ビオチンーアビジン架橋の細胞工学への応用

Ⅰ
解説
ビオチンーア ビジン架橋 の 細 胞 工学 へ の 応 用
冨田昌弘
ビオチンとアビジン間の特異的親和力は古くから知られ，現在に至るまで幅広い分野で
利用されている．近年，遺伝子工学の発展に伴い，生体内で有用蛋白質を発現させる際に，
ビオチンもしくはアビジンを発現蛋白質に結合させる新たな試みがある．また， リボソー
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ムを利用した標的細胞への薬物輸送に関しても，ビオチンー
アビジン架橋を用いていくつか
のコンパー トメントをつくり，複数の ドラッグを一時に輸送できるシステムの構築が進展
している．また，さらに筆者らは， ビオチンーアビジン架橋を利用した新しいモノクローナ
ル抗体作製法の開発に成功した．本稿では，ビオチンー
アビジン架橋の細胞工学における新
展開について解説する．
【ビオ チ ンーア ビ ジ ン 】 【
細 胞 間 架 橋 】 【リ ボ ソー ム 間 架 橋 】
【蛋 白質間 架橋 】
は じめ に
子 量7万
分 子 量 数 百 の ビオ チ ン （ビ タ ミ ンH）
と分
弱 の卵 白 由 来 の ア ビ ジ ン （蛋 白質 ） 間 の親 和
を もつ ビオ チ ン ーア ビ ジ ン架 橋 に 着 目 し， 最 近 の 知 見 を
中 心 と して 概 説 す る． 従 来 ， ビオ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 は ，
力 は 非 常 に 高 く （Kd＝10-15M） ， 特 異 性 が 高 い とい わ
お もに蛋 白質 問 を中 心 と して利 用 され て きた． 近 年 ， 細
れ て い る抗 原 一抗 体 間 の親 和 力 （Kd≒10−9M） の ほ ぼ100
胞 工 学 の発 展 に 伴 い ， 細 胞 間 架 橋 ， リ ボ ソ ー ム 問 架 橋
万 倍 に匹 敵 す る． こ れ は実 に驚 くべ き数 値 で あ る ．
の 有 用 性 が 注 目 さ れ て い る． 本 稿 で は そ の 応 用 例 に つ
ア ビ ジ ン は4つ
ブ ユ ニ ッ トが1分
の サ ブ ユ ニ ッ トか ら構 成 さ れ ， 各 サ
い て解 説 す る．
子 の ビ オ チ ン と結 合 す る1）
． す な わ ち，
ア ビ ジ ン1分 子 は，4分 子 の ビオ チ ン と特 異 的 に結 合 す
る こ とが で き る． また ， ビ オ チ ン と ア ビ ジ ン間 の 結 合
は ， 高 い親 和 力 を もつ に も か か わ らず 共 有 結 合 で は な
く非 共 有 結 合 で あ る こ とが 示 さ れ て お り， ア ビ ジ ンの
1．
ト リプ トフ ァ ン残 基 が ビオ チ ン との 結 合 に 深 く関 与 し
ナ ル抗 体作 製法 の開 発
て い る1∼3）
． 近 年 ， ア ビ ジ ン の 代 わ りにStreptomyces
ビ オ チ ン ーア ビ ジ ン 架 橋 を 利 用 した 新 規 モ ノ ク ロー
本 項 で は， ビオ チ ンーア ビジ ンの 細 胞 間 架 橋 を利 用 し
avidinii由 来 の ス トレ プ トア ビ ジ ンが し ば しば 用 い られ
た効率 的新 規 モノ クロー ナル 抗体作 製 法 につ いて， 筆
て い るが ， こ れ は ス トレ プ トア ビ ジ ン が ， ビ オ チ ン と
者 ら の 研 究 を 中 心 に解 説 す る ． 一 般 に ， モ ノ ク ロ ー ナ
高 い親 和 性 を有 す る の み な らず ， 細 胞 な どへ の 非 特 異
ル 抗 体 を得 る に は， 脾 細 胞 中 に 存 在 す る抗 体 産 生B細
的 結 合 が 少 な い 特 性 を もつ か ら で あ る ．
胞 と ミエ ロ ー マ細 胞
本 稿 で は ， 特 異 性 が 高 く， しか も非 常 に 高 い親 和 性
Masahiro
Tomita，
三 重 大 学 工 学 部 分 子 素 材 工 学 科
（〒514-8507三
重 県 津 市 上 浜 町1515）
［Department
rials, Faculty of Engineering, Mie University, Kamihama-cho, Tsu, Mie 514-8507,Japan]
Application of Specific and Strong Biotin-Avidin Binding for Cell Technology
600
（
骨 髄 腫 細 胞 ） と を融 合 さ せ ， モ
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ を作 製 す る必 要
E-mail
of
Chemistry
for
Mate-
[email protected]
ビオチンー
ア ビジン架橋の細胞工学への応用
が あ る ． そ の 基 本 原 理 は ，1975年
にK?hlerとMil-
（m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide）
過 し た 現 在 で も， な お ， 彼 らの 方 法 を世 界 中 の 多 くの
用 す る方 法 を用 い た ． 図1に
研 究 者 が 利 用 して い る． し か し， この 方 法 で は ， 目的
ア ビ ジ ン の リ シ ン残 基 をMBS分
胞 と ミエ ロ ー マ 細 胞 以 外 の もの とで 非 特 異 的 な
（N-hydroxysuccinimide）
を利
示 す よ うに ， まず 初 め に，
子 中 に存 在 す るNHS
基 を利 用 し て 修 飾 す る． こ
融 合 を 起 こす た め融 合 効 率 が 非 常 に低 く， 目 的 の モ ノ
の 際 ， ア ビ ジ ン内 に 存 在 す る シ ス テ イ ン 残 基 は す べ て
ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ を 得 る の に 多 くの
ジ ス ル フ ィ ド結 合 を形 成 して い る た め ’6）
，MBSは
時 間 と労 力 を 必 要 とす る ．
ジ ンの リシ ン 残 基 との み 選 択 的 に 共 有 結 合 を形 成 す る ．
そ こで ， そ の 欠 点 を是 正 し， 効 率 的 な モ ノ ク ロ ー ナ
次 に，MBSの
アビ
他 方 の 官 能 基 で あ るマ レ イ ミ ド基 を利 用
ル 抗 体 の 作 製 を 可 能 に した の が ， こ こで 述 べ る 新 規 モ
し， 抗 原 の シ ス テ イ ン残 基 と反 応 させ ， チ オ エ ー テ ル
ノ クローナ ル抗体 作 製法 で ある． この方法 の基 本原 理
結 合 を形 成 さ せ る． 結 果 と して，MBSを
は ，① 抗 原 に よ るB細
ア ビ ジ ンが 結 合 した 抗 原-（MBS）-ア
生B細
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原 性 を保 持 で き， しか も， 修 飾 後 の安 定 性 が 高 いMBS
stein4）が 初 め て 示 し た ． 報 告 さ れ て か ら二 十 数 年 が 経
のB細
53
胞 認 識 を利 用 した 目 的 の 抗 体 産
胞 の 選 択 ， ② ビ オ チ ン ーア ビ ジ ン 問 の 特 異 的 親
介 して抗 原 と
ビ ジ ンが 水 溶 液 中
で 効 率 よ く作 製 で き る． こ の 抗 原 コ ン ジ ュ ゲ ー トを用
和 力 に基 づ く， ミエ ロ ー マ 細 胞 と抗 原 選 択 され たB細
い ， 目 的 の 抗 体 産 生B細
胞 との 架 橋 形 成 ， ③ 電 気 パ ル ス を利 用 した 目 的 のB細
に利 用 可 能 な シス テ イ ン残 基 が な い場 合 には2−iminoth−
胞 一ミエ ロー マ 細 胞 複 合 体 の 選 択 的 融 合 で あ る5-15）
．す
iolane（Traut’s
な わ ち， 抗 原 感 作 さ れ たB細
胞 上 に発 現 さ れ る抗 原 レ
る17・18）
．
セ プ タ ー を 介 し て 目 的 のB細
胞 を選 択 後 ， ビオ チ ンーア
ビ ジ ン間 の 高 い 親 和 力 を利 用 して 目的 のB細
胞 と ミエ
胞 を選 択 す る． こ こで ， 抗 原
reagent）
を 利 用 す る こ と も可 能 で あ
ビオ チ ン ーア ビ ジ ン架 橋 形 成 に 必 要 とな る ミエ ロー マ
細 胞 の ビオ チ ン化 法 を 図2に 示 す ． この 場 合 ，NHS-ビ
ロ ー マ 細 胞 間 に架 橋 を 形 成 させ る． 次 に ， 架 橋 形 成 さ
オ チ ン を用 い ， ミエ ロ ー マ 細 胞 膜 上 に 存 在 す る 蛋 白 質
れ たB細
の リ シ ン残 基 の ビオ チ ン化 を行 な う．
胞 一ミエ ロ ー マ細 胞 複 合 体 を 電 気 パ ル ス に よ っ
て 選 択 的 に 融 合 さ せ ， 目的 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生
ハ イ ブ リ ドー マ を 作 製 す る ．
そ れ 以 後 の 方 法 を図3に
示 す ． す な わ ち ， 抗 原 一ア ビ
ジ ン を 用 い， 抗 原 感 作 され たB細
こ こ で は ， と くに この 新 規 法 に お い て 重 要 な ポ イ ン
抗 原 レ セ プ タ ー を介 し て 目 的 のB細
胞 表 面 上 に存 在 す る
胞 を 選 択 した の ち，
トの 一 つ と な る， ビオ チ ンーア ビ ジ ン に よ る細 胞 間 架 橋
ビ オ チ ンーア ビジ ン間 の高 い 親 和 力 を利 用 して ミエ ロ ー
形 成 に必 要 な抗 原 コ ン ジ ュ ゲ ー トの 作 製 法 を 述 べ る．
マ細 胞 と架 橋 を形 成 させ る． そ して， 目的 のB細
筆 者 ら は， 抗 原 コ ン ジ ュゲ ー トの作 製 法 の なか で ， 抗
胞 一
抗
原 一ア ビ ジ ン ービオ チ ンーミエ ロ ー マ細 胞 複 合 体 に 対 して ，
矩 形 波 の電 気 パル ス （2．0∼3．0
kV／cm）
をマ イ クロ秒 の短 時
間 負荷 す る こ とによ って選択
的 に両 細 胞 を融 合 させ ， 目 的
のモ ノ クロー ナル抗 体産 生 ハ
イ ブ リ ドー マ を 作 製 す る ． こ
の新規 モ ノ クロー ナル抗 体作
製 法 は ， 従 来 の ポ リエ チ レ ン
グ リコ ー ル 法19）と比 べ ， 目 的
の モ ノ クロー ナル抗 体産 生ハ
イ ブ リ ドー マ の 作 製 効 率 を ，
少 な く と も1桁
高い値 とし
たis）
． また ， 抗 原 の リ シ ン残
基 を 修 飾 す る た め抗 原 性 の 低
図1抗
原 コ ン ジ ュ ゲ ー トの 作 製 法
ヘ テ ロ 官 能基 を有 す る 化 学 修 飾 剤 で あ るMBSを
法 で あ る． そ の原 理 は ，MBSのNHS基
介 して， 抗 原 とア ビジ ン と を共 有 結 合 させ る方
に よ っ て ア ビジ ンの リシ ン残 基 を， またMBSの
ミ ド基 を利 用 して抗 原 の シ ス テ イ ン残 基 を結 合 させ る ．
マ レイ
下 が 懸 念 され た 抗 原 一ビオ チ ン
を 用 い た 場 合 も， 従 来 法 と比
べ 良 好 な結 果 を 得 る こ とが で
601
54
蛋白質 核酸 酵素 VoL.45No.4（2000）
経 て 進 行 す る． し か し ， この
こ と は ， あ く まで も予 測 で あ
って実証 され てい な い． そ こ
で ， 蛍 光 標 識 を利 用 し た 可 視
化 解 析法 を用 い る ことに よっ
て ， 図3の
各 ス テ ップ の 検 証
を行 なった． まず， 抗原 に よ
るB細
胞 認 識 の 解 析 には ， 抗
原 選 択 され たB細
胞 一抗 原 一ア
ビ ジ ン複 合 体 に対 して 特 異 的
図2ミ
蛍 光 標 識 物 質 ビオ チ ンヲ ィコ
エ ロー マ 細 胞 の ビ オ チ ン 化
NHS-ビ
エ リ ス リ ン （PE） を利 用 し て
オ チ ン を用 い て ミエ ロ ー マ 細胞 表 面 に 存 在 す る蛋 白質 の リシ ン残 基 を修 飾 して ミエ ロ
マ 細 胞 の ビオ チ ン化 を行 な う方 法 で あ る．
検 出 した ． ま た ， ビ オ チ ン化
ミエ ロー マ 細 胞 は ， ス ト レ プ
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トア ビ ジ ンーロ ー ダ ミ ン （Rh）
に よ っ て 蛍 光 標 識 を行 な い 検
証 し た ． 一 方 ， 抗 原 選 択 され
たB細
胞-ミ エ ロ ー マ 細 胞 複
合 体 の 場 合 は，B細
胞 に対 し
て は 抗 原-フ ル オ レセ イ ンイ ソ
チ オ シ ア ネ ー ト （FITC） ， ま
た ， ミエ ロ ー マ 細 胞 に 対 して
は ス トレ プ トア ビ ジ ン-Rhに
よ っ て 蛍 光 標 識 を行 な い 解 析
した． この方法 は，蛍光 波 長
の 異 な る2種
の蛍光 物 質で お
の お のの細胞 を標識 す るこ と
図3新
規 モ ノク ロー ナ ル抗 体作 製 法
抗 原 に よ るB細
胞 認 識 機 構 を利 用 して ， 目的 のB細
に よ っ て ，B細
胞 を抗 原 一ア ビ ジン に よ って選 択 後， ビオ チ
ンーア ビジ ン架 橋 を利 用 して ビオ チ ン化 ミエ ローマ 細 胞 と結 合 させ る ． 最 終 的 にB細
胞 は緑 色 に，
また ， ミエ ロ ー マ 細 胞 は 赤 色
胞 一抗 原 一ア
ビ ジ ン-ビ オ チ ン-ミ エ ロ ー マ 細 胞 複 合 体 に対 して 電 気 パ ル ス を 負荷 して選 択 的 に融 合 を行 な い，
に標 識 さ れ ， 目 的 のB細
目的 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドーマ を作 製 す る ．
胞一
ミエ ロ ー マ 細 胞 複 合 体 を 可 視
的 に検 出 で き る特 徴 を もつ （
図
き た9）
．
4，p．604）． また ， さ らに ， 二 重 蛍 光 標 識 され た 両 細 胞
この 成 功 の ポ イ ン トは ， ビオ チ ンーア ビ ジ ン に よ っ て
目 的 のB細
胞 と ミエ ロー マ細 胞 間 に架 橋 を形 成 させ ， 細
に 対 し て前 述 の よ うに 矩 形 波 の 電 気 パ ル ス を 負 荷 し て
融 合 させ た と こ ろ，FITCの
緑 色 とRhの
赤 色 の混 合 色
胞 間 接 触 を もた ら した こ と に あ る ． す な わ ち ， 電 気 パ
で あ る 黄 色 を呈 す る ハ イ ブ リ ドー マ を確 認 す る こ と が
ル ス 負 荷 に よ っ て これ らの 細 胞 の み が 選 択 的 に 融 合 さ
で き た ． 以 上 の 解 析 結 果 よ り， 図3に
示 され る各 ス テ
れ る ． よ っ て， 理 論 上 ， こ の 新 規 法 に よ っ て 作 製 さ れ
ッ プ が ， 筆 者 らの 予 測 に基 づ き推 移 し て い る こ と を初
る す べ て の ハ イ ブ リ ドー マ は 目的 の モ ノ ク ロー ナ ル 抗
め て 明 ら か に す る こ と に成 功 し た15）
．
体 を産 生 す る こ と が で き る．
3．
2．
新 規 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 作 製 法 の 可 視 化 解 析
ビ オ チ ン ーア ビジ ン架 橋 を介 した 新 規 モ ノ ク ロー ナ ル
抗 体 作 製 法 は， 理 論 的 に は図3に
602
示 された ステ ップ を
新 規 モ ノク ロ ー ナ ル 抗 体 作 製 法 の 応 用
ビ オ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 を利 用 した 新 規 モ ノ ク ロー ナ
ル 抗 体 作 製 法 の応 用 例 と して 第1番
目 に あ げ られ る の
は ， ペ プ チ ド抗 原 の 利 用 で あ る． ペ プ チ ド抗 原 は ， 遺
2
ビオチ ンーアビジン架橋の細胞工学への応用
伝 子 工 学 的 手 法 を用 い て ア ミ ノ酸 配 列 を 予 測 し構 築 で
と会 合 リボ ソ ー ム を 混 合 す る と， 新 た な ビオ チ ンース ト
き る の で ， 生 体 内 に 微 量 に しか 存 在 し な い 目 的 の 抗 原
レ プ トア ビ ジ ン架 橋 に基 づ き， シ ー トは巻 き戻 り， 図
を 精 製 す る必 要 が な い ． 筆 者 ら は， す で に アル ツハ イ
5に 示 す よ うなvesosomeを
マ ー 病 関 連 蛋 白 質 で あ る プ レ セ ニ リ ン1の 親 水 性ル ー
来 と は 異 な り複 数 の 薬 物 あ る い は 物 質 を混 合 す る こ と
プ 領 域 の ペ プ チ ド配 列 を利 用 し て， こ の新 規 法 が ペ プ
な く同 時 に 運 べ る利 点 を も つ ． そ れ ゆ え， リ ボ ソ ー ム
チ ド抗 原 に も応 用 で き る 成 果 を得 て い る15）
．
を 用 い た 標 的 細 胞 へ の 薬 物 輸 送 に お け る， 画 期 的 な 研
さ らに ， 生 体 外 免 疫 法 へ の 応 用 も可 能 と考 え られ る．
生 体 外 免 疫 法 は， モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 作 製 にお い て約
1カ 月 の免 疫 期 間 を必 要 とす る従 来 の生 体 内 免 疫 法 と比
べ ， 免 疫 期 間 を3∼5日
形 成 す る． この 手 法 は ， 従
究 の 一 つ で あ る と考 え られ る ． 将 来 の 発 展 が 大 い に 望
まれ る．
ま た ，virosomeと
よ ばれ るヘ マ グル チ ニ ン を含 む 再
間 と極 端 に短 縮 で き る特 徴 を も
構 成 さ れ た イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス エ ンベ ロー プ が ビ
つ． す なわ ち，短 時 間で 目的 のモ ノク ローナル抗体 を
オ チ ン ーア ビ ジ ン架 橋 を 介 し て リボ ソー ム と結 合 した の
効 率 的 に作 製 で き る可 能 性 を秘 め て い る． 生 体 外 免 疫
ち に 融 合 す る との 報 告 が あ る25）
． これ は， ビオ チ ン ーア
法 を 用 い た 新 規 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 法 も筆 者 ら に よ っ
ビ ジ ン架 橋 に よっ てvirosomeと
て 進 展 して お り， こ の 方 法 の一 番 の ポ イ ン トで あ る， 生
酸 性pH領
体 外 で 抗 原 感 作 さ れ たB細
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55
胞 が抗 原 に よ っ て認 識 され
リボ ソー ム を結 合 させ ，
域 で 膜 融 合 を惹 起 す る ヘ マ グル チ ニ ン に よ っ
て両 者 が 融 合 す る こ と を意 味 し て い る． す な わ ち ，vi−
る結 果 を得 て い る ． した が っ て， 生 体 外 免 疫 法 を利 用
rosomeも
し た新 た な る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 作 製 方 法 の 開 発 も近
き る 可 能 性 を もつ も の と考 え られ る．
い 将 来 実 現 で き る．
， 将 来 ， あ る 目 的 細 胞 へ の薬 物 輸 送 に利 用 で
そ の 他 に， ビ オ チ ン化 リ ン脂 質 を 含 む 陽 イ オ ン リポ
ソ ー ム ど う し を ア ビ ジ ン添 加 に よ り架 橋 形 成 させ た の
ち， カ オ トロ ピ ック 陰 イオ ン ， す なわ ち 硝 酸 イ オ ン， ポ
リア スパ ラギ ン酸 な どを添 加 して融 合 させ る例 もあ る26）
．
標 的 細 胞 へ の 選 択 的輸 送 は 薬 物 輸 送 に お い て 重 要 な
本 節 で は， 初 め に ビ オ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 を利 用 した
意 味 を もっ ． そ の 目 的 の た め の 重 要 な 手 法 と し て ， 抗
リ ボ ソー ム の 標 的 細 胞 へ の 薬 物 輸 送 に ス ポ ッ トを あ て
体 の リ ボ ソ ー ム へ の 結 合 が 考 え られ る． 従 来 は ， シ ス
て 述 べ る． 従 来 か らの リボ ソー ム 間 の 凝 集 方 法 と して
テ イ ン残 基 を利 用 し て抗 体 を リボ ソ ー ム に 共 有 結 合 さ
は ， 浸 透 圧 負 荷 とCa2＋ 添 加 が 報 告 さ れ て い るが20・21）
，
せ て い た ． しか し， 近 年 の 新 しい 方 法 と して ， 穏 和 な
これ らの 方 法 は ， リ ボ ソー ム の 極 端 な 形 状 変 化 を もた
条 件 下 で 抗 体 の ビオ チ ン化 を 行 な い ， ス トレ プ トア ビ
らす 可 能 性 が あ る． 近 年 ， ビオ チ ンース トレ プ トア ビ ジ
ジ ン 化 さ れ た リボ ソ ー ム と架 橋 形 成 させ 抗 体 リ ボ ソー
ン 架 橋 を利 用 した 新 し い リボ ソ ー ム 会 合 法 が 示 さ れ て
ム を作 製 す る 方 法 が あ る27）
． また ， ビオ チ ンー抗 体 を ス
い る22・23）
． この 方 法 の 特 徴 は， リボ ソーム の会 合 が制 御
トレ プ トア ビ ジ ン を介 して ビ オ チ ン化 さ れ た リボ ソー
可 能 で あ る と同 時 に 可 逆 性 を もた せ る こ とが で き る と
ム へ 結 合 させ る こ と も可 能 で あ る28,29）
． こ こで， 多 くの
こ ろ に あ る． し か し， リボ ソ ー ム 会 合 の 可 逆 性 に つ い
研 究 者 が ， ア ビ ジ ン の代 わ り に ス ト レ プ トア ビ ジ ン を
て は ， さ ら な る検 討 が 必 要 と考 え ら れ る． 現 在 ， この
用 い る 理 由 は ， 両 者 の等 電 点 ＊1の違 い に起 因 し て い る
新 規 リボ ソ ー ム 会 合 法 は ， ビオ チ ン-ス トレ プ トア ビ ジ
と考 え ら れ る ． す な わ ち ， ス ト レ プ トア ビ ジ ン の 等 電
ン架 橋 を利 用 した 自己 会 合 に基 づ くvesosomeと
点 は酸1生領 域30）に存 在 す る の に対 し て ， ア ビ ジ ン の 等
よばれ
る マ ル チ コ ンパ ー トメ ン トを有 す る小 胞 の 作 製 法 へ と
電 点 は ， ほ ぼpH10の
進 展 し て い る24）
． そ の作 製 法 を 図5（p．604）に 示 す ． ま
生 理 的 条 件 下 の 中 性pH領
ず ， 負 電 荷 を もつ ビオ チ ン化 リボ ソー ム にCa2＋ を添 加
して い る の で ， 負 に 帯 電 し た 細 胞 膜 お よ び 他 の 負 電 荷
し渦 巻 き状 の シ ー ト と し， さ ら に， ス トレ プ トア ビ ジ
を も つ 物 質 に非 特 異 的 に 結 合 す る 危 険 性 が あ る か らで
ン を 加 え表 面 を ア ビ ジ ン化 す る ． 一 方 ， ビオ チ ン化 リ
あ る． 第1節
ボ ソー ム に ス トレ プ トア ビ ジ ン を加 え 架 橋 形 成 させ 会
ア ビジ ン の リシ ン残 基 がMBSに
合 リボ ソ ー ム を作 製 す る． 最 終 的 に， 渦 巻 き状 シ ー ト
等 電 点 は塩 基 性 側 か ら 中 性 側 へ と移 行 し， ア ビ ジ ン の
＊1蛋
弱 塩 基 性 側 に あ る31）
． そ のた め，
域 で は， ア ビ ジンは正 に帯 電
で 述 べ た 抗 原-（MBS）-ア
ビジ ンの 場 合 は ，
よ って 修 飾 され るた め ，
白質 分 子 の 電 荷 の 総 和 が ゼ ロ とな るpH．
603
56
蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.45No，4（2000)
ビオ チ ン ーア ビ ジ ン架 橋 に よ っ て リボ ソー ム 問 に 凝 集 を
起 こ させ て ， 過 剰 の ビ オ チ ン化 リ ボ ソ ー ム をマ ウ ス体
内 か ら取 り除 く． この 方 法 に よ り腫 瘍 細 胞 の 迅 速 な イ
メ ー ジ ング が 可 能 とな っ た32｝
． これ は， い ま まで の リポ
ソ ー ム に お け る ， ビオ チン ーア ビジ ン架 橋 とは異 な る利
用 法 で は あ るが ， 今 後 ， 医 療 分 野 で の 応 用 が 期 待 で き
る．
Ⅲ.ビオチンーアビジンの蛋白質間および分子間架橋とその
応用
一般的に
， この 分 野 の ビオ チ ンーア ビジ ン架 橋 は， 酵
素 免 疫 測 定 （ELISA)法
FITC+Rh
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図4目
的 のB細
目的 のB細
お よ び 免 疫 プ ロ ッ ト法 に 多 く
利 用 さ れ て い る ． た とえ ば ，ELISA法
胞 一ミエ ロー マ 細 胞 複 合 体
胞 一抗 原 一ア ビ ジ ンービ オチ ンーミエ ロー マ 細 胞 複 合 体 を
抗 原 一FITC， ス トレ プ トア ビジ ンーRhに て 二 重 蛍 光 標 識 を行 な い ，
に お いて ， ビオ
チ ン化 さ れ た 抗 体 と ア ビ ジ ン化 さ れ た 標 識 酵 素 を利 用
して， 目 的 の 抗 原 を 高 感 度 で 定 量 す る 報 告 が あ る33）
．ま
共 焦 点 レーザ ー 顕微 鏡 を用 い て可 視 化 解 析 を行 な っ た結 果 で あ る ．
た ， ビオ チ ン ーア ビ ジ ン架 橋 を 利 用 したEHSA法
B細 胞 は 緑 色
療 診 断 へ の 応 用 例 と し て ， ビ オ チ ン化 さ れ た ピ ア ル ロ
ミエ ロ ー マ 細胞 は 赤 色 に 蛍 光 標 識 され て い る．
の医
ン酸 結 合 蛋 白質 とア ビ ジ ンー標 識 酵 素 を利 用 して ピア ル
正 電 荷 が 打 ち 消 さ れ る 方 向 に 変 化 して い る もの と考 え
ロ ン酸 の 定 量 を ピ コ グ ラム レベ ル まで 可 能 と し， ヒ ト ・
られ る ．
リ ウ マ トイ ド関 節 炎 ， 骨 関 節 炎 の 診 断 に利 用 し た 例 が
他 の ビオ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 の 利 用 方 法 と して ，67Ga
あ る34)．
また は1111n標 識 さ れ た ビオ チ ン化 リボ ソー ム を腫 瘍 を
しか し， 近 年 ， 従 来 とは 異 な る 方 向 で の 新 た な 進 展
もつ∀ ウ ス に 投 与 し ， 腫 瘍 の イ メ ー ジ ン グ が 試 み られ
が み ら れ る ． そ の 一 例 は， 遺 伝 子 操 作 を利 用 し て ， 有
て い る ． こ の 際 ， 過 剰 の リ ボ ソー ム が 存 在 す る と， イ
用 蛋 白 質 と酵 素 的 に ビオ チ ン 化 さ れ る 配 列 の キ メ ラ分
メ ー ジ ン グ が 妨 害 され る． そ こで ， ア ビジ ン を注 射 し，
子 を 発 現 す る方 法 で あ る． こ の キ メ ラ 分 子 は発 現 され
た の ち に ビオ チ ン ・ラ イ ゲ ー
ス に よ り生 体 内 で ビ オ チ ン化
さ れ る の で ， ア ビ ジ ンカ ラ ム
を利 用 し て 分 離 ・精 製 す る こ
とが で きる35,36)．さ らに， ビオ
チ ン化 蛋 白 質 に 特 異 的 な 親 和
力 を 有 す る 目 的 の 蛋 白質 を結
合 さ せ ， ビ オ チ ンー蛋 白 質 一目
的の 蛋 白質複 合体 をア ビ ジン
に よ っ て選 択 的 に トラ ップ し，
目的 の 蛋 白 質 の 分 離 に利 用 す
る試 み も な さ れ て い る37)．ま
た ， 化 学 的 手 法 に よ る抗 体 の
ビオ チ ン 化 で は な く， 抗 体 を
図5vesosomeの
作製法
発 現 させ る 際 に直 接 ビオ チ ン
負 電荷 を も つ ビオ チ ン化 リボ ソ ー ム にCap＋ を添 加 後 ， ス トレプ トア ビジ ンを加 え渦 巻 き状 シー
化 を 行 な う報 告 例 もあ る38)．
トの 表 面 を ア ビジ ン化 す る． 一 方， ビオ チ ン化 リボ ソー ム にス トレプ トア ビ ジ ン を添 加 して 会
合 リボ ソ ー ム を 作 製 す る． 両 者 を混 合 し， 新 た な ビオ チ ンーア ビジ ン架 橋 を形 成 させ る こ とに よ
生 体 内 で の 蛋 白質 の ビオ チ ン
りvesosomeを
化 は， 目 的 の 蛋 白 質 を 化 学 修
604
作 製 す る． （文 献24を
改変）
ビオチ ンーアビジン架橋の細胞工学への応用
飾 す る こ と な く ビ オ チ ン化 で き る た め， 有 効 な 手 法 の
1つ で あ る ．
さ ら に， 生 体 内 で ア ビ ジ ン を結 合 し た 融 合 蛋 白 質 を
57
今 後 ， ビ オ チ ン ーア ビ ジ ン 架 橋 は ， そ の 高 い 選 択 性 ，
親 和 性 を も つ ゆ え ， 多 分 野 に わ た っ て い ま まで 以 上 に
利 用 さ れ る もの と予 測 され る ．21世 紀 に向 け ， ビ オ チ
発 現 させ る研 究 も進 展 して い る． す な わ ち ， 抗 体 と ア
ンーア ビ ジ ン架 橋 の 医 療 ， 産 業 で の さ ら な る新 展 開 が 期
ビ ジ ン との融 合 蛋 白 質 に 対 して ビオ チ ン 化 さ れ た 物 質
待 され る．
（
た と え ば薬 物 また は ペ プ チ ド）を結 合 さ せ た の ち， こ
の 複 合 体 を抗 原 を発 現 して い る標 的 細 胞 に 選 択 的 に 輸
送 す る39）
． 種 々 の物 質 を 目 的 の 細 胞 に運 ぶ 手 段 と して ，
有 用 な 方 法 で あ る と考 え られ る．
非 常 に興 味 深 い 報 告 と して ， ビオ チ ンーア ビ ジ ンの 親
和 力 を 利 用 し て 標 的 物 質 を トラ ップ し た後 ， 光 照 射 に
文
1)
2)
よ っ て 標 的 物 質 を ビオ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 か ら分 離 す る
方 法 が あ る40）
． す な わ ち， ビオチ ンが 結 合 した光 感 受 性
ア ー ム の 一 端 に 結 合 し た標 的 物 質 を ビオ チ ンーア ビ ジ ン
Database Center for Life Science Online Service
架 橋 を 利 用 し て 分 離 ・精 製 後 ， 光 照 射 に よ っ て 光 感 受
3)
4)
5)
性 ア ー ム を切 断 し標 的 物 質 を効 率 よ く回 収 す る こ とが
で き る．
そ の 他 の 利 用 方 法 と し て ， β-ラ ク タ ム抗 生 物 質 の側
鎖 の ア ミノ基 を利 用 して ビオ チ ン を結 合 させ た の ち， ペ
6)
7)
ニ シ リン結 合 蛋 白質 を 分 離 す る方 法41）があ る． また， あ
る蛍 光 性 物 質 を 介 し て ビ オ チ ン を 糖 鎖 に 結 合 させ ， ビ
オ チ ン糖 鎖 複 合 体 を 作 製 す る こ ともで き る． この 複 合
体 を 利 用 して オ リ ゴ糖 特 異 的 レ セ プ タ ー の 検 出 ・分 離
8)
に利 用 す る例42） も あ る． さ らに ， ビオ チ ン標 識 され た
ヌ ク レ オ チ ドを 利 用 して ビ オ チ ン化 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド
を合 成 し， こ の物 質 を利 用 して 特 定 のDNA，RNAの
9)
10)
検 出 ・分 離 に応 用 す る な ど の 報 告 が あ る43）
．
ビオ チ ン は そ の 分 子 量 が 数 百 と小 さ い た め ， 効 率 よ
11)
く目的 物 質 に 結 合 さ せ る こ とが で き る． と くに ，NHSビオ チ ン を利 用 し た ビ オ チ ン化 は ， 簡 便 か つ穏 和 な 条
12)
件 下 で 反 応 が 進 行 す る た め， 目的 物 質 の機 能 を ほ と ん
ど損 う こ とな く ビ オ チ ン化 が で き る と考 え られ る ．
13）
献
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冨 田 昌 弘
・Tsong,T．Y．
：生 物 物 理 ，34，86-89
(1994)
14)
お わ りに
ビオ チ ン ーア ビ ジ ンお よ び ビ オ チ ン ース トレ
15）
プ トア ビジ ン架 橋 に 関 す る報 告 例 として ， 実 に7，000以
上 の 膨 大 な 数 の論 文 発 表 が 現 在 ま で の と こ ろ あ る ． 多
方 面 で この 特 異 的 架 橋 が 応 用 され て い る こ と を う か が
い 知 る こ とが で き る ． 本 稿 で は ふ れ な か っ た が ， エ ン
ド ソ ー ム と リ ソ ソ ー ム の 膜 融 合 の検 出 に も ビ オ チ ンーア
会 シ ン ポ ジ ウ ム ，P.15（1999）
16)
17)
18)
ビ ジ ン架 橋 を利 用 す る 方 法 が あ る． また ， 将 来 ， 標 的
細 胞 へ の 選 択 的 か つ 効 率 的 な遺 伝 子 導 入 や 遺 伝 子 治 療
に お い て も ビオ チ ンーア ビ ジ ン架 橋 は 多 大 な 寄 与 を す る
もの と予 測 さ れ る ．
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冨 田 昌 弘 ・杉
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22)
23)
24)
25)
26)
27)
28)
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36)
37)
38)
39)
40)
41)
42)
43)
冨 田昌弘
略 歴 ：1983年 名 古 屋 市 立 大 学 大 学 院 薬 学 研 究科 博 士 後
期課 程 修 了 （
薬 学 博 士）， ジ ョン ズポ プ キ ン ス大 学 医 学部
生 化 学 部 門研 究 員， 名 古 屋市 立 大 学 薬 学 部助 手， 講 師 を
経 て，1991年4月
よ り現 所 属 （
助 教 授 ）． 研 究テ ーマ ：ビ
オ チ ンーア ビジ ン架 橋 を利 用 した新 規 モ ノ クロ ーナ ル抗 体
作製 法 の 開 発 および 同架 橋 を用 いた リボ ソー ムの標 的細 胞
へ の融 合 ． 関心 事 ：遺伝 子 治 療， ヒ ト型 モ ノ ク ロー ナ ル
抗 体 作製 ．
科学技 術振 興事 業 団
CREST「p53に
よ るゲ ノ
ムの防御機構 」
私 立 大 学 ハ イ テ ク リサ ー
チ セ ン ター整 備 事 業 （アン
チセ ンス核酸 プ ロジ ェク ト）
ボ ス ドク1名
研 究 員 ・技 術 員
研 究 内 容 ：p53の リン酸化 ， アセ チル化 お よびその周 辺
遺 伝 子 の解 析 に かか わ る研 究 （
プ ロ ジ ェ ク トリー ダ
ー ：田矢 洋 一 ）
資 格 ：細 胞 生 物 学 ，分 子 生物 学 に関 して十 分 な経 験 と
豊 富 な知 識 を もち， 上 記研 究 内 容 は もち ろん ，他 の
広 範 な研 究 対 象 に興 味 を有 す る方 ．博 士 号 取 得 者
（
予 定可 ）も し くは同 等 の能 力 を有 す る と思 われ る方 ．
応 募 方 法 ：① 履 歴 書 ・勤 務 経 歴 書 （
研 究 歴 を含 む），
② 業績 リス ト， ③ 自己紹 介
締 切 ：平 成12年3月31日
勤 務 地 ：長 野 県伊 那 市 （
普 通 自動車 運 転 免 許 要）
採 用 期間 ：平成12年 度 か ら最 長4年 間 （
毎年 更 新 ）
問 合 せ ・応 募 ・連絡 先 ：〒396−0002長 野 県伊 那 市 大字
手 良沢 岡 字大 原1063−103
㈱MBL内
㈱ サ イ ク レ ック ス 宮崎 敏 昭
FAX0265-76-7618E-mail:[email protected]
（
問合 せ はFAXかE-mailで
606
．E-mailで
の応 募 可 ）
募 集 分 野 ：遺 伝 子 治 療 お よびDNAワ
ク チ ンに よ る ウ イ
ル ス 病 （HIV， イ ン フ ル エ ン ザ ） の 治 療
最 近 の 発 表 論 文 ：Nature
Biotechnology，17，583−587
(1999),Biochemistry,38,6750-6775(1999),FEBS
Lett.,456,186-190(1999);454,312-316(1999)
任 期 ：3年
応 募 資 格 ：医 ， 薬 ， 理 ， 農 学 系 に お い て 博 士 号 取 得 ．
35歳 まで （
平 成12年3月
現 在 ）．
応 募 締 切 ：随 時 書 類 送 付 の こ と．
着 任 時 期 ：平 成12年4月1日
以 降 の早 い 時期 ．
提 出 書 類 ：履 歴 書 ． 研 究 業 績 目 録 ． 現 在 ま で の 研 究 内
容
（1，000字 ）． 主 要 論 文 別 刷 ．
書 類 送 付 先 ：〒275−0016千
葉 県 習 志 野 市 津 田 沼2一
17-1千
葉 工 業 大 学 工 業 化 学 科 ／ハ イ テ ク リ サ ー チ セ
ンタ ー
高久
Te1.047-478-0407
洋
FAX047-471-8764
E-mail:[email protected]