2次元電気泳動装置Auto2Dを用いたタンパク質の同定

No.
2
2次元電気泳動装置 Auto2Dを用いたタンパク質の同定
北里大学 薬学部 服部成介先生、佐藤龍洋先生
研究概要と方法
Auto2D 泳動条件
Auto2Dはゲルの分離サイズが幅52mm×奥行
48mm×厚さ1mmと小さいために検出される2次元電気
泳動（2-DE）
のスポットサイズも1mm以下と非常に小さ
く密集している。
そのため、
スポットをピッキングする時
に近傍のスポットも取ってしまう恐れがあった。
今回、pH4-5.5のナローIEFチップを用いて分離した
タンパク質をIonspray型（MS/MS）質量分析計を用
いて同定を試みた。
20μgのマウス肝臓可溶性タンパク質をサンプルと
してAuto2Dに供してメーカー標準レシピに基づいて
2-DEを行った。IEFチップは、pH4-5.5、PAGEチップは、
10.0% アクリルアミドゲルを用いた。2-DE後に銀染色
キットを用いて染色を行った後、
目視で単一に分離され
ているスポットから8つのスポットを任意に選択して、
ス
ポットを含むゲルをピペットチップの先端でカットしてチ
ューブに入れた。
トリプシン消化を行った後、C18カートリ
ッジで精製してペプチド断片を得た。Nano-LCにア
プライしたペプチドをLC-MS/MSシステムを用いて
同定した。解析およびタンパク質の同定は、
マウスタン
パク質データベースと照合し行った。
膨 潤
IEF
平衡化
SDS-PAGE
膨潤時間：5分
電流リミット：100μA
STEP1： 200V、 5分、維持 → STEP2：1000V、 5分、
リニア → STEP3：1000V、 5分、維持 → STEP4：7000V、15分、
リニア → STEP5：7000V、 5分、維持
平衡化時間 1：5分 平衡化時間 2：0分 平衡化時間 3：0分
振とう幅：1.000mm
駆動モード：定電流
STEP1
定電流設定値：20mA
電圧リミット：300V
電気泳動時間：30分
Auto2D アプリケーションデータ
結果および考察
pH4-5.5のIEFチップで2次元電気泳動を行った
ときのタンパク質スポットパターンはゲルをピッキングで
きる程度に隣接するスポットと離れていた
（図1）。
ストリ
ーク上にない8つの濃さの異なるタンパク質スポットをカ
ット
（図2）
してLC-MS同定を行った結果、
いずれも高い
信頼度でタンパク質同定を行う事ができた
（表1,図3）。
以上の結果から、Auto2Dのゲルは小さくても、pH
範囲の狭いIEFチップを用いる事によってタンパク質
同定を行う事が可能であることが示された。
サンプル導入時間：30分
等電点
4
5.5
155
98
63
分
子
量
40
32
21
11
Auto2Dで2-DEを行ったマウス肝臓可溶性タンパク質の2ゲル画像
試料：マウス肝臓可溶性タンパク質（20μg）
IEFチップ：pH4-5.5
PAGEチップ：10.0％ アクリルアミドゲル
● 染色：銀染色
●
●
（図1）
Auto2D アプリケーションデータ
タンパク質同定したスポットの位置（図2）
同定したタンパク質（図3）
Spot# Protein name
1
2
3
4
6
5
Calculated
pl Mw(kDa)
1.
78kDa glucose-regulated protein
P06761
5.07 90.8
2.
ATP synthase subunit beta,mitochondrial
P10719
5.18 56.4
3.
60 kDa heat shock protein,mitochondrial
P63039
5.91 61.0
4.
Actin,cytoplasmic 1
Actin,cytoplasmic 2
P60711
P63259
5.29 41.7
5.
Actin,cytoplasmic 1
Actin,cytoplasmic 2
6.
Protein SEC13 homolog
Q5XFW8
5.15 35.5
7.
Proteasome subunit alpha type-5
P34064
4.79 26.4
8.
Lactoylglutathione lyase
Q6P7Q4
5.12 20.8
7
8
UniProt
Accession#
#1
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
45.81
61.31
48.01
40.37
2
21.05
21.05
21.05
Accession
|
|
sp| P62989| UBIQ_RAT
sp P06761 GRP78_RAT
Name
78 kDa glucose-regulated protein OS=Rattus norvegicus GN=Hspa5 PE=1 SV=1
Ubiquitin OS=Rattus norvegicus GN=Rps27a PE=1 SV=1
#2
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
Accession
Name
55.81
75.99
69.94
69.94
ATP synthase subunit beta, mitochondrial OS=Rattus norvegicus GN=Atp5b PE=1 SV=2
10.61
45.17
22.70
16.63
2.54
23.26
2.56
2.56
7.64
33.48
16.63
13.26
|
|
sp| Q6P9T8| TBB2C_RAT
sp| P47819| GFAP_RAT
sp| P85108| TBB2A_RAT
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
35.64
60.21
52.88
48.34
sp P10719 ATPB_RAT
Tubulin beta-2C chain OS=Rattus norvegicus GN=Tubb2c PE=1 SV=1
Glial fibrillary acidic protein OS=Rattus norvegicus GN=Gfap PE=1 SV=2
Tubulin beta-2A chain OS=Rattus norvegicus GN=Tubb2a PE=1 SV=1
#3
Accession
|
|
sp P63039 CH60_RAT
Name
60 kDa heat shock protein, mitochondrial OS=Rattus norvegicus GN=Hspd1 PE=1 SV=1
#4
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
Accession
63.41
84.00
80.27
75.20
61.42
84.00
75.73
70.67
22.46
79.58
35.81
25.20
|
|
sp| P63259| ACTG_RAT
sp| P68035| ACTC_RAT
sp P60711 ACTB_RAT
Name
Actin, cytoplasmic 1 OS=Rattus norvegicus GN=Actb PE=1 SV=1
Actin, cytoplasmic 2 OS=Rattus norvegicus GN=Actg1 PE=1 SV=1
Actin, alpha cardiac muscle 1 OS=Rattus norvegicus GN=Actc1 PE=1 SV=1
#5
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
11.59
45.60
31.47
31.47
11.59
45.60
31.47
31.47
4
14.88
2.56
2.56
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
2.74
12.11
8.70
3.42
Accession
|
|
sp| P60711| ACTB_RAT
sp| P47819| GFAP_RAT
sp P63259 ACTG_RAT
Name
Actin, cytoplasmic 2 OS=Rattus norvegicus GN=Actg1 PE=1 SV=1
Actin, cytoplasmic 1 OS=Rattus norvegicus GN=Actb PE=1 SV=1
Glial fibrillary acidic protein OS=Rattus norvegicus GN=Gfap PE=1 SV=2
#6
Accession
|
Name
|
sp Q5XFW8 SEC13_RAT Protein SEC13 homolog OS=Rattus norvegicus GN=Sec13 PE=1 SV=1
#7
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
Accession
10.81
45.64
31.12
26.97
2.03
16.20
2.13
2.13
2.03
11.59
2.15
2.15
2.03
8.97
2.14
2.14
2
11.43
5.71
5.71
|
|
sp| P48675| DESM_RAT
sp| P31000| VIME_RAT
sp| P21807| PERI_RAT
sp| P68255| 1433T_RAT
Total
%Cov
%Cov(50)
%Cov(95)
Accession
3.39
42.39
19.57
9.24
sp Q6P7Q4 LGUL_RAT
sp P34064 PSA5_RAT
Name
Proteasome subunit alpha type-5 OS=Rattus norvegicus GN=Psma5 PE=2 SV=1
Desmin OS=Rattus norvegicus GN=Des PE=2 SV=2
Vimentin OS=Rattus norvegicus GN=Vim PE=1 SV=2
Peripherin OS=Rattus norvegicus GN=Prph PE=1 SV=1
14-3-3 protein theta OS=Rattus norvegicus GN=Ywhaq PE=1 SV=1
#8
|
|
Name
Lactoylglutathione lyase OS=Rattus norvegicus GN=Glo1 PE=1 SV=3
（表１）各スポットのスコアの詳細
LC-MS/MS分析を行った後、
質量分析ソフトウェアを用いて解析を行った結果、#1-8のスポットすべてにおいてタンパク質を同定
することができた。
図3はもっともトータルスコアの高かった結果を記載している。
（注意）
当資料の内容を他で引用する場合には下記までご相談ください
タンパク質解析・2次元電気泳動装置
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（代表）
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2012年9月現在のものです。
ＳＭＳ-１５２