ブタの成長に伴う骨細胞外マトリックスの変化

北畜会報
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0:3
1
3
4，1
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9
8
ブタの成長に伴う骨細胞外マトリックスの変化
中村富美男・森
休広・海津幸子・浪崎晋二・福永重治*
北海道大学農学部畜産科学科，札幌市
*サンギ北海道研究所，小樽市
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FumioNAKAMURA，YasuhiroMORI，SachikoKAIZU，ShinjiNAMISAKIandShigeharuFUKUNAGA*
Departmento
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キーワード:骨細胞外マトリックス，カルシウム，コラーゲン，成長
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と思われる.
要 約
畜産副生物としての骨は，スープ，ゼラチン，
成長期のブタを用い，加齢に伴う無機成分を含む細
リン
酸カルシウム等の抽出素材として利用されてきたが，
胞外マトリックス (ECM) の変化を調べ，骨の発達に
近年， ECM構成成分は化粧品や細胞培養用試薬とし
果たす ECM構成成分の役割を検討した.
てだけではなく，医療への利用も計られている.骨に
骨の発達は，組成的には水分含量の減少と灰分およ
関しては，老化現象としての骨粗繋症が注目されてい
びタンパク質含量の増加によって，形態的にはハ
るが，多くの研究は骨に存在する細胞や成長因子に集
ヴアース腔の縮小によって特徴づけられた.骨タンパ
9
9
7
)，実質である ECMの骨の
中しており(杉本ら， 1
ク質の殆どを占める I型コラーゲン含量は加齢に伴い
発達や退化に伴う詳細な挙動は明らかにされていな
増加したが，
m型
， v型
，
V
I型コラーゲン，オステオ
い.骨の発達は家畜の生産生理にも重要であり，本研
ポンチンおよび、オステオネクチン含量は減少した. 1
究では，成長期のブタを用い，加齢に伴う ECMの変化
型および m
型コラーゲンは骨全体に存在していたが，
を調べ，骨の発達に果たす ECM成分の役割を検討し
本研究で調べた他の ECMタンパク質成分は管腔周辺
こ
f
部により多く存在していた.骨の発達，即ち，
1型コ
材料および方法
ラーゲンとカルシウムの蓄積には， ECMの微量成分
北海道大学農学部附属農場で飼育したランドレース
が密接に関与していることが推測された.
緒
8，6
0，9
8，1
5
4および、 1
8
2日齢で各 2
種雌ブタを 1，2
占==.
呂
頭屠殺し，採取した中足骨鍛密質を以下の実験に供試
動物体を支えなければならない骨には多量の無機質
が存在するが，骨においては無機質も ECMの一員と
した.
生化学的分析
凍結粉砕した骨粉を用いて，水分，灰分，脂肪含量
9
9
5
)
. 一方，骨タンパク質
みなされている(久保木， 1
6N塩酸によって加水分解し，ニ
の主成分はコラーゲンであり，約 90%を占めている.
を測定すると共に，
型および V型コ
コラーゲンの大部分は I型で少量の m
ンヒドリン法によりタンパク質量を， Hyp量を指標と
ラーゲンを含み (LrNSENMA
YER， 1
9
9
1
)，この他にプ
してコラーゲン量 (BERGMANandLOXLEY
，1
9
6
3
)を
，
ロテオグリカンや骨特有タンパク質と呼ばれる非コ
原子吸光法によりカルシウム量を測定した.一定量の
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)
.
ラーゲンタンパク質が存在する (
骨粉を 0.5MEDTAまたは 0.5N塩酸と共に透析膜
非コラーゲン蛋白質の多くはコラーゲンや無機質の主
に入れ，大量の同液に対して 4o
cで 7日間透析後遠心
体であるヒドロキシアパタイト或いは両者に対する親
分離 (
1
0，
0
0
0rpm， 1
0分)によって得られた上清を脱
(GRYNPASe
ta
l
.，
1
9
9
4
)，骨の石灰
灰抽出画分とし，非コラーゲン蛋白質の分析に供した
和性を有しており
化やリモデリング，即ち，発達と維持に関わっている
受理
1
9
9
8年 4月 2
7日
(GERSTENFELDe
ta
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.，1
9
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4
)
.脱灰後水洗した骨粉に，
SDS-PAGEサ ン プ ル 処 理 液 (1% SDS， 1%βM E，3.6M尿素， 1
0m MT
r
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spH6
.
8
) を添加し，
-31-
中村富美男・森休広・海津幸子・浪崎晋二・福永重治
4Cで一晩撹件後加熱処理 (
9
8C， 3分)によって得
0
0
デンシトグラムの結果， I
I
I型コラーゲンはほぼ直線的
られた画分を I型コラーゲンの分析に供した.脱灰後
8日齢以降急速に， V
I型コラー
に
， V型コラーゲンは 9
0
.
5N 酢酸で洗浄した骨粉を 1
/
5
0量 (W/W) のペプ
ゲンは 9
8日齢までに減少していた.
5Cで 2
4時間撹件処理し
シンを含む同液に懸濁し， 2
骨横断面で観察されるハヴアース腔の大きさは加齢
1
0，
0
0
0rpm， 2
0分)によって得られた
た.遠心分離 (
に伴って縮小し，管腔周辺部のエオジンによる赤染度
0
I
I型コラーゲンの，そ
上清の 0.7M NaCl塩析画分を I
も低下した(図 3A). 単位面積当たりの骨小腔の数は
の上清を V型と V
I型コラーゲンの分析に供した.各画
加齢に伴い増加したが，ハヴアース腔の数は変化しな
分は SDS-PAGE用にサンプル処理後， 3.6M尿素を
I
I型コラーゲン抗体
かった(図示せず).抗 I型および I
含む 5 %あるいは 10%ゲルによって泳動し， CBB染
による陽性反応は骨基質全体で観察されたが，
1型コ
色した.ウエスタン・プロッテイングは，電気泳動像
ラーゲンに対する染色性が加齢に伴って強くなるのに
を転写したニトロセルロース膜をブロッキング処理し
I
I型コラーゲンに対する染色性は弱く
対し(図 3B)， I
v型と V
I型コラーゲンに対する免
た後，抗 I型，抗 I
I
I型，抗 V型，抗 V
I型コラーゲン，
なった(図示せず).
抗オステオネクチン，抗オステオポンチン抗血清を第
疫染色像は類似しており，
一抗体として， PoIgを第二抗体として反応させ， DAB
び骨小腔における強い染色以外にも骨基質全体に陽性
によって発色させ，陽性バンドの吸光度をデンシト
反応が散在していたのに対し， 9
8日齢で、はハヴアース
メーターを用いて測定した.
および骨小腔とその周辺部だけが強染されていた(図
1日齢で、はハヴアースおよ
3C).オステオネクチンおよびオステオポンチンに対
間接蛍光抗体法
.
5N塩酸に 4Cで数週
細断した中足骨綴密質を 0
0
する免疫染色像は局在，加齢変化とも V型や百型コ
間浸潰し脱灰した後，凍結横断切片を調製した.上記
ラーゲンの染色像と類似していた(図 3D).
抗体を第一抗体として反応させた切片を FITC標 識
考
した第二抗体で可視化し，蛍光顕微鏡下で観察した.
察
対照のためにへマトキシリン・エオジン (HE) 染色を
骨組織の発達は，光学顕微鏡によって観察されたよ
行い，ヒッテイング、パーセンテージ法 (CHALKLEY，
うに，ハヴアース腔における骨基質の蓄積(ハヴ〉アー
1
9
4
3
)によりハヴアース腔および骨小腔数を計測した.
ス腔の縮小)と骨細胞(骨小腔)の増加によって特徴
づけられた.この形態的な加齢変化は，タンパク質お
結 果
よび灰分含量の増加という組成的な加齢変化と対応し
ブタ骨の水分含量は， u
甫乳期である 2
8日齢までは約
40%と高かったが，その後は加齢に伴って 20%以下ま
ており，骨内部も動物の成長に伴い発達することが明
らかとなった.
で減少した(図 1A). 対照的に灰分とタンパク質含量
動物の体を支える骨の物理的機能は，同心円状構造
は加齢に伴って増加し，灰分は骨重量の半分以上を占
を呈する骨単位の集積に依拠しているが，ハヴpアース
8日齢から 9
8
めるようになった.タンパク質含量は 2
腔において骨単位が形成されるためには I型コラーゲ
日齢にかけて急速に増加し，その後はほぼ一定となっ
ンとヒドロキシアパタイトが規則的に蓄積する必要が
たが，コラーゲ、ン含量は加齢に伴い直線的に増加した
ある (KRISTIC， 1
9
7
8
)
. V型および V
I型コラーゲンは
(
図 1B). カルシウム含量もコラーゲン同様， 2
8日齢
I型コラーゲンとの結合性を有し，組織特異的なコ
以降直線的に増加しており，灰分に占めるカルシウム
ラーゲンの立体配置に関与していることが知られてお
の割合とタンパク質に占めるコラーゲンの割合は，加
9
9
1
)，オステオネクチンとオス
り (LINSENMAYER， 1
齢に伴い増加した.
テオポンチンはカルシウム結合性を有し，骨における
脱灰後の骨に存在するタンパク質は SDS-PAGE像
ヒドロキシアパタイト沈着への関与が知られている
1型コラーゲンが大半を占めて
(ROACH，1
9
9
4
)
. 免疫染色像においてこれらの微量成
から明らかなように，
いた(図 2A). しかし，泳動パターンに加齢に伴う顕
分は，骨単位形成前のハヴアース腔に局在していたこ
著な変化は観察されず， 1型コラーゲンの α鎖 β鎖 γ
とから，
鎖の比率も加齢変化を示さなかった.一方，脱灰に伴っ
には，
て抽出される非コラーゲンタンパク質は，脱灰法に
ステオポンチンなどの微量成分が密接に関与している
よって SDS-PAGE像が異なり，各々で加齢に伴う変
ことが示唆された.
化が観察された(図 2B，C). ウエスタン・プロッテイ
1型コラーゲンとカルシウムの規則的な蓄積
V型や V
I型コラーゲン，オステオネクチン，オ
従って，骨の物理的機能を担っているのは骨 ECM
ングの結果， EDTA抽出画分において加齢に伴い減少
の主要成分である I型コラーゲンとカルシウムである
したバンドはオステオネクチンであり，塩酸抽出画分
が，骨の発達にとって重要なのは微量成分と考えられ
v型お
た. しかし，骨には構造糖タンパク質やプロテオグリ
I
I
I型
，
ではオステオポンチンが減少していた .
I型コラーゲン含量は何れも加齢に伴い減少した
よび V
t
カンも微量 ECM成分として存在しており (FISHERe
)
. ウエスタン・プロッテインクY
象の
(
図 2D， E， F
a
l
.，1
9
8
7
)，今後の検討が必要と考えられる.
-32-
骨の発達に伴う ECMの変化
図
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国
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カルシウム
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酬入、lhm円冶吋勾眠、て入、
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口
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宮
182
日齢
B
図 1 成長に伴う骨組成の変化
骨の一般組成(%) を(
A
)に，骨 100mg中のタンパク質，コラーゲン， カルシウム含量 (
mg) を(
B
)に示す.
std
98 182
ON
98 182
std
98 182
98 182
OP
std
98 182
98 182
図 2 骨タンパク質の SDS-PAGEおよびウエスタン・ブロッティング像
A は脱灰後の骨粉に残存するタンパク質， Bは EDTA抽出画分， Cは塩酸
抽出画分の CBB染色した電気泳動像を， D，E，Fは脱灰後ペプシン処理に
I
I型，抗 V型，抗 V
I型コラーゲン抗血清による免
より得られた画分の各々抗 I
疫染色像を示す . Aの α1，α2，β，y は I型コラーゲンの鎖名を， Bのオス
テオネクチン (ON)，Cのオステオポンチン (
Op)および D，E， Fの s
t
dは
免疫染色に際し用いた標準タンパク質を，数字は日齢を表す.
33-
中村富美男・森休広・海津幸子・浪崎晋二・福永重治
図 3 骨横断面の HEおよび間接蛍光抗体染色像
A は HE染色像を， Bは抗 I型コラーゲン， Cは抗 V
I型コラーゲン， D は抗オステオネ
クチン抗血清を第一抗体として用いた免疫染色像を示す.図中の hはハヴアース腔を，
5倍.
矢印は骨小腔を，数字は日齢を表す.倍率は 3
文
M.D.，]
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杉本到・太田博明・野津志朗 (
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) 老年性骨粗緊
症のメカニズムの解析.組織培養工学， 2
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-34-