Comments
Description
Transcript
(57)【要約】 脂質代謝を制御するためのDNAまたはRNA、例えばアポA1
JP 2005-500327 A 2005.1.6 (57) 【 要 約 】 脂質代謝を制御するためのＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばアポＡ１遺伝子の肝臓へのトラン スフェクションのための方法は、気体マイクロバブルまたはマイクロスフェアを用いる、 および肝臓における遺伝子の発現を誘導するための超音波を用いる、ＤＮＡまたはＲＮＡ 遺伝子を含有する溶液の肝臓への注入を含む。 (2) JP 2005-500327 A 2005.1.6 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する溶液を肝臓脈管構造へ送達させる工程、および ｂ）溶液への暴露中に肝臓に超音波を適用し、肝臓におけるＤＮＡの発現を誘導する工程 を含む哺乳動物の肝臓へのＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションのための方法。 【請求項２】 溶液を高めた注入圧で経脈管で送達させる、請求項１記載の方法。 【請求項３】 溶液が、更に気体のマイクロバブルを含む、請求項１記載の方法。 【請求項４】 10 気体が、空気、窒素、または酸素である、請求項３記載の方法。 【請求項５】 ＤＮＡが、細胞に組み込まれたときに活発に翻訳される任意のＤＮＡである、請求項１記 載の方法。 【請求項６】 気泡が、カプセル化された気体マイクロスフェアであるか、または気泡が、１以上の界面 活性剤、脂質、タンパク質、リポタンパク質、もしくは重合体で安定化されている、請求 項３記載の方法。 【請求項７】 マイクロスフェアが、末梢血に注入される、請求項３記載の方法。 20 【請求項８】 トランスフェクションされたＤＮＡが、肝臓のコレステロール代謝を改変させる、請求項 １記載の方法。 【請求項９】 ＤＮＡが、アポＡ１をコードし、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１記 載の方法。 【請求項１０】 ＤＮＡが、アポＡ１をコードする裸のプラスミドＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。 【請求項１１】 ＤＮＡ含有溶液を高い注入圧下で送達させる、請求項３記載の方法。 30 【請求項１２】 超音波を適用して肝臓処置の領域を限定する、請求項１記載の方法。 【請求項１３】 アポＡ１をコードするＤＮＡを含む溶液を肝臓の脈管構造へ高い脈管圧下で送達させる工 程を含む、肝臓からのアポＡ１分泌を増加させるための方法。 【請求項１４】 ａ）アポＡ１遺伝子を含有するマイクロスフェアを形成する工程、 ｂ）マイクロスフェアを肝臓へ送達させる工程、および ｃ）マイクロスフェアに超音波を適用し、肝臓においてアポＡ１遺伝子の発現を誘導する 工程 40 を含むコレステロールを調節するための肝臓におけるアポＡ１遺伝子のトランスフェクシ ョンのための方法。 【請求項１５】 マイクロスフェアを末梢血に注入する、請求項１４記載の方法。 【請求項１６】 アポＡ１遺伝子が、裸のアポＡ１プラスミドＤＮＡである、請求項１４記載の方法。 【請求項１７】 医薬的に許容可能な溶液中にＤＮＡおよび安定化された気泡を含む肝臓のトランスフェク ションのための組成物。 【請求項１８】 50 (3) JP 2005-500327 A 2005.1.6 ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡを含む、請求項１７記載の組成物。 【請求項１９】 ＤＮＡが、アポＡ１をコードするプラスミドＤＮＡを含み、プロモーターに作動可能に連 結されている、請求項１７記載の組成物。 【請求項２０】 安定化された気泡が、気体を充填したマイクロスフェアを含む、請求項１７記載の組成物 。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 10 こ の 出 願 は 、 米 国 仮 出 願 出 願 番 号 60/303,784、 ２ ０ ０ １ 年 ６ 月 １ ０ 日 出 願 に 基 づ く 優 先 権を主張する。 【０００２】 本発明は、哺乳動物の肝臓へのＤＮＡのトランスフェクション、特に哺乳動物の器官、と りわけ肝臓へのＤＮＡのトランスフェクションの超音波マイクロスフェア増強に関する。 【背景技術】 【０００３】 導入遺伝子の発現を増強する目的でインビボ遺伝子治療の効率を改善する１つの研究法は Ｄ Ｎ Ａ の 細 胞 へ の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を 促 進 す る た め の 超 音 波 の 利 用 に 関 係 す る 。 Mano meら 、 Circulation、 99(20):2617-2620(1999)（ 参 照 と し て 本 明 細 書 に 組 み 入 れ ら れ る ） 20 は、超音波を用いるインビトロおよびインビボでの裸のプラスミドＤＮＡの大腸癌腫細胞 へ の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を 開 示 し て い る 。 こ の 研 究 で は 、 大 腸 菌 （ Escherichia coli)l acZま た は ベ ー タ ・ ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ 遺 伝 子 （ ベ ー タ ・ gal） を 含 有 す る レ ポ ー タ ー ｐ ｃ Ｄ ＮＡ３−ｌａｃＺプラスミド、およびネオマイシン３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝 子（ｎｅｏ）を用いて移動効率を評価した。ＭＣ３８細胞、マウス大腸癌腫細胞を同系マ ウスに移植し、裸のＤＮＡを伴うプラスミドをマウスおよび細胞に注入した。細胞を１． 2 ０ − MHz、 ２ ０ Ｗ ／ cm の 超 音 波 に 連 続 的 に 暴 露 し た 。 一 過 的 ア ッ セ イ で は 、 有 意 な 数 の 細 胞が、ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子で形質導入された。 【０００４】 Lawrieら 、 Circulation、 99(20):2617-2620(1999） は 、 イ ン ビ ト ロ で 脈 管 細 胞 の ト ラ ン ス 30 フ ェ ク シ ョ ン の 後 、 超 音 波 が 遺 伝 子 発 現 を 増 強 す る こ と を 報 告 し た 。 Lawrieら は 、 非 ウ ィ ルス性遺伝子送達を増強するため補助的な超音波の使用を研究した。この研究では、培養 ブタ脈管平滑筋細胞および内皮細胞を裸のまたはリポソーム複合ルシフェラーゼ・レポー タープラスミドでトランスフェクションした。内皮細胞のリポフェクションの後、補助的 な超音波暴露によりルシフェラーゼ活性が増強された。超音波暴露は、細胞の生存性には 影響しなかったが、脈管平滑筋細胞増殖を阻止したが、内皮細胞増殖を阻止しなかった。 【０００５】 Shohetら 、 Circulation、 101(22):2554-2556(2000)（ 参 照 と し て 本 明 細 書 に 組 み 入 れ ら れ る）は、遺伝子の形質導入のための非侵襲性の方法について記載している。この研究では 、ベータ・ガラクトシダーゼを含有し、そして構成プロモーターにより誘導される組換え 40 アデノウイルスは、アルブミンコーティングされたペルフルオロプロパン充填マイクロバ ブルの表面に結合された。次いでアデノウイルスを効率よく送達させるために同時心エコ ー図法を伴うかまたは伴わずにラット頚静脈にマイクロバブルを注入した。ウイルスを含 有する超音波媒介のマイクロバブルの破壊を行った全ラットの心臓でベータ・ガラクトシ ダーゼ導入遺伝子の心筋発現が示された。 【０００６】 Anwerら 、 Gene Ther.7(17):1516-1525(2000)は 、 分 子 医 学 の 形 態 で あ る 遺 伝 子 治 療 が 、 将 来的に医学処置に大きな影響力を有すると予測されるが、遺伝子治療の臨床使用は、十分 な、正確なそして安全なＤＮＡがインビボで標的細胞に取り込まれることを確実にする遺 伝 子 分 配 系 が 、 不 十 分 で あ る こ と に よ り 阻 ま れ て い る と 報 告 し た 。 Anwerら は 、 非 ウ イ ル 50 (4) JP 2005-500327 A 2005.1.6 ス性トランスフェクション法が安全な適用に有利であるが、とりわけインビボで、トラン ス フ ェ ク シ ョ ン 率 を 上 昇 さ せ る こ と が 有 益 で あ ろ う と 報 告 し た 。 Anwerの 研 究 は 、 イ ン ビ トロおよびインビボでのＤＮＡプラスミドの移動を増強させるために超音波の使用に注目 した。ベータ・ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼＤＮＡレポータープラスミドをイ ン ビ ト ロ で ４ つ の 細 胞 系 （ Ｎ Ｉ Ｈ ３ Ｔ ３ 繊 維 芽 細 胞 、 悪 性 メ ラ ノ ー マ Mewo、 HeLa、 Dunning 前 立 腺 腫 瘍 R3327-AT1） に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 。 超 音 波 は 、 ５ ５ （ Mewo ） か ら ２ ２ ０ 倍 （ Ａ Ｔ １ ） の 刺 激 を 誘 導 し 、 イ ン ビ ト ロ で ２ ％ （ Mewo） か ら １ ２ ％ （ Ａ Ｔ １）のトランスフェクション効率をもたらした。ベータ・ガラクトシダーゼレポーターを 用 い て コ ペ ン ハ ー ゲ ン ・ ラ ッ ト の 皮 下 に 移 植 し た Dunning 前 立 腺 腫 瘍 Ｒ ３ ３ ２ ７ − Ａ Ｔ１でインビボでの刺激を評価した。腫瘍内にＤＮＡを注入した後、集中的な超音波によ 10 り組織学的にベータ・ガラクトシダーゼ陽性細胞の１０倍増加、およびＥＬＩＳＡアッセ イにおいてベータ・ガラクトシダーゼタンパク質発現の１５倍増加が誘導された。対照的 に、静脈内プラスミド適用後に超音波が、レポーター遺伝子発現を増強することは見出さ れなかった。 【０００７】 別 の 研 究 で は 、 Anwerら 、 Gene Ther.7(21):1833-1839(2000)は 、 陽 イ オ ン 性 脂 質 基 盤 の ト ランスフェクション複合体の全身投与後の原発腫瘍への遺伝子移入に及ぼす超音波の局所 適 用 の 影 響 を 調 査 し た 。 Anwerら は 、 （ 塩 化 Ｎ − ［ （ １ − （ ２ − ３ − ジ オ レ イ ロ キ シ ） プ ロピル）］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニウム）：コレステロール基盤のトランスフ ェクション複合体の腫瘍担持マウスへの全身投与の結果、腫瘍およびその他の組織、主に 20 肺における発現に至ることが以前に示されていることを報告した。 【０００８】 脈 管 遺 伝 子 分 配 の た め の マ イ ク ロ バ ブ ル 増 強 超 音 波 技 術 が 、 Lawrieら 、 Gene Ther.7(23): 2023-2027(2000)に よ り 報 告 さ れ て お り 、 こ れ は 参 照 と し て 本 明 細 書 に 組 み 入 れ ら れ る 。 L awrieは 、 心 脈 管 遺 伝 子 治 療 の 進 歩 が 、 ウ イ ル ス ベ ク タ ー の 安 全 性 お よ び 実 用 性 な ら び に 現在の非ウイルス性トランスフェクション技術の効率の悪さに対する懸念により阻まれて いることに注目した。 【０００９】 Tachibanaら 、 に 対 す る 米 国 特 許 Ｒ ｅ ． 第 ３ ６ ９ ３ ９ 号 は 、 液 体 中 に 気 体 の マ イ ク ロ バ ブ ルを含むブースター、例えば３∼５％のヒト血清アルブミン溶液中に０．１∼１００μm 30 7 の 直 径 を 有 す る 気 体 の マ イ ク ロ バ ブ ル の 約 ４ × １ ０ セ ル ／ ml、 お よ び 超 音 波 へ の 暴 露 を 伴う、種々疾患の治療に有用であるブースターおよび医薬品を含む医薬用液体組成物につ いて記載している。 【００１０】 Ungerら に 対 す る 米 国 特 許 第 ５ ５ ４ ２ ９ ３ ５ 号 は 、 造 影 剤 ま た は 薬 物 が そ こ に カ プ セ ル 化 されている気体状の前駆体充填リポソームを含む治療用送達系を開示している。 【００１１】 ＰＣＴ公開Ｗ０８９０２４６４は、生存哺乳動物細胞への材料の導入または材料と細胞の 融合の方法を開示している。該方法は、材料の存在下で液体懸濁液中の細胞を、細胞に損 傷をあたえるのに十分な超音波励起に供することを含む。細胞または細胞膜に導入される 40 材料は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質であるのが好ましい。 【００１２】 中国特許第１０５６１２４号は、動物および植物の双方の遺伝子操作のために超音波を使 用する遺伝子伝導方法を開示している。超音波で処理するＤＮＡ溶液中の生物学的材料は 、溶液中のＤＮＡ分子が細胞内に拡散するような、生物学的材料の細胞膜に構造変化を引 き起こす。 【００１３】 ＰＣＴ公開ＷＯ９８０６８６４は、遺伝子発現を制御するために局所熱を使用する方法を 開示している。熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）遺伝子プロモーターは、選択された治療 用遺伝子で組換えられており、そして選択された細胞で発現される。局所的に調節された 50 (5) JP 2005-500327 A 2005.1.6 加熱、例えば集中的な超音波を用いてｈｓｐプロモーターを活性化する。 【００１４】 ＰＣＴ公開ＷＯ００４２９８８は、患者の組織に付着する白血球に選択的に結合する材料 物質を利用する、そこに付着する白血球を有する組織を同定および／または処置する方法 を開示している。該材料は、活性化された炎症性組織に選択的に結合する気体充填マイク ロバブル・造影剤でよい。超音波エコー図法により活性化された白血球に結合するマイク ロバブルを位置決定でき、そしてマイクロバブル・造影剤に担持される薬物または遺伝子 配列により炎症性組織を処置することができる。 【００１５】 米国特許第６２６５３８７号 ＢＩおよび２０００年８月３１日に公開されたＰＣＴ出願 10 国際公開第００／５０６１７号は、ポリヌクレオチドが細胞にトランスフェクションされ 、そして治療レベルで発現されるように、細胞に連結された脈管にポリヌクレオチドを注 入することによる哺乳動物細胞へのポリヌクレオチドの送達に関する遺伝子治療の方法を 開示している。これらの開示では、脈管内静水（物理学的）圧を増加させるか、または浸 透圧を増加させることにより、組織脈管の透過性を上昇させることによりこの脈管内投与 経路を増強する。 【００１６】 本発明にしたがって、ＤＮＡまたは等価物を末梢血に注入し、そして肝臓に超音波を当て ることにより肝臓における遺伝子発現が達成される。超音波は単独で、場合により注入圧 を上昇させて、破壊されたマイクロスフェアにより増強される場合、ＤＮＡまたは等価物 20 の核への効率のよいトランスフェクションを導く。 【００１７】 発明の概要 したがって本発明の目的は、細胞、例えば哺乳動物の肝臓またはその他の器官における遺 伝子発現を誘導する方法を提供することである。 【００１８】 本発明の別の目的は、ＤＮＡまたは等価物を肝臓にトランスフェクションするための方法 を提供することである。 【００１９】 本発明の更に別の目的は、マイクロスフェアおよび超音波を伴って、ならびに場合により 30 注入圧を上昇させて、望ましいＤＮＡまたは等価物を肝臓にトランスフェクションするた めの新たなおよび改善された方法を提供することである。 【００２０】 アポＡ１遺伝物質を肝臓に注入し、そして超音波およびマイクロスフェアを用いてアポＡ １遺伝子の肝臓細胞におけるトランスフェクションを促進してアポＡ１遺伝子の発現を増 強することにより、アポＡ１遺伝子発現を誘導することが本発明の更に別の目的である。 【００２１】 本発明の前記のおよびその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明を読むこと、 および添付の図面を参照することにより明らかになろう。 【００２２】 40 本発明は、前記の目的および利点を満たして、ＤＮＡまたは等価物を哺乳動物の肝臓また はその他の器官にトランスフェクションするための新たなおよび新規の遺伝子治療法を提 供し、該方法は、 【００２３】 ａ）ＤＮＡまたは等価物を肝臓の脈管構造に送達させる工程、および 【００２４】 ｂ）肝臓をＤＮＡに暴露している間に肝臓に超音波を適用して肝臓におけるＤＮＡの発現 を誘導する工程 を含む。 【００２５】 50 (6) JP 2005-500327 A 2005.1.6 別の態様では、マイクロスフェアまたはマイクロバブルを血液に注入してトランスフェク ション過程を増強する。場合により別の態様においては、ＤＮＡまたは等価物の注入圧を 上昇させてトランスフェクション手順を増強する。 【００２６】 発明の説明 本発明は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびＲＮＡの哺乳動物の器官、例えば肝臓 へのトランスフェクションのための材料および方法を含む。該方法は、高い注入圧、標的 器官、例えば肝臓の超音波処置、または超音波処置および注入圧の組み合わせおよび／ま たはそれとマイクロバブルもしくはマイクロスフェアとの組み合わせ、またはこれらの手 順のいずれかの組み合わせを用いてＤＮＡ含有溶液の脈管内投与を利用する。 10 【００２７】 本発明では、ＤＮＡまたは等価物は、一度哺乳動物細胞に組み込まれると活発に翻訳され 得るＤＮＡ、いずれかのプラスミドＤＮＡ、またはＤＮＡのその他の形態を意味する。Ｄ ＮＡを超音波活性物質、例えば小型の気泡と共に処方できる溶液で使用するのが好ましい 。気泡は、カプセル化された気体マイクロスフェアまたは界面活性剤、脂質、タンパク質 、リポタンパク質、および重合体のごとき材料により安定化された気泡の形態でよい。気 体はいずれの種類の気体から成ってもよいが、生理学的に適合する気体、例えば空気およ び窒素が好ましい。気泡は、血液系において気泡の循環が自由に行えるように、赤血球の 大きさに近いかまたはそれより小さい、直径およそ７ミクロンであるのが好ましい。 【００２８】 20 本明細書で用いる「トランスフェクション」なる用語は、概して分配、またはより具体的 には細胞膜の直ぐ外側から細胞膜の内側へのポリヌクレオチドの移動を意味する。ポリヌ クレオチドが、メッセンジャーＲＮＡにプロセシングされる１次ＲＮＡ転写物である場合 、リボソームが、メセンジャーＲＮＡを翻訳して細胞質内でタンパク質を生成する。ポリ ヌクレオチドが、ＤＮＡである場合、それは核に入り、そこでメッセンジャーＲＮＡに転 写されて細胞質に輸送され、そこでタンパク質に翻訳される。ポリヌクレオチドは、その 転写および翻訳に必要な配列を含有している。これには開始に必要なプロモーターおよび エンハンサー配列などがある。ＤＮＡおよびひいては対応するメッセンジャーＲＮＡ（Ｄ ＮＡから転写された）は、スプライシングされるはずのイントロン、ポリＡ付加配列、な らびにそのタンパク質への翻訳の開始および終止に必要な配列を含有する。したがって、 30 ポリヌクレオチドが、その同族タンパク質を発現する場合には、それが細胞に入っていな ければならない。 【００２９】 ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡが、細胞に分配されて治療的な細胞変化を 生み出すことができる。ポリヌクレオチドまたはその他の遺伝物質の治療目的での分配が 、遺伝子治療として記載される。ポリヌクレオチドは、タンパク質全体または部分を発現 するためにコード化され、そして直接的に器官にその場で、または次いで器官に移植され る細胞への移動により間接的に、のいずれかで送達させることができる。ＤＮＡまたはＲ ＮＡは、遺伝子治療に有用ないずれかの治療用試薬、例えば血清Ａｐｏ Ａ１またはルシ フェラーゼ酵素のヌクレオチドでよい。 40 【００３０】 肝臓の実質細胞には、肝細胞、クッパー細胞、ならびに胆管および胆小管を裏打ちする上 皮細胞などがある。肝臓実質細胞の主要な構成要素は、肝類洞の少なくとも片側、および 胆細管の反対側に存在する多角柱状肝細胞（肝臓細胞としても公知である）である。実質 細胞ではない肝臓細胞には、脈管内の細胞、例えば内皮細胞または繊維芽細胞などがある 。 【００３１】 本発明では、ポリヌクレオチドを遠位または近位の部位で肝臓脈管に送達させる。肝臓脈 管には消化管または別の内臓（例えば脾臓、膵臓、および胆嚢）から肝臓へ血液を輸送す る門脈系などがある。別の肝臓脈管は、肝臓静脈である。下大静脈または最終的に肝臓に 50 (7) JP 2005-500327 A 2005.1.6 繋がる別の脈管を介して肝臓静脈を連絡させることができる。針またはカテーテルを用い てポリヌクレオチドを脈管系に注入する。切開および組織脈管の可視化に続いて直接観察 下で注入を実施することができる。あるいは、カテーテルを遠位部位に挿入し、そして標 的組織に繋がる脈管系に存在するように通り抜けさせることができる。別の態様では、無 傷の皮膚を横切り、そして標的組織に供給またはそこから排出する脈管に入る針を用いて 注入を実施することができる。 【００３２】 肝臓では、肝臓静脈が通常肝臓から下大静脈へ血液を運ぶので、輸出脈管である。また肝 臓で門脈および肝臓動脈が通常肝臓へ血液を運ぶので、肝臓に関する輸入脈管である。プ ラスミドＤＮＡが、肝臓の流出脈管（すなわち肝臓静脈）に分配されると、効率よく発現 10 され得る。 【００３３】 本発明の方法では、場合により注入圧と組み合わせた超音波技術を用いてポリヌクレオチ ド、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡを肝臓にトランスフェクションする。 【００３４】 該方法を実施する場合に、ＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクション試薬と共に溶液に し、そして次いで脈管に注入する。ＤＮＡまたはＲＮＡ溶液は、超音波活性物質、例えば 、血液系を循環するのを可能にするほど十分に小さい直径である小型の気泡と共に処方す るのが好ましい。気体のマイクロスフェアを液体中に捕捉することによりマイクロバブル を形成する。気体は、いずれかの所望の気体でよいが、安全性の理由から、生理学的な気 20 体、例えば空気、酸素、もしくは窒素、または不活性気体、例えば貴ガス、六フッ化イオ ウまたはペルフルオロカーボンガスであるべきである。液体は、生理学的に適合するｐＨ および浸透圧を有する生理食塩水（約１から８重量％）、水性グルコース溶液、ヒト血清 アルブミン溶液の溶液等であるのが好ましい。好ましくは、泡の直径は約０．０１から約 ７ミクロンである。 【００３５】 別の態様では、いずれかの公知の方法、例えば遮蔽法により、または注射器の機能として 注 入 圧 を 上 昇 さ せ る こ と が で き る 。 注 入 圧 は 、 約 ２ か ら １ ０ 秒 間 で 約 １ か ら ５ ０ ０ mlの 溶 液を投与することにより達成される圧力であるのが好ましい。しかしながら、圧力は、肝 臓を損傷し得る圧力以下であるべきである。適当に装着された注入ポンプを用いて注入圧 30 を上昇させることができる。 【００３６】 超音波処置のために、超音波造影剤をＤＮＡまたはＲＮＡ溶液に含める。かかる造影剤は 、 市 販 に よ り 入 手 可 能 で あ り 、 そ し て Molecular Biosystems（ San Diego、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） の Optison超 音 波 造 影 剤 、 お よ び イ ン ド シ ア ニ ン ・ グ リ ー ン 溶 液 、 攪 拌 高 張 生 理 食 塩水、自己血液、または水性マグルミン・ジアトリアゾエート等がある。 【００３７】 好 ま し く は ０ ． ５ か ら １ ０ ． ０ MHzの 超 音 波 シ グ ナ ル を 提 供 す る 公 知 の 超 音 波 装 置 に よ り 超音波を適用することができる。 【００３８】 40 本発明の方法を単独で、または例えば腫瘍の処置において化学療法剤と併せることを含む 別の形態の治療との組み合わせで用いることができる。 【００３９】 アポ−Ａ１遺伝子は、アポリポタンパク質Ａ１を生成し、これは冠動脈心疾患に随伴され るアテローム性動脈硬化症を低減させるのに活発な役割を果たす。ＨＤＬ−コレステロー ル（ＨＤＬ）は、冠動脈心疾患の進展と逆相関する。高レベルのＨＤＬは、冠動脈心疾患 のリスクを低減させ、低レベルは早発性の冠動脈心疾患のリスクの著明な上昇に随伴され る。ＨＤＬは、恐らく、大抵の場合、末梢細胞（特に動脈マクロファージ）からのコレス テロールの流出を促進することにより冠動脈心疾患のリスクを低減させ、そして異化作用 のためにコレステロールを肝臓に輸送する。このプロセスは、コレステロール逆輸送して 50 (8) JP 2005-500327 A 2005.1.6 知られている。 【００４０】 コレステロール逆輸送の進行は、アポリポタンパク質Ａ１を含有し、そして実質的な脂質 含有量を欠いている初期ＨＤＬ粒子と、細胞表面のＡＢＣ１トランスポーター・タンパク 質との相互作用で開始する。ＡＢＣ１トランスポーター・タンパク質は、初期ＨＤＬと相 互作用して、コレステロールのＨＤＬ粒子への流出を促進する。アポリポタンパク質Ａ１ は、遊離のコレステロールをコレステロールエステルにエステル化する血漿酵素レシチン ・コレステロール・アシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化する。コレステロー ルエステルの疎水性特性により、コレステロールエステルは、ＨＤＬおよび脂肪のコアに 移動し、初期ＨＤＬ粒子は、コレステロールエステルでコーディングされた形状の球状に 10 なる。この成熟ＨＤＬ粒子は、脂質をＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）コレステロー ルエステルトランスファータンパク質（ＣＥＴＰ）に移すことによりそのコレステロース エステルを開放するか、またはコレステロールエステルはスカベンジャーレセプターＢ１ （ＳＲＢ１）レセプターを利用して肝臓により取り込まれる。 【００４１】 アポリポタンパク質Ａ１は、肝臓および腸において合成される。そのアミノ酸配列は同定 されている。しかしながらこれまでに、アポＡ１がどのように合成されるかを決定するの に利用できる情報はほとんどなく、したがってアポＡ１合成を上方制御する薬物は未だ開 発されていない。 【００４２】 20 アポＡ１ノックアウトマウスでは、アテローム性動脈硬化を進行させることが示されてい る。ウイルスベクターを利用する遺伝子治療によりこれらのノックアウトマウスにおける アポリポタンパク質Ａ１レベルが上昇し、そしてアテローム性動脈硬化が低減されている 。肝臓が、アポリポタンパク質Ａ１の合成に関与する主要な器官であるので、アポＡ１遺 伝子形質導入を誘導するためのウイルスベクターのヒトにおける反復接種は、現在のとこ ろ有害である可能性があり、そしてこれらの安全性の懸念のためにヒトにおいて実行可能 な治療ではない。したがって、肝臓でアポＡ１遺伝子発現を誘導するためのより安全で非 観血的経路が、希求されている。 【００４３】 本発明は、遺伝子、例えば肝臓におけるアポＡ１遺伝子発現を誘導するための非観血的経 30 路のための方法として特に適している。この手順では、前記した方法を用いて、場合によ り注入圧を上昇させて、裸のプラスミドアポＡ１ ＤＮＡを、処方を含有するマイクロス フェアまたはマイクロバブルを介して末梢血に注入する。肝臓の毛細管内皮細胞は、有窓 性であり、したがってプラスミドの肝臓細胞への取り込みの増強を可能にできる。次いで 肝臓細胞を超音波で処置して、マイクロスフェアを破壊し、そして内皮肝臓細胞の一過性 の有孔性を引き起こし、アポＡ１ ＤＮＡの進入、およびＤＮＡの内皮細胞の核へのトラ ンスフェクションを可能にする。 【００４４】 具体的な方法では、アルビノマウス（体重約２０から３０ｇのＣＤ−１）の３から６匹の マウスの尾静脈に裸のプラスミド・ベータ・ガラクトシダーゼＤＮＡ（レポーター遺伝子 40 ） ２ ０ ０ mgを マ イ ク ロ バ ブ ル 、 例 え ば Ｏ Ｐ Ｔ Ｉ Ｓ Ｏ Ｎ と 共 に 注 入 し 、 一 方 肝 臓 を 標 準 的 な 超音波撮像装置で超音波処理する。３日後、マウスを屠殺し、そして形質導入されたベー タ・ガラクトシダーゼ遺伝子を伴う細胞のパーセントに関して肝臓組織を再計算する。 【００４５】 マウス実験によりＤＮＡの最適用量、マイクロバブル、ならびに超音波を当てる期間およ び正確な位置を評価する。プラスミドを球体の内部、内部シェルに、シェル全体にわたっ て、または表面に配置することができる。その他の代替には、リポソームＤＮＡを利用す ること、またはレポーターＤＮＡと、アポＡ１プラスミドを含有するマイクロスフェアを 用いる末梢血へのトランスフェクション率を増強できるＶＥＧＦとを組み合わせること、 および肝臓に超音波を当てることなどがある。超音波は、単独でおよび破壊されたマイク 50 (9) JP 2005-500327 A 2005.1.6 ロスフェアにより増強されて肝臓の内皮細胞の一過性の有孔性を導き、それによりアポＡ １ ＤＮＡの進入およびＤＮＡの核へのトランスフェクションが可能になる。 【００４６】 一度マイクロスフェアおよびＤＮＡを決定すると、アポＡ１ノックアウトマウスにマイク ロスフェアと裸のアポＡ１プラスミドＤＮＡの組み合わせ（その他のマイクロスフェアま たはその他の形態のＤＮＡを利用することができる）を注入し、一方肝臓に超音波を当て る。主要効果評価項目は、マウス血漿中のアポＡ１のレベルである。 【００４７】 明らかに、前記の教示に鑑みて本発明の多くの修飾および変更が可能である。したがって 、本明細書で具体的に記載した以外に添付の請求の範囲内で本発明を実施できることは理 10 解されよう。 【実施例１】 【００４８】 超音波および高圧の組み合わせを用いるマウスの肝臓のトランスフェクション 【００４９】 マウスの４群に、ルシフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡプラスミドの注入の処置をし（ I.Dankoら 、 Gene Therapy 1:114(1994)） 、 肝 臓 を 志 向 さ せ た 。 体 重 ２ ０ か ら ２ ３ ｇ の マ ウスをイソフルランで麻酔した。腹部正中線切開を行い、そして門脈に２７ゲージのバタ フ ラ イ 針 で カ ニ ュ ー レ 処 置 を 施 し た 。 Harvard注 入 ポ ン プ を 用 い て 、 プ ラ ス ミ ド Ｄ Ｎ Ａ を 含有する処方を動物に投与した。２４時間後、動物の肝臓を収集し、そしてルシフェラー 20 ゼ活性に関して検定した。肝臓の小切片を病理学評価用にも調製した。血液を収集して、 肝臓損傷の指標としてＡＬＴ（アラニン・アミノトランスフェラーゼ）に関して検定した 。 【００５０】 群１：高圧分配 【００５１】 ３ 匹 の マ ウ ス に １ ０ 秒 間 か け て て Ｄ Ｎ Ａ ５ ０ μ gを 含 有 す る 生 理 食 塩 水 １ ． ０ mlを 注 入 し た。注入を行っている間に肝臓の下および上の双方でＩＶＣを閉塞し、注入中の肝臓内部 で高圧を作り出した。 【００５２】 30 群２：超音波分配 【００５３】 第 １ の マ ウ ス で は 、 肝 臓 の 下 の Ｉ Ｖ Ｃ を 閉 塞 し た 後 、 Optison超 音 波 造 影 剤 （ Molecular B iosystems、 San Diego、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ） ０ ． ３ mlと 混 合 し た Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ Ｉ Ｔ ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 試 薬 （ Mirus Corporation 、 Madison， ウ ィ ス コ ン シ ン 州 ） ０ ． ２ ml中 Ｄ Ｎ Ａ ５ ０ μ gか ら 成 る Ｄ Ｎ Ａ を 注 入 し た 。 第 ２ お よ び 第 ３ の マ ウ ス に は Ｉ Ｖ Ｃ 閉 塞 を 行 わ ず に 、 Optison ０ ． ３ mlと 混 合 し た Ｄ Ｎ Ａ ５ ０ μ gを 含 有 す る 生 理 食 塩 水 ０ ． ２ mlを 与 えた。 【００５４】 す べ て の Ｄ Ｎ Ａ 溶 液 を １ 分 間 か け て 連 続 的 に 注 入 し 、 そ し て General Electric超 音 波 撮 像 40 シ ス テ ム （ Ｖ Ｉ Ｖ Ｉ Ｄ ５ モ デ ル ） を 用 い て 肝 臓 の 超 音 波 撮 像 を １ 分 間 実 施 し た 。 Aquaゲ ル を充填したゴム手袋の親指の部分にトランスデューサーの先端部を配置した。肝臓の上に 配置するときに、ゴム手袋の先端で少量のコンタクトゲルを用いた。超音波設定は、以下 のとおりであった。メカニカルインデックス ０．５、フレーム率設定 ５２フレーム／ 秒 、 撮 像 深 度 設 定 ５ cm、 お よ び 周 波 数 １ ． ６ MHz。 肝 臓 内 の 超 音 波 撮 像 シ ス テ ム に よ り注入毎に超音波造影剤を観察した。 【００５５】 群３：超音波および高圧分配の組み合わせ 【００５６】 ３匹のマウスを準備し、そして１群および２群と同様に処置した。マウスに、注入部位の 50 (10) JP 2005-500327 A 2005.1.6 上 お よ び 下 で ２ 分 間 の Ｉ Ｖ Ｃ 閉 塞 を 維 持 し な が ら 全 量 １ ml（ Optison ０ ． ６ mlを 含 む 生 理 食 塩 水 ０ ． ４ ml中 裸 の Ｄ Ｎ Ａ ５ ０ μ g） を １ ０ 秒 間 で 与 え た 。 群 ２ の 処 置 と 同 様 に 肝 臓を１分間撮像した。 【００５７】 結果： 【００５８】 【表１】 10 20 【００５９】 処方を含有するＤＮＡの投与の間の肝臓の超音波処置により、基底値よりも１８９倍大き な平均レベルでのＤＮＡプラスミドの肝臓へのトランスフェクションが可能になった。高 圧および高圧と超音波の組み合わせにより、更に大きなレベルのルシフェラーゼＤＮＡを 30 トランスフェクションできたが、双方は観察可能なレベルの急性肝臓損傷を引き起こすよ うであった。 【実施例２】 【００６０】 アポＡ１をコードするＤＮＡでのマウスの肝臓のトランスフェクション 【００６１】 実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡをマウスに注入している間に超音波を適用する実験 を行った。ＣＭＶプロモーターを用いてヒトアポＡ１をコードするプラスミドＤＮＡを調 製した。処置後１、３、および７日に処置した動物のアポＡ１の血清レベルを測定した。 【００６２】 40 群１：超音波を伴う高圧 【００６３】 各 マ ウ ス を イ ソ フ ル ラ ン で 麻 酔 し た 。 １ ８ ７ μ l中 Ｄ Ｎ Ａ ２ ５ ０ μ g、 Optison ９ ０ ０ μ l、 お よ び 生 理 食 塩 水 ４ １ ２ ． ５ μ lか ら 成 る 注 入 物 質 全 量 １ ． ５ mlを １ ０ 秒 間 か け て 門 脈に分配した。肝臓の上および下でＩＶＣにクランプを配置した後、注入し、そして注入 後２分に除去した。肝臓に超音波を提供した直後に、ＤＮＡを注入し、そして１分間持続 し た 。 ２ ． ５ MHz ト ラ ン ス デ ュ ー サ ー を 用 い て 、 １ ． ５ MHzで 操 作 し て 、 深 度 ２ cmで 、 焦 点 ゾ ン ー ン １ cmで 、 メ カ ニ カ ル イ ン デ ッ ク ス ０ ． ５ 、 ５ ２ フ レ ー ム ／ 秒 、 お よ び 粉 末 設 定 ８ で 超 音 波 を 適 用 し た 。 ト ラ ン ス デ ュ ー サ ー 用 に ２ cmの ス タ ン ド オ フ を 形 成 す る た め に ゲル充填したラテックス手袋を用いて実験１に記載したように超音波を適用した。 50 (11) JP 2005-500327 A 2005.1.6 【００６４】 群２：高圧尾静脈注入 【００６５】 各 々 の マ ウ ス に リ ン ガ ー 溶 液 １ ． ９ ml中 Ｄ Ｎ Ａ １ ０ μ gを 含 む 注 入 物 質 １ ． ９ mlを 注 入 し た。注入物を２から３秒間かけて分配した。 【００６６】 群３：超音波を伴う高圧尾静脈注入 【００６７】 注 入 物 質 が 、 Optison ９ ５ ０ μ lを も 含 む こ と 以 外 は 群 ２ に 関 し て 記 載 し た と お り の 注 入 物 質 １ ． ９ mlを 各 マ ウ ス に 注 入 し 、 ４ か ら ５ 秒 間 か け て 分 配 し た 。 超 音 波 を 注 入 物 質 の 分 10 配開始から３０秒間適用したこと以外は実施例１に記載したように肝臓を超音波で処置し た。超音波を主に肝臓の右葉に志向させた。 【００６８】 結果： 【００６９】 【表２】 20 30 【００７０】 高圧下または圧および超音波を組み合わせて分配した場合、処方を含有するアポＡ１ Ｄ ＮＡの肝臓への投与により、基底値よりも大きな平均レベルまでＤＮＡプラスミドをトラ ンスフェクションすることができた。高圧および超音波の組み合わせで処置した数匹の動 物から急性の肝臓損傷が観察された。 【００７１】 本発明を特定の好ましい態様を参照して説明してきたが、それに関する明確な変更は、当 業者に明確になるので、本発明はそれには限定されないと考えられる。 40 (12) 【国際公開パンフレット】 JP 2005-500327 A 2005.1.6 (13) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (14) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (15) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (16) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (17) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (18) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (19) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (20) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (21) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (22) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (23) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (24) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (25) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (26) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (27) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (28) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (29) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (30) 【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】 JP 2005-500327 A 2005.1.6 (31) 【国際調査報告】 JP 2005-500327 A 2005.1.6 (32) JP 2005-500327 A 2005.1.6 (33) JP 2005-500327 A 2005.1.6 フロントページの続き 7 (51)Int.Cl. Ａ６１Ｐ ＦＩ 3/06 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｐ テーマコード（参考） 3/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 AP(GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT, BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,LU,MC,NL,PT,SE,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW, ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,ES, FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,N O,NZ,OM,PH,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZM,ZW Ｆターム(参考) 4C076 AA61 BB11 CC21 DD01 EE41 EE51 FF43 4C084 AA13 MA05 MA38 MA66 NA13 ZC331 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA38 NA13 ZC33