微生物資源としての植物内生菌に関する研究

Title
Author(s)
微生物資源としての植物内生菌に関する研究
田中, みち子
Citation
Issue Date
2002-12-25
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/32801
Right
Type
theses (doctoral)
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6039.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
微生物資源としての植物内生菌に関する研究
田中みち子
2002年 1
2月
目次 (
T
a
b
l
eo
fC
o
n
t
e
n
t
s
)
第 l章
緒論
1
1
. はじめに
2. 植物内生菌-Endophyte
ーとは
3
. 植物内生菌による生物防除
4
. 植物内生菌による物質生産
第 2章
各種植物からの内生菌の分離
6
はじめに
第 l節
北海道大学植物園内の草本、木本植物を用いた、植物内生菌分離方法の検討
6
1.実験材料及び方法
1) 供試植物
2
) 分離培養培地の調製
3)殺菌方法の検討
2
. 結果及び考察
第 2節
北海道大学植物園、道内各地、東南アジアにおける内生菌の分離
7
1.方法及び材料
1) 供試植物
2)植物内生菌の分離と保存
2
. 結果及び考察
第 3節 小 括
第 3章
植物内生菌の機能探索
8
1
9
はじめに
1.実験材料及び方法
1
9
1)供試菌株
2)前培養
3)オリゴ糖生成酵素の探索
4
) 抗生物質生産能の測定
5) 生理活性物質の探索
6)高分子多糖分解酵素の探索
2
. 結果及び考察
1) オリゴ糖生成酵素の生産株
2
0
2)抗生物質生産能
3
) 生理活性物質及びその他の高分子多糖分解酵素生産株
3
. 小括
第 4章
22
植物内生菌の分類同定とその多様性
29
はじめに
1. 実験材料及び方法
29
1) 形態学的特徴による分類、同定
2) リボソーム R
N
A遺伝子塩基配列の解析
3) イントロンを含む 1
8
Sr
D
N
A断片の解析
2
. 結果及び考察
35
3
. 小括
36
第 5章
植物内生菌によるアレロパシー物質レピジモイド生産と生産株の同定
52
はじめに
1. 実験材料及び方法
52
1)植物内生菌の分離
2
) レピジモイド生産株の探索
3) 生成オリゴ糖の分離と精製
4) H
P
L
Cによる分離分析
5) 機器分析によるオリゴ糖の同定
6) 精製オリゴ糖のアセチル化メチル化物の分析
7) 生産株の分類同定
2
. 結果及び考察
54
1) 生産されたオリゴ糖の同定
2
) レピジモイド生産株の分類及び同定
3
. 小括
第 6章
56
ハルニレ (U
l
m
u
sd
a
v
i
d
i
a
n
a
) の植物内生菌とその相互作用
66
はじめに
第 l節
季節及びハルニレの生理的変化による植物内生菌感染率の変化
1.実験方法及び材料
1) 供試植物及び採取方法
2
) 表面殺菌及び菌類の分離
3) コロニー形成頻度 (
C
o
l
o
n
i
z
a
t
i
o
nF
r
e
q
u
e
n
c
y
)
6
7
第 2節
ハルニレにおける植物内生菌の種構成と各分類群
.
cF
.の季節変化
6
8
1.実験材料及び方法
2
. 結果及び考察
第 3節
優占種における I
T
S領域遺伝子の保存性
70
1
. 実験材料及び方法
2
. 結果及び考察
第 4節
植物内生菌及びその他の分離菌の
CMM培地上での相互作用
7
1
1
. 実験材料及び方法
2
. 結果及び考察
第 5節 小 括
72
第 7章
総括
8
5
第 8章
英文要約
8
9
謝辞
参考文献
第1
章緒論
1.はじめに
味噌や醤油の醸造をはじめ、パンの発酵、ヨーグルトやチーズなどの乳製品、漬物や酒類
の製造など、微生物がその主なプロセスを担っていることは古くから我々のよく知るところ
である。この他にも、酵素やアミノ酸、抗生物質など医薬、農薬の発酵生産、土地の肥沃化
や環境の改善など、微生物資源を活用して我々が受けている思恵は計り知れないものがある。
これらの有用な微生物を求めて、非常に多くの研究者や企業が数々の微生物を自然界から単
離してきた。最近の分子生物学の進歩は、こうして得られた微生物の系統分類を進めるだけ
でなく、環境中から分離し培養することのできない微生物の分類をも可能にした。 Woese1)
は、微生物を含めた、地球上の生物の遺伝子配列をもとにつくられた系統樹において、植物
F
i
g
.1
)。近年、極低温か
や動物に比べ微生物の世界がはるかに多様であることを示している (
ら超高温、超高圧まで、様々な環境から様々な微生物が分離されているが、地球上に生息し
ていると思われる微生物のうち、これまでに分離同定されているものは、真菌類においては 5%
以下、バクテリアにおいては 1%以下であると言われており、多様な微生物の多くが単離同定
)
σ
'
a
b
l
e1
)。一方、新規物質や新規微生物獲得に対する必要性は依
されないまま残されている 2
然大きく、体系的な微生物の探索は重要な課題となっている。
土壌中では、古くから、マメ科植物の根に根粒を形成し窒素固定作用を行う根粒菌や多く
の作物及び根に共生し 4)、作物・樹木の養分吸収を助ける菌根菌が分離され、それらの共生関
係は微生物肥料として農業において重要な働きをしている。
本研究では、多様な微生物遺伝資源を得るひとつの手段として、植物との共生関係に焦点
を当て、共生関係を営む上で必要とされる生理学的特徴をもとに、地上部の植物体中から微
生物を分離し、その同定を図るとともにこれを利用することを目的とした。
2
. 植物内生菌-Endophyte
ーとは
1924年、Le
wiS5)により、雑誌 N
a
t
u
r
eに初めて、
トウヒやカラマツなどの針葉樹の芽や茎、
根の皮層、維管束、髄、コルク皮層組織に真菌菌糸の存在が報告された。
E
n
d
o
t
r
o
p
i
cf
u
n
g
i と表現されており、さらに追跡調査及び報告を行うと書き記されている。そ
の後、植物の生きた組織中に見かけ上病徴を示さずに存在している菌が、様々な植物で証明
されてきた 6-10)。
i
c
t
i
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a
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ff
u
n
g
i
"11) では、植物上に存在しているが寄生生物ではない e
p
i
p
h
y
t
e
最新の円D
という言葉に対して、生きている植物の中に存在する生物を endophyteと定義しているが、意
味上の混乱とあいまいさを残したまま使われているのは否めない。最も広い意味では、植物
のすべての部分に、部分的にあるいは全体的に存在する、細菌からヤドリギのような寄生被
子植物にいたる生物全体をさしている。真菌類については、菌根菌や、病徴や腐敗の兆候を
1
示すことなく感染している病原菌や腐敗菌をも含めて言うことがある。特別な環境条件や宿
主組織が老化や枯死に至ったときにのみ病徴を現す、潜在的病原菌や腐敗菌と、病徴を示さ
ず感染している真菌類の区別ははっきりしていない。地上部の植物に存在し、病徴を示さず
相互作用をもっ真菌類に限って使うこともあれば、病徴にも関わらず植物に内生するすべて
の生物を含めることもある。
植物内生菌の存在は、現在のところ、植物組織の顕微鏡による直接的観察や、表面殺菌し
た植物切片を分離用寒天培地に置いて培養する方法、植物組織抽出液中の内生菌を酵素標識
した抗体を使って検出するエライザ法や内生菌が産生する物質を検出する方法、最近では、
植物組織全体から DNAを抽出し、内生菌の DNA断片を PCRで増幅する方法などで確かめら
れている。
3
. 植物内生菌による生物防除
フェスクトキシコーシスやライグラススタッガーと呼ばれる牧草による家畜中毒症の原因
解明によって、植物内生菌が家畜中毒の原因であることがわかったのは十数年前である。即
ち、主要牧草として栽培されているトールフェスクを摂食したウシ、ウマ、ヒツジは日増し
に体重の低下，産乳量や受胎率の低下、体温、呼吸数の増加、筋肉の震え、四肢の壊痘、蹄
の損失などの中毒症状を起こし、このような症状を起こすトールフェスクからは Neo
砂p
hodium
c
o
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n
o
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h
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a
l
u
m が分離された。また、ニュージーランドの主要草種であるペレニアルライグラ
.l
o
l
i
iに感
スを摂食したヒツジやウシが突然ふらつき、重度の筋肉痩響を起こした。原因は N
染した牧草摂取に起因し、感染植物やその種子から、ロリトレム A、B、C と命名された神経
毒性物質が単離され、構造も明らかにされている
1
2
1
5
)
。その後の研究により、これら内生菌
が感染している植物は、家畜毒性を持つ反面、内生菌の耐虫性物質生産により耐虫性が、
孔抵抗の高まりにより耐乾性をもつことがわかった
気
。これらの有用機能を生物防除や農作
1
6
)
物の改良法として積極的に利用しようとする研究が盛んになっている
。例えば、イネ科植
1
7
)
物に感染しているエンドファイトは、その感染形態や生活環が明らかにされており、ゴルフ
場や緑地で広く栽培されているフェスク、ライグラス類では、植物内生菌を芝草に導入して
おり、エンドファイト感染種子がすでに市販されている
。また、家畜毒性がなく、有用機
1
8
)
能のみを賦与するエンドファイトをセーフエンドファイトと呼ぶが、ニュージーランドでは
ペレニアルライグラスでエンドセーフが見つかり、これを導入した品種育成が報道された
。
1
9
)
健全な植物組織からネオティフォディウム属菌以外のエンドファイトと考えられる糸状菌
が分離され、これらの菌が発病を抑制したと言う報告もある。ワ夕、ジャガイモ、エンドウ
などの多くの植物から植物内生細菌が分離され、その中には、感染植物に病害抵抗性を賦与
するものがあり、ハクサイの根こぶ病を根の植物内生菌類の H
e
t
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c
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mc
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a
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s
i
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a が抑制
する例もある
2
0
)
0
VA菌根菌にも、病害防除効果があるものが見つかっている
2
。
2
1
)
4
. 植物内生菌による物質生産
牧草の植物内生菌とその働きが研究される一方で、病徴を示すことなく、各組織に存在す
る植物内生菌が様々な植物で見つかるにつれ、植物内生菌の生理学的特徴についても、研究
a
r
r
o
l
l，
P
e
t
r
i
n
i22) は、ヨーロッパとオレゴン州の針葉から、 5
6株の内生真菌を
が進められた。 C
分離しこれらの、セルロース、ペクチン、キシラン、リグニンなどに対する資化性を調べて
いる。その結果、内生する複数の真菌が、植物組織内の資源を生理的に分配しながら、同一
i
e
b
e
r ら 23)は、モミやトウヒから分離し
植物内に共存していることを示唆している。また、 S
たLe
p
t
o
s
t
r
o
m
a属の内生菌についてその生理作用を調べ、生産される酵素の電気泳動結果を株
の分類に役立てようとした。牧草エンドファイトの耐病性の研究から、 Neotyphodium
r
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o
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s
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.や P
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c
u
l
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p
. による抗真菌、抗細菌活性の研究が進められ
c
o
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o
p
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i
a
l
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m、C
、1
9
9
3年
、 T
a
x
o
lが植物内生菌によって生産されるという新たな発見に至った。
2
4
2
6
)
a
x
o
lは、当初、北米西岸
乳がんや卵巣がんの抗がん剤としてその利用が約束されている T
原産イチイ (
T
a
x
ωb
陀 v
i
f
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l
i
a
) の内部備管部や形成層組織から分離、抽出されたが、その収量
9
9
3年
、 S
t
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l
eらは、 T
a
x
o
lや T
a
羽田が T
a
x
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sb
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i
αの内生菌で
は微々たる物であった。 1
ある Taxomycesandreanae によって生産されていることを実験的に確かめた
。また、 T
a
x
o
l
2
7
)
はその後、他の植物から分離された他の内生真菌にとっても生産されていることが明らかと
なった
。
2
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3
T
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40
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4.8%
20%
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P
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270
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くingdomsi
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eDomainE
u
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a
r
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a
.AdaptedfromC
a
r
lWo巴se(1994)
5
第2章
各種植物からの内生菌の分離
はじめに
前章で述べた様に、植物内生菌の応用として、現在のところ、内生菌による生物学的防除
や微生物肥料としての利用、抗生物質生産などについて報告されている。健康に生育してい
る植物体内に侵入し、病徴を示すことなく、植物の防御作用やライフサイクルに応答しなが
ら植物組織内で生育を繰り返す、共生微生物に特有特異的な、酵素や生理活性物質は、微生
物資源及び微生物遺伝資源として非常に興味深いものがある。また、植物内生菌では、分離
源の数だけ、異なる菌株、異なった生理活性物質や抗菌物質の取得を期待できる。
微生物資源として共生微生物に特異的な産物を得るためには、まず、常在している植物内
生菌の分離培養が必要である。また、生物種の宝庫と呼ばれる熱帯雨林では、過度の自然破
壊により絶滅を危倶される植物が多く、その常在微生物が失われる前に分離保存することは
急務と思われる。より多くの表面殺菌した植物組織から、より多くの植物内生菌を効率的に
培養基に分離するためには、栄養源が律速にならないなど、適度に大きな簡の目で植物内生
菌を分離してくることが重要であると考えた。そこで、様々な草本及び木本植物をホスト植
物とし、牧草や針葉樹の植物内生菌の分離培地や殺菌条件
3
1，ロ)を参考に以下の条件検討を行
った。得られた結果をもとに、道内各地やインドネシア、マレーシアなどの広い範囲の草本
類を対象に植物内生菌の分離を行った。
第 l節
北大植物園内の草本、木本植物を用いた、植物内生菌分離方法の検討
1.実験方法及び材料
1)供試植物
北海道大学植物園内に発育するハマナス (
R
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)、カエデ (
A
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)、オンコ (
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)、ヤエヤマブキ (
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)、ススキ (
M
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)、エゾトリカブト
ハマエンドウ (
μconitum
y
e
s
o
e
凶 e
)
2) 分離培養培地の調製
0
真菌類分離用に 1
2
1Cで 1
5分間オートクレーブ滅菌した P
o
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od
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r(
P
)
及び Cornmealm
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ta
g
a
r(CMM)培地、細菌の分離用に N
u
t
r
i
e
n
ta
g
a
r(
N
) 培地を使用し
a
b
l
e2
1 の培地組成に示すように、真菌類用にはクロラムフェニコールを、細菌用には
た
。 T
ナイスタチンを加えそれぞれ不要な菌群の発育を抑えた。
3) 殺菌方法の検討
6
，
7
，
8月の夏期に、比較的若い健康な草木類の低・中部に位置する小枝を採取し、研究室に
持ち帰った後、すぐ処理を行った。気孔からの微生物の侵入や、雨など環境の影響を受けや
6
すい葉を避け、小枝や茎、葉柄を長さ 1cmの切片に切り取り、これらに対し、 70%、75%、
95.5%エタノール、 31%過酸化水素水、市販漂白剤 (5.3%以上の次亜塩素酸ナトリウムのみ
を含む)などの殺菌剤を組み合わせたり時間を変えて殺菌した。又、表面殺菌の始めに、流
水下での洗浄過程を加えた後、連続表面殺菌を行う木本の例刊を参考に殺菌方法を検討した。
殺菌後の切片は、滅菌したスライドグラス上で、各切片の内部組織が現れるようカッターを
0
使って切断した後、上記の分離培養培地を含むフレート上に切断面が接するように置き、 27C
で培養した。切片上や切片周辺の分離培地上に発育してくる細菌及び真菌類を実体顕微鏡
(OLYMPUS SZ6045TR 三眼ズーム実体顕微鏡)下で観察した。
2
. 結果及び考察
異なる表面殺菌条件や分離培地における、植物内生真菌や細菌の発育を T
a
b
l
e2
2
"
"
"
3 に示
した。 T
a
b
l
e2・2 に示されるように、木本植物の、比較的半径の太い枝の場合、 70%エタノー
ルの表面殺菌では得られる真菌類や細菌の数に減少変化が見られず、不十分であると思われ
る。また、 P 培地より CMM培地のほうが、分離される内生菌の数や種類に制限を与えにく
い
。 T
a
b
l
e2
3 に示すように、過酸化水素水とエタノールの連続殺菌ではハマナスの比較的太
い枝やヤエヤマブキの細い枝ををサンフルとした時、内生細菌が分離されてこなかった。こ
れらの結果より、殺菌剤や殺菌条件、分離培地組成の違いにより、得られる植物内生菌の数
や種類には、差が生ずることが明らかとなった。そこで、様々な構造をもっ植物組織から表
面殺菌後、発育の早いもの、遅いものものも含め、できるだけ多くの内生真菌や細菌を、簡
便な方法で分離することを目的としたとき、殺菌剤として、 75%エタノール、次亜塩素酸ナ
トリウムのみを含む市販漂白剤を用い、分離培地として真菌類用に CMM培地、細菌用に N
培地を用いることにした。草本の茎など、薄く、柔らかな茎組織に対しては、 75%エタノー
ルのみで、 2分間、木本植物の茎や枝など表層部の厚い、堅固な組織を持つものは、 75%エタ
ノールで、 1分間、 5.3%の次亜塩素酸ナトリウムを含む水溶液で 5分間、最後に、再び 75%
エタノールで 3
0秒間の多段殺菌を行うこととした。
第2
節
北海道大学植物園、道内各地、東南アジアにおける内生菌の分離
1.方法及び材料
1)供試植物
1
9
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5 年から 1
9
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9 年の主に夏から秋にかけ、北海道、インドネシア、マレーシアの様々な
地域から植物を採取した。北海道では、北海道大学植物園内の他、愛別、岩尾内、興部など
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道内各地で採集を行った。インドネシアにおいては、主に、 C
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Kedah で採集が行われた。インドネシア、マレーシアの植物の中には、絶滅を危慎されてい
る植物やその土地固有の種、薬用植物も含まれている。採集した植物のうち、学名の不明な
ものについては、記録写真や標本をもとに、植物研究者による同定がおこなわれた。
2)植物内生菌の分離と保存
比較的若い健康な草木類の枝や茎を切り取り、流水下で 1
0分間十分に洗浄した。水分をふ
き取った後、枝、茎、柄の部分を約 1cmの長さに切断し、クリーンベンチ内で表面殺菌した。
5.3%以上の次亜塩素酸ナトリウムの
木本植物では、 75%エタノールに 1分間、市販漂白剤 (
0秒間切片を浸漬し、オートクレーブ滅菌を
みを含む)に 5分間、さらに 75%エタノールに 3
したペーパータオル上で風乾した。草本植物は、切片を 75%エタノール中に 2分間浸漬した
後、風乾した。さらに、滅菌したスライドグラス上で、これら切片の内部組織が現れるよう
カッターを使って切断し、 CMM及び N培地を含むプレート上に切断面が接するように置き、
室温、あるい 27"Cで培養した。なお、この殺菌条件が十分であるかどうかを調べるため、表
面殺菌後の切片の表面を CMM及び N培地上に押し付けプリントした。切片の周辺や、切片
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アルに入れて滅菌した 20%グリセロール中に浸し、 -80Cで保存した。
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結果及び考察
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4，5，6に北海道、インドネシア、マレーシア各地から採取した植物とその表面殺菌
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7 に各地から採取した植物の数とそれらから分離された細菌及び真菌
方法の一例を、 T
の数を示した。 Fig.2・1は
、 1996年に採取したインドネシア、マレーシアの植物のうち絶滅を
危i
具される種のいくつかを記録した。
絶滅を危倶されている植物やその国固有の植物、北海道特有な植物を含め、様々な草木類
の茎や枝からは、細菌だけが分離されるもの、真菌類だけが分離されるもの、ひとつのホス
ト植物に何種類かの真菌類や細菌が共生しているものなど様々であった。どの植物からも、
一種類以上の真菌類か細菌が分離されていることから、一般的に植物中には一時的にせよ病
徴を現すことなく、植物内部組織に生活する内生菌の存在が予想された。
第 3節
小括
新規機能を有する微生物資源として、植物内部組織に侵入し、宿主植物と相互作用をしな
がら生活する植物内生菌に着目し、北海道及び東南アジアの植物をホスト植物として体系的
研究を行うべく、まず、分離方法の検討を行った。即ち、比較的若い植物の枝や茎を対象と
し、草本類の柔らかく細い組織には、 75%エタノールのみを、また木本類などの堅牢な太い
8
組織には 75%エタノールと市販漂白剤 (
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5
.
3
%次亜塩素酸ナトリウム水溶液)を組み合わせ
て表面殺菌をした後、内部表面が培地表面に接するように、殺菌後の切片を CMM、N培地に
置き、出てくる内生菌を分離するという方法を確立した。さらに、実際に北海道各地、イン
0
2種の植物を採取し、これらの草本類の枝や茎
ドネシア、マレーシアの各地から合わせて 4
から上記の方法で植物内生菌を分離したところ、ほとんどの植物から一種以上の内生菌の存
1
3
3株の植物内生真菌類と 6
7
8株の植物内生細菌を分離し、これらを -80C
在が確かめられ、 1
0
で保存した。
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8
第3章 植 物 内 生 菌 の 機 能 探 索
はじめに
約 4
00種に及ぶ北海道、インドネシア、マレーシアの植物から分離した植物内生菌の有用
性を検討するためスクリーニングを行った。まず、内生菌分離株を前培養し、得られた培養
上清を用いて、これまで当教室で行われてきた様々な探索系、即ち、有用酵素、抗生物質、
生理活性物質の探索に供した。
1
. 実験材料及び方法
1)供試菌株
第 2章、第 2節
、 2
) で示したように分離された、 PDAスラント上の真菌類と NAスラン
ト上の細菌を形態的に単一の株であることを確認した後、探索系のための前培養に供した。
2) 前培養
それぞれの供試菌株を、新しい NAスラント及び PDAスラント培地に、細菌は一白金耳、
0
真菌類は一白金鈎の寒天切片を接種し、 27Cでそれぞれ 1日間と 5日間培養した。
3
) オリゴ糖生成酵素の探索
前培養した細菌及び真菌は T
a
b
l
e3
1に示す本培養培地 5mlにそれぞれ一白金耳と一白金鈎
0
0
，
000Xg4C、
接種し、 27Cで、細菌は 2日問、真菌は 5日間振とう培養した。この培養液を， 2
1
5分間で遠心分離を行い、その上清を粗酵素液とし、 1
0
0m Mリン酸緩衝液(pH 6
.
0
) に 2%
の基質、マンナン、キシラン、イヌリンのいずれかを加えたもの同量と混合し、 37Cで 24時
0
間反応させた。 10 分間煮沸することにより反応を停止し、反応生成物をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィー上で検出した。 (MERCKA
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)，1
2cmの二重展開)マンナン・イヌ
2
0
リンスタンダードとしてそれぞれを 1NHClで加水分解し、アンバーライト lRA-400、IRA1
凶
を用いて脱塩したものを、またキシランスタンダードとして、市販のキシロース(関東化学)
とキシロオリゴ糖(和光純薬)の各 1%溶液をを用い、 p-アニスアルデヒド硫酸発色法によ
り行った。
4) 抗生物質生産能の測定
.培養上清の調製
2) の方法で前培養した真菌類は一白金鈎の寒天切片を、細菌は一白金を 5mlの F・
4及び
0
PD-Y本培養培地 (
T
a
b
l
巴 3
・
2
) を含むリムなし中試験管に接種した。 27Cで、真菌は 5日間、
0
000Xg、4C、
細菌は 2日間振とう培養した後、その培養液に等量の 2 -プロパノールを加え、 2，
で 20分間遠心分離した。
-被検菌の調製
被検菌として、糸状菌の A
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7
7
0
.の 4種を
用いた。これらは AHUの保存株である、被検菌の培養培地組成は、 T
a
b
l
e3
3に示した。
0
A
l
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.は V.8培地に接種後、 2
7Cで 7日間培養した。これに 0.85%の滅菌食塩水lOml
を加え、分生子を白金耳でかきとり、胞子懸濁液を調製した。このうち 5mlを予め 50Cに保
0
温しておいた PDA培地 150mlに混ぜ UVで予め殺菌しておいたマフィンプレートにまいた。
0
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0mlに接種し、 27Cで 2
4時
0
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.
D
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0
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0
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間振とう培養後、その 1mlを 50C保温した YPGA培地 150mlに懸濁して C
アッセイプレートを作成した。
同様に B
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.も NAスラントから PMg培地 1
0mlに接
0
0
種し、 37Cで 2
4時間振とう培養した培養液 1mlを 50Cに保温した NA培地 1
5
0mlに加えて
よく混ぜ C
O
.
D
.
6
6
0
:
0
.
8
'
"1
.0
) 殺菌したプレートにまいた。
-ペーパーディスク拡散法
上記で調製した各アッセイプレート上に培養上清をしみ込ませたペーパーディスク(直径
8mm厚手， ADVANTEC
，
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P
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mは 37Cで 24時間培養した。ペーパーデ
0
ィスクの周囲にクリアーゾーンを形成したものを、抗菌活性のあるものとし、その径を計測
した。
5) 生理活性物質の探索
4) で調製した培養上清は、凍結乾燥後得られた乾燥残分について、 T
5
α リダクターゼ活
性阻害及びマウス毛包細胞増殖活性を指標とした育毛剤評価試験に供された。 T
5
α リダクタ
ーゼ活性阻害は、テストステロンをジヒドロテストステロン (DHT) に 変 換 す る 酵 素 -
T
e
s
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t
e
r
o
n
e5αreductase C
ラット肝由来)ーの活性に対する阻害作用を測定し、マウス毛包
細胞増殖活性は、新生仔 C3Hマウスの背部皮膚から毛包細胞を単離、培養して、この増殖、
促進活性を測定するものである。
6) 高分子多糖分解酵素の探索
o
t
a
t
o
デンプン分解酵素生産株の探索は、 Dhawale ら 33) の方法と可溶性デンプンを加えた P
a
g
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rs
t
a
r
c
h(
P
A
S
) 寒天フレートによって行われた。インドネシアの植物から分離した植物内生
0
7Cで 2
3日間培養し、ルゴール液により染色して、
真菌類を PAS寒天プレート上に接種後、 2
コロニーの周りのクリアーゾーンを調べた。
2
. 結果及び考察
1) オリゴ糖生成酵素の生産株
スクリーニングに用いたキシランは、燕麦もしくは白樺由来であるが、一般に、キシラン
は植物細胞壁にヘミセルロースとして存在する。 T
a
b
l
e3
4 にオリゴ糖生産株の探素結果を示
したが、植物内生真菌類における菌体外へのキシラン分解酵素生産株の割合は、非常に高い
ものであり、当教室で同時に行われた、落ち葉などから分離したりター菌におけるオリゴ糖
20
生産株の割合、 63%にくらべても高い傾向にあった(データは示していなしユ)。内生細菌によ
るキシラン分解酵素生産株の割合はカビの二分の一以下であったがこれも、土壌細菌のキシ
ラン分解酵素生産株の割合と比較すると多い傾向にあり、その生理的特徴を考えると、キシ
ラナーゼ生産菌として、植物内部で生活する内生菌が有望であるといえる
。また、これら
3
4
)
a
b
l
e3
5 に示した。オリコ糖の機能について明らかに
の酵素によるキシランの分解生成物を T
されているものは数少ないが
旬、内生真菌においては，そのうちのひとつであるキシロオリ
3
5
3
ゴ糖のうち、二糖、三糖の生産株が圧倒的に高く、次に五糖、単糖及び四糖の順であった。
Amorphophalluss
p
. 由来のグルコマンナンを分解する酵素生産は、真菌よりも細菌において
比較的多く見られ、また、これらの酵素による生成物は、真菌類では単、二、三糖が多く、
細菌では、三糖以上が多かった。
イヌリン (
S
i
g
m
a
) 分解酵素の生産株の割合は、キシランやマンナンに比べるとカビ、細菌
両者において低く、また酵素分解生成物も、単糖か五糖以上であった。イヌリンはチコリの
根などに多く、貯蔵炭化水素として考えられることから、茎や枝から分離される植物内生菌
に特異的な酵素生産としてイヌリン分解酵素を探索するのは難しいのかもしれない。
近年、食物繊維として、あるいは腸内細菌のプレバイオティックとしてオリゴ糖に対する
需要は高まりつつある。これら、植物内生菌によるオリゴ糖生産酵素が、微生物学的生産や、
クローニングによる大量生産を可能にし、又、これらオリゴ糖の諸機能が実験的に解明され
るであろう。
2)抗生物質生産能
T
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b
l
e3-6に、抗菌活性のあった植物内生菌とその割合を示した。真菌、細菌とも約 10%か
ら 30%の割合で、様々な抗細菌及び抗真菌物質を生成していた。植物内生真菌が、真菌、細
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sら
菌に対して、内生細菌が真菌、細菌に対してと様々なケースが見られた。 S
は、植
3
9
)
物内生菌とそうでない真菌や病原菌の、種々の微生物に対する抗菌活性や植物に対する除草
作用を調べているが、植物に対する除草作用は、植物内生菌のほうが高く、また植物側の植
物内生菌に対する抵抗作用も高かった事を報告している。これらの結果を考えあわせると、
植物内生菌が、幅広い生物に対する抗生物質のリード探索源として大いに期待できるものと
思われる。
3) 生理活性物質及びその他の高分子多糖分解酵素生産株
0株、マレーシアの植物から分離ししたカビ 1
0株
インドネシアの植物から分離した細菌 1
の培養上清について T
5
α リダクターゼ活性阻害及びマウス毛包細胞増殖活性を調べた結果、
0株中 7株 (P-4培地)に T
5・αリダクターゼ活性阻害作用が、 4株 (PDY培地か F
・4
培
カビ 1
地)にマウス毛包細胞増殖活性が見られた。これらのうち 3株について、さらに大量に培養
し活性を調べた結果、これら 3株の培養上清に育毛剤として評価されうる物質の存在が認め
られ、これらの株とその培養液について特許の申請を行った (
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これらのスクリーニングで得られた、有用な株及びその生産物と分離源を T
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e3
7 に列挙
2
1
した。これらの有望な株のうち、北海道を代表する植物ハマナス CRosar
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) から分離さ
れたカビ 7Aの分泌するキシロオリゴ糖生成酵素のひとつは、キシランを分解して、キシロビ
オースを主な生成物とすることが明らかとなり、この酵素を精製後、諸性質を決定した
4
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また、インドネシアのビワモドキ C
プンからグルコースを主生成物とする何種類かのアミラーゼを分泌する株であった。マルト
トリトールをグルコースとマルチトールに分解するこの酵素のひとつは精製され、その諸性
8
SrDNA
，ITS 領域の塩基配列解析により
質が調べられた。後に生産株は形態学的及び 1
Fusicoccums
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.と同定された
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植物から分離された内生細菌であるが、グルコマンナン分解酵素を分泌し、マンノビオース
やマンノトリースを大量に生産した。この菌の分泌する酵素も精製され、諸性質が明らかに
されている。さらにこの細菌は 1
6
SrDNAの配列の解析及び生理試験結果より、 B
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植物内生菌の有用性を調べるため、 8
9
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8
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を
、 652株のカビと 483株の細菌について抗生物質生産性を調べた。その結果、植物細胞壁の
主成分であるキシラン、マンナン、根の貯蔵物質イヌリンから単独あるいは複数の様々なオ
リゴ糖生産酵素産生株を得た。特に、カビにおいては、その機能が明らかにされた数少ない
オリゴ糖のひとつである、キシロビオース、キシロトリオースを高生産する株が数多く得ら
れた。このように、植物内生菌が植物細胞中に存在する様々な多糖を分解する酵素を持ち合
わせていることが予想され、高分子多糖分解酵素やオリゴ糖生産酵素の探索源として期待さ
れる。
030%の割合で、抗力ビ、抗細菌まれに抗酵母活性を持ち、新規抗生物
又、内生繭の内 1
質探索源としても有用であると思われる。数株の培養液からは、特定の酵素活性を阻害した
り、細胞増殖を活性化する物質を生産するものが得られ、未知の有用生理活性物質生産への
期待も大きいと思われる。
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HokkaidoJapan
S
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HokkaidoJ
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A
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ak
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k
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"
14A
Xylan -砂 X1，
X2，
X
3
.An
t
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u
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g
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X2
，
X3a
n
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u
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n -惨F6
Xylan -惨 X1，
An
t
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g
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b
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Xylan .X2a
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An
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Xylan -砂 X2a
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n 一歩GF4
An
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An
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da
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t
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b
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c
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l
17B
44
71
I
n
u
l
i
n 一歩 F5andXylan
An
t
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u
n
g
a
l
Mannan 一砂 M4
1
1
2
3
3B
5D
llA
12A
15B
れ3
コ
。
一砂 X2
，
X3
Humulus l
u
p
u
l
u
s
c
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r
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i
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Rubus
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Unknown
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Unknown
Coleusg
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D
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x
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T7
2
Am
y
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D
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M42
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(Kemuncong)
L
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h
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ss
p
.
M
a
l
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y
s
i
a
M
a
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y
s
i
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1
1
3
M3
Glucomannan -惨 M2，
Hotouniac
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X
l
:
x
y
l
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s
e
，
X2:
x
y
l
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b
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s
e
，
X
3
:
x
y
l
o
t
r
i
o
s
e
，
M2:mannobiose
，
M
4
:
m
a
n
n
o
t
e
t
r
a
o
s
e，
M5:mannopentaose F
5
:
i
n
u
l
o
p
e
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t
a
o
s
e
，
F
6
:
i
n
u
l
o
h
e
x
a
o
s
e，
G
f
4
:
g
1
y
c
o
s
yl
i
n
u
l
o
t
e
t
r
a
o
s
e
第4
章植物内生真菌の分類同定とその多様性
はじめに
北海道、インドネシア、マレーシアの各地の植物から分離した植物内生菌のうち、オリゴ
糖生産酵素、抗生物質、生理活性物質や高分子多糖(デンプン)分解酵素などを高生産する
いくつかの株 (
T
a
b
l
e37
) が得られたので、これらの分類、同定を試みた。とくに、植物内生
・
菌として分離されてくるカビの分類同定をすすめ、これまで土壌から分離されてきた一般真
菌との相違を明らかにしようとした。
真菌の同定の多くは、これまで長い間、寒天培地上での接合子、子嚢、分生子形成様式や
その形態的特徴により行われてきた。しかし、近年の分子遺伝学の進歩により、真菌が持つ
より普遍的な遺伝子の配列の変化により系統樹を作成し、その系統的分類が可能となった。
このことは、特徴的な形態を作らない真菌の分類や、ひいては、分離培養が不可能な微生物
においても、そのゲノムを抽出することができれば、系統的分類が可能であることを意味す
る
。
植物内生菌として、真菌を分離し、一般的な微生物培地上で培養を繰り返す場合、その多
くは、栄養菌糸の発育がよくなり、有性世代の形成能力が失われたり、分生子形成能力が稀
になってしまう傾向にある。何かの構造体を形成したとしても、不完全世代の分生子果であ
ったり、あるいは菌核のままで終わってしまうことが多い。従って従来の方法では、分類が
困難であったり、時間のかかるものが多かった。そこで、生物によく保存されているリボソ
ーム RNA遺伝子の 1
8
SrDNA と I
T
S領域(In
t
e
r
n
a
lt
r
a
n
s
c
r
i
b
e
ds
p
a
c
e
rr
e
g
i
o
n
) の塩基配列を読
e
n
B
a
n
k、EMBLや DDBJなどのデータベースに登録されている既知の真菌
み、現在までに G
の配列と比較することにより、相向性の高い配列及び菌株を選び出した。さらに、得られた
配列をもとに系統樹を作成して系統的分類を行い、形態学的な特徴とあわせて分類、同定を
行った。
1.実験材料及び方法
1)形態学的特徴による分類、同定
PDAスラント培地に分離した T
a
b
l
e3
7の各真菌及びマレーシア、タイ、北大植物園の植物
から分離された 9株の真菌を PDA
、C
z
a
p
e
k
D
o
xa
g
a
r(
C
Z
A
)、C
o
r
nm
e
a
la
g
a
r(CMA)、Ma
1
te
x
t
r
a
c
t
a
g
a
r(MEA) および O
a
tm
e
a
la
g
a
r(OMA)プレート培地に三点接種し、 2
7Cで l週間から 1ヶ
0
月間培養後、実体顕微鏡及び光学顕微鏡下で、コロニ一、菌糸発育状況、有性世代の形成や
分生子形成などについて観察した。なお、 PDA
、 CMAフレートは、 1
2
1Cで 2
0分間オートク
0
レーブ滅菌した D
i
f
c
o社製培地を、 CZAは
、 m
o
d
i
f
i
e
dC
z
a
p
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k
D
o
xl
i
q
u
i
dm
e
d
i
u
m(OXOID)をプ
レートに分注し作成した。 MEAは麦芽エキス (
D
i
f
c
o
)2
0
.
0g
， ペプトン(和光純薬) 1
.0g
、
グルコース(関東化学)2
0
.
0g
、伊那寒天 2
0
.
0
gにイオン交換水 1リットル加え、 pHを lNHCl
2
9
で6
.
0に合わせた後、同様に滅菌した。 OMAプレート培地は、オートミール(雪印乳業) 50g
0
を 500mlのイオン交換水に漫し、 70Cで 1時間保持した。これをガーゼでろ過し、 lLに定
容した後、 20gの伊那寒天を加え、 121tで 20分間オートクレーブ滅菌したものを用いた。
2) リボソーム RNA遺伝子塩基配列の解析
①
ゲノムの抽出
.供試菌株
T
a
b
l
e3
ヴに挙げた植物内生菌のうち、細菌 1
1・
3株をのぞくすべての真菌及びマレーシア、
タイ、北大植物園から分離された 9株の真菌
-菌体収集用培養培地
ツアベック液体培地として m
o
d
i
f
i
e
dCzapek-Dox l
i
q
u
i
d medium (OXOID) 3
3.
4 g，y
e
a
s
t
e
x
t
r
a
c
t(オリエンタル酵母 )2gを、ポテトデキストロース液体培地として P
o
t
a
t
od
e
x
t
r
o
s
eb
r
o
t
h
.
0に合わせた後、 100mlずつ坂
(
D
i
f
c
o
)24gをそれぞれ 1Lのイオン交換水に溶かし pHを 6
0
口フラスコに分注し 1
2
1C、 1
5分間のオートクレーブ滅菌をした。
.1M トリスー塩酸緩衝液 (pH8
.
0，
8.
5
)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 1
21
.1
4gを計量し、約 800mlのイオン交換水
0
1
2
1C、1
0分間)
に溶解後、濃塩酸で pHを調整して 1Lに定容した。オートクレーブ滅菌 (
し、保存した。
.0
.
5M EDTA(
p
H8
.
0
)
EDTANa2 H20 を 1
8
6
.
1
2g計量して、約 800ml のイオン交換水に懸濁し、粒上の水酸
0
1
2
1C、1
0
化ナトリウムを用いて pHを調整した後、 lLに定容した。オートクレーブ滅菌 (
分間)して保存した。
.TENバッファー
lOm M トリスー塩酸、 1m MEDTA
，0
.
1M ì、~aCl，
VλζJ
守中
る
i
H
、1
r
SDS
1Jnuqd
EDTA
mmmm
NaCl
22
トリスー塩酸緩衝液 (pH8
.
5
)
MMM
.抽出用緩衝液
pH8
.
0
.TE緩衝液
H8
.
0
)
トリス四塩酸緩衝液(p
lOm M
0
.
5M EDTA
1m M
.TE飽和フェノール
核酸抽出用フェノール(和光純薬)を温水中で溶解し、 0.1%のキノリノールを加え、 1 M
トリスー塩酸緩衝液 (pH8
.
0
) を加えて撹枠し、静置する。水槽を取り除き、再度トリスー
塩酸緩衝液を加えて、同様に撹持、静置、水槽交換を数回繰り返した後、水槽を TEに替え、
30
4Cに保存した。
0
.RNaseA溶液
RNaseA (
S
i
g
m
aN
o
.4
8
7
5
)を 20mg/lの濃度になるように 10mMトリスー塩酸(p
H7
.
5
)、1
5
m M塩化ナトリウム緩衝液に溶解し、 1
0分間沸騰水中で加熱して、 DNase活性を失活させ
たものを用いた。
-核酸精製用クロロホルム溶液
クロロホルムとイソアミルアルコールを 24:1の割合で混合したものを用いた 0
.方法
0
真菌は PDAスラント上で、 27C、5日間前培養し、これをツアベック液体培地か、また
0
D
i
f
l
∞)100mlずつを含む坂口フラスコに接種し、 27Cで
はポテトデキストロース液体培地 (
4
3
3日間振とう培養 (
1
3
0r
p
m
)した。培養菌体から、 Raed巴rと B
r
o
d
a
) の方法を参考に、ゲノ
000Xg，
4C、1
0分間の遠心分離で菌体を集め、これに TENバ
ムの抽出を行った。即ち、 6，
0
ッファーを加えて、菌体を洗浄後、ろ紙 C
N
o
.
1，東洋櫨紙)上で減圧漉過した。得られた菌
0
体のケーキを -80Cで凍結し、一晩凍結乾燥した。乾燥後の菌体を乳鉢でよくすりつぶし、
その 50mgをマイクロチューブC1.
5mI)に量り採り、抽出用緩衝液 500mlを加え、よく
懸濁した。 TE飽和フェノール 350μlを加え、均一になるまで(約 20秒)撹持した。さら
5，
0
0
0中 m、
に核酸精製用クロロホルム溶液を 150μl加え同様に混合した。微量高速遠心機、 1
4Cで 1時間遠心分離した。上層を新しいマイクロチューブ、に移し、これに RNaseA25μl
0
を加えて、 37Cで 6
0分間保持した。ここに τE飽和フェノール 500μiを加え混合し、 1
5，
000
0
rpm、4Cで 5分間遠心分離し、上層を得た。この操作を繰り返した後、上層に 500μ1の核
0
酸精製用クロロホルム溶液を加え、同様に遠心し上層を得た。
この操作を繰り返した後、
54体積のイソフロパノールを加えて、よく振り混ぜた。 1
5，
000rpm、4Cで 1
0分
上層の 0.
0
間遠心し、上清をデカンテーションして捨て、マイクロテューブに残ったペレットを 70%
エタノールでよくすすいだ後、同様に遠心し、 DNAのペレットを得た。ペレットは、減圧
0
乾燥させた後、 50μ1TE緩衝液を加え、 DNAを再懸濁し -20Cで保存した。
②
1
8
SrDNA領域及び I
T
S領域の PCRによる増幅
.50XTAE C
電気泳動用緩衝液)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
242g
/
1
氷酢酸
5
7
.
1ml
!
l
0
.
5M EDTA(pH8
.
0
)
1
0
0ml
/
l
使用時にはイオン交換水で 50倍に希釈し、 1XTAEとして用いた。
.エチジウムブロマイド溶液
エチジウムブロマイド C
S
i
g
m
a
)を 1
0mg
/
ml になるように滅菌水に溶解し、保存溶液
.
5
μg
/
1になるようにイオン交換
を作成した。アガロースゲル染色に用いる際は、これを 0
水で希釈し使用した。
31
• 3 M酢酸ナトリウム (pH5
.
2
)
酢酸ナトリウム (
3水和物) 20.
4g を 40mlのミリ Q水に溶かし、氷酢酸で pHを調整し
ながら 50ml にメスアップ後、オートクレーブ滅菌する。
-方法
上記で得られたゲノム DNAをテンプレートとし T
a
b
l
e4
1に示す各種の真菌 rDNAに特
i
g
.
4
1に示す 1
8
SrDNAの NS1-NS6
，NS5・NS8領域と I
T
S
異的なプライマー叫を用いて、 F
の5
.
8
SrDNAを含む I
T
S
5・ITS4領域を PCRで増幅させた。Am
p
l
iT
a
qDNAPolym巴r
a
s
e(
A
p
p
l
i
e
d
，USA
，以下 ABI)を用い、サーマルサイクラー (
G
e
n
e
Am
pPCRSystem2400，
B
i
o
s
y
s
t
e
m
s，CA
9600，ABI) で T
a
b
l
e4
2に示す組成の反応液を T
a
b
l
e4
3の条件で反応させた。反応後の反
A
g
a
r
o
s
eH14 ITAKARAJ (宝酒造)、 1XTAE
，
応液 3μl を1.5%アガロースゲル電気泳動 (
Mupid
之電気泳動槽、
100V) 及びエチジウムブロマイド染色により増幅産物を確認した。
PCR による増幅断片が一本のバンドであること、その分子量が相当する大きさであること
ycroSpin
を確かめた後、以後のシーケンス反応のために精製を行った。当初の精製は、 M
c
o
l
u
m
n
sS300HRs
y
s
t
e
m(
P
h
a
r
m
a
c
i
aB
i
o
t
巴c
h
) を用いて、遠心分離により反応液中の余分なプ
ライマーを除いた後、残った酵素類を除くために、 TE飽和フェノールおよび核酸抽出用ク
ロロホルムを加え遠心分離後、さらに上層に核酸抽出用クロロホルムを加えて混合遠心し、
上層を新しいエッペンテューブに移した。これに十分の一容量の 3 M酢酸ナトリウムと 2
.
5
0
倍量のエタノールを加え、 -80Cで 3
0分間静置し、 PCRで増幅した DNA断片を沈殿させ
た。このベレットを 70%エタノールで洗浄、遠心分離し、減圧乾燥をして、 10μlの滅菌水
に溶解させた。後に、 SUPREC™ PCR(
T
a
k
a
r
aBIOMEDICALS) を用いそのマニュアルに従
って精製した。
PCR産物のシーケンス
③
②で得られた、精製後の PCR産物の濃度を測りテンプレートとし、 T
a
b
l
e4
1に示した、
・5でラベルした蛍光プライマーと、 T
h
巴r
moS
e
q
u
e
n
c
巴 f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
t
それぞれのプライマーを Cy
l
a
b
e
l
l
e
dp
r
i
m
e
rc
y
c
1es
e
q
u
e
n
c
i
n
gk
i
t(Am
e
r
s
h
a
m
)を用いて、シーケンス反応を行った。当初は、
このシーケンス反応産物を A
L
F
e
x
p
r
e
s
s I DNAS
e
q
u
e
n田 r(Ame
r
s
h
a
mp
h
a
r
m
a
c
i
a
)で電気泳動
し、そのマニュアルに従って、塩基配列を読んだ。シーケンサーとして ABIPRISM377DNA
a
b
l
e4
1 の各フライマーと B
i
g
D
y
e
T
e
r
m
i
n
a
t
o
rCyc
1
e
S
e
q
u
e
n
c
i
n
gS
y
s
t
e
m(
A
B
I
)を導入後は、 T
c
i
n
gFSReadyR巴a
c
t
i
o
nK
it(ABI)を用いて、そのマニュアルに従いシーケンス反応を
Sequ巴n
e
n
t
r
i
S
e
pS
p
i
n Columns (
A
B
I
)を用いて、余分な蛍光フライマーなど除いた後、塩基
行い、 C
配列を読んだ。
④
塩基配列の解析及び系統樹の作成
S
o
自w
areD
e
v
e
l
o
p
m
e
n
t
)，A
u
t
o
A
s
s
e
m
b
l
e
r(
A
B
I
)を用い
塩基配列の編集は、 GENETYX-MAC(
て行った。データベースに既存する真菌類の rDNA配列データとの比較は、 DNAI
n
f
o
r
m
a
t
i
o
n
3
2
a
n
dS
t
o
c
kC
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n
t
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r(
N
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t
i
o
n
a
lI
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fA
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l
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s
o
u
r
c
e
s
，
T
s
u
k
u
b
a
，
J
a
p
a
n
)
，の FASTA45)、
BLAST SEARCH
“)及び N
a
t
i
o
n
a
lC
e
n
t
e
rf
o
rB
i
o
t
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c
h
n
o
l
o
g
yI
n
s
t
i
t
u
t
i
o
n (NCBI)の BLAST
SEARCHを利用した。③で得られた植物内生真菌の 18SrDNA及び ITS領域の配列とデー
タベースから得られたそれぞれの相向性の高い類似配列をもとに、系統樹を作成した。系
a
b
l
e4
8，4
9に示した。植物内生菌
統樹作成に利用した真菌名とそのアクセション番号は T
の配列と類似の配列は CLUSTALW47)を用いて多重整列し、ギャップを除いた、 18SrDNA
の 1629塩基、 ITS領域の 623塩基を比較した。この結果に基づき、 PHYLIPプログラムパ
F
e
l
s
e
n
s
t
e
i
n，J
.D
e
p
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r
t
m
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to
fG
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i
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s，U
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i
v
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s
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fW
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h
i
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g
t
o
n，S
e
a
t
t
l
e
) のD
n
a
d
i
s
t
ッケージ C
で進化距離行列データを、 N
e
i
g
h
b
o
r(
N
J法)で無根系統樹を作成し、 S
e
q
b
o
o
tで樹形の統計
学的評価を行った。
3) イントロンをふくむ 18SrDNA断片の解析
18SrDNAの NS1NS6，
NS5-NS8産物の分子量が、通常の約 1
5
0
0塩基、 600塩基よりも大
・
きいものが、北海道、インドネシア、マレーシアからの各植物内生菌において見られた。
実際の 18SrDNA遺伝子の塩基配列を調べるためトータル RNAを抽出し、 RT-PCRによる
18SrDNA断片の増幅を行ってその塩基配列を読むことにした。
①
トータル RNAの抽出
-供試菌株
97M42、97M40株:マレーシアの植物から分離され、育毛剤として評価されうる物質を
生産する植物内生真菌。
-培地
菌体培養用培地は、 2)①のゲノム抽出用培地に準ずる。
.R
N
a
s
e
F
r
e
e滅菌水(以下 RF水とする)
0
R
N
a
s
e
F
r
e
eにするため、イオン交換水を 1
2
1C、40分間オートクレーブした。
すべてのガラス、ポリエチレン器具、ミリ Q 水も、 121
"
C、2
0分間のオートクレーブ滅菌
をした。
.RNA抽出用クロロホルム
RNA専用のクロロホルムとイソアミルアルコールを 49:1で混合し、遮光して RNA専
用として室温に保存する。(新しい試薬ビンを開ける)
.RNA抽出用フェノール
核酸抽出用フェノール 30g をポリプロピレン製 50mlスクリューキャップ遠心管に採り、
ミリ Q 水約 20mlを加えてフタをし、 65Cの温水中で溶解する。フェノールが溶けたら、
0
よく振とうし、室温以下で冷却後、アルミホイルなどで遮光して 4Cで保存する。
0
.RNA用 3M酢酸ナトリウム (pH5.
2
)
酢酸ナトリウム (
3水和物) 2
0.
4g を 40mlのミリ Q水に溶かし、氷酢酸で pHを調整
33
ながら 50ml にメスアップ後、オートクレーブ滅菌する。
• RNA専用イソプロパノール及びエタノール、 70%エタノール
RNA専用イソプロパノール及びエタノールは、試薬ビンから直接使用する。 70%エタノ
ールは RF水で希釈した。
.RNA抽出方法
0
培養菌体を漉過し、 -80Cで凍結するまでは、 DNA抽出方法に準ずる。ただし、 TEN
バッファーで洗浄鴻過後の菌体ペレットは、液体窒素中で速やかに凍結した。液体窒素中
.
1g を、予め、 ISOGEN(
ph
e
n
o
landg
u
a
n
i
d
i
n
e
で乳棒、乳鉢を用い凍結菌体を摩砕し、この 0
t
h
i
o
c
y
a
n
a
t
e
)(
N
i
p
p
o
nGene
，
J
a
p
a
n
)1ml を分注したエッペンテューフに移した。 5分間、よく
混合し、ここに 200μlのクロロホルムを加えて、再び 5分間よく混合した。微量高速遠心
5，
000中m、4Cで 1
5分間遠心分離して、上層を新しいエッペンにとり 0
.
5
4容積のイ
機で 1
0
ソプロパノールを加え RNAを沈殿させるため、室温に 5 1
0分聞置いた。これを再び、 1
5，
0
0
0
同
中m、4Cで 5分間遠心分離して、上清を取り除いた後、 70%エタノールで RNAペレットを
0
洗浄した。これを、減圧乾燥させた後、 20μiの RF水に溶解した。ここに、フェノール、
5，
0
0
0rpm、4Cで 5分間遠心分
クロロホルムを 100μlずつ加え、 3分間よく混合した後、 1
0
離して上層を新しいエッペンテューフ、に移した。この操作を 3回繰り返した後、上層に等
1
.1%の 3 M酢酸ナトリ
量のクロロホルムを加え、遠心分離後、新たに移し採った上層に、 1
ウムと 2
.
2容のエタノールを加え、 RNAを沈殿させた。 -20Cに一晩静置した後、 1
5，
000rpm、
0
0
4Cで 5分間遠心分離し上清を除いた。得られた RNAペレットは 70%エタノールで洗浄し、
同様に遠心分離して減圧乾燥した後、 20μlの RF水に再懸濁した。これを -20Cで保存し
0
た
。
• 20XMOPS電気泳動バッファー
0.
4M
MOPS(
3
(
N
m
o
r
p
h
o
l
i
n
o
)p
r
o
p
a
n
e
s
u
l
f
o
n
i
ca
c
i
d
)
100mM 酢酸ナトリウム
3水和物
20mM EDTA
MOPS，酢酸ナトリウム、 EDTAの順に RF水に溶解し、 pHを 7
.
0に合わせた後 (
2NNaOH)
メスアップし、 0.2μmのミリポアフィルターで塘過滅菌した。これを遮蔽して室温に保存
した。
• 1%アガロースゲル
0
RNA専用のアガロース 19、20XMOPS5mlをミリ Q 水 77mlに溶解した。温度を 6
0C
まで下げてから、 1
8mlのホルムアルデヒド (2.2MRNA専用)を加えて混合し、ゲルの型
枠に流し込む。
• RNAサンプルの調整
トータル RNA
10μg
20XMOPS
1
.0μl
34
ホルムアルデヒド
3.5μl
ホルムアミド
10.0μ1
1
.5ml のエッペンチューブに上記の RNA、バッファ一、ホルムアルデヒド及びホルムア
0
5Cで 1
5分間加温した後、急冷しローディン
ミドを採り、 RF水で 20ml にする。これを 6
グバッファーを加える。
1XMOPS泳動バッファー
20XMOPSを RF水
で
、 20倍希釈した。
.変性ゲルによる電気泳動
n
a
s
e
F
r
e
eにするため、
電気泳動用ゲルの型枠やコーム、泳動槽及び実験を行う環境は、 R
5%H
02 水、及び RF水での洗浄、ふき取りを行った。これに変性ゲルを作り、上記で調
z
製した RNAサンプルを加え、 50V、約 80分間泳動後、エチジウムブロマイドで染色した。
②
RT-PCRによる 18SrDNAの増幅
①で得られた、 97M42及び 97M40から抽出した RNAをサンプルとし、濃度を測定した後、
RNAPCRK
i
t(AMV)Ve
.
r
2
.
1(
T
a
k
a
r
a，
BIOMEDICALS)を用い、そのマニュアルに従って RT-PCR
を行った。逆転写反応におけるサンプル用のフライマーは、 Random9mers，
dp(NNNNNNNNN)
を使用した。また、 PCRのフライマーとして、 T
a
b
l
e4
1，
2に示す NS1・NS6，
NS5-NS8，
NS1・NS8
の組み合わせを用いた。逆転写反応及びその後の PCRの反応液組成及び反応条件を T
a
b
l
e4
4，
5，
6，
7 に示した。
③ PCR産物のシーケンス
NS1-NS8で増幅する断片が得られたので、これをテンプレートとし、 2)③と同様に、
その塩基配列を読み、 2)で得られた、データとの比較を行った。
2
. 結果及び考察
PDA
，CZA，MEA培地上で 2週間培養した、いくつかの植物内生真菌の形態を Fig4-2に示
i
g43に示すような特徴的な s
e
t
a
eと分生子を形成してい
す
。 44株は 3週間から 4週間後に F
・
7
1，
3B株では、いずれも菌糸の発育がよく、分生子や分生子果の形成
るのが観察された。 7A，
が見られなかった。
18S rDNAのうち、 NS1 と NS8で挟まれた領域は、菌株により増幅したりしない場合があ
り
、 NS1NS6，NS5・NS8で増幅する断片の塩基配列を読み、これをオーバーラップさせて、全
同
18S rDNA配列とした。 NS1-NS6，NS5-NS8で増幅しない断片もあり、これらについて、 NS1-
，NS3・NS4，
NS5-NS6，
NS7
・N
S8のそれぞれの断片を増幅させると、 F
i
g
.
4
4に示すように、
NS2
NS5NS6断片が通常より長いこと、 NS5や NS6のアニーリングサイトが数多くあることなど
・
が明らかとなった。複数のバンドが見られる場合は、 PCR条件を変えることにより、単一の
バンドを得るようにした。長い断片は、断片内にフライマーを設計し、全長を読んだ。 97M40，
97M42
，14Aの 3株は 18SrDNAの長さが通常よりも長い株であった。 97M40株から抽出され
た全 RNAの電気泳動図を F
i
g
.
4
づに示した。ランダムプライマーで逆転写し、得られた cDNA
35
から 1
8SrDNAの NS1NS8，NS1・NS6，NS5・NS8の各断片を PCRで増幅した後(日g
.
4
6
)、この
幽
塩基配列を読んだ。ゲノム DNAから得られた PCR産物の塩基配列と比較することにより、
p
sから 480b
p
sのいくつかの配列が挿入断片(イントロン)である
長い断片に含まれる 380b
8SrDNA配列中にふくまれるイント
ことが明らかとなった。 97M42株についても、同様に 1
ロン部分が明らかとなった(
F
i
g
. 47A
，
7
B
)
0 cDNA から得られたこの挿入部分の配列は、
・
e
a
r
c
hや AutoA
s
s
e
m
b
l
e
r フログラムを使用し編集した配列と一
GENETYX-MACの homologys
致したので、以後、その DNA配列に長いイントロンを含む株では、編集プログラムによって、
8
SrDNA配列を使って、類似配列の検索に用いた。
イントロン部分を削除した 1
本実験で得られた各植物内生真菌の rDNA
配列と、検索の結果得られた各菌に類似の配列
(
T
a
b
l
e牛 8，
9
) を用いて作成した系統樹を F
i
g4
8，
9に示した。 F
i
g4
8の 1
8
SrDNAに基づ、く系統
樹では、各国の様々な植物から分離されたこれら 2
5株の内生菌は、それぞれの類似の配列を
持つ既知の菌と高いブーツストラップ値で分岐するクラスターを作っていた。系統樹に含ま
れる、植物内生真菌のうち、赤色で囲んだものはマレーシアの、緑色は北海道の、そして、
黄色がインドネシアの植物から分離された真菌を示している。また、これら 2
5 株の植物内生
真菌は、これまでに分離された植物のほんのー握りであるが、それぞ、れ丹r
e
n
o
m
y
c
e
t
e
s(
核菌類)，
L
o
c
u
l
o
a
s
c
o
m
y
c
e
t
e
s (小房子嚢菌類)、 D
i
s
c
o
m
y
c
e
t
e
s(
盤菌類) ，Hymenomycetes (菌輩類)各グル
ープに属していた。丹r
e
n
o
m
y
c
e
t
e
s (核菌類)では、さらに D
i
a
p
o
r
t
h
a
l
e
s(
ジアポノレテ目)， X
y
l
a
r
i
a
l
e
s
(クロサイワイタケ目) P
h
y
l
l
a
c
h
o
r
a
l
e
s (クロカワキン目)H
y
p
o
c
r
e
a
l
e
s (ボタンタケ自)の各クラスターに
わかれ、また小房子嚢菌類も、 P
l
e
o
s
p
o
r
a
c
e
a
e
，Phaeo
司
p
h
a
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，L
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a
e
，C
o
c
c
o
d
i
n
i
αc
e
a
e の6つの科に分かれて深い分岐を作っており、植物
に内生する真菌が、系統的に非常に多様で、あることが明らかで、あった。(直線の距離は十塩基に対し
て一塩基の変化がおきる距離に対応している)。
I
T
S領域の塩基配列をもとに作られた系統樹 (
F
i
g4
9
) でも明らかなように 1
8
SrDNA
の配列の相向
性が非常に高い株間でも、 I
T
S領域の相同性が低く、細かく深く分岐していることから、同じ属に属して
いても種やその他の性質が異なると予想され、やはり系統的に多様な株の存在が考えられた。
また、 44
株の形態的特徴で、ある s
e
t
a
eや分生子形成は、ひとつのおおきなクラスターを形成している
C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m 属の特徴をよく現していた。 IT81のもつ黒色の菌糸や分生子果形成の特徴は，
B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
i
c
e
a
e のアナモノレフ状態 Fusicoccums
p
.の特徴と一致した48)。
このように、データベースにおける 18SrDNA
や各属における I
T
S領域のデータが増加してしも現在、
rDNA
塩基配列の解析は、有性世代の形成が不可能で、あったり、胞子形成能の低い真菌について、
科や属レベルでの分類を可能にした。これをもとに胞子形成条件や培地の検討を重ね、形態学に
得られた結果がこの系統分類結果と一致し、同定に至った株がいくつか存在した。
3
. 小括
様々な有用機能を持つ 2
5株の植物内生真菌について、形態学的分類と、 1
8
SrDNA及び I
T
S
36
領域の塩基配列に基づく系統分類を行った。その結果、各内生真菌類は、それぞれの最も相
向性の高い配列を持つ既知の株と独立したクラスターを作り、その分類学的位置は多様であ
った。
また、分子生物学的に系統分類が可能になった現在、この方法が、真菌の分類分野におい
ても、有性世代の形成が不可能で、あったり、胞子形成能の低い植物内生真菌における分類手段の
ひとつとして、非常に有効で、あることが明らかとなった。
3
.
7
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b
l
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'TCCTCCGCTTATTGATATGCT
I
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S
5
5
'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
3
'
NS1
5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC
3
'
NS2
5
'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3'
NS3
5にGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3'
NS4
5
'-CTTCCGTCAATTCCTTTAA
3
'
NS5
5'-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG
3
'
NS6
5にGCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3
'
NS7
5
'-GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC-3'
NS8
5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'
酬
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r
a
i
n
sb
a
s
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don18SrDNA
同国mpsisa
mygdafi
7A 円 旧mo
，
阿β mafi
Diapor
t
he phaseo
l
o
f
l
υm
14A
Pyrenomycetes
D
i
a
po
r
t
h
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l
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s
Phom
l
FO
H
y
p
o
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N
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ag
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1
44
Loculoascomycetes
9
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D
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l
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949
Paraphaeosphaeriam
i
c
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i
1
123
50
.
.
C
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l
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CJ1
12A
Ph
yl
l
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c
h
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r
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l
es
Coniothrium白 ckeliiAHU9617
38
Ampelomyceq
u
e
r
c
i
n
u
s
0
.1
8otryosphaeri
ar
i
b
i
s
Oiscomycetes
F
i
g
.4
9
.Dendrograms
howingt
h
e
r
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l
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i
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s
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samong1
7endophyt
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cfung
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i
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g
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Pez
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l
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s
打7
2
詮o
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ab
o
u
d
i
e
r
i
T
e
r
f
c
第5
章
植物内生菌によるアレロパシ一物質レピヂモイド生産と
生産株の同定
はじめに
新たな微生物資源の探索を目的に、分離した植物内生菌のオリゴ糖、生理活性物質、抗菌
物質の生産性などを調べた結果、多くの内生菌が様々な物質生産機能を持つことが明らかと
なった。内生菌と植物との相互作用や、内生菌の感染サイクル、植物組織内での生理作用を
考えるとき、植物内生菌の生産する新たな機能探索物質を期待することも可能である。
強力なアレロパシ一物質レピジモイドは、芽生えにおける茎の発育を促進し根の発育を抑
えること、様々な植物種の発芽種子から惨出することが報告されている
4
9，5
0
)。植物の発育や
老化における、レピジモイドの刺激、阻害作用についても明らかにされている
5
1-5
4
)。このレ
L
e
p
i
d
i
u
ms
a
t
i
v
u
mL.)の種の穆出物から抽出された
ピジモイドは、当初、発芽したクレス (
4
9
)。
D
g
l
u
c
o
s
eと α-L-rhamnoseから、多くのステップを経て、光学異性体の混合物として合成され
h
a
m
n
o
p
y
r
a
n
o
s
y
l
4d
e
o
x
y
α帽
しt
h
r
e
oh
e
x4
e
n
o
p
y
r
a
n
o
s
i
d
u
r
o
a
t
eで表され
ており、その構造が 2-0r
・
るこ糖である
・
圃
5
5
)。様々な植物や生態系に対するアレロパシ一物質の影響、その作用機構をさ
らに幅広く研究するために、レピジモイドを大量に生産することが、非常に重要である。
オクラ Ubelmoschuse
s
c
u
l
e
n
t
u
mMoench) から抽出される多糖は、その繰り返し構造として、
F
i
g
. 子1
)。そこで、化学合成の代わりに、微生物
レピジモイドによく似た構造をもっている (
にこの多糖を分解させ、レピジモイドを得ょうと試みた。植物の細胞壁から侵入し、宿主植
物の免疫システムを破って、植物内で共生する植物内生菌に特異的な性質を予想すると、オ
クラ多糖を分解できる酵素の探索源として、植物内生菌を選ぶのは非常に妥当なことと思わ
れる。オクラ多糖を単一の炭素源としたスクリーニング系で、レピジモイド生産株を得、こ
のカビによるオクラ多糖分解物がレピジモイドであることを、物理化学的手段で確かめた後、
その生産株の同定をおこなった。
1
. 実験材料及び方法
1)植物内生菌の分離
1997年、インドネシア、ジャワ島にある C
i
b
o
d
a
s植物園内の植物とオクラから、第 2章
、
第 2節に記した方法により、植物内生真菌及び細菌を分離した。各々の真菌は寒天切片とし
て、細菌は細胞懸濁液として、 20%グリセロール水溶液中、 -80Cで保存し、スクリーニン
0
グに供した。
2
) レピジモイド生産株の探索
基本的に、第 3章のオリゴ糖生成酵素の探索方法と同様に行った。 T
a
b
l
e3
1 に示されたキ
52
シラン、マンナン分解酵素用培地のうち、これら多糖の代わりにオクラ多糖を 2
.
5 g/l使用し
た。オクラ多糖は細かく破砕したオクラから水抽出し、エタノール沈殿させたものを用いた 56)。
培養上清を第 3章と同様に調製し、基質をオクラ多糖に代えて、酵素反応した後、その反応
生成物を TLCで検出した。スタンダード物質として、ラムノース、ガラクトースおよびガラ
クツロン酸を使用した。
3) 生成オリゴ糖の分離と精製
粗酵素液は上記と同様に調製し、 100mMリン酸緩衝液 (pH6
.
0
) に 0.5%のオクラ多糖を
0
加えたもの同量と混合した後、 3
7Cで 24時間反応させた。反応終了後、 2倍量の 99.5%エタ
0
ノールを加えて、 4C、 8
，
000中m で
， 1
5分間遠心分離し、残った多糖を除去した。得られた上
清を、ロータリーエパポレーターで 1m!まで濃縮し、さらに 2倍量の 99.5%エタノールを加
0
えて遠心分離し (
4C、5，
000rpm、5分間)下方の粘性の高い沈殿物を除去した。この操作を
2回繰り返した後、得られた上清を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (MERCK
.
t9385 K
i
e
s巴1
9巴16
0
)、2ーブロパノール:酢酸エチル:水 =4:5:2 を用いて分画した。各
Ar
画分について TLC分析を行い、レピジモイドを含んでいると思われる画分を集め、遠心減圧
濃縮器を用いて乾回した。
4
) HPLCによる分離分析
乾回した上記の画分を超純水およびアセトニトリルに溶かし、 HPLC用のサンプルとした。
その他の条件は以下に示す。
送液ポンプ
L
6
2
0
0 I
n
t
e
r
i
g
e
n
tPump(HITACHI)
流速
0
.
5ml/min
検出器
L・4200 UV-VisDet
巴c
t
o
r(HITACHI)，
a
t214nm
カラム
Am
i
d
e
8
0(TOSOH)4
.
6mmX250m m
カラム温度
80C、655A
・5
2ColumnOven(HITACHI)
溶媒
a
c
e
t
o
n
i
t
r
i
l
e (和光純薬):2m Mt
r
i
f
l
u
o
r
o
a
c
e
t
i
ca
c
i
d(
A
B
I
)
0
= 85:15
5) 機器分析によるオリゴ糖の同定
精製したオリゴ糖は、 ESI(
E
l
e
c
t
r
o
nS
p
r
a
yI
o
n
i
z
a
t
i
o
n
)マススペクトルを測定したりOELJMS-
SX102A使用)。また、重水置換後、 P
e
r
k
i
n
E
l
m
e
rSystem2000F下 IRにより、赤外線吸収スペ
クトルを測定し、官能基の確認をした。また、オリコ、糖を重水に溶解し、 B
r
u
k
e
rAMX-500
s
p
e
c
t
r
o
m
e
t
e
rを使って、 lH-NMRと 13C-NMRスペクトルを測定した。
6
) 精製オリゴ糖のアセチル化メチル化物の分析
5
3
得られた精製オリゴ糖を無水酢酸、ピリジンと反応させてアセチル化し、さらにアセトニ
1
5-C-5
) と反
トリル中でジメチルスルホン酸、炭酸ナトリウム及びクラウンエーテル (
3
C
N
M
Rスペク
応させてアセチル化メチル化物を合成し、そのマススペクトル、 lH-NMRと 1
トルを測定した。
7) 生産株の分類同定
オクラ多糖を分解してオリゴ糖を生産する植物内生菌の同定は通常の形態学的特徴に基づ
8
SrDNAと 5
.
8
SrDNAを含む I
T
S領域を増幅し、その塩基配列を読んで解析す
いた方法と、 1
る方法の両方で、行った。
①形態学的特徴による分類、同定
、 1の1)の方法に準じた。但し、 PDA
，CZA
，MEAの寒天培養プレート培地上
第 4章
0C，2
7C，3
7Cで培養するだけでなく、胞子形成を誘導する手段として CMA
，
に三点接種後、 2
0
0
0
MEA
，三浦寒天培地上、 2
7C、暗所で 1週間培養後、蛍光灯下でさらに 3週間以上培養し
0
2
1C、1
5分間のオートクレーブ滅菌し
た。三浦寒天培地は、下記の組成のものを調製し 1
0
参出液、胞子形成の様子を培養 3日後から約一ヶ月にわたり、
た。プレート上のコロニ一、 j
光学顕微鏡下で観察した。また胞子形成が確認できた寒天切片をオスミウムガスで固定し、
S
E
M
:JOEL
，
J
S
M
5
31O)下で、観察した
風乾後、走査型電子顕微鏡 (
0
・三浦寒天培地
G
l
u
c
o
s
e
KH
P
0
2 4
MgS04 7H
0
2
K
C
l
NaN03
Y
e
a
s
te
x
t
r
a
c
t
A
g
a
r
D
i
s
t
i
l
l
e
dw
a
t
e
r
19
19
0
.
2g
0
.
2
g
2
.
0g
0
.
2
g
1
3
g
1
，
0
0
0m
l
(純正化学)
(キシダ化学)
(和光純薬)
(関東化学)
(関東化学)
(オリエンタル酵母工業)
(和光純薬)
② リ ボ ソ ー ム RNA遺伝子塩基配列の解析
第 4章
、 1の 2)に示す方法で行った。但し、培養後の菌体を減圧鴻過して、ケーキ状
SOPLANT I(ABI)を用いて、そのマニュアルに従い、 DNAの抽出を行った。 1
8
SrDNA
にし、 I
及び I
T
S領域の各断片の PCRによる増幅から系統樹の作成まで、すべて、第 4章
、 2
)①
④の方法に従い行った。
2
. 結果及び考察
1)
生産されたオリゴ糖の同定
様々なインドネシアの植物から分離した 5
0株の真菌と 8株の細菌のうち、 2
9株の真菌が
54
オクラ多糖からレピジモイド様オリゴ糖を生産した。即ち、生成されたオリゴ糖は、 TLC 上
スポットの色や Rf値がレピジモイドものと同じであった (
F
i
g
.
5・2
)。多くの植物内生真菌が、
L
r
h
a
m
n
o
s
e，
D
g
a
l
a
c
t
o
s
e，
D
g
a
l
a
c
t
u
r
o
n
i
ca
c
i
dをその構成糖として持つオクラ多糖を分解し、オリ
ゴ糖を生産するものと思われる。粗酵素反応後の生成物の濃度や、生成の時間的変化を TLC
上で調べ、シソ科の植物 C
o
l
e
u
sg
a
l
e
a
t
u
s
gから分離された 1
1
2
3を選んで、これ以降の実験に
用いた。
またこの株は、 AHU9748 として、当教室に菌株保存登録したため、以後この生産
株については AHU9748とする。
AHU9748 の培養液から調製した粗酵素液を用いて、オクラ多糖と反応させ、その反応液か
ら抽出、精製を繰り返し、オクラ多糖に対する収率約 7.1%でオリゴ糖を得た。このオリゴ糖
の TLC上の Rf値や HPLCにおける保持時間は、標品の値と一致した。また、 ESIマススペク
トル中、 m/z367に[M+Natのピークを示し、レピジモイドの場合と一致した。赤外線吸収ス
ペクトルでは、ガラクツロン酸カルボキシル基 (
1
5
9
3cm
勺、糖の水酸基 (
3
3
6
4cm
勺の存在を
示した σig.5-3)。これらの結果は Hasegawaら 49) の機器分析データと一致している。 lH-NMR
及び 13C-NMRスペクトルでは、精製オリゴ糖において若干ピーク数が多かったが、大まかな
ピークの位置は Hasegawaら 49) のデータと一致した。
Z5
4
6 に示し、レピジモイ
アセチル化メチル化物の質量分析においても、基準ピークを m!
ドのアセチル化メチル化物であることが明らかであった。赤外吸収スペクトルでは、水酸基
の吸収を表すピークが存在しなかった。 NMR では、アセチル化メチル化オリゴ糖のアノマー
巴m
ura55) らの値と一致するアセトキシメチルプロトンと、
混合物のピークが見られたが、 Kos
メチルプロトンのシグナルが存在した (
T
a
b
l
e51
)。
・
これら分光学的分析結果が、文献に示された値と一致したことから、オクラ多糖を植物内
生菌の酵素により分解して得た産物は、レピジモイドであることが確かめられた。
2) レピジモイド生産株の分類及び同定
0
生産株 AHU9748は
、 PDA培地上でよく発育し、 27C、7日間で直径 53mm""'56m mの集
落に達した。菌糸表面は白く、若い時は、ビロード状で平坦であるが、次第に湿って、透明
の粘質物でおおわれた (
F
i
g5
4
A
)。コロニ一周縁は、薄く全縁。においはなくコロニー裏面
は黄色がかった茶 (
y
e
l
l
o
w
i
s
hb
r
o
w
n
) からオリーブブラウン色 (
o
l
i
v
a
c
e
o
u
sb
r
o
w
n
) に変化した。
0
37Cでは発育しなかった。 27C、暗所で 1週間培養し、さらに蛍光灯下で 3週間以上培養を
0
続けると、直径 0
.
0
5cm "
"
'
0
.
2 cm、褐色 (
d
a
r
kb
r
o
w
n
) からオリーブブラウン色(
o
l
i
v
a
c
e
o
u
s
b
r
o
w
n
) の分生子果を MEA、
CMA及び三浦寒天培地の菌糸表面や寒天中に形成した (
F
i
g5-4B，
D
及び 5
づA)。分生子果はオリーブ、がかったグリーンからグレーの分生子形成細胞から成り、分
l
a
s
t
i
cに形成されていた。分生子の大きさは、長さ 1
1
.2-1
2.
5 μ m、幅 3.
5生子は 1個づっ b
4.0μmで、透明、ー細胞型で、直線型の円筒形か楕円形であった (
F
i
g
s5-4C
，
D 及び 5
5
B
)。
AHU9748株の 18SrDNA及び 5
.
8
SrDNA を含む ITS 領域の塩基配列をよみ、その類似配
列を検索した結果、 18SrDNAにおいては、 C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
mg
l
o
e
o
司
p
o
r
i
o
i
d
e
sに相向性が最も高く
55
(
9
7
.
1% /1
6
6
1b
p
s
)、I
T
S領域においては C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
mdematium の配列が最も類似していた
(
9
2
.
6
%/5
7
9b
p
s
)
oI
T
S領域の塩基配列は、多くの C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m属の種の系統分類を理解する
上で、評価されている向。既知の、いくつかの近縁種の配列を AHU9748株のものと多重配列
8
SrDNA及び I
T
S領域の配列に基づいて作成した系
し、第 4章 lの 2)、④に示す方法で、 1
i
g5
6
.
7に示した。
統樹を F
生産株 AHU9748 は
、 P
h
y
l
l
a
c
h
o
r
a
c
e
a
eのクラスターに属しており、ここにはアナモルフ状
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m属も含まれている。また、 F
i
g5
ヴでは、C. d
ematiumと共に、明らかに分
態の C
r
巴e
n
i
v
a
s
a
p
r
a
s
a
dら
かれたクラスターを作った。 S
の形が鎌形、三日月 C
f
a
1
c
a
t
e
)か
は、仁 dematium においては、その分生子
5
7
)
紡錘形 C
f
u
s
i
f
o
r
m
) であるとしているが、生産株の分生子
は円筒形 C
c
y
l
i
n
d
r
i
c
a
U か楕円形 C
e
l
l
i
p
s
o
i
d
) であることで、異なっていた。
形態学的及び分子生物学的データに基づき、この生産株 AHU9748を、アナモルフ状態のク
ロカワキン科 C
P
h
y
l
l
a
c
h
o
r
a
c
e
a
e
) に属する菌で、 C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
mdematium に近縁の、しかしな
がら、その分生子の形でC. d
ematium とは区別される C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m 属の真菌であると分類
T
S配列が 7
.4%以上異なることも考えられるので、新種としての提案
同定した。同種内で、 I
は、C. dematium との相違を、形態学的、生理学的にも明らかにした上で行いたいと考えてい
る
。
3
. 小括
植物から放出され、他の植物や微生物、昆虫に対して、阻害的あるいは促進的な何らかの
作用を及ぼすアレロパシ一物質のひとつ、レピジモイドを、植物オクラに含まれる多糖を微
生物分解することにより得ようとした。その分解酵素を生産する微生物として、植物内生菌
，
を探索源とし、有望な分解菌を高頻度で得た。そのひとつ AHU9748株の分解生産物を、 TLC
HPLCで確認しながら抽出精製後、物理化学的分析を行ったところ、マススベクトル、赤外吸
3C-NMRスペクトル分析において、レピジモイドの値と一致す
収スペクトル、 lH-NMR及び 1
るデータを得、この生産オリゴ糖をレピジモイドと同定した。
またさらに、この生産株 AHU9748を形態学的及び分子生物学的データに基づき、この生産
p
h
y
l
l
a
c
h
o
r
a
c
e
a
e
)に属するがアナモルフ状態で、 C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m
株 AHU9748を、クロカワキン科 C
dematiumに近縁の、 C
o
l
l
e
t
o
t
r
i
c
h
u
m 属の真菌であると分類同定した。
この株が生産する酵素反応の機構については、まだ明らかにされていないが、この章にお
いて得られた実験結果より、植物内生菌は、これらが持つ特異的な性質を考えたとき、様々
な生理活性物質生産のための微生物遺伝資源として、広汎な可能性を持つことが示唆された。
文、植物内生菌の持つ特異性を明らかにするために、それぞれの植物と内生菌との間でどの
ような相互関係が成り立っているのかを知ることが、大切であると思われる。
現在、雑草抑制アレロパシーを示す植物として、マメ科牧草ヘアリーベッチ、
56
トールフエ
スクやオオムギナタネなどの草本からクルミ、チャ、ナラ、カエデなどの木本まで広い範囲
の事例があると言われている。これらの植物と、植物内生菌との相互作用についても興味あ
るところである。
57
T
a
b
l
e5・
1
.13C-NMRs
p
e
c
t
r
ao
fm
e
t
h
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le
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rw
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hf
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e
* P
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d
u
c
t
*
*
P
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d
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c
t
*
*
170.
4
1
7
0.
4
1
3
6
9.
4
6
9
.
3
2
1
7
0
.
1
1
7
0
.
0
1
4
6
9
.
0
6
8
.
9
3
1
6
9
.
9
1
6
9
.
9
1
5
6
8
.
3
6
8
.
3
4
5
1
6
9.
1
6
9.
5
1
6
6
6
.
2
6
6
.
2
5
1
6
8
.
8
1
6
8
.
8
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これまで、数多くの植物から内生菌を分離し、有用酵素や生理活性物質を生産するいくつかの株
を得た。さらに、これら植物内生菌の持つ多様な微生物遺伝資源を有効に引き出し、利用するために
は、その宿主植物との関係において、植物内生菌が果たす役割や生理的意義を明らかにすることが
重要な意味を持っと思われる。即ち、こういった共生微生物がその被共生者とどのようなメカニズ、ムで
どのような相互作用を持つのか、双方からのシグナル物質や因子などがどのような分子機構で働くの
かなどを解明することは、生物防除的な内生菌の利用はもとより、共生微生物が特異的に生産する新
規な酵素、二次代謝産物、生理活性物質など探索物質の幅を大きく広げるであろうと思われる。
、 3に述べたように、
植物内生菌と植物の共生関係における内生菌の感染形態や、生活環は、第 l章
根では菌根菌や根粒菌において、また、地上部では牧草や
1
5
1
7
)、最近では野菜などを中心とした草
本植物の葉や根で、その詳しい研究がなされてしもお)。木本植物においても、その存在は早くから確
かめられており
7
)、日本でも、
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lは、内生菌感染のない若い葉を使った胞子液による接種試験で、
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2
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この菌の感染が見られたこと、芽吹いた直後の葉には感染があまり見られないこと、降雨量の増大に
伴い感染率が上がることなどから、胞子の水平伝播による感染サイクルを予想している。感染源となる
胞子は、樹冠に近い枯葉や枯れ枝上に形成されると考えているが、牧草エンドファイトで、確かめられた
ような詳しい感染形態や相互の生理作用については明らかにされてはいない。木本の小枝や樹皮、
木質部に内生する菌については、その生活環すら明らかではないが、現在のところ、胞子を介して感
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e65)は、ヨーロッパにおける森林の
染するのではなし功吃考えられている 63J4)。KowalskiとK
木々の枝では、外樹皮に多くの内生菌が存在することや、生きている枝と枯死した枝には、数々の共
1種の樹木について報告している。枝の自然な刈り込み(落枝現
通な真菌類が分離されてくることを 1
象)には、真菌類が関与していると言われているが、健康な状態で存在していた植物内生菌のいくつ
かは、早い段階からこれに関与し、枝に胞子形成する基質を得、ホスト植物は刈り込みによって生長
力を失った枝を切り捨ててゆくことにより、主たる幹や茎をより攻撃的な病原菌の蔓延から逃れるという
ように、内生菌と森林樹木の枝との共生を相利共生であると解釈している。樹皮から分離された真菌
の昆虫に対する忌避作用
6
6
)や、活性を示すいくつかの二次代謝産物 6
7
)
も事象として明らかにされて
はいるものの、これらの接種試験に基づいた感染形態や生活環など、未だ不明な点が多い。
第2-4章で述べた様に、我々は、植物園や様々な地域の様々な植物の枝や茎から、内生菌を分離、
分類し、その機能を調べてきた。植物園の様々な植物の枝や茎から、その内生菌を 3年間にわたり分
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同じような形態を有する真菌類が得られた。これらの真菌のうち、いくつかは、抗菌活性やオリゴ糖生
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aは、その茎や根が浮腫や、リウ
産酵素を持つものであった。 Ulmusd
マチ様関節炎、癌に対する韓国の伝統的治療薬として使われており、又、そのメタノール抽
出物には、グルタミン酸誘導型神経毒に対して保護活性のあること
6
8
)や、アリマキの共存 6
9
)
が報告されているが、これまで内生菌についての報告はない。そこで、落葉高木広葉樹、ハノレニレ
を宿主植物として、まず、表面殺菌した枝組織から植物内生菌を分離し、これら落葉広葉樹の、特に
枝の内生菌がハルニレの成長に果たす役割や、その感染形態及び生活環を明らかにすることを目的
に、以下の実験を行った。
節
第1
季節及びハルニレの生理作用の変化による植物内生菌感染率の変化
1
. 実験方法及び材料
1
) 供試植物及び採取
""3mの四
北海道大学キャンパスに自生する二本のハノレニレの、異なる方向に伸びた地上部 2m
本の枝を採取した。北大キャンパスで、は、芽生えの前である 4月から、花が咲き翼果形成後、葉を伸
1月、休止期の 1月
、 3月まで、季
ばす 6月、アリマキ、カメムシなどの成虫の多い 9月、落葉期の 1
節を追って、 2"-3ヶ月ごとに 8本の枝を採取した。 F
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g
.6
-1.にそれぞ、れの季節におけるハルニレの
外観と様子を示した。但し、ここにおける枝とは、外樹皮、内樹皮及び木質部すべてを含む。
その生理活性が異なると予想される、芽生え直後の樹齢一年以内の小枝や、 6 月、葉の生育が旺
1月
、 1月の水分含量の少ない枯れ枝も分離源とし
盛な時期にもかかわらず、葉を付けていない枝、 1
た。また、開花後、枝に付いていたものを、 4回にわたり 30個ずつ採取した翼果と、枝を採取した木の
周りの地面から、開花、飛散後の翼果を集め、虫食いや腐敗のない、 30個を種のサンフ。ノレとした。
2
) 表面殺菌及び菌類の分離
0分間洗浄し、十分に水分をふき取った 8本の枝から、 1
2切片を切り取り、直ちに表面
流水下で 1
)の表面殺菌及び分離法と同様に、各切片及び翼果から分離培地
殺菌に供した。第 2章、第 2節 2
上に発育してくる細菌や菌類を分離し、保存した。なお、表面殺菌後、内部組織が現れるようにカット
した枝切片や翼果は、分離培地上にプリントすることにより、表面殺菌が十分であるか否かを確認し
た
。
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)(コロニー形成頻度、以後 C.F.とする)とし、植物内生真菌や
F
.を計算した。
細菌が分離された切片数を調べて、C.
2切片について、季節毎に植物内生真菌や細菌が分離される枝の数を
また、一年以上の各枝の 1
.
F
.の変化を調べた。
調べ、 8本の枝の平均値を計算し、季節による C
2
. 結果及び考察
67
異なる生理活性状態や、生育状態にある枝切片における C
.
F
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-1.に示したが、一年以上
を経た枝では、一年以内の伸びたばかりの枝に比べ、菌類や細菌の C
.
F
.が共に高い傾向にあった。
6月にもかかわらず、葉がついていない枝は、生理活性状態が通常とは異なると思われるが、真菌類
の分離頻度には差がなかった。
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.6
・2
. に示した。翼果の C
.F
.
は
、
翼果における植物内生菌の分離頻度は、翼果の状態と共に、 F
枝に比べ、真菌、細菌ともに低かった。細菌に関しては、分類を行っていないので、詳しい考察はでき
ないが、翼果が熟す前は、細菌が分離されてこないのに対し、飛散の前の状態や、飛散後の翼果から
は細菌が分離されていること、真菌類の分離頻度は、いずれの状態でも低いと言う結果が得られた。
牧草エンド、ファイトとして知られる Neo
砂'
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hodiuml
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、
菌糸が種子内に侵入し、この種子の発芽と
共に菌糸も伸び始め、幼苗の生育に従って菌糸も細胞間隙を伸長する。そして、植物が種子を結実
させると、エンド、ファイトも種子内に移行するという、種子.植物.種子の感染サイクルを送るといわれて
いる
。ハルニレにおける内生真菌類に関しては、このような種を介する感染サイクルが成立してい
1
7，1
9
)
ないのではなし功吃思われる。
F
.の季節ごとの変化と、札幌市における年間の平均
さらに、一年以上の各枝切片について見たC.
気温、平均降水量を合わせて F
i
g
.6
3に示す。 W
i
l
s
o
nと C
a
r
r
o
U62)は、カシの木の葉において、植物
i
s
c
u
l
aq
u
e
r
c
i
仰が、落ち葉などに形成された分生子果内の胞子が雨などを介して、萌芽直
内生菌 D
後の葉に感染し、その感染率は、雨量の増加とともに高くなることを明らかにしている。しかし、ハルニ
.
F
.
レの枝切片においては、細菌は、年間を通して、全体に C
果、特に平均気温が 1
叩O
O
C以上になる 4月
、 9月に比べ、マイナスとなる 1月から 3月では、 C
.
F
.は有
意に低いことが明らかなった。一方、真菌類は、一年間を通し、ほぼすべての枝切片から分離され、降
水量や気温に関係なく、枝には、いずれかの真菌類の存在が明らかとなった。この結果から、侵入に
成功した真菌類の菌糸と死滅する菌糸の差のほとんど一定量が、菌糸の状態で、細胞間隙に存在し
ていることが考えられる。また、この状態の菌糸が、新しい枝の形成に伴い、これに向かって伸長する
という可能性も考えられる。
節
第2
ハノレニレにおける植物内生菌の種構成と各分類群C.F
.の季節変化
1.実験材料及び方法
分離された各菌類について、形態学的観察及び分子生物学的手段により分類を進めた。切片の周
辺及び切片上に現れた真菌をまず、菌糸及び、コロニーの色、形、胞子形成などにより大まかな菌群に
分けた。ひとつの菌群のうち代表的な株の 1
8SrDNAとI
T
S領域の塩基配列を読みデータベース検
索を行った。分離培地上で分類の不可能な株については、さらに CMA、MEA に接種後、形態によ
I(ニッポ
る分類及び塩基配列による検索を進めた。減圧櫨過後の培養菌体ケーキから、 ISOPLANTI
、 1の 1
)、2
)
ンジーン)を用い、添付のマニュアルに従って、ゲ、ノムの抽出を行った以外すべて、第4章
の方法に従った。形態及びデータベース検索の結果から、各分類群の同定を行った。この結果をもと
68
に、季節毎に採取した各枝の 1
2切片について、その植物内生真菌の種構成と、各分類群における
C
.
F
.を調べた。
2
. 結果及び考察
同定を行った各分類群について、C.F
.
(
コロニー形成頻度)を求め、一年間を通して分離されてきた
i
g
.
6
・4の右の図である。通常の健康な枝から分
植物内生菌類を頻度別に高いものから並べたのが、 F
離されてきたものの他、生理作用が異なっていると思われる、 6 月にもかかわらず、葉の付いていない
枝、枯れて乾燥した枝についても分離されてきた菌を示した。
また、左の棒グラフは、生理状態が異なると思われる三種類の枝切片について、それぞれの分類
.
F
.を積み上げたものである。健康なハルニレ枝切片から年間を通し、 70・80%の高頻度で分離
群の C
k
e
l
i
iとPhomopsiss
p
.がありこれら 2つが優占種で、あると思われた。
されてくるものに、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m戸c
k
e
l
i
iは、健康な枝に比べ、生理状態が通常とは異なると思われる 6月に葉の無い枝
C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mかc
や、枯れて水分の少ない枝においては頻度が低いことが明らかで、あった。
4-22%の低頻度でP
a
r
a
p
h
a
e
o
s
p
a
e
r
i
as
p
.の無性世代やPhomas
p
.A
l
t
e
r
n
a
r
i
as
p
.B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
a
c
e
a
e
の無性世代 (
M
i
t
o
s
p
o
r
i
c
)の4種が分離され、これら4株も、 1年を通して内生する菌類であると予想され
i
g
.6
4の左の棒グラフが示すように、 B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
a
c
e
a
e の無性世代は葉のついていない枝に
る
。 F
仰 向c
k
e
l
i
i
，Phomopsis s
p
.の他に、特異的に
おいて有意に頻度が高く、またこの枝では、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
z
p
.，T
r
i
c
h
o
d
e
r
m
as
p
.，P
e
s
t
a
l
o
t
i
as
p
.，S
c
o
p
u
l
a
r
i
o
p
s
i
ss
p
.や'M
u
c
o
rs
p
. が分離され、葉の離脱と
B
o
t
r
y
t
i
ss
p
.，Fusarium s
p・
2
なんらかの関連が考えられた。時々分離されるものとしては、 P
h
a
e
o
s
h
a
e
r
i
as
Epicoccums
p
.，陪r
t
i
c
i
l
l
l
u
ms
p B
a
s
i
d
i
o
m
y
c
e
t
e
sの無性世代の菌群があった。ハルニレは他の樹木に
吋
比べ木質部の水分含量が多し立言われているが 70)、枯れて水分含量の少ない枝切片においては、
X
y
l
a
r
i
a
l
e
s
を除いたこれらの菌群が出現せず、植物組織内の生理的不活性化に1
)
慎応で、きなかったと思
p
.は、植物組織内の
われる。逆に、植物の生理作用に関係なく、高頻度で、分離されてくるPhomopsis s
生理活性変化に影響を受けず、その生活環をおくることができる内生菌ともいえる。
αsp.の無性世代や Phomas
p
.B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
a
c
e
a
e の無性世代
優占株はもとより、 P
a
r
a
p
h
a
e
o
s
p
a
e
r
i
0
(
M
i
t
o
s
p
o
r
ic)は、接種後、 24C、1
2時間周期の蛍光灯下で培養した CMAや MEAプレート上や、
表面殺菌した切片上で分生子果を形成し、粘液物質中に胞子が存在する形をとっていた。このことは、
その感染サイクノレや分離頻度となんらかの関連があると思われる。
k
e
l
i
iとPhomopsis s
p
.について， 各校ごとに C
.
F
.の平均値を求
優占種とおもわれるC
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m戸c
i
g
.6
5のグラフである。各々のグラフの下には、寒天培地上でのそ
め、季節ごとにフ。ロットしたものが F
れらの発育とさらには時間周期の蛍光灯下で形成させた、分生子果中の分生子の様子を示した。ま
p
. の次に比較的よく出現してくるP
a
r
a
p
h
a
e
o
s
p
a
e
r
i
as
p
.無性世
た
、C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
iとPhomopsiss
i
g
.
6
6に示した。 Phomopsiss
p
.における α、3胞子 71)な
代の寒天培地上での発育と分生子の様子をF
c
k
e
l
i
iとP
a
r
a
p
h
a
e
o
s
p
a
e
r
i
as
p
.無性世代胞子の大きさや色
ど、の特徴的な分生子の形やC
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mβl
の違いは、各枝切片から分離した真菌類を分類する際、指標として役立った。
F
i
g
. 67 には、優占株を含めたすべての菌群について、 C
.
F
.を求め、季節によるその変化を棒グラ
・
6
9
フに表した。 F
i
g
.6
5の左のグラフが示すように、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
iでは、 4月から 1月まで、ほぼ
.
F
.が低かった。
その頻度が一定であり、 3月では 4月にくらべ有意に C
Phomopsis s
p
.は、温度が下がる 1
1月
、 1月
、 3月において 4月よりも有意にその C
.
F
.は高かった。落
o
w
a
l
s
k
iと K
e
h
r
b
r
a
n
c
h
e65)の言うような、
葉や落枝の時期にコロニー出現頻度を上げていることから、 K
内生菌が落枝を促進させることにより、樹木が成長力を失った枝を切り捨て、主たる幹や枝を守る相利
p
. の分類群にも成立していると思われる。また、
共生的な関係が、ハルニレの枝と Phomopsiss
Phomopsiso
b
l
o
n
g
aという菌類が、ニレ科の植物に穴をあけ Dutchelmd
i
s
e
a
s
eを媒介する昆虫に対
し、忌、避作用のある物質を産生すると言う報告 66，67)がある。ハルニレから分離された PhomopsisSp.は
、
形態学的にも、 rDNAの塩基配列からも、 P
homopsiso
b
l
o
n
g
aとは異なる種であることを確かめたが、 9
月のハルニレから分離された PhomopsisSp.の CMM寒天培地上のコロニーには、黄褐色の渉出液
生成が多く見られ、 9 月ごろからハノレニレの葉にその成虫が見られるアリマキやカメムシなどの生活環
ともなんらかの相互関係の可能性があると思われる。
F
i
g
. 67を見ると明らかなように、優占種である C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mルc
k
e
l
i
i の出現頻度の減少傾向と、
・
Phomopsiss
p
. 出現頻度の増加傾向は、植物内という限定された場所と栄養源をうまく分け合って、そ
の占有率を交代させているようにも取れる。
値を多少変化さ
さらに、年聞を通し、他の出現頻度が低い菌群についても、季節によってそのC.F
せていることから、植物の生理作用の変化や、外来の菌などと内生菌の聞になんらかの相互作用が存
在してしもと思われる。
第3
節
優占菌類群における I
TS領域遺伝子の保存性
1
. 実験材料及び方法
北海道大学植物園内に生育する一本のハノレニレの枝を、夏に三年間採取し、この枝切片からも、
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
i
，
同様に植物内生真菌及び細菌を分離しているが、このハルニレからも、 C
Phomopsis s
p Paraphaeo
宅
p
a
e
r
i
as
p
.が頻繁に分離された。また、北海道大学キャンパス内において
吋
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m戸c
k
e
l
i
i
， Phomopsiss
p
.を得
三年間にわたり、枝切片から同様に分離し、優占種として C
てきた。これらの株が、遺伝的にどのくらい保存されているかを、植物病原菌などにおいて、菌株の同
T
S領域の塩基配列を比較することにより調べた。植物内
定指標とされ、比較的変化の起こりゃすい I
生菌の分離方法及び I
T
S領域塩基配列の解析は、第 1節及び、第 2節に準ずる。
2
. 結果及び考察
植物園及び大学キャンパスで、継続的に分離された、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m角c
k
e
l
i
i
， Phomopsis s
p
.，
Paraph
αe
o
s
p
a
e
r
i
as
p
.の各株から得られた、 I
T
S領域配列のうち相同性のあったものを F
i
g
.6
・8に示し
p
.，
た。表中、 E 番号は植物園由来、 U 番号はキャンパス由来を示しているが、 Phomopsis s
P
a
r
a
p
h
a
e
o
s
p
a
e
r
i
as
p
.で
、
は
、 ITS 領域の塩基配列が 100%相同である株を毎年得た。 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m
f
u
c
k
e
l
i
iでも、一塩基以外相同で、 ITS領域の約 98番目が、植物園由来のもので G，キャンパス由来
;
o
t
'
のもので A となっていた。札幌エリア北大近くのハルニレには，場所的には一部に限定されているが，
植物内生菌類として、遺伝的にもかなり近い株が毎年、感染及び生育を繰り返していると思われる。
第 4節
植物内生菌及びその他の分離菌の CMM培地上での相互作用
第 2節及び第 3節では、ハノレニレの枝切片から植物内生真菌を分離することにより、種構成と優占
p
.では落葉期から休止期にかけてその C
.
F
.が
種が明らかとなった。また、優占種のうち、 Phomopsis s
高いことから、その聞にハルニレ枝上で、越冬すると思われる昆虫類や、枝へ侵入する他の真菌や細
菌との相互作用が予想された。しかし、これら優占種の昆虫に対する具体的な現象や、外来真菌や他
の内生真菌、細菌との関係は全く不明である。そこで、まず手始めに、優占種 2種と、第 3節で分離さ
れた他の真菌群との相互関係を明らかにするため、 CMM培地上で、次のような対時法実験を行つ
た
。
1
. 実験材料及び方法
ハノレニレの枝切片から分離された優占種以外の菌分類群のうち、 4-22%の低頻度でコロニーを出
現させている分類群をグループ I、出現したり、しなかったりするその他の分類群をグ、ルーフ'
n、及び
6月にもかかわらず葉をつけていなし 1枝から分離された分類群をグループ I
I
Iとした。 T
a
b
l
e6
2にその
内訳を示す。
2
4C、1
2時間間隔で
グループ。 I、E、国の各菌株を CMM培地に三点接種し、人工気象器内 (
0
蛍光照射)で 8日間前培養した。この前培養コロニーの、生育が盛んな外縁部分から、直径 5m m程
の菌体を寒天ごと切抜き、培養寒天切片とした。プレート(直径 9 cm)上の対峠用培地何M M培地)
5m m のニ点に優占種とグ、ノレーフ。 I、E、Eの各菌株培養寒天切片を対峠させ、前培
の外側から 1
養と同条件の人工気象器内で、 1
0 日間培養した。対峠させた各株のコロニー間の距離、及び優占種
のコロニ一半径を測定し、対峠させたコロニーの生育状態の観察を行った。また、コントローノレとして
優占株どうしを対峠させ、これらの半径をもって優占株の平均半径としたO
2
. 結果及び考察
各菌株と対時させた時の、優占株の半径とコントロール平均半径の比、対峠した二株の生育状態、
a
b
l
e6
3 に示した。また、対峠した二株の生育状態は以下のよう
及び、優占株と各菌株間の距離を T
に A"'Dで表わし、 F
i
g
.
6
θ に代表されるク、ノレープに分けて示した。
A: 両株とも、対峠させた株方向にほぼ同心円状に生育している。
B: 優占株は、対時させた株方向にほぼ同心円状に生育しているが、対時させた株の生育は同心
円状ではなく、対峠株の外縁は優占株の外縁に沿うように生育している。
C: 優占株は、対峠させた株方向にほぼ同心円状に生育してしもが、対時株は優占株を覆うよう
に生育している。
D: 二株間の距離が比較的大きく、優占株も対時株もほぼ同心円状に生育しているか、あるいは
7
1
優占株の対峠させた株側が、押されたように横長の楕円状に生育している。
T
a
b
l
e63から明らかなように、まず、優占株の C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
i
，と Phomopsis s
p
.の
、 CMM上
・
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mかc
k
e
l
i
i
，Phomopsisspに
での発育は、どちらが優勢でも阻害されているわけでもない。 C
.
F
.
値の高い Paraphaeo
平a
e
r
i
as
p
. も同様な傾向にあった。また、 Paraphaeospaef
匂 s
pを除
ついで C
いた、クツレープ Iの分類群は、優占株のコロニー周縁のほうが優勢な Bのタイフoで、あった。クツレーフ。
Eの分類群は、様々なタイプの生育を双方の株がしており ，
P
h
a
e
o
s
h
a
e
r
i
as
p
.，
Fusariums
p
.と対時した
場合は、優占種は D タイプの発育をし、コロニー間の寒天中には、着色物質が生成されていた。
P
h
a
e
o
s
h
a
e
r
i
as
p
.，
Fusariums
p
.が対峠した株の生育を抑制するような、なんらかの物質を生産している
甲a
e
r
i
as
p
. と他の植物内生菌
可能性も考えられる。この傾向は、データとして示さないが、 Paraphaeo
a
s
i
d
i
o
m
y
c
e
t
巴sに対時させると、イ憂占種はいずれもそのコロニ}半径を小さくし、
との聞にも見られた。 B
a
s
i
d
i
o
m
y
c
e
t
e
sは
、 CMM上で、植物内生菌の優占種とは無関
タイプ C の生育をしていることから、 B
係に旺盛に発育していると思われる。この傾向は、健康な枝切片からは分離されてこない、グループ。
皿の P
e
s
t
a
l
o
t
i
as
p
.を除いたすべての分類群で見られた。、このことから、 B
a
s
i
d
i
o
m
y
c
e
t
e
s
.，
B
o
t
r
y
t
i
ss
p
.，
S
c
o
p
u
l
a
r
i
o
p
s
i
ss
p T
r
i
c
h
o
d
e
r
m
as
p
.，
Mucors
p
.の分類群に属するこれら腐朽菌と呼ばれる分離株は、
吋
健康なハルニレの枝切片中で、は、イ憂占種による物理的、あるいは化学的な発育阻害か、植物側から
の侵入、発育抑制が起こっていると予想される。また、植物内に侵入し、枝組織中に生育している植
物内生菌の間にも、高頻度で分離される優占種と、そうではない内生菌との間に、栄養源に関して優
劣の関係が存在すること、低頻度で分離される内生菌ではあるが、生成する二次代謝産物により、他
の内生菌の発育を抑えるものがあることがあきらかとなった。これらの、植物内生真菌は、おそらく、第
1節で得られた、植物内生細菌との聞にも、相互作用があると思われるが、これについては、今後の実
験に期待したい。
節小括
第5
共生微生物の持つ多様な微生物遺伝資源を有効に引き出し、利用するためには、その宿主植物と
の関係において、ど、のようなメカニズ、ムで、ど、のような相互作用が成り立っているのか、双方からのどのよ
うなシグナル物質や因子などが、いかなる分子機構で働くのかなどを解明することが重要な鍵を握る。
そこで、ハノレニレの枝とその植物内生菌との相互作用を調べる最初のステッフ。として、枝切片及び
翼果の感染率を調べたところ、一年以内の若い枝は、内生真菌、細菌いずれにおいても、一年以上
の枝よりも感染率が低かった。また、ハルニレの枝切片からは、年間を通し、降水量や気温に関係なく、
ほとんど 100%に近い状態で、内生真菌類のコロニーが出現していた。ハルニレの種子からは、飛散
直前や直後の状態では、数十パーセントの C
.
F
.で細菌が分離されたが、真菌類はほとんど分離され
てこなかった。
また、それらの内生真菌の種構成として、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
i とPhomopsiss
p
.が高頻度で分離さ
れ、これら 2つが優占種であると思われた。 4-22%の低頻度でParaphae
ωpaeria sp.の 無 性 世 代 や
Phomas
p
.A
l
t
e
r
n
a
r
i
as
p
.B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
a
c
e
a
eの無性世代 (
M
i
t
o
s
p
o
r
i
c
)の4種が分離されおり、これら4
7
2
株も、 1年を通して内生する菌類であると予想され、グループ Iとした。 B
o
t
r
y
o
s
p
h
a
e
r
a
c
e
a
e の無性世
代は葉のついていない枝において有意に頻度が高く、またこの枝では、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m舟c
k
e
l
i
，
Phomopsiss
p
.の他に、特異的に、 B
o
t
r
y
t
i
ss
p
.，T
r
i
c
h
o
d
e
r
m
as
p
.，
P
e
s
t
a
l
o
t
i
as
p S
c
o
p
u
l
a
r
i
o
p
s
i
ss
p
.
や
吋
p
. など腐朽菌と言われるものが分離され、これらをグループ皿とした。葉の離脱が起こる原因
Mucors
p
.，
となんらかの関連が考えられた。健康な枝から、時々分離されるものとしては、 P
h
a
e
o
s
h
a
e
r
i
as
Fusariums
p
.，
Epicoccums
p
.，
陪r
t
i
c
i
l
l
I
ums
p
.，B
a
s
i
d
i
o
m
y
c
e
t
e
sの無性世代の菌群があり、枯れて水分
含量の少ない枝切片においては、これらの菌群が分離されてこなかった。この菌群のグループを Eと
培地上で、
して、さらに、優占種と、グループ I、E、Eとの菌群の聞の相互作用を調べるため、 CMM
対峠培養を行った。その結果、優占種とグループ Iでは、優占株がほぼ優勢に発育し、 Eでは、優占
株との聞に発育に作用するような物質を生成するものや、優占株を覆って発育するものもあった。皿と
l
l
fこ属するほとんどの分類群の発育が旺盛で、優占株を覆うように発
の対峠培養結果では、グループ i
育していた。
k
e
l
i
i
，Phomopsis s
p
.について
また、優占種、 C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
m戸c
C
.F.値の季節変化を調べたところ、
，は 4月と翌 3月では有意にその出現頻度が減少し、 Phomopsis s
p
.は 4月に
C
o
n
i
o
t
h
y
r
i
u
mf
u
c
k
e
l
i
i
1月
、 1月
、 3月でその頻度が上がっていた。
比べ 1
k
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これらの結果を考え合わせると、まず、ハノレニレ枝切片における内生真菌の感染サイクルとして、牧
草エンドファイトのような種子を介した感染経路は考えにくいと思われる。落葉樹の葉においては、胞
子を介した水平伝播が予想されているが、枝や茎では、何がと、のように感染しサイクルがまわるのか?
寒天培地上の表面殺菌した切片上(この場合は枯れた切片になる)に粘液を伴って形成される、優占
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ている可能性があると思われる。あるいは、菌糸のまま、枝の細胞間隙を栄養供給源及び住処とし、新
しく形成された枝に伸長することも考えられる。また、優占種出現頻度の季節変化から、ハノレニレに対
する植物内生真菌の役割として、現在のところ次の二つが予想される。即ち、ハルニレにとっては不都
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.による抑制作用と、内生真菌によるハノレニレの不要な枝の削除で、あ
合な昆虫に対する、 Phomopsiss
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9 月のハノレニレから分離された
Phomopsiss
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.の CMM寒天培地上のコロニーには、黄褐色の渉出液生成が多く見られこと、 9月ごろ
からハルニレの葉にも、アリマキやカメムシなど成虫が見られることを根拠としてしも。また、多くの真菌
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gに関係していると言われている。健康な状態、で、枝内に生
類が自然界の木本で起こる n
息しその場所を確保していた内生真菌は、植物の生育力が変化し、枯死してゆくに伴い、分生子形成
73
の場所を得、植物は、内生真菌に場所や栄養を供給するかわりに、主となる枝や幹への病原菌や他
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の菌の感染を防ぐとし、った相利共生が成立していると思われる。 C
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対峠したとき、優占種が植物内では優位に発育していること、低頻度で出現してくる内生菌のなかに
は、他の内生菌の発育を抑えるような二次代謝産物生産の可能性があるとしづ結果がこのことを支持
する。
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84
第7章 総 括
系統的に多様であることが確かめられながら、その多くが未分離、未同定のままである地
球上の微生物を探索する場として、地上部植物の内部組織に焦点を当てた。本研究では、植
物体内に侵入し、病徴を示すことなく、植物の防御作用やライフサイクルに応答しながら植
物組織内で生育を繰り返している植物内生菌を微生物探索資源として利用するため、体系的
に、分離及び機能探索、そして有望株の同定を行い、得られた植物内生真菌による特異的物
質の生成例を挙げた。さらに植物と内生菌の相互作用を調べ、微生物資源としてその可能性
を探究した。
第 2 章では、より多くの植物から、植物内生菌を分離するための表面殺菌条件及び分離方
法を検討し、この方法で、北海道、インドネシア、マレーシアの、土地固有の植物や、絶滅
0
2種の植物を採取し、 1
1
3
3株の内生真菌と 6
7
8株の内生細菌
が危倶される植物を含めた、 4
を分離保存した。どの植物からも、一種類以上の真菌類か細菌が分離されていることから、
一般的に植物中には、一時的にせよ、病徴を現すことなく植物内部組織に生活する内生菌の
存在が予想、された。
第 3章では、得られた植物内生菌についてその有用性を検討した。それぞれの内生菌を各
種培地で液体培養し、その培養上清を用いて、有用酵素、抗生物質、生理活性物質生産株の
スクリーニングを行った結果、植物組織成分であるキシランやマンナンからキシロオリゴ糖
やマンノオリゴ糖を生成する株を数多く得た。これらのうち、キシロビオースやマンノトリ
オースを主生成物とする酵素については、その諸性質が調べられた。また、真菌、細菌に対
5
αリ
して抗菌力をもっ植物内生真菌や、内生細菌が約 10%から 30%の割合で得られた。 T
ダクターゼ活性阻害及びマウス毛包細胞増殖活性を調べた結果、真菌 1
0株、細菌 1
0株のう
5
α リダクターゼ活性阻害及びマウス毛包細胞増殖活性があり、
ち、真菌 3株の培養上清に T
育毛剤として評価されうる活性物質の存在が認められた。この他、グルコースを主生成物と
する何種類かのアミラーゼ生産株や、植物に対し感化作用をもっレピジモイド生産株を得、
植物内生菌がオリゴ糖生産菌や抗生物質のリード化合物、あるいは様々な生理活性物質の探
索源として大いに期待できることが確かめられた。レピジモイド生産菌については、第 5章
に詳しく述べている。
5株について、形態学的観察及び、既知の菌との系
上記の株を含む有用と思われる真菌の 2
塩基配列の解析をし、これらにより分類同定した結果を第 4章に述べ
統関係を得るため rDNA
た。その結果、各内生真菌類は、それぞれの最も相向性の高い配列を持つ既知の株と独立し
核菌類) ，
た深い分岐を持つクラスターを作り、その分類学的位置は大きく、 Pyrenomycetes(
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s(核菌類)では、さらに D
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均l
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，Coccodiniaceae の各科に分けられた。これらの結果より、植物に内生する真菌
が、系統的に非常に多様であることが明らかになった。
新規微生物の探索資源として、さらに
様々な植物から、様々な内生菌を分離することが望まれる。また、分子生物学的に系統分類
が可能になった現在、この方法が、真菌の分類分野においても、有性世代の形成が不可能であ
ったり、胞子形成能の低い植物内生真菌における分類手段のひとつとして、非常に有効な方法である
ことが判明した。
植物から放出され、他の植物や微生物、昆虫に対して、阻害的あるいは促進的な何らかの
作用を及ぼす化学物質をアレロパシ一物質という。このアレロパシ一物質のひとつ、レピジ
モイドは、当初、クレス発芽種子の粘質物から抽出されたが微量であり、植物オクラに含ま
れる多糖を微生物分解することによりこれを大量に得ようとした。その種の分解酵素生産あ
るいは物質生産の可能性が高い微生物として植物内生菌を考え、これを探索源として有望な
株を高頻度で得た。そのひとつ AHU9748株の分解生産物を、 TLC， HPLCで確認しながら抽
出精製後、物理化学的分析を行ったところ、マススペクトル、赤外吸収スペクトル、 lH-NMR
及び 1
3
CNMRスペクトル分析において、クレスの種から抽出されたレピジモイドの値と一致
開
するデータを得、この生産オリゴ糖をレピジモイドと同定した。
またさらに、形態学的及び分子生物学的データに基づき、この生産株 AHU9748を、クロカ
ワキン科 (
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) に属し、アナモルフ状態で、 C
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mdematium に近縁では
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m 属の真菌であると分類同定した。
あるが異なる、 C
この株が生産する酵素反応の機構については、まだ明らかにされていなし hが、とれまでに
明らかにされているレピジモイドの様々な機能や第 4章において得られた実験結果より、こ
ういった植物のアレロパシ一物質の生産に、植物内生菌が関与していることも考えられる。
植物に関連した生理活性物質あるいはそれらを生成する酵素などの探索源としても、植物内
生菌は大きな可能性を持つことが示された。また、植物内生菌の生産する特異的酵素や活性
物質を明らかにし、有用物質として探索するためには、それぞれの植物と内生菌との聞でど
のような相互関係が成り立っているのかを理解することが、重要で、あると思われる。
そこで第 6章では、その幹や根の抽出物の生理活性や、アリマキの共存が報告されている
0
0年を超えることも珍しくない落葉高木広葉樹ハル
が、植物内生菌の研究例がなく、樹齢 1
ニレ (
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ω)から、毎年特異的に、形態の似た分類群がいくつか分離されるのを受
け、これを研究対象植物として取り上げた。ハルニレとその枝から分離されてくる植物内生
菌は、ハルニレにどのように感染し、どのような生活環をとるのか、ハルニレとの聞にどの
ような相互関係が成立しているのかを調べるため、いくつかの実験を行った。
まず、生理状態の異なる枝切片や翼果における植物内生菌のコロニー出現頻度(C.F
.
) を調
べたところ、一年以内の若い枝は、一年以上の枝よりも、内生真菌、細菌いずれにおいても、
C
.F.は低かった。また、ハルニレの枝切片からは、年聞を通し、降水量や気温に関係なく、ほ
86
とんど 100%に近い状態で、内生真菌類のコロニーが出現していた。ハルニレの種子からは、
飛散直前や直後の状態では、数十パーセントのc.F.で細菌が分離されたが、真菌類はほとん
ど分離されてこなかった。
また、それら内生真菌の形態学的及び分子生物学的手法による分類、同定の結果、構成種
として、 Coniothyriumf
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i とPhomop
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.が高頻度で、分離され、これら 2つが優占種であ
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.の無性世代やPhoma s
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ると思われた。 4-22%の低頻度でParaphaeospaeria s
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の 4種が分離され、これら 4株も、 1年を通して内生
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する菌類であると予想され、グループ Iとした。
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e の無性世代は葉のついて
いない枝において有意に頻度が高く、またこの枝では、 Coniothyriumかc
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.やMucors
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.などが
他に、特異的に、 B
分離され、これらをグループ Eとした。その多くが腐朽菌と言われるこれらの分類群は、葉
の離脱が起こる原因となんらかの関連も予想された。健康な枝から、時々分離されるものと
しては、 Phaeoshaerias
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.，
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.，
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の菌群があり、枯れて水分含量の少ない枝切片においては、これらの菌群が分離されてこな
かった。この菌群のグループを Eとして、さらに、優占種と、グループ I、 E、Eの各菌群
との相互作用を調べるため、 CMM培地上で、対峠培養を行った。その結果、優占種とグルー
プ Iでは、優占株がほぼ優勢に発育し、 Eでは、優占種の発育に作用するような物質を生成
するものや、優占株を覆って発育するものもあった。
Eとの対峠培養結果では、グループ直
に属するほとんどの分類群の発育が旺盛で、優占株を覆うように発育していた。
また、優占種、 Coniothyriumルc
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，Phomopsis s
p
.についてコロニー出現頻度 C
C
.
F
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節変化を調べたところ、c.かc
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，は 4月と翌年 3月では有意にその頻度が減少し、 Phomopsis
s
p
.は 4月に比べ 1
1月
、 1月
、 3月でその頻度が上がっていた。 Phomopsis s
p
.における C
.F
.
の
増加は蕗葉期から冬にかけてのハルニレの生理状態やハルニレを取り巻く環境となんらかの
関係が示唆される。 C かc
k
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i
iの出現頻度の減少傾向と Phomopsiss
p
. 出現頻度の増加傾向は、
植物内という限定された場所と栄養源をうまく分け合って、その占有率を交代させているとも考えられ
る
。
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，Phomopsiss
p
.と、これらについで出現頻度が比較的高い P
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いて、植物園と大学キャンパスで、ハルニレから毎年分離されてくる各分類群の株の I
基配列を読み、遺伝的相向性を調べたところ、 100%の相向性を持つ株が毎年得られた。
これらの結果を考え合わせると、まず、ハルニレ枝切片における、内生真菌の感染サイク
ルとして、牧草エンドファイトのような種子を介した感染経路は考えにくいと思われる。優
占種、仁丹l
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，Phomopsiss
p
.の分生子果に代表される粘液を伴って形成される分生子と、年
.
F
.
値、及び、 I
T
S領域塩基配列の保存性から、枝切片上での分生子による
間を通して、高い C
感染や、枝細胞間隙内での菌糸の伸長が繰り返し行われている可能性が大きい。また、優占
種出現頻度の季節変化や、対~寺法の結果から、ハルニレに対する植物内生真菌の役割として、
87
ハルニレにとっては不都合な昆虫や真菌に対する生育抑制作用や、内生菌によるハルニレの
不要な枝の排除の可能性が考えられた。
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aという菌類が、ニレ科の植物に穴を
昆虫に対する抑制作用については、 Phomopsiso
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eを媒介する昆虫に対し、忌避作用のある物質を産生すると言う報告
あけ Dutchelmd
と
、
66，
6
7
)
9月のハルニレから分離された PhomopsisS
p
.の CMM寒天培地上のコロニーには、黄褐色の惨出
液生成が多く見られこと、 9月ごろからハルニレの葉にも、アリマキやカメムシなど成虫が見られること
を根拠としているが、これを実験的に確かめるには、更なる研究を待たねばならない。また、多くの真
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gに関係していると言われている。健康な状態で、
菌類が自然界の木本で起こる n
枝内に生息しその場所を確保していた内生真菌は、植物の生育力が変化し、枯死してゆくに
伴い、分生子形成の場所を得、植物は、内生真菌に場所や栄養を供給していたかわりに、主
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.の C
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となる枝や幹への病原菌や他の菌の感染を防ぐ。 C
が、枯れた枝切片においても高かったことや、各グループに属する植物内生真菌の分類群が
優占種と対峠したとき、優占種が植物内では優位に発育していること、低頻度で出現してく
る内生菌のなかには、他の内生菌の発育を抑えるような二次代謝産物生産の可能性があると
いう結果がこのことを支持すると思われる。
このような感染サイクルや相互作用が、共生微生物と植物との聞に成立しているとすると、
まず分生子の着生から、発芽、菌糸の侵入と伸長に至る過程で、植物側が提供する栄養源を
利用する為の酵素はもちろん、植物側に過敏感反応をおこさせず、あるいは、植物の作り出
す防御物質を無毒化するための酵素や、阻害物質シグナル物質を植物内生菌の側が用意しな
ければならないことになり、これらの酵素や物質を新規有用物質として、植物内生菌から探
し当てる可能性は高い。また、宿主植物の周囲の植物に影響を及ぼすホルモン様物質や、昆
虫が植物に住みにくくなるような毒性物質などの生理活性物質探索源としても期待すること
ができる。また、種特異性の高い植物内生菌の、感染サイクルを利用したベクターとしての
新たな可能性も考えられる。これらの目的の為には、第 6章の結果から、植物側の生理活性
を高める時期、あるいは植物や、植物に関わる他の生物の活動時期に、内生菌の分離を行う
のが望ましい。
本研究においては、植物から数多くの内生菌を分離し、これらが、酵素、抗生物質、生理
活性物質などの生産株として有望であること明らかにした。さらに、植物内生真菌では、 rDNA
の解析による系統分類の結果、非常に多様であることが示唆された。また実際、植物内生菌
から様々なオリゴ糖や生理活性物質の生産株の取得に成功し、それぞれについて詳細な研究
が進められた。内生菌の感染サイクルや相互作用を個々に明らかにすることにより、内生菌
に特有な物質生産の予測が可能となり新規物質の探索を効果的にすることを示唆した。さら
に、様々な植物から、分離条件によって制限することなく、できるだけ広範囲の内生菌を分
離し、個々の植物との相互作用を理解することで、産業上重要な新規微生物遺伝資源の探索
に貢献するものと思われる。
88
第 8章 英 文 要 約
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謝辞
本研究を進め、論文を作成するにあたり、終始、直接ご教示ご鞭撞そしてご校閲を賜りました北海道
大学大学院農学研究科応用生命科学専攻分子生命科学講座応用菌学分野冨田房児教
授、ならびに、様々な面において暖かいご指導、ご鞭健及びご校閲を賜りました、同応用生命科学専
攻分子生命科学講座微生物資源生態学分野の横田篤教授、同応用生命科学専攻分子生
命科学講座応用菌学分野の浅野行蔵助教授に、心から感謝申し上げます。
本論文の審査にあたり、副査をお引き受けし、ただき、ご校閲を賜りました生物化学分野松井博和
教授に御礼申し上げます。
本研究の遂行に当たりましては、多くの方々の援助と暖かい助言を頂きました。北海道大学大学院
農学研究科応用生命科学専攻分子生命科学講座微生物資源生態学分野須藤学元助手(現
生物遺伝資源センター)、同講座応用菌学分野曽恨輝雄助手、阿部歩技官、
千田正
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良美千代さんならびに本大前庄の人;I~ 業主及び学生祐氏に深く感謝し、たします。
最後に、本論文完成まで、静かに励まし、見守リ続けてくれた家族にも、ここで感謝します。
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田中みち子
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宮下清貴、ソフトサイエンス社、 1091
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