第30回衛生微生物協議会資料（PDF

国立感染症研究所における輸入デングウイルス
感染症の検査・診断状況と
通常RT PCRプライマ の変更
通常RT-PCRプライマーの変更
平成21年7月9日
衛生微生物技術協議会 第30回研究会
ウイルス情報交換会Ⅱ
サンスクエアー堺（B棟ホール）
田島茂、小滝徹、林 昌宏、大松 勉、
高 智彦
高崎智彦、☆倉根一郎
倉
（国立感染研・ウイルス第1部）
デングウイルス検査
デング感染症疑い患者血清・尿
（日本人帰国者、外国人入国者）
発熱、頭痛、発疹、筋肉痛、関節痛等
発熱
頭痛 発疹 筋肉痛 関節痛等
血小板数減少、CRP値増加など
１）抗体検査
抗デングウイルスIgM捕捉ELISA
(IgG)
国立感染症研究所 ２）遺伝子検出検査
ウイルス第一部
Real-time PCR (TaqMan法)
第二室
C
Conventional
ti
l PCR
３）ウイルス分離
蚊由来細胞c6/36への接種
４）ウイルス抗原検査
）
抗 検査
NS1抗原検出ELISA
・血清型の特定
塩基配列の決定
・塩基配列の決定
・各地域の新規
ウイルス株の分離
トレンドの把握
古典的RT
RT--PCR用プライマー配列
primer
New D2 プライマー
sequence
gene
size(bps)
D1s
D1c
GGACTGCGTATGGAGTTTTG
ATGGGTTGTGGCCTAATCAT
E
NS1
490
DV2s
DV2c
AGRTTYGTCTGCAAACACTCC
GTGTTACTTTRATTTCCTTG
E
231
D2s
D2c
D2(TR)s
D2(TR)c
GTTCCTCTGCAAACACTCCA
GTGTTATTTTGATTTCCTTG
GCATAGAGGCTAAGCTGACC
AAGGGGACTCACTCCACAAT
E
E
E
E
230
D3s
D3c
GTGCTTACACAGCCCTATTT
TCCATTCTCCCAAGCGCCTG
E
NS1
320
D4s
D4c
CCATTATGGCTGTGTTGTTT
CTTCATCCTGCTTCACTTCT
NS2a
NS2b
398
Dus
Duc
TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG
TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC
C
PreM
511
263
D1,2,3,4;dengue type 1,2,3,4 s;sense primer, c;complimentary primer, u;universal primer
国内輸入デング感染症報告数
輸入デング感染症報告数
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009*
50
52
32
49
74
58
89
104
当室で実験室診断した
当室
実験室診断した
デング感染症例数
35
31
26
20
43
30
52
69
17
*2009年7月6日現在
2008年月別輸入デング熱症例数
13
12
11
症
症例数
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Jan
Feb
Mar
Apr
May
Jun
Jul
Aug
Sep
Oct
Nov
Dec
2008年全検査検体に占める陽性検体の割合
（検査数 131）
チクングニアウイルス
陰性
61
（47%）
1（1%）
陽性 69
（52%）
陽性患者における男女の割合
不明 1
1%
女性 27
39%
男性 41
60%
陽性患者の年代分布
不明 1
（1%
）
60代 8（12%）
10歳未満 1（1%）
50代 9
（13%）
10代 3（4%）
20代 23
（34%
）
40代 9
（13%）
30代 15
（22%
）
患者検体から同定されたデングウイルスの割合
Type 1, 17
不明 19
Type 4, 7
Type 2, 9
Type 3, 17
渡航地域別輸入デ グ感染症例数
渡航地域別輸入デング感染症例数
アフリカ, 1
アフリカ
中南米, 2
アジア・オセアニア,
ジ オ
66
Jamaica
0
6
4
Inndia-Pakistann
8
Thailannd-Philippiness
10
Singapore-Malaysia-Thaailand-Singapore
12
Thailand-Laaos-Cambodia
14
Raos-Maldives-SriLankaa
Guatemala-Honduras
Thailand-Vietnum
Malaaysia-Vietnam
m
Tuval
Cotte d'Ivoiree
・DENV-3であった。
・サウジアラビアの株に最も近縁
であったものの アジアよりも南米
であったものの、アジアよりも南米
のグループに近い。
・アフリカのデングウイルスに関する
情報が非常に少ないことから、今回
得られたウイルスは非常に貴重で
ある。
East Timor
Solomon Is.
Malaysia
Cambodia
Singapore
Myanmarr
Maldives
Vieｔnam
Philippiness
Indonesia
India
Thailand
2008年渡航国別輸入デング感染症例数
東南アジア
南アジア
東南-南アジア
東南
南アジア
オセアニア
中南米
アフリカ
2
2009年国内輸入デング感染症
陽性
１７
陰性
２１
月別報告数
感染者年代分布
男女の割合
1月
５
2月
４
4月
２
5月
６
20代
８
30代
４
50代
２
60代
１
不明
２
男性
１２
女性
４
不明
１
*2009年7月6日現在
2009年国内輸入デング感染症
ウイルス型
渡航国
1型
４
2型
６
3型
１
4型
３
不明
３
インドネシア
３
マレーシア
３
東ティモール
タイ
ベトナム
カンボジア
スリランカ
ボリビア
バヌアツ
トンガ
トンガ、マーシャル諸島
シンガポール、マレーシア
*2009年7月6日現在
2009年国内輸入チクングニヤ感染症
年国内輸
ク グ ヤ感染症
７
陽性
月別報告数
感染者年代分布
男女の割合
渡航国
1月
１
2月
１
5月
１
6月
４
40代
３
50代
３
60代
１
男性
２
女性
５
インドネシア
４
マレーシア
２
インド
１
*2009年7月6日現在
アルボウイルスレファレンスセンター
ボウイ
タ
H20年度報告
H20
年度報告
チクングニヤウイルス合成RNAの作
チクングニヤウイルス合成RNA
の作
製および配布と検査体制の確立
国立感染症研究所 ウイルス第1部第2室
H21.7.9
衛生微生物技術協議会第30回研究会
チクングニヤ熱の流行状況と媒介蚊としてのヒトスジシマカ
ヒトスジシマカの分布地
分布
2009年、タイ、マレ
2009年
タイ マレーシア
シア、インドネシア、
インドネシア
シンガポール、インドで患者数増加中
2006年日本人２名スリランカから
輸入症例確認、
009年 月 日現在、 0例が
2009年7月2日現在、10例が
確認されている。
2007年北イタリア約３００人
患者発生（１名死亡）
2008年香港１名輸入症例
2007/8年台湾空港
３名FSで検出
2005-6年インド１４０万人
2009年も流行は継続
2009年マレーシア
年
2687名患者発生
２００４年ケニヤ
温暖化と干ばつ
チクングニヤ流行
2005-6年スリランカ3.7万人
2008年秋タイに侵入、
2009年はすでに2万人を
超えている
2005-6年セーシェル1万人
年
コモロ諸島
2005-6年マヨット５千人
2009年シンガポール
299名患者発生
2005-6年モーリシャス １万人
2005-6年レニオン２４万人（人口の1/3)
（強毒株出現 約250人死亡）
インドネシアの患者数は把握で
きないが、日本にはすでに3例
の輸入症例が確認されている。
チクングニヤ熱診断体制状況
1. ウ
ウイルス遺伝子検出
遺伝 検
東京都健康安全研究センター、名古屋市衛生研究
所、三重県保健環境研究所、大阪府公衆衛生研
究所、神戸市環境保健研究所、広島県保健環境
センター、熊本県保健環境科学研究所。
（準備中：宮城県保健環境ｾﾝﾀ ）
（準備中：宮城県保健環境ｾﾝﾀｰ）
２．中和試験《可能施設（準備中）》
東京都健康安全研究センタ
東京都健康安全研究センター、名古屋市衛生研究
名古屋市衛生研究
所、大阪府公衆衛生研究所。
チクングニヤウイルス合成RNA
チクングニヤウイルス合成
RNAの作製と配布
の作製と配布
(+)RNA
非構造蛋白質
5’cap
構造蛋白質
3’Poly A
E1
9994
11310
RNA standard
10181
RT-PCR primers
10294
TaqMan RT-PCR primers & probe
プライマー
11540
10573
10849 10880
10894
塩基配列 (5'-3')
CHIK 10294s
ACGCAATTGAGCGAAGCACAT
CHIK 10
10573c
3
AAATTGTCCTGGTCTTCCTG
Taq-Chik607F（10849）
GCR CCM TCT KTA ACG GAC AT
Taq Chik672R（10894）
Taq-Chik672R（10894）
GCC CCC RAA GTC KGA GGA R
Taq-Chik638P（10880）
FAM-TACCAGCCTGCACYC-MGB-3’
患者血清中のCHIK RNAの検出
患者血清（病日）
2
RNA copies (log10)
8
9
8
7
6
5
4
3
2
1
(kbp)
(kbp)
2.5
1.5
1.0
0.7
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.05
40
RT PCR
RT-PCR
2.5
1.5
10
1.0
0.7
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.05
35
Cт
Real Time
RT-PCR
30
1.8 x 109 RNA
copies/ml
i / l
25
20
15
10
2
3
4
5
6
7
8
RNA copies/ 5μl (log10)
9
東南アジアにおけるチクングニヤ熱患者発生状況
（2008 2009）
（2008-2009）
◎マレーシアの2008年の患者数
は4 271名2009年に入り第23週
は4,271名2009年に入り第23週
までで、すでに2687人の患者が報
告されている。
告されている
◎シンガポール（Ministry of
Health）によれば、2009年第25週
までで、チクングニヤ熱患者は
299人の患者が報告されている。
◎タイでは 2009年11週までで
◎タイでは、2009年11週までで、
10559人のチクングニヤ熱患者が
報告されている。
報告されている
CTK Biotech社 IgM Rapid Test の評価
インドからの輸入症例血清
第108病日
第137病日
第137病日
(+)
(+)
マレーシアからの輸入症例血清
第1病日 第3病日 第9病日
第1病日第3病日
(-)
(-)
(+)
SD社のものも同様のイムノクロマトキットである。
IgM抗体キットの評価
抗体キ ト 評価
• タイでの使用経験からは、擬陽性はある。
• SD社はIgM
社は
ELISAキットは、capture法を採
キ は
法を採
用していないため、IgG抗体に影響される可
g
能性がある。
今年度は、米国CDCから抗アルファウイル
ス-HRP抗体を分与してもらう予定である。
新たに感染症法に収載された
アルファウイルス群の抗体検査
抗アルファウイルス-HRP抗体を用いることで
• ウマ脳炎ウイルス群
EEE,WEE,VEEの
EEE,WEE,VEE
のIgM
IgM--捕捉
捕捉ELISA
ELISAの完成
の完成