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QIAamp® UCP Pathogen Mini
プロトコールとトラブルシューティング
全血、スワブ、培養液、体液からの微生物 DNA 精製
Sample & Assay Technologies
目次
プロトコール
400 µl の全血からの病原体 DNA の前処理
（機械的な前溶解処理プロトコール）
400 µl の全血からの病原体 DNA の前処理（前溶解処理なしプロトコール）
3
5
体液あるいは培養液からの微生物 DNA の前処理
（機械的な前溶解処理プロトコール） 6
（バクテリア 2 x 109、酵母 5 x 107 まで）
体液あるいは培養液からの微生物 DNA の前処理
（バクテリア 2 x 109 あるいは酵母 5 x 107 まで）
（前溶解処理なしプロトコール）
8
眼、鼻、咽頭やその他のスワブからの微生物 DNA の前処理
（機械的な前溶解処理プロトコール）
9
眼、鼻、咽頭やその他のスワブからの微生物 DNA の前処理
（前溶解処理なしプロトコール）
11
病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）
12
病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）
14
トラブルシューティング
2
16
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
プロトコール：400 µl の全血からの病原体 DNA の前
処理（機械的な前溶解処理プロトコール）
本プロトコールでは、全血から病原体 DNA を精製するために Pathogen Lysis Tube
を用いて機械的溶解を前もって行ないます。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（12、14 ページ）で使用する
ために、ウォーターバスまたはヒートブロックを 56℃に加熱してください。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱します。
■■ “プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）”のステッ
プ 12、
“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
■■ 使用前に、100 µl の Reagent DX を 15 ml の Buffer ATL に添加します。少量が
必要な場合は、1.5 ml の Buffer ATL を滅菌済みの 2 ml 容器に入れてから 10 µl
の Reagent DX を添加します。Reagent DX を添加後、よく混和します。調製し
た溶液は室温（15 ∼ 25℃）で 6 ヶ月安定です。
操作手順
1.
100 µl の Buffer ATL（Reagent DX 含有）を新しい Pathogen Lysis Tube に添加する。
血液中のバクテリアおよび真菌の溶解には Pathogen Lysis Tubes（L）を推奨し
ます。
2.
400 µl の血液を添加し、10 秒間ボルテックスする。
3.
Pathogen Lysis Tube を Microtube Foam Insert にセットし、最高スピードで 10
分間ボルテックスする。
代替方法：Pathogen Lysis Tube を TissueLyser LT にセットして 50 Hz で 10 分
間破砕するか、あるいは FastPrep-24 instrument を使用して、6.5 m/s の速度
で 45 秒間の振蘯を 5 分間のインターバルをおいて 2 回行なってください。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
3
4.
ボルテックス終了後 Pathogen Lysis Tube を取り出し、蓋内側の液滴を回収する
ために 8,000 x g で 5 秒間チューブを遠心操作する。
5.
ステップ 4 の上清 400 µl を新しい 2 ml のマイクロ遠心チューブに入れる。
6.
4
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
プロトコール：400 µl の全血からの病原体 DNA の前
処理（前溶解処理なしプロトコール）
本プロトコールは全血からの病原体 DNA の精製用です。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（12、14 ページ）で使用する
ために、ウォーターバスまたはヒートブロックを 56℃に加熱してください。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱しておきます。
■■ “プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）”のステッ
プ 12、
“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
操作手順
1.
2.
400 µl の血液を新しい 2 ml チューブに入れる。
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
5
プロトコール：体液あるいは培養液からの微生物
DNA の前処理（バクテリア 2 x 109、酵母 5 x 107 まで）
（機械的な前溶解処理プロトコール）
本プロトコールでは、体液あるいは培養液（バクテリア 2 x 109 、酵母 5 x 107 まで）
から微生物 DNA を精製するために、Pathogen Lysis Tube を用いて機械的溶解を前
もって行ないます。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（12、14 ページ）で使用する
ために、ウォーターバスまたはヒートブロックを 56℃に加熱してください。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱しておきます。
■■ “プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）”のステッ
プ 12、
“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
■■
使用前に、100 µl の Reagent DX を 15 ml の Buffer ATL に添加します。少量が
必要な場合は、1.5 ml の Buffer ATL を滅菌済みの 2 ml 容器に入れてから 10 µl
の Reagent DX を添加します。Reagent DX を添加後、よく混和します。調製し
た溶液は室温（15 ∼ 25℃）で 6 ヶ月安定です。
操作手順
1.
1.5 ml までの体液あるいは培養液を Pathogen Lysis tube に入れて最高速度で
5 分間遠心操作する（>14,000 x g）。
2.
上清を除去し棄てる。必要ならば、ステップ 1 および 2 を繰り返す。
ピペットを用いて上清を慎重に取り除きます。ガラスビーズを一緒に除去しな
いように気をつけます。
3.
6
500 µl の Buffer ATL（Reagent DX 含有）を添加し、ペレットを再懸濁する。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
4.
Pathogen Lysis Tube を Microtube Foam Insert にセットし、最高スピードで 10
分間ボルテックスする。
代替方法：Pathogen Lysis Tube を TissueLyser LT にセットして 50 Hz で 10 分
間破砕するか、あるいは FastPrep-24 instrument を使用して、6.5 m/s の速度
で 45 秒間の振蘯を 5 分間のインターバルをおいて 2 回行なってください。
5.
ボルテックス終了後 Pathogen Lysis Tube を取り出し、蓋内側の液滴を回収す
るために 8,000 x g で 5 秒間チューブを遠心操作する。
6.
Pathogen Lysis Tube から上清 400 µl を新しい 2 ml のマイクロ遠心チューブに
入れる。ガラスビーズを上清と一緒に取り出さないように気をつける。
7.
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
7
プロトコール：体液あるいは培養液からの微生物
DNA の前処理（バクテリア 2 x 109 あるいは酵母 5 x
（前溶解処理なしプロトコール）
107 まで）
本プロトコールは、体液あるいは培養液（バクテリア細胞 2 x 109 あるいは酵母 5 x
107 まで）からの微生物 DNA の精製が可能です。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（12、14 ページ）で使用する
ために、ウォーターバスまたはヒートブロックを 56℃に加熱してください。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱しておきます。
■■ “プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）”のステッ
プ 12、
“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
操作手順
1.
1.5 ml までの体液を 2 ml チューブに入れて、最大速度（>14,000 x g）で
5 分間遠心操作する。
2.
上清を除去し棄てる。必要に応じてステップ 1 および 2 を繰り返す。
3.
400 µl の Buffer ATL を添加し、細胞ペレットを再懸濁する。
4.
8
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
プロトコール：眼、鼻、咽頭やその他のスワブからの微
生物 DNA の前処理
（機械的な前溶解処理プロトコール）
本プロトコールでは、眼、鼻、咽頭、その他スワブから微生物 DNA を精製するた
めに、Pathogen Lysis Tube を用いて機械的溶解を前もって行ないます。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ この前処理プロトコールのステップ 3 および両病原体および微生物 DNA 精製
用プロトコールで使用するため、サーモシェーカーを 56℃に加熱しておき
ます。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱しておきます。
■■ “プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）”のステッ
プ 12、
“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
■■ 使用前に、100 µl の Reagent DX を 15 ml の Buffer ATL に添加します。少量が
必要な場合は、1.5 ml の Buffer ATL を滅菌済みの 2 ml 容器に入れてから 10 µl
の Reagent DX を添加します。Reagent DX を添加後、よく混和します。調製し
た溶液は室温（15 ∼ 25℃）で 6 ヶ月安定です。
操作手順
1.
スワブの先を切り落として 2 ml のマイクロ遠心チューブに入れる。
2.
650 µl の Buffer ATL（Reagent DX 含有）を添加する。
3.
サーモシェーカーにチューブをセットして、600 rpm で振蘯させながら 56℃
で 10 分間インキュベートする。
4.
2 ml のマイクロ遠心チューブを開いて全溶液を慎重に Pathogen Lysis Tube へ
移す。
5.
Pathogen Lysis Tube を Microtube Foam Insert にセットし、最高スピードで 10
分間ボルテックスする。
代替方法：Pathogen Lysis Tube を TissueLyser LT にセットして 50 Hz で 10 分
間破砕するか、あるいは FastPrep-24 instrument を使用して、6.5 m/s の速度
で 45 秒間の振蘯を 5 分間のインターバルをおいて 2 回行なってください。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
9
6.
ボルテックス終了後 Pathogen Lysis Tube を取り出し、蓋内側の液滴を回収す
るために 8,000 x g で 5 秒間チューブを遠心操作する。
7.
Pathogen Lysis Tube から上清（約 400 µl）を新しい 2 ml のマイクロ遠心チュー
ブに入れる。ガラスビーズを上清と一緒に取り出さないように気をつける。
8.
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
10
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
プロトコール：眼、鼻、咽頭やその他のスワブからの
微生物 DNA の前処理（前溶解処理なしプロトコール）
これは、眼、鼻、咽頭、その他スワブから微生物 DNA を精製するためのプロトコー
ルです。
実験開始前の準備事項
■■ 検体を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ Buffer ATL または Buffer APL2 中に沈殿物が形成されている場合は 56℃で溶解
してください。
■■ この前処理プロトコールのステップ 3 および両病原体および微生物 DNA 精製
用プロトコールで使用するため、サーモシェーカーを 56℃に加熱しておき
ます。
■■ ウォーターバスまたはヒートブロックを用意し、両病原体および微生物 DNA
精製用プロトコールのステップ 4 用に 70℃に加熱しておきます。
■■
プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコール）のステッ
プ 12、プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）
のステップ 13 で使用する溶出用 Buffer AVE を室温（15 ∼ 25℃）に戻します。
■■ 英語版 Handbook 14 ページの説明に従って Buffer APW1 および Buffer APW2
を調製したことを確認してください。
操作手順
1.
スワブの先端を切り落として 2 ml のマイクロ遠心チューブに入れる。
2.
500 µl の Buffer ATL を添加する。
3.
サーモシェーカーにチューブをセットして、600 rpm で振蘯させながら 56℃
で 10 分間インキュベートする。
4.
2 ml のチューブを開いて全溶液を慎重に新しい 2 ml のチューブに移す。
5.
12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸引プロトコー
ル）”、あるいは 14 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（スピンプロトコール）”に続ける。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
11
プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製
（吸引プロトコール）
本プロトコールは、吸引法（推奨）を用いて、前処理した 400 µl サンプルから微
生物 DNA を精製するためのものです。前処理した 400 µl のサンプルからのスピン
プロトコールを用いた DNA 精製は、14 ページのスピンプロトコール“プロトコー
ル：病原体および微生物 DNA 精製（スピンプロトコール）”をご覧ください。
操作手順
1.
40 µl の proteinase K を添加し、10 秒間ボルテックスして検体を混和する。
2.
検体を 56℃で 10 分間インキュベートする。
3.
検体に 200 µl の Buffer APL2 を添加する。蓋を閉めて、パルスボルテックスで
30 秒間混和する。
注：効率的に病原体を溶解するためには、検体と Buffer APL2 を十分に混和し、
完全に均一な溶液を形成することが重要です。
4.
70℃で 10 分間インキュベートする。
5.
チューブをスピンダウンし、蓋の内側に付着した溶液を回収する。
6.
300 µl エタノールをライセートに添加する。蓋を閉め、15 ∼ 30 秒間パルス
ボルテックスして完全に混和する。
7.
QIAamp UCP Mini Column の Tube Extender にステップ 6 のライセートを慎重に
アプライする。真空ポンプのスイッチを入れる。すべてのライセートがカラム
を通過した後、真空ポンプのスイッチを切り、吸引力を 0 mbar にする。Tube
Extender を慎重に取り外し、廃棄する。
クロスコンタミを回避するために、Tube Extender を取り除く際に隣接する
QIAamp UCP Mini Column の上を通らないように注意します。
8.
600 µl の Buffer APW1 を QIAamp UCP Mini Column に添加する。カラムの蓋を
開 け た ま ま で 真 空 ポ ン プ の ス イ ッ チ を 入 れ る。 す べ て の Buffer APW1 が
QIAamp UCP Mini Column を通過した後、真空ポンプのスイッチを切り、吸引力
を 0 mbar にする。
9.
750 µl の Buffer APW2 を QIAamp UCP Mini Column に添加する。カラムの蓋を
開 け た ま ま で 真 空 ポ ン プ の ス イ ッ チ を 入 れ る。 す べ て の Buffer APW2 が
QIAamp UCP Mini Column を通過した後、真空ポンプのスイッチを切り、吸引力
を 0 mbar にする。
10. QIAamp Mini Column の蓋を閉める。吸引マニホールドから取り除き、VacConnector は捨てる。QIAamp UCP Mini Column を新しい 2 ml コレクションチュー
ブに移し、最高速度（20,000 x g；14,000 rpm）で 3 分間遠心操作する。
11. QIAamp UCP Mini Column を新しい 2 ml のコレクションチューブにセットする。
蓋を開き、56℃で 3 分間インキュベートして、メンブレンを完全に乾燥させる。
12
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
12. QIAamp UCP Mini Column を新しい 1.5 ml 溶出用チューブに移し、コレクショ
ンチューブは捨てる。20 ∼ 100 µl の Buffer AVE を QIAamp UCP Mini メンブ
レンの中央に慎重にアプライする。蓋を閉め、室温で 1 分間インキュベート
する。
重要：溶出バッファーを室温に戻したことを確認します。少量（50 µl 未満）
で溶出を行なう場合は、メンブレンの中央に溶出バッファーをアプライするこ
とで、カラムに結合した DNA が完全に溶出されるようにします。溶出バッ
ファーの量は、ダウンストリームのアプリケーションでの必要性に応じて調節
可能です。回収される溶出液量は、カラムにアプライした溶出用バッファー量
よりも 5 µl（最高）少なくなります。
13. 最高速度（20,000 x g；14,000 rpm）で 1 分間遠心操作し、DNA を溶出する。
14. ステップ 12 および 13 を繰り返す。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
13
プロトコール：サンプル調製（スピンプロトコール）
本プロトコールは、マイクロ遠心機を用いて、前処理した 400 µl サンプルから微生
物 DNA を精製します。吸引プロトコールを用いた前処理した 400 µl サンプルから
の DNA 精製は、12 ページの“プロトコール：病原体および微生物 DNA 精製（吸
引プロトコール）
”をご覧ください。
操作手順
1.
40 µl の proteinase K を添加し、10 秒間ボルテックスする。
2.
検体を 56℃で 10 分間インキュベートする。
3.
検体に 200 µl の Buffer APL2 を添加する。蓋を閉めて、パルスボルテックスで
30 秒間混和する。
注：効率的に病原体を溶解するためには、検体と Buffer APL2 を十分に混和し、
完全に均一な溶液を形成することが重要です。
4.
70℃で 10 分間インキュベートする。
5.
チューブをスピンダウンし、蓋の内側に付着した溶液を回収する。
6.
300 µl のエタノールをライセートに添加する。蓋を閉め、15 ∼ 30 秒間パルス
ボルテックスして完全に混和する。
7.
ステップ 6 の混合液 600 µl を QIAamp UCP Mini Spin Column（2 ml コレクショ
ンチューブ中）にカラムの縁を濡らさないように注意してアプライする。蓋を
閉 め て 6,000 x g（8,000 rpm） で 1 分 間 遠 心 分 離 す る。QIAamp UCP Mini
Spin Column を新しい 2 ml コレクションチューブ（付属品）に移し、ろ液の入っ
ているコレクションチューブは廃棄する。
遠心分離中のエアゾール形成を避けるために、各スピンカラムは密閉してくだ
さい。
8.
QIAamp UCP Mini Spin Column にステップ 6 の残りの混合液をアプライし、
ステップ 7 を繰り返す。
9.
QIAamp UCP Mini Spin Column を慎重に開き、カラムの縁を濡らさないように
600 µl の Buffer APW1 を添加する。蓋を閉めて 6,000 x g（8,000 rpm）で 1 分
間遠心分離する。QIAamp UCP Mini Spin Column を新しい 2 ml コレクション
チューブ（別途準備）に移し、ろ液の入っているコレクションチューブは廃棄
する *。
10. QIAamp UCP Mini Spin Column を慎重に開き、カラムの縁を濡らさないように
750 µl の Buffer APW2 を添加する。蓋を閉めて最高速度（20,000 x g、14,000
rpm）で 3 分間遠心分離する。
* フロースルー液は Buffer APL2 あるいは Buffer APW1 を含んでいるので、
漂白剤と一緒にしないでください。
“Safety Information”は英語版 Handbook 7 ページをご覧ください。
14
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
11. 推奨：QIAamp UCP Mini Spin Column を新しい 2 ml のコレクションチューブ（別
途準備）にのせ、ろ液の入っている古いコレクションチューブは廃棄する。最
高速度で 1 分間遠心操作を行なう。
このステップにより Buffer APW2 のキャリーオーバーの可能性を排除するこ
とができます。
12. QIAamp UCP Mini Column を新しい 2 ml のコレクションチューブにセットする。
蓋を開き、56℃で 3 分間インキュベートして、メンブレンを完全に乾燥させる。
13. QIAamp UCP Mini Column を新しい 1.5 ml 溶出用チューブに移し、コレクショ
ンチューブは捨てる。20 ∼ 100 µl の Buffer AVE を QIAamp UCP Mini メンブ
レンの中央に慎重にアプライする。蓋を閉め、室温で 1 分間インキュベート
する。
重要：溶出バッファーを室温に戻したことを確認します。少量（50 µl 未満）
で溶出を行なう場合は、メンブレンの中央に溶出バッファーをアプライするこ
とで、カラムに結合した DNA が完全に溶出されるようにします。溶出バッ
ファーの量は、ダウンストリームのアプリケーションでの必要性に応じて調節
可能です。回収される溶出液量は、カラムにアプライした溶出用バッファー量
よりも 5 µl（最高）少なくなります。
14. 最高速度（20,000 x g；14,000 rpm）で 1 分間遠心操作し、DNA を溶出する。
15. ステップ 13 および 14 を繰り返す。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
15
トラブルシューティング
コメント
微生物・病原体 DNA が溶出液にほとんどあるいは全く溶出されていない
a） 採血管に EDTA 以外の
抗凝固剤が入っている
EDTA 以外の抗凝固剤では血液中の DNA が急速に分
解する可能性がある。新しい検体で精製操作を再度
行なう。
b） 病原体の機械的な
溶解が不完全
Pathogen Lysis Tube を Vortex-Genie の Microtube foam
insert を用いて 10 分間ボルテックスするか、TissueLyser
LT にセットして 50 Hz で 10 分間破砕するか、または
FastPrep-24 instrument を使用し、45 秒間の振蘯を 5 分
間のインターバルをおいて 2 回行なったことを確認
する。
c） 96 ∼ 100％ではなく
低濃度のエタノールを
使用
新しい検体と 96 ∼ 100％エタノールで精製操作を
繰り返す。メタノールやメチルエチルケトンのよう
な物質を含んだ変性アルコールは使用しない。
d） Buffer APW1 あるいは
Buffer APW2 の調製が
不正確
オリジナルの Buffer APW1 および Buffer APW2 濃縮
液をエタノ−ルで正確に希釈したか確認する（英語
版 Handbook 14 ページ参照）
。新しい検体で精製操
作を再度行なう。
e） Buffer APW1 あるいは
Buffer APW2 を
70％エタノールで調製
オリジナルの Buffer APW1 および Buffer APW2 濃縮
液を 96 ∼ 100％エタノ−ルで正確に希釈したか確
認する（英語版 Handbook 14 ページ参照）
。新しい
検体で精製操作を再度行なう。
f） QIAamp UCP Mini
Column を
室温（15 ∼ 25℃）で
1 分間インキュベート
しなかった
Buffer AVE を添加後、QIAamp UCP Mini Column を室
温で 1 分間インキュベートする。
16
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
コメント
溶出した核酸を用いたダウンストリーム実験で良い結果がでない
a） 溶出液中に DNA が
少ないか皆無
“微生物・病原体 DNA が溶出液にほとんどあるいは
全く溶出されていない”
（16 ページ）の項で原因を
調べる。可能なら、アッセイに使用する溶出液量を
増やす。
b） 使用した溶出液量が
適切でない
ダウンストリーム反応に適した溶出液の最大量を決
める。それに従って、ダウンストリーム反応に加え
る溶出液量を増やすか減らす。それに従って溶出に
用いるバッファー量を調節する。
c） バッファー類を完全に
混和していない
洗浄用 Buffer APW2 の塩分およびエタノール成分が、
次の実験まで長期間放置されたために分離した。各
精製実験前に、常にバッファーを完全に混和する。
d） Buffer APW1 と
Buffer APW2 の順番を
間違えて使用
Buffer APW1 と Buffer APW2 をプロトコールの順序
に従って使用したか確認。新しい検体で再度精製を
行なう。
e） ダウンストリーム反応
の感度が低下
ダウンストリーム反応にテンプレートとして添加す
る溶出液の量を調節する。
f） 溶出溶液中に
エタノールが残留
それぞれのプロトコールに記載されている乾燥ス
テップを行なう。
Buffer APL2 の添加後、白色沈殿物を形成
Buffer APL2 の添加後、
白色沈殿物を形成
ほとんどの場合、Buffer APL2 の添加後に形成した沈
殿物は 70℃でのインキュベーション中に溶解され
る。この沈殿物は操作やその後のアプリケーション
に影響しない。
Buffer ATL あるいは Buffer APL2 中の白色沈殿物
白色沈殿物は低温での
保存あるいは長期保存
により形成される
Buffer ATL あるいは Buffer APL2 中のほとんどの沈殿
物は 56℃でのインキュベーションにより溶解され
る。この沈殿物はキットの性能に影響しない。沈殿
物を高温で溶解しても、精製される核酸の収量ある
いは品質に影響を及ぼさない。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
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コメント
メンブレンが目詰まり
a） 吸引力が –800 ∼
–900 mbar に達して
いない
吸引マニホールドをしっかりと閉じていない。吸引
装置のスイッチを入れた後、吸引マニホールドの蓋
を下に押す。吸引力が十分であるかチェックする。
QIAvac 蓋のガスケットが劣化している。吸引マニ
ホールドのシールをチェックし、必要なら交換する。
VacValve に 欠 陥 が あ る。VacValve を す べ て 取 り 外
し、VacConnector を直接 luer extension に挿入する。
QIAamp UCP Mini Column を VacConnector に 挿 入
し、カラムの蓋を閉じ、真空ポンプのスイッチを入
れる。吸引力が十分であるかチェックする。必要な
らば VacValve を交換する。
真空ポンプへの連結部で漏れがある。Luer cap で luer
extension をすべて閉じて、真空ポンプのスイッチを
入れる。ポンプのスイッチを入れた後（かつ vacuum
regulator valve を閉じた後）
、吸引力が安定している
かをチェックする。必要ならポンプと吸引マニホー
ルドの連結部を交換する。
上記全てをチェック後、吸引力が十分でない場合は、
より吸引力の強い真空ポンプと交換する。
b） タンパク質分解が
不完全
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Proteinase K を長時間・高温度で保管した場合、活性
が低下することがある。新しい検体と新しく調製し
た Proteinase K を用いて操作を繰り返す。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
コメント
c） メンブレンが目詰まり
VacValve（使用している場合）を閉じて、
Tube Extender
の ラ イ セ ー ト が 漏 れ な い よ う に Tube Extender、
QIAamp UCP Mini Column、VacConnector、VacValve を QIAvac 24 Plus マ ニ ホ ー ル ド か ら 取 り 外
す。Tube Extender に残っているライセートを、新し
い 2 ml チューブに慎重に移す。装置（上記参照）か
ら QIAamp UCP Mini Column を取り外し、2 ml のコ
レクションチューブにセットし、1 分間あるいはサ
ンプルが完全にメンブレンを完全に通過するまで最
高速度で遠心操作する。QIAamp UCP Mini Column、
Tube Extender、VacConnector お よ び オ プ シ ョ ン の
VacValve をもう一度組み立てる。残りのサンプルラ
イセートを Tube Extender に移し、吸引ポンプのス
イッチを入れ、VacValve を開き、残りのライセート
を QIAamp UCP Mini Spin Column に通過させる。
QIAamp UCP Mini Spin Column の目詰まりが続く場
合、上の操作を繰り返す。
QIAamp UCP Pathogen Mini プロトコールとトラブルシューティング 05/2011
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Trademarks: QIAGEN®, QIAamp® (QIAGEN Group); TurboMix® (Bete Fog Nozzle, Inc.).
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記載の QIAGEN 製品は研究用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。
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