博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
ペプチドフェロモンの受容と生成に
関する研究
Perception and Generation of Newt Pheromone
申 請 者
氏 名
専攻・研究指導
(課程内のみ)
中田
Tomoaki
友明
Nakada
生命理工学専攻・分子生理学研究
20 0 7 年 3 月
両生類の求愛行動には嗅覚系が重要な役割を担っているといわれている。日本
の 代 表 的 な 有 尾 両 生 類 で あ る ア カ ハ ラ イ モ リ (Cynops pyrrhogaster)の 求 愛 行 動 で
は、繁殖期の雄は雌の総排出口や頚部に鼻先を近づけ、その雌が成熟しているこ
とを確かめると雌の行く手を自らの頚部で遮り、尾を煽動させて総排出口の周り
の水を雌の鼻先へ送り、雌をひきつける。この時雄の総排出口からは、腹部肛門
腺 (腹 腺 )に 通 じ て い る 管 状 構 造 の 毛 様 突 起 が 突 出 し て お り 、 こ の 行 動 に 関 わ る 何
らかの化学物質が腹腺より分泌・放出されていると考えられてきた。また通常の
雄の飼育水に比べ、腹腺を除去した雄の飼育水は雌に対する誘引活性が低下する
こと、雌の嗅上皮の電気応答が腹腺の抽出物により上昇するという報告からも腹
腺に雌をひきつけるフェロモンが存在することが示唆されてきた。この雌誘引物
質 の 本 体 は 1995 年 に 脊 椎 動 物 で は 初 め て の ア ミ ノ 酸 １ ０ 残 基 (SIPSKDALLK) の
ペ プ チ ド フ ェ ロ モ ン と し て 同 定 さ れ た 。 こ の フ ェ ロ モ ン は ソ デ フ リ ン (sodefrin)
と名付けられ、雄には誘引活性を示さない性特異性と他種の雌を誘引しない種特
異 性 を も つ 。 ま た 、 そ の cDNA 塩 基 配 列 が 明 ら か に な る と 、 成 熟 型 ソ デ フ リ ン は
189 残 基 の ア ミ ノ 酸 よ り 成 る 前 駆 体 タ ン パ ク 質 よ り プ ロ セ ッ シ ン グ を 受 け て 生 成
されることが示唆された。また、非繁殖期の腹腺からはソデフリンの C 末端側
の 前 駆 体 配 列 3 残 基 （ ISA） が 切 断 さ れ て い な い ア ミ ノ 酸 13 残 基 の ペ プ チ ド
（ s o d efri n .ISA; SIPSKDALLKISA） と 、 ソ デ フ リ ン の 1 0 残 基 目 の リ ジ ン が ア ス パ
ラギンに置換され、C 末端側３残基が切断されていないヴァリアントペプチド
（ [Asn10]sodefrin.ISA; SIPSKDALLNISA ） が 精 製 さ れ た 。 こ れ ら の ペ プ チ ド を 合
成し、フェロモンとして機能するかを調べたところ、二つのペプチドは雌誘引活
性を示さないことが分った。この事からソデフリンにはヴァリアントペプチドが
存 在 し 、 ソ デ フ リ ン の 活 性 の 発 現 に は ア ミ ノ 酸 10 残 基 の ペ プ チ ド と し て 翻 訳 後
にプロセッシングを受ける必要がある事が分かった。一方、イモリではフェロモ
ン分子の受容については、鋤鼻上皮を介するということの他には詳しいことは不
明である。
以上の背景から本研究の目的はこのソデフリンの受容機序およびソデフリンと
そのヴァリアントペプチドフェロモンの構造、生成機序を明らかにすることでイ
モリの求愛行動の機構を分子レベルで理解することにある。
第１章ではイモリの求愛行動とソデフリンに関るこれまでの様々な研究を解説
し 、更 に 本 研 究 の 目 的 に 到 達 す る ま で の こ れ ま で の 研 究 経 過 に つ い て 述 べ て い る 。
第２章ではソデフリンの受容機序について述べる。ソデフリン受容に関しては
解 離 し た 鋤 鼻 上 皮 の 特 定 の 細 胞 で ソ デ フ リ ン に 応 答 し 細 胞 内 Ca2+濃 度 が 上 昇 す
る こ と か ら 、 ソ デ フ リ ン 応 答 に は Ca2+が 情 報 伝 達 物 質 の 一 部 で あ る こ と が 示 唆
さ れ た の で 、 Ca2+を セ カ ン ド メ ッ セ ン ジ ャ ー と す る 情 報 伝 達 系 の 阻 害 剤 を 用 い て
ソデフリンへの細胞の応答性を調べ、フェロモン情報伝達機構について調べた。
その結果、少なくとも２つのシグナル伝達経路が存在すると考えられた。１つは
1
リガンドの結合によりソデフリン受容体が受容した信号は三量体 G 蛋白を介し
て phospholipase C (PLC)の 活 性 化 、 phosphatidylinositol 4,5-bis-phosphat (PIP2)
を 加 水 分 解 し て inositoltrisphosphate (IP3) が 産 生 さ れ 、 IP3 は 小 胞 体 膜 上 の IP3 受
容 体 に 結 合 し て C a 2 + を 放 出 す る と い う 経 路 で あ り 、も う 一 方 は 、活 性 化 し た P L C
が P I P 2 を 加 水 分 解 し た 際 に I P 3 と 同 時 に 産 生 さ れ る d i a c y l g l y c er o l （ D A G ） が
protein kinase C（ PKC） へ 結 合 し こ れ を 活 性 化 。 PKC が 細 胞 膜 上 の Ca2+チ ャ ネ
ル を 開 き 細 胞 内 Ca2+濃 度 が 上 昇 す る と い う 経 路 で あ る 。
第 ３ 章 で は 地 域 個 体 群 間 で の ソ デ フ リ ン と そ の ヴ ァ リ ア ン ト mRNA の 発 現 に
つ い て 述 べ て い る 。 ソ デ フ リ ン 特 異 プ ラ イ マ ー を 用 い た RT- P C R 法 に よ っ て 、 日
本国内３地域（千葉・新潟・奈良）から採集したアカハライモリ個体ごとの腹腺
に発現するソデフリンとそのヴァリアントをコードするｃＤＮＡ断片を得た。得
られた各クローンの塩基配列を解析することで、各個体に発現しているヴァリア
ントの種類と比率について調べたところ、１個体の腹腺中で複数のヴァリアント
前 駆 体 m R N A が 発 現 し て お り 、部 分 配 列 の 異 な る 延 べ 2 3 ク ロ ー ン が 確 認 さ れ た 。
ソデフリンが全ての地域の全個体で発現している一方で、ヴァリアントの発現パ
ターンは３地域で異なっており、特に奈良産イモリの腹腺からはソデフリンの８
番 目 の ロ イ シ ン が ヴ ァ リ ン に 置 換 さ れ て い る ヴ ァ リ ア ン ト （ [ Va l 8 ] s o d e f r i n ;
S I P S K D AV L K ） を コ ー ド す る m R N A の 発 現 が 検 出 さ れ た 。 こ の ヴ ァ リ ア ン ト 遺
伝子はほか２地域では検出されず、奈良産イモリに特異的に発現していることが
わかった。
第４章ではソデフリンとそのヴァリアントペプチドの精製とヴァリアントペプ
チ ド を コ ー ド す る mRNA に つ い て 述 べ て い る 。 奈 良 県 産 の ア カ ハ ラ イ モ リ ６ ０
個 体 分 の 腹 腺 か ら 水 溶 性 分 子 を 水 抽 出 し 、 Sep-Pak C18 カ ー ト リ ッ ジ に 通 し 、 吸
着成分を溶出後ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより合
成 ソ デ フ リ ン お よ び [ Va l 8 ] s o d e f r i n の 溶 出 パ タ ー ン を 指 標 に し て ２ つ の ペ プ チ ド
を精製し、N 末端アミノ酸配列解析法によってペプチドの同定を行ったところ、
奈 良 産 イ モ リ の 腹 腺 に は ソ デ フ リ ン お よ び [ Va l 8 ] s o d e f r i n の 両 者 が 成 熟 ペ プ チ ド
と し て 存 在 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 奈 良 産 イ モ リ の 腹 腺 よ り cDNA
ラ イ ブ ラ リ ー を 作 成 し 、 ソ デ フ リ ン 前 駆 体 を コ ー ド す る cDNA を プ ロ ー ブ と し て
奈 良 産 イ モ リ 腹 腺 c D N A ラ イ ブ ラ リ ー か ら [ Va l 8 ] s o d e f r i n を コ ー ド す る 全 長 c D N A
を 単 離 し 、 塩 基 配 列 を 解 析 し た と こ ろ ソ デ フ リ ン と 同 様 189 残 基 の ア ミ ノ 酸 よ り
成 り 、 [ Va l 8 ] s o d e f r i n の ア ミ ノ 酸 配 列 を そ の Ｃ 末 端 近 く に も つ タ ン パ ク 質 を コ ー
ドしていることがわかった。
第５章では奈良産イモリの腹腺より単離同定された地域特異的ソデフリンヴァ
リアントのフェロモンとしての機能、雌誘引活性について述べている。奈良産イ
モ リ の 腹 腺 か ら 精 製 、 そ の 前 駆 体 m R N A が 特 異 的 に 検 出 さ れ た [ Va l 8 ] s o d e f r i n が
フ ェ ロ モ ン と し て の 活 性 を 有 し て い る か を 調 べ る た め に 、 豊 田 ら （ 1994 年 ） の
2
測 定 法 に 従 い 、 合 成 [ Va l 8 ] s o d e f r i n の 雌 誘 引 活 性 を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、 ソ デ フ
リンは全ての地域の雌に対して誘引活性を有しているが、奈良産イモリ特異ヴァ
リ ア ン ト [ Va l 8 ] s o d e f r i n は 奈 良 産 の 雌 に 対 し て の み 、 雌 誘 引 活 性 を 示 し 、 千 葉 や
新 潟 の 雌 に 対 し て は 誘 引 活 性 を 示 さ な い か 、 奈 良 産 イ モ リ に 対 す る 有 効 量 の 10
倍量以上を必要とする事が明らかになった。
第６章ではソデフリンを前駆体から生成する酵素の存在と性質に対して述べる。
活 性 型 の ア ミ ノ 酸 10 残 基 の 成 熟 ソ デ フ リ ン を 前 駆 体 タ ン パ ク 質 よ り 生 成 す る 酵
素が腹腺内に存在していることを確かめるために、前駆体のアミノ酸配列より予
測 し た 成 熟 ペ プ チ ド の 両 側 の 切 断 部 位 の N 末 側 の ア ミ ノ 酸 配 列 (LGR 、 お よ び
LLK) を 認 識 す る プ ロ テ ア ー ゼ の 活 性 に つ い て 、 結 合 し た ペ プ チ ド が 切 断 さ れ る
事 で 蛍 光 度 が 変 化 す る MCA（ peptidil-4-methyl-coumaryl-7-amide ） の 結 合 し た ペ
プ チ ド ( B o c ( t e r t - b u t y l ox y c a r b o n y l ) - LGR - M C A 、 お よ び B o c - LLK- M C A) を 基 質 と し
て用いて調べた。その結果、腹腺抽出液は両基質に対して高い分解活性を有して
いたが、煮沸した腹腺抽出液、プロテアーゼ阻害剤を抽出液に加えたときには基
質の分解活性は無くなった。また、性的に発達した雄イモリからとった腹腺と、
未発達な個体の腹腺の抽出液のタンパク量あたりのプロセッシング酵素活性を調
べたところ、両基質に対する腹腺抽出液の分解活性は、性的に発達した個体で有
意に高いことが分かった。反応液に様々なクラスプロテアーゼに対する阻害薬を
加え、基質の切断を阻害する物質について調べたところ、両基質ともセリンプロ
テアーゼに対する阻害薬によって酵素活性が阻害された。このことから、この酵
素はセリンプロテアーゼファミリーに属するものと推定された。この酵素活性の
至 適 条 件 は Boc-LGR-MCA お よ び Boc-LLK-MCA と も に pH9.0、 40˚C で あ っ た 。
第７章では本研究により得られた結論、現在進行中の実験の結果並びに今後の
展望について述べている。本研究によりソデフリンの受容に関してそのシグナル
伝 達 経 路 を 調 べ ２ つ の 経 路 の 存 在 を 示 唆 し た 。ま た 、ソ デ フ リ ン の 生 成 に 関 し て 、
1 個 体 の 腹 腺 に 複 数 の ヴ ァ リ ア ン ト の 前 駆 体 mRNA が 発 現 し 、 奈 良 特 異 的 に み ら
れ た [ Va l 8 ] s o d e f r i n は 、 精 製 を 行 っ て そ の 生 物 活 性 を 調 べ た と こ ろ 、 奈 良 産 の 雌
に対してのみソデフリンと同等以上の活性を有していること、前駆体からソデフ
リンおよびそのヴァリアントを切り出すプロセッシング酵素の活性が腹腺抽出液
にあることを見出した。
今後の課題としてはソデフリン受容体の同定、ソデフリンを前駆体より生成させ
るプロセッシング酵素の同定とフェロモンの生成機構の解明が挙げられる。
現在、脊椎動物のフェロモン受容体と考えられている二型鋤鼻受容体の相同遺
伝子９７個をアカハライモリよりクローニングしその分子系統樹を作成したとこ
ろイモリ二型鋤鼻受容体は 7 つのサブグループに分かれることが分かった。今後
はソデフリン応答細胞で発現する二型鋤鼻受容体のサブグループの同定、受容体
遺伝子のクローニングを行う予定である。
3
研
究
業
績
種 類 別
題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文 ⃝
1. I s o l a t i o n ,
⃝
characterization and bioactivity of a region-specific
p h e r o m o n e , [ Va l 8 ] s o d e f r i n f r o m t h e n e w t , C y n o p s p y r r h o g a s t e r. P e p t i d e s .
Nakada T , To y o d a F, I w a t a T, Ya m a m o t o K , C o n l o n J M , K a t o S , K i k u y a m a
S.（ 印 刷 中 ）
2. E v i d e n c e f o r p r o c e s s i n g e n z y m e s i n t h e a b d o m i n a l g l a n d o f t h e n e w t ,
Cynops pyrrhogaster that generate sodefrin from its biosynthetic
p r e c u r s o r. Z o o l o g i c a l s c i e n c e .
N a k a d a T , I s h i z u k a Y, I w a t a T, To y o d a F, K a t o T, C o n l o n J M , K i k u y a m a
S. (印 刷 中 )
3. M o l e c u l a r c l o n i n g o f t h r e e t y p e o f a r g i n i n e v a s o t o c i n r e c e p t o r i n t h e
n e w t , C y n o p s p y r r h o g a s t e r. G e n e r a l a n d c o m p a r a t i v e e n d o c r i n o l o g y.
H a s u n u m a I , S a k a i T, N a k a d a T , N a m i k i H , K i k u y a m a S . ( 印 刷 中 )
4. P r o c e s s i n g o f m u l t i p l e f o r m s o f p r e p r o s o d e f r i n i n t h e a b d o m i n a l g l a n d
of the red-bellied newt, Cynops pyrrhogaster: regional and individual
differences in preprosodefrin gene expression. Peptides. 2004, 25(9):
1537-43.
I w a t a T, C o n l o n J M , N a k a d a T , To y o d a F, Ya m a m o t o K , K i k u y a m a S .
5. A m p h i b i a n p h e r o m o n e s a n d e n d o c r i n e c o n t r o l o f t h e i r s e c r e t i o n . A n n
NY Acad Sci. 2005, 1040:123-30.
K i k u y a m a S , N a k a d a T , To y o d a F, I w a t a T, Ya m a m o t o K , C o n l o n J M .
6. R e g i o n a l l y s p e c i f i c o c c u r r e n c e o f a n a c t i v e s o d e f r i n v a r i a n t i n t h e r e d bellied newt. Ann N Y Acad Sci. 2005, 1040:351-3.
I w a t a T, I s h i z u k a Y, N a k a d a T , To y o d a F, Ya m a m o t o K , C o n l o n J M ,
Kikuyama S.
7. P o s s i b l e e x i s t e n c e o f p r o c e s s i n g e n z y m e s g e n e r a t i n g s o d e f r i n m o l e c u l e
i n t h e a b d o m i n a l g l a n d . I n : O i s h i T, Ts u t s u i K , Ta n a k a S , K i k u y a m a S ,
e d i t o r s . Tr e n d s i n C o m p a r a t i v e E n d o c r i n o l o g y. N a r a A s i a O c e a n i a
Society for Comparative Endocrinology; 2004. pp.426-8.
I s h i z u k a Y, I w a t a T, C o n l o n J M , To y o d a F, N a k a d a T , Ya m a m o t o K ,
Kikuyama S.
1. 前 駆 体 か ら ソ デ フ リ ン を 生 成 す る プ ロ セ シ ン グ 酵 素 の 存 在 と そ の 活
性の季節変動
2006. 9 (松 江 ) 日 本 動 物 学 会 第 77回 大 会
中田友明、豊田ふみよ、岩田武男、石塚洋子、加藤尚志、菊山榮
講演
2. 雄 イ モ リ 腹 腺 中 ス テ ロ イ ド の 雌 誘 引 効 果
2006. 9 (松 江 ) 日 本 動 物 学 会 第 77回 大 会
豊田ふみよ、原口省吾、松永昌彦、筒井和義、中田友明、中村真理
子、山本和俊、菊山榮
124
3. S i g n a l Tr a n s d u c t i o n P a t h w a y s f o r S o d e f r i n i n Vo m e r o n a s a l C e l l s o f t h e
Female Newt, Cynops pyrrhogaster
6 t h I n t e r n a t i o n a l C o n g r e s s o f N e u r o e n d o c r i n o l o g y, 2 0 0 6 . P i t t s b u r g h , U S A
N a k a d a T. , I w a t a T. , K a n e k o M . , Ya d a T. , S h i o d a S . , K a t o T. , K i k u y a m a S .
4. 奈 良 産 イ モ リ 特 異 的 ソ デ フ リ ン バ リ ア ン ト の 単 離 、 遺 伝 子 ク ロ ー ニ
ングおよび生理活性
2006.3 (東 京 ) 第 58回 日 本 動 物 学 会 関 東 支 部 大 会
中 田 友 明 、 豊 田 ふ み よ 、 岩 田 武 男 、 M. J. Conlon、 加 藤 尚 志 、 菊 山
榮
5. ア カ ハ ラ イ モ リ の 頸 部 に 雌 誘 引 フ ェ ロ モ ン ・ ソ デ フ リ ン が 発 現 す る
2006.3 (東 京 ) 第 58回 日 本 動 物 学 会 関 東 支 部 大 会
宮本怜、中田友明、蓮沼至、山本和俊、中村真理子、豊田ふみよ、
菊山榮
6 . I s o l a t i o n a n d B i o a c t i v i t y o f a S o d e f r i n Va r i a n t f r o m t h e A b d o m i n a l
G l a n d o f t h e N e w t , C y n o p s p y r r h o g a s t e r.
1 5 t h I n t e r n a t i o n a l C o n g r e s s o f C o m p a r a t i v e E n d o c r i n o l o g y, 2 0 0 5 . B o s t o n ,
USA
N a k a d a T . , To y o d a F. , I w a t a T. , I s h i z u k a Y. , C o n l o n M . J . , K a t o T. ,
Kikuyama S.
7. 奈 良 産 イ モ リ の 腹 部 肛 門 腺 に 存 在 す る ソ デ フ リ ン バ リ ア ン ト , ア オ
ニリン
2005.10 (筑 波 ) 日 本 動 物 学 会 第 76回 大 会
中田友明，豊田ふみよ，岩田武男，コンロン マイケル，加藤尚志，
菊山榮
8. 奈 良 産 イ モ リ の 肛 門 部 腹 腺 に 存 在 す る ソ デ フ リ ン バ リ ア ン ト の 精 製
とその雌誘引活性
2004. 9 (神 戸 ) 日 本 動 物 学 会 第 75回 大 会
中田友明，岩田武男，豊田ふみよ，石塚洋子，加藤尚志，菊山榮
9. 地 域 、 個 体 間 で の ソ デ フ リ ン と そ の バ リ ア ン ト の 遺 伝 子 発 現 の 比 較
2004.3 (東 京 ) 第 56回 日 本 動 物 学 会 関 東 支 部 大 会
中田友明，岩田武男，石塚洋子，菊山榮
125
研
究
業
績
種 類 別
題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
その他
（講演）
1. 甲 状 腺 ホ ル モ ン お よ び ビ ス フ ェ ノ ー ル Ａ に よ る 甲 状 腺 刺 激 ホ ル モ ン
抑制機構
2006. 9 (松 江 ) 日 本 動 物 学 会 第 ７ 7回 大 会
金子美代子、岡田令子、中田友明、山本和俊、中村正久、菊山榮
2. イ モ リ 脳 内 ア ル ギ ニ ン バ ソ ト シ ン 受 容 体 の 発 現 解 析
2006.9（ 松 江 ) 日 本 動 物 学 会 第 ７ 7回 大 会
蓮沼至、中田友明、豊田ふみよ、山本和俊、菊山榮
3. ア カ ハ ラ イ モ リ ア ル ギ ニ ン バ ソ ト シ ン ( AV T ) 受 容 体 c D N A の ク ロ ー ニ
ング
2006.3 (東 京 ) 第 58回 日 本 動 物 学 会 関 東 支 部 大 会
酒井俊彦、蓮沼至、中田友明、豊田ふみよ、山本和俊、菊山榮
126