm]。
0
2-25
. 電気泳動
・
2
2
3
. グルコシルトランスフエラーゼの精製
8時間自の茎葉部を液体窒素で凍結
以下の操作はすべて 4Cで行った。コムギ播種後 4
0
19
7
0
) の方法に従
各精製段階における活性フラクション中のタンパク質は、 Laemmli (
い、変性条件下におけるポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAGE) により分析した。
2
2節と同様の抽出液(新鮮中の 5倍量)を用いて粗酵素液を調製した。この
後磨砕し、 2
000gで 30分間遠心分
粗酵素液に硫酸アンモニウムを 45%飽和になるまで添加した後、 20，
000
離し、得られた上清にさらに硫酸アンモニウムを 60%飽和になるまで添加した。その後、 20，
gで 3
0分間遠心分離を行い、得られた沈殿を少量の抽出液に懸濁した。この懸濁液を PD-10
カラムを用いて脱塩後、同じ緩衝液であらかじめ平衡化した B
l
u
e
S
e
p
h
a
r
o
s
eカラム(約 2
0ml
)
に添加した。カラムに保持されなかったタンパク質を同じ緩衝液を用いて洗浄後、溶出液 (
1
0
m MUDP-Glc、 50m MT
r
i
s
H
C
l、4m M2
-メルカフトエタノール、 pH7
.
5
) を用いて目的タ
慮過により濃縮した後、 S
uperdex200HR1
0
/
30カ
ンパク質を溶出した。この溶出溶液を限外 j
P
h
a
r
m
a
c
i
a
)を用 いたゲル櫨過クロマトグラフィーに供した(溶出溶媒:50m MT
r
i
s
H
C
l、
ラム (
4mM2
-メルカプトエタノール、 1
5
0m M塩化ナトリウム、 pH7
.
5
;流速:0.
5mVmin)。さらに
ここで得られた活性画分を、 5
0mMT
r
i
s
H
C
l、4m M2
-メルカフトエタノール (pH8
.
0
) であ
oQ HR5
/
5カラム (
P
h
a
r
m
a
c
i
a
) に添加し、 1
1
0-260m Mの塩化
らかじめ平衡化した Mon
0m
l
) によ りタンパク質を溶出した。
ナトリウム直線勾配(溶出液量:5
各精製段階における活性測定には 2
00m MDIMBOAを基質として用いた。また、タン
r
a
d
f
o
r
d(
1
9
7
6
) の方法に従い、ウシ血清アルフ会ミンを標準として行った。ま
パク質定量は、 B
た、ゲル漉過クロマトグラフィーにおける分子量測定には以下のタンパク質を標準として用い
た;フェリチン (
4
4
0kDa)、ヒト IgG (
1
6
0kDa)、トランスフェリン (
8
1kDa)、オブアルブミン
(
4
3kDa)、ミオグロビン (
1
7
.
6kDa)。
2
2
4
. 酵素活性の測定
.
5mMUDP-Glcおよび 0
.
2m M基質
グルコシルトランスフエラーゼ、の活性測定は、 0
(DIBOAまたは DIMBOA) を含む反応液 (
5
0mMT
r
i
s
H
C
l、4mM2
-メルカプトエタノール、
pH7
.
5
)に適当量の粗酵素液を添加し、 35Cで適当時間インキュベートすることにより行った。
0
2・2節と同様の方法によ り行った。また、反応の至適 pH
反応停止および生成物の定量は 2は
、 pH5
.
2-7.4はリ ン酸カリウム緩衝液、 7.
4-9.2は T
r
i
s
H
C
l緩衝液、 9.
2-11はグリシ
ンー水酸化ナトリウム緩衝液を用いて測定 した。
-1
8-
信
1
9-
図 2-1-Aに示すように、吸水前の乾燥種子中においても、 わずかながらではあるが活性
. 結果
3
2
が認められた。そして、 吸水開始 12時間後には、任側部 分における活性が約 2倍に、 そし
て 24時間後にはおよそ 3-4倍程度に上昇した。またこのとき、 DIBOAと DIMBOAの両基
. コムギ芽生えにおけるグルコシルトランスフエラーゼ活性の経時変化
-1
3
2
コムギ中の HxGlc濃度が、吸水開始後から急速に増大するという過去の報告に基づき
]、コムギ、吸水種子中および発芽後の茎葉部、根部におけるグルコシル
5
9
9
l1
.
ta
akagawae
[N
トランスフエラーゼ活性を経時的に測定した。なお、本研究におけるコムギの生育条件下では、
質に対する活性は同調して増加していた。 一方で、医乳部分( 庇を含まない側)に おける酵
素活性は、両基質に 対して吸水開始後 24時間まで、の聞に変化は認められなかった。
発芽後の茎葉部・根 部それぞれにおける 活性の変化を図 2-1-Bおよび 2-1-Cに示す。
DIBOAおよび DIMBOAに対するグルコシルトラ ンスフエラーゼ、活性は発芽以降も上昇し、茎
播種後(吸水開始後 )約 16-20時間程度で発芽を始めた。
3
.
2
葉部・根部の両方に おいて播種後 36-48時間で最大となった (茎葉部;DIBOA:1
5
4
-0-DIBOA(embryo)
DIMBOA(embryo)
一
・
- DIBOA(endosperm)
r
:
l
-
5
.
1BOA:9
¥
l
mgF W，DI
/
5pkat
.
mgF W、根部 ;DIBOA:6
/
5pkat
.
7
mgF W，DIMBOA:1
/
pkat
A
。その後、茎葉部で、は独立栄養期に移行するに従って急速に活性が低下し、播
mgF W)
/
pkat
--6-DIMBOA(endosperm)
~
3
10程度とな った。 一方で、根部におい ては緩やかに活
/
種後 168時間では最大値のお よそ 1
2
性が低下してい った。 ここにおいても先と同じように、 DIBOAと D酌 lBOAの両基質に対する
01
E
、
、
、
~
x
:
.
a
活性は完全に平行して変化していた。
l
。
。Ho6ursaf1t2erimb1i8bition24
. コムギ芽生えからのグルコシルトランスフエラーゼの精製
2
3
2
前節において、 UDPG:Hxグルコシルトランスフエラーゼ活性が、播種後 36-48時間で
ヲ4
・よ句 A
司ム唱ム唱
nuoopb
吋ζ
唱ム
バ MY
Tム 噌 ム
吋 n u n o
4
古色
E¥
ム噌よ
三比四
A'
差
Ebm
﹀﹀比四
086420864
B
こなった。 そこで、播種後 48時間のコムギ茎葉部よりグルコシルトラ
最大となることが明らか l
C
DIMBOA
c
l
G
DIMBOA.
粗酵素液を硫酸アンモニウムを用いた塩析により分画したところ、ほぼすべての活性は 45
ー
e
epharos
S
-60%飽和画分に認められた。次に、 この画分を緩衝液に再懸濁後脱塩し、 Blue
を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。グル コシルトランスフエラーゼの酵素反
6
Glc
DIBOA-+DIBOA.
応における基質(糖 供与体) である UDP-Glcによりカラムからタンパク質を溶出した結果、
4
2
2
。
24
比活性は 46倍程度上昇した。その後、 Superdex200によるゲル漉過クロマトグラフィーにお
0
36
48
60
ンスフエラーゼの精製を試みた。
72
24
84
36
48
60
72
84
ing
d
e
e
rs
e
t
f
sa
Hour
ing
d
e
e
rs
e
t
f
Hoursa
) におけるグルコシルトラン
B，C
) および芽生えにおける (
A
. 吸水種子 (
1
図 2
スフエラーゼ活性の変化
:吸水種子中の活性。 .，DIMBOAグルコシルトランスフエラーゼ(旺側)、
A
O.DIBOAグルコシルトランスフエラーゼ(佐側)、 企.DIMBOAグルコシルト
壬乳側)、ム司 DIBOAグルコシルトランスフエラーゼ‘(目壬乳
H
ランスフエラーゼ C
における活性。 ..DIMBOAグルコシ
C)
B)および根部 (
:茎葉部 (
C
) B，
J
倶I
ルトランスフエラーゼ、 O.DIBOAグルコシルトランスフエラーゼ、
0
5mlで活性が最大となり 、本酵素の分子量は およそ 40kDaと推定さ
.
3
いては、溶出液量 1
)。続いて、 ここで得られた活性画分を MonoQを用 いた強陰イオン交換クロマ
2
れた(図 2
)。主要ピーク(ピ
3
トクマラフィーに供したところ、二つの明瞭な活性ピークが検出された(図 2
) 各フラクション中のポリペプチド構成を SDS-PAGEにより分析したところ、分子量 49
ーク 2
および 47kDaのバンドのみが観察され、両バンドの強度変化が酵素活性変化と一致してい
) についても SDS-PAGEにより分析し
4)。また、 もう一つの活性ピーク(ピーク 1
た(図 2)。以
5
こなった(図 2
たところ、分子量 47kDaのバンドを主要バンドとして含むことが明らか l
-20-
-21-
は分子量 49および(もしくは) 47kDa
上の結果より、 コムギのグルコシルトランスフエラーゼ、
のモノマーであり、 2つ以上のアイソザイムが存在することが示された。
ここまでの精製過程で、 MonoQクロマトグラフィーにおけるピーク 2については 、およ
1 32 33 34 35
(kDa)M 27 28 29 30 3
200
1
16
66 暢
1
)。 しかし、 ピーク 1についてはタンパク質量が 微量
そ 1500倍の精製が達成された(表 2-
綿議Z議議書ぷおL3
話事叩
42鵠
で、
あったため、比活性を測定することがで、きなかった。
30 ~
500
と 100
400
4・4
・て
ω
300
場・4
:丘~
60
8
J
5
3
200
エ
= 40
(コ︿E
)O∞刊 ︿
〉
.
.
.
.
Q
の 80
〉、
図2
・2
.S
u
p
e
r
d
e
x200によるゲル;慮過
クロマトグラフィー
.:D
酌1
BOAグルコシル トランスフエ
ラーゼ活性
ラフィー (MonoQ) における各活性フラクション
図 24 陰イオン交換クロマト夕、、
のSDS-APGE
ゲル上の数字は MonoQ におけるフラクション番号。 M:マーカータンパク質
ω
i二
100
A280
場回d
、
ト
ー
o 20
。
"
#
G
O
5
10
15
M
e
l
u
t
i
o
nvolume(
mり
12
玄 100
ι
コ 80
何
ミテセ
.
三aS 60
す
て .
.
c
0)
.~
エ
= 40
ω
.
.
.
。
￡
ご
o
(
f
l
.
、
、
-
20
2
。
。
200
議舗面静
116
溺諭酔
66
鎖倒酔
5
鴫
4
図2
・3
.MonoQによる陰イオン交換ク
ロマトグラフィー
.:DIMBOAグルコシjレトランスフエ
ラーゼ活性
42
輔
副
摩
明州説ア
)O∞N︿
(コ︿E
8642
〉
司_，
坤ー
3 4
10
吟_，
~
~
2
(kDa)
20
輔総動静
令
30 磐梯酔
4
10
20
30
40
50
f
r
a
c
t
i
o
nN
o
.
図2
5. 各精製段階における活性フラクションの SDS-PAGE
M:マーカ ータンパク質、 1
:粗酵素液、 2:B
l
u
eS
e
p
h
a
r
o
s
e、
3
:Su
p
e
r
d
e
x2
0
0、
4
:MonoQ (ピーク 2
)、5
:MonoQ (ピーク 1
)
2
33
. グルコシル トランスフエラ ーゼ の 特 性
前節 (
2
3
2節)において部分精製 され、 コムギ芽生えにおけるグルコシルトランスフエ
MonoQ クロマトグラフィーでのピーク 2
) について性状解析を行った。
ラーゼ (
-22-
ー
23-
表 2・1 グルコシルトランスフエラーゼの精製
-メルカプトエタノール、 EDTAおよび
表 2-3. 2
金属陽イオンの効果
n
o
t
a
i前c
r
u
Recovery P
y
t
i
v
i
t
c
ca
i
f
i
c
e
p
S
(%)
)
d
l
o
f
(
)
n
i
e
t
o
r
gp
m
/
t
a
k
n
(
粗酵素液
100
7
.
0
(%)
0
.
1
46.7
eSepharose
u
l
B
8
.
0
3
1
.
4
3
Superdex200
6
.
9
9
4
20.
1
5
1
1
.
2
8
9
7
.
4
1488
MonoQ
y
t
i
v
i
t
c
ea
v
ti
a
l
e
R
l
o
r
t
n
o
C
100
5mM)
.
0
EDTA(
1
0
1
4mM)
2-Mercaptoehanol(
140
。
5mM)
Cu2+ (
5mM)
.
0
Mn2+ (
ルコシルトランスフエラーゼの基質特異性
表 2・2.ク♂
ax
m
V
)
n
i
e
t
o
r
mgp
/
t
a
k
n
(
4
1.
4
2
+
1
0
1
φ
2
102
5mM)
.
0
Ca (
Km
(M)
ド
5mM)
.
0
Mg (
446
3
.
1
4
1424
40.6
HBOA
.
d
.
n
.
d
.
n
-メルカプトエタノールは、酵素活性をおよそ 40%増大させた。
た。一方で、還元試薬である 2
HMBOA
.
d
.
n
.
d
.
n
また、金属陽イオンの中では 、Cu-が酵素活性を完全に阻害し、 M n-も約 60%阻害した。
n
i
t
e
l
u
c
s
E
.
d
.
n
d
.
n
その他の Ca - および、 Mg2~ は全く 1舌 '1主に変化を与えな‘かった。ここでの 2ーメルカプトエタノー
DIBOA
DIMBOA
2
2
2
2
u-の効果は、部分精製したトウモロコシグルコシルトランスフエラーゼに対する過
ルおよび C
d
e
t
c
e
t
e
td
o
.:N
d
n.
去の報告 [BaileyandLarson1989]と一致するもの-であった。
5-7.7の間で最大値とな った。そこで以下の測
.
反応の至適 pHを測定したところ、 pH7
m値およびび、Lm
印IBOA用いた場合の K
5の反応液を用いた。糖受容体として D
.
定には pH7
仏
九
/
九
仏
杭
m
)。また、 DIMBOAに対する K
2
nで、あった(表 2
i
e
t
o
r
mgp
/
.3凶4、446nkat
はそれぞぞ、れ、 41
nで、あった。 また、糖供与体の
i
e
t
o
r
mgp
/
t
ax値はそれぞれ、 40.6μM、 1424nka
u
r
値および V
m値は 40.0μMであった。一方で、 Hxではなくラクタムである HBOAお
UDP-Glcに対する K
よび HMBOAを糖受容体とした場合は、反応液中の酵素添加量を増やし反応時間を延長 し
た場合でも、酵素活性を検出することがで、きなかった。 MonoQクロマトグラフィーにおける
ピーク 1に対しても DIBOAおよび DIMBOAに対する K 値を求めた結果、それぞれ 64.6μM
lU
および、 37μMであった。ピーク 1に関してはタンパク質濃度を測定することができなかったた
x値を算出することはできなかったが、 DIMBOAに対する活性は DIBOAに対す
a
u
r
め、その V
anotshown)。
t
a
d
る活性のおよそ 2-3倍程度で、あった (
次に、 EDTA、2-メルカプトエタノール、金属陽イオンの効果を表 2-3に示す。 2価イオ
/の キレーターである EDTAを 5mM添加した場合でも、酵素活性に変化は認められなか っ
-24-
-25-
と考えられた。
. 考察
4
2
0倍程度にな った (MonoQクロ
0
5
今回用いた精製過程により、最終的に比活性が約 1
コムギの耐病性因子である Hx類の濃度が発芽 後急速に上昇し 、その後独立栄 養期に
7kDaの 2
9および 4
)。しかし、 SDS-PAGEによる分析では 4
マトグラフ ィーにおけるピーク 2
]。また前章において、
5
9
9
l1
.
ta
Nakagawae
移行するに従 って減少していくことが知られている [
つのポリペプチドの確認され、また、この 2つのペプチドの MonoQ カラムからの溶出パター
、 Hx類 の消長と同
-450) が
これらの生合成経路上流に位置する水酸化酵素(チトクローム P
に相当するのかは明ら
ンは全く同じであったため、このどちらがグルコシルトランスフエラーゼ、
調して増減していることを明らかにした。この第 2章においては、これら水酸化酵素のさらに
ルコシルト
:シナピン酸グ、
c
l
G
P
D
かにならなか った。これまでに、アブラナ科より単離された U
の同
c生合成の制御に最も直接的に関わるグルコシルトランスフエラーゼ、
l
下流に位置しHxG
ランスフエラーゼが、糖供与体のヌクレオチド部分に高い特異性を示すことが報告されている
時期における活性変化を測定した。その結果、この酵素活性も同様の消長パターンを示すこ
]。そこで、これらの 2つのペプチドをクロマトグラフィーにより分離する
8
9
9
s1
i
l
l
dE
n
ga
n
[Wa
とが明らかになり、この時期の Hx類発現 の調節にグルコシルトランスフエラーゼが関与して
eをアフィ ニティークロマ トグラフィーの担体として精製を試みたも
n
i
m
a
l
o
n
a
x
e
h
Pために、 UD
いることが示唆された。さらにこの結果は、発芽直後の時期における Hx生合成経路全体 の
のの、この担体は本酵素を吸着することができなかった。また、ヒドロキシアパタイトも同様で
活性化、という前章での考察を支持するものである。
チドをそれぞ、れ分離することは不可能であ った。コムギ
あり、本研究においてはこれらのぺフ。
コムギに含まれる Hx類は主に DIMBOA-Glcであるが、特に発芽直後の時期においては
Dの 3つのゲノムより構成される 6倍体植物であるため 、同様の生理的活性を持つ
B，
、 A，
は
]。また、DIBOA-Glcと
5
9
9
l1
.
ta
ae
w
a
g
a
k
DIBOA-Glcも比較的高い濃度で発現している [Na
9およ
酵素を複数持っている可能性も否定することはできな、い。このため、本章で示された 4
DIMBOA-Glcの発現時期には若干の相違が認められている。このことから、 DIBOAと
チドの両方がグルコシルトランスフエラーゼであるとも考え得る 。
7kDaのポリペフ。
び4
1BOAに対してそれぞれに特異的な 2つの酵素が存在するのではないかとも考え得るが、
¥
l
DI
これまでに Hxをその体内に蓄積する植物については、トウモロコシおよびライムギより
両基質に対するグルコシルトランスフエラーゼ活性の経時変化は茎葉部・根部ともに完全に平
n
o
t
h
g
i
e
9;L
8
9
n1
o
s
r
a
dL
n
ya
e
l
i
a
B
Hx-グルコシルトランスフエラーゼが部分精製されている [
あった。このことから、この時期に発現して いる主な Hxグルコシル トランスフエ
行したもので、
]。本章で、精製を行ったコムギグツレコシルトランスフエラーゼ(ピーク 2) の DIBOA、
4
9
9
l1
.
ta
e
ラーゼはただ一つであるということが示唆された。
4倍
u副値は DIMBOAが DIBOAのおよそ 3
r
u値はほぼ同程度 であり、 V
r
DIMBOAに対する K
MonoQ) において、二つの
酵素精製 における強陰イオン交換クロマト クFラフィー (
あった。この結果は、これま
程度であった。また、ピーク 1に関しても Km値は同様の結 果で、
。ま
3、ピーク 1およ び 2)
1BOA-グルコシルトランスフエラーゼ活性が検出された(図 2
¥
l
DI
でに報告されているトウモロコシ ・ライムギの酵素と同様のものであり、そこで見られる若干の
た、ピーク 1に関してはさらに 2つピークが近接して構成されているようにも見える。この結
相違は、酵素の精製状態や反応条件の違いなどにより説明しうる範囲のものである。また、
果から、コムギには少なくとも 2つのグルコシルトランスフエラーゼアイソザイムが存在するこ
今回得られた結果は、過去に報告のあるコムギ組酵素液中のグルコシルトランスフエラーゼ活
]はトウモロコシから の酵素精製にお いて 、
9
8
9
n1
o
s
r
a
dL
n
ya
e
l
i
a
B
yら [
e
l
i
a
とが示唆され た。B
慮過クロマトクcラフィーによるトウ
]。さらに、ゲル j
5
9
9
.1
l
ta
ne
o
t
h
g
i
e
L
性と同様の傾向である [
BOA-グル コシルトランスフエラーゼ、
同じく陰イオン交換クロマトグラフィーによって 2つの DIM
3kDa
0および 4
モロコシおよびライムギグルコシルトランスフエラーゼの分子量は、それぞれ 5
活性が検出されることを報告している。そして、より高濃度の塩により溶出されたアイソザイム
2
や 2・メルカ
である。これは、本研究で得られた分子量測定とほぼ同ーといえる。また、 Cuー
1BOAに対する K同値にはそれほど差がないものの、低濃度で溶出されるア
¥
l
の DIBOA、DI
]の示したトウ
9
8
9
n1
o
s
r
a
dL
n
ya
e
l
i
Ba
yら [
e
l
i
a
プトエタノールの酵素活性に及ぼす効果は、 B
イソザイムは DIMBOAのみに高い親和性を示すことを明らかにした。しかし、今回得られた
モロコシ由来グルコシルトランスフエラーゼの結果と同じものである 。これらの結果に加え、本
m
コムギグルコシルトランスフエラーゼの場合は、 DIBOAおよび DIMBOAの両基質に対する K
章ではコムギグルコシルトランスフエラーゼの分子量はゲル漉過クロマトグラフィーにより 40
値に関して 2つのピーク間では有意な差は見られなかった。 このことから、コムギにおけるア
7kDaであったことから、この酵素は単 一のサ
9または (および) 4
kDa、SDS-PAGEにより 4
イソザイムはトウモロコシにおいて報告されている 2種のアイソザイムに相当するものではない
ブユニットからなるモノマーとして存在することが明らかになった。
ー
62
-27-
-グルコシルトランス
x
これまでの結果より、コムギ・トウモロコシ・ライムギに存在する H
第三章
コムギ芽生えにおける βグルコシダーゼの精製と性状解析
フエラーゼの性質は、多少の違いはあるもののほぼ同様のものであることが示された。 トウモ
IMBOA-Glcを主に蓄積し、ライムギは DIBOA-Glcを蓄積
ロコシおよびコムギは Hxとして D
J。しかし、グルコシルトランスフエラーゼは、これら 3種の植物すべて
8
8
9
する[Niemeyer1
類似の基質特異性を示すことが明らかになった。この結果は、グルコシルトランスフエラー
で、
ゼと同じく Hx発現に直接的に関与するグルコシダーゼとは異なるものである。このことは、
これら植物における Hx発現機構の進化を酵素レベルで考える上で非常に興味深い結果とい
える。
. 序論
1
3
-グルコシダーゼ
s
) は、動植物をはじめカビやバクテリア等まで幅広く生
1
.2
.1
2
.
(EC3
J。この酵素はアリールーグルコース
2
8
9
ndWiseman1
物に存在する酵素である [Woodwarda
J、その 0-グ
7
7
9
e1
s
e
e
R
またはアルキルーグルコースといったグルコース配糖体を基質とし [
ルコシド結合の加水分解反応を触媒する。本酵素の生理的役割としては様々なものをあげる
ことができるが、植物におけるその役割のーっとしては耐病性への関与があり、シアン含有
化合物・環状ヒドロキサム酸(Hx)・ステロイド・イソフラボノイド等のグルコース配糖体を加
;Conn
5
7
9
z1
r
a
landB
e
s
o
H
水分解することにより病害虫に対する抵抗性化合物を遊離させる [
J。グルコシダーゼとその基質であるグルコ
2
9
9
;Cuevas1
8
8
9
s1
u
i
s
i
;N
8
8
9
;Niemeyer1
1
8
9
1
ース配糖体は、細胞内においてそれぞれ異なる部位に保存されていると考えられており、例
l
.
ta
.1990;Hughese
l
ta
;Mkponge
5
:
8
9
s1
e
k
a
K
えばシロツメクサやカッサパでは細胞壁 [
s
u
i
s
i
;N
1
8
9
dConn1
n
ra
e
y
a
h
T
J、トウモロコシ・モロコシ・エンバクではフラスチド [
2
9
9
1
J等に酵素が存在するとされている。そし
8
9
9
kandEsen1
e
c
i
;C
3
9
9
r1
e
l
t
e
t
;EsenandS
8
8
9
1
て傷害や感染などにより細胞が物理的に破壊されることで酵素と基質が接触し、グルコースと
活性本体であるアグリコンが遊離する。
DIBOAや DIMBOAといった Hx類、はコムギ・トウモロコシ・ライムギなどのイネ科植物
J。これら Hx
8
8
9
emeyer1
に見られる耐病性因子であり、抗力ビ・抗バクテリア活性を示す[Ni
) は、コムギやトウモロコシの
c
l
cと DIMBOA-Glc;HxG
l
G
DIBOA
類のグルコース配糖体 (
l
.
ta
発芽直後の時期に一過的に最も多量に発現している二次代謝産物である[Nakagawae
J。そして、前章までにおいて、このような Hx類の消長は Hx生合成
8
9
9
l1
.
ta
ie
u
s
i
b
;E
5
9
9
1
経路全体の活性化によるものであるとことが示された。
Hx類の生合成には多くの酵素が関わっているが、その中でも βグルコシダーゼは活性
本体である Hx類アグリコンの発現に最も直接的に関与する酵素である。つまり、従属栄養期
におけるコムギ耐病性の発現制御に最も深く関与して.いる酵素であるといえ、その性状を明ら
かにすることは非常に重要な意味を持つといえる。これまで、 Hx類を体内に蓄積する植物の
;
2
9
9
n1
e
s
E
グルコシダーゼに関しては、トウモロコシの酵素が最もよく研究されている [
J。しかし、コムギを含むその他の植物に関しては全く情報がない。
4
9
9
BabcockandEsen1
-28-
ー
29-
そこで、この第三 章ではコムギの芽生えに発現しているベンゾキサジノン配糖体グルコシダー
. 実験方法
2
3
ゼ の精製を行 い、その性状解析を 行 った。また、コムギ品種・種間でのアイソザイムの多形
. Hx類の調製
-1
2
3
性につ いても検討した。
品
.) (
eL
l
a
e
r
e
ec
l
a
c
e
S
DIBOAおよび その配糖体 DIBOA-Glcは播種後 3日のライムギ (
種:春 一番)茎葉部より単離した。配糖体は、植 物体を液体窒素で凍 結後、磨砕し、新鮮
000gで遠心分離し、得られた上
2，
重の 5倍量のメタノールで摘出した。その後、抽出物を 1
清を減圧濃縮した。 さらに漉紙を用いて漉過後、ヘキサンに対して分液し、得られたメタノー
;
0
5
S
0
2
)メタノールに溶解し、 ODSゲル (ODS-AM1
v
/
v
ル層を減圧濃縮した。その後、 50%(
ル担体に吸着さ
) を加えて撹排することにより、疎水性の不純物をゲ、
n
a
p
a
]
.，Kyoto，
o
YMCC
せて除去した。この溶液を 5-10mlまで濃縮したのち、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)
)
v
/
v
0x250mm);溶出溶媒， 24%(
2
I5C18HG(
lI
i
s
o
k
a
分取により精製を行った[カラム， W
0mνmin]。アグリコンは、精製した配糖体を 50
)酢酸水溶液;流速， 1
v
/
v
1% (
.
メタノール /0
) 中でコムギグルコシダーゼの粗酵素液により室温・ 1時
5
.
mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5
間加水分解し、配糖 体と同条件での HPLC精製を行うことにより得た。 DIMBOAおよび
) (品種:スノーデント
.
sL
y
a
am
e
Z
DIMBOA-Glcの調製は、播種後 3-4日のトウモロコシ (
) 茎葉部を材料とし、 DIBOAもしくは DIBOA-Glcと同様の方法により行 った。
8
0
1
e
n
o
3
n
i
z
a
x
o
z
n
e
b
4
1，
y
x
o
h
t
e
m
勾ー 7
o
r
d
y
h
e(HBOA)および 2
n
o
3
n
i
z
a
x
o
z
n
e
b
4
1，
巧2-Hydro
)らの方法に従い合成した。また、その配糖体、 HBOA-Glcお
0
6
9
1
(HMBOA)は Honkanen(
よび HMBOA-Glcはそれぞれ DIBOA-Glcおよび DIMBOA-Glcを還元することによ り得た
]。
0
6
9
n1
e
n
a
t
r
i
[HonkanenandV
. 植物材料
2
2
3
ラスチ ック製バ ットに蒸留水で、湿らせたペーパータオルを敷き、その上にコムギ
フ。
2時間、 25 Cで一
) (品種:アサカゼコムギ)種子を播種し、日長 1
.
mL
u
v
i
t
s
mαe
u
c
i
t
i
r
T
(
0
定時間インキュベートした。
.
3
2
3
-グルコシダーゼの精製
s
行 った。コムギからのグルコシダーゼの精製は主に Esen
以下のすべての作業 は 4Cで、
0
)の方法に従 い行った。播種後 48時間のコムギ茎葉部、およそ 3gを液体窒素中で凍
2
9
9
1
(
0)に懸濁し
.
0m M酢酸ナトリウム緩衝液、 pH6
5
結、磨砕し、新鮮重 の 5倍量の抽出液 (
-30-
1-3
慮過することにより内在
000gで 20分間遠心分離後、得られた上清を限外 j
5，
た。懸濁液を 1
)酢酸水溶液を用い
v
/
v
性Hx類を除去し、これを粗酵素液とした。粗酵素液の pHを 50%(
000
0，
.8に調整 し、そのまま4 Cで約 2時間放置した。この冷却沈降により生じた沈殿を 2
て4
0
. 電気泳動および N末端アミノ酸配列の解析
5
2
3
8時間 のコムギの茎葉部から抽出 した粗酵素液
グル コシダーゼの活性染色には播種後 4
0m M酢酸ナトリ
gで 30分間遠心分離することにより除去し、上清に含まれるタンパク質を、 5
)
E
G
A
P
e
v
i
t
a
n
)の方法に従い、 4 C、未変性状態で (
4
6
9
1
s(
i
v
a
を用 いた。電気泳動は D
s
u
l
lP
l
e
c
c
A
8)であらかじめ平衡化した弱陽イオン交換クロマトグラフィー (
.
ウム緩衝液 (pH4
5)中で 4
.
e緩衝液 (pH5
n
i
a
v
l
おこなった (8%ポリアクリルアミド)。電気泳動後、ゲルを McI
) に吸着させた。カラムを同じ緩衝液約 20mlで洗浄後、塩
l
CM，Waters)カラム(約 5m
-グルコシド (6BNG)および 10
s
-ナフチル -ブロモー2
5rnM6
.
、 0
C、30分間平衡化し、その後
O
8-6.0の pH勾配によりタンパク質を溶出し
.
化ナトリウム 0-400mMの直線勾配、または 4
5)
.
e緩衝液中 (pH5
n
i
a
v
Il
t)を溶解させた Mc
l
a
tBlueBBs
s
a
F
rnMフ ァストブル ー BB塩 (
8の
.
8に調整後、 pH4
.
)酢酸で pH4
v
/
v
た。グルコシダーゼ活性を持つフラクションを 50%(
)
v
/
v
で暗下、 30C、2時間インキュベートした。染色終了後、ゲルを蒸留水で 2回洗浄し、 10%(
c，Waters)にタ
c
Sep-PackVac1
sCMカラム (
u
l
1P
酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化した Accel
-メチルウンベ
4
)酢酸水溶液に浸して固定した。基質として蛍光色素 (
v
/
v
メタノール /10%(
lで目的タンパク質を溶出し
n
5r
.
pH8程度)2
ンパク質 を吸着させ、 50rnM酢酸ナトリウム (
-グ、ルコシド :4MUG) を用いた場合は、電気泳動後に上と同じ条件でゲルをイン
s
リフェリル -
た。さらに、ここで得られた活性画分をゲル積過クロマトグPラフィーにより精製した [カラム，
0量の 1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、lNラ ンプ下
1
/
キュベー卜した後、反応液量の 1
0rnM塩化
0
5)、1
pH5.
0rnM酢酸ナトリウム緩衝液 (
;溶出溶媒， 5
0
3
/
0
Superdex200HR1
でバンドを観察した。フロテアーゼ、阻害剤のザ、イモグラムへの影響を検討するためには、酵
]。ゲル漉過クロマトグラフィーにおける分子量測定には以下のタ
n
i
n
r
l
l
n
5r
.
ナトリウム;流速， 0
0rnM
素液を以下の化合物を含む緩衝液で抽出し、直ちに native-PAGEにより分析した;1
0kDa)、トラン
6
1
0kDa)、ヒト IgG (
4
4
ンパク質を標準タンパク質として用いた:フェリチン (
e，40μM
n
i
d
i
n
r
a
z
n
e
n，1rnMb
i
a
p
i
t
n
e，20μMa
d
i
r
o
u
l
lf
y
n
o
f
l
u
s
e
n
a
h
t
e
m
l
y
n
e
h
p
o
n
i
d
i
n
r
a
4
。なお、以上に
6kDa)
.
7
1
3kDa)、ミオグロビン (
4
1kDa)、オブアルブミン (
8
スフェ リン (
e。
n
o
t
e
lk
y
h
t
e
m
o
r
o
l
h
ec
n
i
s
y
l
yトL
S
o
t
t
l
O
e，and1rnMN
n
i
l
o
i
h
t
n
a
n
e
h
p
0
1
0rnM1，
n，1
i
t
p
e
p
u
e
l
0
0
.4rnMDIMBOA-Glcを基質とし
9m MDIBOA-Glcおよび 1
述べた各精製過程においては、 2.
ユニット構成の検討には、 native-PAGE
Native-PAGEにおけるバンド中に含まれるサブ、
)の方法に従 い、
6
7
9
1
d(
r
o
f
d
a
r
てグルコシダーゼ活性を測定した。また、タンパク質定量は B
)を用いて
n
o
c
i
m
A
r(
o
t
u
l
i
r
t
n
e
後ゲルを CBBで染色し、各バンドを剃万を用いて切 り抜き、 C
ウシ血清アルブ戸ミンを標準として行った。
ゲル中に含まれるタンパク質を電気的に溶出した。このタンパク質のポリペプチド構成は、
)の方法に従い SDS-PAGEにより分析し、銀染色法により確認した。
0
7
9
1
i(
l
n
r
n
r
e
a
L
ポリペプチドの N-末端アミノ酸配列 の解析のためには精製タンパク質を SDS-PAGEに供
. 酵素活性測定
4
2
3
0rnMリン酸緩衝液
0
2
0m Mクエン酸0
グル コシダーゼ活性は、最終液量 500μlの 1
5)中、 2-10μlの酵素液、 30 Cで 3-10分間反応を行うこと
pH5.
e緩衝液) (
n
i
a
v
l
I
Mc
(
0
により測定した。酵素反応を 50μ!の 1N塩酸で停止後、生成したアグリコンを HPLCで分
した後 PVDF膜 にブロッテインクごし、 CBBにより染色した。その後、 60および 58kDaペプチ
ドを切り抜き、そのままプロテインシーケンサーに供することで N-末端アミノ酸配列の解析を
。
n)
r
e
t
s
y
nSequencingS
i
e
t
o
r
HPG1005AP
子った (
f
1%
)メタノール /0.
v
/
v
;溶出溶媒， 24% (
)
n
r
n
6x150r
4.
I5C18HG(
lI
i
s
o
k
a
析した[カラム， W
)酢酸;流速，
v
/
v
0-30分)/3%(
)酢酸水溶液、または 20-60% メタノール直線勾配 (
v
/
v
(
pNP)配糖体を基質とし
]。ρニトロ フェノ ール (
n
r
0n
;検出， 28
;カラム温度， 40 C
n
i
n
r
V
n
8r
.
0
0
μlの 6 N水酸化ナトリウムで反応を停止後、生成したアグリコンを吸光度 400
0
た場合は、 5
nmで定量することにより酵素活性を測定した。反応液に添加した酵素量および反応時間は、
) および
u
Kr
その反応中に反応速度変化が起こらないよう適当に設定した。ミカエリス定数 (
]プロットにより求めた。
s
-[
v
l
sJ
)は [
x
a
u
r
V
最大反応速度 (
ー
32-
3-3
3
3
2
. コムギ芽生えからのグルコシダーゼの精製
3・3
. 結果
播種後 4
8時間のコムギ茎葉部より調製した組酵素液の pHを 4
.
8に調整し、 4Cで約 2
0
3
3
1
. グルコシダーゼ活性のコムギ芽生えにおける動態
時間放置することにより、その上清部分のグルコシダーゼの比 活性は D
IBOA-Glcおよび
コムギ(アサカゼコムギ)の芽生えにおいて、 H
xGlc(
DIBOAG
l
cおよび DIMBOA-Glc)
DIMBOA-Glcに対して 4-5倍上昇した。そこで得られた上清を陽イオン交換クロマトグラフィ
カf 過的に高濃度で発現しているという過去の報告 [Na
k
a
g
a
w
ae
ta
.
l1
9
9
5
]に基づき 、 同じ
(
A
c
c
e
l
lP
l
u
sCM) 担体に吸着させた後、 0-400m Mの塩化ナトリウム直線勾配でタンパ
時期における H
xGlcグルコシダーゼ活性の経時変化を、茎葉部 ・根部それぞれより調製し
ク質を溶出した。 そして、各フラクションの活性測定および、SDS-PAGEによる含有ポリペプチ
た粗酵素液を用いて測定した。
ドの分析を行ったところ、 6
0および 5
8kDaのポリペプチドがグルコシダーゼ活性の変化とよ
く一致していた(図 32)。
A
B.Root
A.Shoot
100
40
20
。
。 σ/ベトーや一一←~
24
36
48
60
72 84
96
24
hoursaftersowing
36
48
60
72 84
80
300
60
200
40
00¥0)
20
60
400
100
。
20
96
。
10
h0ur
saf
ter50W i
n9
図3
1
. コムギ芽生えにおける βグルコシダーゼ活性の経時変化
(
0)
:D
I
B
O
A
G
l
cg
l
u
c
o
s
i
d
a
s
e，(
・)
:D
IMBOA-Glcg
l
u
c
o
s
i
d
a
s
e
(ZE) U
一 のZ
40
μ一﹀一μυの
60
80
¥戸
h
L
mE むの﹀五
﹀﹀
EDZa
﹀﹀比四
80
n
u
100
工町一工主ご
(
主
一
﹀ -uυ の百ω
120
nU
4i
120
20
40
30
50
60
fractionNo.
B
kDa
M
6
10
16
14
18
2
0 24
28
∞
2
1
16
・-
舗刷 - 岨 ・
司嗣・・拘刷隣
‘句骨向 、
図3
1に示すように 、DIBOA-Glcおよび DIMBOA-Glcグル コシダーゼともに、茎葉部で
駒山
崎明輔欄嶋嚇夢
句"嶋W噌.，..
軍.k--.
は発芽とともに新鮮重あたりの活性が急速に増大し、播種後約 4
8時間で、最大となった
(
DIBOA-Glcグ、ルコシダ ーゼ、
:1
3p
k
a
t
/
mgFW、DIMBOA-Glcグルコシダーゼ:1
2
5p
k
at
/
mg
FW)
。また、根部では 播 種 後 約 3
6時間後に両活性とも最大となった (
DIBOA-Glcグル コシ
地相~4Ø臨
ダーゼ、 :1
2pkat
/
mgFW、DIMBOA-Glcグルコシダーゼ、 :8
3p
k
at
/
mgFW) DIMBOA-Glcグ
0
ルコシダーゼ活性の最大値は、茎葉部にお いて D
IBOA-Glcグル コシダーゼの最大値の約 1
0
倍 、根部では約 7倍で、あった。 また、 反応の至適 pHは両基質に対して 5
.
5であ った。 ここで
得られたグルコシダーゼ活性の消長と 、過去 に報 告 のある H
xGlcの消長パターン
[
N
a
k
a
g
a
w
ae
ta
.
l1
9
9
5
]との聞には時間的な相関が認められた。
-34-
図 3-2 弱陽イオン交換クロマトグラフィー (
A
c
c
e
l
lP
l
u
sCM) における各フラクションの
DIMBOA-Glcクソレコシダーゼ、
活性 (
A
) とSDS-PAGE(
B)
。
Bにおける各レーン上の番号は Aにおける各フラクションの番号。Bにおける矢印は 6
0お
よび 58kDaポリペプチドの位置を示している。M:マーカータンパク質
ー
35-
2・Bに示されるように、より低塩濃度で溶出されたフラクション(フラクション 6-10)
図3
8kDaのバンドよりもむしろ 60kDaの方がバンド強度が強く、それとは逆に高塩濃度側
は5
8kDaのほうが 60kDaよりも強かった。これと同様の結果は 、
(フラクション 24-28) では 5
0の pH勾配で行ったと
8-6.
この陽イオン交換クロマトグラフィーを塩濃度勾配ではなく pH4.
0kDaのバンドが主要バンドであり、高 pHでは 58kDa
きにも得られた。すなわち、低 pHでは 6
時間の泳動時間で分析を行うとゲルの陰極側末端にやや幅の広い バンドのみが確認された
tshown)。しかし、この分析条件下ではバンドの移動度が低く解像度が良好でなか
o
an
t
a
d
(
ったため、これが単独のバンドであるか、もしくは複数のバンドの集合体なのかは不明で、あっ
) を行った。その結
E
G
A
P
e
v
i
t
a
n
た。そこで、泳動時間を 4時間に延長し、再度電気泳動 (
Aに示すとおり、分子量約 270-330kDaの箇所に 7本(バンド 1-7) および約
3果、図 3) の計 8本のバンドが明瞭に観察され、コムギグルコシダ
600kDaの箇所に 1本(バンド 8
。
hown)
anots
t
a
d
が主要バンドであった (
0によるゲ
ex20
d
陽イオン交換クロマトグラフィーにおける活性フラクションを集め、 Super
.2mlにグルコシダーゼ活性が 1ピー
0
ル糠過クロマトグラフィーに供したところ、溶出液量 1
クとして検出され、分子量マーカータンパク質との比較により 、このグル コシダーゼの分子量
はおよそ 300kDaであると推測された。また、この活性フラクションを SDS-PAGEにより分析
、 コムギにおけ
したところ、 60および 58kDaのバンド 2本のみが観察された。この結果より
8kDaの 2種類のサブユニット
るべンゾキサジノン類 配糖体グルコシダーゼは、 60および 5
ーゼには複数のアイソザイムが存在することが示された。次に、各アイソザイムが 60および 58
kDaのと、ちらのサブユニットから構成されているのかを明らかにするため、上で得られた
PAGEゲルから各バンドを切り抜き、ゲル中に含まれるタンパク質を電気的に溶出した
ve
i
at
n
A
3
-B)。その結果、図 3
3
、 SDS-PAGEにより含有ポリペプチドのバンド強度を比較した(図 3
後
レ
) は 60kDaのバンドの方が強く、逆にバンド 5-7 (
のバンド 1および 2 (レーン 1および 2
) はどち
) は 58kDaの方が強かった。そしてバンド 3および 4 (レーン 3および 4
ーン 5-7
らのバンド強度もほぼ 同程度であった。以上の結果より、コムギ芽生え中には複数タイプのヘ
からなるオリゴマーであることが明らかになった。
テロオリゴマーが存在することが示唆された。すなわち、図 3・3-Aのバンド 1および 2のアイ
8kDaのモノマ一、そしてバンド 3お
7は主に 5
ソザイムは主に 60kDaのモノマ一、バンド 51 グルコシダーゼの精製
表 3y
r
e
v
o
c
e
R
%)
(
y
t
i
v
i
t
c
ca
i
f
i
c
e
Sp
)
n
i
e
t
o
r
/mgp
t
a
k
n
(
c DIMBOA-G
DIBOA-Gl
c
Gl
c DIMBOAGl
DIBOA-
0
0
1
Crude
1
2.
1
0
.
8
4
n
o
i
t
a
t
i
p
i
c
e
r
p
o
y
r
C
0
.
9
4
0
.
1
4
2
0
.
3
9
sCM
u
l
lP
l
e
c
c
A
4
1.
1
1
0
653.
4
1.
2
x200
e
d
r
e
p
u
S
0
.
2
7
6
3373
9
.
1
1
n
o
i
t
a
c
i
f
i
r
u
P
)
d
l
o
f
(
c
Glc DIMBOA-Gl
DIBOA-
8kDaのモノマーから構成されてい
よび 4に相当するアイソザイムはほぼ等量の 60および 5
ることが示唆された。
M) クロマトグラフィー
usC
l
elP
c
Ac
3で得られた結果は、先の陽イオン交換 (
この図 3-
0
0
1
0
.
1
0
.
1
0
0
1
0
.
4
0
5.
6
.
1
3
2
.
9
5
.
3
1
PAGE上で高い移動度をもち、陽イオン交換体によ
ivet
a
電荷を帯びたタンパク質(つ まりn
0
.
5
1
4
5.
5
0
0.
7
る保持が 弱いアイソザイム)は主に 60kDaモノマーから構成され、逆に負電荷の弱いタンパ
における各フラクションの SDS-PAGEの結果とも矛盾しないものである。すなわち、より負の
native-PAGE上での移動度が低 く、陽イオン交換体により強く保持されるアイソザイム)
ク質 (
vePAGE
i
at
は 58kDaモノマーから主に構 成されているといえる。しかし、ゲル漉過および n
晦
-末端アミノ酸配列 の解析のため、精製グルコシダーゼを SDS-PAGEに供した
続いて N
のち PVDF膜にブロッティングし 、 目的 バンドのアミノ酸配列を分析した。その結果、両ペプ
に基づく分子量の推定は、特にその分子量が大きい場合には信頼性が低いため、コムギの
グル コシダー ゼを構成しているサブ、ユニットの数を正確 に決定することは出来なかった。
-Proという全く同じ結果を示した。
y
l
G
le-I
o
r
P
u
l
G
la
-A
o
r
P
s
y
ーL
?)
r
e
S
-(
o
Thr-Pr
lyチドとも、 G
t
ye
t
a
h
o
b
o
z
r
n1992;B
e
s
E
2残基の 配列は、トウモロ コシのグルコシダー ゼ [
ここで得られた 1
]だけでなく、これまで 報告のある植物由 来グルコシダ ーゼ の配列とは全く類似性 を
3
9
9
l1
.
a
示さなかった。
.5
ive-PAGEにより分析した際、通常の l
t
a
精製グルコシダーゼを 8% 分離ゲルを用いて n
-36-
ー
37-
A
B
1BOA-Glcに対する活性とほぼ同等であった。しかし、アピゲニン、
v
I
n) は同濃度の DI
i
e
t
o
r
p
C
1 2 3 4 5 6 7 8
ルテオリン、およびホルモノネチンの各配糖体に対しては、ゲニステイングルコシドよりも低い
活性しか示さなかった。
一
8-
NP-s-グルコシドをよい基質
市販されているスイートアーモンド由来グルコシダーゼは、 p
11
T
f
一
]、この酵素は HxGlcに対 して非常
7
7
9
y1
e
l
h
s
u
dC
n
ra
e
v
o
r
G
とすることが報告されているが [
IBOA-Glc:
3mM;D
>
n
Kr
n，
i
e
t
o
r
mgp
/
t
:V，>4nka
c
l
G
A
O
B
I
D
に低い活性しか示さなかった (
出品
同 >3mM)。
，
K
n，
i
e
t
o
r
mgp
/
kat
n >0.6n
r
V
:
>
a
二
3
. グルコシダーゼの基質特異性
表 3・2
) およびゲルより溶出した各アイソザイムの SDSA
E(
G
A
P
e
v
i
t
a
. 精製酵素の n
・3
図3
x
a
m
V
Km
)
n
i
e
t
o
r
/mgp
t
a
k
n
(
(mM)
c
l
G
A
O
B
I
D
1060
4
3
.
1
DIMBOA-Glc
4100
2
7
2
.
0
220
2
0
.
2
HMBOA-Glc
540
0
2
3
.
0
n
i
l
u
c
s
E
320
0
4
2
.
0
n
i
c
i
l
a
S
.a
d
.
n
.
d"
.
n
c
l
G
s
P
N
p
520
0
7
.
1
e
d
i
s
o
t
c
a
l
a
g
pNP・s
47
8
7
.
1
e
d
i
s
o
l
y
x
β
P
N
p
35
1
1
.
3
e
d
i
s
o
c
u
f
s
P
N
p
1080
7
6
.
0
HBOA-Glc
)
B
PAGE (
0
0
0kDa、バン ド8は約 6
3
3
0
7
7は分子量約 2
Aは CBBによる染色。バン ド1
ド番号に相
kDao Bは銀染色法による染色。各レーン上の数字は Aでのバ ン
8kDa
0および 5
当。レーン上の Cはゲル漉過後 の精製酵素。右の矢印は 6
ポリペプチドの位置。
. グルコシダーゼの基質特異性
3
3
3
nilX値を求めた。その結果、 DIMBOA-Glc
r
r値および V
表 3・2に示す化合物について、 Kn
cが最もよ
l
G
1BOAv
I
7mMとなり、 DI
2
n値 が 0.
n、Kr
i
e
t
o
r
mgp
/
kat
x値が 4100n
a
u
r
に対する V
Glc-O
OH 0
c
l
G
n
i
l
o
e
t
u
L
OH
Glc
ni
e
t
s
i
n
e
G
pu
0
6
1
c
l
G
n
i
e
t
s
i
n
e
G
420
_O、
J
1
o
C
~"、、
，，/ジム¥
'-/‘
Formononetin-Glc
C
C
a
'
A
門
M
m
Mi
dm 氏
ζnu
3‘・t t
e
-川
maa
w
w
引
c
・ .
d V
w
ゐY K U H U
ahu
a値を求め
ラボノイドおよび、イソフラボノイドは反応液 への溶解度が低か ったため KIllおよび Vx
U
l
mg
/
at
k
0n
2
4
5m Mにおける酵素活性 (
0
.
ることは出来なかったが、ゲニステインク。ルコシド 0
-38-
OH
'"v' ~
84
o c du
NP-a-グルコースおよびサリシンに対しては、ほとんと、活性が見られなかった。フ
た。また、 p
H
9
Apigenin-Glc
1
39
c
l
G
n
i
t
e
n
o
n
o
m
r
o
F
NAA
NP-s-ガラクトースおよび、pNP-s-キシロースに対する活性は低いものであっ
r=0.67mM)、 p
Kn
OH 0
Glc-O 、~
C
円
U
n，
i
e
t
o
r
mgp
/
t
ka
1080n
1ム J
Glc-O
6
ll
川副 =
ふJ
G日、~ _O~ j
b
G
G
--
，
NP-s-フコースが最もよい基質であり (V
人工基質の中では、 p
n ト
n ド川
o
e
。
n値はほぼ同程度で、あっ た
r
1BOA-Glcよりもかなり小さいものであったが、 K
v
I
x値 は DI
a
n
r
るV
L
デオキシ類縁体である HMBOA-Glcおよびエスクリンに対す
mM)。 また、 DIMBOA-Glcの N-
nMMQM
，
A門 ﹄
.34
=1
n
r
K
n値 は DIMBOA-Glcの約 5倍程度であった (
r
n)、その K
i
e
t
o
r
mgp
/
kat
060n
同 日 =1
(V
e
d
i
s
o
c
u
l
g
a
P
N
p
mFM
い基質であることが明らかになった。本酵素は DIBOA-Glcに対しても活性を示したものの
メ" _OH
-39-
OMe
. グルコシダーゼアイソザイムの品種 ・種による発現パターンの比較
4
3
3
これまでの SDS-PAGEおよび naitve-PAGEの結果より、コムギ芽生えにおけるグルコシ
ダーゼには複数のアイソザイムが存在することが示唆された。そこで次に、これらアイソザイ
-
1 2 3 4 5
ムの発現パターンをザイモグラムによりコムギ品種 ・種間で比較した。植物材料としては、
図 3-4. コムギグルコシダーゼのザイモグラム
Eで分析 した後、 グルコ シ
G
A
P
e
v
i
t
a
組酵素液を n
ダーゼの活性染色を行った。
;レー ン
i
g
u
m
o
k
e
z
a
k
a
s
.A
v
nc
r
u
v
i
t
s
e
.a
レーン 1，T
.
，T
g，レーン3
n
i
r
p
eS
s
e
n
i
h
.C
v
mc
u
v
i
t
s
e
.a
2，T
;
a
t
l
e
p
ms
u
c
i
t
i
r
;レーン4，T
1
n6
i
r
o
.N
v
mc
u
v
i
t
s
e
a
n
o
d
g
n
a
.L
v
mc
u
d
i
g
r
u
mt
u
c
i
t
i
r
，T
レーン 5
) の他に 2種の
1
mを 3品種 (Asakazekomugi，ChineseSpring，Norin6
e
v
i
t
s
e
ma
u
c
i
t
i
r
T
ωおよび T turgidum) を用いた。
l
e
p
m (Ts
u
c
i
t
i
r
T
t
s
各植物材料より調製した組酵素液を native-PAGEにより分析した後、 6BNGおよび Fa
tとともにインキュベー卜することによりグルコシダーゼ活性を持つバンドを染色し
l
a
BlueBBs
た。この染色方法は、基質である 6BNGがグルコシダーゼにより加水分解され、そこで生じ
リングすることにより不溶性の色素が生じることを利
tがカッフ。
l
a
tBlueBBs
s
たアグリコンと Fa
用した染色方法である。アサカゼコムギより調製した組酵素液および精製酵素を、この染色
tshown)。また、プロテアー
o
an
t
a
d
法により分析したところ、両者とも同じ結果が得られた (
+
ゼ阻害剤存在下で酵素液を調製した場合でも、得られるバンドには変化が見られなかった。
a
t
a
d
さらに、粗酵素液を蛍光基質である 4MUGで染色した場合にも同様の結果が得られた (
2節において精製した HxGlcグルコシダ
3
tshown)。以上の結果より、この条件下では 3
o
n
ーゼのみが染色されること、そしてゲル上で観察される複数のバンドは抽出 過程で生じた人
為的産物ではないことが示された。なお、今後の解析には、より明瞭なバンドが観察された
6BNGを用いる方法を採用した。
mの 3品種については同じ移動度のバンドが観察された
u
v
i
t
s
e
4に示すように、 T a
図3
) では全
g
n
i
r
p
eS
s
e
n
i
h
C
4、レーン 1-3)。レーン 1 (アサカゼコムギ)とレーン 2 (
図3
(
く同じ位置に 7本の明瞭なバンドが確認されたが、それぞれのバンド 強度には多少の差違が
認められた(すなわち、より陽極側の バンドがレ ーン 1では濃いのに対し、レーン 2では陰
1) のバンドは明瞭さに欠けたため 、バン
Norin6
極側のバンドの方が濃かった)。レーン 3 (
mよりもより移動度 の高
u
v
i
t
s
e
.a
aにおいては T
t
l
e
p
ドの数を特定することが出来なかった。 Ts
)。また、 A および B ゲノムのみからなる 4
い位置に、バンドが集合して観察された(レーン 4
mでは、 1本の濃いバンドおよび薄く不明瞭なバンド(ゾーン)が観
u
d
i
g
r
u
.t
倍体コムギ、 T
なかったために、その数を特
)。しかし、これらに関してもバンドが明確で、
察された(レーン 5
。
定することが出来なか った
-40-
-41-
合でも明瞭に確認することが出来た。このことから、コムギクマ
ルコシダーゼは Esenらの報告
34
.考察
したトウモロコシのグルコシダーゼとは異なり、植物体内に複数のアイソザイムを持つものと
図3
1で示したとおり、コムギ芽生えにおける βグルコシダーゼ活性は、 HxGlc類
[Nakagawae
ta
.
l1
9
9
5
Jと同調して変化しており、特に DIMBOA-Glcに対して高い活性を示す
推測された。
ゲル j
慮過および電気泳動の結果から、この時期のコムギには 60および 5
8kDaのサブ
もので、あった。 HxGlc類はコムギの発芽直後の時期において非常に高濃度で発現しており、
ユニットから構成されるヘテロオリゴマーのグルコシダーゼが存在することが示された。この
この時期に最も多量に存在する二次代謝産物である。このことから、植物体内におけるこのグ
ことから native-PAGEにおいて複数のバンドが見られる理由 のーっとして、各アイソザイム聞
ルコシダーゼの最も主要な基質は HxGlc類であると考えられ、植物組織の破壊に際し HxGlc
の分子量の違いを挙げることができる。この分子量の違いは、異なった分子量のサブ、
ユニ ッ
が本酵素により加水分解され、直ちに有毒なHxが高濃度で発現するものと推測される。
トが様々な割合でオリゴマーを構成することにより生じるものである。しかし 、どのような機構
表3
2に示すように、 HBOA-Glcや HMBOA-Glcといったラクタム配糖体に対する活性は、
により各サブユニットが集合して、オリゴマーを構成するのかは今のところ明らか l
こなっていな
ヒドロキサム酸 (
D
i
l
l
O
A
G
l
cや DIMBOA-Glc) に対する活性よりも低かった。 K
r
u値にはそれ
い
。 トウモロコシグルコシダーゼは 60kDaサブユニットからなるホモ二量体であり、その二
ほと、
差が認められ なかったにもかかわらず、
九日値は 5-8倍程度小さいも のであったことから、
量体構築に関わる遺伝子座は 60kDaサブ、
ユニットをコードする遺伝子座とは異なるというこ
N-ヒドロキシ基 は K
r
u値よりもむしろ V
r
n
a
x値により大きな影響を及ぼすということが示唆された。
とが示唆されている [
Fr
o
v
a1
9
9
4
J。このことは、コムギグルコシダーゼに関する研究において
人工基質である pNP配糖体に対する活性は、トウモロコシ由来グルコシダーゼの結果とほぼ
も有益な情報となりうると考えられるが、コムギ (
T
.αe
s
t
i
v
u
m
) はトウモロコシとは異なり 6倍
同様であり [
B
a
b
c
o
c
kandEsen1
9
9
4
J、コ ムギグルコシダ ーゼの場合も酵素活性発現には糖
体植物であるため、状況は 一層複雑であると思われる。
部分の構造が重要であることが明らかになった。また、イネ科には通常存在 しないイ、ノフラボ
2品種の T
.a
e
s
t
i
v
u
m(
アサカゼコムギと Ch
i
n
e
s
eS
p
r
i
n
g
) のザイモグラムでは同 じ移動
ノイド配糖体のゲニステイングル コシドが比較的良好な基質であったことは、非常に興味深 い
度の複数のバンドが観察されたが、それぞれのバンド強度は品種間で異なっていた。この事
結果であった。イソフラボノイド配糖体のゲニステイングル コシドとホルモノネチングルコシドが
実は 、先に述べたような可能性、つまり各アイソザイムの発現調節をつかさどる因子が別に存
フラボノイド配糖体よりも高い活性を示したことから、 B環の位置が重要であると考えられる。
ηt
i
c
u
m問では活性染色によるバン
在することを示唆しているのかもしれない。また、 3種の T
植物由来のグルコシダーゼの多くは、基質のアグリコン部分に対する特異性が緩やかなもの
ド(ゾーン)の移動度が異なり、特に Aおよび Bの 2つのゲノムから構成される 4倍体コム
が多いが 、一部の酵素、特にシアン含有化合物の配糖体グルコシダーゼの中にはアグリコン
ギ (
T
.t
u
r
g
i
d
u
m)では、 他と比べて非常に狭い範囲しか染色されなかった。これは非常に興
部分に対して非常に高い特異性を示すものが報告されている [
H
o
s
e
landConn1
9
8
2
J。本研
味深 い結果であ り、このことに対する最も単純な説明としては、 D ゲノムが存在していないた
究で得られた結果も、この場合と同様にグルコシダーゼ活性発現におけるアグリコン部分の構
めにグルコシダーゼ遺伝子の一つが欠損している、ということが考えられる 。
造の重要性を示すものであると思われる。
多くの植物由来グルコシダーゼは、活性中心周辺のアミノ酸配列の相向性か ら、ファミリ
T
r
i
t
i
c
u
ma
e
st
i
v
u
mより調製したグル コシダーゼの native-PAGEでは、分子量約 270
- 1グルコシダーゼに分類されている [
H
e
n
r
i
s
s
a
t1
9
9
2
J。そして、それらの 酵素 の中には活
-330kDa程度 の 7本のバンドが確認できたが
、 Esenらは 同様の現象を近交系トウモロコ シ
性中心以外にも類似性を示すものがあり [Akiyamae
ta
.
l1
9
9
8
J、例えば、トウモロコシグルコ
より酸性 (pH<6) 条件下で抽出したグルコシダーゼについて報告している [Esenand
シダーゼの cDNAより推定されるアミノ酸配列 は、モロコ シのグルコシダーゼ (
d
hu
r
r
i
n
a
se1)
Cokums1
9
9
1
J。しか し、観察される複数のバンド数が経時的に変化すること、そして SH-プ
の配列と 70% の相同性を示すことが 明らかになっている [
C
i
c
e
kandEsen1
9
9
8
J。一方で
、
ロテアーゼ阻害剤を添加することによりバンドの生成が抑制されることから、彼らはこれら複数
本研究で得られたコムギグルコシダーゼの N-末端アミノ酸 1
2残基の配列は、他の植物由来
のバンドが抽出過程における人為 的産物であると結論づけた。しか し、本研究でのコムギに
グ、ルコシダーゼ、
とは全く相向性を示さなかった(ライムギのグルコシダーゼは除く;次章参
おける複数のバンドは、 SH-フロテアーゼ阻害剤存在下で抽出後直ちに電気泳動に供した場
-末端部分は 、その全配列の中でも最も保存性の低い
照)。しかし、植物グルコシダーゼの N
-4
2-
-4
3-
領域ある。この事実を考慮に入れると、今回の結果は必ず、しも全配列にわたって他のグルコ
第四章
ライムギ芽生えにおける βグルコシダーゼの精製と性状解析
シダーゼと類似性が低いことを示唆するものではないと考えられる。さらに、これまで報告の
あるファミリー 1グルコシダーゼの結晶構造 [
B訂 r
e
t
te
ta
.
l1
9
9
5
;Burmeistere
ta
.
l1
9
9
7
;
S
a
n
z
-A
p
a
r
i
c
oe
ta
.
l1
9
9
8
]においても、 N-末端部分は酵素の表面部分に存在し明確な 2次構
4
1
. 序論
これまでにも述べてきたように、環状ヒドロキサム酸 (Hx) のグルコース配糖体 (HxGlc)
-末端部分は酵素機能にそれほど大きな影響
造をとっていないことが示されていることから、 N
はコムギ、トウモロコシ、ライムギなどのイネ科植物に蓄積されている耐病性因子であり
を及ぼしていないと思われる。本研究においてコムギグルコシダーゼの性質としては HxGlc
[Niemeyer1
9
8
8
]、植物の発芽直後の時期に高濃度で発現している[Nakagawae
ta
.
l1
9
9
5，
に対する高い活性、酸性の至適 pH、芽生えにおける高レベルでの発現、オリゴマーとしての
E
b
i
s
u
ie
ta
.
l1
9
9
8
]。これまでの Hx類に関する多くの研究は、主にトウモロコシを用いて行わ
存在、等が明らかになったが、これらの諸性質はトウモロコシグルコシダーゼにも共通するも
れてきており、コムギやライムギに関する研究は多くない。トウモロコシおよびコムギに含まれ
のである。このことからも、コムギおよびトウモロコシグルコシダーゼの基本的な性状は類似
l
¥
1BOA-Glcであるが、ライムギにおける主要Hx類は DIBOA-Glcである。
る主な Hx類、は DI
しているものと考えられる。
このことからも、 Hx類に関する総合的な知識を得るためには、ライムギについてもトウモロコ
60および 58kDaのポリペプチドが全く同一の N-末端アミノ酸配列を示したことに対して
シなどと同様の情報を得ることが不可欠である。
は、いくつかの考察が可能である。まず第一に、 2つの異なる遺伝子により 60および 58kDa
前章までにおいて、コムギ中の Hx生合成酵素について様々な性質を明らかにしてきた。
サブユニットが別々にコードされていることが考えられる。しかし、コムギ (Ta
e
st
i
v
u
m)は 6
そこでこの第四章においては、まず最初にライムギ芽生えにおける Hx類の動態を明らかにす
倍体植物であるため、異なるゲノムの遺伝子座でコードされた複数のグルコシダーゼが非常
ることを目的とした。そしてさらに、 Hx類による植物の耐病性発現に最も直接的に関与し、な
によく似たものであるとしてもそれほど意外ではない。そして、もしこれが事実であるとすると、
おかつトウモロコシおよびコムギにおいて最もよく研究されている酵素であるHxGlcグルコシ
両遺伝子の転写・翻訳は空間的にも時間的にもほぼ同一でなければならず、また、輸送ペ
ダーゼの性状解析を行うことにした。
プチドも細胞内の同じ部位をターゲ、
ッ トとしていなければならない。しかし、 N
-末端配列が最
も保存性の低い箇所であることを考慮すると、他の可能性もあげることが出来る。つまり、両
ペプチドとも元来は同ーのものであるが、翻訳後修飾の過程で酵素の
c
-末端側がプロテアー
ゼにより切断されて 58kDaペプチドが生じるとも考えられる。しかし、いずれの仮定に対して
も現在のところは証拠が得られていない。この問題の解明のために、グルコシダーゼ cDNA
のクローニングや遺伝子解析などが今後の課題となると思われる。
-44-
-45-
いたゲル癒過クロマトグラフィーに供し、最終的に精製酵素を得た[溶出溶媒， B
i
s
T
r
i
s
H
C
l
4・2
. 実験方法
(pH6
.
8
)/150mM塩化ナトリウム;流速， 0
.
5mVmin]。ゲル j
慮過クロマトグラフィーにおける
分子量測定には次のタンパク質を標準として用いた;フェリチン (
4
4
0kDa)、ヒト IgG (
1
6
0
4
2
-1
. Hx類の調製
DIBOA-Glcおよび DlM
BOA-Glcはそれぞれ、播種後 3日のライムギ (
S
e
c
a
l
ec
e
r
e
a
l
eL
.)
kDa)、トランスフェリン (
8
1kDa)、オブアルブミン (
4
3kDa)、ミオグロビン (
1
7
.
6kDa)。各
およびトウモロコシ (
Z
e
am
a
y
sL.)の茎葉部より抽出・精製し、それらのアグリコン、 DIBOA
精製段階におけるグルコシダーゼ活性の測定には、基質として1.5m Mの DIBOA-Glcおよ
および DIMBOAは配糖体をグルコシダーゼで加水分解することにより調製した (
22
1節 参
び DlM
BOA-Glcを用いた。タンパク質濃度は B
r
a
d
f
o
r
d[
1
9
7
6
]の方法に従い、ウシ血清アル
照
)
。
ブミンを標準として求めた。
2
-Hydroxy-1，
4b
e
n
z
o
x
a
z
i
n
3
o
n
e(HBOA)および 2
h
y
d
r
o
勾
ー 7-metho
苅r
・1
，
4b
e
n
z
o
x辺 m3
o
n
e(HMBOA)は Honkanenら [HonkanenandV
i
r
t
a
n
e
n1
9
6
0
]の方法に従い合成し、
HBOA-Glcおよび HMBOA-Glcは 2
2
1節で述べた方法により、それぞれ DIBOA-Glc、
4
2
4
. 酵素活性測定
。ーグルコシダーゼ活性は 1
00m Mクエン酸ー200m Mリン酸緩衝液 (Mc
I
l
v
a
i
n
e緩衝液)
DlM
BOA-Glcを還元することにより調製した。
中で、 32
4節で述べたのと同じ方法により測定した。
4
2
2
.植物材料
4
2
5
. 電気泳動および、 N-末端アミノ線配列の解析
ライムギ (
S
e
c
al
ec
e
r
e
a
l
eL
.
) (品種 :春一番)の種子をエタノールで 洗浄後、蒸留水で
よくすすぎ、蒸留水で、湿らせたパーパータオル 2層の上に播種した。生育は、日長 1
2時間、 25
~-グルコシダーゼの活性染色、 SDS-PAGE 、および、 N- 末端アミノ酸配列は、 3-2-5 節で
述べたのと同様の方法を用いて行った。
o
cの条件下で行った。
4
2
3
. ~-グルコシダーゼの精製
以下のすべての精製作業は 4 Cで行った。播種後 4
8時間のライムギ茎葉部約 5gを液
0
体窒素により凍結し、磨砕後、新鮮重の 5倍量の抽出液 (
5
0m M酢酸ナトリウム緩衝液、 pH
6
.
0)に懸濁した。懸濁液を 1
5，
000gで 20分間遠心分離後、得られた上清に含まれる内在性 Hx
類を限外漉過により除去して粗酵素液を得た。次に粗酵素液の pHを 50%(
v
/
v
)酢酸水溶液
で5
.
0に調整した。その後、 20，
000gで 30分間遠心分離して得られた沈殿を 50m M
B
i
s
-T
r
i
s
H
C
l緩衝液 (
pH6
.
8) に懸濁した。この懸濁液中にふくまれるタンパク質を、同緩
衝液であらかじめ平衡化しておいた DEAE-Sepharoseカラム (
Pharmacia) (
約 3ml) に吸着
させ、 O、 7
0、350、 500m Mの塩化ナトリウムを溶解させた同緩衝液により段階的にタンパク
質を溶出した。続いて、塩化ナトリウム 350mM画分を脱塩後 MonoQHR5
/
5カラム
(
Pharmacia)に吸着させ、そののちに塩化ナトリウムの直線的塩濃度勾配 (
150-4
0
0m M)
によりタンパク質を溶出した [
緩衝液， B
i
s
T
r
i
s
H
C
l(pH6
.
8
)
;流速， 1ml
/
m
i
n
;溶出液 量
， 50
m
l
]。そして、ここで得られた活性画分を Superdex200HR1
0
/
30カラム (
Pharmacia)を用
-46-
ー
47-
移行するに従い活性は低下し、播種後 84時間で、は酵素活性は最大値のおよそ半分になった
4・3. 結果
)。また、両酵素活性は茎葉部・根部の両方において播種後 84時間までの間平行し
2
図4
(
. 環状ヒドロキサム酸配糖体(HxG
1
3
4
) および HxGlcグルコシダーゼのライムギ芽生え
c
l
における動態
て推移した。
0時間で発芽を開始し、
本研究における生育条件下では、使用したライムギは播種後約 1
B.Root
.Shoot
A
500
500・
、 D
に
1に示すよう
cのみが検出された。図 4Gl
BOAIBOA-Glcの濃度
結果、茎葉部では DI
400
400・
mg
/
l
1nmo
7.
cは発芽とともに発現し、播種後 24時間で最大値となった (
-Gl
A
された。 DIBO
mgFW
V
3nmo
.
0時間後に 3
c濃度は緩やかに増加し続け、播 種後 6
-Gl
A
IBO
v
l
。また、 Dl
FW)
HLmEDmvE
cも同様に検出
l
G
ほぼ一定濃度となった。 一方、根部では DIBOA-Gl
cだけでなく DIMBOA-
EDm ぷ巳
2程度で
/
独立栄養期に移行していくに従ってその濃度は次第に減少していき、最大値の約 1
l
﹀﹀
。そして、
mgFW)
21nmoV
6時間で最大となった (
は発芽直後から急速に増大し、播種後約 3
﹀﹀比四
約 30時間後に緑化し始めた。発芽直後の時期において、 Hx類の発現を経時 的に測定した
300
200
100
100
。
。
24
に達した。
200
48
24
72
.Root
B
cク ルコシダーゼ活性の経時変化
l
G
x
. ライムギ芽生えにおける H
図 4・2
cグルコシダーゼ
Gl
MBOAcグルコシダーゼ，ム:DI
l
-G
A
0:DIBO
25
25
72
ing
d
e
e
rs
e
t
f
hoursa
rseeding
e
t
f
hoursa
.Shoot
A
48
o
20
20
E¥
oEC
一
﹀﹀ 比 四
s
. 15
.
u
15
0>
E
2. ライムギ芽生えからの βグルコシダーゼの精製
34-
o 10
E
10
C
5
。
。
。
cグルコシダーゼが発芽問もない時期に高レベルで
cおよび HxGl
l
G
前節において、 Hx
5
24
48
72
96 240
。
lc
G
ごなった。 そこで次に、播種後 48時間のライムギ茎葉部より Hx
発現していることが明らか l
24
48
72
96 240
rseeding
e
t
f
hoursa
rseeding
e
t
f
hoursa
類の経時変化
図 4・1. ライムギ芽生えにおける Hx
A
ム:DIMBO
c，
l
G
c，0:DIBOA，A :DIMBOAl
G
DIBOA.:
グルコシダーゼ、の精製を行った。
)の酢酸水溶液で
v
/
v
、 抽出液の pHを 50%(
播種後 48時間のライムギ茎葉部を抽 出後
0に調製した。 この 際、ほとんどすべてのグルコシダーゼ活性は、上清にではなく沈殿画分
.
5
8)に再懸濁後、懸濁液
pH6.
l緩衝液 (
C
H
ssTi
i
に検 出された。そこでこの沈殿を 50m MB
唱
0、
eを用いた弱陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。タンパク質は、 7
s
o
r
a
h
p
e
S
E
A
を DE
コ シタfーゼ、活性
cを加水分解しアグリコンを遊離 させる機能を持つグ〕レ
l
続いて、両 HxG
6時間後
を測定した。両酵素活性とも発芽とともに発現し、茎葉部 ・根部の両方で播 種後 3
に最
mgFW，
/
.
at
k
mgFW;DIMBOA-Glc，320p
/
.
at
k
値となった(茎葉部:DIBOA-Glc，410p
。 その後独立栄養 期に
mgFW)
/
.
at
k
c，105p
l
G
mgFW;DIMBOA/
.
t
ka
50p
c，1
-Gl
A
根部:DIBO
8-4
350、500mMの塩化ナトリウムにより段階的に溶出し、活性の検出された 350m M塩化ナトリ
ウム画分をさらに MonoQを用いた強イオン交換ク口、マトグラフィーで精製した。その結果、
cグルコシダーゼ活性が複数のピークと
A-Gl
cおよび DIMBO
l
3に示すように DIBOA-G
図 4して検出された。また、両酵素活性の溶出パターン (ピーク形状)は全く同一で、あった。次
) を一つにまとめ、引
5
3のフラクション 24および 2
図4
ここでの最大活性フラクション (
-49
骨
)。ま
1
び DIMBOA-Glcの両基質に対して最終的におよそ 45倍の生成が達成された(表 4
e
t
a
r
t
s
b
u
100 S
ー0-DIBOA-Glc
500
、 SDS-PAGE (銀染色法により染色)上では分子量 60kDaのバンドのみが検出された(図
た
80
400
)。
4
4
60
300
--6-DIMBOA-Glc
〉、
本J
E)O∞N︽
(コ︽
、
‘
'
〆
〉
J
.
.
.
j
.
u
〉、の
.
.
_
-，
l
J
.
.
.
j
.
>
'
v
ω
υ z 40
〔
1. ライムギグルコシダーゼの精製
表4
200
句。可
DIBOA-Glc DIMBOA-G
こ
10-
0
門
¥、
u
20
。
。
10
30
20
40
nNo
o
i
t
c
a
r
f
図 4-3. 強陰イオン交換クロマトグラフィー (MonoQ)
0による精
0
x2
e
d
r
e
p
れのフラクション容量は 1ml。影付きは、さらに Su
それぞ、
c
l
G
IBOAD
0:
)
5
2
42
ン
ョ
シ
ク
ラ
フ
、
5
1
ン
製に供したフラクション(フラクショ
グルコシダーゼ、 企:D酌1BOA-Glcグルコシダーゼ
0
(kDa)
M
2
3
4
5
6
(%)
Glc
DIBOA-Glc DIMBOA-
n
o
i
t
a
c
i
f
i
r
u
P
)
d
l
o
f
(
DIBOA-Glc DIMBOA-Glc
0
.
1
0
.
1
6
.
4
9
6
2.
2
.
3
5
.
3
7
1
.
8
7
9
.
3
2
.
4
0
.
2
4
0
.
3
5
等電点沈殿
4
0.
1
1
0
.
2
7
1
1
.
7
7
DEAE-Sepharose
3
5.
6
1
0
.
3
2
2
粗醇素
100
Recovery
y
t
i
v
i
t
c
ca
i
f
i
c
e
p
S
)
n
i
e
t
o
r
(nkaVmgp
100
100
MonoQ
1033
1538
2
.
9
1
6
.
2
2
6
.
4
2
9
.
8
2
Superdex200
1922
2322
6
.
9
2
.
9
8
.
5
4
6
.
3
4
-末端アミノ酸配列を解析したところ、 その配
次に、精製したライムギグルコシダーゼの N
-Trpで
o
r
P
s
y
L
u
e
L
s
y
L
r
h
-T
e
h
P
l
a
-V
o
r
P
y
l
G
e
l
l
o
r
P
u
l
G
r
e
S
o
r
P
s
y
L
r
e
S
o
r
P
r
h
-T
y
l
列は G
あることが明らかになった。 この配列は前章 (第三章) で示したコムギグルコシダーゼの N
rがコムギでは
e
S
2残基の配列と第 7番目の残基以外は同一であったが (
末端アミノ酸 1
)、 コムギ以外の既知の植物クゃ
a
l
A
とは全く類似'性を示さなかった。 MonoQ ク口
ルコシダーゼ、
200
) に関しても、先と向様
5
3のフラクション 1
マトグラム上の 2番目に大きい活性ピーク(図 4
16
1
に Superdex200によるゲル癒過クロマトグラフィーで精製を行 ったところ、分子量が約 300
情婦勝匂事婚出5
)。
4
kDa、SDS-PAGE上で 60kDaの単一バンドという同様の結果が得られた(図 4
66
‘酬輔告
漏耐雌
さらに、 MonoQクロマトグラム上で観察された複数の活性ピークについて、各フラクシ ョ
ンに含まれるポリペプチドの比較を native-PAGEおよび SDS-PAGEにより行った。図 4-5Aに
44
示すように、すべてのフラクションについて SDS-PAGEゲル上で 60kDaのポリ ペプチドが観
察された。また、 native-PAGEゲル上でもおよそ 300kDaのバンドがすべてのフラクションに
30
おいて観察された(図 5B)。先ほどまでの結果から、 この約 300kDaのバンドがグルコシダ
4. 各精製段階における活性フラクションの SDS-PAGE
図4
;
e
s
o
r
a
h
p
e
S
E
A
E
組酵素液;レーン 2，等電点沈殿;レーン 3，D
，
レーン 1
oQ のフラクション
n
o
l
i
α
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
MonoQ;レーン 5，S
レーン 4，
)
5
0(MonoQ のフラクション 1
0
x2
e
d
r
e
p
u
;レーン 6，S
)
5
2
4
2
つ異なり、
とに少しず、
ーゼに相当すると推測されたが、これらのバンドの移動度はフラクションこ守
その移動度は大きかった。以上の結果から、 ライム
溶出されたフラクションほと、
より高濃度で、
ギには電気的状態の異なる複数のグルコシダーゼアイソザイムが存在することが示唆された。
また、粗酵素液を抽出後直ちに native-PAGEにより分析し、グルコシダーゼを活性染色によ
き続き Superdex200によるゲル漉過クロマトク?ラフィ ーに供した。標準タンパク質より分子量
)。
B
5
り検出を試みたところ、上と同じ移動度の複数のバンド(ゾーン)が観察された(図 4
を測定した結果、 グルコシダーゼの分子量はおよそ 300kDaと推定され、 DIBOA-Glcおよ
ルコシダーゼであることが確認された。
このことからも先の native-PAGE上のバンドがクマ
-50-
1-5
舌性に変化を与えなか った。ま
にお いて完全に酵素活性を抑制したが 、一方で EDTAは全く1
A
2
2mM で完全阻害、 2価イオンの Cu-も強い阻害活性を示した
.
は0
、 1価陽イオンの Ag+
た
15 17 18 19 2021 22 23 24
+が 34%活性を阻害 した。
.5m Mで 98%の阻害)。その 他 の 2価イオンの中では、 Zn2
0
(
.
薗
‘
一
2. 力スタノスペルミン、 EDTA、
表4
および金属陽イオンの効果
一一……
一 日 惨
y
t
i
v
ti
c
ea
v
i
t
a
l
e
R
%)
(
駒郡骨
坤胸骨
明
蜘償供
軸
W蜘 句 か と
l
o
r
t
n
o
C
100
5mM)
.
0
EDTA(
1
0
1
議命噛楠州
2mM)
.
0
Ag+(
。
。
5mM)
0.
Cu2+(
6
.
1
5mM)
.
0
Mn2+(
7
.
9
B
2mM)
0.
e(
n
i
m
r
e
p
s
o
n
a
t
s
a
C
B
15 17 18 19 20 21 22 23 2415
C
…
一
I
t
説
一
l 't~i蜘t意義
i
φ
2
7
.
2
1
S
φ
2
6
.
i6
E
5mM)
.
0
Fe (
5mM)
0.
Zn (
1
0
1
5mM)
0.
Ca (
2令
5mM)
0.
Mg2+(
)
8
E(
G
A
P
e
v
i
t
a
)および n
A
5. 各 MonoQフラクションの SDS-PAGE(
図 4ゲル 上の数字は MonoQクロマ トグラフィ ーでのフラクション番号を表す。A
0kDaボリペフチドの位置を示す。 Bにおいて、Cは粗
における矢 印は、6
酵素液を活性染色したもの 。
2
1.
9
副値および Km値を求めた。その
m
3に示す化合物 に対して 、それぞれの V
続いて、表 4
=
x
a
m
V
結果 、DIMBOA-Glcが供試化合物 の中で最も良 好 な基質であることが 明らかにな った (
デメトキシ体である DIBOA-Glcもよい
。また、その 7・
17m M)
6
.
=0
n，Km
i
e
t
o
r
mgp
/
t
4952nka
nと供試化合物 中
i
e
t
o
r
mgp
/
t
ka
あった。しかし 、DIBOA-Glcに対する 九割値は 5870n
基質で、
. ライムギグルコ シダーゼの性状解析
3
3
4
3のフラクシ ョン
前節 の強陰イ オン交換クロマトグラフィ ーにおける最大活性ピーク(図 4-
。ま
9m M)
.1
Km=1
あった (
、 その K山値 は DIMBOA-Glcのおよそ 2倍で、
最大である 一方で
図
、 さらにゲル漉過クロ マトグ、ラ フィーにより精製した精製グル コシダ ーゼ (
24および 25) を
420
値はそれぞれ 1
ax
た、ラクタム配糖体 の HBOA-Glcおよび HMBO-Glcに対する Vm
. レーン 5に相当) を用 い、性状解析を行っ た。
4
4
9m Mであ
8
.
0m Mおよび 0
.
nであり 、Km値は 2
i
e
t
o
r
mgp
/
t
a
k
nおよび 1005n
i
e
t
o
r
mgp
/
nkat
c
o
あっ た。
9-5.1、25-30 で、
.
5、4
.
反応至適 pH、等電点 、反応至適温度はそれぞ れ 5
s
P
N
-グルコースおよび p
s
P
N
。 Hx類縁体以外では、 エスクリンおよび人工基質である p
った
2に示す。このと
EDTA)、カ スタノスペ ルミンの 効果を表 4
次に 、金属イ オン 、キレー ター (
ルコース)およ
グ、
αー
P
N
p
グPルコース休 (
フコー スに対 しても高い活性を示した。しかし、 αー
e緩衝 液) 中で反応を行うと金
n
i
a
v
Il
c
き、これまでの活性測定において用 いてき た反応液 (M
性を示さなかった。フラボノイドおよびイソフラ
舌'
びサ リシンに対しては、 ほとんどもしくは全く i
属陽イオンと緩衝液 中のリン酸が不溶性 の塩を形成する。そこで 、こ の実験 においては
5
0
.
ボノイド配 糖体のなかではゲニステイングル コシドに対して最も高い活性を示した(濃度 0
1に示すとお
5)を使用し た。表 4
pH5.
e緩衝液の 代 わりに酢酸ナトリウム緩衝液 (
n
i
a
v
Il
Mc
。
n)
i
e
t
o
r
mgp
/
m Mで 837nkat
2m M
.
]は 0
4
8
9
l1
.
ta
le
u
a
S
りβグルコシダーゼの阻害剤として知られるカスタノスペル ミン [
ー
25
ー
53-
表4
2
4
4. 考 察
グルコ シダ ー ゼ の 基 質 特 異 性
Vm
a
x
Km
(
nka
t
/mgp
r
o
t
e
i
n
)
(mM)
DIBOAGlc
5870
1.
1
9
DIMBOA
Gl
c
4952
0.
6
1
7
HBOA
Glc
1
4
2
0
2
.
0
974
E
s
c
u
l
i
n
0.
1
5
1
n
.
d.
"
n
.
d.
pNP・sGlc
828
0
.
9
pNPs
x
y
l
o
s
i
d
e
7
8
.
2
3.
1
7
pNPsfucoside
1
6
7
1
0
.
6
1
6
3
2.
4
L
u
t
e
o
l
i
nGlc
4
9
.
9
Formononetin-Glc
1
2
.
9d
G
e
n
i
s
t
e
i
n
G
l
c
837d
/OH
よび HxGlcグルコシダーゼ活性が向調的に増減しているということは前章においても示したと
G
l
c
O
ta
.
l1995;Ebisuie
ta
.
l1
9
9
8
]、本章で明らかになったライムギにおけ
おりであり [Nakagawae
る HxGlcおよびグルコシダーゼの消長もそれらと同様の結果といえる。以上の事実は、これ
OH 0
L
u
t
e
o
l
i
n
G
l
c
ら3つのイネ科植物 には 、HxGlcおよび HxGlcグルコシダーゼの発現調節に関わる共通の
機構が存在していることを示唆しているのかもしれない。
OH 0
v人
しかし、グルコシダ ーゼの性状をこれら植物 問で 比較した場合、いくつかの相違点も認
OH
.
0に調
めら れ る。たとえば、ライムギグル コシダ ーゼの精製過 程 において粗酵 素液の pHを 5
整した際、ほとんと、
の活性はそのときに生じる沈殿画分に検出された。しかしこの結果は、同
G
l
c也
、H
、
;
ノ
必
)
、
，
、o
O
、
r￨
、t
〆、ク
入
)
、
様の 処理をした場合に、沈殿ではなく上清に活性を検 出できたコムギやトウ モロコシのグルコ
d
OMe
F
o
r
m
o
n
o
n
e
t
i
nG
l
c
9
9
2
]。この ような相違を生じる原因としては、
シダ ーゼとは異なるものである [
前章;Esen1
各酵 素の等電点の違いをまず第一に考えることができるが、今回の場合はそれだけが原因と
は考えにくい。なぜならば 、確かに等電点に違いはあるものの、その差はそれほど大きいも
A
c
t
i
v
i
t
ya
t4
.
7mM， A
c
t
i
v
i
t
ya
t2mM，d A
c
t
i
v
i
t
ya
t0.
05mM
b
の両方が検出された。コムギおよびトウモロコシの発芽直後の時期において、 HxGlc濃度お
A
p
i
g叫
d
N
o
td
e
t
e
c
t
e
d
8
[
Ni
emeyer1988]、本研究において使用したライムギにおいても、茎葉部では DI
BOA-Glcの
cと DIMBOA-Glc
みが存在することが示された。しかし一方で、根部においては DIBOA-Gl
G
e
n
i
s
t
e
i
n
G
l
c
1
1c
Apigenin-Glc
/ X
G
l
cO
b
7
0.
4
pNPa・glucoside
ふ』40H
8
S
a
l
i
c
i
n
pNPs・g
a
l
a
c
t
o
s
i
d
e
y
0
.
8
9
3
1
0
0
5
HMBOA
Glc
よ
G
lc
O
、lOA
H，
O
o、
ライムギに含まれる主要な Hx類縁体は DIBOA-Glcであることが知られており
C
.
2、コムギ:~).1 -5
.
6、ライムギ :4.
9-5.1)
。今回、
ので はないからである(トウ モロコ シ:5
その 原因 については解 答 を得ることがで、
きなかったが、ライムギグルコシダーゼが他植物の
グル コシダ ーゼよりも疎水性が高いことをあるいは示唆 しているのかもしれない 。
強陰イオン交換 クロマトグラフィー (
MonoQ) において、そのク ロマトグラム上で複数の
DffiOA-Glcおよび DIMBOA-Glcク
ご
ルコシダー ゼ、
活性のピークが検 出され(図 43
)、両者
のピ ー ク形状はほぼ同 一であった。この結果から、ライムギにおける複数のグルコシダーゼ
Glcに対する活性に
アイソザイムの存在 を示唆され、ま た、それらの DIBOA-Glcと DIMBOA-
は差が ないことを示さ れ た
。 また、図 4
1の茎葉部 ・根部の両方において DffiOAGl
cグル
コシダ ーゼ活性 が DIMBOA-Glc活性と同 レベルで平行して変化 していることから、ある特定
時期 にどちらかの基質のみに特 異性の高いアイソザイムが発現しているのではないことが示唆
され た。
ゲル i
慮過 ク口マトグラフィー (
Superdex2
00)および SDS-PAGEの結果から、ライムギ
ー
5
4-
-55-
0kDaのポリペプチドより構成される分子量およそ 300kDaのオリゴマー
グルコシダーゼは 6
明らかにな ったように、コムギグルコシダーゼも native-PAGE上で明瞭な複数のバンドを示す。
であることが示された。しかし、ゲル漉過クロマトグラフィーによる分子量測定はそれほど信
0および 58kDaの 2種の-サブ ユニ ットから構成されているものの、
コムギグルコシダーゼは 6
ユニ ットの数を正確に特定する
頼性の高いものではないため、オリゴマーを構成しているサブ、
その他の点についてはライムギグルコシダーゼと非常に類似点も多く、ライムギグルコシダー
5からも明らかなように、 MonoQクロマトグラム上で確認された複
ことはできなか った。 図 4
ゼとコムギグルコシダーゼは相互によく似た酵素であると考えられる 。
00kDaのオ
ユニットからなる約 3
0kDaサブ、
数のグルコシダーゼのアイソザイムは、すべて 6
P
2残基固までは
-末端アミノ酸配列は、 1
また、ライムギおよびコムギのグルコシダーゼ N
-PAGE上でみられるわずかな移動度の違いは、それ
e
v
i
t
a
リゴマーと考えられる。しかし、 n
一つを除き全く同じ配列を示した(前章参照)。このこともまた、両酵素の類似性を強く示唆
ぞれの電気的状態に差があることを示しているものと思われる。 Esenら [EsenandCokums
するものである。しかし、これらの配列は他の植物グルコシダーゼのアミノ酸配列と全く類似
cで、数 時間イ ンキュベー トする
]は、近交系トウモロコシより調製した粗酵素液を 25-37o
1
9
9
1
性を示すものではなかった。前章でもふれたように、トウモロコシグルコシダーゼを含む多く
と、多様な移動度のグルコシダーゼが native-PAGE上で観察されることを報告 しており、そ
の βグルコシダーゼは、その活性部位周辺のアミノ酸配列からファミリー 1グルコシダーゼに
れらはインキュベート中に生じたグルコシダーゼの電気的多様性に起因するもので、天然に
]、N-末端配列 の機能発現に対する寄与は非常に低いもの
1
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分類されれるが [
存在するものではないと結論づけた。また彼らによれば 、低 pH (pH4-6) において観察さ
-末端アミノ酸配列における差異は、他
であると考えられる。このため、今回明らかになった N
)で
れる複数の明瞭なバンドは SH-プロテアーゼの作用によるものであり、高 pH (> pH6
のファミリー 1グルコシダーゼと の大きな違いを必ずしも示すものではないと考えられる。
の不明瞭なバンド(ゾーン)は他のプロテアーゼの 働きによるものである 。また、高 pHで生
ライムギグルコシダーゼの反応至適 pHおよび等電点は、トウモロコシおよびコムギのグ
じるこのようなバンド(ゾーン)はプロテアーゼ阻害剤を添加してもその生成を抑制すること
]。しかし、反応至適温度はトウモロ
2
9
9
ルコシダーゼと同程度の結果であった [前章;Esen1
はできず、粗酵素液調製後ただちに native-PAGEに供 したときにのみ発生を防ぐことができ
0 Cであった。金属陽イオンの影響について
3
5
0Cであるのに対し、ライムギでは 2
コシが 5
ている 。しかし、本研究においては、調製直後の 酵素液を活性染色により分析した場合でも、
グルコシダーゼの活性を強く阻害したが、トウモロコシの場合
がライムギ、
"ふ
u
および C
、 Agは
MonoQ各フラ クションと同様の移動度を持つバンド(ゾーン)を観察することができた(図
2
は Cu+の阻害は報告されていない [Esen1992L DIBOA-Glcおよ び DIMBOA-Glcに対する
)。このことから、ライムギグルコシダーゼにおいてみられる電気的多様性は、トウモロコ
b
5
4
ax値は、それぞれのラクタム (HBOA-Glcおよび HMBOA-Glc)に対する値と比較して 4-5
u
r
V
シの場合のようなプロテーゼの作用によるものではないと考えられる。
u値は1.4-1.7倍小さい値だった。このことは、酵素活性発現の
r
倍大きかったが、一方で K
これまで、ライムギにおいて複数のアイソザイムの存在が示唆されたが、その由来につ
0
0
m叫値に大きく現れ
u値よりも V
r
-ヒドロキシ基が重要であり、その効果は K
4
ためには基質の N
いては現段階では何の情報も得られていない。しかし、それを考察する際には トウモロコシの
-ヒドロキシ基の効果は、コムギや
4
るということを示唆するものである。そして、このような N
ルコン
に関する知見を参考とすることがで、きるかもしれない。トウモロコシグ、
グルコシダーゼ、
]。こ
2
9
9
トウモロコシのグルコシダーゼにも共通するもので、あった[前章;BabcockandEsen1
0kDaのボリ ペフチドよりなるホモ二量体であると考えられている。また、このグ
夕、ーゼは、 6
-メトキシ基のライムギグルコシダーゼに及ぼす影響は、コムギやトウモロコシの
れに対し、 7
;Pryor
7
7
9
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b
u
t
S
は非常に多形性の遺伝子座によりコードされている [
ルコシダーゼ、
グルコシダーゼに対するものとは異なる結果で、あった。コムギやトウモロコシでは、 DIBOA-Glc
]。このため、雑種系のトウ モロコ シより調製した組酵素液を native-PAGEによ り分析した
8
7
9
1
-メトキシ類縁体である DIMBOA-Glcや HMBOA-Glcに対し
や HBOA-Glcよりもそれぞれの 7
;Esenand
7
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際には、数本のバンドをゲル上で確認することができる [
]。しかし今回の研究では、ライムギグル
8
9
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てかなり高い活性を示した[前章;E
]。これまでのところ、ライムギグルコシダーゼをコードする遺伝子座や、ライム
0
9
9
Cokmus1
コシダーゼが 7ーメトキシ基 の影響をコムギやトウモロコシほど大きく受けているような結果は得
ギグルコシダーゼの多形性に関する情報は存在しないが、この酵素が 60kDaのサブユニッ
ルコース、 pNP-フコース、エスクリン、ゲニステインク戸ルコシ
られなかった。さらに、 pNP-グ、
トから構成されることを考えれば 、図 45でみられたような native-PAGE上の複数のバンドも、
ドといった Hx類縁体以外の化合物にも、コムギやトウモロコシのグルコシダーゼと比べて高
トウモロコシグルコシダーゼと同様な機構により発現しているのかもしれない。また、前章で
い活性を示した。以上の結果から、ライムギグルコシダーゼはコムギやトウモロコシの酵素よ
・
ー
65
ー
75
りも基質特異性が低いということが示唆された。特に、ライムギグルコシダーゼが DIMBO
A
-Gl
c
総括
だけでなく D
IBOA-Glcに対しても同様に高い活性を示したことは、ライムギにおける主要 Hx
種が DT
h
1B
OA-Glcではなく DI
BO
A
G
l
cであることを考えると重要な意味を持つように思える。
これまで、ライムギ、コムギ、トウモロコシにおけるグルコシダーゼについて、その諸性
質を比較してきたが、全般的な性状はいず、れの酵素も類似していると考えられる。とくに、ラ
イムギとコムギ、
のグルコシダーゼ、
は非常によく似ているといえるであろう。しかし 、それらの問
には相違点もいくつか認められ、特にそれは基質特異性において顕著である。なぜこのよう
な基質特異性の相違が生じるのか、そしてなぜ電気的に多様 なアイソザ、
イムが存在するか 、
ということを解明するための第一歩としては、本酵素の全アミノ 酸配列の決定や、それに続く
ゲノム DNAの解析などがあげられる。そして、そこで得られた結果は 、これら植物 の進化過
程の違いについても何らかの手掛かりを与えるものかもしれない
環状ヒドロキサム酸(Hx)類はイネ科植物に構成的に存在する耐病性因子であるが、植
物の発芽直後の時期においてはHx配糖体 (
H
x
G
l
c
) が傷害や感染とは無関係に一過的に
高濃度で発現している。本研究は、このようなイネ科植物の Hx類発現機構解明の 一環とし
て、コムギおよびライムギにおけるHx生合成酵素の動態と性状を明らかにすることを目的に
して行われた。
Hxの一つである DIBOAの生合成経路は、インドールを分岐点としていJ
プトファン生合
成経路と Hx生合成経路に分かれ、インドール以降はチトクローム P4
5
0による 4段階の水
酸化反応(一酸素原子付加反応)である。そこで、第一章ではこの 4段階の反応のうち最初
と最後の酵素反応に注目し、コムギ従属栄養期におけるそれら酵素活性の動態を測定した。
その結果、両酵素活性とも Hx類の消長と同調して経時的に増減していていることが明らか l
こ
なった。また、 Hx類は通常の植物内では不活性 なグルコース配糖体として蓄積されている。
そこで、第二章および第三章では 、アグリ コンー配糖体聞の反応を触媒するグルコシルトラン
スフエラーゼおよびグルコシダーゼの酵素活性についても検討した。そして、これらの酵素活
性の経時変化とHx類、の経時変化との聞にも時間的な相関が認められ、以上の結果より、コ
ムギにおける Hx
G
l
cの一過的な発現はその代謝経路全体の活性化によるもであることが示唆
された。
次に、イネ科植物における耐病性発現の調節機構に関する詳細な知見を得るために、こ
の調節に最も直接的に関与する二つの酵素、グルコシルトランスフエラーゼとグルコシダーゼ
について精製を行い 、その性状解析を行った。
第二章では 、コ ムギのグルコシルトランスフエラーゼは分子量が 49もしくは 47kDaのモ
ノマーであることが明らかにされ、さらに、二つのアイソザイムが存在することが示唆された。
また、この酵素は DIBOAよりも DIMBOAに対して高い活性を持つことが示されたが、この
結果は、コムギにおける主要 Hx種が DIMBOAで、
あることと矛盾しないものであった。トウモ
ロコシやライムギ由来のグル コシルトランスフエラーゼに関して、酵素レベルでの報告はこれ
までごく少数しかないが、それらと本研究で得られた結果を比較したところ、これらのグルコ
シルトランスフエラーゼ、
の性状には大きな相違点を認めることがで、
きなかった。コムギおよびト
ウモロコシにおける主要 Hx
G
l
cが DIBMBOA-Gl
cであり、ライムギにおける主要化合物が
DIBOA
-Gl
cであることを考えると、この結果は興味深いものである 。
ー
5
8-
-59-
第三章では、コムギグルコシダーゼの精製と性状解析を行い、この酵素が 6
0および 5
8
kDaの二つのサブユニットから構成される分子量約 3
0
0kDaのヘテ ロオリゴマーであること、
で得られた結果はコムギ・ライムギ ・トウモロコシにおける病害抵抗機構の進化や、さらには
イネ科植物全般の感染防御機構に対する新たな知見に結びつくものと思われる。
そしてサブユニットの構成比が異なる複数のアイソザイムが存在することが示唆された。この
ような結果は、トウモロコシグ、ルコシダーゼ、には見られない新規なものであった。また、 3品
種の T
i
行t
i
c
u
ma
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u
m間ではこ のアイソザイムの発現パターンに大きな差違は認め られな
かったが、 他の T
r
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c
u
m、特に 4倍体コムギでは、アイソザイムの発現が T
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v
u
mとは
大きく異なっていた。このグルコシダーゼの基質特異性について詳細に検討した結果、
DIMBOA-Glcに対して特に高い活性を示すことが明らかになった。また、コムギグルコシダー
ゼとトウモロコシグルコシダーゼの基質特異性の比較から、両酵素の基質の認識にはそれほ
ど大きな違いはないことが示唆された。
過去の Hxに関する研究はトウモロコシを主な植物材料として使用しており、コムギやラ
イムギ、
に関する研究は非常に少数で、あった。そこで本研究においては、第三章までのコムギ
に関する研究と併せて、第四章ではライムギ従属栄養期における Hx類の動態を明らかにし、
さらにそのクεルコシダーゼ、
の性状解析を行った。そして、ライムギにおいても H
xGlcおよび
HxGlcグルコシダーゼ活性が同 調して変化していることが示され、こ のような従属栄養期にお
ける Hx生合成酵素の一過的な活性化はイネ科植物に共通の現象であることが示唆された。
また、精製されたグルコシダーゼは 6
0kDaのサブ、
ユニ ットからなる分子量約 3
0
0kDaのホモ
オリゴマーであることが明らかになり、さらに複数のアイソザイムの存在が示唆された。また、
その N
-末端アミノ酸配列がコムギグルコシダーゼの N末端配列と高い相向性を示したことか
ら、両酵素の類似性が示唆された。しかし、グルコシルトランスフエラーゼ、の場合とは異なり
基質特異性には興味深い違いが認められた。すなわち、ライムギのグルコシダーゼは
DIMBOA-Glcだけでなく DIBOA-Glcに対しても同様の高い活性を示した。また、その他の基
質に対してもコムギやトウモロコシ由来のグルコシダーゼよりも高い活性を示し、ライムギグル
コシダーゼは比較的広い基質特異性を持つことが明らかとなった。
以上のように本研究においては、イネ科植物における Hx生合成酵素に関して新たな知
見を多く得ることができたが、その一方で新たな問題点が残された。例えば複数アイソザイム
の由来とその意義、さ らに基質特異性における相違の由来を明らかにすることなどがあげられ
る。本研究で明らかになったク守ルコシルトランスフエラーゼおよびグルコシダーゼの性状をよ
り詳細に検討し、さらに全アミノ酸配列の決定や遺伝子解析等の分子生物学的手法を導入 し
ていくことで、今回提起された問題点に対する解答が得られることが期待される。また、そこ
-6
0-
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引用文献
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謝辞
本研究は京都大学大学院応用生命科学専攻生物機能制御化学研究室で、行ったもので、あ
ります。本研究を行う機会を与えてくださり、終始御指導と激励を賜りました京都大学大学院
農学研究科、岩村倣教授に心から感謝致します。また、研究を進めるにあたり数々の貴重な
御助言、御鞭 f
達を頂きました京都 大学大学院農学研究 科、三芳秀人助教授 並びに京都大学
大学院農学研究科、石原亨先生、そして様々なコムギ種子を快く提供して下さった京都大学
大学院農学研究科、遠藤隆教授に深く御礼申し上げます。
また、本研究の共同研究者である田辺純也氏、さらに、本研究を進める上で数多くの御
意見、御援助を頂きました当研究室の戎居健吉氏、及川￨彰氏、野村泰治氏に深く感謝致しま
す
。
最後に、日頃より暖かい御支援を下さり、また、相談相手ともなって頂いた京都大学生
物機能制御化学研究室の方々に心より御礼申し上げます。
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