熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
HIV感染抵抗者から学ぶ次世代エイズワクチン創製に関す
る基礎研究 : 霊長類を用いた交叉免疫抗原に関する基礎
研究
Author(s)
大坪, 靖治
Citation
Issue date
2013-03-25
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/30909
Right
熊本大学学位論文
HIV 感染抵抗者から学ぶ次世代エイズワクチン創製に関する基礎研究
-霊長類を用いた交叉免疫抗原に関する基礎研究-
2013
大坪
靖治
HIV 感染抵抗者から学ぶ次世代エイズワクチン創製に関する基礎研究
-霊長類を用いた交叉免疫抗原に関する基礎研究-
2013
大坪
靖治
Basic Study for Development of the Next Generation of AIDS Vaccine
Candidates Based on the Immune Response of HIV-resistant Individuals
-Basic Study on Cross-immunity in Non-human Primate ModelYasuharu Otsubo
Basic Study for Development of the Next Generation of AIDS Vaccine
Candidates Based on the Immune Response of HIV-resistant Individuals
-Basic Study on Cross-immunity in Non-human Primate ModelYasuharu Otsubo
The progress on the development of a vaccine has been slow since the AIDS epidemic
was first recognized in 1981. Recent and the most expected vaccine regimen is four priming
injections of a recombinant canarypox vector vaccine (ALVAC-HIV [vCP1521]) plus two
booster injections of a recombinant glycoprotein 120 (gp120) subunit vaccine (AIDSVAX
B/E). This regimen was evaluated in a clinical trial in Thailand in 2009 and showed that the
vaccine efficacy for prevention was approximately 30%, however, vaccination did not affect
the degree of viremia or the CD4+ T-cell count in subjects with HIV infection. This clinical
trial concluded that these results showed only a modest benefit, but they offer insight for
future research. However, we must consider the way of complete defense at mucosal sites
which are primary transmission sites for HIV, because elimination of HIV after infection is too
difficult owing to its mutation and destruction of immune system.
Furthermore, the mucosal transmission of HIV-1 infection established in a short term
makes it increasingly difficult to develop HIV-1 vaccine. Although the events between HIV-1
exposure and establishment of infection in humans are poorly understood, it has been
established in nonhuman primates that mucosal infection can occur following 30-60 min
exposure to the infectious virus, suggesting that the time for the induction of protective
immunity during HIV-1 transmission must be critically short, or vaccine-induced immune
responses should be maintaind before exposure to HIV-1.
Therefore, we have to create a novel vaccine which vaccine-induced immune responses
have been maintaind before exposure to HIV-1 and completely prevent transmission of HIV
at the mucosal sites. In fact, the simultaneous presence of anti-CCR5 and anti-HIV-1
envelope glycoprotein 41 (gp41) antibodies (Abs) at sites of HIV-1 exposure was effective in
preventing its transmission to HIV-1-exposed seronegative (ESN) subjects. These humoral
immune responses contribute to an extremely low level of viral replication below the
detection limit of a standard assay in ESN subjects, suggesting that more than one type of
immunity such as anti-CCR5 and anti-HIV humoral responses must be induced by a vaccine
if that vaccine is to be effective against HIV-1 infection. In this paper, we report that our
immunogen reconstructe the immune responses in ESN subjects in nonhuman primate, and
bovine alpha-2-HS-glycoprotein (bAHSG) is able to maintain this vaccine-induced immune
response.
1. Anti-CCR5 and anti-gp140 Abs were induced simultaneously by HIV multiantigen
vaccine (HMV).
In this study, we designed HMV with four components; cyclic closed-chain dodecapeptide
mimicking the conformation-specific domain of CCR5 (cDDR5), recombinant trimeric
SIVmac239 gp140 (ENV), Tetragalloyl-D-lysine dendrimer (TGDK) as M cell targeting
molecule, and CpG-ODN as mucosal adjuvant. When inguinally administered to three
rhesus macaques, the immunogen simultaneously induced both anti-CCR5 and anti-ENV
Abs in sera, and the purified serum IgG fraction exerted an inhibitory effect on SIVmac239
infection in vitro.
2. bAHSG functions as booster and cross-reacting antigens
When further boosted with bAHSG to HMV-immunized monkeys, the responses of
anti-CCR5 and anti-ENV Abs in sera were significantly enhanced. To examine the
cross-reactivity of bAHSG, it was administered to three naive cynomolgus macaques in the
form of TGDK-Hubantigen-bAHSG (THbA). The results showed a statistically significant
increase in IgG response against cynomolgus CCR5 and SIVmac239 ENV, and the
induction of neutralizing activity against SIVmac239.
Our results suggest that it is possible to reconstruct the immune responses in ESN
subjects before HIV-1 exposure if a vaccine-induced immune response is boosted by an
antigen such as bAHSG through daily food intake after the mucosal administration of a
vaccine immunogen.
目次
第 1 章 緒論
第 1 節 研究の背景
第 2 節 研究の方針
2-1 HIV に対するワクチンの現状と問題点
2-2 霊長類モデルの有用性と問題点
2-3 HIV に対するワクチン創製における解決策
第 2 章 HIV multiantigen vaccine（HMV）の作製
第 1 節 組換え gp140 の作製
1-1 gp140 expression constructs
1-2 Vero 細胞へのトランスフェクション及び gp140 の精製
第 2 節 Hub-antigen、cDDR5、TGDK の合成
第 3 節 HMV の合成
第 4 節 考察
第 3 章 アカゲザルを用いた HMV の免疫原性の評価
第 1 節 アカゲザルへの免疫
第 2 節 抗血清の抗体価
第 3 節 抗血清の中和活性
第 4 節 血清中 IgG の特異性確認
第 5 節 考察
第 4 章 Bovine alpha-2-HS-glycoprotein（bAHSG）による交叉免疫効果
第 1 節 bAHSG による追加免疫
第 2 節 考察
第 5 章 カニクイザルを用いた TGDK-Hubantigen-bAHSG (THbA)の
免疫原性の評価
第 1 節 THbA のカニクイザルへの免疫
第 2 節 血清中 IgG の抗体価
第 3 節 血清中 IgG の立体構造認識
第 4 節 血清中 IgG の中和活性
第 5 節 考察
第 6 章 総括
第 7 章 実験の部
参考文献
謝辞
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本論文中に用いられた略語一覧表
Abs
AB-NTA
ADCC
AIDS
bAHSG
BCA
BN-PAGE
BPB
BSA
cART
CBB-G250
CCA
CCR5
CD
cDDR5
contg.
CpG-ODN
CTL
CXCR4
DMEM
DMF
DMSO
ECL-2
EDTA
ELISA
EMEM
ENV
ESNs
FCS
FDA
FITC
GALT
Antibodies
N-(5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid
Antibody-dependent cellular cytotoxicity
Acquired immunodeficiency syndrome
Bovine alpha-2-HS-glycoprotein
Bicinchoninic acid
Blue native poly-acrylamide gel electrophoresis
Bromophenol blue
Bovine serum albumin
Combination antiretroviral therapy
Coomassie brilliant blue G-250
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
C-C chemokine receptor type 5
Cluster of differentiation
Cyclic closed-chain dodecapeptide mimicking
conformation-specific domain of CCR5
containing
CpG-oligonucleotides
Cytotoxic T lymphocyte
CXC chemokine receptor type 4
Dulbecco’s modified Eagle medium
N, N-dimethyl formamide
Dimethyl sulfoxide
Extracellular loop-2
Ethylenediaminetetraacetic acid
Enzyme-linked immunosorbent assay
Eagle's minimal essential medium
Envelope
Exposed seronegatives
Fetal calf serum
Food and Drug Administration
Fluorescein isothiocyanate
Gut-associated lymphoid tissue
gp
HIV
HMV
kDa
Glycoprotein
Human immunodeficiency virus
HIV multiantigen vaccine
kilo Dalton
the
POD
LTNPs
LTR
MAP
MAT
MALDI TOF-MS
M-cell
MHC
MW
NAb
NIH
NMM
NTA
NTA-Ni
PBS (-)
PCR
POD
PE
PEG
PVDF
rAd5
RPMI
SDS
SIV
sm
TBS
TEA
TFA
TGDK
THbA
TMBZ
TLR9
Tris
UNAIDS
Peroxidase
Long-term non-progressors
Long terminal repeat
Multiple antigen peptide
Metal affinity tag
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight
mass spectrometry
Microfold/membranous cell
Major histocompatibility complex
Molecular weight
Neutralizing antibody
National Institute of Health
4-Methylmorpholine
Nitrilotriacetic acid
Nickel-binding NTA
Ca2+, Mg2+ free phosphate-buffered saline
Polymerase chain reaction
Peroxidase
Phycoerythrin
Polyethylene glycol
Polyvinylidene difluoride
Recombinant adenovirus type 5
Roswell Park Memorial Institute
Sodium dodecyl sulfate
Simian immunodeficiency virus
Sooty mangabey
Tris-buffered saline
Triethylamine
Trifluoroacetic acid
Tetragalloyl-D-lysine dendrimer
TGDK-Hubantigen-bAHSG
3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine
Toll-like receptor 9
Tris (hydroxymethyl) aminomethane
The joint United Nations programme on HIV/AIDS
UPA
WHO
wpim
X-gal
Undecapeptidyl arch
World Health Organization
week postinitial immunization
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase
本論文は次の論文を基礎とするものである。
1. Bovine alpha-2-HS-glycoprotein functions as a booster antigen for
efficiently stimulating humoral immune responses to CCR5 and
SIVmac239 envelope glycoprotein
Yasuharu Otsubo, Seizo Yashiro, Kiyoteru Nozaki, Kaoru Matsuura,
Kouhei Kiyonaga, Ryotarou Mitsumata, Yoshihiro Takahashi,
Mitsuaki Masuyama, Atsunobu Muneoka, Nobutoki Takamune, Shozo Shoji,
Shogo Misumi
Biochemical and Biophysical Research Communications, 443: 301-307
(2014).
第1章
第1節
緒論
研究の背景
1981 年 に 後 天 性 免 疫 不 全 症 候 群 (acquired immunodeficiency syndrome;
AIDS)が症例報告され、その原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス(human
immunodeficiency virus; HIV）が 1983 年に報告されてから、多くの研究者に
よって HIV の感染機構および感染制御に関する研究がなされてきた。UNAIDS の
2013 年の報告 1)によれば、HIV 感染者は世界で 3530 万人を越え、2012 年の 1 年
間で 160 万人が死亡、新たに 230 万人が感染したと推定されている。新規感染
者は 2001 年と比較し 33%減少、死亡者数は最も多かった 2005 年から 30%減少し
たが、根本的な治療法は未だ確立されていない。現在、HIV に対する多くの薬剤
が開発され、それらを組合わせた抗 HIV 療法(combination antiretroviral
therapy; cART)が導入されており、先進諸国においては AIDS 発症を劇的に抑制
または遅延させることに成功しているが、発展途上国では cART 含め薬剤療法が
不十分である 1)。実際に、2012 年では 970 万人の HIV 陽性者が抗 HIV 治療を受
けているのみであり、これは WHO ガイドライン(2013 年)2)において抗 HIV 治療を
必要とされている人の 34%となることを示している。また、先進諸国における
cART の導入は、HIV 感染症を治療可能な疾患へと成し得た一方で、同時に大き
な問題も抱えることなっている。cART は HIV 複製を強力に阻害し、ウイルス量
を検出限界以下にまで抑制することができるが、HIV 感染細胞を体内から完全に
排除することはできず、生涯にわたり治療薬を飲み続けなければならない。そ
の結果、膨大な医療費（3 剤投与で年間約 250 万円、40 年飲み続けると約 1 億
円）、さらには多剤耐性株の出現などの問題点が生じている。特に、先進諸国に
おける薬剤耐性問題は深刻であり、米国では 10 人に 1 人に耐性ウイルスが報告
され 3)、日本においても新規感染患者の薬剤耐性ウイルスの検出が報告されてい
る 4)。したがって、安全で安価な感染あるいは発症を予防できる新規ワクチンの
1
開発が強く望まれている。
これまで、HIV の予防あるいは治療のためのワクチン開発が世界的に進められ
てきたが、未だ有効な HIV ワクチンは開発に至っていない。HIV 外被糖タンパク
質(エンベロープタンパク質； ENV)である gp120 に対する抗体の誘導を目的と
したワクチンである AIDSVax (VaxGen 社)の第 III 相臨床試験(1998 年)5）、HIV
に特異的な細胞障害性Ｔ細胞(cytotoxic T lymphocyte; CTL)の誘導を目的とし
た組換え 5 型アデノウイルスベクターrAd5 を用いたワクチン（Merck 社）の第
IIb 相臨床試験(2007 年)6）にみられるように、これまでのワクチン開発における
基本概念が HIV の場合には通用しなかった。米国 NIH は、Merck 社のワクチン失
敗を受けて、多くのワクチン研究計画の抜本的な見直しをはかり、「研究の優
先順位を基礎研究へ」という大きな転換を提言している。その後最近の成果と
して、2009 年にタイで HIV の遺伝子を組込んだカナリア痘ワクチンと AIDSVax
を組合わせたワクチンデザインで臨床試験を行ったところ、約 30%の感染予防効
果がみられた 7）。このワクチンデザインでは、HIV 感染が成立した者の血漿中ウ
イルス量及び CD4 陽性 T 細胞数には影響を与えなかったが、これまでにない大
きな成果として WHO 及び UNAIDS より声明が出されている。しかし、HIV はいっ
たん宿主に感染すると変異を繰り返し、免疫細胞を崩壊して感染後の免疫シス
テムによって排除されにくいことを考慮すると、約 30%の感染予防効果では十分
ではないと言える。さらに HIV は粘膜面を短い時間で通過し、感染を成立させ
てしまうという特徴は、初発感染部位である粘膜面で完全に HIV の感染を防ぐ
という手段が HIV の根絶につながると期待される。
第2節
2-1
研究の方針
HIV に対するワクチンの現状と問題点
ポリオや天然痘に対するワクチンで見られるように、ワクチンはこれまで広
範な病原体に対して有効な手段であるという認識があったが、HIV に対するワク
2
チン開発は極めて困難であった。HIV 以外の多くの病原体に対しては弱毒生ワク
チンや不活化ワクチンが開発され、弱毒生ワクチンは免疫原性が高く、液性免
疫及び細胞免疫を両方誘導できることこともよく知られており、実際 simian
immunodeficiency virus (SIV)感染に関してもサルで完全防御を成し遂げた例
もある 8)。しかしながら HIV そのものが免疫不全ウイルスであることに加えて、
復帰変異などによる病原性の獲得＝AIDS 発症の危険性を考慮すると現実的では
なかった。そこで、化学的、または物理的に抗原を不活化された不活化ワクチ
ンの開発が進められたが、中和抗体(neutralizing antibody； Nab)は誘導でき
るがエピトープの高次構造が壊れているため NAb の中和活性が低く、また CTL
の誘導はあまり期待できないという結果になった。同様に精製または合成ペプ
チドワクチンも Nab の誘導のみしか期待できなかった。一方、HIV 特異的な CTL
を誘導させるワクチンも様々なベクターを用いて開発されてきたが 9-12)、一旦感
染が成立してから完全にウイルスを体内から排除することは極めて難しいとの
判断から、最終的に理想のワクチンは、HIV 特異的 NAb 及び HIV 特異的 CTL の効
果的な誘導が HIV 感染防御及び制御において最も重要であると考えられるよう
になっている。その理由は簡単に述べると、NAb は侵入してくるウイルスは中和
(排除)できるが、一度感染が成立すると、感染細胞を排除することに対しては、
抗体依存性細胞障害作用(ADCC 活性)に依存することになる。逆に CTL は感染細
胞に対しては傷害活性を示すが、体内に侵入してきたウイルスや新たに感染し
ようとするウイルスそのものに対しては作用できないためである。実際にヒト
においてこの概念を支持する事象として、HIV-1 に感染して 15 年以上正常な免
疫能を保っている、つまりウイルス複製をコントロールできている長期未発症
者(long-term non-progressors; LTNPs)では HIV-1 に対する中和抗体価と細胞
性免疫が高いことが報告されている 13,14)。
HIV-1 固有の特性である易変異原性と遺伝的多様性も HIV ワクチン開発にお
ける主要な障害となっている。HIV-1 は RNA ウイルスであり、宿主細胞で複製す
3
るために HIV-1 自身の逆転写酵素により DNA へ逆転写後、宿主のゲノムへ組込
む。HIV-1 の逆転写酵素は誤って読み違えた塩基配列を校正する手段を有さない
ために高頻度(1 回の転写で全ゲノムの 1∼10 残基が変異)で変異を自身のゲノム
へ入れてしまう。その結果、塩基配列に多様性を生じさせ、一個体内で多様な
遺伝的亜種(quasi species)が誕生し得る。CTL のような強い HIV の複製抑制機
構の存在下においても変異は生じ、やがて CTL からの認識を逃れるエスケープ
変異体が選択される。
さらに、HIV 感染において粘膜での伝播速度が短時間であることも、HIV に対
するワクチン開発において主要な障害となっている。ヒト以外の霊長類におい
て、粘膜感染はウイルス曝露後 30∼60 分で成立し数日以内にリンパ節へ排泄さ
れ全身に広がることが確認されている
15-17）
。また、感染急性期では腸管関連リ
ンパ組織(gut-associated lymphoid tissue； GALT)内の CD4 陽性 T 細胞の急速
な枯渇が知られており
18、19）
、一度粘膜感染すると免疫応答による感染の防御は
不十分であることが示唆される。これらのことは、この短い伝播時間の間に粘
膜面での防御免疫を誘導するか、あるいはワクチンにより誘導される免疫応答
を HIV に曝露される前から維持しておくことの重要性を示唆している。
2-2
霊長類モデルの有用性と問題点
前述した HIV に対するワクチンの問題点を解決するために、動物モデルによ
る評価は欠かせない。一般的な動物モデルとしては、げっ歯類が利用しやすく、
非臨床研究のさまざまな分野で使用されているけれども、HIV や HIV に類縁の
SIV は原則としてげっ歯類には感染させることができないために、ヒト細胞が生
着できる NOG マウスなどのヒト化マウスが利用されている。ヒト化マウスによ
り様々な研究が可能になった一方で、ワクチン評価、特に AIDS ワクチン開発の
分野においては、宿主の免疫機構、感染動態に関連するタンパク質、遺伝的背
景など複合的な因子が重要であり、上記のヒト化マウスではワクチン候補の評
4
価には不十分であると考えられる。したがって、ヒトに最も近縁な動物であり、
免疫学的、解剖学的、生理学的機能などの面においてヒトと類似する霊長類が
動物モデルとして有用である。
一方、霊長類モデルを利用する上での問題点もある。まず、HIV はヒト以外で
はチンパンジーにしか感染しない。チンパンジーに感染し AIDS を発症させうる
HIV 株もあるが 20)、チンパンジーを HIV 感染モデルとして利用するには倫理的問
題、取り扱いや飼育の難しさ、コストの面から実用的ではない。一方、サル免
疫不全ウイルス SIV のうち、SIVmac ウイルスはアジアに生息するアカゲザルに
感染し AIDS 様症状を発症することから、ワクチン評価として主にアカゲザルが
使用されてきた
21）
。しかし、米国を中心にワクチンの評価モデルとして多用さ
れてきたアカゲザルの多くはインド産であり、現在はインドから輸出禁止とな
ったため、本邦におけるインド産アカゲザルの入手はほぼ皆無である。その他
の国、例えば中国からアカゲザルを本邦へ輸入することは可能であるが、産地
の違いによる主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex；
MHC）の違いがあり、MHC の違いによって SIV の感染率の違いも指摘されている
22-28）
。また、HIV 感染の多くが経膣感染であり、SIV の経膣感染モデルの確立が
求められるが、アカゲザルは季節性繁殖であるため性周期がヒトの性周期とは
合致していない。一方、医薬品の前臨床試験で多用されているカニクイザルは
日本国内でもアカゲザルより安定的に供給されており、性周期もヒトと同様で
あるため、HIV 感染の霊長類モデルはカニクイザルへシフトすることが望まれて
いる。
2-3
HIV に対するワクチン創製における解決策
本研究では、HIV に対するワクチンを創製するにあたり、上記のように 1）HIV
の易変異原性、2）遺伝的多様性、3）感染成立までの速度、4）初発感染部位で
ある粘膜防御の 4 点を克服することが重要であると考え、霊長類を用いて基礎
5
的研究を行った。臨床において、非常にリスクの高い性行動をしているにもか
かわらず感染から逃れている HIV 感染自然抵抗者(exposed seronegatives;
ESNs)の存在が知られているが、ESNs は上記 4 点の課題を克服して、感染抵抗性
を示していると考えられる。実際、ESNs の膣内には、ウイルスの ENV に対する
抗体やウイルスが宿主へ感染する際に用いるレセプターCCR5 に対する抗体を保
有しているとの臨床知見が得られている 29−32）。このことは、ウイルス ENV およ
び CCR5 に対する抗体に補足されないように HIV が変異すると、ウイルスの感染
能力がなくなることを示唆しており、ウイルス ENV および CCR5 に変異によって
逃れることのできない重要なエピトープが存在すると考えられる。また、HIV の
初発感染部位である粘膜面でウイルス ENV および CCR5 に対する抗体を誘導する
ことが、HIV 感染防御を可能にするワクチン開発の戦略となりうることを示唆し
ている。
6
第2章
HIV multiantigen vaccine(HMV)の作製
本研究では、ESNs の免疫状態を戦略的に模倣するために、ウイルス ENV と宿
主側 CCR5 に対する抗体を同時に誘導できる抗原の作製を試みた。HIV-1 の細胞
内侵入は、ウイルスの ENV と宿主細胞膜の CD4 分子及び CCR5 との相互作用によ
って引き起こされる。ウイルス ENV は、外被糖タンパク質 gp120 と膜貫通タン
パク質 gp41 の三量体であり、gp120 が宿主細胞の CD4 分子と結合することによ
り gp120 の立体構造変化を生じる 33）。その結果、gp120 内の V3 領域を含む CCR5
結合領域が露出し、宿主細胞膜上の CCR5 と結合する 34）。さらに gp120 と CCR5
の相互作用によりウイルス粒子と宿主細胞膜間の距離が近接し、それと同時に
gp41 の細胞外領域に構造変化が生じ、それまで内側に折りたたまれていた gp41
の疎水性の高いアミノ末端部分が宿主細胞膜へ挿入され、ウイルス表面膜と宿
主細胞膜の融合が開始される 35）。実際に gp41 ペプチド抗原を用いた粘膜での免
疫は、in vitro でいくつかの HIV-1 の株に対して中和活性を持ち、ウイルスの
トランスサイトーシスを阻害する血清中および粘膜面抗体を誘導することも確
認されている 36、37）。
一方、宿主側 CCR5 は、7 回膜貫通 G タンパク質共役型受容体であり、細胞外
には N 末端と 3 つのループを有する。HIV-1 感染において、CCR5 の第 2 細胞外
ループ(extracellular loop-2; ECL-2)は、その侵入に非常に重要な部位であり、
ジスルフィド結合によって前半部分にアーチ状の特徴的な立体構造を有してい
る 38-43）。本研究では、この領域を undecapeptidyl arch (UPA)と命名した。UPA
由来の環状 dodeca peptide (cDDR5)を用いて、Balb/c マウス、カニクイザルお
よびアカゲザルに免疫すると、抗 HIV-1 活性を持つ CCR5 特異的な自己抗体を誘
導できることを確認している 44-46）。
前章で示した ESNs の知見のように、ウイルス ENV および CCR5 は、有効なワ
クチン抗原となり得ると期待される。本章では、戦略的に ESNs の免疫応答を模
7
倣するための新規ワクチン抗原として、polyethylene glycol（PEG）骨格を基
本とした Hub-Antigen に、アカゲザル CCR5 の UPA を模倣した環状ペプチド
(cDDR5)、SIVmac239 の外被糖タンパク質由来の三量体 gp140、将来的な粘膜ワ
クチンへの応用を考慮して粘膜面での抗原取込み機能を持つ M-cell の標的分子
tetragalloyl-D-lysine dendrimer (TGDK)、アジュバントとして TLR9 のリガン
ドである CpG-ODN を結合させた HIV multiantigen vaccine (HMV)を作製した
(Fig. 1)。
cDDR5
TGDK
Hub-antigen
NTA-Ni
CpG-ODN
Fig. 1
ENV
Schematic representation of HMV
HMV has four components as stated below:
cDDR5; Cycloimmunogen for inducing anti-CCR5 antibody
ENV; Trimeric SIVmac239 envelope glycoprotein 140
TGDK; M cell targeting molecule
CpG-ODN; Mucosal adjuvant and TLR9 ligand
TGDK は、Caco-2 cell を M-cell へ分化させた in vitro M 様細胞モデルにお
いて特異的に結合し、M 様細胞を介してトランスサイトーシスされることを増山
らが明らかにしている 47)。さらに、増山らは金粒子でラベルした TGDK を用いた
解析により、TGDK がアカゲザルの小腸パイエルパッチの M-cell から取込まれる
8
ことを確認し、さらに TGDK を cDDR5 とともに Hub-Antigen に結合させた抗原を
アカゲザルに経口投与して、抗 HIV 活性をもつ糞便中 IgA を誘導できることを
確認している 47)。
本研究で用いた CpG-ODN は、naive B 細胞の活性化のために核酸アジュバント
として用いた。HMV の合成には、粘膜アジュバントである class B タイプのホス
ホロチオエート化した CpG ODN 2006 を用いた。
第1節
1-1
組換え gp140 の作製
gp140 expression constructs
有効な中和活性を発揮する抗体を誘導するには、ワクチン抗原が実際のウイ
ルス粒子や感染機構に関わる分子の立体構造を模倣していることが重要である
と一般的に考えられている。HMV に結合させる ENV は、実際に ENV がとっている
三量体構造と糖鎖修飾を模倣するため、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来
の Vero 細胞を用いた組換え gp140 として作製した。Vero 細胞にトランスフェク
トする gp140 発現プラスミドの模式図を Fig. 2 に示す。通常、ENV は宿主細胞
により gp160 として合成された後、宿主細胞由来のプロテアーゼである furin
により gp120 と gp41 に切断され 48)、非共有結合により gp120/gp41 三量体を維
持するが、その結合は脆弱である。そこで、gp160 の furin 切断部位に 2 ヶ所の
アミノ酸置換を導入し、furin 切断を受けずに ENV 複合体の三量体構造を維持さ
せて HMV に結合させる ENV(gp140)とした。なお ENV は Vero 細胞の培養上清中に
回収するために、
ENV そのものの膜貫通ドメインから C 末端側は排除されている。
まず、感染性 SIVmac239 の DNA クローン(pMA293HS)を元に、ENV 配列を PCR
で増幅し、pT7Blue に組込んだ。その後、gp41 から gp120 が解離するのを防ぎ
三量体を形成させるため、furin cleavage sites である 512 番目の Arg と 523
番目の Lys を Glu へ変異させた DNA を、最終的にベネズエラ馬脳炎ウイルス由
来のプロモーターを組込んだ pERK vector に組み込んだ。また、Hub-Antigen に
9
Ni-binding NTA (NTA-Ni)を介して結合させるため、MAT-tag sequence を挿入し、
pERK-SIVmac239 gp140(R512E, K523E)を調製した（Fig. 2）。
Fig. 2
gp140 expression constructs
The SIVmac239 gp140 coding sequence was amplified by a blunt-end PCR from
the infectious SIVmac239 DNA clone, pMA293HS, and directly ligated with
pT7Blue. The pT7Blue-SIVmac239 gp140 construct contained the SIVmac239
gp140 coding sequence truncated after Lys669 (numbered beginning from the
first amino acid residue of the mature SIVmac239 envelope protein) with the
Kozak consensus sequence and Bgl II site sequence. To prevent any
dissociation of gp120 from the gp41 moiety, both the primary and secondary
furin cleavage sites were eliminated by the mutation of Arg512 and Lys523 to
Glu residues in pT7Blue-SIVmac239 gp140. Furthermore, pT7Blue-SIVmac239
gp140 (R512E, K523E) was digested with the Xba I and Bgl II, and the resulting
DNA
fragment
was
then
pCMV-FLAG-MAT-2 vector.
cloned
into
Xba
I/Bgl
II
double-digested
Finally, the SIVmac239 gp140 (R512E, K523E)
coding sequence with FLAG and MAT sequences was amplified and the
resulting PCR fragment was digested with Asc I and then cloned into the Eco RV
and Asc I double-digested pERK vector.
10
1-2
Vero 細胞へのトランスフェクション及び gp140 の精製
pERK vectorに組み込まれたプロモーターが一本鎖(+)RNAウイルスであるベネ
ズエラ馬脳炎ウイルスであるため、得られたgp140 のDNAをRNAに転写後、このRNA
（14 µg）をelectroporationによってVero細胞にトランスフェクトし、培養上
清を回収した。培養上清中の可溶性gp140 について透析および濃縮を 5 回繰り返
し、SIVmac239 gp140(R512E, K523E)とした。
SIVmac239 gp140(R512E, K523E)が精製されていることを確認するため、
SDS-PAGE (Fig. 3A) 及 び Western blotting (Fig. 3B ） を 行 い 、 SIVmac239
gp140(R512E, K523E)の 165 kDa にバンドを確認した。アルブミン等を含む血清
由来のタンパク質は透析および濃縮を 5 回繰り返すことにより減少していった。
さらに、凍結乾燥後の SIVmac239 gp140(R512E, K523E)を用いて、BN-PAGE を行
ったところ、Vero 細胞から分泌された SIVmac239 gp140(R512E, K523E)は、分
子量から三量体構造を構築していることが示唆された（Fig. 3C）。
11
A
B
(kDa)
C
(kDa)
(kDa)
175
gp140
Trimer gp140
175
440
83
242
1st
5th
83
Dialysis
&
Concentration
Fig. 3
Confirmation of SIVmac239 gp140 (R512E, K523E)
Reducing SDS-PAGE (A), western blotting
(B), and BN-PAGE (C) analysis of
purified SIVmac239 gp140 (R512E, K523E). Proteins in each dialysate (100 µL)
were precipitated with ethanol and the resulting precipitates were subjected to
SDS-PAGE and western blotting with an anti-gp130 Ab. The lyophilized gp140
(R512E, K523E) was dissolved in BN sample buffer and then subjected to
BN-PAGE.
第2節
Hub-antigen、cDDR5、TGDK の合成
Hub-antigen、cDDR5、TGDK は増山らが作製した方法
47)
に従って調製した。
Hub-antige は、SUNBRIGHT HGEO-200NP に 7.2 倍量の SUNBRIGHT HGEO-200PA を
DMF 中で 16 時間混合後、透析し、凍結乾燥した。TGDK は、dendrimer resin の
D-Lysine を骨格として galloyl 基 4 分子を結合させ、
M 細胞標的分子として TGDK
を合成した。cDDR5 は、直鎖 decapeptide (H2N-KRSQREGLHYTG-COOH)を Fmoc
chemistry で合成し、C 末端 Gly と N 末端 Lys を酸アミド結合により縮合し環状
化した。調製した cDDR5 は MALDI TOF-MS により分析を行い、環状化前が
1431.22 m/z (Fig. 4 上 段 ) の ピ ー ク を 示 し 、 環 状 化 後 が 脱 水 縮 合 に よ り
1413.67 m/z (Fig. 4 下段)にピークを示しことを確認した。
12
1431.22
a.i.
4000
3000
2000
1000
0
-1000
-2000
-3000
-4000
Rhesus linear DDR5
1413.67
Rhesus cDDR5
1400 1500 1600 1700 m/z
Fig. 4
Confirmation of cDDR5
MALDI-TOF MS spectra of linear DDR5 and cDDR5. The spectra exhibited two
peaks at m/z 1431.22 and 1413.67: the upper peak is that of the ion derived from
linear DDR5, and the lower peak is that of the ion derived from cDDR5.
第3節
HMV の合成
TGDK のエチレンジアミン、
cDDR5 の Lys 残基、AB-NTA、6-aminohexanol-labeled
phosphorothioate-modified CpG ODN 2006 の各アミノ基を介して SUNBRIGHT
PTE-100NP に結合させた後（各コンポーネント：SUNBRIGHT PTE-100NP=2：1）で
結合させた後、Hub-antigen に結合させた。これに第 1 節で調製した SIVmac239
gp140(R512E, K523E)を混合し、室温で 5 時間攪拌して、HMV とした。HMV は、
透析外液 PBS(-)で 24 時間透析後、透析外液を 5 mM NiSO4 に変えて 4℃で 6 時間
透析を行った。次に透析外液を脱イオン水に変えて 4℃で 24 時間透析後、凍結
乾燥した。
13
第4節
考察
通常、ENV は宿主細胞により gp160 として合成された後、宿主細胞由来のプロ
テアーゼである furin により gp120 と gp41 に切断され
48)
、非共有結合により
gp120/gp41 三量体を維持するが、その結合は脆弱である。そこで、HMV に結合
させる ENV は、gp160 の furin 切断部位に 2 ヶ所のアミノ酸置換を導入し、furin
切断を受けずに ENV 複合体の三量体構造を維持させた 49-51)。さらに、gp160 の状
態で発現させると gp41 の膜貫通領域が含まれるため 50)、Vero 細胞膜に貫通して
発現するので、gp120 と gp41 の ectodomain までを gp140 として発現させた。本
方法により作製した SIVmac239 gp140(R512E, K523E)は、三量体構造を有したま
ま Vero 細胞から分泌されていることが SDS-PAGE、Western blotting、BN-PAGE
により確認された。
HMV に結合させた cDDR5 は、アカゲザル CCR5 の UPA 部分が環状化しているこ
とが MALDI TOF-MS により確認され、HMV はウイルス ENV および宿主側 CCR5 の立
体構造を模倣した多価抗原であることが証明された。本章において調製した HMV
は、将来的に HIV の初発感染部位である粘膜面で効果を発揮するワクチン抗原
を目指しており、付加的に結合させた TGDK および CpG ODN が粘膜ワクチンとし
ての効果を発揮するものと考えられる。
14
第3章
アカゲザルを用いた HMV の免疫原性の評価
HIV が発見されて約 30 年、霊長類を用いた多くの研究がなされてきたが、未
だ有効なワクチンは開発されていない。多くのワクチン戦略が、臨床試験を含
めて評価されてきたものの、現時点で最大の成功は 2009 年にタイで実施された
感染予防率約 30%のワクチンである 7)。しかしながら、約 30%の感染予防率では
短時間で粘膜を通過し 15-17）、変異を繰り返しながら増殖していく HIV を完全に
抑止することはできないと考えられる。
一方で、臨床の場において自然に HIV に感染抵抗性を示す ESNs の存在が知ら
れているにも関わらず、ウイルス ENV と CCR5 に対する抗体を同時に誘導すると
いう試みはなされていない。両抗体をワクチンによって同時に誘導することが
できれば、ウイルスがワクチンによって誘導される宿主免疫応答から逃れるこ
となく、HIV 感染を強く防止できるワクチンを開発できる可能性がある。特に
ESNs にみられるように膣内に両抗体を誘導できれば、初発感染を防止できる新
規の有効なワクチン戦略となりうると考えている。
本研究では、ESNs の HIV に対する免疫機構に学び、霊長類を用いてウイルス
ENV と CCR5 に対する抗体を同時に動物モデルで誘導することを試みた。本章で
は、前章で作製した HMV が戦略的に ESNs の免疫応答を模倣して、ウイルス ENV
と CCR5 に対する抗体を同時に誘導することが可能であるかを検討するため、ア
カゲザルの鼠径部に HMV を皮下免疫し、免疫後に得られた抗血清を用いてウイ
ルス ENV と CCR5 に対する抗体を解析した。
15
第1節
アカゲザルへの免疫
前章で調製し凍結乾燥した HMV を、PBS(-)で再懸濁し、10 mg /body で 3 例の
アカゲザル（免疫群：動物番号 4∼6）の左右鼠径部に皮下投与した。対照群に
は Hub-antigen のみを対照抗原として、3 例のアカゲザル（対照群：動物番号 1
∼3）に同様に間歇皮下投与した。HMV 免疫群、対照群ともに 0、1、6 週目に投
与する免疫スケジュールとした(Fig. 5)。全動物より初回投与前に血清を採取
しておき、1、2、4、6、7、8、9、10 週目で血清を採取した。その後も継続して
経時的に血清を採取した。なお、HMV の投与によって症状観察、体重推移に変化
はみられなかった(data not shown)。
Immunization schedule
Fig. 5
第2節
Immunization schedule for rhesus monkeys
抗血清の抗体価
前節で得られた血清中抗体のウイルス ENV および cDDR5 に対する反応性を確
認するため、cDDR5 を結合させた Multi-Pin ELISA (cDDR5-coupled-multipin
ELISA)および ELISA プレートに AB-NTA 介して SIVmac239 gp140(R512E, K523E)
を固相化した抗 ENV-ELISA を行った。得られた血清は、100 倍希釈してそれぞれ
の ELISA の一次抗体とした。二次抗体は POD-conjugated goat anti-monkey IgG
を用いて、主波長 450 nm、参照波長 630 nm の吸光度を測定した。
cDDR5-coupled-multipin ELISA の結果、免疫群の血清は 7 週目から明らか
な抗体上昇を示した(Fig. 6A)。一方、抗 ENV-ELISA の結果、免疫群の血清は 2
週目から抗体上昇を示し、10 週目でも高い抗体価を維持していた。以降、ウイ
16
ルス ENV に対する抗体を継続してモニタリングしたところ、少なくとも 48 週
間抗 ENV 抗体が維持されていることが確認された(data not shown)。なお、い
ずれの ELISA 法においても、対照群の抗体上昇は認められなかった(Fig. 6）。
したがって、アカゲザルにおいて、ウイルス ENV と CCR5 に対する抗体は HMV を
免疫することで同時に誘導できることが確認できた。
17
A
cDDR5-specific Abs
Fig. 6
Anti-cDDR5 and
gp140 Ab responses of
postimmunization sera
Sera (1/100 dilution) obtained
after immunization with HMV
(Nos. 4 ‒ 6) or control Ag
(Nos. 1‒ 3) were examined
by
B
ENV-specific Abs
cDDR5-coupled-multipin
ELISA
(A)
and
anti-ENV
ELISA (B, C) to investigate
whether the anti-cDDR5 and
anti-ENV Ab can be raised.
C
ENV-specific Abs
18
第3節
抗血清の中和活性
前節で得られた血清中抗体が、SIVmac239 に対する中和活性を有しているかを
評価するため、in vitro で MAGIC-5 assay52)を行った。MAGIC-5 assay に用いる
MAGIC-5 細胞は、HeLa 細胞に HIV-1 LTR-β-gal plasmid をトランスフェクショ
ンし、また CD4 発現レトロベクターを感染させることで得られた MAGI 細胞に、
CCR5 を発現させるために pEFBOSbsrHuCCR5 をトランスフェクションし、クロー
ニングした細胞である。MAGIC-5 細胞は HIV あるいは SIV が感染し、ウイルスゲ
ノムが組み込まれると、ウイルスの転写が活性化され、LTR 下流に lac Z がコー
ドされたβ-ガラクトシダーゼが発現する。β-ガラクトシダーゼを発現した細
胞は X-gal を分解し、核が青色を呈するため、HIV あるいは SIV の感染の有無を
可視的に識別することができる。
本実験において、MAGIC-5 細胞にウイルス曝露する際、温度溶出型 Protein A
である Byzen Pro で精製した血清中 IgG を混合し、その中和活性を評価した。
免疫群の動物番号 6、対照群の動物番号 3 の血清中 IgG を用いて MAGIC-5 assay
を実施したところ、動物番号 6 ではウイルス液に混合した抗体濃度に依存して
SIVmac239 の感染を阻害し、10 µg/mL で高い中和活性があることが確認された
(Fig. 7）。動物番号 3 では抗体濃度 10 µg/mL まで中和活性は確認されなかった
（Fig. 7）
。なお、動物番号 6 の血清中 IgG にみられた中和活性は、SIVmac239
以外のいくつかの SIV 株(SIVsmH4MC、SIVsmE660）に対しても同様の結果が得ら
れ(data not shown)、HMV の免疫によって広域中和能を有する抗体が誘導されて
いると考えられた。
19
*
**
Antibody concentration (µg/mL)
Fig. 7
Inhibitory effects of postimmunization sera on SIVmac239 infection
Antiviral activities of purified 7-wpim-serum IgGs from #3 and #6 macaques were
analyzed by MAGIC-5 assay. The number of blue cells is expressed as %
relative to the number of blue cells in the preimmunization serum (control) for
each Rhesus macaque. Values are means of triplicate determinations.
*P< 0.05 and **P< 0.01 by Mann-Whitney U-test.
第4節
血清中 IgG の特異性確認
前節で確認された中和活性は、抗 ENV 抗体と抗 CCR5 抗体の両抗体の効果によ
るものと推測される。そこで本節では、この二つの抗体のうち、抗 CCR5 抗体が
どの程度中和活性に寄与しているのかを検討した。従来 Protein A による抗体
精製は酸による溶出であり、抗体の力価を落とさずに精製することが難しかっ
たが、今回、温度溶出型 Protein A Byzen Pro を用いたマイルドな条件で抗体
画分を精製していることから、抗体価に可能な限り影響がないように配慮し、
ウイルスに対する中和活性を明らかにすることに努めた。まず、免疫群の動物
番号 6、対照群の動物番号 3 の血清中 IgG を Byzen Pro で精製し、PBS(-)で
20
100 µg/mL に調製した。
cDDR5 を結合させた Multi-Pin に 7 回反応させることで、
各血清中 IgG から抗 cDDR5 抗体を除去した。抗 cDDR5 抗体が除去されているこ
とを、cDDR5-coupled-multipin ELISA で確認した(Fig. 8A)。動物番号 3 の 0
週目(投与前)及び 7 週目の血清から得られた血清中 IgG、ならびに動物番号 6 の
0 週目(投与前)の血清から得られた血清中 IgG では除去作業を繰り返しても変化
はなかったが、動物番号 6 の 7 週目の血清から得られた血清中 IgG は除去回数
を重ねるごとに抗 cDDR5 抗体の反応が減少し、7 回目除去後には動物番号 3 の抗
体価と同程度になった(Fig. 8A）
。また、動物番号 3 のおよび動物番号 6 の 7 週
目の血清から得られた血清中 IgG と 7 回抗 cDDR5 抗体除去処理終了後の血清中
IgG を用いて、MAGIC-5 assay を行い、SIVmac239 に対する中和活性を評価した
（Fig. 8B）
。動物番号 3 の血清中 IgG では中和活性が見られないものの、動物
番号 6 の血清中 IgG では除去前の中和活性が約 80%から、除去後の約 50%に低下
した（Fig. 8B）。したがって、HMV を免疫したアカゲザルで誘導された血清中
IgG の中和活性は、抗 CCR5 抗体による活性だけでなく、抗 ENV 抗体も中和活性
を発揮していることが確認できた。
21
Fig. 8
B
MAGIC-5 assay
7th
6th
5th
4th
3rd
2nd
cDDR5-coupled multipin ELISA
1st
A
Specificity of postimmunization sera
0- and purified 7-wpim-serum IgGs from #3 and #6 macaques were selectively
depleted of Abs that bound to cDDR5-coupled multipins. The Ab titers against
cDDR5 and antiviral activities were measured by cDDR5-coupled multipin ELISA
(A) and MAGIC-5 assay (B). Values are means of triplicate determinations.
*P< 0.05 and **P< 0.01 by Student’s t-test.
第5節
考察
本研究では、HMV をアカゲザルの鼠径部に皮下投与することにより、ESNs 同
様、ウイルス ENV および CCR5 に対する抗体を血清中に同時に誘導できた。さら
に、HMV を免疫したアカゲザル由来の抗血清中 IgG は SIVmac239 に対する中和活
性を有しており、本知見は、ウイルス ENV に対する抗体と、CCR5 に対する抗体
の両方による効果であった。HMV は、実際のウイルス表面の ENV の糖鎖修飾を考
慮して、三量体組換えタンパク質として Vero 細胞に発現させたタンパク質を結
合させており、また SIV の感染に重要と考えられる CCR5 由来の UPA の立体構造
を模倣したペプチドを結合させたことで、in vitro において高いウイルス中和
22
抗体を誘導できたと考えられる。
HMV の免疫よって戦略的に構築された ESNs と同様の免疫応答は、in vivo に
おいても高いウイルス中和活性を期待できる。ESNs の血中や膣内には、ウイル
ス ENV 対する抗体の存在が知られており
31−32）
、さらに、男性 ESNs では、尿道
でのウイルス ENV 特異的 IgA 量が多いことが確認されている 53)。特に gp41 に対
する IgA および CD4-gp120 complex の立体構造エピトープを持つ IgG は、遺伝
的な地域差を超えてアジアおよびヨーロッパ両方の ESNs で確認されており、ウ
CCR5 に対する抗体も ESNs
イルス抵抗性に重要であると考えられている 54)。また、
の血中、唾液および膣粘液中に存在していることが知られている 30）。CCR5 に対
する抗体は、ウイルスの侵入を競合阻害する以外にも、CCR5 を down-modulation
してウイルスの侵入を阻害していることが分かっている 29）。これらのことは、
ESNs にみられるウイルス ENV および CCR5 に対する抗体の同時誘導が、HIV に対
する自然抵抗性に大きく寄与していることを示している。
本研究により HMV によって、
ESNs 同様にアカゲザルでウイルス ENV および CCR5
に対する抗体を同時に誘導できたが、伝播速度が速い HIV を防御するには、日
常的な抗原曝露によってウイルスが侵入する前に ESNs にみられる免疫応答を維
持しておくことが重要と考えられる。このワクチン戦略を支持する事例として、
safe sex によりウイルスの曝露を受けなくなった ESNs では血漿中の HIV 特異的
IgA 量が減少し 55)、また HIV 特異的 CTL 応答が弱まった ESNs は HIV 陽性に転じ
たこと 56)が報告されている。本研究では，ESNs の日常的なウイルス抗原曝露を
模倣するために、ウイルス ENV および CCR5 に対する抗体を同時誘導できる交叉
免疫抗原の探索を行った。
23
第4章
Bovine alpha-2-HS-glycoprotein（bAHSG）による
交叉免疫効果
一般的なワクチンでは、基礎免疫の後、誘導された抗体量は一定期間を経て
徐々に減少し、免疫担当細胞もメモリー状態に移行してしまう。再度、同抗原
による曝露を受けてもメモリーB 細胞が再活性化してウイルスの中和に要する
抗体が十分産生されるまでには数時間を要し、30∼60 分で標的細胞へ吸着・侵
入してしまうと予測されている HIV の感染を完全に防御することは困難である
と思われる。一度 HIV 感染が成立すると、HIV は免疫系を崩壊していくため生体
からの排除は困難であることが判っている。そこで私は、ウイルスが侵入する
前に抗体を準備しておくことが重要と考え、本研究では HMV で誘導したウイル
ス ENV および CCR5 に対する抗体産生 B 細胞を再活性化する交叉免疫抗原の探索
を行った。交叉免疫の概念は、ワクチンの歴史から学ぶところが多く、ジェン
ナーが牛痘を天然痘に応用した例はあまりにも有名である。また、BCG ワクチン
接種後に、日常的に結核菌以外の非結核性好酸菌に曝されることで結核に対す
る抵抗性が持続することもよく知られている。
本研究において、前章における HMV 免疫アカゲザルに、ウイルス ENV が含ま
れない HMV(ENV 以外はすべて含まれた抗原）を投与してもウイルス ENV に対す
る抗体が上昇するという現象を確認した。そのため、SIVmac239 gp140(R512E,
K523E)の調製過程における Vero 細胞培養上清中に交叉免疫抗原となりうる成分
が含まれている可能性があると考え、Vero 細胞培養上清成分について、HMV に
対する抗血清を用いた Western blotting、または二次元電気泳動および MS 分析
するプロテオーム解析を行い、HMV に対する抗血清が反応する因子を bAHSG と同
定した。本章では、この bAHSG が交叉免疫抗原になりうるかを、HMV を免疫した
アカゲザルに追加免疫して検討した。
24
第1節
bAHSG による追加免疫
前章において HMV あるいは Hub-antigen を皮下免疫したアカゲザル全例に、
プロテオーム解析により見出した bAHSG を 1 mg/body で左右鼠径部に皮下投与
した。追加免疫は、ウイルス ENV および cDDR5 に対する血清中抗体の反応性が
みられなくなった 106 週目に行い、
追加免疫後 1 週目(107 週目)および 2 週目
（108
週目）に血清を採取した(Fig. 9)。
追加免疫後に得られた血清から、Byzen Pro を用いて IgG を精製し、100 µg/mL
に な る よ う に PBS(-) で 希 釈 後 、 cDDR5-coupled-multipin ELISA お よ び 抗
ENV-ELISA によってウイルス ENV および cDDR5 に対する反応性を確認した。二次
抗体は POD-conjugated goat anti-monkey IgG を用いて、主波長 450 nm、参照
波長 630 nm の吸光度を測定した。cDDR5-coupled-multipin ELISA および抗
ENV-ELISA ともに、免疫群の血清は追加免疫後 1 週目(107 週目)から抗体上昇し
プラトーに達した。また、その抗体価は HMV で基礎免疫後ピークに達した 10 週
目の値に近い値を示した。なお、いずれの ELISA 法においても、対照群の抗体
上昇は認められなかった(Figs. 9A and 9B)。したがって、HMV で基礎免疫した
アカゲザルにおいて、bAHSG は交叉免疫効果があることが示された。
また、追加免疫後 2 週目（108 週目）の動物番号 6 の血清を用いて、NIH AIDS
Reagent Programより提供を受けたrecombinant SIVmac239 gp130 に対する反応
性をwestern blottingで確認したところ、130 kDaの位置にバンドが確認できた
(Fig. 9C）
。
25
A
HMV-immunized group
Control group
0
10
106 107
Weeks
108
B
HMV-immunized group
Control group
0
10
106 107
Weeks
108
C
(kDa)
Fig. 9
175
Booster effect of bAHSG
Three HMV-immunized macaques (nos. 4-6) and
80
control Ag-immunized macaques (nos. 1-3) were
58
inguinally administered 1 mg of bAHSG.
46
The
30
induction of anti-ENV and Anti-CCR5 Abs in sera
25
was analyzed by anti-ENV Ab ELISA (A) and
108 wpim
antiserum
cDDR5-coupled-multipin ELISA (B).
The activity
of bAHSG-boosted antisera at 108 wpim was
analyzed by western blotting with SIVmac239
gp130 (5 µg) (C).
26
第2節
考察
プロテオーム解析によって見出された交叉免疫抗原候補物質 bAHSG は、HMV
で基礎免疫したアカゲザルに追加免疫することにより、ウイルス ENV および CCR5
に対する抗体を再誘導することができた。HMV の基礎免疫では、ウイルス ENV に
対する抗体上昇が 2 週目から、CCR5 に対する抗体上昇が 7 週目からみられてい
たが、bAHSG の追加免疫後 1 週目（107 週目）から抗体上昇がみられた。さらに、
bAHSG による追加免疫は、Hub-antigen で基礎免疫した対照群にも行っており、
対照群では追加免疫後 2 週目（108 週目）でも変化がみられなかった。これらの
ことは、bAHSG による追加免疫効果により HMV 基礎免疫により作られたメモリー
B 細胞を再活性化していることが示唆された。興味深いことに、HMV 免疫アカゲ
ザルに TGDK のみを結合させた Hubantigen を追加免疫しても、ウイルス ENV お
よび CCR5 に対する抗体の再上昇は認められなかった(data not shown)。したが
って、交叉免疫は HMV に結合したいずれかの抗原によって誘導されるわけでは
なく、bAHSG が持つ有用な特性であることを示唆している。
現時点では、bAHSG による交叉免疫効果の詳しいメカニズムは明らかではない。
bAHSG は 1944 年に肝臓由来の血中タンパク質として発見されており、ウシの血
清中にアルブミンより多く存在する 57）。その後、同様の物質がヒトでも発見さ
れ alpha-2-HS-glycoprotein/fetuin-A と命名されており 58）、血中でミネラルや
遊離脂肪酸の主要なキャリアーとして働いていることが確認されている
59）
。
bAHSG やヒトの fetuin-A は、
Cystatin-like domain を含んだ構造を有しており、
多くの糖鎖修飾を受けるタンパク質であるが、未だその全容は明らかではない
(Fig. 10)59）。bAHSG の一次配列をウイルス ENV 一次配列と比較すると、相同性
は高くなく(Fig. 11)、bAHSG にみられた交叉免疫誘導効果は、糖鎖修飾を含め
た立体構造特異的なエピトープの類似性により発揮されたものであるかもしれ
ないと推測された。今後、bAHSG の結晶構造解析等により、その追加免疫機構を
明らかにしていく必要がある。
27
Fig. 10
Cartoon of human fetuin-A
Fetuin-A showing cystatin-like domains 1 and 2 and a third unrelated domain in
green, yellow, and blue shading, respectively. The cotranslational and
posttranslational
modifications
disulfide
bridges
(C-C
in
yellow)
Ser-phosphorylation sites (S in red), protease-sensitive sites (R-K, dibasic
tryptic cleavage site; L-L, chymotryptic cleavage site; R-T, furin-sensitive
cleavage site; all in green), allelic variants (T230/T238; M230/S238) depicted as
orange asterisks, and Asnlinked complex N-glycosylation sites, and Ser/Thr
O-glycosylation sites depicted as blue symbols, respectively.
28
Fig. 11
Alignment of bAHSG and SIV ENV
29
第 5 章
カニクイザルを用いた TGDK-Hubantigen-bAHSG (THbA)の
免疫原性の評価
前章において交叉免疫誘導能が示唆された bAHSG の免疫原性を確認するため、
bAHSG を TGDK とともに Hub-antigen に結合させた THbA を用いて、naive なカニ
クイザルへ皮下免疫した。TGDK は将来的に粘膜免疫に応用することを考慮して
用いた。
第1節
THbA のカニクイザルへの免疫
Hub-antigen (168 mg)に TGDK (12 µmol)と bAHSG (50 mg)を結合させ、THbA
とした。得られた THbA を透析後、凍結乾燥した。凍結乾燥した THbA を PBS(-)
で再懸濁し、5.4 mg/body (bAHSG として 1 mg/body)で 3 例のカニクイザル(免
疫 群 ： 動 物 番 号 4 ∼ 6) の 左 右 鼠 径 部 に 単 回 皮 下 投 与 し た 。 対 照 群 に は
Hub-antigen のみを対照抗原として、3 例のカニクイザル（対照群: 動物番号 1
∼3）に同様に単回皮下投与した(Fig. 12)。全動物より投与前に血清を採取し
ておき、4、8、10、12、14 週目で血清を採取した。なお、THbA の投与によって
症状観察、体重推移に変化はみられなかった(data not shown)。
Immunization schedule
TGDK
Hub
bAHSG
TGDK-Hubantigen-bAHSG (THbA)
Fig. 12
Immunization schedule for cynomolgus monkeys
30
第2節
血清中 IgG の抗体価
THbA の免疫後に得られた血清から、Byzen Pro を用いて IgG を精製し、
100 µg/mL に な る よ う に PBS(-) で 希 釈 後 、 抗 ENV-ELISA お よ び
cDDR5-coupled-multipin ELISA によってウイルス ENV および cDDR5 に対する反
応性を確認した。二次抗体は POD-conjugated goat anti-monkey IgG を用いて、
主波長 450 nm、参照波長 630 nm の吸光度を測定した。cDDR5-coupled-multipin
ELISA および抗 ENV-ELISA ともに、免疫群の血清は 4 週目から有意な抗体上昇
を示した。なお、いずれの ELISA 法においても、対照群の抗体上昇は認められ
なかった(Fig. 13)。したがって、THbA で免疫したカニクイザルでは交叉免疫誘
導が起こり、ウイルス ENV および CCR5 に対する抗体が同時に誘導されることが
示された。
A
Fig. 13
B
Anti-ENV Ab titer
Anti-CCR5 Ab titer
Immunogenicity of THbA
Serum IgG (100 µg/mL) obtained after immunization with THbA or control Ag
were examined by anti-ENV ELISA (A) and cDDR5-coupled-multipin ELISA (B)
to investigate whether the anti-ENV and anti-cDDR5 Abs can be raised.
*P < 0.05 and **P < 0.01 by ANOVA and Dunnett’s test.
31
第3節
血清中 IgG の立体構造認識
前節で抗体誘導が確認された血清中 IgG が、細胞表面で発現する native な ENV
および CCR5 に結合するかどうかを検討するために、SIVmac239 が持続感染して
ENV を発現している SIVmac239/CEMx174 細胞と、カニクイザル CCR5 が発現して
いる HSC-F 細胞を用いて flow cytometry を行った。
murin anti-SIVmac251 gp130 Ab を SIVmac239/CEMx174 細胞と、あるいはマ
ウスから作製した CCR5 に対する抗体である K8 精製抗体を HSC-F 細胞と反応さ
せた後、一次抗体として動物番号 2 あるいは 5 の精製 IgG（0 週目と 4 週目）
を 100 µg/mL で 30 分 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 二 次 抗 体 と し て
FITC-conjugated anti-monkey IgG を反応させ、細胞に感染している SIV を固定
化するため cold PBS(-)を添加した直後に 2% paraformaldehyde in PBS(-)を添
加し、1 時間 4℃でインキュベートした。最後に細胞を Washing buffer で洗浄
し、500 µL の Washing buffer で再懸濁後、FACS 解析(Beckman Coulter)を行っ
た。その結果、動物番号 5 の 4 週目由来血清中 IgG が SIVmac239/CEMx174 細胞
に発現する SIVmac239 と HSC-F 細胞に発現する CCR5 を認識してピークが現れ、
かつ murin anti-SIVmac251 gp130 Ab あるいは K8 精製抗体によって結合が阻害
されピークが左にシフトした。動物番号 2 の血清由来 IgG および動物番号 5 の
0 週目由来血清中 IgG では、細胞表面の SIVmac239 と CCR5 に反応しなかった
（Figs. 14A∼D）
。
さらに、血清中 IgG の ENV あるいは CCR5 に対する特異性を確認するため、前
処理として動物番号 2 あるいは 5 の精製 IgG（0 週目および 4 週目）を各細胞と
30 分間プレインキュベート後、一次抗体として murin anti-CXCR4 Ab あるいは
murin anti-CD4 Ab を反応させた。二次抗体として PE-labeled anti-mouse IgG
を反応させ、細胞に感染している SIV を固定化するため cold PBS(-)を添加した
直後に 2% paraformaldehyde in PBS(-)を添加し、1 時間 4℃でインキュベート
32
した。最後に細胞を Washing buffer で洗浄し、500 µL の Washing buffer で再
懸濁後、FACS 解析(Beckman Coulter)を行った。その結果、動物番号 2 および 5
の血清由来 IgG は、murin anti-CXCR4 Ab あるいは murin anti-CD4 Ab による
CXCR4 および CD4 の認識を阻害しなかった（Figs. 14E∼H）。これらの結果は、
THbA によって誘導された抗体が、細胞表面で発現する naive な分子の立体構造
を特異的に認識していることを示している。
A
E
Fig. 14
anti-gp130 Ab+#2-4w
B
anti-gp130 Ab+#5-4w
C
anti-CCR5 Ab+#2-4w
D
anti-CCR5 Ab+#5-4w
#2-4w
#5-4w
#2-4w
#5-4w
#2-0w
#5-0w
#2-0w
#5-0w
#2-4w+anti-CXCR4 Ab
F
#5-4w+anti-CXCR4 Ab
G
#2-4w+anti-CD4 Ab
H
#5-4w+anti-CD4 Ab
anti-CXCR4 Ab
anti-CXCR4 Ab
anti-CD4 Ab
anti-CD4 Ab
Isotype control
Isotype control
Isotype control
Isotype control
Inhibition of binding of postimmunization sera
Inhibition of binding of 4-wpim-serum IgG from #2 or #5 macaques to
SIVmac239-infected CEMx174 or HSC-F cells by anti-gp130 (A and B) or
anti-CCR5 Ab (C and D) was analyzed by flow cytometry. Inhibition of binding
of anti-CXCR4 (E and F) or anti-CXCR4 Ab (G and H) to SIVmac239-infected
CEMx174 or HSC-F cells by 4-wpim-serum IgG from #2 or #5 macaques was
also examined.
33
第4節
血清中 IgG の中和活性
第 1 節で抗体誘導が確認された血清中 IgG が、SIVmac239 に対する中和活性を
有しているかを評価するため、in vitro で MAGIC-5 assay を行った。
本実験において、MAGIC-5 細胞にウイルス曝露する際、Byzen Pro で精製した
血清中 IgG を混合し、その中和活性を評価した。免疫群の動物番号 5、対照群の
動物番号 2 の血清中 IgG を用いて MAGIC-5 assay を実施したところ、動物番号 5
の 4 週由来の血清抗体は、動物番号 2 の 4 週由来の血清抗体と比べ SIVmac239
の感染価を約 20%にさせた(Fig. 15）。なお、動物番号 5 の血清中 IgG にみられ
た中和活性は、SIVmac239 以外のいくつかの SIV 株（SIVsmH4MC、SIVsmE660）に
対しても同様の結果が得られ(data not shown)、THbA の免疫によって広域中和
能を有する抗体が誘導されていると考えられた。
MAGIC-5 assay
Fig. 15
Inhibitory effects of postimmunization sera on SIVmac239
infection
The antiviral activities of 4-wpim-serum IgGs from #2 and #5 macaques were
measured by MAGIC-5 assay.
Values are means of triplicate determinations.
**P< 0.01 by Student’s t-test.
34
第5節
考察
THbA をカニクイザル鼠径部に皮下投与することにより、ESNs 同様にウイルス
ENV および CCR5 に対する抗体を同時に誘導することができ、これらの抗体は
SIVmac239 に対する中和活性も有していることが示された。Flow cytometry で
使用した murin anti-SIVmac251 gp130 Ab のエピトープは不明であるが、murin
anti-CCR5 Ab は CCR5 の UPA をエピトープとしていることから、THbA で誘導さ
れた血清中 IgG は CCR5 の UPA をエピトープの 1 つとしているか、競合させた抗
体との立体的な障害により CCR5 と結合できなかった可能性が考えられる。THbA
の交叉免疫機構は明らかになっていないが、前章で述べたように bAHSG の糖鎖
修飾を受けた立体構造がエピトープとなって、交叉免疫効果を発揮し、in vitro
において高いウイルス中和抗体を誘導できたと考えられる。
本研究において、THbA はウイルス ENV および CCR5 に対する交叉免疫抗原であ
ることが確認されたため、今後 ESNs にみられる免疫応答を粘膜面にうまく模倣
し、それを維持することが課題である。ESNs においても、日常的なウイルス曝
露のリスクが減ることにより、HIV 特異的な免疫応答が低下し、感染抵抗性がな
くなることが言われている
54-55)
。本研究では当初より粘膜免疫を念頭において
THbA に TGDK を結合させており、THbA の経鼻投与や経口投与により M-cell を介
した粘膜免疫応答も誘導できると考えている。また、THbA に結合させた bAHSG
はウイルス ENV と CCR5 に交叉免疫原性があることから、bAHSG を食事等により
日常的に摂取することによって、THbA で誘導される免疫応答を維持することが
可能であると考えられる。今後、粘膜免疫に関する新たな知見を応用し、THbA
によるより効率的な粘膜免疫の誘導を試みたいと考えている。
最終的に、THbA による粘膜免疫を達成した場合、サルにおいて in vivo 経膣
感染モデルでウイルス中和活性を評価しなければならないが、ヒトにおける経
膣感染を模倣しているモデルは十分確立されていない。ヒトでの HIV 経膣感染
は、free virus とともに精液や感染細胞を含む状態で曝露されており、また HIV
35
と精子が相互作用し精子がウイルスのキャリアーになっているだろうというこ
とから 60)、霊長類の経膣感染モデルにおいても、ウイルス曝露量、曝露回数に加
え、曝露するウイルス液に精子や感染細胞を混在させるかが議論の的である
61)
。
本研究では、粘膜ワクチンの in vivo 評価系として霊長類の経膣感染モデルに
ついても検討を進めている。
まとめると、bAHSG はウイルス ENV および CCR5 に対する抗体を同時に誘導で
きる交叉免疫抗原であり、TGDK および Hub-antigen と結合させた THbA は ESNs
の免疫応答を模倣したワクチン効果を示すことが確認できた。また、bAHSG を日
常的に摂取することで ESNs にみられる免疫応答を維持できるという可能性を与
えた。今後、bAHSG および THbA を交叉免疫抗原として粘膜免疫に応用し、霊長
類での経膣感染モデルによって評価することで、新規のエイズワクチンを開発
することが可能であると考えられる。
36
第6章
総括
本研究では、以下のことを明らかにした。
1．HMV によるウイルス ENV および CCR5 に対する抗体の同時誘導能
Hub-antigen に立体構造及び糖鎖修飾を模倣したウイルス ENV および CCR5
を結合させ、さらに M-cell 標的分子 TGDK と CpG ODN を結合させた HMV を作
製した。HMV をアカゲザル左右鼠径部へ皮下投与することにより、ウイルス
ENV および CCR5 を認識する抗体（血清中 IgG）
を同時に誘導することができ、
これらの抗体は in vitro でウイルス中和活性を有することが確認された。
2．bAHSG の追加免疫効果
HMV で基礎免疫されたアカゲザルへ、非病原性抗原である bAHSG を追加免
疫することにより、ウイルス ENV および CCR5 に対する液性免疫応答を再活
性化することが確認された。糖鎖構造を含めた bAHSG の立体構造がエピトー
プとなって、交叉免疫原性を発揮していると推測された。
3．THbA の交叉免疫原性
Hub-antigen に bAHSG と TGDK を結合させた THbA を作製した。THbA をカニ
クイザル左右鼠径部へ皮下投与することにより、ウイルス ENV および CCR5
を認識する血清中 IgG を同時に誘導することができ、これらの抗体はウイル
ス中和活性を有することが確認された。
以上から、bAHSG はウイルス ENV および CCR5 に対する抗体を同時に誘導でき
る交叉免疫抗原であり、TGDK および Hub-antigen と結合させた THbA は ESNs の
免疫応答を模倣したワクチン効果を示すと考えられた。また、bAHSG を日常的に
37
摂取することで ESNs にみられる免疫応答を維持できるという可能性を与えた。
本研究における結果は、ESNs にみられる粘膜免疫防御を模倣した新規のエイズ
ワクチンを開発する上で、有用な知見を与えると考えられる。
38
第7章
実験の部
培養細胞
Vero 細胞は 10% FCS を含む EMEM 培地、MAGIC-5 cell は CD4 の発現を維持す
るために puromycin（1 mg/mL）入りの 2.5% FCS を含む DMEM 培地、SIV 感染し
た CEM×174 およびカニクイザル由来のリンパ系・血球細胞である HSC-F は 10%
FCS を含む RPMI 培地を用いて培養した。各々の細胞は 37℃、5% CO2 存在下にお
いて tissue culture flask 内で対数増殖期(2.0×105∼1.0×106 cells/mL)の範
囲で継代培養を行った。なお、細胞濃度は trypan blue 染色法により、生細胞
数と死細胞数をカウントして求めた。
実験動物
雌アカゲザル（4∼6 才齢）は、中国（繁殖場：Guangdong Zhaoqing Laboratory
Animals Research Center、Xiangang、Gaoyao City、Guangdong、China、輸入
元：Guangdong Scientific Instruments & Materials Import/ Export Corporation、
434、Yuexiu Road、Guangzhou、China）より購入した。雌カニクイザル（4∼6
才齢）は、中国（繁殖場および輸入元：Guangxi Grandforest Scientific Primate
Company, Ltd.、537300、Dayiling Ping Nan County Guangxi、China）より購
入した。購入後、検疫し、株式会社新日本科学にて飼育した。
血清
サルの大腿静脈から採血し、室温で 20∼60 分間静置後、遠心分離して血清を
得た。
39
第 2 章に関する実験
2.1
gp140
gp140 は三量体構造と糖鎖修飾を模倣するために、Vero 細胞で発現させた組
換え gp140 として作製した。
まず、感染性 SIVmac239 の DNA クローン（pMA293HS）を元に SIVmac239 gp140
の遺伝子配列を blunt-end PCR で増幅し、pT7Blue に組込んだ。この construct
中の gp140 の配列は、669 番目の Lys までを含み 5’側に Kozak 配列、3’側に Bgl II
site を PCR の段階で付加させている（ENV gp140 F-kozak；
5’-ACCACCATGGGATGTCTTGGGAATCA-3’,
ENV
gp140
R
Bgl
II
；
5’-AGTCAGATCTCTTTATCCAAGAAGCAAGGTCAAA-3’）。
次に、gp41 から gp120 が解離するのを防ぎ三量体を形成させるため、
pT7Blue-SIVmac239 gp140 construct 中で、furin cleavage sites である 512
番目の Arg と 523 番目の Lys を Glu へ変異させた。Xba I と Bgl II で切断後、
得られた DNA フラグメントを Xba I/Bgl II double-digested pCMV-FLAG-MAT-2
vector にクローニングした。
最後に、FLAG と MAT 配列を含んだ配列を PCR（Primer FM-F；
5’-AGAGCTCGTTTAGTGAACCGT-3’，Primer FM-R；5’-TTACTATTAGTGCTTGTGGCGGTG-3’）
で増幅し、得られた PCR 産物を Asc I で切断して、Asc I で切断したフラグメン
トを pERK vector に組込んだ。RNA の調製の際には、pERK vector に組み込んだ
gp140 の DNA を Not I で切断して直線 DNA にし、フェノール・クロロホルム抽
出して Ambion mMESSAGE mMACHINE T7 kit を用いて RNA に転写した。この RNA
（14 µg）を electroporation によって 1.2×107 cells の Vero 細胞にトランス
フェクトし、72∼144 時間後に培養上清を回収した。
培養上清中の可溶性 gp140 を、MW cut-off 100,000 の Spectra pore（Spectrum
Laboratories, Inc.）を用いて透析外液を PBS(-)で、4℃、48 時間透析した。
透析後に、透析膜をキムワイプで保護して重しを乗せて 4℃で濃縮した。透析内
40
液の PBS(-)が少量になったら、新たに PBS(-)を加えて濃縮するという操作によ
り SIVmac239 gp140(R512E, K523E)を精製・濃縮した。
2.2
HMV の合成
Hub-antigen、cDDR5、TGDK は増山らが作製した方法
47)
に従って調製した。
Hub-antige は、
SUNBRIGHT HGEO-200NP (NOF Corporation)に 7.2 倍量の SUNBRIGHT
HGEO-200PA (NOF Corporation)を DMF（N, N-dimethylformamide）中で 16 時間
混合後、MW cut-off 12∼14 kDa の透析バッグ（Spectrum Laboratories）を用
いて、透析外液を脱イオン水で 2 日間透析し、凍結乾燥した。
cDDR5 は、直鎖 decapeptide (H2N-KRSQREGLHYTG-COOH)を Fmoc chemistry で
合成し、得られた側鎖保護直鎖ペプチドの C 末端 Gly のカルボキシル基と N 末
端 Lys のアミノ基を酸アミド結合により縮合し環状化した。環状側鎖保護
dodecapeptide は常法に従い、脱保護操作を行うことにより調製した。
TGDK は、(Fmoc)4-D-MAP-ethylendiamine-Trt-resin に 20% piperidine を含む
DMF を加えて Fmoc を脱保護し、DMF で洗浄後、3,4,5-trimethoxybenzoic acid
chloride と Triethylamine (TEA)中で 40℃、120 分間撹拌した。1% の TEA を含
む DMF で 3 回 洗 浄 し 、 DMF で 5 回 洗 浄 す る こ と に よ り
(MeO-Galloyl)4-D-MAP-ethylendiamine-Trt-resin を得た。次に、BBr3/methylene
chloride 溶液を加え 40∼50℃で 5 分間撹拌してメトキシ基を脱保護および
resin からの切り出し、凍結乾燥して調製した。
Hub-antigen に cDDR5 (2 equivalent)、TGDK (2 equivalent)、AB-NTA (Dojindo
Molecular Technologies, Inc.、2 equivalent)および CpG-ODN (2 equivalent)
を結合させるため、TGDK のエチレンジアミン、cDDR5 の 1 番目の Lys、AB-NTA、
6-aminohexanol-labeled phosphorothioate-modified CpG ODN 2006（Japan Bio
Services Co., Ltd.）の各アミノ基を SUNBRIGHT PTE-100NP（NOF Corporation、
1 equivalent）に DMF 中で 48 時間反応させた。最終的に、Hub-antigen（168 mg）
41
に TGDK（6 µmol）、cDDR5（6 µmol）、AB-NTA（6 µmol）、CpG-ODN（1.1 µmol）
が結合した調製物に、2.1 で調製した SIVmac239 gp140(R512E, K523E)を等量体
積比で緩やかに混合し、室温で 5 時間攪拌した。得られた HMV を MW cut-off
14,000 の Spectra pore を用いて透析外液 PBS(-)で 24 時間透析後、透析外液を
5 mM NiSO4 に変えて 4℃で 6 時間透析を行った。次に透析外液を脱イオン水に変
えて 4℃で 24 時間透析後、凍結乾燥した。得られた HMV の 10 mg は、56 nmol の
TGDK、90 nmol の cDDR5、36 nmol の AB-NTA、20 nmol の CpG-ODN、タンパク質
として 183 µg 分であった。
2.3
SDS-PAGE および Western blotting
2.1 で調製した各精製物を凍結乾燥後、BCA（Bicinchoninic acid）法でタン
パク定量を行った．タンパク質量を一致するように，10 µL の脱イオン水で調製
し、9 µL の Incubation buffer［125 mM Tris-HCL (pH 6.8) contg. 4% SDS and
20% Glycerol］、1 µL の 2-mercaptoethanol (2-Me)、1 µL の BPB (1 mg/mL)溶
液を加え、5 分間煮沸処理して SDS 化を行った。Super sep 5∼20%（和光純薬工
業株式会社）を用いて 20 mA で約 2 時間電気泳動を行った。次にセミドライ型
トランスウェスタン泳動装置を用いて 80 mA で 60 分間、PVDF 膜へのブロッティ
ングを行った。
ブロッティング後、
ゲルは CBB-G250 で染色し、
PVDF 膜は TBS contg.
5% skim milk でマスキング後、Canget Signal solution 1（TOYOBO）で 1 µg/mL
に希釈した murin anti-gp130 SIVmac251 Ab (Immuno Diagnostics, Inc.)で室
温、4 時間反応させた。二次抗体として POD-conjugated AffiniPure goat
anti-mouse IgG(H+L)を Canget Signal solution 2 (TOYOBO)で希釈して室温で
1 時間反応させた。洗浄後、Western Lightning Chemiluminescense Reagent Plus
(Perkin Elmer)で 1 分間反応させルミノイメージアナライザーLAS-1000 Plus を
用いて検出した。
42
2.4
BN-PAGE
凍結乾燥後のSIVmac239 gp140(R512E, K523E)を脱イオン水に溶かし2倍量の
BN sample buffer ［20 mM Bis-Tris、10% glycerol、500 mM ε-aminocaproic acid、
20 mM NaCl、2 mM EDTA、0.1% Triton X-100 (pH 7.0)］を加えた。泳動槽の陽
極側にAnode Buffer ［50 mM Bis-Tris (pH 7.0)］を注ぎ、サンプルをアプラ
イ後、陰極側にCathode buffer ［15 mM Bis-Tris、50 mM tricine、0.02% Coomassie
blue G250 (pH 7.0)］を注いだ。100 Vで泳動を開始し、4時間かけて180 Vにも
っていき、その後180 Vで2時間泳動した。泳動後、セミドライ型トランスウェ
スタン泳動装置を用いて80 mAで90分間、PVDF膜へのブロッティングを行った。
一 次 抗 体 と し て SIVmac251 gp130 antibody を 反 応 さ せ 、 二 次 抗 体 と し て
POD-conjugated goat anti mouse IgGを反応させ、ルミノイメージアナライザ
ーLAS-1000 Plusで検出した。
2.5
MALDI TOF-MS
Peptide 約 1 mg に 12 µL の m-cresol、72 µL の thioanisol、及び 400 µL の
trifluoroacetic acid （TFA）を加え、室温で 5 時間攪拌後、さらに 36 µL の
ethane dithiol、80 µL の Trimethylbromosirane (TMBS)を加え、氷中で 2 時間
攪拌後、1 mL の冷 diethylether を加えて遠心後、得られた沈殿を再度冷
diethylether で洗浄し、
得られた沈殿を TA buffer (0.1% TFA:acetonitrile= 6:4
の混液)で溶解し、CCA (α-Cyano-4-hydroxy cinnamic acid)飽和させた TA buffer
と 1:1 (v/v)で混合し、乾燥後、MALDI TOF-MS にて測定した。
第 3 章に関する実験
3.1
HMV の免疫
凍結乾燥した HMV 10 mg を 2.5 mL の PBS(-)で再懸濁し、3 例のアカゲザルの
左右鼠径部に約 1.25 mL ずつ 0、1、6 週で間歇皮下投与した。対照群には
43
Hub-antigen のみを対照抗原として、3 例のアカゲザルに同様に間歇皮下投与し
た。投与後、経時的に血清を採取した。
3.2
cDDR5-coupled Multi-Pin ELISA
ELISA の一次抗体として採取した血清を 100 倍希釈して用い、2 時間反応さ
せた。二次抗体は POD-conjugated goat anti-monkey IgG (Cappel Laboratories)
を用い、1 時間反応させた。発色基質として TMBZ および、発色停止液として 0.3 N
H2SO4 を用い、主波長 450 nm、参照波長 630 nm の吸光度を測定した。
3.3
抗 ENV-ELISA 用プレートの作製
ELISA プレート（Nunc CovaLink NH Modules）に PEG を用いて AB-NTA を結合
後、AB-NTA と Ni の錯体形成を利用して SIVmac239 gp140(R512E, K523E)の
MAT-Tag を介して結合させた。
まず、AB-NTA 3.2 mg (12 µmol)に脱水 DMSO (300 µL)を加えて完全に溶解さ
せ、100% NMM を 5 µL 加えて pH を測定した(pH の測定は AB-NTA solution 1 µL
に脱イオン水を 4 µL 加えて pH を用いて測定した)。
pH が 8.0 になるまで 100% NMM
を 1 µL ずつ加えた。
pH 8.0 に調整後、さらに脱水 DMSO を 300 µL 加えた。
PTE-100NP
60 mg(6 µmol)に DMSO(300 µL)を加えて溶解させた溶液に、AB-NTA solution (pH
8.0)を攪拌しながら穏やかに加え、室温で 3 時間攪拌した。反応後に反応溶液
を 4 倍希釈するように脱水 DMSO を約 3 mL 加え ELISA プレートに 50 µL/well ず
つ加えて、室温で 2 時間振とうした。振とう後に well の液を除去し、20 mM
Tris-HCl(pH 7.4)を加え洗浄し、これを 3 回繰り返して未反応の-NH 基を不活化
させた。次に、200 mM NiSO4 を 50 µL/well ずつ加え 20 分間室温で振とうした。
反応後、50 mM phophate buffer で 2 回洗浄し、2.1 で調製した SIVmac239
gp140(R512E, K523E)溶液を 50 mM phophate buffer (pH 8.0)で約 1 nmol 量
(gp140)になるように希釈し 50 µL/well で室温にて一晩振とうした。
44
3.4
抗 ENV-ELISA
HMV には SIVmac239 gp140(R512E, K523E)調製時の血清由来の BSA が結合して
いる可能性があるため、血清の希釈液に BSA を添加した 0.5% BSA/PBS(-)を用い
て抗 BSA 抗体の抗体価測定への影響を除いた。作製した ELISA プレートを 0.5%
スキムミルクでマスキング後、一次抗体として 100 倍希釈した血清を 55 µL/well
で 添 加 し 、 室 温 で 2 時 間 振 と う し た 。 二 次 抗 体 と し て 4000 倍希 釈した
POD-conjugated goat anti-monkey IgG を 55 µL/well で添加し、室温で 1 時間
振とうした。発色基質として TMBZ および、発色停止液として 0.3 N H2SO4 を用
い、主波長 450 nm、参照波長 630 nm の吸光度を測定した。
3.5
MAGIC-5 assay
MAGIC-5 細胞を 1.0×104 cells/well (200 µL)で 96 well plate に播種後、
一晩培養した。翌日上清を除き、DEAE dextran solution (20 µg/mL)、SIVmac239
(p27 抗原量として 5 ng)と Byzen Pro (ノマディックバイオサイエンス株式会社)
で精製した血清中 IgG の混合液(40 µL)を添加して、37℃、2 時間曝露した。そ
の後、passage medium を 160 µL 加え、さらに 48 時間培養した。培養後、培養
上 清 を 除 去 し 、 Fixing solution ［ PBS(-) contg. 1% formaldehyde 、 0.2%
glutaraldehyde］を 50 µL 加えて固定化後、PBS(-)で洗浄し、Staining solution
［9.5 mL of PBS(-)、200 mL of 0.5 M potassium ferrocyanide、200 mL of 0.5 M
potassium ferricyanide、100 mL of 40 mg/mL X-Gal in DMF、and 10 mL of 2 M
MgCl2］を 50 µL 加え、50 分間 37℃で染色した。染色後、染色液を除去し、PBS(-)
を加えて青色を呈色している細胞をカウントした。
3.6
血清中 IgG の精製
血清から IgG の精製は Byzen Pro を用いた。Byzen Pro は従来の酸性条件下で
45
の抗体溶出型と異なり温度溶出型 Protein A である。Byzen Pro のカラムにゲル
を入れ、PBS(-)で洗浄後、血清をゲルに添加し 4℃、5 分で Protein A と IgG を
結合させた。ゲルの 5 倍量の PBS(-)で洗浄後、40℃に温めた PBS(-)をゲルに添
加することで IgG を溶出させた。
3.7
Depletion of anti-cDDR5 serum IgG
動物番号 3 と 6 の血清から Byzen Pro で精製した血清中 IgG を PBS(-)で
100 µg/mL に調製した。希釈した血清は、cDDR5 を結合させた Multi-Pin に 4℃、
1 時間で反応させ、この過程を 7 回繰り返した。除去抗体を回収し、抗 cDDR5 抗
体が除去されたことを、3.2 の測定で確認した。
第 4 章に関する実験
4.1
bAHSG の追加免疫実験
bAHSG の追加免疫は、HMV を免疫したアカゲザルの抗体価が十分に低下してい
る 106 週目に行った。bAHSG を PBS(-)で 1 mg/mL に溶解し、HMV を免疫したアカ
ゲザル全例の左右鼠径部に約 500 µL ずつ皮下投与した。追加免疫後 1、2 週に
血清を採取した。
4.3
cDDR5-coupled Multi-Pin ELISA
3.2 の方法に準じた。ただし、一次抗体には採取した血清から Byzen Pro で精
製した血清中 IgG を用いた。
4.4
抗 ENV-ELISA
3.4 の方法に準じた。ただし、一次抗体には採取した血清から Byzen Pro で精
製した血清中 IgG を用いた。
46
4.5
Western blotting
追加免疫後 2 週目 (投与後 108 週)の動物番号 6 番の血清について、western
blotting を行った。western blotting は、常法にしたがって NIH AIDS Research
and Reference Reagent から入手した recombinant gp130 (#2322)を電気泳動後、
PVDF 膜に転写し、1 次抗体として 100 倍希釈した血清を反応させ、2 次抗体に
POD-conjugated anti-monkey IgG を用いた。
第 5 章に関する実験
5.1
THbA の合成
TGDK のエチレンジアミンのアミノ基を 1.5 倍量の SUNBRIGHT PTE-100NP に結
合させて PEG 化し、PEG 化した TGDK (12 µmol)を Hub-antigen (168 mg)と DMF
中で 12 時間反応させ、結合させた。得られた TGDK-Hub-antigen は、さらに bAHSG
(50 mg)と PBS(-)中で反応(室温、一晩)させ、TGDK-Hub-antigen と bAHSG を結
合させた。得られた THbA を MW cut-off 3,500 の Spectra pore を用いて透析外
液 PBS(-)で 4℃、24 時間透析を行った。次に透析外液を脱イオン水に変えて 4℃
で 36 時間透析後、凍結乾燥した。
5.3
THbA の免疫
凍結乾燥した THbA 5.4 mg (1 mg の bAHSG を含む)を 1 mL の PBS(-)で再懸濁
し、3 例のカニクイザルの左右鼠径部に約 500 µL ずつ単回皮下投与した。対照
群には Hub-antigen のみを対照抗原として、3 例のカニクイザルに同様に単回皮
下投与した。投与前及び投与後 4、8、10、12、14 週に血清を採取した。
5.4
cDDR5-coupled Multi-Pin ELISA
3.2 の方法に準じた。ただし、一次抗体には採取した血清から Byzen Pro で精
製した血清中 IgG を用いた。
47
5.5
抗 ENV-ELISA
3.4 の方法に準じた。ただし、一次抗体には採取した血清から Byzen Pro で精
製した血清中 IgG を用いた。
5.6
Flow cytometry
SIVmac239/CEM×174 細胞（1×106 cells）を Washing buffer( 2% FCS/0.02% sodium
azide in PBS(-))で洗浄した後、10 µg/50 µL で Murine anti-gp130 SIVmac251
Monoclonal Antibody(ImmunoDiagnostic, Inc.)を 50 µL 添加し、氷上で 30 分
間インキュベートした。一方、HSC-F 細胞（1×106 cells）は、Washing buffer
で洗浄した後、25 µg/mL で K8 精製抗体を 50 µL 添加し、氷上で 30 分間インキ
ュベートした。その後、それぞれの細胞は、一次抗体としてコントロール群#2
サルと免疫群#5 サルの免疫後 0w と 4w 精製抗体を 100 µg/mL という濃度で 50 µL
添加し、再び氷上で 30 分間インキュベートした。次に、二次抗体として Washing
buffer で細胞を洗浄し、ANTI-MONKEY IgG (WHOLE MOLECULE) FITC CONJUGATE
を 50 µL 添加し氷上で 30 分間インキュベートした。その後、細胞が SIV に感染
しており固定化する必要があったために、cold PBS(-)を 500 µL 添加した直後
に 2% paraformaldehyde in PBS(-)を 500 µL 添加し、1 時間 4℃でインキュベー
トした。最後に細胞を Washing buffer で洗浄し、500 µL の Washing buffer で
再懸濁後、FACS 解析(Beckman Coulter)を行った。
さらに、血清中 IgG の ENV あるいは CCR5 に対する特異性を確認するため、
SIVmac239/CEM×174 細胞（1×106 cells）および HSC-F 細胞（1×106 cells）を Washing
buffer で洗浄した後、pre treat 処理としてコントロール群#2 サルと免疫群#5
サルの免疫後 0w と 4w 精製抗体を 100 µg/mL という濃度で 50 µL 添加し、氷上
で 30 分間インキュベートした。CXCR4 に対する抗体の結合性の影響を確認する
ために、一次抗体として 10 µg/mL の Murine anti-CXCR4 (44717.111) Antibody
48
を 10 µL 添加し、再び氷上で 30 分間インキュベートした。なお、この際コント
ロールには、Isotype contorol IgG2B を同じ濃度で用いた。一方、CD4 に対する
抗 体 の 結 合 性 の 影 響 を 確 認 す る た め に 、 一 次 抗 体 と し て 0.5 µg 量 の
Anti-CD4(Leu-3a)を 50 µL までメスアップして添加し、再び氷上で 30 分間イン
キュベートした。なお、この際コントロールには、Isotype contorol IgG1κ を
同じ濃度で用いた。次に、これらの細胞は Washing buffer で細胞を洗浄し、二
次抗体として Goat anti-mouse IgG-PE を 50 µL 添加し氷上で 30 分間インキュ
ベートした。その後、細胞が SIV に感染しており固定化する必要があったため
に、cold PBS(-)を 500 µL 添加した直後に 2% paraformaldehyde in PBS(-)を
500 µL 添加し、1 時間 4℃でインキュベートした。最後に細胞を Washing buffer
で洗浄し、500 µL の Washing buffer で再懸濁後、FACS 解析を行った。
5.7
MAGIC-5 assay
3.5 の方法に準じた。ただし、血清から IgG の精製は Byzen Pro を用いた。
49
参考文献
1) UNAIDS/WHO,
“UNAIDS
report
on
the
global
AIDS
epidemic”;
http://www.unaids.org/, 2013.
2) WHO, “Guidelines: HIV”; http://www.who.int/hiv/pub/guidelines/en/, 2013.
3) Volberding P.A., The New York case: lessons being learned, Ann. Intern.
Med., 142, 866-868 (2005).
4) Ibe S., Hotta N., Takeo U., Tawada Y., Mamiya N., Yamanaka K., Utsumi M.,
Kaneda T., Prevalence of drug-resistant human immunodeficiency virus type
1 in therapy-naive patients and usefulness of genotype testing, Microbiol.
Immunol., 47, 499-505 (2003).
5) Flynn N.M., Forthal D.N., Harro C.D., Judson F.N., Mayer K.H., Para M.F.,
Placebo-controlled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine
to prevent HIV-1 infection, J. Infect. Dis., 191, 654-665 (2005).
6) Iaccino E., Schiavone M., Fiume G., Quinto I., Scala G., The aftermath of the
Merck's HIV vaccine trial, Retrovirology, 5, 56 (2008).
7) Rerks-Ngarm S., Pitisuttithum P., Nitayaphan S., Kaewkungwal J., Chiu J.,
Paris R., Premsri N., Namwat C., de Souza M., Adams E., Benenson M.,
Gurunathan S., Tartaglia J., McNeil J.G., Francis D.P., Stablein D., Birx D.L.,
Chunsuttiwat S., Khamboonruang C., Thongcharoen P., Robb M.L., Michael
N.L., Kunasol P., Kim J.H., Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent
HIV-1 infection in Thailand, N. Engl. J. Med., 361, 2209-2220 (2009).
8) Daniel M.D., Kirchhoff F., Czajak S.C., Sehgal P.K., Desrosiers R.C.,
Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef
gene, Science, 258, 1938-1941 (1992).
9) Amara R.R., Villinger F., Altman J.D., Lydy S.L., O'Neil S.P., Staprans S.I.,
Montefiori D.C., Xu Y., Herndon J.G., Wyatt L.S., Candido M.A., Kozyr N.L.,
50
Earl P.L., Smith J.M., Ma H.L., Grimm B.D., Hulsey M.L., Miller J., McClure
H.M., McNicholl J.M., Moss B., Robinson H.L., Control of a mucosal
challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine,
Science, 292, 69-74 (2001).
10) Shiver J.W., Fu T.M., Chen L., Casimiro D.R., Davies M.E., Evans R.K.,
Zhang Z.Q., Simon A.J., Trigona W.L., Dubey S.A., Huang L., Harris V.A.,
Long R.S., Liang X., Handt L., Schleif W.A., Zhu L., Freed D.C., Persaud
N.V., Guan L., Punt K.S., Tang A., Chen M., Wilson K.A., Collins K.B.,
Heidecker G.J., Fernandez V.R., Perry H.C., Joyce J.G., Grimm K.M., Cook
J.C., Keller P.M., Kresock D.S., Mach H., Troutman R.D., Isopi L.A., Williams
D.M., Xu Z., Bohannon K.E., Volkin D.B., Montefiori D.C., Miura A., Krivulka
G.R., Lifton M.A., Kuroda M.J., Schmitz J.E., Letvin N.L., Caulfield M.J., Bett
A.J., Youil R., Kaslow D.C., Emini E.A., Replication-incompetent adenoviral
vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity, Nature,
415, 331-335 (2002).
11) Barouch D.H., Kunstman J., Kuroda M.J., Schmitz J.E., Santra S., Peyerl
F.W., Krivulka G.R., Beaudry K., Lifton M.A., Gorgone D.A., Montefiori D.C.,
Lewis M.G., Wolinsky S.M., Letvin N.L., Eventual AIDS vaccine failure in a
rhesus monkey by viral escape from cytotoxic T lymphocytes, Nature, 415,
335-339 (2002).
12) IAVI, “IAVI report”; www.iavi.org/, 2013.
13) Kirchhoff F., Greenough T.C., Brettler D.B., Sullivan J.L., Desrosiers R.C.,
Brief report: absence of intact nef sequences in a long-term survivor with
nonprogressive HIV-1 infection, N. Engl. J. Med., 332, 228-232 (1995).
14) Pilgrim A.K., Pantaleo G., Cohen O.J., Fink L.M., Zhou J.Y., Zhou J.T.,
Bolognesi D.P., Fauci A.S., Montefiori D.C., Neutralizing antibody responses
51
to human immunodeficiency virus type 1 in primary infection and
long-term-nonprogressive infection, J. Infect. Dis., 176, 924-932 (1997).
15) Mestecky J., Humoral immune responses to the human immunodeficiency
virus type-1 (HIV-1) in the genital tract compared to other mucosal sites, J.
Reprod. Immunol., 72, 1-17 (2006).
16) Pope M., Haase A.T., Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for
strategies to prevent infection, Nat. Med., 9, 847-852 (2003).
17) Lackner A.A., Veazey R.S., Current concepts in AIDS pathogenesis: insights
from the SIV/macaque model, Annu. Rev. Med., 58, 461-476 (2007).
18) Li Q., Duan L., Estes J.D., Ma Z.M., Rourke T., Wang Y., Reilly C., Carlis J.,
Miller C. J., Haase A.T., Peak SIV replication in resting memory CD4+ T cells
depletes gut lamina propria CD4+ T cells, Nature, 434, 1148-1152 (2005).
19) Guadalupe M., Reay E., Sankaran S., Prindiville T., Flamm J., McNeil A.,
Dandekar S., Severe CD4+ T-cell depletion in gut lymphoid tissue during
primary human immunodeficiency virus type 1 infection and substantial
delay in restoration following highly active antiretroviral therapy, J. Virol., 77,
11708-11717 (2003).
20) Mwaengo D.M., Novembre F.J., Molecular cloning and characterization of
viruses
isolated
from
chimpanzees
with
pathogenic
human
immunodeficiency virus type 1 infections, J. Virol., 72, 8976-8987 (1998).
21) Letvin N.L., King N.W., Immunologic and pathologic manifestations of the
infection of rhesus monkeys with simian immunodeficiency virus of
macaques, J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., 3, 1023-1040 (1990).
22) Valentinea L.E., Loffredo J.T., Watkins D.I., Beyond Mamu-A*01+ Indian
Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules
that Bind Epitopes from the Simian AIDSViruses, HIV Molecular Immunology,
52
29-51 (2007).
23) Loffredo J.T., Maxwell J., Qi Y., Glidden C.E., Borchardt G.J., Soma T., Bean
A.T., Beal D.R., Wilson N.A., Rehrauer W.M., Lifson J.D., Carrington M.,
Watkins
D.I.,
Mamu-B*08-positive
macaques
control
simian
immunodeficiency virus replication, J. Virol., 81, 8827–8832 (2007).
24) Sacha J.B., Giraldo-Vela J.P., Buechler M.B., Martins M.A., Maness N.J.,
Chung C., Wallace L.T., León E.J., Friedrich T.C., Wilson N.A., Hiraoka A.,
Watkins D.I., Gag- and Nef-specific CD4+ T cells recognize and inhibit SIV
replication in infected macrophages early after infection, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 106, 9791–9796 (2009).
25) Ouyang D., Xu L., Dai Z., Shi H., Zhang G., Zheng Y., He X., Identification of
major histocompatibility complex class I alleles in Chinese rhesus macaques,
Acta. Biochim. Biophys. Sin., 40, 919-927 (2008).
26) Loffredo J.T., Sidney J., Bean A.T., Beal D.R., Bardet W., Wahl A., Hawkins
O.E., Piaskowski S., Wilson N.A., Hildebrand W.H., Watkins D.I., Sette A.,
Two
MHC
class
I
molecules
associated
with
elite
control
of
immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind
peptides with sequence similarity, J. Immunol., 182, 7763-7775 (2009).
27) Reed J.S., Sidney J., Piaskowski S.M., Glidden C.E., León E.J., Burwitz B.J.,
Kolar H.L., Eernisse C.M., Furlott J.R., Maness N.J., Walsh A.D., Rudersdorf
R.A., Bardet W., McMurtrey C.P., O'Connor D.H., Hildebrand W.H., Sette A.,
Watkins D.I., Wilson N.A., The role of MHC class I allele Mamu-A*07 during
SIV(mac)239 infection, Immunogenetics, 63, 789–807 (2011).
28) Sugimoto C., Watanabe S., Naruse T., Kajiwara E., Shiino T., Umano N.,
Ueda K., Sato H., Ohgimoto S., Hirsch V., Villinger F., Ansari A.A., Kimura A.,
Miyazawa M., Suzuki Y., Yamamoto N., Nagai Y., Mori k., Protection of
53
Macaques with Diverse MHC Genotypes against a Heterologous SIV by
Vaccination with a Deglycosylated Live-Attenuated SIV, PLoS One, 8,
e1000462 (2010).
29) Lopalco L., Barassi C., Pastori C., Longhi R., Burastero S.E., Tambussi G.,
Mazzotta F., Lazzarin A., Clerici M., Siccardi A.G., CCR5-reactive antibodies
in seronegative partners of HIV-seropositive individuals down-modulate
surface CCR5 in vivo and neutralize the infectivity of R5 strains of HIV-1 In
vitro, J. Immunol., 164, 3426-3433 (2000).
30) Barassi C., Lazzarin A., Lopalco L., CCR5-specific mucosal IgA in saliva and
genital fluids of HIV-exposed seronegative subjects, Blood, 104, 2205-2206
(2004).
31) Pastori C., Weiser B., Barassi C., Uberti-Foppa C., Ghezzi S., Longhi R.,
Calori G., Burger H., Kemal K., Poli G., Lazzarin A., Lopalco L., Long-lasting
CCR5 internalization by antibodies in a subset of long-term nonprogressors:
a possible protective effect against disease progression, Blood, 107,
4825-4833 (2006).
32) Bomsel M., Pastori C., Tudor D., Alberti C., Garcia S., Ferrari D., Lazzarin A.,
Lopalco, L., Natural mucosal antibodies reactive with first extracellular loop
of CCR5 inhibit HIV-1 transport across human epithelial cells, AIDS, 21,
13-22 (2007).
33) Doms R.W., Peiper S.C., Unwelcomed guests with master keys: how HIV
uses chemokine receptors for cellular entry, Virology, 235, 179-190 (1997).
34) Rizzuto C.D., Wyatt R., Hernández-Ramos N., Sun Y., Kwong P.D.,
Hendrickson W.A., Sodroski J., A conserved HIV gp120 glycoprotein
structure involved in chemokine receptor binding, Science, 280, 1949-1953
(1998).
54
35) Chan D.C., Fass D., Berger J.M., Kim P.S., Core structure of gp41 from the
HIV envelope glycoprotein, Cell, 89, 263-273 (1997).
36) Zhang H., Huang Y., Fayad R., Spear G.T., Qiao L., Induction of mucosal and
systemic neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus type
1 (HIV-1) by oral immunization with bovine Papillomavirus-HIV-1 gp41
chimeric virus-like particles, J. Virol., 78, 8342–8348 (2004).
37) Dennison S.M., Sutherland L.L., Jaeger F.H., Anasti K.M., Parks R., Stewart
S., Bowman C., Xia S.M., Zhang R., Shen X., Scearce R.M., Ofek G., Yang
Y., Kwong P.D., Santra S., Liao H.X., Tomaras G., Letvin N.L., Chen B., Alam
S.M., Haynes B.F., Induction of antibodies in rhesus macaques that
recognize a fusion-intermediate conformation of HIV-1 gp41, PLoS One. 6,
e27824 (2011).
38) Olson W.C., Rabut G.E., Nagashima K.A., Tran D.N., Anselma D.J., Monard
S.P., Segal J.P., Thompson D.A., Kajumo F., Guo Y., Moore J.P., Maddon
P.J., Dragic T., Differential inhibition of human immunodeficiency virus type 1
fusion, gp120 binding, and CC-chemokine activity by monoclonal antibodies
to CCR5, J. Virol., 73, 4145-4155 (1999).
39) Wu L., LaRosa G., Kassam N., Gordon C.J., Heath H., Ruffing N., Chen H.,
Humblias J., Samson M., Parmentier M., Moore J.P., Mackay C.R.,
Interaction of chemokine receptor CCR5 with its ligands: multiple domains
for HIV-1 gp120 binding and a single domain for chemokine binding, J. Exp.
Med., 186, 1373-1381 (1997).
40) Lee B., Sharron M., Blanpain C., Doranz B.J., Vakili J., Setoh P., Berg E., Liu
G., Guy H.R., Durell S.R., Parmentier M., Chang C.N., Price K., Tsang M.,
Doms R.W., Epitope mapping of CCR5 reveals multiple conformational
states and distinct but overlapping structures involved in chemokine and
55
coreceptor function, J. Biol. Chem., 274, 9617-9626 (1999).
41) Kajumo F., Thompson D.A., Guo Y., Dragic T., Entry of R5X4 and X4 human
immunodeficiency virus type 1 strains is mediated by negatively charged
and tyrosine residues in the amino-terminal domain and the second
extracellular loop of CXCR4, Virology, 271, 240-247 (2000).
42) Chabot D.J., Zhang P.F., Quinnan G.V., Broder C.C., Mutagenesis of CXCR4
identifies important domains for human immunodeficiency virus type 1 X4
isolate envelope-mediated membrane fusion and virus entry and reveals
cryptic coreceptor activity for R5 isolates, J. Virol., 73, 6598-6609 (1999).
43) Zhou N., Luo Z., Luo J., Liu D., Hall J.W., Pomerantz R.J., Huang Z.,
Structural and functional characterization of human CXCR4 as a chemokine
receptor and HIV-1 co-receptor by mutagenesis and molecular modeling
studies, J. Biol. Chem., 276, 42826-42833 (2001).
44) Reimann K.A., Li J.T., Veazey R., Halloran M., Park I.W., Karlsson G.B.,
Sodroski J., Letvin N.L., A chimeric simian/human immunodeficiency virus
expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate
env causes an AIDS-like disease after in vivo passage in rhesus monkeys, J.
Virol., 70, 6922-6928 (1996).
45) Igarashi T., Endo Y., Englund G., Sadjadpour R., Matano T., Buckler C.,
Buckler-White A., Plishka R., Theodore T., Shibata R., Martin M.,
Emergence of a highly pathogenic simian/human immunodeficiency virus in
a rhesus macaque treated with anti-CD8 mAb during a primary infection with
a nonpathogenic virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 14049-14054 (1999).
46) Nakayama D., Misumi S., Mukai R., Tachibana K., Umeda M., Shibata H.,
Takamune N., Shoji S., Suppression of multiclade R5 and X4 human
immunodeficiency virus type-1 infections by a coreceptor-based anti-HIV
56
strategy, J. Biochem., 138, 571-582 (2005).
47) Misumi S., Masuyama M., Takamune N., Nakayama D., Mitsumata R.,
Matsumoto H., Urata N., Takahashi Y., Muneoka A., Sukamoto T., Fukuzaki
K., Shoji S., Targeted delivery of immunogen to primate m cells with
tetragalloyl lysine dendrimer, J. Immunol., 182, 6061–6070 (2009).
48) Moulard M., Chaloin L., Canarelli S., Mabrouk K., Darbo H., Retroviral
envelope glycoprotein processing: structural investigation of the cleavage
site, Biochemistry, 37, 9870 (1998).
49) Chen B., Cheng Y., Calder L., Harrison S.C., Reinherz E.L., Skehel J.J.,
Wiley D.C., A chimeric protein of simian immunodeficiency virus envelope
glycoprotein gp140 and Escherichia coli aspartate transcarbamoylase, J.
Virol., 78, 4508-4516 (2004).
50) West J.T., Johnston P.B., Dubay S.R., Hunter E., Mutations within the
putative membrane-spanning domain of the simian immunodeficiency virus
transmembrane glycoprotein define the minimal requirements for fusion,
incorporation, and infectivity, J. Virol., 75, 9601-9612, (2001).
51) Chen B., Zhou G., Kim M., Chishti Y., Hussey R.E., Ely B., Skehel J.J.,
Reinherz E.L., Harrison S.C., Wiley D.C., Expression, purification, and
characterization of gp160e, the soluble, trimeric ectodomain of the simian
immunodeficiency virus envelope glycoprotein, gp160, Biol. Chem., 275,
34946-34953 (2000).
52) Mochizuki N., Otsuka N., Matsuo K., Shiino T., Kojima A., Kurata T., Sakai K.,
Yamamoto N., Isomura S., Dhole T.N., Takebe Y., Matsuda M., Tatsumi M.,
An infectious DNA clone of HIV type 1 subtype C, AIDS Res. Hum.
Retroviruses., 15, 1321-1324 (1999).
53) Lo Caputo S., Trabattoni D., Vichi F., Piconi S., Lopalco L., Villa M.L.,
57
Mazzotta F., Clerici M., Mucosal and systemic HIV-1-specific immunity in
HIV-1-exposed but uninfected heterosexual men, AIDS, 17, 531-539 (2003).
54) Lopalco L., Barassi C., Paolucci C., Breda D., Brunelli D., Nguyen M.,
Nouhin J., Luong T.T., Truong L.X., Clerici M., Calori G., Lazzarin A., Pancino
G.,
Burastero
S.E.,
Predictive
value
of
anti-cell
and
anti-human
immunodeficiency virus (HIV) humoral responses in HIV-1-exposed
seronegative cohorts of European and Asian origin, J. Gene. Virol., 86,
339–348 (2005).
55) Mazzoli S., Lopalco L., Salvi A., Trabattoni D., Lo Caputo S., Semplici F.,
Biasin M., Bl C., Cosma A., Pastori C., Meacci F., Mazzotta F., Villa M.L.,
Siccardi A.G., Clerici M., Human immunodeficiency virus (HIV)-specific IgA
and HIV neutralizing activity in the serum of exposed seronegative partners
of HIV-seropositive persons, J. Infect. Dis., 180, 871–875 (1999).
56) Kaul R., Rowland-Jones S.L., Kimani J., Dong T., Yang H.B., Kiama P.,
Rostron T., Njagi E., Bwayo J.J., MacDonald K.S., McMichael A.J., Plummer
F.A., Late seroconversion in HIV-resistant Nairobi prostitutes despite
pre-existing HIV-specific CD8+ responses, J. Clin. Invest., 107, 341–349
(2001).
57) Pedersen K.O., Fetuin, a globulin isolated from serum, Nature, 154, 575
(1944).
58) Schultze
H.E.,
Heide
K.,
Haupt
H.,
Charakterisierung
eines
niedermolekularen α2-Mukoids aus Humanserum, Naturwiss, 49, 15-17
(1962).
59) Jahnen-Dechent W., Heiss A., Schäfer C., Ketteler M., Fetuin-A regulation of
calcified matrix metabolism, Circ. Res., 108, 1494-1509 (2011).
58
60) Maxmen A., HIV sticks to sperm, J. Exp. Med., 206, 2578-2579 (2009).
61) Hessell A.J., Poignard P., Hunter M., Hangartner L., Tehrani D.M., Bleeker
W.K., Parren P.W., Marx P.A., Burton D.R., Effective, low-titer antibody
protection against low-dose repeated mucosal SHIV challenge in macaques,
Nat. Med., 15, 951-954 (2009).
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謝辞
本研究に際し、終始御懇篤なる、御指導、御鞭撻ならびに御校閲を賜りました、
熊本大学大学院 医学薬学研究部 庄司 省三 名誉教授、熊本大学大学院 生命科
学研究部 三隅 将吾 教授に衷心より感謝申し上げます。
本論文作成に際し、御指導ならびに御校閲を賜りました、熊本大学大学院 生命
科学研究部 森岡 弘志 教授に心より感謝申し上げます。
本論文作成に際し、御指導ならびに御校閲を賜りました、熊本大学 薬学部附属
創薬研究センター 藤田 美歌子 准教授に心より感謝申し上げます。
本研究を行うに際し、有益な御指導、ご助言を賜りました、熊本大学 イノベー
ション推進機構 知的財産部門 高宗 暢暁 准教授に心より感謝申し上げます。
本研究を行うに際し、御指導を頂きました、株式会社 新日本科学 永田 良一 代
表取締役社長に心より深謝申し上げます。
本研究を行うに際し、激励ならびに御指導を頂きました、株式会社 新日本科学
福
好一郎 専務、鮫島 秀暢 安全性研究所長に心より感謝申し上げます。
本研究を行うに際し、御指導ならびにご協力を頂きました、株式会社 新日本科
学 宗岡 篤信 先生に心より感謝申し上げます。
また、本研究に際し、日夜多大なる御協力頂きました、髙橋 義博 博士、増山
光明 博士、永友 寛一郎 博士、谷口 ゆかり 氏、小原 后恵 氏、谷口 康徳 氏、
有馬 大輔 氏をはじめ、株式会社 新日本科学 安全性研究所の皆様方に心より
感謝申し上げます。
最後に、私をこれまで育ててくれた両親と、私を支えてくれた妻 美生に心より
感謝致します。
2014 年
大坪
60
靖治