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Twinkle:Tokyo Women`s Medical University
Title Author(s) Journal URL Chromogenic Substrate（色原性基質）の臨床化学への応用 降矢, 熒 東京女子医科大学雑誌, 34(6):237-249, 1964 http://hdl.handle.net/10470/14244 Twinkle:Tokyo Women's Medical University - Information & Knowledge Database. http://ir.twmu.ac.jp/dspace/ 1 （女子医大誌 第34巻 第6号頁 237一一一一r249 日博引039年6月） 説〕 〔綜 Chromogenic Substrate（色原性基質） の臨床化学への応用 東京女子医科大学生化学教室（主任 榮 助教授 降 矢 プリ 松村義寛教授） ケイ ヤ （受付 昭和39年5月！3日） は比色分析法による酵素活性度測定を，より迅速 はじめに 病的状態で血中に増量を示す酵素の多くは，主 に，より微量化するために合成的につくられた基 として細胞の壊死によるか，または別の何らかの 質である．大森（1937年）1）がはじめてp一ニト 機序により細胞内成分が流血中に放出されること mフェノールリン酸を合成しホスファターゼの による，したがって血中の酵素活性度が疾病の消 基質として用いたのがChromogenic substrate 長と何らかの関係があり，かつその測定が此較的 のはじまりで，以後Huggins＆Talalayによ 容易であるならば血中酵素活性度測定が診断や治 るアルカリホスファターゼの基質としてフェノー ルフタレインニリン酸2），Seligman らによる 療効果の判定の一助として利用できることにな リパーゼ基質としてのβ一ナフトールラウリン酸 る． たとえば，骨疾患や閉塞性黄疸の場合の血清ア 3）など数多くの報告があり，最近著者らも血清リ ルカリホスファターゼの増加，前立腺癌における パーゼの基質としてp一石トロフェノールラウリ ン酸や，酸ホスファターゼの基質としてプロムフ 血清酸ホスファターゼの増加，心筋梗塞発作時の 血清トランスアミナーゼの増加，急性膵炎のばあ ＝ノール青一ニリン酸（以下，BPB一ニリン酸と省 いに血清リパーゼやアミラーゼが増加し，疾患の 改善とともにこれら諸酵素の活性度が平常に戻る 略する）を合成して酵素的水解の特異性を検し， ことは周知のことである． これら血中酵素活性度を臨床化学的に測定する には，一定量の基質液に一定量の被検液を作用さ 更に数十例の患者1血清に応用し，少しく知見を得 たので，現在臨床化学的に応用されている諸種 Chromogenic substrateの紹介とともに著者ら の実験結果を4）報告しよう． せて一一一i定時間に分解された基質量または反応生成 Chromogenic substrateとは： 物を滴定法，比色分析法などにより測定する．前 老は後者に比べて精密ではあるが操作が複雑で長 酵素的水解により直接，色素を遊離し，あるい は簡単な操作で容易に色素を作る物質を遊離する 時間の測定時間を要し多：量の検査材料を要する． 一般に比色分析法では操作がより簡単であり測定 時間も短縮され検査材料もより少量ですみ，いわ 基質をいう．前者を一次的色原性基質，後者を二 次的色原性基質と名付けよう． これらはいずれも芳香族化合物とのエステル， ゆる微量定量が可能である． Chromogenic substrateすなわち色原性基質 グリコシド，ペプチドであり，無色ないし極く淡 Kei FURIYA（Department of Biochemistry， Tokyo Woinen’s Medical College）： Applications of chro− mogenic substrates in clinical chemistry． 一 237 一 2 エステルを合成した．それらのうちにフェノー ルフタレインリン酸のCa塩， Pb塩， Ba塩な 一次喜色原性基虞 e2，0粛。H．H2。塾歌詠〉・H・H・匙・・ OH どがあったが，これらは水に難溶性であり酵素に OH P一ニトロフェノーリレ無罪リン酸 P一二卜［］フェノー）レリン酸 よる水解速度が非常に小であるから短時間のうち （組目劉 （無色） に正確な結果を得るためには多量の血清を要する 二次的色原性基屓 0 ア1レカリ ことを述べている．Huggins＆Talalay2）により 0 （｝・一苧一・H・・、。塾て〉。H・H・十・H 水溶性のフェノールフタレインニリン酸のNa塩 OH欝・・ン｝一… OH （無創 フェノールリン酸 フェノール （C20Hユ30i1P2Na5）が合成され，少量：の1血清に 無ネKリフ酸 よるアルカリホスファターゼ活性度の測定が可能 になった．現在ホスファタァブとして市販せられ 図 1 ているアルカリホスファターゼの半定量に用いら れているものも，この基質を使用している． 色の物質である，例を図1に示す． フェノールフタレインニ、リン酸ナトリウムは一・ 一次的色原性基質には。一，m一， p一ニトロフェ ノールやフェノールフタレインやBPBのごとき 次的色原性基質に属し，無色の物質であり，アル pH指示薬の脂酸エステルおよび無機酸のエステル カリホスファターゼにより水解されてフェノール およびグリコシドがあり，フルオレスセインのよ 讐1∴罵漁 うな螢光物質の脂酸エステルと無機酸エステルお よびグリコシドなどもこれに属し，アミノ酸の 。一，m一， P一ニトロアニリドなどもそうである． 二次的色原性基質にはフェノールやα一，βナフ トールなどの脂酸エステルおよび無機酸エステル およびグリコシド，アミノ酸のナフチールアミ 図 2 フタレインを遊離する（図2）． ド，アミノ酸のひ，m一， p一アミノ安息香酸アミ 実際に血清について測定するには，PH 9．7に調 ドなどがある． 製した基質液に血清を加え，370Cで1時間反応さ 臨床化学的に応用されるChromogenic sub− せる．次いでPH 11．2のグリシン緩衝液を加えてpH strateについて＝ Chromogenic substrateを用いて酵素活性度 を10．6にすると，フェノールフタレインによる紅 色の呈色は安定となるので，所定の時間内に540 エnμ部における吸光度を測定する． を測定できる酵素は主に水解酵素に限られる．こ れらの基質は血清中酵素の活性度測定に広く用い この基質を用いると除蛋白操作なしに，また最 られるものであるが，検査材料の取扱いに注意を 小限の操作過程によりアルカリホスファターゼ活 すればバイオプシーにより得られた組織材料や穿 性度を測定し得る特長がある．一方短所として紅 刺液，尿にも応用できる． 色の吸光度は必ずしも常に酵素量に比例しない． この点につきRzhekhilla6）はフェノールフタレ インニリン酸の酵素的水解は2段階で行なわれ，・ 2個のリン酸エステル結合のうち，最初のエステ 1） アルカリホスファターゼの基質 この酵素はRobison（1923年）により‘‘Bone enzyme”として骨の化骨と重要な関係がある ことが発見されて以来今日に至るまで最も広く研 究されている酵素の一つであり，骨および肝疾患 の消長の一指標となることは周知のことである． ①フェノールフタレインニリン酸 King5）はホスファターゼの水解作用により Chromogen（色素原）を遊離する数種のリン酸 一 238 一 ル結合の水解速度は2番目のリン酸エステル結合 の水解速度よりも大であり，また最初の酵素的水 解の段階で生じたフェノールフタレインーリン酸 がフェノールフタレインニリン酸の水解を阻害 し，後者が水解により消失してくれば前者の水解 速度がより大になることを述べている． （2｝：P一二〉ロフェノールリン酸 1 3 ：16 竃』8 益6 4 2 ：：ワ・窃譜 繍争 P一ニト［】フェノ「ル i4 12 10 4＝アミノアンチピリン フェノール P一ニト甲弱漱 図 ／X， ノ ノ 、 ノ ・ 色のキノン物質を生ずる（図4）ので，これを 500mμ部で吸光度を測定して酵素活性度を求め ’、P一：’FDフ．ノ→レ ’N （酸性） 1 ／ 一XN N ノ！ @ 4 ・痛 i XN． i 、 ／ 赤色のキノノ鼠戸 る．実際にはPH 10．0重炭酸緩衝液に血清を加え， ＼ 〈N 260 280 320 360 400 4t−fO det 波長 mμ 37℃で15分間反応させ，次いでアルカリを加え， 4一アミノアンチピリン液，フェリシアンカリウ ：図3P一＝トロフェノールおよびP一ニトロフェノー ム液を加えて発色させる．操作は①，②に比しや ルリン酸の吸光度曲線 や煩雑ではあるが，除蛋白操作なしに少：量の血清 で短時間に酵素活性度を測定し得る利点がある． 大森1）により合成されBessey， Lowry， Bro− 2）酸フォスファターゼの基質 lck7）により広く紹介された一次的色原性基質であ る．pH10．3グリシン緩衝液に血清を加えて38。C， 血中のこの酵素と前立腺癌との関係は古くから 30分野反応させてから0．02N NaOHを加えて強 アルカリ性となし，生じた黄色色調を400∼420 mμ部で吸光度を測定し活性度を求める．図1に 知られている．酵素の活性度測定にはアルカリフ 示すようにアルカリホスファターゼにより本基質 検血清を加えて370Cで反応させる．反応後，アル ォスファターゼの活性度測定に用いられる基質を pH 5∼6の酸性域の緩衝液に溶解させ，これに被 は水解されてp一ニトロフェノールを生じ，これ カリを過剰に加えて発色させればよい．たとえば はpk 7．2の酸アルカリ指示薬であるから強アル Hugginsら2）はフェノールニリン酸をPH 5．4酢酸 カリ性にすれば黄色を呈する．基質および遊離し 緩衝液に溶解して使用している．この方法では， た色素の吸光単曲線を図3に示す．この基質はア 特に尿の酸ホスファターゼ活性度を測定するばあ ルカリホスファターゼによりBodanskyによる い透析により尿中の色素を除去する必要がないの ．β一グリセmリン酸8）の2∼3倍の速度で水解さ で尿をそのまま検査に使用できる．Hudsonら12） ．れ，フェノールフタレインニリン酸の25∼30倍の はp一ニトロフェノールリン酸をpH 5．4酢酸緩衝 ．速度で水解され，また少量の血清（0．05m1）で 液に溶解して使用し，Kind＆King11）はフェ 測定可能であり，操作も簡単であり，更に遊離さ ノールリン酸をpH 4．9クエン酸緩衝液に溶解して ．れたp一ニトmフェノールのアルカリ性のもとで の分子吸光係数が大であるため，少量の検査材料 用いている． で正確，迅速に酵素活性度を測定し得る． ホスファターゼの検出を試みた． 著者らのはBPB一八リン酸を合成し，組織の酸 腎組織の新鮮凍結切片をpH 4．7にしたBPB一ニ ③フェノールリン酸 この色原性基質を用いるアルカリホスファター リン酸基質液に入れて20℃，工5∼60分間反応さ ゼ活性度測定法はKing＆Armstrong9）により 報告され，後にKing＆Kindlo）により改良さ せ，昇乗を飽和した1％酢酸に10分間浸し，次で 1％酢酸で洗瀞後，酢酸グリセリンに封入して検 ．れた．この基質は二次的色原性基質に属し，アル カリホスファターゼにより水解されて図2のよう 鏡すると糸球体は染色せず細尿管のある部分に青 染する顯粒が見られる．これは腎の酸ホスファタ ・にフェノールを遊離する．フェノールはそのまま ーゼにより水解されて生じたBPBが，酸性のも では呈色しないが，アルカリ性にした酸化剤の存 とで蛋白に吸着され青斑されるのであり，この部 在のもとで4一アミノアンチピリンと縮合して赤 分は酸ホスファターゼの存在を示すものと考えら 一 239 一 4 れる． 明した．Aldridg13）は，ヒト血清中には水解酵素 この一次的色原性基質を法医学に応用してみる と，BPB一ニリン酸基質液を精液のついた布地に 主として含まれ，後者は酢酸エステルを酪酸エス としてコリンエステラーゼとA一エステラーゼが る，従来，p一ニトロフェノール法が精液の酵素的 テルよりも速やかに水解することを述べ，Adams ら1のは，ヒト血清コリンエステラーゼが酪酸エ ステルを酢酸エステルに優先して水解することを 検出法として使用されているが，その黄色が見難 認めている．それゆえMainら15）は。一ニトロア いことと，アルカリ性にしなければ発色しない点 などから，このBPB一ニリン酸を使用すればより ェノール酪酸を合成し，ヒト血清コリンエステ ラーゼの基質として充分使用可能なことを述べ 簡便であろう． た．表1はMainら15）の実験結果で。一ニトロフ1 つけると，精液中の酸ホスファターゼにより水解 され，1分後には精液の付着した部分が青議す 3） コリンエステラーゼの基質 エノール酪酸がコリンエステラーゼに高度の特 コリンエステラーゼはアセチルコリンを水解す 異性を示すことがわかる．この基質は一次的色原 る酵素をいうが，1血清中のコリンエステラーゼは 性基質であり，pH 7．6リン酸緩衝液に基質を溶解・ コリン酪酸エステルをアセチルコリンよりも大な し，これに少量の血清（O．004∼0。1m1）を加 る速度で水解し，更に他のコリンエステルを水解 えて25℃，10分間反応させ出現する黄色，すなわ・ する非特異的酵素（Pseudo−cholinesterase）で ち。一ニトロフェノールのイオン化したものの色 ある．肝臓で生成され血清に供給されていること をそのまま400mμ部で吸光度を測定し酵素活性 はほぼ確実であり，肝疾患に際して鋭敏に活性度 が減弱するので最近，肝機能検査法として臨床的 度を求める．基質およびニトロフェノールの吸光 度曲線を図5に示す．なお，同一1血清をジイソブ’ に応用されるようになってきている．この活性度 の減弱が血清アルブミンの減少とほぼ同一の意義 ロピルフルオロリン酸（DFP）で処理してから 同様に操作すればA一エステラーゼの酵素活性度 を有しているので，肝疾患のみに特異的とはいえ が求められるから，この値を補正すれば正確なコ ないが，活性度の増加は，ほとんどネフローゼの リンエステラーゼ活性度が得られる． ばあいに限られ，診断的意義が大きいといわれて この基質を用いると微量の血清で，しかも最少 限の操作過程により短時間に正確なコリンエステ いる． ①O一ニトロフェノール酪酸 ラーゼ活性度が求められるので，優秀な基質と思 Mainユ2）は。一， m一， p・ニトロフェノールの脂 われる．ただ合成方法の条件がやや難しく，結晶 酸エステルを用いて血清コリンエステラーゼ活性 化し難いという短所がある． ② フェノール安息香酸 度を測定するばあい，同時にA一エステラーゼに よっても水解されることを認め，これらのうち Gomori16）により供試された二次的色原性基：質 A一エステラーゼによる。位のエステルの水解速 である．pH 7。6に調製した基質液に血清を加えて 度はm一，p一位のエステルにくらべ遅いことが判 反応させると酵素的に水解されフェノールを遊離 表1 ＝トロフェノールエステルに対するヒト血清コリンエステラーゼ 活性度とAエステラーゼ活性度の比較15） 活性度 基 質 （遊離したニトロフェノール μmoletml血清1分） コリンエステラーゼ Aエステラーゼ 一v一一一一一pt コリンエステラーゼ Aエステラーゼ 0一＝トロフェノール酪酸 0・ニトロフェノール酢酸 2． 59 O．068 P一ニ トロラェノール酪酸 0． 66 O． 27 0． 32 1． 04 p一ニトロフェノール酉乍酸 L50 O． 78 一 240 一 42 1．9 2． 41 0． 31 5 5 一 〇一ニトロフェノー）レ（pH 9） ・r，o 一←←榊＋ @O一ニトロフェノール（pH4．5） O．8 一一一一 1 Z一二ニトロ7エノール酉各酸 4 o．6fr VYA t O・4 ロ 。r，，3 N ヨ N N 0，2 N 02tht 250 x 2 sN 300 3so 400 4 so soo−gstbo 一波長 mμ 1 tz6Tt 図5Q一ニトロフェノールおよび。一＝トロフェノー ル酪酸の吸光度曲線15） 500 600 700 波長 辺μ DM する．これにジアゾ5一ニトロー2一アミノアニ ソールを加え，終濃度が4∼6％アルコールにな E…分子吸光係数 D…吸光度 るようにアルコールを加えると全く安定な栓赤色 G…濃度9／1 L・一ヲ己日長C皿 の色素を生ずる17）．490mμ部で吸光度を測定す 図7 CL す． 4） れば酵素活性度が求められる． E＝＝；．一i’：一’ ロイシンアミノペプチダーゼの基質． ロイシンアミノペプチダーゼは腎，肝，小腸粘 ．③ β一カルボナフトオキシコリン Seligmanら18）により合成供試された二次的色 膜，脳，血液に広く分布し最近，血清のロイシン 原性基質である．この基質は血清コリンエステラ アミノペプチダーゼ活性度測定が肝胆道疾患の鑑 ｭにより水解されてβ一ナフトールカルボン酸 別に役立ち，Kowlessarらによると，この酵素 を遊離する．これは自然に脱炭酸されてβ一ナフ のアイソザイムを測定することにより急性流行性 下一ルを生ずる．生じたβ一ナフトールにジァゾ 肝炎と細面磁性肝炎の鑑別を容易にし，Schδn ー＝ウム塩を反応させて紫色のアゾ色素となし，こ ら19）は閉塞性黄疸のばあいに血清ロイシンアミノ ・一 れを酢酸エチルで抽出して540mitL部で吸光度を ペプチダーゼ活性度測定が，アルカリホスファタ 測定し酵素活性度を求める．彼らは主に融点134 ーゼ活性度測定よりもより診断的価値があること ∼136℃のβ一カルボナフトオキシコリンのヨウ を述べ，近時世人の注目を喚起しつつある． ①L一ロイシルーP一網トロアニリド f（ヴσ一環・高田 L一日イシン 1．2 P一ニトロアニリド ．、①OC。。H・CH、C・、N＋…、・、エ・ ミ ：↓ co・（目然に脱炭酉鋤 O．9 E 蝶蝶蹄→継短謄 ヲオルトアニシジノ P一ニトロ i o．6 アニリノ （紫色） 図 6 O．3 化物を用いたが．6一プロム化合物もコリンエス テラーゼの基質になり得ることを報告している． 一250 300 350 400 450 以上の反応機構を図6に示す． →波長mN アゾ色素を酢酸エチルで抽出した液の吸光度曲 線，は図7⑳如く550皿風部付近に極大吸収を示 一 241 一 図8L，UイシソP一ニトロア＝リドおよびP‘ニトロ ァ＝リソの吸光度曲線 6 この基質がロイシンアミノペプチダーゼに対し高 度の親和性を示すことがわかる． O，02 この基質は③のし一ロイシルーβ一ナフチルアミド よりも優れた基質である。それは，p一ニトロアニ リンがβ一ナフトールをジアゾ化して呈色．させた ．E アゾ色素の2倍以上の分子吸光係数を示すことに 耳αOl pH 8 よる． 30 ec t ②DL一ロイシルーm一アミノ安息香酸 降矢21）n）はm一アミノ安息香酸のペプチドを多 丁 2 種合成してその酵素的水解の特異性を検し23），こ 3 一一 γnU／n泥 （酉孝素量） れらのうちで DL一門イシルーm一アミノ安息香酸 が，ロイシンアミノペプチダーゼの基質として適 しており，少量の1血清を用い短時間に酵素活性度 図9 ロイシンアミノペプチダーゼによるL一ロイシ ンP一ニトロアニリドの水解 を測定し得ることを認めた2D． f50 この基質に血清を加えPH 8，37。Cで所定立聞反： 応させると酵素的に水解されてm一アミノ安息香． 120 酸を生じる．このm一アミノ安息香酸をジアゾ化 ’ミ 導・・ してアゾ色素を生成させ，540m／tL部で吸光度を一 差6。 Sch6n ら・による19） 表2． ／ 30 」’51・・溺，、）孫6’0 図10ロイシソァ’t〆ノペプチダーゼによるL一ロイシ ンp．ニトロァニリドの水解速度 ロイシン アルカリ ア こ ノヘフ ホスフアタ 診断 チダーーゼ 一ゼ 番号 性 1 男 250 2 女 3 4 10 膵癌 144 41 閉塞性黄疸 女 103 7 男 102 54 5 男 101 87 6 女 78．5 28 急性肝炎 閉塞性黄疸 lt 急性肝炎 7 男 72 19 最近Tuppyら20）により合成された一次的色 8 男 7e．7 50 原性基質であり，酵素的水解により黄色の色素で 9 男 70 6 あるp一ニトロアニリンを遊離する．基質および 10 女 69 39 p一ニトnアニリンの吸光度曲線は図8の如く， 基質の極大吸収は紫外部にあり可視部ではほとん 11 女 68．4 6 12 13 女 58．8 女 56 15 13 ど示さないので無色である．p一ニトロアニリンの 14 男 54 14 極大吸収は380 mlt部にあるので380∼400mμ 15 女 53．8 30 11 部で吸光度を測定して酵素の活性度を求める， 16 男 53．8 12 11 なお400mμでの分子吸光係数は10，800である． 図9は豚腎から精製したロイシンアミノペプチダ 狽奄ﾉよるこの基質の水解を示したもので酵素 量に比例したp一ニトロアニリンの生成が認めら ー一一 れる．なおLineweaver＆Burkの式に従い 1／vと1／sをプロットすると函10のようになり， 一242一 17 男 47．8 13 18 女． 46．6 7 19 男 45 15 2e 女 45 10 肝へ癌転移 急性肝炎 肝への癌転移・ Zノ ／t ノノ 胆嚢炎 tl n lt 21 男 44．6 16 ’22 男 40．7 8 胆嚢炎 23 女 39．6 9 慢性肝炎 肝への癌転移2 7 類の異化作用を司る．また癌組織に特に高い活性 Schδn らによる19） 表3 度が見られる．実験的に1一メントールを注射して ロイシン 番号 性 ア ミ ノペ フチター ゼ GP田 GO田 1 女 140 325 87 急性肝炎 2 男 139 72 54 急性膵炎 3 男 135 304 104 急性肝炎 4 女 123 164 52 閉塞性黄疸 5 女 105 275 66 急性肝炎 6 男 102 49 15 急性膵炎 7 男 102 38 23 8 男 99．51 45 18 9 女 97．21 64 32 10 女 11 男 93．11 254 91 急性肝炎 82．il 25 i 11・急性膵炎 12 13 男 女 65．51 O 18 14 女 58．6 11 15 男 56．5 17 1 20 16 17 女 女 ーゼの活性度が非常に増加したことも報告されて いる26）．臨床化学的には尿中に排出される抱合ス テロイドを測定するばあいには欠くべからざるも のである． ①Talalayら26）はフェノールフタレインリン 酸ナトリウムの水溶液をウサギに注射しウサギの 尿中に排出されるフェノールフタレインモノーβ一 閉塞性黄疸 グルクロニドを単離して精製し結晶を得た．これ は一次鼠色原性基質であり，pH 4．5に調製した基 質液に血清を加え38。C，1時間反応させるとフェ 721281・7雛醜 56．3 56．1 9 3σ，0σ0 25 胆嚢炎 ・引女 54，71 124 i 95 20 男 54．31163 男 47．8， 9 ， 1・！． 男 il，，．g・61L：Lq 1−EL，1 23 女 36，5i14 v’N． t ＼2α伽 ｝25認 ，、誌 N xx xx NN xN s 細，卿 ，5ミ N h．．．r N ミ 65 i肝への癌転移 22 フ■ノールtt．タレインモノーβ一クンレクロニド へ 127 i 152 1評 NN一’！’ ．一N X’X 25，蜘 ユ8 ど ど rmJExrm 肝への癌転移層 56．1！ 78 1 10 18 女 21 肝障害をおこさせたマウスの肝のβ一グルクロニダ 診断 5，，ご1θ 7エ1・一ルフタレイ1！ ・峨 ・・ミ ，L＿＝ここ＝＝ご二＿一＿＿＿＿」．こ量 胆嚢炎 レ 3ぎ。 ごコ‘ 4一二［〕 4θo 面 560 ’i ’； ；i ’＝ ミ ト ・反工て 自、μ 18 1肝への癌転移 図11 フェノー ／vフタレイソモノー，3 一グルクiコニド およひフェノールフタレインの吸光度曲線 測定すれば酵素活性度が求められる． COOH ③L−mイシルーβ一ナフチルアミド 響ゆ〆升μ『蹴 Nachlasら24）により合成され供試された二次 的色原性基質である．pH 8に調製した基質液に血 清を加え37。C，30分間反応させると酵素的水解を 受けβ一ナフトールを遊離する．これにジアゾニ ウム塩を加えると図6に見られるような紫色のア 聯 の珊 フェノールフタレイン （アルカリ性で 紅e） ゾ色素を生成するから540mμ部で吸光度を測定 して酵素活性度を求める． 図 正常値は男！8−37単位，女16−30単位であり， 12 胆嚢炎，肝臓癌などではGOT， GPTよりもロ ノールフタレインを遊離し，これにアルカリを加 イシンアミノペプチダーゼの方が早期に高い活性 えてpH 10．0∼10．4とすれば安定した紅色の色調2） を示すという19）．なお，諸種疾患のばあいの血清中 が得られる．フェノールフタレインのアルカリ性 の本酵素および二，三の酵素を表2，表3に示す． での色の極大吸収は図11に示すように550∼555 5） P一グルクロニダーゼの基質 mμ部に存し，分子吸光係数は26，600であり，フ β一グルクロニダーゼは哺乳動物の肝，腎，脾， ェノールフタレインモノーβ一グルクロニドは415 精巣上体など諸組織および体液中に含まれ粘多糖 一 243 一 ∼420mμ部に極大吸収部を有しこの部における 8 分子吸光係数ははるかに小さく130を示すにす 除蛋白せずそのまま400m双部で吸光度を測定し て酵素活性を求める．水解速度は酵素量に此弄す ぎない．従って遊離したフェノールフタレイン量 を，アルカリ性にして550mμ附近での吸光度を る． 測定することにより求めれば酵素活性度がわか 3） オキシトチナ・一一 tfの基質 る．基質の構造式および酵素的水解は，図12に示 オキシトチナーゼは脳下垂体後葉から分泌され る一種のホルモンであるオキシトチンを水解する すとおりである． ②フェノールβ一グルクロニド 酵素である．この酵素の基質としてL一シスチン Kerrらにより報告された基質であり27），二次 ビスーP一ニトロアニリドがTuppy ら20）により報 的色原性基：質であり，pH 5．2クエン酸緩衝液に血 告されている．これは一次的野原性基質であり， 清や肝ホモジネートを加え，38℃で一定時間反応 妊婦血清に応用するばあいはpH 7．4にした基質液 させると基：質が酵素的に1水解されてフェノールを に血清を加え30℃で5分反応させれば充分であ 遊離する．このフェノールをFolin−Ciocalteuの り，基質が酵素により水解されp一ニトロアニリ 試薬2S）を加えて発色（青色）させ，赤色ブイルタ ンを遊離し黄色は呈する．これを4eOmμ部で吸 ーにより吸光度を測定し酵素活性を求める． 光度を測定し酵素活性度を求める． 6）・カルボキシペプチダーゼの基質 カルボキシペプチダーゼの活性度測定は膵液， 一次的色原性基質であるグリシンーp一ニトmア ニリド，L一ロイシンーp一ニトロアニリドも血清オ 胃液などに応用される．Dunn＆Smith29）によ り二次的色原性基質であるカルボベンゾキシグリ 1500 シルーβ一1・一ナフチルアラニン，またはカルボベン グリンンーP一ニトロアニリド ゾキシグリシルーβ一2一ナフチルアラニンが酵素活 性度測定のために用いられている．後者は前者 〔1200 § ロ の4倍の速度で水解される．PH 7．4にした基質液 ミ900 歪 に消化液を加え所定時間反応させ，遊離するβサ 〕600 フトールにジアゾニウム塩を反応させると紫色の 300 アゾ色素（図6，図7）を生ずる．540miZ部で 吸光度を測定し酵素活性度を求める． ．調つ）や 一v ﾅ轟輪 30 60 ． 90 120 i50 1σ3倣s」Wm。の Ravinら30）は，カルボナフトキシーDL一フェニ ルアラニンがカルボキシペプチダーゼの優秀なる 図131血清オキヅトチナーゼによる色原性基質の水解 基質であるこ．とを述べ，生物体液に応用し好結 果を得ている．この基質は酵素により水解され キシトチナーゼにより水解されるが，L一シチシ β一ナフトールカルボン酸を生じる．これは自然に ンービスーP一ニトロアニリドの方が厭なるKmを示 脱炭酸されβ一ナフトールとなるからジアゾニウ し，すなわち酵素に対する親和性が大であるた ム塩を加えると図6の如き工作により紫色のアゾ め，これが適当な基質と思われる（図13）． 色素を生じる．これを酢酸エチルで抽出し540mμ 9） リパーゼの基質 部での吸光度を測定し酵素活性度を求める． リパーゼ測定は急性膵疾患の診断の一助として 血清アミラーゼ測定と同様に重要である． 7） トリプシンの基質 血清中にある脂酸エステルを分解する酵素を Tuppyら20）によりNα一ベンゾイルーDL一アルギ ニンーP一ニトロアニリドが合成され供試された． 2群にわけ，短鎖の脂酸エステルを水解するもの pH 8に調整した基：血液に酵素液を加え37。C，60 をエステラーゼと称し，肝，腎，膵，血清中にあ 分反応させると酵素的水解により遊離したp一＝ り，タウロコール酸により部分的に阻害される． 一方，長鎖の脂酸エステルを水解するものをリバ トロアニリンのために黄色を呈してくる．これを ー 244 一 9 一ゼと称しタウロコール酸により促進され31），主 濁したフェノールラウリン酸に一血清0．2mlを加 として膵，血清中に存在する． え37℃で30分反応させ，酵素的水解により遊離し ①β一ナフトールラウリン酸 たフェノールを，Folin−Ciocarteuのフェノール Seligmanらにより初めて合成され32），種々 試薬28）を加えて発色させ，遠沈後，赤色フィルタ その酵素的特異性を検討された33）二次的色原性基 ーを用いて吸光度を測定し酵素活性度を求める． 質である．基質液に血清を加えると水解されて この方法は，血清量および反応時闇が短縮され， β一ナフトールを遊離するので，これにジアゾニ オリーブ油を用いた測定結果と一一一・致した価が得ら ウム塩を添加し紫色のアゾ色素となし（図6），型 れる点からみて良い測定法と思われる． の如く540mμ部で吸光度を測定して酵素活性度 を求める． ②p一ニトロフェノールラウリン酸 著者ら4）は一次的色原性基質であるp一ニトロ フェノールラウリン酸をはじめて合成し，酵素特 ，7eo A 異性を検し，血清リパーゼ測定のための優れた基 ．600 光．400 質であることを報告した．pH 8．2ベロナール緩衝 B 贈げ 吸500 液にポリビニールアルコールを加えてp一ニトロ り八。一ゼ 活li生度 弓ts3 燦 ．300 フェノールラウリン酸のコロイド懸濁液をつく り，この基質液に」血清0．2mlを加えて，37。C30 c 海山テラーゼ ，2CO ，100 タウ占｝搬活賑 分反応させると酵素により水解されp一ニトロフ 添加なし ェノールを遊離してくる（図1）．これに三三のア ルカリを加えてPH 8．8となし，420mμ付近で吸 ．OOI ．003 ．005 ．007 膵mg 光度を測定し活性度を求める．著者らはp一，m一， ’図14 リパーゼ，エステラーゼ活性度の測定 o一ニトロフェノールラウリン酸を合成し供試した （ぴ…嚇・Hs・畦犠（◇OH・・H3・嚇C… が，このばあい酵素的水解により生じたp一，m一， β一ナフトー，レラ7Vン酸 ∫3一アフトール o一ニトロフェノールのpkはそれぞれ7．2，8．4， ラウリン酸 この基：質は：水に難i溶性ゆえ，pH 7．4ベロナール 緩衝液にコロイド懸濁液として用い，血清は0．2 mlあればよく37。C，5時間反応させる．オリー ブ油を基質とするCherry， Cranda11法鋤では 血清2ml，反応時聞は24時間を必要としTietzに よる変法35）を用いても．血清量21n1，反応時間は 雪 血目 膵 澗 k． O．2 @ ／．0 野 蚕 6時間必要であるのに此べれば優れているといえ よう． ．血清O．2 mlにヒト膵ホモジェネートを加え くa as．」an」」 〈α一cr〕」αS A」 a． Q一 cL at cL cl Q a一’ aJ’ aP一 a o一’ a． 61 て，タウロコール酸を添加したばあいと添加しな zzzzzzz zzzzzz2 1 1 1 1 t l l t L i l t l t Qaaft．ooE aaaaooE iU・ばあいのβ一ナフトールラウリン酸の水解速度 は図14のようになり，B一曲線がリパーゼ活性度を 図15膵および血清によるニト・フェノール脂酸 エステルの水解 示し添加した膵ホモジェネート量に比例してリパ 注＝p−NPA……p一 ＝トロフェノール酢酸 ーゼ活性度も高くなってゆく． P−NPP……P一州トロフェノールプロピオソ酸 p−NPB……p一＝ト・フェノール酪酸 p．NPL……p．ニト・フェノールラウリソ酸 o−NPB……o一ニトロフ＝ノール酪酸 o．NPL……o一ニト・フェノールラウリソ酸 m．NPL……m，ニト・フェノールラウリン酸 ② フェノールラウリン酸 Seiferらss）により合成され供試された二次的 色原性基質である．pH 7．4ベロナール緩衝液に懸 一 245 一 10 7．1であり，pk値が低いほど測定に便利なわけ 7 である．更にそれぞれの分子吸光度を求めたとこ 11 ろ，m一ニトロフェノールははなはだ低い値であ 11 り，かつpK 8という値と相まって基質としては劣 O．4 つ ることがわかった．o一ニトロフェノールの分子吸 g 光度もp一ニトロフェノールの約30％であるから o一一一〇P一ニトロフエ／「ル 摯 o・3 p一ニトロフェノールラウリン酸を基質とした． ウサギの肝，腎，膵のホモジェネーートおよび1血 択O．2 清によるニトロフェノール脂酸エステルの水解を 測定すると図15の如く，膵ではp一ニトロフェノー ロ ’ o．t 1．，．o，zトロ騰 瓶菰 ルラウリン酸の水解値が非常に高く血清はp一ニ トUフェノール酢酸の水解値が最も高く肝，腎で は血清とほぼ同様な態度を示した．前者はリパー 一Scrn， O ＋5cm ゼの活性，後者の群はエステラーゼ活性を思わせ 図17ウサギ肝抽出液の電気泳動 る． pH 7．4］XE／20リソ酸緩衝液60V，1．2mAicm2，40時間 ついで，p一ニトロフェノールを水解する酵素活 P一二トロ7エノOレ 性の細胞内分布をしらべるために，比較的に分画 ラウリン酸の水角4 餐・・ しやすいウサギの肝ホモジェネートを作りHoge− boom法により37）ミトコンドリア，ミクロソーム， 核，上清とに分画しp一ニトロフェノールラウリン o （＋） 酸の水解を測定した．この結果をde Duveの表 腿 現法により図示すると99）図16の如く，ミクロソー 工1．0 電 之 ム部にこの基質に対する酵素活性が高いことがわ （ny＞ オリーフつ由の水解 二陣 かる． （＋） o （一） 次に，ウサギ肝を超音波で破壊し100，000g×1 図18膵抽出液の電気泳動 時間の上清を澱粉を支持体とする電気泳動法によ pH 8．2M／20べ・ナール緩衝液80 V，1 mAicm220 時間 り酵素を分離し，p一ニトロフェノール酢酸，0一ニ 4 トロフェノール酪酸，p一ニトロフェノールラウリ ン酸の酵素的水解をしらべると図17の如く，電気 芝 泳動的に2つの部分が見られ，腎でも同様に2つ 葺2 の部分に分けられる． 降矢ら39）はウサギの，肝，腎の臓器抽出液を澱粉 を支持体とする電気泳動法により分画し，その画 ：分にっき数種の脂酸エステルおよびオリーブ油の 水解を検した結果から，膵ではオリーブ油を水解・ する三分によりp一ニトロフェノールラウリン酸も N M ．P S 蛋白一代目一一一L一一一一 50 o 1000／o 水解されることを確認した（図18）．このことから 図！6P一ニトロフェノールラウリン酸の酵素的水解 p一ニトロフェノールの長鎖脂酸エステルは，いわ の家兎肝細胞内分布 N…核 ゆるリパーゼにより水解されることが判明した． M：…ミトコンドリア ：P…ミクロソーム また和田43）はp一ニ トロフェノールラウリン酸を S…上清 一 246 一 11 l 腎 ◎1 炎 ● 己 1 O◎◎（X）◎ l l l l o乙 e 糖 尿病 l ee l I ÷ 。・・6・・dl l 悪性腫瘍 ＠ l ＠○●○●oo◎◎● ＠ 炎 I l ト◎◎◎ e 1 e ＠ofp＠ 疸 肝 ◎ l 肝硬変 黄 l l・ 蚤・獅蚤・ ネフローゼ o o I ・1◎◎る ・ 1 1 1 o behcet 其 ；b、，t過％。。・、 1＠＠。 ◎◎8・・； 他 oA／6＞1．4 0総蛋白＞6％ ◎L4＞妬＞i．0δ6％〉総蛋白＞4％ ●1．0＞A／6 l o ol“1 ee cDe） cto o co am co o！ en l l o ooo 1 ◎○○○（猟）OO CDe O 【 杢4％〉総蛋白 0．35 0．7 r． ’一’ O．4．．． O，8 0．D （tt20rn！D 図19諸種患者血清によるp一ニトロフェノールラウリン酸の水解 用いて血清リパーゼを定量し，この際，コリンエ geboom法37）により核，ミトコンドリア，ミクロ』 ステラーゼの阻害剤であるエゼリンを添加して ソーム，上清の露分にわけ，各種脂酸エステル， も，基質の分解速度に関係のないことを認め，コ リンエステラーゼはこの基質を分解しないと述べ BPB脂酸エステルの水解態度をしらべた． BPB一ニラウリン酸は次のように酵素的zk解さ． た．p一丁トロフェノールラウリン酸によるリパー れる．BPBのpkは4であるのでpH 8に調製し ゼ測定法を，本学中検・化学部へ提出された58例の た基質液を用いて酵素活性をしらべれば，反応後． 患者血清について応用した結果を図19に示す40）． アルカリを加えることなしにそのままBPBの遊．、 一血清によるp一ニ トロフェノールラウリン酸の水 離した量がわかるので便利である．実際にはBPB一． 解は急性膵炎で増加し，ネフローゼや重篤な腎機 ニラウリン酸をアルカリ水解して， BPB一モノラ 能障害を伴なう糖尿病未期や肝硬変，悪性腫瘍で は低下し，特に重篤な腎機能障害を伴なう糖尿病 ウリン酸となしてからこれを酵素活性度測定のた： では，急激なNPN上昇に先行してP一ニトロフ めに用いる． まとめ ェノールラウリン酸の酵素的zk解の低下が見られ 以上，Chromogenic substrateの紹介と臨床1 たのは興味深い． 化学への応用を述べた．このChromogenic sub− ④ プロムフェノール青ラウリン酸（以下BPB一 strateは非天然の基質であるから，これを用い ラウリ．ン酸と省略） た成績をただちにその構造上の類似性から，既知』 降矢ら39）はBPBとラウリルクロリドをアセト ン中でピリジンと反応させBPB一ラウリン酸を合 の酵素作用に結びつけるのは危険である． 成し家兎の肝，腎，膵のホモジェネートを作りHo一 酵素とでは同一基質に対する水解速度が異なって また，精製純化された酵素と，組織や血清中の．・ ・・B＜：＝濃−BPBラウ，。酸 くる．Hi11ら41）はChromogenic sqbstrateで・ あるL一ロイシルーβ一ナフチルアミドは，精製さ （無色） （黄色） れたロイシンアミノペプチダーゼにより非常に小． ＋ラウ・・酸．坦BPB＋ラウ・ソ酸 なる速度で水解されるが，血清や組織などによる、 （青色） 一 247 一 12 水解速度は大で．あり，これは血清や組織中の他の of plasma， phosphatase by determination of hydrolysed phenol with amino−antipyrine． 酵素によっても水解されるためであろうと述べ ている．Behalらca）も血清中ではChromogenic 11） Hudson， P．B．， H． Brendler and W．W． substrateは幾つかの酵素により水解される．可能 Scott： A simple method for ，the determin− J Clin Path 7 322 （！9． 54） ation of serum acid phosphatase． J Urol 性があるといっている．．しかし，これらの点を三 58 89 （1947）． 三し適当な処理を行なったり，酵素特異性を充分 12） Main， A．R．： The differe4tiation of the 検討した上で使用するならば，測定操作が簡単で A−type esterases in sheep serurn． Biochem 測定所要時間が短かく，少量の検査材料で酵素活 J 75 188 （1960） 13） Aldridge， W．N．： Selrurn esterases 1． Two 性度を測定しうる．したがって同時に多数の検査 types of esterases （A and B） hydrolysing p−nitrophenyl acetate， propionate and buty− 材料の処理が可．能であり，自動的測定も可能であ rate， and a method for their determinati− ろう．今後このようなChromogenic substrate on． Biochem J 53 110 （1953） の開発は酵素化学的診断の上に大いに貢献するで 14） Adams， D・H． and V．P． Whittaker：Cho− linesterases of human blood 1． Specificity of the plasma enzyme and its relation to あろう． ．終りに臨み御指導御校閲を賜わった松村教授に深謝 the erythrocyte cholinesterase． Biochim Bi− いたします． ophys Acta 3 358 （1949） （本稿の大要は， 東．京女子医科大学学会第124回例 15） Main， A．R．， K．E． Miles， and P．E． Braid： The determination of ’human−serum−cholin− ・会（昭和39年2月28日）の席上で講演した．） 文 esterase activity with o−nitrophenyl buty− 献 rate． Biochem J 78 769 （1961） 1） Omori， Y．： Phosphomonoesterase： Enzymol 16） Gomori， G．： ． Methods for quantitative es− 4 217 （1937） timatibn of hydrolytic enzymes in serum ．．2）’ Huggins， C． and P．’Talalay ： Sodium phe− and other biological fluids． Amer J Clin nolphthalein phosphate as a subst．rate for Path 24 q．9 （1954） phoSphatase tests． J Biol Che皿 159 399 17） Gomori， G．： Determination of phenol in （1945） biological material． J Lab Clin Med 34 27s ；：3）Seligma皿， A．］M． and］畷．1虹． Nachlas ：The （1949） ．． colorimetric determination of lipase and 18） Ravin， H．A：， K−C． TsDu， and txK．M． Selig− esterase in human serurn． J CIin lnvest man： Colorimetric estimation and histo− chemical demonstration of serum cholin− 29 31 （1950） ．4）降矢螢・降矢震：ニトロフェノール脂酸 esterase： J Biol Chem 191 843 （！951） 工．スチルの酵素水解．．．生．化学33615（1961） 19）Sc恥n，． H．， B． R邑ssler， u且d且・」． Weyer・ ，，・5） King， E．J．： Preparation of phenolphtha− graf： Zur Bestimmung．der Leucinamino− lein phosphate． J Path Bact 55 31！ （1943） peptidase−aktivitat in Serurn． Z Klin Chem ， ．，6） Rzhekhina， N．1．： The kinetics of hydro− 1 73 （1963） lysis of phenolphthalein Na phosphate in 20） TUppy， H・， U． Wiesbauer und E． Win− the presence of alkaline phosphatase（Rus− tersberger： AminostiureLp−nitroanilid als Substrat fttr aminopeptidasen und andere sian）． Excerpta Medica 16 495 （1963） ，’7） Bessey， O．A．， O．H． LDwry and M．」 Bre． proteolytische Fermente． Hoppe−Seyler’s Z ck ： A method for the rapid determination physiol qhem 329 278 （1962） of alkaline phosphatase with fivq cubic 21）降矢 震＝ペプチダーゼについ．て． 酵索化学 シンポジウム464（1950） millimeters of serum． J Biol Chem 164 321 （1946） 22）降矢 震：D一ペプチダーゼについて． 干葉 医学雑誌29129（1953） 23）降矢 震：m一アミノ安息香酸の水解． 干葉 医学雑誌29124（1953） T／8） Badansky， A．： Determination of serum inorganic phosphate and of serum phosph− atase． Amer J Clin Path 1 51 （1937） ・・g） King， E．J． and A．R． Armstrong ： A con− 24） Nachlas， M．M．， T．P． Goldstein， and A．M． venient method for determing serum and Seligman： An evaluation of aminopepti− dase specificity with seven chromogenic bile phosphatase activity． Canad Med Ass J 31 376 （1934） ：rlO） Kind， P．R．N． and E．J． King ： Estimation substrates． Arch Biochem Biophys 97 223 一 248 一 13 3s） Tietz， N．W． and J．D． Stepleton： An im− （1962） 25）Talal町， P．， W．H． FishMa皿and C． Hug． proved method for the determination on． lipase in serum． Amer J CIin Path 31 i48 gins：Chromogenic substrates II． Phenol− phthalein gluc血ronic acid as substrate fQr （1959） 36） Seifer， A． and G． Perle ： Photometric mic一一 the assay of glucuro且idase． J Biol Chem rodetermination of serum lipase with a 166 757 （！946） 26）Kerr， L・M．H：。 and G．A． hewy：β一glucu− phenyl laurate substrate． Clin Chem 7 178・ ronidase activity and tissue damage． Na． （196」．） 37） HcgebDom， G．H．， W．C． Schneider and ture 160 463 （1947） 27）Kerr， LM：．H．， A．F． Graham and G．A． M．J． Striebich： Cytochemical studies V． Lewy＝Use of phenol glucuronide ill the assay ofβ一glucuronidase． Bioche皿J42191 On the isolation and biochemical properties； of liver cell nuclei． J Biol Chem 196 111． （1948） （1952） 28）Foli皿，．0． and V． Ciocalteu：Tyrosine and 3s） DE Duve， C．， B．C． Pressman， R． Gianet一一 tryptophan determination in proteins． J Bi− to， R． Wattiaux and F． Appllmans，：， ol Chem 73625（！927） Tissue fractionation studies 6． lntracellular 29）Dunn， F・W・and E・L Smith：Action．of distribution patterns of enzymes in rat一” carboxypeptidase on derivatives of unnatu曽 ral aminoacids． J Biol Chem 187385（1950） liver tissue． Biochem J 60 604 （1955） 39）降矢 震・藤村真示・小林靖典・石原運雄t 加藤徳太郎：Bromophenol blue（BPB）脂酸 30）．Ravin， H．A。 and A．M。 Seligman＝The colorimetric estimation of carboxypeptidase エステルによるエステラーゼの測定． 第15回 酵素化学シンポジウム講演．集抜刷（1963） activity． J Biol Chem 190391（1951） コ 31）Wills堀tter， R． und F． Memmen＝Uber 40）降矢 榮・降矢 震：血清リパーゼによる二・ トロフェノール脂酸エステルの水解．生化学 die Wirkung des Pankreaslipase auf ver− schiedelle．Substrate． Hoppe−Seyler’s Z Phy− 34 500 （1962） tll） Hill， R．L． and E．L． Smith ： Hydrolysis o￡’ siol Chem 133 229 （1924） 32うNachlas， M．M． alld A．M． Seligman＝Evi− dence for the specificity of esterase a且d amino acid amide derivatives of 2−amino一一 fluorene， 4−aminobiphenyl and 4，4’一diamino・一 董ipase by the． use of three chromogenic biphenyl by ieucine aminopeptidase． Proc substrates． J Biol Chem 181343（1949） 33）Seligma皿， A．M． a且d M．M． Nachlas：The Soc Exptl Biol Med 92 500 （1956） 42） Behal， F．J．， R．D． Hamilton， CLB． Kana− colorimetric determination of里ipase and vage and E．C． Kelly： Studies on amino esterase in human serum． J CIin InVest 29 peptidases in human blood． Arch Biochem 3！ （1950） Biophys 100 308 （1963） 34）Cherry，1．S． and L．A． Jr． Cra聾da11：The 43）和田 恵：Lipaseの定量方法．成人．病3・54 Specificity of pancreatic lipase． Amer J （1963） Physiol 100266（1931） 一 249 一