抗体測定（メソッド編） • LCメソッド • MSメソッド •クロマトグラム •クロマト

抗体測定（メソッド編）
• LCメソッド
• MSメソッド
• クロマトグラム
• マススペクトル
• Protein Deconvolutionによるデコンボリューション
よるデ
ボ
シ
・Manual ReSpect
・Auto ReSpect （バッチ処理したい時）
1
分析条件 (LC)
Column: Zorbax 300SB-C8, 1 mm x 50 mm, 3.5 m, 300Å (Agilent)
Mobile phase A: 0.1% Formic acid
Mobile p
phase B: 1 / 1 /3 = H2O / IPA / MeCN + 0.1% formic acid
Flow rate: 0.2 mL/min
Gradient: 0 min(B5%) – 5 min(B90%) – 6.5 min(B90%) – 7 min(B5%) – 12 min(B5%)
Column Oven: 60C
UV: 215 nm (bandwith 8nm)
Sample: Intact mAb Mass Check Standard (Waters), 1 g/L, 1 L injection
2
分析条件 (MS)
・Ionization
Ion source
Sheath gas flow rate
Aux gas flow rate
Spray voltage (kV)
Capillary temp. (C)
Heater temp
temp. (C)
( C)
:
:
:
:
:
:
HESI probe
50
15
4.0
300
450
・Full Scan
Polarity
P
l i
In-source CID (eV)
Microscans
Resolution
AGC ttargett
Maximum IT (ms)
Scan range
3
:
:
:
:
:
:
:
positive
ii
35
10
17,500
5 5
5e5
60
m/z 1500-4500
クロマトグラム@Exactive plus
RT: 0.00 - 12.02 SM: 5G
NL:
4.68E5
UV_VIS_1
UV
mAb_1ug_lo
wgas_17K_6
0ms 5e5 m
0ms_5e5_m
z1500_RP01
4.19
UV 215nm
450000
400000
350000
mAb_1ug_lowgas_17K_60ms_5e5_mz1500_RP01 #330-362 RT: 4.20-4.60 AV: 33 NL: 4.97E5
T: FTMS + p ESI sid=35.00 Full ms [1500.00-4500.00]
2698.87
100
2748.84
2604.20
2800.70
95
2854.54
マススペクトル
90
85
mAU
300000
2910.47
2968.66
80
250000
2559.30
3029.22
75
2515 96
2515.96
200000
70
3092.27
150000
65
7.89
100000
60
9.09
NL:
7.41E7
TIC F: ms
MS
mAb_1ug_lo
wgas_17K_6
0ms_5e5_m
z1500_RP01
4.31
TIC
90
Relative Abundance
80
Relative Abundan
nce
0
100
3158.05
2474.00
50000
55
3226.70
50
2433.54
45
40
70
35
60
30
50
25
2394 29
2394.29
3298.36
2356.32
3373.34
2319.57
2283.86
2215.70
40
3380.74
20
0.37
3451.82
2183.18
30
15
20
10
10
5
3533.94
2151.42
3710.57
2090.92
0
0
4
1
2
3
4
5
6
Time (min)
7
8
9
10
11
12
0
1500
2064.13
1981.67
2000
3809.93
2500
3000
m/z
3500
4000
4500
マススペクトル@Exactive plus
z=55
2698.87
100
2604.20
95
2800.70
90
z=50
85
2910.47
2559.30
80
75
3029.22
2515.96
70
3092.27
Relative Abun
ndance
65
z=60
60
3158.05
2474.00
55
3226.70
50
2433.54
45
z=65
40
z=45
2394.29
2356.32
35
30
3230.28
3373.34
2319.57
25
2283.86
z=65
20
3376.97
2183.18
15
3710.57 3805.72
2120.73
10
z=40
3533 94
3533.94
2088.69
3809.93
5
0
1600
5
1800
2000
2200
2400
2600
2800
3000
m/z
3200
3400
3600
3800
4000
4200
4400
マススペクトル (拡大) @Exactive plus
mAb_1ug_lowgas_17K_60ms_5e5_mz1500_RP01 #330-362 RT: 4.20-4.60 AV: 33 NL: 4.97E5
T: FTMS + p ESI sid=35.00 Full ms [1500.00-4500.00]
2698.87
100
2748.84
95
z=55
2650.72
90
2800.70
z=54
z=56
85
2854.54
z=53
z=52
80
75
2751.85
2653.62
Relative Abun
ndance
65
2803 70
2803.70
2701 82
2701.82
70
2851.41 2857.59
2695.95
2647.86
2797.67
60
2745.83
55
50
45
40
35
30
2656.50
2754.79
2704.73
2860.76
2806.78
25
20
2658.25
15
2759.67
2706.44
2709.46
10
2808.62
2762.69
5
2862.64
2814.78
0
2640
6
2660
2680
2700
2720
2740
2760
m/z
2780
2800
2820
2840
2860
2880
2900
マススペクトル (拡大) @Exactive plus
mAb_1ug_lowgas_17K_60ms_5e5_mz1500_RP01 #330-362 RT: 4.20-4.60 AV: 33 NL: 4.97E5
T: FTMS + p ESI sid=35.00 Full ms [1500.00-4500.00]
2698.87
100
z=55
95
90
85
Hex Hex Hex
80
75
2701 82
2701.82
70
2695.95
Relative Abun
ndance
65
60
55
50
45
40
35
30
2704.73
25
20
15
2706.44
2709.46
10
2692.31
5
2712.46
0
2670
7
2675
2680
2685
2690
2695
2700
2705
m/z
2710
2715
2720
2725
2730
2735
Protein Deconvolution: Manual ReSpect
アルゴリズムの選択
データの選択
メソッドの選択
8
Protein Deconvolution: パラメーター
※ デフォルト値
※ Output
O tp t Mass Rangeの
Minだけ、140,000に変更
9
Protein Deconvolution: ピークの選択
※ 右クリックでAveragingにし、
解析するピーク範囲を選択
10
Protein Deconvolution: ピークの選択
※ 選択した範囲のスペクトルが表示されます。
11
Protein Deconvolution: ピークの選択
※ プロセスをクリックすると
デコンボリューションされます。
オリジナルスペクトル
デコンボリューション
スペクトル
データの詳細
12
結果例@Exactive plus
理論値(base peak)=148,382.5 [C6590H10134O2091N1706S52]
観測値=148,382.9, ∆0.4 Da (2.7 ppm)
G0F + G1F
G0F + G0F
Hex
G1F + G1F
G0F + G2F
Hex
G1F + G2F
Hex
Hex
e
13
Protein Deconvolution: レポート
※ レポートはPDFとして保存可能です。
14
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
アルゴリズムの選択
メソッドの選択
データの選択
15
※ デフォルトだとクロマト全てに対して、データを処理しにいきますので、解析したいピークの保持時間(RT)が解っているときは、
RTを指定した方が良いです。（次ページ）
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
※ AutoRespectだとChromatogramが見れないので、一度Manual Respectから開始します。
16
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
※ ここでRTを指定し、Methodを別名保存します。
ここでRTを指定し Methodを別名保存します
※ AutoRespectだとChromatogramが見れないので、一度Manual Respectから開始します。
17
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
※ 使用するメソッド名
※ Runをクリックすると、計算がはじまります。
18
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
※ みたいデータを指定して、Open Resultでデータが開きます
※ Queued→Completedとなると計算終了です。
19
Protein Deconvolution: Auto ReSpect （バッチ処理）
デコンボリューション
スペクトル
データの詳細
20