イムノアフィニティカラムによる前処理

LAAN-A-LC136
L430
No.
高速高分離分析の応用（その42）
Nexeraによる食品中アフラトキシンの分析
－イムノアフィニティカラムによる前処理－
High Speed with High Resolution Analysis (Part 42)
Analysis of Aflatoxins in Food by Nexera
Using Immunoaffinity Column for Sample Preparation
アフラトキシンは発がん性や急性毒 性を持つカビ毒で，
アプリケーションニュースNo. L422では，アフラトキシン
食品における汚染が厳しく監視されています。従来，国内
分析の効率化をはかるため，超高速LCシステム“Nexera”
のアフラトキシン規制はアフラトキシンB1に対して行われて
によりアフラトキシン4成分を超高速分析し，さらに高感度
いましたが，2011年10月より総アフラトキシン（アフラトキシ
蛍光検出器“Prominence RF-20A XS”を用いて，アフラト
ンB1 ，B2 ，G1 ，G 2の総和）
を対象とすることになりました1）
。
キシンを誘導体化処理なしで直接検出する方法をご紹介し
通知試験法には，アフラトキシンの精製に多機能カラム
ました。
もしくはイムノアフィニティカラムを用いるよう記述されてい
ここでは，加工品および香辛料中のアフラトキシンをイム
ます 。このうち，香辛料や加工品など夾雑成分の多い試
ノアフィニティカラムで精製し，これを直接蛍光検出法で高
料では，イムノアフィニティカラムによる精製が有効と考え
速分析した例をご紹介します。
2）
A. Nomura K. Watanabe
られます。
■食品試料の分析－イムノアフィニティカラムによる前処理
Analysis of Food Sample – Sample Preparation with Immunoaffinity Column
※1
焙煎ピーナッツ（加工品）およびナツメグ（香辛料）
につ
いて，次ページFig. 2およびFig. 3の方法で前処理を行いま
0.70
mV
Roasted Peanuts
した※2。イムノアフィニティカラムには“AFLAKING”
（堀
※3
場製作所製）
を用いました。各試料には，アフラトキシン
3
1
0.50
B1およびG1が0.8 μg/kg，B 2およびG 2が0.2 μg/kgになるよ
4
う，標準液を添加しました。
Fig. 1に焙 煎ピーナッツおよびナツメグの 分析結果を，
0.25
2
Table 1にその分析条件を示します。この分析方法では，コ
ンベンショナル条件（アプリケーションニュースNo. L428参
照）に比べ，分析時間を約4分の1に短縮可能です。また，
イムノアフィニティカラムを用いた前処理では，アフラトキシ
ン以外の成分はほとんど検出されませんので，カラムをさら
に短くしていっそうの高速化が期待できます。
なお，本分析法では，アフラトキシンB1およびG1をトリフ
ルオロ酢酸
（TFA）
による誘導体化処理
（水酸化体への変換）
Spiked
0
Unspiked
0.0
0.65
1.0
※1 ： 焙煎ピーナッツおよびナツメグ試料は，財団法人マイコトキシン
検査協会様よりご提供いただきました。
※2 ： 通知試験法 2）
とは一部異なります。
※3 ：“AFLAKING”
は株式会社島津ジーエルシーよりご購入いただけ
ます。
Table 1　分析条件
Analytical Conditions
: Shim-pack XR-ODSⅡ（100 mm L.×3.0 mm I.D., 2.2 μm）
Column
Mobile Phase : Water / Methanol / Acetonitrile = 6 / 3 / 1 (v/v/v)
: 1.0 mL/min
Flow Rate
Column Temp. : 50 ℃
Injection Volume: 8 μL
: RF-20Axs Ex. at 365 nm, Em. at 450 nm
Detection
: Conventional cell
RF Cell
: 25 ℃
Cell Temp.
3.0
min
mV
Nutmeg
0.50
3
なしで直 接 高 感 度検 出していますが， 次ページFig. 4に
TFA処理後分析した結果を参考として示します。
2.0
1
0.25
2
4
Spiked
0
0.0
Unspiked
1.0
2.0
3.0
min
■Peaks
1. Aflatoxin G2, 2. Aflatoxin G1,
3. Aflatoxin B2, 4. Aflatoxin B1
Fig. 1　焙煎ピーナッツおよびナツメグのクロマトグラム
（上段）アフラトキシン標準添加，
（下段）添加なし
Chromatograms of Roasted Peanuts and Nutmeg
(Upper) Spiked, (Lower) Unspiked
No.L430
Sample 10 g
Sample 10 g
(Aflatoxin Standard Solution)
(Aflatoxin Standard Solution)
40 mL Water / Methanol = 2/8 (v/v)
40 mL Acetonitrile / Water / Methanol = 6/4/1 (v/v)
Standing in dark at room temperature for 5 min
Standing in dark at room temperature for 5 min
Mixing for 30 min
Mixing for 30 min
Filtration
Filtration
10 mL up to 50 mL with water
10 mL up to 100 mL with 10% Tween 20 aq.
Filtration with Glass Microfiber Filter
Filtration with Glass Microfiber Filter
10 mL
10 mL
Clean-up by Immunoaffinity column “AFLAKING”
Clean-up by Immunoaffinity column “AFLAKING”
Elution up to 10 mL with Acetonitrile
Elution up to 10 mL with Acetonitrile
Fraction
Fraction
(1.5 mL)
(1.5 mL)
(1.5 mL)
(1.5 mL)
Evaporation by N2 gas
Evaporation by N2 gas
Evaporation by N2 gas
Evaporation by N2 gas
0.1 mL TFA
0.1 mL TFA
Standing in dark at room
temperature for 15 min
Standing in dark at room
temperature for 15 min
Sample solution for Fig. 1
0.5 mL Water / Acetonitrile
= 9/1 (v/v)
0.4 mL Water / Acetonitrile
= 9/1 (v/v)
0.5 mL Water / Acetonitrile
= 9/1 (v/v)
Sample solution for Fig. 1
Sample solution for Fig. 4
Fig. 2　焙煎ピーナツの前処理
Sample Preparation for Roasted Peanuts
0.4 mL Water / Acetonitrile
= 9/1 (v/v)
Sample solution for Fig. 4
Fig. 3　ナツメグの前処理
Sample Preparation for Nutmeg
■トリフルオロ酢酸による誘導体化処理試料の分析
Analysis of Food Sample after Derivatization with Trifluoroacetic Acid
Table 2　分析条件
Analytical Conditions
Fig. 4にTFA誘導体化処理を行った食品試料の分析結果
を，Table 2にその分析条件を示します。各試料はFig. 2，
Fig. 3に示すように，イムノアフィティカラムによる前処理後，
TFAによる誘導体化処理を行いました。
mV
: Shim-pack XR-ODSⅡ(100 mm L.×3.0 mm I.D., 2.2 μm）
Column
Mobile Phase : Water / Methanol / Acetonitrile = 6 / 3 / 1 (v/v/v)
: 0.9 mL/min
Flow Rate
Column Temp. : 40 °C
Injection Volume: 8 μL
: RF-20Axs Ex. at 365 nm, Em. at 450 nm
Detection
: Conventional cell
RF Cell
: 25 °C
Cell Temp.
mV
Nutmeg
Roasted Peanuts
2
1.5
1.0
1.0
1
5.0
4
3
0.5
Spiked
0
0.0
2
1
Unspiked
1.0
2.0
3.0
min
4
3
Spiked
0
0.0
Unspiked
1.0
2.0
3.0
min
■Peaks 1. Aflatoxin G2a (G1), 2. Aflatoxin B2a (B1), 3. Aflatoxin G2, 4. Aflatoxin B2
Fig. 4　焙煎ピーナッツおよびナツメグのクロマトグラム-TFA誘導体化処理後；
（上段）アフラトキシン標準添加，
（下段）添加なし
Chromatograms of Roasted Peanuts and Nutmeg-After Derivatization with TFA ; (Upper) Spiked, (Lower) Unspiked
［参考文献］
1）
「アフラトキシンを含有する食品の取扱いについて」
（平成23年3月31日，厚生労働省食安発0331第5号）
2）
「総アフラトキシンの試験法について」
（平成23年8月16日，厚生労働省食安発0816第1号）
2011年10月
島津コールセンター
0120-131691
TEL:075-813-1691
3100-09103-570-IK
2011.10