集 : ステロイドホルモンとP-450 アルドステロン生合成の分子機構

ロイドホルモンとP-450
アル ドステロン生合 成の分子機構
生城 真一 ・小南 思郎 ・武 森 重樹
鉱 質 コル チ コ イ ドの ア ル ドス テ ロ ンは 副 腎 球 状 層 に お い て特 異 的 に 生 合 成 さ れ る 。 低
Na,
高K食
で 飼 育 した ラ ッ トの 副 腎 では11β
ドス テ ロ ン合 成 活 性 を もつP-450が
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同 様 の 機 構 が 存 在 す る。 一 方,
位 水 酸 化 活 性 を もつP-450_<11β>以外 に ア ル
球 状 層 に 新 た に 発 現 して お り,
ウ シ副 腎 に お い ては11β
ヒ ト副 腎 に お い て も
位 水酸 化 と ア ル ドス テ ロ ン合 成
の 両 活 性 を もつP-450_<11β>が全 細胞 層 に 分 布 して い る こ とか ら, 束 ・網 状 層 に お い て は ア
ル ドステ ロ ンの 合 成 を抑 制 す る機 構 が 存 在 す る と考 え られ る。 こ の 抑 制 機 構 には ミ トコ ン
ドリア 内 膜 に共 存 す るP-450_<SCC>とP-450_<11β>の 特 異 的 な 相 互 作 用 が 関与 す る こ とが 明 ら
か に な っ た。 こ の よ うな オ ル ガ ネ ラ 膜 に お け るP-450分
子種 間 の 相 互 作 用 に よ る活 性 調
節 は ス テ ロ イ ドホ ル モ ン 生 合 成 の 代 謝 制 御 に ま った く新 しい 概 念 を提 供 す る も の で あ る。
は じめ に
図1に 示 す よ うに, デ ナ キ シ コル チ コステ ロン (以下
副 腎皮 質 は形 態 学的 に異 な る3種 類 の細 胞
層 (球状 層, 束 状 層 お よび 網 状 層) か ら構 成 され てお り,
DOCと
略 す)
か ら アル ドス テ ロンへ の変 換 は ス テ ロイ
鉱 質 コル チ コイ ドの ア ル ドス テ ロン は球 状 層 にお いて,
ド核 の11β
糖 質 コル チ コイ ドとア ン ドロ ゲ ンは束 ・網 状 層 に お い て
デ ヒ ドに酸 化 され る反 応 であ る。P-450_<11β>が11β 位 に
産 生分 泌 され る こ とが 古 くか ら知 られ て い る。 ス テ ロイ
加 え て18位
ドホ ル モン の生 合 成経 路 に お い て 鍵酵 素 と して重 要 な 役
テ ロ ンの18位
位 の 水酸 化 に 加 え て, 18位 メ チ ル基 が ア ル
の水 酸 化 も触 媒 す る こ とか ら, コル チ コス
の メチ ル基 が水 酸 化 され て18-ヒ
ドロキ
略
シ コル チ ヲス テ ロン に変 喚 され た の ち, 18-ヒ ドロ キ シ
す) が 副 腎 の 各 細胞 層 に お け る特 異 的 な 代 謝 パ タ ー ンを
ス テ ロ イ ド脱 水 素 酵 素 の作 用 で ア ル デ ヒ ド基 に酸 化 され
決 め て い る と考 え られ るが, そ の分 子 レベ ル で の 裏 付 け
る代 謝 経 路 が 想 定 され, 束 ・網状 層 細胞 は この酵 素 を 欠
は 必ず しも充 分 で は な か った 。 近 年, コ レス テ ロー ル を
くた め に アル ドステ ロ ンの合 成 が で き な い もの と考 え ら
出 発 基 質 と した ス テ ロ イ ドホ ル モン 生 合 成 経 路 に 関 与す
れ て い た 。 しか し, 小 島 ら^<3)>は
ア ル デ ヒ ド基 へ の酸 化 は
る種 々 のP-450分
い ず れ もNADPHとO_2を
割 を 果 た して い る シ トク ロムP-450
(以下P-450と
子 種 が単 離 精 製 され, そ れ らP-450
要 求す るモ ノオ キ シ ゲ ナ ー
の 酵 素 的 性 質 な らび に 遺 伝 子 的 性 質 の全 貌 が 解 明 され た
ゼ の反 応 であ る こ とを証 明 した 。 した が って, DOCか
こ とか ら, 各 細 胞 層 に お け る ステ ロイ ドホル モン の特 異
ら ア ル ドス テ ロン の生 合 成過 程 に お い て は1分 子 のO_2
的 な産 生 機 構 に つ い て 分 子 レベ ル で理 解 す る こ とが 可 能
は11β
に な って きた^<1,2)>。
しか し, 鉱 質 コル チ コ イ ドのア ル ドス
基 の二 重 水酸 化 に 消 費 され,
テ ロンが 球 状 層 細 胞 で特 異 的 に産 生 され る機 構 に つ い て
に脱 水 さ れ て ア ル デ ヒ ド基 を 生 ず る反 応 機 構 が 明 らか に
は 分 子 レベ ル で の説 明が 困 難 な現 象 であ る と考 え られ て
され た 。 しか し, これ らの 反 応 がP-450_<11β>の単 一 酵 素
き た。
に よ っ て触 媒 さ れ るか, あ るい は複 数 のP-450分
Shin-ichi
[Faculty
Ikushiro,
of
Shiro
Integrated
Kominami,
Arts
&
Sciences,
Shigeki
Hiroshima
Takemori,
University,
位 の水 酸 化 に, 2分 子 のO_2は18位
広 島 大 学 総 合 科 学 部
Higashisenda-machi,
(〒730
のメチル
1分 子 のH_2Oが
非酵素的
広 島 市 中 区東 千 田 町
Naka-ku,
Hiroshima
730,
子種
1-1-89)
Japan]Molecular Mechanism
Key【副
word
腎 皮 質 】 【ス テ ロ イ ドホ ルモ ン合 成 】 【P-450】 【ア ル ドステ ロン】
3043
22
蛋 白 質
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図1,
核 酸
酵 素
DOCか
Vol. 37
No. 16
(1992)
ら ア ル ドス テ ロ ンへ の代 謝 経 路
に よ って触 媒 さ れ るか否 か は 球 状 層 に 特 異 的 な アル ドズ
って,
テ ロン の産 生 機 構 と の関 連 か ら きわ め て 興 味 の あ る問 題
り, 後 者 のP-450は
前 者 のP-450は
ア ル ドス テ ロン合 成 酵 素^<*1>で
あ
で あ る。 この 問 題 を解 決 す るた め に, こ こ数 年 間, 国 内
るP-450_<11β>であ る。 両 者 のN末 端 か ら20残
の い くつ か の研 究 グ ル ー プ は しの ぎ を削 っ て研 究 に取 り
ノ酸 配 列 は6番
組 ん で きた 。
る以 外 は 同 じ であ っ た 。
糖 質 コル チコ イ ドの産 生 に関 与 す
目 の ア ミノ酸 残 基 が Leu
さ らに, ラ ッ ト副 腎. cDNAラ
本 稿 では ラ ッ トや ヒ トと対 比 して ウシ の 副 腎 に お け る
基のア ミ
と Val で異 な
イ ブ ラ リー を作 成 し,
アル ドステ ロン 生 合 成 の機 構 につ い て最 近 筆 者 ら^<22)>が
得
今 井 ら^<7)>は
ア ル ドス テ ロン合 成 酵 素 を コー ドしたcDNA,
た 研 究 成 果 を 中 心 に 紹 介す る。
堅 中 ら^<8)>はP-450_<11β>を
コ ー ドしたcDNAを
それ ぞれ 単
離 して 塩 基 配 列 を 決 定 した 。 ア ル ドス デ ロ ン合 成酵 素 と
I.
P-450_<11β>はい
ず れ もN末 端 に 同 じ長 さ の 延 長 ペ プ チ ド
ラ ッ トお よび ヒ ト副 腎 に お け る
を も って お り, 成 熟 型 蛋 白 質 の分 子量 は そ れ ぞれ54,273
ア ル ドス テ ロ ン合 成 機 構
(476ア
ナ トリ ウム欠 乏 食, カ リウ ム補 充 食 で飼 育 され た ラ ッ
トの 副 腎球 状 層 ミ トコン ド リアで は ア ル ドス テ ロン 合 成
ミノ酸 残 基) と54,608
(475ア
ミノ酸 残 基) で
あ る。 両 酵 素 の ア ミノ酸 配 列 は 高 い 相 同 性 を示 し, へム
結 合 領 域 を は じめP-450間
で よ く保 存 さ れ て い るい く
活 性 が 正 常 ラ ッ トに 比 較 して 著 しく上 昇 す る と と もに,
つ か の領 域 が 見 い だ され た 。 また, 両 者 のN末 端か ら6
ア ル ドス テ ロン 生 合 成 の最 終 段 階 を 触 媒 す る であ ろ うと
番 目 の ア ミノ酸 残 基 は Leu
考 え られ る49Kの
果 と よ く一 致 して い た 。 表1の 上 段 に 示す よ うに, ラ ッ
蛋 白 質 がSDS電
気泳動上で新たに
と Val で精 製 酵 素 の分 析結
出 現す る とい う報 告 が あ る^<4,5)>。
こ の結 果 に基 づ い て, 荻
トP-450_<11β>フ
ァ ミ リーの2つ
島 ら^<6)>は
同 じ条 件 下 で 飼 育 した ラ ッ ト副 腎 か ら分 子 量 の
ミ ドを構 築 し, COS細
異 な る2種 類 のP-450分
と して種 々 の生 成 物 量 を 測 定 した 結 果,
子 種 を 単 離 精 製 す る こ とに 成
のcDNAを
功 した 。 球 状 層 細 胞 の ミ トコ ン ド リアか ら単離 したP-
cDNAば
450 (49.5K)
る も の であ る こ とが 証 明 され た^<9)>。
は11β
18-ヒ ドゴ キ シ-DOC,
位 の水 酸 化 に加 え て, DOCか
ら
18-ヒ ドロキ シ コ ル チ コ ステ ロン
含 む プ ラス
胞 内 で 発 現 さ せ, DOCを
基質
これ ら2つ の
ア ル ドス テ ロン 合 成酵 素 とP-450_<11β>に
相当す
ア ル ドステ ロン合 成 酵 素 とP-450_<11β>のラ ッ ト副 腎 細
と ア ル ドステ ロン を生 成 す る反 応 を触 媒 す る の に対 して,
胞 層 で の分 布 を調 べ る こ とは, 酵 素 活 性 の分 布 との相 関
束 ・網 状 層 ミ トコン ドリア のP-450
性 を知 る うえ で重 要 で あ る。 しか し, 両 酵 素 の ア ミノ酸
の11β
位 と18位
(51.5K)
はDOC
の水 酸 化反 応 を触 媒 して コル チ コス
配 列 の相 同性 が きわ め て 高 い た め, in situ ハ イ ブ リ ッ
アル ド
ド形 成 法 あ るい は 各酵 素 を特 異的 に認 識 す る ペ プ チ ド抗
ス テ ロ ンの生 成 反 応 を 触 媒す る こ とが で き な い 。 した が
体 を 作 製 して 免 疫 組 織 化 学 的 に両 酵 素 の分 布 が調 べ られ
テ ロン と18-ヒ
ドロキ シ-DOCを
*1
研 究 グ ル ー プ に よ っ て は,
*2
Parker
3044
生 成 す る が,
P-450_<11β,aldo>, P-450_<aldo>あ
る い はP-450_<C18>な
ら^<35)>は
マ ウ ス副 腎 に つ い て ま っ た く同 じ結 果 を 得 て い る。
どの 略号 が使 用 され て い る 。
23
アル ドステロ ン生合成 の分子機構
表1.
a)
2種 のP-450cDNAを
b)
文 献9,
文 献14よ
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表2.
含 む プ ラ ス ミ ドを 用 い てCOS細
り抜 粋 。(岡 本 氏 (阪 大)
胞 で 発 現 させ たP-450のDOC代
と静 岡 氏 (高 知 医 大)
の ご厚 意 に よる)
ウ シ副 腎 細 胞 層 の無 傷 お よ び可 溶 化 ミ トコン ド リア 標 品 に お け るDOC代
た^<10,34)>。P-450_<11β>は
束 ・
網 状 層 に分 布 して い る が, アル
ドス デ ロ ン合 成 酵 素 は 球 状 層 に のみ 分 布 してい た^<*2>。
こ
謝活性
物 の抗 体 は後 者 のP-450と
謝 活 性^<18)>
のみ 反 応 した 。
河 本 ら^<13-15)>は
ヒー
ト副 腎 のP-450_<11β>とア ル ドス テ ロン
の こ とは ウ ッ ト副 腎 で の球 状 層 に特 異 的 な ア ル ドステ ロ
合 成酵 素 に 相 当す るP-450分
シの産 生 機 構 を よ く説 明す る こ とが で き る。
グを試 み るた め に, 原 発 性 アル ドス テ ロン症 患 者 の ヒ ト
ヒ ト副 腎に 関 して, Mornet
た2種 類 の 遺 伝 子 (CYP11B1,
ら^<11)>はP-450_<11β>に
関連 し
副 腎 腫 瘍 か らcDNAラ
子種 のcDNAク
ロー ニン
イ ブ ラ リー を作 成 して2種 類 の
CYP11B2)
が 存 在す る
cDNAク
こ とを 報 告 した 。CYP11B1はP-450_<11β>遺
伝子に相当
した 。 これ ら に コ ー ドされ て い る ア ミ ノ酸 配 列 の 相 同 性
した が, CYP11B2の
実 体 に つ い て は不 明 で あ った 。 荻
ローン を単 離 し, そ れ ぞ れ の塩 基 配 列 を 決 定
は90%と
非 常 に構 造 が 似 て い る 。 これ らcDNAを
島 ら^<12)>は
原 発 性 アル ドス テ ロン症 患者 か ら摘 出 した 副 腎
ラス ミ ドに構 築 してCOS細
プ
胞 で発 現 させ酵 素 活 性 を 測
の非 腺 が ん 部 分 か ら調 製 した ミ トコ ン ド リア は ア ル ドス
定 した ところ, 発 現 させ た2つ のP-450間
テロン 合 成 活 性 を 示 さ な い が, 腺 が ん 部 分 か ら調 製 した
に基 質 特 異 性 に差 が あ り, 片 方 のP-450に
ミ トコ ン ドリアは ア ル ドス テロ ン合 成 活 性 を もつ こ とを
ステ ロン合 成 活 性 が 見 い だ さ れ た (表1の
見 いだ した。 さ ら に, ウ シP-450_<11β>IgGを 用 い たSDS
これ ら両 者 の遺 伝 子 プ ロモ ー タ ー 領 域 には48%し
電 気 泳 動 上 の免 疫ブ ロ ッテ ィン グ で, 前 者 の ミ トコ ン ド
同性 が な く, ま った く別 個 の 遺伝 子 と して異 な る発 現 制
リア は1本 のP-450_<11β>
(50K) バン
御 を受 け て い る こ と も明 らか に な らた^<15)>。
ドだ け を もつ のに 対
に は 明 らか
のみ アル ド
下段)。 ま た,
か相
して, 後 者 の ミ トコ ン ドリナはP-450_<11β>の近 傍 に も う
1本 のバン ド (48.5K)
CYP11B2遺
を もつ こ とが 観 察 さ れ, か つ
II.
伝 子 産 物 の抗 体 と反 応 した 。 こ の よ うに後
ウ シ 副 腎 に お け るブ ル ドス テ ロ ン
合成機構
者の蛋 白質 が ア ル ドステ ロン合 成 酵 素 であ る可 能 性 が強
く示 唆 され た の で, ア ル ドステ ロン産 生 腺 が ん の副 腎 を
用 い てDOCめ11β
P-450_<11β>
(50K)
位 お よび18位
とDOCの11β
水 酸 化 を触 媒 す る
位 と18位
の水 酸 化
1.
ウ シ 副 腎 の 球 状 層 細 胞 に 特 異 的 な ア ル ドス テ ロ ン
の産生
ウ シ副 腎 皮 質 の 球 状 層 お よび 束 ・網 状 層 の各 細 胞 か ら
とア ル ドス テ ロン合 成 を触 媒 す る ア ル ドス テ ロ ン合 成 酵
調製 した 無 傷 ミ トコ ン ドリア に, DOCと
素 (48.5K)
る リン ゴ酸 を 加 え て反 応 を 行 な う と, 表2に 示 され る よ
が 単離 精 製 さ れ た 。CYP11B2の
遺伝子産
呼吸基 質であ
3045
24
蛋 白 質
うに, コル チ コス テ ロン と18-ヒ
核 酸
酵 素
ドロキ シDOCの
Vol. 37
No. 16
(1992)
生成
活 性 は 両 細 胞 層 であ ま り違 いが み られ な い の に対 して,
18-ヒ ドロキ シ コ ルチ コ ステ ロン とア ル ドステ ロン の 生
成 活 性 は 球 状 層 で 高 い値 を 示 して い る。 と くに ア ル ドス
テ ロン の 生 成 活 性 は 束 ・網 状 層 に 比 べ て 球 状 層 ミ トコ ン
ドリア で約8倍
高 い値 を示 して い る。各 々 ミ トコ ン ドリ
ア を コー ル酸 で 可 溶 化 して, ア ド レノ ドキ シ ン, NAD
PH-ア
ドレ ノ ドキ シ ン還 元 酵 素 とNADPHを
加えて反
応 を 行 な う と. 無 傷 ミ トコ ン ド リア で は アル ドス テ ロン
の合 成 が み られ な か った 束 ・網 状 層 に お い て, 球 状 層 と
図2.
P-450_<11β>-プロ テ オ リ ポ ソ ー ム の デ オ キ シ コ ル チ ゾ ル
同 じ程 度 の ア ル ドス テ ロン合 成 活 性 を 示 し た^<16∼18)>。
一
方,
ウ シ副 腎 ミ トコン ド リア か ら単離 精 製 され た 分 子 量
11β
位 水 酸 化 活 性 に 対 す るP450_<SCC>の
P-450_<11β>-プロ テ オ リポ ソ ー ム
行 な っ たP-450_<SCC>
の異 な る2種 のP-450_<11β>(48.5Kと49.5K)
も11β
はいずれ
位 水酸 化 活 性 に 加 え て ア ル ドス テ ロン 合 成 活 性
し た あ と,
(20pmol)
を37℃,
活 性 を 測 定 した 。1 :
3 :熱 処 理
5 : FITC処
(60℃,
5分)
(20pmol)
2分
無 添 加,
P-450_<SCC>,
影 響^<22)>
と さ ま ざ ま な処 理 を
間 イ ンキ ュベ ー ト
2 : 未 処 理P-450_<SCC>,
4 : 抗 体 処 理P-450_<SCC>,
理 し たP-450_<SCC>。
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を も っ て お り, 副 腎 のす べ て の 細胞 層 に 分 布 して い る こ
とが 報 告 され て い る^<19)>。
さ ら に, ウ シ副 腎 のcDNAラ
イ ブ ラ リーか ら単 離 した2種 類 のP-450_<11β>cDNA
P-450_<11β>-2,
pc-P-450_<11β>-3)をそ れ ぞ れCOS細
値 (7分-1)
(pc-
胞 で発
を示 して い る。P-450_<11β>にP-450_<SCC>を等
モ ル加 え て 活 性 を測 定 す る と, P-450_<11β>の11β位 水酸
化 活 性 は約6倍
(40分^<-1>)に上 昇 した 。 このP-450_<SCC>
現 させ 活 性 を測 定 した と ころ, いず れ もア ル ドス テ ロ ン
を 熱 処 理 やP-450_<SCC>抗 体 で処 理 した 標 品 を加 え て も活
合成 活 性 を示 す こ とが 見 い だ さ れ た^<20,21)>。
以 上 の結 果 か
性 に対 す る促 進 効 果 はみ られ ず,
ら, ウ シ副 腎 にお い て は ラ ッ トや ヒ トの 場 合 と異 な り,
450_<SCC>中に混 入 して い る脂 質 や 他 の蛋 白質 成 分 に よ る
P-450_<11β>分
子 が11β
も の では な い こ とが 示 され た 。P-450_<SCC>を フ ル オ レ セ
位 水酸 化 活 性 に 加 え て アル ドス テ
こ の効 果 が 精 製P-
ロン合 成 活 性 を 潜在 的 に も って お り, 球 状 層 で は ア ル ド
ン イ ソチ ナ シ ア ネ ー ト (FITC)
ステ ロン合 成 活 性 を発 現 して い る の に対 して, 束 ・網 状
番 目の Lys
層 の ミ トコン ドリア で は ア ル ドス テ ロン合 成 活 性 が何 ら
互 作 用 が 妨 げ られ て, P-450_<SCC>は電 子 授 受 能 を消 失 す
か の抑 制 を受 け て い る こ とが 強 く示 唆 され た 。
残 基 が 修 飾 され,
る^<23)>。
しか し, FITCで
で化 学 修 飾 す る と, 348
ア ドレノ ドキ シン との相
修 飾 され たP-450_<SCC>は 未 処 理
のP-450_<SCC>と 同 じ程 度 の 促進 効 果 を示 した 。P-450_<SCC>
2.
ウ シ副 腎 ミ トコ ン ドリア のP-450_<11β>の活 性 調 節
の 基 質 で あ る20α-ヒ
ドロキ シ コ レス テ ロ ール や 阻 害 剤
の ア ミノ グル タ チ ミ ドを 加 え て も, 11β 位 水 酸 化 反 応 に
に対 す るP-450_<SCC>の 役 割
副 腎 ミ トコン ドリア に はP-450_<11β>以外 にP-450_<SCC>
おけ るP-450_<SCC>の 促 進 効 果 は影 響 され な い。P-450_<SCC>
が 局 在 して お り, ス テ ロイ ドホ ル モン 生合 成 の初 発 段 階
のか わ りに シ トク ロ ムb_5やNADPH-P-450還
であ る コ レス テ ロ ー ル側 鎖 切 断 反 応 を触 媒 して い る。P-
の よ うな ミク ロ ソー ム蛋 白 質 も ま った く促 進 効 果 を 示 さ
450_<SCO>は ミ トコ ン ド リア膜 内 で電 子伝 達系 (ア ド レ ノ
な い こ とか ら, P-450_<SCC>のP-450_<11β>に
対 す る活 性 の促
ドキ シン, NADPH-ア
ドレ ノ ドキ シ ン還 元酵 素) をP-
450_<11β>と
共有 して い る こ とか ら, 蛋 白質間 の相 互 作 用 で
お 互 いの 活 性 に 影 響 を与 え る可 能 性 が考 え られ る。
A.
P-450_<11β>プ
ロテ オ リポ ソー ム 反 応 系 に お け る
P-450_<SCC>の活 性 に 与 え る 影 響
進 効 果 は ミ トコ ン ド リアP-450分
元酵 素
子種間に特異的な反
応 で あ る こ とが示 さ れ た 。
リポ ソー ム膜 上 で のP-450分
子 種 間 の 相 互 作 用 がP-
450_<11β>の
活 性 に 影 響 を 与 え る こ とを 明 らか に す る た め
に, DOCを
基 質 と して代 謝 させ た場 合 のP-450_<11β>の
活
ウ シ副 腎 ミ トコ ン ドリアか ら精 製 したP-450_<11β>を リ
性 に対 す るP-450_<SCC>の 濃 度 依 存 性 が 調 べ られ た 。図3
ン脂 質 膜 に 組 み 込 んだ プ ロテ オ リポ ソー ム反 応^<36)>系
を用
に示 す よ うにP-450_<SCC>の 添 加 に 伴 い, 11β 位 と18位
い て11β
す る精製P-450_<SCC>の 影 響 が解 析 され た^<22)>。
図2に 示 す
水 酸 化 活 性 値 は 上 昇 し, 最 大値 へ 収 束す る (図3a, b)。
一 方 , DOCか
らア ル ドス テ ロン と18-ヒ ドロキ シ コル
よ うに, リポ ソー ム膜 に 組 み 込 まれ たP-450_<11β>の デ オ
チ コス テ ロ ンの生 成 活 性 はP-450_<SCC>の 添 加 に よ り著 し
キ シ コル チ ゾル を 基 質 と した11β
く減 少 し, 最 小値 へ収 束 す るこ とが観 察 され る (図3c,
3046
位 水酸 化 とア ル ドス テ ロン 合 成 の 両 活 性 に 対
位 水 酸 化 活 性 は低 い
25
アル ドステ ロン生合成の分子機構
図4.
ウ シ副 腎 球 状 層 (zG) と, 束 ・綱 状 層 (zFR)
の
ミ トコ ン ド リア内 膜 で のDOCの
代 謝 活 性 に 対す る
抗P-450_<SCC>IgGの
図3.
P-450_<11β>-プロ テ オ リポ ソ ー ム のDOC代
す るP-450_<SCC>の
濃 度 依 存 性^<22)>
P-450_<11β>-プ ロ テ オ リ ポ ソ ー ム
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キ ュ ベ ー ト し た の ち,
μM)
(20pmol)
とP-450_<SCC>を
合 体 を 形 成 し たP-450_<11β>の
(V_f=14.9, V_c=176.7),
OHコ
(c)
イン
活 性 を 測 定 した 。 実 線 は 解 離 定 数
を 用 い て 計 算 し た 理 論 曲 線 。 次 のV_fとV_cは
14.0),
活 性 値 。(a)
(b)
コル チ コ ス テ ロ ン
18-OHDOC
(V_f=0.9, V_c=
(d)
18-
(V_v=2.81, V_c=0.33)。
す る抗 体 を用 い てP-450_<11β>の活 性 に 与 え る 膜 に 内在 し
てい るP-450_<SCC>の 影 響 が解 析 され た^<22)>。
図4は
ら コ ルチ コ ス テ ロン
位 水酸 化 活 性 に お い て は 球 状 層 に比 べ
て束 ・網 状 層 の ほ うが抗 体 に よ る阻害 効 果 が 大 き い。 一
方, ア ル ドス テ ロン生 成 活 性 は 抗 体 を 添 加 す る こ とに よ
り束 ・網 状 層 で4倍 の 促 進 効 果 が 見 られ るが, 球 状 層 で
酵 素 活 性=[P-450_<11β>]×V_f+[P-450_<11β>・P450_<SCC>]
は1.7倍
×V_c
[P-450_<11β>] お よ び
ミ トコ
謝 活 性 に 対 す る 抗P-450_<SCC>
影 響 を示 して い る。DOCか
を生 成す る11β
最大値 あ るい は 最 小値 を 示す と仮 定
す る と, 観 察 さ れ る 活 性 値 は 次 式 で 表 わ さ れ る 。
ここで
10時 間 イ ン
胞 層 よ り ミ トコ ン ドリア 内膜 を 調 製 し, P-450_<SCC>に 対
ン ドリア 内膜 のDOC代
リポ ソ ー ム 膜 上 でP-450_<SCC>とP-450_<11β>が1対1
の 複 合 体 を 形 成 し,
を0.5mg抗P-450_<SCC>IgG
非 共 存 下 (無 地) あ る い は 共 存 下 (斜 線) で0℃,
キ ュベ ー した の ち, 活 性 を 測 定 した 。
IgGの
d)。
影 響^<22)>
(0.1mg)
(300
遊 離 型 と複
ア ル ドス テ ロ ン (V_f=1.19, V_c=0.16),
ル チ コス テ ロ ン
ミ トコン ド リア 内 膜
謝 に 対
[P-450_<11β>・P-450_<SC>] は そ
の促 進 効 果 に と ど ま って い る。 また, 球 状 層 ミ
ト コン ドリア に精 製P-450_<SCC>を 添 加 す る と, 11β 位 水
リポ
酸 化 活 性 の上 昇 と と もに ア ル ドス テ ロ ン生 成 活 性 は ほ と
ソ ー ム 膜 上 で の 濃 度 を 表 わ し, V_fはP-450_<SCC>無
添加
ん ど見 られ な くな った 。 した が って, 球 状 層 で は ミ トコ
の と き のP-450_<11β>の
複合
ン ド リア 膜 に 内在 し てい るP-450_<SCC>とP-450_<11β>分 子
各濃度 にお
間 の相 互 作 用 が 弱 い の に 対 し て, 束 ・網 状 層 で は 強 く働
れ ぞ れ 遊 離 型 お よ び 複合 体 を 形 成 し たP-450_<11β>の
活 性 値, V_cはP-450_<SCC>と
体 を 形 成 し た と き の 活 性 値 を 表 わ す 。 図3の
け る 測 定 値 か ら 上 の 式 を 用 い てP-450_<11β>とP-450_<SCC>
い て い るた め に ア ル ドス テ ロ ン生 成 活 性 が 抑 制 され て い
の 解 離 定 数 は300μMの
る と考 え られ る。
値 が 得 られ た 。 こ の 値 を 用 い て
作 成 し た 理 論 曲 線 は 測 定 値 と よ く一 致 し て い る 。 し た が
っ て,
リポ ソ ー ム 膜 上 でP-450_<11β>とP-450_<SCC>は1対
ミ トコ ン ド リア のP-450分
子 種 間 で の相 互 作用 の 強
さ の違 い を 球 状 層 と束 ・網 状 層 の ミ トコン ドリア 内 膜 に
そ の ス テ ロ イ ド代 謝
つ い て調 べ るた め に, 分 子 内 に ジ ス ル フ ィ ド結 合 を もつ
活 性 が 著 し く影 響 を 受 け, 11β 位 の 水 酸 化 反 応 が 促 進 さ
光反 応 性2価 ヘ テ ロ架 橋 試 薬^<24)>を
用 い て蛋 白 質間 の架 橋
れ る の に 対 し て,
反 応 に よ る複 合 体 の形 成 が解 析 され た 。 図5に 示 され る
1の 複 合 体 を 形 成 す る こ と に よ り,
ア ル ドス テ ロ ン合 成 活 性 は 抑 制 さ れ る
よ うに 架 橋 処 理 を施 さ な い標 品 (レ ーン2)
と考 え られ る。
B.
ミ ト コ ン ド リ ア 内 膜 に お け るP-450_<SCC>と
い 。 架 橋 処 理 を 施 した標 品 (レ ー ン3)
P-450_<11β>間 の 相 互 作 用
リポ ソ ー ム 反 応 系 に お い てP-450_<SCC>がP-450_<11β>の
に 関 して, 束 ・
網
状 層 で はP-450_<SCC>よ りもや や 低分 子 量 付 近 に バン ドが
ミ ト コン ド リ ア 膜 内 で
観 察 され, 他 のバ ン ドに比 べ て そ の 染 色 が 強 い こ とか ら
活 性 を 調 節 す る因 子 と し て 働
特 異 的 に架 橋 され て い る よ うに 思 わ れ る。 一 方, 球 状 層
活 性 に 影 響 を 与 え る こ とか ら,
P-450_<SCC>がP-450_<11β>の
では両細胞
層 ミ トコ ン ドリアにP-450_<SCC>の バン ドしか 観 察 され な
い て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で,
ウ シ副 腎 の各 細
にお い て は それ に 相 当す る もの は 観 察 され な い 。 図5b
3047
26
蛋
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図5.
白 質
核 酸
酵 素
Vol. 37
No. 16
(1992)
ミ トコ ン ドリア 内膜 に お け るP-450_<SCC>と の 架 橋 蛋 白 質 の 電 気 泳 動 に よ る解 析
架 橋 処 理 を 行 な った ミ トコ ン ドリア内 膜 (zG : 球 状 層, zFR : 束 ・網 状 層) か らP-450_<SCC>IgGを
結 合 さ せ た カ ラ ムに よ り遊 離 のP-450_<SCC>と 複 合 体 形 成 したP-450_<SCC>を 単 離 精 製 し, 架 橋 試 薬 分 子 内
の ジ ス ル フ ィ ド結 合 を 切 断 した の ち に 電 気 泳 動 を 行 な った (A : 銀 染 色, B : 免 疫 染 色)。 レーン1 :
未 処 理 ミ トコ ン ドリア 内 膜 画 分,
画 分, レー ン3
レ ー ン2
: 未 処 理 ミ トコ ン ド リア内 膜 か ら抗 体 カ ラ ムに よ り精 製 した
: 架 橋 処 理 ミ トコ ン ドリア 内 膜 か ら抗 体 カ ラ ムに よ り精 製 した 。画 分 矢 印 上 : P-450_<SCC>,
矢 印 下 : P-450_<11β>。
の レー ン3で わ か る よ うに架 橋 処 理 を行 な った 束 ・網 状
子 レベ ル の発 現 調 節 を受 け て い る。 また,
層 ミ トコ ン ドリア で 見 られ た 低 分 子 量 の バン
も 同様 な ア ル ドス テ ロン合 成 酵 素 が存 在 す る こ とが酵 素
ドはP-
ヒ トにお い て
450_<11β>で
あ る こ とを 示 して い る。両 層 にお い てP-450_<SCC>
レベ ル お よび遺 伝 子 レベ ル で証 明 され て い る。 した が っ
の バン ドは ほ ぼ 同 じ ぐ らい の強 さ に染 色 され て い るが,
て, これ ら動 物 種 に お い ては 球 状 層 のみ に発 現 して い る
P-450_<11β>は
明 らか に束 ・網 状 層 の ほ うが 強 く 染 色 さ れ
ア ル ドス テ ロン合 成 酵 素 が ア ル ドス テ ロン の層 特 異 的 な
て い る。 架 橋 実 験 に用 い た ミ トコン ドリア 内膜 小 胞 にお
産 生 を決 め て い る こ とは 明 らか であ る^<25,26)>。
これ ら の動
け るP-450の
物 に対 して ウシや ブ タ の副 腎 にお い て は, そ の よ うな2
配 向 性 を調 べ る と, 両 層 と もに90%以
上
が 外 側 に 存 在 して お り, 架 橋 反 応 の違 いが 内 膜 小 胞 の反
種 類 のP-450分
転 に 基 因 す る も の では な い と考 え られ る。 こ の よ うに両
的 に ア ル ドス テ ロ ン産 生 能 を有 す るP-450_<11β>の活 性 調
子 種 は い ま だ 確 認 され てお らず, 潜 在
細 胞 層 の ミ トコ ン ドリア 内膜 に お い てP-450_<SCC>とP-
節 に よ りア ル ドス テ ロ ンの層 特 異 的 な産 生 が起 こ っ て い
450_<11β>分
子 間 で架 橋 反 応 に違 い を生 ず る こ とは, P-450
る こ とが考 え られ る^<27∼30)>。
ウシ副 腎 で は リポ ソー ム反 応
分 子 種 間 で の相 互 作 用 の程 度 が両 細 胞 層 間 で異 な って い
系 を用 い た 解 析結 果か ら, P-450_<11β>がP-450_<SCC>と
複合
る こ とを 示す ひ とつ の証 拠 に な り うる。
体 を形 成 す るこ とに よ り, そ の代 謝 活 性 が著 し く影 響 を
受 け る こ とが 明 らか に な った 。 さ ら に, ミ トコン ドリア
III.
内膜 を用 いたP-450_<SCC>に 対 す る抗 体 阻 害 お よび 架 橋 反
活性調節モデル
応 の実 験 か ら, 副 腎細 胞 層 に お い て ミ トコ ン ド リアP鉱 質 コ ル チ コイ ドで あ る ア ル ドス テ ロン は, 副 腎球 状
層 ミ トコ ン ド リア で のみ 特 異 的 に産 生 され る こ とが さ ま
450分
子種 間 で の 相互 作 用 に よ りP-450_<11β>のス テ ロイ
ド代謝 活 性 が 調節 を 受 け て い る可 能 性 が示 唆 され た。
ざ まな 動 物 種 に お い て 明 らか に され て き た。 ラ ッ トで は
以 上 の結 果 か ら, ウ シ副 腎 にお け るP-450_<11β>に よる
球 状 層 で特 異 的 に発 現 した ア ル ドス テ ロ ン合 成 を触 媒 す
ア ル ドス テ ロ ンの 層特 異 的 な活 性 調 節 の機 構 につ い て は
るP-450が
子種
次 の よ うな解 釈 が可 能 であ る。 図6に 示 す よ うに, 球 状
の水 酸 化 の
層 の ミ トコ ン ドリア 内膜 で はP-450_<11β>はP-450_<SCC>と
単 離 精 製 さ れ た 。 この新 しいP-450分
のア ミノ酸 配 列 はDOCの11β
位 と18位
み を 触 媒 す るP-450_<11β>の構 造 と類 似 して い るが,
明ら
か に 異 な る遺 伝 子 産 物 であ り, P-450_<11β>と
は 異 な る遺 伝
3048
相互 作用 が 弱 い た め, ア ル ドス テ ロン生 成 反 応 を触 媒 で
き る状 態 で機 能 して い る。一 方, 束 ・網 状 層 のP-450_<11β>
アル ドステ ロン生合成 の分子機 構
27
研 究 か ら脂 質膜 上 で のP-450分
子 種 間 の相 互 作 用 が ア
ル ドス テ ロン合 成 に 著 しい 影 響 を 与 え る こ とが 明 らか に
な った こ とか ら, こ の膜 蛋 白 質間 の 相 互 作 用 に よ る活 性
の調 節が細 胞 外 ジ グナル によ るアル ドス テ ロン分 泌 の短
期 的促進 に関 与 レて い う可 能 性のひと つ と して 考 え られ
る。 今 後, 培 養 細 胞 系 を 用 い た 実 験 に よ りアン ギ オ テ ン
シンIIに よ る ア ル ドス テ ロ ン合 成 の 促 進 と ミ ト コン ドリ
ア膜 にお け るP-450分
図6.
ウ シ副 腎 細 胞 層 に お け るP-450分
DOC代
謝 活性
子 種 間 で の相 互 作 用 との関 連 性
を調 べ る こ とに よっ て, ウ シ副 腎 で の ア ンギ オ テ ン シン
子種の動態 と
IIの短 期 効 果 の作 用 機 序 に お け る ブ ラッ グ ボ ッ クス が分
子 レベ ル で解 明 で き る こ とを 期 待 した い 。
はP-450_<SCC>と 複合 体 を形 成 して い る た め ア ル ドス テロ
ン 生 成 反 応 が 抑 制 され, 糖 質 コル チ コイ ドを産 生 で き る
文
献
状 態 で機 能 して い る と考 え られ る。 こ の よ うに球 状 層 ミ
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トコ ン ド リア で は, P-450_<11β>の
基 質 であ るDOCは
図1
1)
に 示 した3段 階 の 水酸 化 を連 続 的 に受 け て ア ル ドス テ ロ
ンに 変 換 さ れ るの に対 して, 束 ・網 状 層 ミ トコ ン ドリア
で はDOCの
2)
大 部分 が コル チ コス テ ロン に変 換 され て ア
ル ドス テ ロン生 成 は卸 制 を受 け て い る。 こ の よ うに ミ ト
コ ン ド リア 膜 上 で のP-450分
子 種 間 の 相互 作 用 に よ り
3)
P-450_<11β>の
代 謝 活 性 が 層 特 異 的 に 調 節 され て い る 可 能
性 が あ る。 この よ うな 脂 質膜 上 で の 異 な るP-450分
子
種 間 の相 互 作 用 に よ り, そ の酵 素 活 性 自身 が 制 御 を受 け
る とい う現 象 はP-450の
新 しい 活 性調 節 機 構 と して 注
4)
5)
目に 値 す る。
6)
7)
おわ りに
副 腎 球 状 層 で の ア ル ドス テ ロン の産 生 分 泌
は さ ま ざ まな 因 子 に よ り調 節 を受 け る こ とが 知 られ て い
8)
る。 柴 田 ら^<13)>,
今 井 ら^<32)>は
ラ ッ ト副 腎 に お け る アル ドス
テ ロン合 成 酵 素 の発 現 量が アン ギ オ テン シンIIや カ リウ
ム に よ り長 時 間 に影 響 を 受 け る こ とを 免 疫 プ ロ ッ ト法 と
mRNAの
定 量 か ら解 析 して い る。 これ ら の因 子 に よ る
9)
10)
ア ル ドス テ ロ ン合 成 促 進 の 長 期 的 効 果 は 明 らか に ア ル ド
ス テ ロン合 成 酵 素 の遺 伝 子 レベ ル で の 発現 調 節 に 関 係 し
た 現 象 と して理 解 で き る。 これ に 対 して, 培 養 細 胞 系 の
実 験 よ りア ンギ オテン シ ンIIが 球 状 層 細 胞 のア ノ
ヒドス テ
ロン分 泌 を10∼20分
11)
12)
の短 時 間 に 著 し く促 進 す る こ とが
知 られ て い る。 小 島 ら^<33)>の
研 究 に よれば,
アン ギ オ テ ン
13)
シ ンIIが 球 状 層 細 胞 表 面 の レセ プタ ー に 結 合 し, 細 胞 内
セ カン ドメ ッセ ン ジ ャ ー と して の カル シ ウ ム濃度 が 変 動
す る こ とが 示 され て い るが, どの よ うな 機 構 に よ り細 胞
内 で の アル ドス テ ロ ン合 成 が 短 時 間 で 促 進 され るか は 依
然 未 解 決 の問 題 と して 残 され た ま まで あ る。 ウ シ副 腎 の
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