Chip-Based Infusion法によるユビキチン化 タンパク質の網羅的解析

Chip-Based Infusion法によるユビキチン化
タンパク質の網羅的解析
○山中秀徳、前田洋祐、武吉正博、美濃部安史 財団法人化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所
Ⅱ ポリユビキチン化タンパク質の濃縮
概要
タンパク質分解機構の異常が様々な疾患につながることが知られており、中でもユビ
キチン化タンパク質の網羅的な解析は癌をはじめとする疾患マーカー探索のターゲッ
トとして注目されている。そこで、我々はnanoLC-ESI-MS/MSを用いたショットガン
解析と Chip-Based Infusion法の組み合わせによるユビキチン化タンパク質の網羅的
解析を試みた。
ユビキチン化タンパク質の分画にはPolyubiquitin Affinity Beadsを用い、ラット肝のタ
ンパク質抽出液からユビキチン化タンパク質のみを回収、濃縮した。濃縮したユビキ
チン化タンパク質は、トリプシンを用いて消化しペプチド混合物を得た。ユビキチン
をトリプシン消化した際に生成するGly-Glyにスルホン酸タグを導入するとMS/MS時
にタグに特徴的なパターンが得られることが報告されている1)。トリプシン消化物の
ショットガン解析による網羅的な解析と同時に、スルホン酸タグを導入したペプチド
をChip-Based Infusion法で解析することによりショットガン解析で検出できない微量
なユビキチン化タンパク質の同定およびユビキチン化部位の決定を試みた。
1)
Wang, D. et al., Anal. Chem. 2006, 78, 3681-3687
･スルホン酸タグの反応条件
ラット肝を10倍容の4 ℃に冷却した溶解バッファー
(50 mM HEPES, pH7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl
and 1% Triton® X-100)で ポリトロン型ホモジナイザ
ーで固形状のものがなくなるまで氷上で処理した。続
けて、超音波処理（20秒間ON＋30秒OFFのサイクル
を3回繰り返す。）後、8,000 g x 10分間遠心した上清
をユビキチン化タンパク濃縮キット（Ubiquitinated
Protein Enrichment Kit、calbiochem社. CA, USA）を
使用しキットのプロトコールに従ってポリユビキチン
化されたタンパク質を濃縮した。
トリプシン消化後のペプチド抽出液(5 ml)に5 mlの4Sulfophenyl isothiocyanate(SPITC)溶液(10 mg/mL,
20mM NaHCO3, pH9.0)を添加、55 °Cで30分間反応を
実施した。1 μlの1%蟻酸溶液を添加して反応を終了さ
せた。MS測定は、反応液を20倍希釈したものを使用
した。
･質量分析の条件
電気泳動はMighty Small II SE250/260（GEヘルスケア
バイオサイエンス社,Buckinghamshire, UK)を使用し、
泳動バッファー（50 mM Glycine, 6M Tris, 0.1%(w/v)
SDS）を循環型冷却装置で20℃に冷却しながら40 mA
一定で、各10μlの試料をゲルにアプライして実施した。
免疫ブロッティングは、SDS-PAGEゲルをニトロセル
ロース膜に転写した後に抗ユビキチン抗体(Cat. No.
662099, Merck社)を使用して行った。
･画像解析
Typhoon（GEヘルスケア バイオサイエンス社, Buckinghamshire, UK）を用いて以下の励起、蛍光波長でゲ
ルイメージを取得した。
励起波長　蛍光波長
Cy3
532nm
588nm
Cy5
633nm
670nm
Sypro® Ruby
480nm　620nm
取得したゲルイメージは、ImageQuant（GEヘルスケア
･酵素（トリプシン）消化条件
分画後の血清蛋白質は、DTT溶液、ヨウドアセトアミ
ド溶液で還元処理後に、トリプシン（プロメガ社,
WI,USA）で酵素消化（30℃、一晩）した。
A　B　C
97
66
Polyubiquitin Affinity Beads を使用することによ
りラット肝タンパク質からポリユビキチン化さ
れたタンパク質が濃縮されたことを抗ユビキチ
ン抗体による免疫ブロッティングで確認した。
45
30
20.1
図-3. ポリユビキチン化タンパク質のSDS-PAGE
14.4
LaneB ; アフィニティビーズで濃縮したポリユビキチン化タンパク質
LaneA ; ラット肝タンパク質 Whole Lysate
LaneC ; 抗ユビキチン抗体による免疫ブロッティング
Ⅲ ポリユビキチン化タンパク質のショットガン解析
Polyubiquitin Affinity Beads で濃縮したポリユビキチン化タンパク質のナノLCESI-MS/MSによるショットガン解析から75種類のタンパク質が同定された。
同定されたタンパク質の中で7タンパク質については、MS/MSデータの解析から
ユビキチン化部位が特定された。
･ ユビキチン化タンパク質の濃縮
･ SDS-PAGE
Lane
kDa
キャピラリー電圧：3300 V
コーン電圧：45 V
Collision-induced dissociation (CID)ガス：アルゴン
低コリジョンエネルギー：20 eV
通常測定時のコリジョンエネルギー：25–35 eV
MSスキャン時間：20 s
MSMSスキャン時間：20 s
･ nanoLC条件
カラム：L-column Micro (CERI, Tokyo,Japan)
(75 μmID×15 cm, 3 μm,100Å,S/N C0306521）
カラム温度：室温
移動相：A液　95/5　水/アセトニトリル　0.1％蟻酸
B液　5/95　水/アセトニトリル　0.1％蟻酸
流速　：2.5 μL/min
･ Chip based Infusion条件
ESI Chip：5.5 μm x 28 μm (Lot A8C230FF)(Advion社,
NY, USA)
電圧： 2.0 kV
ガス圧：0.6 psi
サンプル量：7.0 mL
Aspiration Delay：1 s
Contact Closure Delay：30 s
表-1. ショットガン解析により同定されたポリユビキチン化タンパク質
表-2. nanoLC-ESI-MS/MSデータの解析からユビキチン化部位が特
（MASCOTスコア上位30種を表示）
定されたタンパク質とユビキチン化部位の一覧
G ene ID
gi|8393186
gi|33356830
gi|204501
gi|204499
gi|113612
gi|204070
gi|8392833
gi|25742739
gi|149062768
gi|89573921
gi|68341941
gi|109509445
gi|206736
gi|197387259
gi|114145710
gi|13489067
gi|149038122
gi|4139571
gi|6981420
gi|9506503
gi|19173736
gi|6981006
gi|220734
gi|149046711
gi|4504301
gi|68163561
gi|157817839
gi|109459479
gi|109500730
gi|51948444
P rotein nam e
carbam oyl-phosphate synthetase 1 [R attus norvegicus]
C hain A , C rystal S tructures O f C lass M u C him eric G st Isoenzym es M 1-2 A nd M 2-1
glutathione S -transferase (E C 2.5.1.18)
glutathione S -transferase Y -b subunit (E C 2.5.1.18)
R ecN am e: F ull= F ructose-bisphosphate aldolase B ; A ltN am e: F ull= Liver-type aldolase
electron transfer flavoprotein alpha-subunit
m edium -chain acyl-C oA dehydrogenase [R attus norvegicus]
acyl-C oA synthetase long-chain fam ily m em ber 1 [R attus norvegicus]
sim ilar to T B P -associated factor 172 (T A F -172) (T A F (II)170) (predicted) [R attus norvegicus]
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [R attus norvegicus]
karyopherin alpha 5 [R attus norvegicus]
P R E D IC T E D : sim ilar to D N A 2 D N A replication helicase 2-like [R attus norvegicus]
ribosom al protein L7
von W illebrand factor A dom ain containing 5B 2 [R attus norvegicus]
hypothetical protein LO C 499136 [R attus norvegicus]
N -ethylm aleim ide-sensitive factor [R attus norvegicus]
rC G 51044 [R attus norvegicus]
C hain A , R at Liver S -A denosylhom ocystein H ydrolase
protease, serine, 2 [R attus norvegicus]
collagen-like tail subunit of asym m etric acetylcholinesterase [R attus norvegicus]
serine carboxypeptidase 1 [R attus norvegicus]
histone cluster 1, H 1t [R attus norvegicus]
delta3, delta2-enoyl-C oA isom erase precursor [R attus norvegicus]
rC G 37969 [R attus norvegicus]
histone cluster 1, H 4a [H om o sapiens]
acrosin binding protein [R attus norvegicus]
sem aphorin 5A [R attus norvegicus]
P R E D IC T E D : hypothetical protein [R attus norvegicus]
P R E D IC T E D : hypothetical protein isoform 3 [R attus norvegicus]
aurora kinase A interacting protein 1 [R attus norvegicus]
P rotein N am e
ユビキチン化部位
D N A 2 D N A replication helicase 2-like
K.GKIDVTVGVK.I + 2 GlyGly (K)
ribosom al protein L7
K.LSSPRGGMK.K + GlyGly (K)
rC G 37969
-.MSIQHSLLPDPEK.Q + GlyGly (K)
acrosin binding protein
R.LQSDSEPK.F + GlyGly (K)
hypothetical protein isoform 3
R.ILNMIRQK.S + Oxidation (M); GlyGly (K)
im m unoglobulin superfam ily, m em ber 10
K.VQIIRK.D + GlyGly (K)
protocadherin beta 16
K.LDLQLDQETGDLLLNEK.V + GlyGly (K)
Ⅳ ポリユビキチン化タンパク質のChip based infusion法による検出
・ポリユビキチン化タンパク質をトリプシン消化した際に生成するGly-Gly（ジグ
リシジル基）にスルホン酸タグを導入した後に、Chip based infusion法でMS/MS
解析を行うことによってショットガン解析で検出されなかったポリユビキチン化
タンパク質（dihydrofolate reductase: DHFR)が検出された。また、MS/MSデータ
の解析からユビキチン化部位が特定された。
Ⅰ ESI chip based infusion法による高感度検出
ESI Chip technology
(Advion BioSciences, Inc.)
T ip to C h ip C o u p lin g
ESI Chip
通常のナノスプレー（25μmID)の1/5の口径5.5μmIDのノズルからスプレー
Robotic probe
1.4 kV
inlet
図-5. スルホン酸タグを導入したポリユビキチン化タンパク質のナノ
nozzle
LC-ESI-MS/MS解析のクロマトグラム
ノズルは測定ごとに新品を使用するのでキャリーオーバーフリー
5.5 μm ID
Backing Pressure ~ 0.2 psi
Mass spectrometer
ion orifice
Sample
解析用のゲルではSaturation Dyeで1～5μgをラベル
通常のMS解析よりも100～500倍の感度UPが必要
Nozzle dimensions: 5.5 μm ID x 28 μm OD x 55 μm height
Conductive pipette tip
collision energy = 20 eVの条件でスルホン酸
Nanoelectrospray
タグの脱離によるピークが確認された。
Infus ion flow rate 100nL/min
10 μLのサンプルで約9 0 m in 連続して測定が可能
図-6. Chip-based infusion測定のMS/MSクロマトグラム
3秒積算したMSクロマト
まとめ
BPI クロマト
１．Polyubiquitin Affinity Beads を使用することによりラット肝タンパク質
から濃縮したポリユビキチン化タンパク質をショットガン解析することに
よって75種類のポリユビキチン化タンパク質が同定された。
TIC クロマト
90分積算したMSクロマト
２．同定されたタンパク質の中で、7種のタンパク質についてはMS/MSデー
タの解析からユビキチン化部位が特定された。
スプレー開始
96min
10μLのサンプルで90分間以上
安定したスプレーが可能
積算時間の延長によりピーク強度は、26.5倍に
図-1. 10μlのサンプルをスプレーした際のBPIクロマト(上図）
およびTICクロマト（下図）
図-2. MS644-648部分を拡大したMSクロマト
上図：Survey Modeで通常実施している積算3sのMSクロマト
下図：90min間のデータを積算したMSクロマト
３．Chip based infusion法により積算時間を延長することによって、ショ
ットガン解析で検出されなかったポリユビキチン化タンパク質（DFHR)を
検出、同定することに成功した。