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公表特許公報 特表2015
(19)日本国特許庁（ＪＰ） 〔実 44 頁〕 公表特許公報（Ａ） (12) (11)特許出願公表番号 特表2015-527065 （Ｐ２０１５−５２７０６５Ａ） (43)公表日 平成27年9月17日(2015.9.17) (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード(参考) Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ２Ｂ１５０ Ｃ１２Ｎ 9/42 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 9/42 ＺＮＡ ４Ｂ０１７ Ｃ１２Ｎ 1/15 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｂ０２３ Ｃ１２Ｎ 1/19 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｂ０２４ Ｃ１２Ｎ 1/21 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/21 審査請求 有 予備審査請求 ４Ｂ０３２ 未請求 （全70頁） 最終頁に続く (21)出願番号 特願2015-524590(P2015-524590) (71)出願人 513207806 (86)(22)出願日 平成24年8月3日(2012.8.3) デュポン ニュートリション (85)翻訳文提出日 平成27年4月3日(2015.4.3) エンシス エーピーエス (86)国際出願番号 PCT/CN2012/079653 デンマーク、コペンハーゲン (87)国際公開番号 WO2014/019219 ーケー−１００１、ピー．オー．ボックス (87)国際公開日 平成26年2月6日(2014.2.6) １７、ランゲブロゲイド バイオサイ ケー ディ １ (74)代理人 100071010 弁理士 山崎 行造 (74)代理人 100118647 弁理士 赤松 利昭 (74)代理人 100138438 弁理士 尾首 亘聰 (74)代理人 100138519 弁理士 奥谷 雅子 最終頁に続く (54)【発明の名称】酵素 (57)【 要 約 】 本発明は、食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製造、例えば醸造工程、に使用 するのに適した、改良された性質を有する新規な酵素、及び当該酵素を含む組成物に関す る。 ( 2 ) JP 1 2015-527065 A 2015.9.17 2 【特許請求の範囲】 、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸 【請求項１】 置換を有する、又はその任意の機能性断片である、請求 エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、 項１∼７のいずれか一項に記載の酵素。 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番 【請求項９】 号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19 配列番号1∼25のいずれか１つによって同定されるアミ 、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、 ノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む、請求項１ 配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１ ∼８のいずれか一項に記載の酵素。 つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又 【請求項１０】 はその任意の機能性断片を含む酵素。 【請求項２】 配列番号1∼25のいずれか１つによって同定されるアミ 10 ノ酸配列、又はその任意の機能性断片からなる、請求項 不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキ １又は３のいずれか一項に記載の酵素。 シラン基質への活性に対する可溶性アラビノキシラン基 【請求項１１】 質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率が、約７．０未満、例 請求項１∼１０のいずれか一項に記載の酵素をコードす えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５． るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。 ５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満であ 【請求項１２】 る、請求項１に記載の酵素。 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を含む組み換え発現ベ 【請求項３】 クター。 エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であっ 【請求項１３】 て、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物又は請求項１２に記載 配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配 20 のベクターで形質転換された細胞。 列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つ 【請求項１４】 と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又は 請求項１∼１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１ その機能性断片を含む酵素。 １に記載のＤＮＡ構築物、請求項１２に記載のベクター 【請求項４】 、又は請求項１３に記載の細胞を含む調製物。 ４０∼７０℃の範囲、例えば４５∼６５℃の範囲、例え 【請求項１５】 ば５０∼６５℃の範囲、例えば５５∼６５℃の範囲の至 請求項１、２、及び４∼１０のいずれか一項に記載のエ 適温度を有する、請求項１∼３のいずれか一項に記載の ンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１ 酵素。 種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含む組成物。 【請求項５】 【請求項１６】 配列番号1∼25から選択されるいずれか１つのアミノ酸 30 前記１種以上のβ-グルカナーゼが請求項３∼１０のい 配列と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６ ずれか一項に記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活 、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、 性を示す酵素である、請求項１５に記載の組成物。 ９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する 【請求項１７】 、又はその任意の機能性断片である、請求項１∼４のい 請求項３∼１０のいずれか一項に記載のエンド-1,3(4)- ずれか一項に記載の酵素。 β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上の 【請求項６】 キシラナーゼと組み合わせて含む組成物。 アミノ酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満、例え 【請求項１８】 ば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、 前記１種以上のキシラナーゼが請求項１、２、及び４∼ 例えば３００未満のアミノ酸、例えば２００∼３５０の １０のいずれか一項に記載のエンド-1,4-β-キシラナー 範囲、例えば２２０∼３４５の範囲のアミノ酸である、 40 ゼ活性を示す酵素である、請求項１７に記載の組成物。 請求項１∼５のいずれか一項に記載の酵素。 【請求項１９】 【請求項７】 前記エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及び前記エン 前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号1∼25から選択さ ド-1,4-β-キシラナーゼ活性が、少なくとも２種の異な れるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少なくとも る酵素、例えば２つの異なる種（species）からの少な １、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のア くとも２種の異なる酵素に由来する、請求項１５∼１８ ミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である のいずれか一項に記載の組成物。 、請求項１∼６のいずれか一項に記載の酵素。 【請求項２０】 【請求項８】 少なくとも２種の酵素の組み合わせを含む請求項１５∼ 前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1∼25から選択さ １９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記２種 れるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して最大１、２ 50 の酵素が、次の配列からなるリストから選択されるそれ ( 3 ) JP 2015-527065 3 4 ぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有す 配列番号3及び配列番号10、 るアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はその任意の機 配列番号4及び配列番号10、 能性断片である、組成物。 配列番号5及び配列番号10、 配列番号1及び配列番号7、 配列番号6及び配列番号10、 配列番号2及び配列番号7、 配列番号17及び配列番号10、 配列番号3及び配列番号7、 配列番号18及び配列番号10、 配列番号4及び配列番号7、 配列番号19及び配列番号10、 配列番号5及び配列番号7、 配列番号20及び配列番号10、 配列番号6及び配列番号7、 配列番号17及び配列番号7、 配列番号21及び配列番号10、 10 配列番号22及び配列番号10、 配列番号18及び配列番号7、 配列番号23及び配列番号10、 配列番号19及び配列番号7、 配列番号24及び配列番号10、 配列番号20及び配列番号7、 配列番号25及び配列番号10、 配列番号21及び配列番号7、 配列番号1及び配列番号11、 配列番号22及び配列番号7、 配列番号2及び配列番号11、 配列番号23及び配列番号7、 配列番号3及び配列番号11、 配列番号24及び配列番号7、 配列番号4及び配列番号11、 配列番号25及び配列番号7、 配列番号5及び配列番号11、 配列番号1及び配列番号8、 配列番号6及び配列番号11、 配列番号2及び配列番号8、 20 配列番号17及び配列番号11、 配列番号3及び配列番号8、 配列番号18及び配列番号11、 配列番号4及び配列番号8、 配列番号19及び配列番号11、 配列番号5及び配列番号8、 配列番号20及び配列番号11、 配列番号6及び配列番号8、 配列番号21及び配列番号11、 配列番号17及び配列番号8、 配列番号22及び配列番号11、 配列番号18及び配列番号8、 配列番号23及び配列番号11、 配列番号19及び配列番号8、 配列番号24及び配列番号11、 配列番号20及び配列番号8、 配列番号25及び配列番号11、 配列番号21及び配列番号8、 配列番号1及び配列番号12、 配列番号22及び配列番号8、 30 配列番号2及び配列番号12、 配列番号23及び配列番号8、 配列番号3及び配列番号12、 配列番号24及び配列番号8、 配列番号4及び配列番号12、 配列番号25及び配列番号8、 配列番号5及び配列番号12、 配列番号1及び配列番号9、 配列番号6及び配列番号12、 配列番号2及び配列番号9、 配列番号17及び配列番号12、 配列番号3及び配列番号9、 配列番号18及び配列番号12、 配列番号4及び配列番号9、 配列番号19及び配列番号12、 配列番号5及び配列番号9、 配列番号20及び配列番号12、 配列番号6及び配列番号9、 配列番号17及び配列番号9、 配列番号21及び配列番号12、 40 配列番号22及び配列番号12、 配列番号18及び配列番号9、 配列番号23及び配列番号12、 配列番号19及び配列番号9、 配列番号24及び配列番号12、 配列番号20及び配列番号9、 配列番号25及び配列番号12、 配列番号21及び配列番号9、 配列番号1及び配列番号13、 配列番号22及び配列番号9、 配列番号2及び配列番号13、 配列番号23及び配列番号9、 配列番号3及び配列番号13、 配列番号24及び配列番号9、 配列番号4及び配列番号13、 配列番号25及び配列番号9、 配列番号5及び配列番号13、 配列番号1及び配列番号10、 配列番号6及び配列番号13、 配列番号2及び配列番号10、 50 配列番号17及び配列番号13、 A 2015.9.17 ( 4 ) JP 5 2015-527065 A 2015.9.17 6 配列番号18及び配列番号13、 配列番号23及び配列番号16、 配列番号19及び配列番号13、 配列番号24及び配列番号16、並びに 配列番号20及び配列番号13、 配列番号25及び配列番号16 配列番号21及び配列番号13、 【請求項２１】 配列番号22及び配列番号13、 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増 配列番号23及び配列番号13、 加する総圧力が、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍ 配列番号24及び配列番号13、 ｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ 配列番号25及び配列番号13、 ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７ 配列番号1及び配列番号14、 配列番号2及び配列番号14、 ０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３ 10 ３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば 配列番号3及び配列番号14、 ３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満の値に 配列番号4及び配列番号14、 軽減する、請求項１５∼２０のいずれか一項に記載の組 配列番号5及び配列番号14、 成物。 配列番号6及び配列番号14、 【請求項２２】 配列番号17及び配列番号14、 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増 配列番号18及び配列番号14、 加する総圧力が、前記組成物を含まない陰性対照を用い 配列番号19及び配列番号14、 た場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３ 配列番号20及び配列番号14、 、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、 配列番号21及び配列番号14、 ３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４ 配列番号22及び配列番号14、 20 ７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３ 配列番号23及び配列番号14、 、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、 配列番号24及び配列番号14、 ８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３又は９５％ 配列番号25及び配列番号14、 軽減する、請求項１５∼２１のいずれか一項に記載の組 配列番号1及び配列番号15、 成物。 配列番号2及び配列番号15、 【請求項２３】 配列番号3及び配列番号15、 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５ 配列番号4及び配列番号15、 分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定 配列番号5及び配列番号15、 するウォルトのろ過性は、酵素を含まない対照に対して 配列番号6及び配列番号15、 、１．５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて、例えば 配列番号17及び配列番号15、 30 １．７倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、例えば１ 配列番号18及び配列番号15、 ．９倍を超えて、例えば２．０倍を超えて、例えば２． 配列番号19及び配列番号15、 １倍を超えて、例えば２．２倍を超えて、例えば２．３ 配列番号20及び配列番号15、 倍を超えて、例えば２．４倍を超えて、例えば２．５倍 配列番号21及び配列番号15、 を超えて増加する、請求項１５∼２２のいずれか一項に 配列番号22及び配列番号15、 記載の組成物。 配列番号23及び配列番号15、 【請求項２４】 配列番号24及び配列番号15、 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５ 配列番号25及び配列番号15、 分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定 配列番号1及び配列番号16、 配列番号2及び配列番号16、 するウォルトのろ過性は、前記組成物を含まない陰性対 40 照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１ 配列番号3及び配列番号16、 １、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７ 配列番号4及び配列番号16、 、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、 配列番号5及び配列番号16、 ４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６ 配列番号6及び配列番号16、 １、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７ 配列番号17及び配列番号16、 、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、 配列番号18及び配列番号16、 ９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、 配列番号19及び配列番号16、 １５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２ 配列番号20及び配列番号16、 １０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７ 配列番号21及び配列番号16、 ０、２８０、２９０、又は３００％増加する、請求項１ 配列番号22及び配列番号16、 50 ５∼２３のいずれか一項に記載の組成物。 ( 5 ) JP 7 2015-527065 A 2015.9.17 8 【請求項２５】 デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、請 任意の１種以上の更なる酵素を含む、請求項１５∼２４ 求項１∼１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４ のいずれか一項に記載の組成物。 に記載の調製物、又は請求項１５∼２６のいずれか一項 【請求項２６】 に記載の組成物で前記デンプン含有原料を処理する工程 前記１種以上の更なる酵素が、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1. を含む方法。 136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ、セ 【請求項３６】 ルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L-アラビナ 醸造工程においてロイターリング中に増加する圧力を軽 ナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、β-キシ 減する方法であって、請求項１∼１０のいずれか一項に ロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン1,4-β- 記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１ グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ-β-1,4- 10 ５∼２６のいずれか一項に記載の組成物で醸造用マッシ グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダーゼからな ュを処理する工程を含む方法。 るリストから選択される、請求項２５に記載の組成物。 【請求項３７】 【請求項２７】 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノ 食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製造におけ ンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのよう る、請求項１∼１０のいずれか一項に記載の酵素、請求 な穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を 項１４に記載の調製物、又は請求項１５∼２６のいずれ 製造する方法であって、請求項１∼１０のいずれか一項 か一項に記載の組成物の使用。 に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項 【請求項２８】 １５∼２６のいずれか一項に記載の組成物でデンプン含 ドウ製品又はベークド製品の製造における、請求項１∼ 有原料を処理する工程を含む方法。 １０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の 20 【請求項３８】 調製物、又は請求項１５∼２６のいずれか一項に記載の 醸造用マッシュを製造する方法であって、請求項１∼１ 組成物の使用。 ０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調 【請求項２９】 製物、又は請求項１５∼２６のいずれか一項に記載の組 パルプ又は紙の調製における、請求項１∼１０のいずれ 成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。 か一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は 【請求項３９】 請求項１５∼２６のいずれか一項に記載の組成物の使用 バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃 。 料を製造する方法であって、請求項１∼１０のいずれか 【請求項３０】 一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請 穀物成分の調製のための、請求項１∼１０のいずれか一 求項１５∼２６のいずれか一項に記載の組成物でデンプ 項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求 30 ン含有原料を処理する工程を含む方法。 項１５∼２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。 【請求項４０】 【請求項３１】 請求項３８又は３９に記載の方法によって得られた製品 前記穀物がライ麦、小麦、又は大麦である、請求項２９ 。 に記載の使用。 【請求項４１】 【請求項３２】 請求項４０に記載の製品を含む組成物であって、前記製 ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変における 品が０．１％∼９９．９％の範囲で含まれるような組成 、請求項１∼１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項 物。 １４に記載の調製物、又は請求項１５∼２６のいずれか 【発明の詳細な説明】 一項に記載の組成物の使用。 【請求項３３】 【技術分野】 40 【０００１】 ワイン又はジュースの製造における、請求項１∼１０の 本発明は、食品、飲料（ビール等）、飼料、又はバイオ いずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物 燃料の製造における使用（例えば、醸造工程における使 、又は請求項１５∼２６のいずれか一項に記載の組成物 用）に適した改良された性質を有する酵素、及び、当該 の使用。 酵素を含む組成物に関する。 【請求項３４】 【背景技術】 バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃 【０００２】 料の製造における、請求項１∼１０のいずれか一項に記 ビール製造における酵素の使用はよく知られている。マ 載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５ ッシュのろ過性の改善及びエキス収率の向上のために糖 ∼２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。 化（マッシング）工程に酵素を適用することは、国際公 【請求項３５】 50 開公報WO97/42302に記載されている。 ( 6 ) JP 9 2015-527065 A 2015.9.17 10 【０００３】 本明細書において、「機能性断片」とは、酵素の切断体 国際公開公報WO2005/118769及びWO2005/059084は、ビー であって、非切断の基準酵素と実質的に同じ程度の酵素 ル製造工程における糖化及びろ過工程に関し、また、当 活性又は非切断の基準酵素の少なくともかなりの程度の 該工程における酵素組成物の使用に関するものである。 酵素活性を有する酵素切断体をさす。 【０００４】 【００１０】 国際公開公報WO99/57325は、ペニシリウム・フニクロス 第二の側面において、本発明は、 ム（Penicillium funiculosum）の菌株、当該菌株から エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であっ 得られる新規酵素混合物、及びそれらに対する核酸配列 て、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、 に関するものである。 【０００５】 配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配 10 列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つ しかし、食品製品及び飲料製品の製造（例えば、ビール と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又は 又はウイスキー等のアルコール飲料の製造における糖化 その機能性断片を含む酵素 工程、蒸煮工程、及びろ過工程）において有用な改良さ に関する。 れた酵素及び酵素の組み合わせについては、更に必要と 【００１１】 されている。 第三の側面において、本発明は、 【発明の概要】 本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築 【発明が解決しようとする課題】 物 【０００６】 に関する。 本発明の課題の一つは、食品製品及び飲料製品の製造（ 【００１２】 例えば、アルコール飲料又はノンアルコール飲料の製造 20 更に別の側面において、本発明は、 や、ビール又はウイスキーのような穀物使用飲料又はモ 本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築 ルト使用飲料の製造）に適した酵素を提供することにあ 物を含む組み換え発現ベクター る。本発明によって提供される酵素は、醸造における使 に関する。 用に関して改良された性質を有してもよい。この多種多 【００１３】 様な改良された性質には、例えば、温度最適性の改良、 更に別の側面において、本発明は、 不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）への活性に 本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築 対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への 物で形質転換された細胞 活性の比率の改良、醸造工程のロイターリング（ロイタ に関する。 ー式ろ過）及び／又はろ過の工程中に増加する総圧力（ 【００１４】 合計圧力）の軽減（減少）、及び酵素処理した原料のろ 30 更に別の側面において、本発明は、 過性の向上等が含まれる。 本発明の酵素、本発明のＤＮＡ構築物、本発明のベクタ 【課題を解決するための手段】 ー、又は本発明の細胞を含む調製物 【０００７】 に関する。 本発明者らは、１種以上の酵素及び酵素の特定の組み合 【００１５】 わせが、公知の酵素や公知の酵素を組み合わせた場合の 更に別の側面において、本発明は、 性質を改良すること、特に、デンプン含有原料が１種以 本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を 上の酵素で処理されて醸造用マッシュが製造される醸造 、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含 工程における酵素の使用に関して酵素の性質を改良する む組成物 ことを発見した。 【０００８】 に関する。 40 【００１６】 すなわち、第一の側面において、本発明は、 更に別の側面において、本発明は、 エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、 本発明のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番 素を、任意の１種以上のキシラナーゼと組み合わせて含 号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19 む組成物 、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、 に関する。 配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１ 【００１７】 つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又 更に別の側面において、本発明は、 はその任意の機能性断片を含む酵素 食品製品、飼料製品、又はビール若しくはウイスキー等 に関する。 のモルト飲料製品の製造における、本発明の酵素、本発 【０００９】 50 明の調製物、又は本発明の組成物の使用 ( 7 ) JP 11 2015-527065 A 2015.9.17 12 に関する。 ンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのよう 【００１８】 な穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を 更に別の側面において、本発明は、 製造する方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組 ドウ製品又はベークド製品の製造における、本発明の酵 成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法 素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用 に関する。 に関する。 【００２７】 【００１９】 更に別の側面において、本発明は、 更に別の側面において、本発明は、 醸造用マッシュを製造する方法であって、本発明の酵素 パルプ又は紙の調製における、本発明の酵素、本発明の 調製物、又は本発明の組成物の使用 、調製物、又は組成物でデンプン含有原料を処理する工 10 程を含む方法 に関する。 に関する。 【００２０】 【００２８】 更に別の側面において、本発明は、 更に別の側面において、本発明は、 穀物成分の調製のための、本発明の酵素、本発明の調製 バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃 物、又は本発明の組成物の使用 料を製造する方法であって、本発明の酵素、調製物、又 に関する。いくつかの実施形態においては、穀物は、ラ は組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法 イ麦、小麦、又は大麦である。 に関する。 【００２１】 【００２９】 更に別の側面において、本発明は、 更に別の側面において、本発明は、 ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変における 20 本発明の方法によって得られた製品 、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物 に関する。 の使用 【００３０】 に関する。 更に別の側面において、本発明は、 【００２２】 本発明の方法によって得られた製品を含む組成物であっ 更に別の側面において、本発明は、 て、前記製品が０．１％∼９９．９％の範囲で含まれる ワイン又はジュースの製造における、本発明の酵素、本 ような組成物 発明の調製物、又は本発明の組成物の使用 に関する。 に関する。 【図面の簡単な説明】 【００２３】 【００３１】 更に別の側面において、本発明は、 30 【図１】ラボスケール醸造及びパイロットスケール醸造 バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃 において使用する糖化プロファイル。１０分間のマッシ 料の製造における、本発明の酵素、本発明の調製物、又 ングイン（マッシュ投入）期間によって糖化を開始し、 は本発明の組成物の使用 その期間の後に酵素を添加した。 に関する。 【図２】グルカナーゼ及びキシラナーゼのスクリーニン 【００２４】 グを確認するパイロット規模醸造の適用結果。アスペル 更に別の側面において、本発明は、 ギルス デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、本 わせたバチルス 発明の酵素、調製物、又は組成物で前記デンプン含有原 、ブランク及びUltraFlo maxを対照として試験した。収 料を処理する工程を含む方法 に関する。 ツビゲンシス（A. tub）キシラナーゼと組み合 スブチリス（B. sub）グルカナーゼを 集したデータは、平均流量（L/h）、ロイターリングの 40 工程中に増加した総圧力（mmWC、ここで1mmWC=9.80665P 【００２５】 a）、及びロイターリングの工程中に記録した最大圧力 更に別の側面において、本発明は、 （mmWC）である。 醸造用途においてロイターリング（ロイター式ろ過）中 【図３】醸造におけるキシラナーゼの機能。 に増加する圧力を軽減する（減少させる）方法であって 【図４】流量−種々のキシラナーゼの候補を適用したロ 、本発明の酵素、調製物、又は組成物で醸造用マッシュ イターリング。 を処理する工程を含む方法 【図５】ビールろ過−繰り返し行ったろ過の平均。 に関する。 【図６】ビールろ過−繰り返し行ったろ過の平均。 【００２６】 【図７】実施例３の糖化工程図。 更に別の側面において、本発明は、 【発明の詳細な説明】 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノ 50 【００３２】 ( 8 ) JP 13 2015-527065 A 2015.9.17 14 ビールとは、大麦穀物由来の麦芽等のモルト、必要に応 6-結合のいずれかによって(前者の結合が多い）結合し じてデンプン含有植物原料（例えば、穀物）等の付加原 たグルコースのホモポリマーからなる。 料、及び必要に応じて香料（例えば、ホップ等）に由来 【００３９】 するアルコール飲料のことを、伝統的にビールと呼んで ビール等の発酵飲料を製造する工程は、一般に醸造と呼 いる。 ばれる。これらの飲料の製造において使用される伝統的 【００３３】 な原料は、水、ホップ、及びモルト（麦芽）である。モ 本発明に関しては、用語「ビール」は、デンプン含有植 ルトに加えて、又はモルトに替えて、普通のコーングリ 物原料の発酵／醸造によって製造される全てのウォルト ッツ、精製したコーングリッツ、粉砕した醸造酵母、米 （麦汁）発酵物を含むことを意味する。従って、又、特 、ソルガム、精製したコーンスターチ、大麦、大麦スタ に、ビールは、もっぱら付加原料から製造されてもよい 10 ーチ、脱穀大麦、小麦、小麦スターチ、乾燥した穀物、 し、モルトと付加原料の組み合わせから製造されてもよ 穀物フレーク、ライ麦、オート麦、ジャガイモ、タピオ い。 カ、及びシロップ（コーンシロップ、サトウキビシロッ 【００３４】 プ、転化糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ）等 本発明に関しては、用語「発酵」は、培養物中で微生物 の付加原料を、デンプン供給源として用いてもよい。デ を生育させることによるエタノール等の物質の生産を意 ンプンは、酵素によって、最終的に発酵性糖に変換され 味する。一般に、酵母等の微生物が発酵に使用される。 る。 【００３５】 【００４０】 本明細書において、用語「モルト」は、モルトにした大 主としてモルトから製造されるビール（例えば、付加原 麦等、任意のモルトにした穀物を意味する。「付加原料 料は１５∼２０％までである）に関しては、種々の理由 」は、モルト又は大麦麦芽以外の全てのデンプン含有植 20 により、モルト（モルトは、主として、選ばれた品種の 物原料を意味する。 大麦から製造される）は、ビールの全体の性質及び品質 【００３６】 に大きな影響を及ぼす。第1に、モルトは、ビールの最 用語「デンプン含有植物原料」は、例えば、大麦、小麦 初の香味料である。第２に、モルトは、発酵性糖の大部 、トウモロコシ、ライ麦、ソルガム、キビ、又は米、及 分を供給する。第３に、モルトはタンパク質を供給し、 びこれらの任意の組み合わせ等の１種以上の穀物であり このタンパク質はビールのボディー及び泡の性質に関与 得る。デンプン含有植物原料は、例えば、粉砕する、モ する。第４に、モルトは、糖化の時に必要な酵素活性を ルトにする、部分的にモルトにする、又はモルトにしな 供給する。 い等の処理を行ってもよい。モルトにしていない穀物も 【００４１】 、又、「原料穀物」と呼ぶ。非穀物性のデンプン含有植 ホップも又、香味付を含めて、ビールの品質に重要な影 物原料は、例えば、ジャガイモ及びキャッサバ等の塊茎 30 響を及ぼす。特に、ホップ（又は、ホップ成分）により 植物を含む。 、ビールに望ましい苦味物質が添加される。更に、ホッ 【００３７】 プは、タンパク沈殿剤として働き、保存剤並びに泡形成 本明細書において、用語「飲料」及び「飲料製品」は、 及び安定化の補助剤となる。全てのビールが、ホップを オールモルトビール、ビール純粋例の下で醸造したビー 用いて製造されるわけではない。プロテアーゼ（例えば ル、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール 、パパイン）等の他の安定化剤も又、使用してもよい。 、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、 【００４２】 ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノーアルコー 本発明を限定的に解釈するものではないが、伝統的なビ ルビール、ノーアルコールモルトリカー等の発泡性発酵 ール醸造工程は、次のように説明できる： 飲料を含む。また、用語「飲料」又は「飲料製品」は、 【００４３】 非発泡性ビール、及び代替モルト飲料（例えば、フルー 40 ビール製造工程は、当技術分野で周知である。簡単にい ツの香り（レモン、オレンジ、ライム等の柑橘類の香り えば、ビール製造工程は、５つの工程を含む：（ａ）糖 、又はベリーの香り）のモルト飲料）、リカーの香りの 化（マッシング）及び／又は付加原料の蒸煮（クッキン モルト飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラの グ）、（ｂ）ウォルトの分離及び抽出、（ｃ）ウォルト 香りのモルトリカー）、又はコーヒーの香りのモルト飲 の煮沸及びホップ添加（ホッピング）、（ｄ）冷却、発 料（例えば、カフェインの香りのモルトリカー）、等） 酵、及び貯蔵(storage)、（ｅ）熟成(maturation)、加 を含む。 工、及び包装。一般的には、第１工程では、粉砕又は圧 【００３８】 砕したモルトを水と混合し、制御された温度の下で一定 ビールは、基本的に同様の工程によって、種々のデンプ の時間保持して、モルト中の酵素にモルト中のデンプン ン含有植物原料から製造することができる。デンプンは を発酵性糖へ変換させる。 、主として、グルコース残基が、α-1,4-結合又はα-1, 50 【００４４】 ( 9 ) JP 15 2015-527065 A 2015.9.17 16 第２工程では、マッシュをロイタータン（ロイター式ろ 21690-64-2)」を参照してもよい。 過槽）又はマッシュフィルター（マッシュろ過布）へ移 【００５２】 し、そこで液体を穀物残渣から分離する。この甘い液体 キシラナーゼは、EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1. は、ウォルト(麦汁）と呼ばれ、残りの穀物残渣はスペ 136、及びEC 3.2.1.156に分類される。キシラナーゼの ントグレイン（モルト粕）と呼ばれる。一般的にはマッ 活性は、例えば、本実施例に記載したように測定しても シュを抽出するが、この抽出においてスペントグレイン よい。本発明のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を （モルト粕）に残っている可溶性エキスを回収するため 示す酵素と組み合わせて用いるための好ましいキシラナ に、マッシュに水を加える。 ーゼは、EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、及 【００４５】 びEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ（例えば、国 第３工程では、ウォルトを激しく煮沸する。これにより 10 際公開公報WO2010072226、WO2010072225、WO2010072224 、ウォルトが殺菌され、色、香味、及び香りが増す。煮 、WO2005059084、WO2007056321、WO2008023060A、WO942 沸中のある時点で、ホップを添加する。 1785、WO2006114095、WO2006066582、US2008233175、及 【００４６】 びWO10059424に開示されているいずれかの酵素）を含む 第４工程では、ウォルトを冷却して発酵槽へ移す。この 。 発酵槽は、予め酵母が添加されているか、又はウォルト 【００５３】 添加後に酵母を添加する。酵母は、発酵によって糖をア エンド-1,4-β-キシラナーゼは、EC 3.2.1.8に分類され ルコールと二酸化炭素ガスに変換する。発酵の最後に発 る。この酵素は、キシランの1,4-β-D-キシロシド結合 酵槽を冷却する。又は、発酵を止めるために発酵槽を冷 をエンド加水分解する。 却してもよい。酵母は、凝集し、回収される。 【００５４】 【００４７】 20 本明細書において、用語「ファミリー１１キシラナーゼ 最終工程では、ビールを冷却し、ある期間貯蔵する。こ 」、「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１ の貯蔵期間中に、ビールは清澄になり、香味が増し、ビ 」、又は単に「ＧＨ１１キシラナーゼ」は、EC 3.2.1.8 ールの外観、香味、賞味期間に悪影響を及ぼす可能性の に分類されるエンド-1,4-β-キシラナーゼをさし、これ ある物質が沈殿する。包装の前に、ビールにカーボネー は、キシランの1,4-β-D-キシロシド結合をエンド加水 ションを行い、必要に応じて、ビールをろ過及び低温殺 分解し、「B. Henrissat著、"A classification of gly 菌する。 cosyl hydrolases based on amino acid sequence simi 【００４８】 larities"、Biochem. J. 280 (1991), pp. 309−316」 発酵後には、通常、約２重量％∼約１０重量％のアルコ に従ってファミリー１１キシラナーゼに分類される。 ールを含む飲料が得られる。非発酵性の炭水化物は、発 【００５５】 酵中には変換されず、最終ビール中で溶解固形物の大部 30 用語「ファミリー１０キシラナーゼ」、「グリコシドヒ 分を形成する。 ドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１０」、又は単に「ＧＨ 【００４９】 １０キシラナーゼ」は、キシラナーゼ（EC:3.2.1.8）、 この残渣が残るのは、モルトのアミラーゼがデンプンの エンド-1,3-β-キシラナーゼ（EC:3.2.1.32）、セロビ α-1,6-結合を加水分解することができないからである オヒドロラーゼ（EC:3.2.1.91）等のいくつかの公知の 。非発酵性の炭水化物は、ビール１２オンス当たり、約 活性を有する酵素を含む。 ５０カロリーの寄与をする。 【００５６】 【００５０】 いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナ 近年、ライトビール、減カロリービール、又は低カロリ ーゼ活性を示す本発明の酵素は、ファミリー１１キシラ ービールと呼ばれる醸造飲料が、特に米国市場で広く普 ナーゼである。いくつかの実施形態において、エンド-1 及している。米国において定義されているように、これ 40 ,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の酵素は、ファミ らのビールは、製造業者の通常のビールより約３０％低 リー１０キシラナーゼである。 いカロリーのビールである。 【００５７】 【００５１】 一つの側面において、本発明の酵素組成物は、実施例に 伝統的な醸造工程に関する他の情報、及び本発明に適用 記載したアッセイによって測定されるエンド-1,4-β-キ する醸造技術の技術分野において使用する用語の定義に シラナーゼ活性を有する。 ついては、「"Technology Brewing and Malting"、Wolf 【００５８】 gang Kunze著 (the Research and Teaching Institute キシラナーゼ活性を測定するアッセイは、ｐＨ３．５又 of Brewing, Berlin (VLB)), 2nd revisedEdition 1999 はｐＨ５、及び５０℃で、基質としてキシランを用いて , ISBN 3-921690-39-0, 3rd edition (2004): ISBN 3-9 、実施してもよい。あるいは、酵素の更に別の特性及び 21690-49-8, 4 t h updated edition, 2010 (ISBN 978-3-9 50 仕様について、これと異なるｐＨ及び温度の値でアッセ ( 10 ) JP 17 2015-527065 A 2015.9.17 18 イを実施することができる。酵素活性は、５４０ｎｍで 素の別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値で のキシロースによる吸光度の単位時間当たりの増加から アッセイを実施することもできる。 計算される。 【００６５】 【００５９】 エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性の１単位は、アッ いくつかの実施形態において、本発明の酵素組成物は、 セイの条件（ｐＨ５．０（又は指定されたｐＨ）及び５ 実施例に記載したアッセイによって測定した場合、少な ０℃）の下で、１分間に１μｍｏｌのグルコース当量を くとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約６０００ 生じる酵素の量として定義される。 Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約７０００Ｕ／ｇ、例えば少 【００６６】 なくとも約８０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約８５０ ０Ｕ／ｇのキシラナーゼ活性を含む。 いくつかの実施形態において、本発明の酵素組成物は、 10 実施例に記載したアッセイによって測定した場合、少な 【００６０】 くとも約１００００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１２０ 本発明の酵素組成物は、セルロース分解活性を有しても ００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１４０００Ｕ／ｇ、例 よい。セルロースの系統名は4-(1,3;1,4)-β-D-グルカ えば少なくとも約１５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも ン4-グルカノヒドロラーゼであり、セルロース分解酵素 約１８０００Ｕ／ｇのβ-グルカナーゼ活性を含む。 又はセルラーゼはEC 3.2.1.4に分類される。セルラーゼ 【００６７】 は、例えばセルロース、リケニン、及び穀物のβ-D-グ 更に別の側面において、本発明の酵素組成物は、ラミナ ルカンの(1→4)-β-D-グルコシド結合をエンド加水分解 リナーゼ活性を有するか、又はラミナリナーゼ活性を有 し、又β-D-グルカン（1,3-結合も含んでいる）の1,4- する任意の１種以上の更なる酵素を含む。ラミナリナー 結合も加水分解する。セルラーゼには、又、エンド-1,4 ゼ活性は、アッセイのセクションに記載したラミナラー -β-D-グルカナーゼ、β-1,4-グルカナーゼ、β-1,4-エ 20 ゼ（ｌａｍｉｎａｒａｓｅ）アッセイの記載のように決 ンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼ A、セルロシン 定する。 AP、エンドグルカナーゼ D、アルカリ セルロース、セ 【００６８】 ルラーゼ A3、セルデキストリナーゼ、9.5 セルラーゼ ラミナリナーゼは、E.C. 3.2.1.6に分類されるエンド-1 、アビセラーゼ、パンセラーゼ SS、及び1,4-(1,3;1,4) ,3(4)-β-グルカナーゼ、又はE.C. 3.2.1.39に分類され -β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ等の別の名称も るグルカンエンド-1,3-β-D-グルコシダーゼであってよ ある。 い。ラミナリナーゼ、エンド-1,3-β-グルカナーゼ、エ 【００６１】 ンド-1,4-β-グルカナーゼという代替名を持つエンド-1 本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のセ ,3(4)-β-グルカナーゼは、E.C. 3.2.1.6に分類される ルラーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記載 。基質は、ラミナリン、リケニンおよび穀物Ｄ−グルカ した「セルラーゼ活性の方法」により測定する。 30 ンを含み、酵素は、Ｃ−３の位置でグルコース残基（グ 【００６２】 ルコース残基の還元性基は、加水分解する結合に関与し 更に別の側面において、本発明は、実施例に記載したア ている）に置換されている場合に、β-D-グルカンの(1 ッセイにより決定するエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ →3)-結合又は(1→4)-結合のエンド加水分解を触媒する 活性を有する酵素に関する。 。(1→3)-β-グルカンエンドヒドロラーゼ、エンド-1,3 【００６３】 -β-グルカナーゼ、及びラミナリーゼという代替名を持 本明細書において、「β−グルカナーゼ」又は「ベータ つグルカンエンド-1,3-β-D-グルコシダーゼは、E.C. 3 -グルカナーゼ」とは、EC 3.2.1.6のエンド-1,3(4)-β- .2.1.39に分類され、例えばラミナリン、パラミロン及 グルカナーゼをさす。Ｃ−３の位置でグルコース残基（ びパキマンのような基質の(1→3)-β-D-グルカンの(1→ グルコース残基の還元性基は、加水分解する結合に関与 3)-β-D-グルコシド結合を加水分解する。 している）に置換されている場合に、β-D-グルカンの( 40 【００６９】 1→3)-結合又は(1→4)-結合のエンド加水分解を触媒す いくつかの側面において、本発明の酵素組成物はアラビ る。本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵 ナナーゼ活性を有するか、又はアラビナナーゼ活性を有 素と組み合わせて用いる好ましいβ-グルカナーゼは、 する更なる酵素を含む。アラビナナーゼは、EC 3.2.1.9 国際公開公報WO2004087889、WO2005059084、WO9414953 9に分類される。系統名は、5-α-L-アラビナン5-α-L- 、WO2007056321、WO9531533、WO08023060、WO200510058 アラビナノヒドロラーゼであるが、アラビナンエンド-1 2、WO9828410、WO9742301、WO2006066582、WO05118769 ,5-α-L-アラビノシダーゼ、及びエンド-1,5-α-L-アラ 、WO2005003319、及びWO10059424に記載されたいずれか ビナナーゼ、エンド-α-1,5-アラバナーゼ、エンド-ア １種のβ-グルカナーゼを含む。 ラバナーゼ、1,5-α-L-アラビナン、及び1,5-α-L-アラ 【００６４】 ビナノヒドロラーゼ等のいくつかの別の名称もある。ア 標準的なアッセイはｐＨ５．０で実施するが、更に、酵 50 ラビナーゼは、(1→5)-アラビナンの(1→5)-α-アラビ ( 11 ) JP 19 2015-527065 A 2015.9.17 20 ノフラノシド結合をエンド加水分解する。アラビナナー で、１分間に、p-ニトロフェニルβ-D-セロビオピラノ ゼは、アラビナンにも作用する。 シドから１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを生じる酵素 【００７０】 の量として定義される。 本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のア 【００７７】 ラビナーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記 いくつかの側面において、本発明の酵素組成物はα-N- 載したアラビナーゼアッセイにより測定する。アッセイ アラビノフラノシダーゼ活性を有するか、又はアラビノ は、ｐＨ３．５及び５０℃で、基質としてサトウダイコ フラノシダーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「α-N ンアラビナンを用いて、実施できる。また、酵素の更に -アラビノフラノシダーゼ」又は「α-N-アラビノフラノ 別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ及び温度 シダーゼ」は、EC 3.2.1.55の酵素をさす。α-N-アラビ の値でアッセイを実施することができる。酵素活性は、 10 ノフラノシダーゼは、α-L-アラビノシドの末端の非還 ５４０ｎｍでの吸光度の単位時間当たりの増加から計算 元性のα-L-アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒 される。 する。 【００７１】 【００７８】 アラビナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ３ ．５及び５０℃）の下で、ΔOD5 4 0 n m .min - 1 本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のア の増加を生 ラビノフラノシダーゼ活性は、「アッセイ」という表題 じる酵素の量（総アッセイ体積に対して標準化したもの で下記に記載したアラビノフラノシダーゼアッセイによ ）として定義される。 り測定する。標準的なアッセイはｐＨ５．０および５０ 【００７２】 ℃で実施するが、更に、酵素の別の特性及び仕様につい いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、β-D て、これと異なるｐＨ値及び温度でアッセイを実施する -グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有するか、又は 20 こともできる。 β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有する更な 【００７９】 る酵素を含む。β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼは α-N-アラビノフラノシダーゼ活性の１単位は、アッセ 、E.C 3.2.1.21の酵素をさす。 イの条件（ｐＨ５．０および５０℃（又は指定された通 【００７３】 り））の下で、１分間に、p-ニトロフェニルα-L-アラ いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、β- ビノフラノシドから１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを キシロシダーゼ活性を有するか、又はβ-キシロシダー 生じる酵素の量として定義される。 ゼ活性を有する更なる酵素を含む。「β-キシロシダー 【００８０】 ゼ」又は「キシラン1,4-β-キシロシダーゼ」は、E.C 3 いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、グル .2.1.37の酵素をさす。β-キシロシダーゼは、(1→4)- カン1,4-β-グルコシダーゼ活性を有するか、又はグル β-D-キシランの加水分解を触媒し、非還元末端から連 30 カン1,4-β-グルコシダーゼ活性を有する更なる酵素を 続するD-キシロース残基を除去する。 含む。「グルカン1,4-β-グルコシダーゼ」又は「グル 【００７４】 カン1,4-β-グルコしダーゼ」は、E.C3.2.1.74の酵素を 本発明のいくつかの側面において、本発明の酵素組成物 さす。グルカン1,4-β-グルコシダーゼは、(1→4)-β-D はセロビオヒドロラーゼ活性を有するか、又はセロビオ -グルカンの(1→4)-結合の加水分解を触媒し、連続した ヒドロラーゼ活性有する更なる酵素を含む。「セロビオ グルコース単位を除去する。 ヒドロラーゼ」又は「セルロース1,4-β-セロビオシダ 【００８１】 ーゼ」は、EC 3.2.1.91の酵素をさす。セルロース1,4- いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、キシ β-セロビオシダーゼは、セルロース及びセロテトラオ ログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ活性を有 ースの1,4-β-D-グルコシド結合の加水分解を触媒して 、鎖の非還元端部からセロビオースを放出する。 するか、又はキシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グル 40 カナーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「キシログル 【００７５】 カン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ」は、E.C3.2.1 本発明の酵素組成物のセロビオヒドロラーゼ活性は、「 .155の酵素をさす。キシログルカン特異的エキソ-β-1, アッセイ」という表題で下記に記載したセロビオヒドロ 4-グルカナーゼは、キシログルカンの(1→4)-β-D-グル ラーゼアッセイにより測定する。標準的なアッセイはｐ コシド結合のエキソ加水分解を触媒する。 Ｈ５．０で実施するが、更に、酵素の別の特性及び仕様 【００８２】 について、これと異なるｐＨ値でアッセイを実施するこ 更なる側面における本発明の酵素及び酵素組成物は、デ ともできる。 ンプン加水分解物を含む水溶液の粘度を減少させること 【００７６】 を含む工程に使用してもよい。 セロビオヒドロラーゼ活性の１単位は、アッセイの条件 【００８３】 （ｐＨ５．０（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）の下 50 本発明の酵素及び酵素組成物は、デンプン加水分解物を ( 12 ) JP 21 2015-527065 A 2015.9.17 22 含む水溶液のろ過を含む工程に使用してもよい。いくつ 【００８９】 かの実施形態においては、デンプン加水分解物を含む水 用語「マッシュ」は、水性のデンプンスラリー（例えば 溶液はビール製造のためのマッシュであり、他の実施形 、破砕した大麦麦芽、破砕した大麦、及び／又は他の付 態においては、デンプン加水分解物を含む水溶液は食品 加原料、又はこれらの組み合わせを含む）で、水と混合 組成物である。 されており、後に、ウォルトとスペントグレイン（モル 【００８４】 ト粕）に分離されるものと理解される。 あるいは、本発明の酵素組成物は、フルーツジュース、 【００９０】 ワイン、穀物加工、燃料アルコール、第１世代又は第２ 用語「マッシュの分離」は、ロイターリング（ロイター 世代のバイオ燃料（例えば、バイオエタノール等）、及 び飲用アルコールの製造に使用してもよい。 式ろ過）又はマッシュろ過等によって、スペントグレイ 10 ン（モルト粕）からウォルトを分離することと理解され 【００８５】 る。 いくつかの実施形態において、第１世代又は第２世代の 【００９１】 バイオ燃料（例えば、バイオエタノール等）は、サトウ 用語「ビールろ過」は、精密ろ過又は膜処理等によって キビ、ジャガイモ、トウモロコシ、小麦ソルガム等の農 、ビール中にまだ存在している酵母細胞及び他の濁り生 業による供給原料から、又はトウモロコシ茎葉、スイッ 成物質を除去する分離工程と理解される。 チグラス若しくは他の植物材料等のセルロース系原料か 【００９２】 ら製造される。いずれの場合も、発酵性糖は、原料から 本発明の酵素調製物（例えば、本発明により調製される 抽出し、微生物によってアルコールへ発酵させる。アル 食品成分の形態における酵素調製物）は、使用、及び／ コールは蒸留し、輸送燃料として使用してもよい。本発 又は適用方法、及び／又は投与方法に応じて、溶液の形 明の酵素組成物は、このバイオ燃料の製造において使用 20 態であっても固体の形態であってもよい。固体形態は、 してもよい。原料からの多糖類の抽出を増強するために 乾燥酵素粉末としての形態、又は粒状酵素としての形態 、多糖類の発酵性糖への分解を促進するために、及び／ とすることができる。 又は、固形分からの液体の分離、流量特性、ポンプ能力 【００９３】 等の加工パラメータを高めるために、酵素複合体を添加 一つの側面において、本発明は、本発明の酵素または酵 してもよい。 素組成物、酵素キャリア、並びに、必要に応じて、安定 【００８６】 剤及び／又は防腐剤を含む酵素組成物調製物を提供する 本発明の工程は、任意のグリスト（粉砕したモルト）の 。 糖化に適用してもよい。本発明によれば、粉砕穀物は、 【００９４】 任意の植物および植物の一部（塊茎、根、茎、葉、及び 本発明の更なる側面において、酵素キャリアは、グリセ 種子を含む）に由来する任意のデンプン及び／又は糖含 30 ロール又は水からなる群から選択される。 有植物原料を含んでもよい。 【００９５】 【００８７】 更なる側面において、本発明の調製物は、安定剤を含む いくつかの実施形態において、グリストは、大麦、小麦 。一つの側面において、安定剤は、無機塩、ポリオール 、ライ麦、オート麦、トウモロコシ、米、ミロ、キビ、 、糖、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され 及びソルガム由来の穀物等の穀物を含む。好ましくは、 る。一つの側面において、安定剤は塩化カリウム等の無 ウォルトのグリストの、少なくとも１０％、又は、より 機塩である。別の側面において、ポリオールは、グリセ 好ましくは少なくとも１５％、更により好ましくは少な ロール、プロピレングリコール、又はソルビトールであ くとも２５％、又は、最も好ましくは少なくとも３５％ る。更に別の側面において、糖は、小分子炭水化物、特 、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少な に、グルコース、フルクトース、及びサッカロース等の くとも９０％、又は１００％（ｗ／ｗ）が、穀物に由来 40 いくつかの甘味性の糖のいずれかである。 する。 【００９６】 【００８８】 更なる側面において、本発明の調製物は防腐剤を含む。 いくつかの実施形態において、グリストは、大麦麦芽等 一つの側面において、防腐剤は、メチルパラベン、プロ のモルトにした穀物を含む。好ましくは、ウォルトのグ ピルパラベン、ベンゾエート、ソルベート、若しくは他 リストの、少なくとも１０％、又は、より好ましくは少 の食品認可された防腐剤、又はこれらの混合物である。 なくとも１５％、更により好ましくは少なくとも２５％ 【００９７】 、又は、最も好ましくは少なくとも３５％、例えば、少 本発明の特定の実施形態 なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％ いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナ 、又は１００％（ｗ／ｗ）が、モルトにした穀物に由来 ーゼ活性を示す本発明の酵素は、必要に応じて任意の１ する。 50 種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、 ( 13 ) JP 23 2015-527065 A 2015.9.17 24 醸造に使用した場合に粘度を顕著に低下させ、マッシュ いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β- 及びビールの分離の改善を促す。 キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１ 【００９８】 種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、 醸造に使用するための望ましいキシラナーゼ特性は、以 異臭形成を低減し、及び／又は異臭の可能性を低減する 下の点のうちの１つ以上を含んでもよい： 。 ａ）酵素基質特異性 【０１０４】 ＷＥ−ＡＸ／ＷＵ−ＡＸ比は粘度に影響を与える。いく 本発明の一つの側面は、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活 つかの実施形態において、この比は、約７．０未満、例 性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号1、配列番号2 えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５． 、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列 ５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満であ 10 番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番 る。 号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列 ｂ）酵素基質選択性 番号25から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％ 酵素による切断が枝分かれ部位にどれくらい近いかで、 の同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性 その機能性に影響を与えると考えられる。 断片を含む。 ｃ）酵素の熱安定性 【０１０５】 糖化中に連続して起こるＡＸの可溶化−熱安定性が重要 別の側面は、エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示 な性質。従って、いくつかの実施形態において、本発明 す酵素に関し、本酵素は、配列番号7、配列番号8、配列 のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、６５ 番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番 ∼７８℃の温度範囲内で熱安定性である。 号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16から選 ｄ）酵素の至適ｐＨ。従って、いくつかの実施形態にお 20 択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有 いて、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む。 酵素は、ｐＨ５．４∼５．６の範囲の至適ｐＨを有する 【０１０６】 。 本発明のいくつかの実施形態において、エンド-1,4-β- ｅ）酵素阻害（例えば、キシラナーゼの既知の重要な因 キシラナーゼ活性を示す酵素は、不溶性アラビノキシラ 子）。 ン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質への活性に 【００９９】 対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への 醸造に使用した場合の前記の粘度の顕著な低下は、同一 活性の比率が、約７．０未満、例えば約６．５未満、例 の条件及び量で使用した既知の酵素又は既知の酵素活性 えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５． の組み合わせを有する対照（Ｕｌｔｒａｆｌｏ（登録商 ０未満、例えば約４．５未満である。 標）Ｍａｘ等）と比較したときの、醸造使用時の粘度の 30 【０１０７】 低下として測定してもよい。 いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、４０∼ 【０１００】 ７０℃の範囲、例えば４５∼６５℃の範囲、例えば５０ いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β- ∼６５℃の範囲、例えば５５∼６５℃の範囲の至適温度 キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１ を有する。 種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、 【０１０８】 醸造に使用した場合にマッシュ及びビールの分離を改善 いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番 する。 号1∼25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と 【０１０１】 少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７ いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β- 、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、 キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１ 40 ９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する、又は 種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、 その任意の機能性断片である。 異臭形成（アラビノキシランの分解に関連する異臭形成 【０１０９】 等）の可能性を低くする。 いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、アミノ 【０１０２】 酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満、例えば３３ いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β- ０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１ ３００未満のアミノ酸、例えば２００∼３５０の範囲、 種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、 例えば２２０∼３４５の範囲のアミノ酸である。 ろ床崩壊（ロイターリングの場合等）の危険性を低下さ 【０１１０】 せる。 いくつかの実施形態において、本発明の前記酵素のアミ 【０１０３】 50 ノ酸配列は、配列番号1∼25から選択されるいずれか１ ( 14 ) JP 25 2015-527065 A 2015.9.17 26 つのアミノ酸配列と比較して少なくとも１、２、３、４ 、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有 する、又はその任意の機能性断片である。 【０１１１】 いくつかの実施形態において、本発明の前記酵素のアミ ノ酸配列は、配列番号1∼25から選択されるいずれか１ つのアミノ酸配列と比較して最大１、２、３、４、５、 ６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、 又はその任意の機能性断片である。 【０１１２】 10 いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番 号1∼25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配 列、又はその任意の機能性断片を含む。 【０１１３】 いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番 号1∼25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配 【０１１８】 列、又はその任意の機能性断片からなる。 いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナ 【０１１４】 ーゼ活性を示す酵素とエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ 本発明の更に重要な側面は、本発明のエンド-1,4-β-キ 活性を示す酵素との組み合わせは、次の表の通りである シラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のβ-グ 20 。 ルカナーゼと組み合わせて含む組成物に関する。いくつ 【０１１９】 かの実施形態において、この１種以上のβ-グルカナー 【表２】 ゼは本発明のβ-グルカナーゼである。 【０１１５】 本発明の更に重要な側面は、本発明のエンド-1,3(4)-β -グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のキ シラナーゼと組み合わせて含む組成物である。いくつか の実施形態において、この１種以上のキシラナーゼは本 発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であ る。いくつかの実施形態において、この１種以上のキシ 30 ラナーゼは、配列番号17及び／又は配列番号18の酵素で ある。いくつかの実施形態において、この１種以上のキ シラナーゼは、配列番号19、配列番号20、配列番号21、 配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び／又は配列 番号25の酵素、又はその任意の機能性断片である。 【０１１６】 【０１２０】 いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナ エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素である第１ ーゼ活性を示す酵素とエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ の酵素の上記の組み合わせのいずれか１つは、エンド-1 活性を示す酵素との組み合わせは、次の表の通りである 。 ,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素のいずれか１つ 40 と組み合わせてもよいと理解されるべきであり、この場 【０１１７】 合の２つの酵素間の比率は、１：１０、２：１０、３： 【表１】 １０、４：１０、５：１０、６：１０、７：１０、８： １０、９：１０、１０：１０、１０：９、１０：８、１ ０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１ ０：２、又は１０：１、例えば１：１０∼１０：１、例 えば２：１０∼１０：２、例えば３：１０∼１０：３、 例えば４：１０∼１０：４、例えば５：１０∼１０：５ 、例えば６：１０∼１０：６、例えば７：１０∼１０： ７、例えば８：１０∼１０：８、又は例えば９：１０∼ 50 １０：９の範囲内である。 ( 15 ) JP 27 2015-527065 A 2015.9.17 28 【０１２１】 配列番号12、配列番号22及び配列番号12、配列番号23及 いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、少な び配列番号12、配列番号24及び配列番号12、配列番号25 くとも２種の酵素の組み合わせを含む。ここで、前記２ 及び配列番号12、配列番号1及び配列番号13、配列番号2 種の酵素は、次の配列からなるリストから選択されるそ 及び配列番号13、配列番号3及び配列番号13、配列番号4 れぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有 及び配列番号13、配列番号5及び配列番号13、配列番号6 するアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はその任意の 及び配列番号13、配列番号17及び配列番号13、配列番号 機能性断片である。 18及び配列番号13、配列番号19及び配列番号13、配列番 配列番号1及び配列番号7、配列番号2及び配列番号7、配 号20及び配列番号13、配列番号21及び配列番号13、配列 列番号3及び配列番号7、配列番号4及び配列番号7、配列 番号22及び配列番号13、配列番号23及び配列番号13、配 番号5及び配列番号7、配列番号6及び配列番号7、配列番 10 列番号24及び配列番号13、配列番号25及び配列番号13、 号17及び配列番号7、配列番号18及び配列番号7、配列番 配列番号1及び配列番号14、配列番号2及び配列番号14、 号19及び配列番号7、配列番号20及び配列番号7、配列番 配列番号3及び配列番号14、配列番号4及び配列番号14、 号21及び配列番号7、配列番号22及び配列番号7、配列番 配列番号5及び配列番号14、配列番号6及び配列番号14、 号23及び配列番号7、配列番号24及び配列番号7、配列番 配列番号17及び配列番号14、配列番号18及び配列番号14 号25及び配列番号7、配列番号1及び配列番号8、配列番 、配列番号19及び配列番号14、配列番号20及び配列番号 号2及び配列番号8、配列番号3及び配列番号8、配列番号 14、配列番号21及び配列番号14、配列番号22及び配列番 4及び配列番号8、配列番号5及び配列番号8、配列番号6 号14、配列番号23及び配列番号14、配列番号24及び配列 及び配列番号8、配列番号17及び配列番号8、配列番号18 番号14、配列番号25及び配列番号14、配列番号1及び配 及び配列番号8、配列番号19及び配列番号8、配列番号20 列番号15、配列番号2及び配列番号15、配列番号3及び配 及び配列番号8、配列番号21及び配列番号8、配列番号22 20 列番号15、配列番号4及び配列番号15、配列番号5及び配 及び配列番号8、配列番号23及び配列番号8、配列番号24 列番号15、配列番号6及び配列番号15、配列番号17及び 及び配列番号8、配列番号25及び配列番号8、配列番号1 配列番号15、配列番号18及び配列番号15、配列番号19及 及び配列番号9、配列番号2及び配列番号9、配列番号3及 び配列番号15、配列番号20及び配列番号15、配列番号21 び配列番号9、配列番号4及び配列番号9、配列番号5及び 及び配列番号15、配列番号22及び配列番号15、配列番号 配列番号9、配列番号6及び配列番号9、配列番号17及び 23及び配列番号15、配列番号24及び配列番号15、配列番 配列番号9、配列番号18及び配列番号9、配列番号19及び 号25及び配列番号15、配列番号1及び配列番号16、配列 配列番号9、配列番号20及び配列番号9、配列番号21及び 番号2及び配列番号16、配列番号3及び配列番号16、配列 配列番号9、配列番号22及び配列番号9、配列番号23及び 番号4及び配列番号16、配列番号5及び配列番号16、配列 配列番号9、配列番号24及び配列番号9、配列番号25及び 番号6及び配列番号16、配列番号17及び配列番号16、配 配列番号9、配列番号1及び配列番号10、配列番号2及び 30 列番号18及び配列番号16、配列番号19及び配列番号16、 配列番号10、配列番号3及び配列番号10、配列番号4及び 配列番号20及び配列番号16、配列番号21及び配列番号16 配列番号10、配列番号5及び配列番号10、配列番号6及び 、配列番号22及び配列番号16、配列番号23及び配列番号 配列番号10、配列番号17及び配列番号10、配列番号18及 16、配列番号24及び配列番号16、並びに、配列番号25及 び配列番号10、配列番号19及び配列番号10、配列番号20 び配列番号16 及び配列番号10、配列番号21及び配列番号10、配列番号 【０１２２】 22及び配列番号10、配列番号23及び配列番号10、配列番 いくつかの実施形態において、エンド-1,3(4)-β-グル 号24及び配列番号10、配列番号25及び配列番号10、配列 カナーゼ活性及びエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性は、 番号1及び配列番号11、配列番号2及び配列番号11、配列 少なくとも２種の異なる酵素、例えば２つの異なる種（ 番号3及び配列番号11、配列番号4及び配列番号11、配列 species）からの少なくとも２種の異なる酵素に由来す 番号5及び配列番号11、配列番号6及び配列番号11、配列 40 る。 番号17及び配列番号11、配列番号18及び配列番号11、配 【０１２３】 列番号19及び配列番号11、配列番号20及び配列番号11、 いくつかの実施形態において、本発明の組成物を醸造用 配列番号21及び配列番号11、配列番号22及び配列番号11 途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する 、配列番号23及び配列番号11、配列番号24及び配列番号 総圧力（合計圧力）は、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４ 11、配列番号25及び配列番号11、配列番号1及び配列番 ５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば 号12、配列番号2及び配列番号12、配列番号3及び配列番 ４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例え 号12、配列番号4及び配列番号12、配列番号5及び配列番 ば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例 号12、配列番号6及び配列番号12、配列番号17及び配列 えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、 番号12、配列番号18及び配列番号12、配列番号19及び配 例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満 列番号12、配列番号20及び配列番号12、配列番号21及び 50 の値に軽減（減少）する。 ( 16 ) JP 29 2015-527065 A 2015.9.17 30 【０１２４】 て使用する配列及び酵素は、シグナルペプチドを有して いくつかの実施形態において、醸造用途においてロイタ いても有していなくてもよい。 ーリングの前に用いる場合、増加する総圧力（合計圧力 【０１２９】 ）は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比 アッセイ 較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１ ＤＮＳ ７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３ 系統名：1,4-(1,3;1,4)-β-D-グルカン4-グルカノヒド 、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、 ロラーゼ ５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６ ＩＵＢ番号：EC 3.2.1.4 ７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３ 【０１３０】 、８５、８７、８９、９１、９３又は９５％軽減（減少 10 原理 ）する。 セルラーゼのアッセイは、β-1,4-グルカンであるカル 【０１２５】 ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の1,4-β-D-グルコ いくつかの実施形態において、本発明の組成物を醸造用 シド結合の酵素的なエンド加水分解に基づく。反応生成 途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間の 物（β-1,4グルカンオリゴサッカリド）は、3,5-ジニト ろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウ ロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基 ォルトのろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１． の増加を比色測定によって、測定した。酵素活性は、グ ５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて、例えば１．７ ルコース当量としての還元性基の濃度と５４０ｎｍでの 倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、例えば１．９倍 吸光度との関係から計算した。 を超えて、例えば２．０倍を超えて、例えば２．１倍を 【０１３１】 超えて、例えば２．２倍を超えて、例えば２．３倍を超 20 アッセイはｐＨ５．０で実施したが、酵素の更に別の特 えて、例えば２．４倍を超えて、例えば２．５倍を超え 性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを て、増加する。 実施することができる。 【０１２６】 【０１３２】 いくつかの実施形態において、５分間のろ過の後に回収 単位の定義 したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性 セルラーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５． は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較 ０（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）下で、１分間に して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７ １μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定 、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、 義される。 ３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５ 【０１３３】 １、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７ 30 材料 、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、 カルボキシメチルセルロース。供給業者：Megazyme Ltd ８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１ . 製品番号：CM-Cellulose 4M １０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７ D-グルコース‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). ０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０ セルラーゼ活性法（ＤＮＳ 製品番号：10117 ＣＭＣ法） M.W.: 180.16 、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、 無水酢酸ナトリウム‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd ( 又は３００％増加する。 BDH). 【０１２７】 酢酸（氷酢酸）‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH) いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、任意 . 製品番号：10001 の１種以上の更なる酵素を含む。いくつかの実施形態に 3,5-ジニトロサリチル酸GPR（3,5-ジニトロ-2-ヒドロキ おいて、１種以上の更なる酵素は、EC 3.2.1.32、EC 3. 40 シ安息香酸）。 2.1.136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ 号：28235 、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L-アラ 水酸化ナトリウムペレット‘AnalaR'。 ビナナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、β- ck Ltd (BDH). キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン1,4- (+)-酒石酸カリウムナトリウム‘AnalaR'。 供給業者 β-グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ-β-1 ：Merck Ltd (BDH). ,4-グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダーゼから 1.5 %(w/v溶液)カルボキシメチルセルロース(CMC)溶液( なるリストから選択される。 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0中)（基質溶液）。 【０１２８】 3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)溶液。 本明細書に記載した配列によって同定され、本発明に従 トリウムペレット及び600 g/Lの(+)-酒石酸カリウムナ って単独で、又は他の酵素若しくは化合物と組み合わせ 50 トリウムを含む緩衝液中に20g/LのDNS 製品番号：10236 M.W.: 82.03 M.W.: 60.05 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10252 製品番 供給業者：Mer M.W.: 40.00 製品番号：10219 M.W.: 282.22 32g/Lの水酸化ナ ( 17 ) JP 2015-527065 31 A 2015.9.17 32 グルコース標準溶液(0.50 mg/ml) 単位の定義 【０１３４】 ラミナリナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ 手順 ５．０及び５０℃（又は指定された通り））下で、１分 酵素組成物をサンプル中に希釈した。また、0、0.125、 間に１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量とし 0.25、0.375、及び0.5 mg/mlのグルコース濃度を用いて て定義される。 、図２に示すグルコース標準曲線を作成した。 【０１４３】 【０１３５】 材料 0.25 mlの酵素溶液を50℃で1.75 mlの基質溶液（1.5% w セルラーゼ活性アッセイに関する上記の材料を参照 /v）と混合した。10分後にDNS溶液を添加することによ り反応を停止させた。この後、95℃で5分間加熱した。 【０１４４】 10 ラミナリン（ラミナリア・ディギタータ（Laminaria di 【０１３６】 gitata）由来）。供給業者：Sigma-Aldrich Co. Ltd. 異なるサンプルの540 nm (OD5 4 0 n m )の光学濃度を測定し 製品番号：L 9634 た。 1.00 %(w/v溶液)ラミナリン溶液（基質溶液 【０１３７】 ナトリウム緩衝液、pH 5.0) 計算 【０１４５】 酵素活性は、図２に示した標準曲線から決定する。 1.75 mlのラミナリン溶液を、50℃で10分間、0.25 mlの 【０１３８】 希釈酵素溶液と混合する。そして、2 mlのDNS溶液を添 活性は次のように計算する： 加することにより反応を停止する。 【０１３９】 【０１４６】 【数１】 20 0.1M酢酸 0、0.125、0.25、0.5、及び0.75 mg/mlのグルコース溶 液を用いて、標準曲線を作成した。 【０１４７】 式中： 光学濃度は、540 nm (OD5 4 0 n m )で測定した。 T = ΔOD5 4 0 n m TEST 【０１４８】 = OD5 4 0 n m TEST - OD5 4 0 n m BLANK 計算 m = 標準曲線の勾配（約1.0） 活性は次のように計算する： c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.02 【０１４９】 )180.16 ≡ グルコースの分子量 【数２】 3 10 ≡ μmolへ変換する A ≡ アッセイ体積（ml） 30 V ≡ 酵素体積（ml） 式中： t ≡ アッセイ時間（分） T = ΔOD5 4 0 n m TEST D = 実際の酵素希釈係数（例えば、1.000gを1リットル = OD5 4 0 n m TEST - OD5 4 0 n m BLANK に希釈する場合はD = 1000） m = 標準曲線の勾配（約1.0） 【０１４０】 c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.03 ラミナリナーゼ（ＤＮＳ ラミナリン法） )180.16 ≡ グルコースの分子量 3 原理 10 ≡ μmolへ変換する ラミナリナーゼによって触媒される反応は、1,3-β-D- A ≡ アッセイ体積（ml） グルカンの1,3-グルコシド結合のエンド加水分解に関す V ≡ 酵素体積（ml） る。基質には、ラミナリン、パラミロン及びパキマンが 40 t ≡ アッセイ時間（分） 含まれる。反応生成物（β-1,3-グルカンオリゴサッカ D = 酵素希釈係数（例えば、1gを1リットルに希釈する リド）は、3,5-ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果 場合はD = 1000） として生じる還元性基の増加を比色測定によって、測定 【０１５０】 する。酵素活性は、グルコース当量としての還元性基の アラビナーゼ 濃度と５４０ｎｍでの吸光度との関係から計算する。 原理 【０１４１】 アラビナーゼ活性のアッセイは、3,5-ジニトロサリチル アッセイはｐＨ５．０及び５０℃で実施したが、酵素の 酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増加を比 更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ及び 色測定により測定することに基づく。酵素活性は、アラ 温度の値で実施することができる。 ビノース当量としての還元性基の濃度と５４０ｎｍでの 【０１４２】 50 アッセイ 吸光度との関係から計算した。 ( 18 ) JP 33 2015-527065 A 2015.9.17 34 【０１５１】 【数３】 アッセイはｐＨ３．５で実施したが、酵素の更に別の特 性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを 実施することができる。 式中： 【０１５２】 T = ΔOD5 4 0 n m TEST 単位の定義 = OD5 4 0 n m TEST - OD5 4 0 n m BLANK アラビナーゼ（アラビナナーゼ（エンド-1,5-α-L-アラ m = 標準曲線の勾配（約1.0） ビナナーゼ））活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.02 ３．５（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）下で、１分 )150.13 ≡ アラビナーゼの分子量 間に１μｍｏｌのアラビノース当量を生じる酵素の量と 10 10 ≡ μmolへ変換する して定義される。 A ≡ アッセイ体積（ml） 【０１５３】 V ≡ 酵素体積（ml） 材料 t ≡ アッセイ時間（分） Megazymeサトウダイコンアラビナン D = 実際の酵素希釈係数（例えば、1.000gを1リットル アラビノースSigma A3131 に希釈する場合はD = 1000） M.W.: 150.1 3 無水酢酸ナトリウム‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd ( 【０１６０】 BDH). アラビノフラノシダーゼ 製品番号：10236 M.W.: 82.03 アッセイ 酢酸（氷酢酸）‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH) α-N-アラビノフラノシダーゼによって触媒される反応 . は、α-L-アラビノシドの非還元性α-L-アラビノフラノ 製品番号：10001 M.W.: 60.05 3,5-ジニトロサリチル酸GPR（3,5-ジニトロ-2-ヒドロキ 20 シド残基における末端結合の加水分解に関する。この酵 シ安息香酸）。 素は、α-L-アラビノフラノシド、(1,3)-結合及び／又 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番 号：28235 は(1,5)-結合を含むα-L-アラビナン、アラビノキシラ 水酸化ナトリウムペレット‘AnalaR'。 ck Ltd (BDH). 製品番号：10252 供給業者：Mer M.W.: 40.00 (+)-酒石酸カリウムナトリウム‘AnalaR'。 ：Merck Ltd (BDH). ン、並びにアラビノガラクタンに作用する。 製品番号：10219 【０１６１】 供給業者 α-N-アラビノフラノシダーゼのアッセイは、p-ニトロ M.W.: 282.22 フェニルα-L-アラビノフラノシドの酵素的加水分解に 1.5 %(w/v溶液)アラビナン溶液(0.1M酢酸ナトリウム緩 基づく。このアッセイは、連続モニタリング法ではなく 衝液、pH3.5中)（基質溶液）。 、２点法である。酵素活性の計算は、インキュベーショ 3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)溶液。 32g/Lの水酸化ナ トリウムペレット及び600 g/Lの(+)-酒石酸カリウムナ ン期間の最初と最後に実施する測定に基づく。反応生成 30 物（p-ニトロフェノール）は、ｐＨ調製後、比色測定に トリウムを含む緩衝液中に20g/LのDNS よって測定する。酵素活性は、p-ニトロフェノールの濃 アラビナーゼ標準溶液(0.50 mg/ml) 度と４００ｎｍでの吸光度との関係から計算する。 【０１５４】 【０１６２】 手順 希釈酵素溶液の調製： 酵素組成物をサンプル中に希釈した。また、0、0.125、 全ての酵素溶液は、粉末または液体の酵素調製物から、 0.25、0.375、及び0.5 mg/mlのアラビナーゼ濃度を用い ガラス器具による蒸留水を用いて調製する。アッセイ希 て、グルコース標準曲線を作成した。 釈誤差は、小さい体積又は重量を大きく希釈する工程を 【０１５５】 避けることによって、最小限にする。酵素希釈を行う場 0.25 mlの酵素溶液を50℃で1.75 mlの基質溶液（1.5% w /v）と混合した。10分後にDNS溶液を添加することによ 合、液体サンプルであっても最初の酵素サンプルの重量 40 を測定すればより正確である。この場合、液体サンプル り反応を停止させた。この後、95℃で5分間加熱した。 の場合には２０℃でその液体の比重を測定することが必 【０１５６】 要である。 異なるサンプルの540 nm (OD5 4 0 n m )の光学濃度を測定し 【０１６３】 た。 アッセイは、連続モニタリング法ではなく、２点法であ 【０１５７】 るので、異なる酵素系及び条件の場合でもインキュベー 計算 ション期間内の直線性を保証することが重要である。基 酵素活性は、標準曲線から決定する。 質濃度、ｐＨ、温度、及びアッセイ時間が標準アッセイ 【０１５８】 条件の下では、アッセイは、ΔOD5 4 0 n m TEST (T) = 0.20 活性は次のように計算する： ∼1.50の範囲内で直線的であることが証明されている。 【０１５９】 50 しかし、好ましくは、ΔOD5 4 0 n m TEST (T) = 0.400∼0.8 ( 19 ) JP 2015-527065 35 A 2015.9.17 36 00の限定した範囲内でアッセイを実施する。 セロビオヒドロラーゼのアッセイは、p-ニトロフェニル 【０１６４】 β-D-セロビオピラノシドの酵素的加水分解に基づく。 手順 反応生成物（p-ニトロフェノール）は、ｐＨ調製後、比 各酵素サンプルアッセイは、３つの分析（２重試験（Ｔ 色測定によって測定する。酵素活性は、p-ニトロフェノ ＥＳＴ）の分析及びブランク（ＢＬＡＮＫ）の分析）を ールの濃度と４００ｎｍでの吸光度との関係から計算す 含む。ここに記載する手順は、単一の酵素サンプルの分 る。 析である。 【０１７２】 【０１６５】 アッセイは、ΔOD5 4 0 n m TEST (T) = 0.400∼0.800の直線 【表３】 的な限定した範囲内で実施する。 10 【０１７３】 手順 各酵素サンプルアッセイは、３つの分析（２重試験（Ｔ 【０１６６】 ＥＳＴ）の分析及びブランク（ＢＬＡＮＫ）の分析）を 0.25 mlの希釈酵素溶液を50℃でこの溶液に添加した。1 含む。ここに記載する手順は、単一の酵素サンプルの分 0分後に4 mlの0.4Mグリシン溶液、pH 10.8（停止試薬） 析である。 を添加することにより反応を停止させた。 【０１７４】 【０１６７】 【表４】 吸光度は、水のブランクに対して、25℃、400 nmで測定 した。 ・測定したTESTの２重試験に対して、OD4 0 0 n m TESTを決 20 定した。 【０１７５】 ・OD4 0 0 n m BLANKを決定した。 0.25 mlの希釈酵素溶液を50℃でこの試験溶液に添加し 【０１６８】 た。30分後に4 mlの0.4Mグリシン溶液、pH 10.8（停止 計算 試薬）をそれぞれの試験管に添加した。 【０１６９】 【０１７６】 【数４】 吸光度は、1cmのガラスキュベット中で、水のブランク に対して、25℃、400 nmで測定した。 ・測定したTESTの２重試験に対して、OD4 0 0 n m TESTを決 定した。 30 ・OD4 0 0 n m BLANKを決定した。 【０１７７】 計算 式中： 【０１７８】 T = OD400nm TEST - OD400nm BLANK 【数５】 18300 = p-ニトロフェノールのモル吸光係数（1 cm経路 長） V = 7.25 （試験における全液体体積（ml）） t = 10（分） 1 u = 1 μmol.min-1 E = 0.25（希釈酵素サンプルの体積（ml）） 40 D =酵素希釈係数（例えば、1 mlを1リットルに希釈する 式中： 場合はD = 1000） T = OD4 0 0 n m TEST - OD4 0 0 n m BLANK 【０１７０】 18300 = p-ニトロフェノールのモル吸光係数（1 cm経路 セロビオヒドロラーゼ アッセイ 長） 原理 V = 7.25 （試験における全液体体積（ml）） セロビオヒドロラーゼによって触媒される反応は、セル 1000 = リットルへ変換する ロース及びセロテトラオースの1,4-β-D-グルコシド結 10 = μmolesへ変換する 合の加水分解に関し、鎖の非還元末端からセロビオース t = 30（分） を放出する。 1 u = 1 μmol.min 【０１７１】 6 - 1 50 E = 0.25（希釈酵素サンプルの体積（ml）） ( 20 ) JP 37 2015-527065 A 2015.9.17 38 D =酵素希釈係数（例えば、1 mlを1リットルに希釈する ８． 場合はD = 1000） 選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して最大 【０１７９】 １、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のア 番号付けした本発明の実施形態： ミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である １． 、実施形態１∼７のいずれか一つに記載の酵素。 エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であ 前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1∼25から って、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、 【０１８７】 配列番号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列 ９． 番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番 るアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む、実 号23、配列番号24、及び配列番号25から選択されるいず 施形態１∼８のいずれか一つに記載の酵素。 れか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配 10 【０１８８】 列、又はその任意の機能性断片を含む酵素。 １０． 【０１８０】 れるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片からなる ２． 、実施形態１又は３のいずれか一つに記載の酵素。 不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラ 配列番号1∼25のいずれか１つによって同定され 配列番号1∼25のいずれか１つによって同定さ ビノキシラン基質への活性に対する可溶性アラビノキシ 【０１８９】 ラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率が、約７．０未 １１． 満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。 約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未 【０１９０】 満である、実施形態１に記載の酵素。 １２． 【０１８１】 換え発現ベクター。 ３． エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素 20 実施形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵素 実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物を含む組み 【０１９１】 であって、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番 １３． 号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号 態１２に記載のベクターで形質転換された細胞。 14、配列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれ 【０１９２】 か１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列 １４． 、又はその機能性断片を含む酵素。 、実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物、実施形態１２に 【０１８２】 記載のベクター、又は実施形態１３に記載の細胞を含む ４． 調製物。 ４０∼７０℃の範囲、例えば４５∼６５℃の範囲 実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物又は実施形 実施形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵素 、例えば５０∼６５℃の範囲、例えば５５∼６５℃の範 【０１９３】 囲の至適温度を有する、実施形態１∼３のいずれか一つ １５． に記載の酵素。 30 実施形態１、２、及び４∼１０のいずれか一つ に記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を 【０１８３】 、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含 ５． む組成物。 配列番号1∼25から選択されるいずれか１つのア ミノ酸配列と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５ 【０１９４】 、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、 １６． ９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を ∼１０のいずれか一つに記載のエンド-1,3(4)-β-グル 有する、又はその任意の機能性断片である、実施形態１ カナーゼ活性を示す酵素である、実施形態１５に記載の ∼４のいずれか一つに記載の酵素。 組成物。 【０１８４】 【０１９５】 ６． １７． アミノ酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満 前記１種以上のβ-グルカナーゼが実施形態３ 実施形態３∼１０のいずれか一つに記載のエン 、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０ 40 ド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の 未満、例えば３００未満のアミノ酸、例えば２００∼３ １種以上のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物。 ５０の範囲、例えば２２０∼３４５の範囲のアミノ酸で 【０１９６】 ある、実施形態１∼５のいずれか一つに記載の酵素。 １８． 【０１８５】 、及び４∼１０のいずれか一つに記載のエンド-1,4-β- ７． キシラナーゼ活性を示す酵素である、実施形態１７に記 前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号1∼25から 前記１種以上のキシラナーゼが実施形態１、２ 選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少な 載の組成物。 くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ 【０１９７】 個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片 １９． である、実施形態１∼６のいずれか一つに記載の酵素。 前記エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性が、少なくとも２ 【０１８６】 50 前記エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及び 種の異なる酵素、例えば２つの異なる種（species）か ( 21 ) JP 2015-527065 39 40 らの少なくとも２種の異なる酵素に由来する、実施形態 配列番号22及び配列番号9、 １５∼１８のいずれか一つに記載の組成物。 配列番号23及び配列番号9、 【０１９８】 配列番号24及び配列番号9、 ２０． 少なくとも２種の酵素の組み合わせを含む実施 配列番号25及び配列番号9、 形態１５∼１９のいずれか一つに記載の組成物であって 配列番号1及び配列番号10、 、前記２種の酵素が、次の配列からなるリストから選択 配列番号2及び配列番号10、 されるそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同 配列番号3及び配列番号10、 一性を有するアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はそ 配列番号4及び配列番号10、 の任意の機能性断片である、組成物。 配列番号1及び配列番号7、 配列番号5及び配列番号10、 10 配列番号6及び配列番号10、 配列番号2及び配列番号7、 配列番号17及び配列番号10、 配列番号3及び配列番号7、 配列番号18及び配列番号10、 配列番号4及び配列番号7、 配列番号19及び配列番号10、 配列番号5及び配列番号7、 配列番号20及び配列番号10、 配列番号6及び配列番号7、 配列番号21及び配列番号10、 配列番号17及び配列番号7、 配列番号22及び配列番号10、 配列番号18及び配列番号7、 配列番号23及び配列番号10、 配列番号19及び配列番号7、 配列番号24及び配列番号10、 配列番号20及び配列番号7、 配列番号25及び配列番号10、 配列番号21及び配列番号7、 20 配列番号1及び配列番号11、 配列番号22及び配列番号7、 配列番号2及び配列番号11、 配列番号23及び配列番号7、 配列番号3及び配列番号11、 配列番号24及び配列番号7、 配列番号4及び配列番号11、 配列番号25及び配列番号7、 配列番号5及び配列番号11、 配列番号1及び配列番号8、 配列番号6及び配列番号11、 配列番号2及び配列番号8、 配列番号17及び配列番号11、 配列番号3及び配列番号8、 配列番号18及び配列番号11、 配列番号4及び配列番号8、 配列番号19及び配列番号11、 配列番号5及び配列番号8、 配列番号20及び配列番号11、 配列番号6及び配列番号8、 30 配列番号21及び配列番号11、 配列番号17及び配列番号8、 配列番号22及び配列番号11、 配列番号18及び配列番号8、 配列番号23及び配列番号11、 配列番号19及び配列番号8、 配列番号24及び配列番号11、 配列番号20及び配列番号8、 配列番号25及び配列番号11、 配列番号21及び配列番号8、 配列番号1及び配列番号12、 配列番号22及び配列番号8、 配列番号2及び配列番号12、 配列番号23及び配列番号8、 配列番号3及び配列番号12、 配列番号24及び配列番号8、 配列番号4及び配列番号12、 配列番号25及び配列番号8、 配列番号1及び配列番号9、 配列番号5及び配列番号12、 40 配列番号6及び配列番号12、 配列番号2及び配列番号9、 配列番号17及び配列番号12、 配列番号3及び配列番号9、 配列番号18及び配列番号12、 配列番号4及び配列番号9、 配列番号19及び配列番号12、 配列番号5及び配列番号9、 配列番号20及び配列番号12、 配列番号6及び配列番号9、 配列番号21及び配列番号12、 配列番号17及び配列番号9、 配列番号22及び配列番号12、 配列番号18及び配列番号9、 配列番号23及び配列番号12、 配列番号19及び配列番号9、 配列番号24及び配列番号12、 配列番号20及び配列番号9、 配列番号25及び配列番号12、 配列番号21及び配列番号9、 50 配列番号1及び配列番号13、 A 2015.9.17 ( 22 ) JP 41 2015-527065 2015.9.17 42 配列番号2及び配列番号13、 配列番号17及び配列番号16、 配列番号3及び配列番号13、 配列番号18及び配列番号16、 配列番号4及び配列番号13、 配列番号19及び配列番号16、 配列番号5及び配列番号13、 配列番号20及び配列番号16、 配列番号6及び配列番号13、 配列番号21及び配列番号16、 配列番号17及び配列番号13、 配列番号22及び配列番号16、 配列番号18及び配列番号13、 配列番号23及び配列番号16、 配列番号19及び配列番号13、 配列番号24及び配列番号16、並びに 配列番号20及び配列番号13、 配列番号21及び配列番号13、 A 配列番号25及び配列番号16 10 【０１９９】 配列番号22及び配列番号13、 ２１． 配列番号23及び配列番号13、 場合、増加する総圧力が、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば 配列番号24及び配列番号13、 ４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例え 配列番号25及び配列番号13、 ば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例 配列番号1及び配列番号14、 えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、 配列番号2及び配列番号14、 例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満 配列番号3及び配列番号14、 、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未 配列番号4及び配列番号14、 満の値に軽減する、実施形態１５∼２０のいずれか一つ 配列番号5及び配列番号14、 に記載の組成物。 配列番号6及び配列番号14、 20 醸造用途においてロイターリングの前に用いる 【０２００】 配列番号17及び配列番号14、 ２２． 配列番号18及び配列番号14、 場合、増加する総圧力が、前記組成物を含まない陰性対 配列番号19及び配列番号14、 照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１ 配列番号20及び配列番号14、 １、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７ 配列番号21及び配列番号14、 、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、 配列番号22及び配列番号14、 ４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６ 配列番号23及び配列番号14、 １、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７ 配列番号24及び配列番号14、 、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３又 配列番号25及び配列番号14、 は９５％軽減する、実施形態１５∼２１のいずれか一つ 配列番号1及び配列番号15、 30 醸造用途においてロイターリングの前に用いる に記載の組成物。 配列番号2及び配列番号15、 【０２０１】 配列番号3及び配列番号15、 ２３． 配列番号4及び配列番号15、 場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によ 配列番号5及び配列番号15、 って測定するウォルトのろ過性は、酵素を含まない対照 配列番号6及び配列番号15、 に対して、１．５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて 配列番号17及び配列番号15、 、例えば１．７倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、 配列番号18及び配列番号15、 例えば１．９倍を超えて、例えば２．０倍を超えて、例 配列番号19及び配列番号15、 えば２．１倍を超えて、例えば２．２倍を超えて、例え 配列番号20及び配列番号15、 配列番号21及び配列番号15、 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる ば２．３倍を超えて、例えば２．４倍を超えて、例えば 40 ２．５倍を超えて増加する、実施形態１５∼２２のいず 配列番号22及び配列番号15、 れか一つに記載の組成物。 配列番号23及び配列番号15、 【０２０２】 配列番号24及び配列番号15、 ２４． 配列番号25及び配列番号15、 場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によ 配列番号1及び配列番号16、 って測定するウォルトのろ過性は、前記組成物を含まな 配列番号2及び配列番号16、 い陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７ 配列番号3及び配列番号16、 、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２ 配列番号4及び配列番号16、 ５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１ 配列番号5及び配列番号16、 、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、 配列番号6及び配列番号16、 50 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる ５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７ ( 23 ) JP 43 2015-527065 A 2015.9.17 44 ５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１ 記載の調製物、又は実施形態１５∼２６のいずれか一つ 、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、 に記載の組成物の使用。 １４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２ 【０２１２】 ００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６ ３４． ０、２７０、２８０、２９０、又は３００％増加する、 バイオ燃料の製造における、実施形態１∼１０のいずれ 実施形態１５∼２３のいずれか一つに記載の組成物。 か一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又 【０２０３】 は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載の組成物の ２５． 使用。 任意の１種以上の更なる酵素を含む、実施形態 １５∼２４のいずれか一つに記載の組成物。 【０２０４】 ２６． バイオエタノール等の第一世代又は第二世代の 【０２１３】 10 前記１種以上の更なる酵素が、EC 3.2.1.32、E ３５． デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であ って、実施形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵素、 C 3.2.1.136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナ 実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５∼２６ ーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L- のいずれか一つに記載の組成物で前記デンプン含有原料 アラビナナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ を処理する工程を含む方法。 、β-キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカ 【０２１４】 ン1,4-β-グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキ ３６． ソ-β-1,4-グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダ 圧力を軽減する方法であって、実施形態１∼１０のいず ーゼからなるリストから選択される、実施形態２５に記 れか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、 載の組成物。 又は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載の組成物 【０２０５】 ２７． 20 食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製 醸造工程においてロイターリング中に増加する で醸造用マッシュを処理する工程を含む方法。 【０２１５】 造における、実施形態１∼１０のいずれか一つに記載の ３７． 酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５ しくはノンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキ 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若 ∼２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。 ーのような穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲 【０２０６】 料製品を製造する方法であって、実施形態１∼１０のい ２８． ドウ製品又はベークド製品の製造における、実 ずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物 施形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態 、又は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載の組成 １４に記載の調製物、又は実施形態１５∼２６のいずれ 物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。 か一つに記載の組成物の使用。 【０２１６】 【０２０７】 ２９． 30 ３８． 醸造用マッシュを製造する方法であって、実施 パルプ又は紙の調製における、実施形態１∼１ 形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１ ０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の ４に記載の調製物、又は実施形態１５∼２６のいずれか 調製物、又は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載 一つに記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程 の組成物の使用。 を含む方法。 【０２０８】 【０２１７】 ３０． ３９． 穀物成分の調製のための、実施形態１∼１０の バイオエタノール等の第一世代又は第二世代の いずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製 バイオ燃料を製造する方法であって、実施形態１∼１０ 物、又は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載の組 のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調 成物の使用。 【０２０９】 ３１． 製物、又は実施形態１５∼２６のいずれか一つに記載の 40 前記穀物がライ麦、小麦、又は大麦である、実 組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。 【０２１８】 施形態２９に記載の使用。 ４０． 【０２１０】 られた製品。 ３２． 【０２１９】 ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変 実施形態３８又は３９に記載の方法によって得 における、実施形態１∼１０のいずれか一つに記載の酵 ４１． 素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５∼ て、前記製品が０．１％∼９９．９％の範囲で含まれる ２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。 ような組成物。 【０２１１】 【実施例】 ３３． 【０２２０】 ワイン又はジュースの製造における、実施形態 １∼１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に 50 実施例１ 実施形態４０に記載の製品を含む組成物であっ ( 24 ) JP 45 2015-527065 A 2015.9.17 46 醸造用途のためのキシラナーゼ／グルカナーゼに関する 【０２２５】 方法及び結果 WU-AXエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性は、１単位（μg 【０２２１】 ペントース/キシラナーゼサンプルg）の定義に当たる、 以下の方法は、醸造において使用するキシラナーゼ及び 上記の条件の下で可溶化したペントースの量（μgペン グルカナーゼをスクリーニングするために使用されてい トース）として定義される。 る。 【０２２６】 【０２２２】 キシラナーゼ活性アッセイ 方法： サンプル（このアッセイにおいておよそOD540 = 0.25∼ 水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナー ゼ法： 0.30が得られるもの）、及びキシロース標準液（0、0.1 10 25、0.250、0.375、及び0.500 mg/ml蒸留水）を蒸留水 サンプル（このアッセイにおいておよそOD540 = 0.25∼ 中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの可溶性小麦ア 0.30が得られるもの）、及びキシロース標準液（0、0.1 ラビノキシラン（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYH, 25、0.250、0.375、及び0.500 mg/ml蒸留水）を蒸留水 Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸 中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの可溶性小麦ア 、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、2 ラビノキシラン（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYH, 50μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。 Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸 蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、2m 、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、2 lのDNS溶液（1%の3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、1.6 50μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。 %の水酸化ナトリウム、30%の酒石酸カリウムナトリウム 蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、2m 、蒸留水中）を酵素−基質溶液及び2.0 mlの標準溶液に lのDNS溶液（1%の3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、1.6 20 添加する。サンプル、ブランク、及び、標準液を添加し %の水酸化ナトリウム、30%の酒石酸カリウムナトリウム たDNSを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入れる。その後 、蒸留水中）を酵素−基質溶液及び2.0 mlの標準溶液に 、サンプル、ブランク及び標準液を、25℃の水浴に20分 添加する。サンプル、ブランク、及び、標準液を添加し 間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全 たDNSを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入れる。その後 てのサンプルの光学濃度をOD540で読み取る。サンプル 、サンプル、ブランク及び標準液を、25℃の水浴に20分 の希釈、試験に使ったサンプルの量、及び標準液に基づ 間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全 いて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することがで てのサンプルの光学濃度をOD540で読み取る。サンプル きる。 の希釈、試験に使ったサンプルの量、及び標準液に基づ 【０２２７】 いて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することがで エンド-1,4-β-キシラナーゼWE-AX活性の１単位は、上 きる。 30 記の条件の下で、1分間に1 μmolのキシロース当量を生 【０２２３】 じる酵素の量として定義される。 エンド-1,4-β-キシラナーゼWE-AX活性の１単位は、上 【０２２８】 記の条件（水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ） グルカナーゼ活性アッセイ キシラナーゼ法）の下で、1分間に1 μmolのキシロース サンプル（このアッセイにおいて標準曲線内にOD540が 当量を生じる酵素の量として定義される。 得られるもの）、及びグルコース標準液（0、0.125、0. 【０２２４】 250、0.500、及び0.750 mg/ml蒸留水）を蒸留水中で調 水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナー 製する。t=0分の時点で、1,75 mlの大麦β-グルカン（1 ゼ法： .5%大麦β-グルカン（P-BGBM, Megazyme, Bray, Irelan サンプルを蒸留水中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの不溶性小麦（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYI, d）、1M酢酸ナトリウム/酢酸、pH 5中）を50℃で試験管 40 に入れる。t=5分の時点で、250μlの酵素溶液を50℃で Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸 基質に添加し、混合する。蒸留水をブランクとして使用 、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、2 する。t=15分の時点で、2mlのDNS溶液（1%の3,5-ジニト 50μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。蒸 ロサリチル酸（DNS）、1.6%の水酸化ナトリウム、30%の 留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、サン 酒石酸カリウムナトリウム、蒸留水中）を酵素−基質溶 プル及びブランクを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入 液及び2.0mlの標準溶液に添加する。サンプル、ブラン れる。その後、サンプル及びブランクを遠心分離し、残 ク、及び、標準液を添加したDNSを、沸騰した水浴（95 存する不溶性基質を沈殿させる。溶液に取り込まれたア ℃）に15分間入れる。その後、サンプル、ブランク及び ラビノキシランの量は、「Rouau, X. 及び Surget, A. 標準液を、25℃の水浴に20分間入れることにより冷却す (1994), Carbohydrate Polymers, 24, 123-132」に記載 る。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度を された方法を用いて決定する。 50 OD5 4 0 で読み取る。サンプルの希釈、試験に使ったサン ( 25 ) JP 47 2015-527065 A 2015.9.17 48 プルの量、及び標準液に基づいて、サンプルのグルカナ した。大麦及びモルトの両方とも、約0.7 mm（∼0.7 mm ーゼ活性を計算することができる。 ）のローラー間隔を用いて２回粉砕した。 【０２２９】 【０２３６】 エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性の１単位は、アッ 初期マッシュ温度53℃を目標にして、マッシングイン（ セイの条件（pH 5.0（又は指定されたｐＨ）及び50℃） マッシュ投入）を行った。マッシングイン（マッシュ投 の下で、１分間に1 molのグルコース当量を生じる酵素 入）後、水：グリスト比率を2.8:1にするためのマッシ の量として定義される。 ュ体積の調製、及びpHを約5.56（∼5.56）にするための 【０２３０】 ｐＨ調製（乳酸）等、少しの調整を行った。マッシュの ラボスケール醸造における使用方法 微調整の後、酵素を添加し、図１の糖化プロファイルを 75:25の比率のピルスナーモルト：大麦を、3:1の水：グ 10 実施した。70℃の糖化休止は15分間にプログラムしたが リスト比率（150ml:50gグリスト）で使用して、ラボス 、ヨウ素試験によりデンプンが存在しないことが示され ケール醸造における使用試験を実施した。最初に、マッ るまで、休止時間を5分間延長した（Ludwig Narziss an シングイン（マッシュ投入）及びｐＨ調製（5.4、2 M H d Werner Back, Technische Universitaet Muenchen (F 2SO4）の前に、水を予熱した。初期温度に復帰した後に akultaet fuer Brauwesen, Weihenstephan), Abriss de （10分間）、糖化プロファイル（マッシングプロファイ r Bierbrauerei. WILEY-VCH Verlags GmbH Weinheim Ge ル）（図１参照）を開始し、酵素を添加する。マッシン rmany, 2005）。 グオフ（糖化終了）後、通常のプラスチック漏斗及びろ 【０２３７】 紙（paper filter No 1, 24 cm直径, Whatman, England 78℃での5分間の休止の後、マッシングオフ（糖化終了 ）を用いて、ウォルトの分離を実施する。ろ過性能及び ）を開始した。事前に「フォルスボトム（疑似底）」の いくつかの他のウォルトのパラメータ（すなわち、粘度 20 真下の高さまで水を入れたロイタータン（ロイター式ろ 、β-グルカン、ペントサン等）を評価した。 過槽）にマッシュを移した。ろ過ケークを形成するため 【０２３１】 、マッシュを5分間休止させた。この後、15分間の再循 ウォルトの濾過を３０分間測定し、その後、ろ過を終了 環（140 L/h）を行い、ろ過ケークの形成とウォルトの した。回収したウォルトは、更なる分析を行う前に、冷 清澄化を確実にした。 却した。 通常、フルスケール醸造では、所定のウォルト濁度が得 【０２３２】 られた時に、ろ過を開始する。しかし、本試験では、15 ろ過 分間、再循環を一定に保ち、各試験間の比較が可能なよ ろ過データは、ブランク（外来性酵素を添加しない醸造 うにした。 ）に対する５、１０、１５、及び２０分後に回収したウ ロイターリング中、時間（分）、回収したウォルトの体 ォルトの体積として記載した。 30 積（L）、ろ過ケーク間のろ過圧力差（mmWC、mm水柱） 【０２３３】 、ポンプ容量（%）、ウォルト濁度（EBC）、及びマッシ パイロットスケール醸造 ュ温度（℃）を含むデータを収集した。 パイロットスケールの醸造設備（2 HL 容量）で試験を 【０２３８】 実施した。ウォルトの分離はロイターリングによって実 ろ過中にろ過ケーク間で増加する圧力は、ウォルトのロ 施し、ビールろ過は水平式珪藻土ろ過によって実施した イターリング性能の基準の設定に寄与する因子であると 。 考えられる。非常に高い圧力差（例えば、ファーストウ 【０２３４】 ォルト（一番麦汁）回収中では250 mmWC、及びロイター 「チャレンジングな」醸造条件の下でグルカナーゼ及び リングの残りについては450 mmWC）に達すると、ろ過ケ キシラナーゼの組み合わせによるろ過の最適化を解明す ークのレーキング（ディープカットとしても知られてい るために、75%のモルト及び25%の大麦を含む混合グリス 40 る）が必要となる。 トを用いて、パイロットスケール醸造試験を実施した。 レーキングは、特別に設計された刃でろ過ケークをゆっ 最初に、水：グリスト比率を2.8:1（糖化開始）に設定 くり切断することにより、ろ過ケークが崩れる、又はろ し、ロイターリングの開始時には3.1:1に増加させた。 過流路の形成を回復させる工程である。ろ過ケークのレ これに比べて、フルスケールの醸造所のロイターリング ーキングの後、6分間の麦汁再循環（流速：120 l/h）を では、水：グリスト比率は、約3.2∼3.8が一般的である 行って、ろ過を継続するためにろ過ケークを水で満たし 。従って、3.1:1の水：グリスト比率という本パイロッ た。ろ過ケークのレーキングは、それをしないと低下し ト試験の設定は、このスケールのチャレンジングな限界 てしまうろ過性能を回復させる（それをしないとウォル であると考えられる。 トの品質が低下する）。圧力により必要となるレーキン 【０２３５】 グを３回目のスパージング（湯添加）開始までに行わな モルト及び大麦は、２本ローラーミルを用いて乾式粉砕 50 かった場合、３回目及び４回目のスパージングの開始時 ( 26 ) JP 49 2015-527065 A 2015.9.17 50 に自動的に行うレーキングを行い、ウォルト分離が終了 【０２４４】 するまでろ過が完全に詰まってしまうことのないように 結果を表２に示す。 した。 【０２４５】 【０２３９】 【表６】 ロイターリングは、表１に示す設定を用いて行った。 【０２４０】 【表５】 【０２４１】 最終のロイターリングの後、スウィートウォルトをマッ シュタンに戻し、加熱して沸騰させ、ホップを添加した 。ホッピングを80分間継続させ、ホッピングの最後にｐ Ｈを5.10± 0.05に調整する。ワールプールを用いてビ ターウォルトからホップを除去し、その後、ウォルトを 約8℃（∼8℃）に冷却した。発酵のために、Fermentis の下面発酵乾燥酵母(サッカロミセス・セレビシエ（Sac 20 charomyces cerevisiae)）W34/70を選択した。酵母を30 分間再水和させ、100 g/HLで投入した。主発酵を10℃で 【０２４６】 5∼6日間保ち、その後、発酵度が得られ、ダイアセチル 【表７】 が80 ppb未満になるまで、15℃で熟成(maturation)させ た。ビールは、1℃、0.7 barで更に2∼3週間貯蔵した後 、ろ過した。 【０２４２】 1.2 μm PP-キャンドルプレート及び珪藻土を用いて、 ビールを水平にろ過した。ろ過装置には8プレートまで 入れることができ、約0.5 m2（∼0.5 m2）の総ろ過面積 30 が得られる。本試験では、3プレートを入れて、130 L/h の流速でろ過を実施し、その結果、6.9 HL/(h・m2)のろ 過速度が得られた。フルスケールの醸造所では、ろ過速 度は、通常、5∼7 HL/(h・m2)に設定される。従って、 本試験の設定は、明らかに、上限であり、醸造工程にお 【０２４７】 ける酵素使用を選択することから得られる潜在的利益を WE-AX酵素活性(U)及びWU-AX酵素活性(U)は、「水抽出可 検証するために、計画的にチャレンジングなビールろ過 能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法」の 条件を選択したものである。ビールろ過中は、ビールろ セクション及び「水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ− 過性能を検証するために、流速(L/h)及び圧力値(P-in及 ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクションで記載したように びP-out)をモニターした。また、ビール品質を評価する 40 測定した。 ために、オリジナルグラビティ(OG)、外観エキス(AE)、 【０２４８】 アルコール体積(ABV)、外観発酵度(ADF)、真正発酵度(R 使用試験において更に試験するために、生化学的スクリ DF)、pH、色、及び苦味等、いくつかのビール分析を実 ーニングの結果に基づいて、可溶性アラビノキシラン対 施した。 不溶性アラビノキシランに関し、適切な活性比を有する 【０２４３】 キシラナーゼを選択した。結果を表３に示す。 結果： 【０２４９】 キシラナーゼ： 【表８】 可溶性基質及び不溶性基質に対する活性、ｐＨ特性、及 び温度特性について、キシラナーゼをスクリーニングし た。 50 ( 27 ) JP 51 2015-527065 A 2015.9.17 52 【０２５５】 グルカナーゼ活性／単位は、前記のグルカナーゼ活性ア 【０２５０】 ッセイで記載したように決定した。 【表９】 【０２５６】 20 使用試験において更に試験するために、生化学的スクリ ーニングの結果に基づいて、適切な特性を有するグルカ ナーゼを選択した。結果を表５に示す。 【０２５７】 【表１１】 【０２５１】 ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性 能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ 液の体積として示される。 【０２５２】 WE-AX酵素活性(U)及びWU-AX酵素活性(U)は、「水抽出可 能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法」の セクション及び「水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ− 40 ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクションで記載したように 【０２５８】 測定した。 ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性 【０２５３】 能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ グルカナーゼ 液の体積として示される。 活性及び温度特性について、グルカナーゼをスクリーニ 【０２５９】 ングした。結果を表４に示す。 キシラナーゼ及びグルカナーゼの個々のスクレーニング 【０２５４】 に基づいて、組み合わせ実験を実施した。結果を表６に 【表１０】 示す。 【０２６０】 50 【表１２】 ( 28 ) JP 53 2015-527065 A 2015.9.17 54 【０２６７】 10 【表１５】 【０２６１】 ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性 能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ 液の体積として示される。 【０２６２】 検証のために、更に、2HLパイロットスケール設備で適 切な組み合わせを試験した。結果を表７及び図３に示す 。 【０２６３】 20 【表１３】 【０２６８】 図３に示した穀物中の水不溶性アラビノキシラン(WU-AX )は、醸造所において、ろ過ケークの安定性と連動して いる。 穀物中のフェルラ酸(FA)の濃度は、その組織に大きく依 存する。その最高濃度は果皮材料中で認められる。一方 、胚乳中の濃度はそれよりもかなり低い。異なる濃度が 報告されている。おおよそ、不溶性繊維で2700 μg/g、 可溶性繊維で185 μg/gの濃度である(Bunzelet al. 200 【０２６４】 30 1, Journal of Sc. of food and agriculture, vol. 81 実施例２ , p. 653-60)。 この実施例は、醸造に使用するキシラナーゼが、高分子 【０２６９】 量可溶性アラビノキシラン(HMWS-AX)及び水抽出可能ア これは、FAが発見されるのは、不溶性繊維(WU-AX)のア ラビノキシラン(WE-AX)に対して、非常に高い選択性を ラビノキシランのキシロース分子２００個中に１個、及 有することを示すために行った。これにより、アラビノ び可溶性繊維(WE-AX)のキシロース分子２５００個中に キシランの限られた量だけが可溶化されると考えられ、 １個であるということを意味する。 その結果、これに関連する異臭の可能性は非常に低減さ 【０２７０】 れる。 キシラナーゼが、遊離フェルラ酸及び4-VG等のビールの 【０２６５】 異臭形成を引き起こすことはよく知られた事実である。 粘度が著しく減少すれば、マッシュ分離及びビール分離 40 【０２７１】 が容易になる。醸造に使用するための望ましいキシラナ 方法 ーゼ特性は、表８の次の点のうちの１つ以上を含んでも 表８及び９に記載した基準に基づいて、DuPont Industr よい： ial Biosciencesの１５種を超えるキシラナーゼを候補 【０２６６】 として選定した。30%未満の大麦を麦芽と組み合わせた 【表１４】 実験室のマッシング（糖化）を用いて、キシラナーゼを スクリーニングした。中でも、マッシュの分離速度、ペ ントサン／アラビノキシランのレベル、及びウォルトの 粘度をモニターした。 我々の仮説を試験し、キシラナーゼの特性を醸造におけ 50 る機能性と連動させるために、いくつかのパイロット醸 ( 29 ) JP 2015-527065 55 A 2015.9.17 56 造プラント試験で、最も良い候補を試験した。選択した ・アラビノキシランの分解に関連する異臭形成の可能性 キシラナーゼの候補の最適使用量を、β−グルカナーゼ が低下 と組み合わせて試験した。 ・キシラナーゼを過剰使用することに寛容性がある 【０２７２】 【０２７９】 結果及び考察： 多くの場合、キシラナーゼは、分離を制御するために、 【０２７３】 β-グルカナーゼと組み合わせて使用することができ、 【表１６】 非常に有利な効果が得られる。 【０２８０】 実施例３： 10 2 HLパイロット醸造試験におけるX3/BglS (AtuXyn3/Bsu GluSともいう)の組み合わせの評価 【０２７４】 【０２８１】 パイロットプラント醸造では、酵素使用量が唯一の変数 材料及び方法： である。WU-AX選択性キシラナーゼ(X1)を使用すると、 実験：酵素： ろ床の崩壊が生じる。WE-AX選択性キシラナーゼの候補 AtuXyn3(X3)/BsuGluS(Bgls)(a)：BglS(バチルス(Bacill （リファレンス、X2, X3）は、増加する圧力を軽減する us)グルカナーゼ)及びX3(アスペルギルス(Aspergillus) （減少させる）。リファレンスは、キシラナーゼ及びβ キシラナーゼ)の組み合わせ；BgLS: 0.50 mgタンパク/k -グルカナーゼのブレンドである。 gグリスト、及び、X3: 1.50 mgタンパク/kgグリスト。 【０２７５】 AtuXyn3(X3)/BsuGluS(Bgls)(b):AtuXyn3(X3)/BsuGluS(B 【表１７】 20 gls)(a)と同様であるが、堅牢性(robustness)を試験す るためにX3使用量を20%増加させる。 【０２８２】 リファレンス：使用量0.20 kg/Tグリストの基準酵素製 品(Ultraflo(登録商標)Max)。 【０２８３】 原料： 【０２７６】 付加原料：大麦 22% w/w。 【表１８】 モルト：ピルスナーモルトChiraz ナーモルトQuench DMG 30 42,6% w/w、ピルス 35,4% 重量/重量(ww)。 【０２８４】 ｐＨの酸調整のために使用した全ての材料、カルシウム 、亜鉛、及び苦味レベルは、食品グレードであり、標準 的な醸造の材料であると考えられる。 【０２８５】 醸造のレシピは、国際的なラガービールのビールスタイ ルを目的とした。 【０２８６】 【０２７７】 ミリング（粉砕）： β-グルカナーゼ(B)と組み合わせて中使用量(X)及び高 使用量(Xh)で使用した場合のWE-AX選択性キシラナーゼ Kunzelの2ローラーパイロットミル。粉砕する原料をロ 40 ーラーに２回通して、4ローラーミルをシミュレートし の最適なブレンド（20%大麦/80%麦芽の場合）。結果は た。 、良好なマッシュ分離性能及びビール分離性能を示し、 【０２８７】 異臭形成及びろ床崩壊の危険性は低い。 モルトグリスト：ミルは、１回目にローラーに通す時は 【０２７８】 1.5 mm、２回目にローラーに通す時は0.7mmで運転した 結論 。 本試験により、マッシング中にWE-AXの選択性が高いキ 【０２８８】 シラナーゼを醸造に使用することが重要であることが証 大麦グリスト：ミルは、１回目にローラーに通す時は1. 明された。得られる利点は次の通りである： 5 mm、２回目にローラーに通す時は0.4mmで運転した。 ・良好なマッシュ分離及びビールろ過性能 【０２８９】 ・ロイターリング時のろ床崩壊の危険性が最小限 50 醸造所 2 HL： ( 30 ) JP 57 2015-527065 A 2015.9.17 58 全ての醸造は、16°プラトー（ Plato）を目標とした190 ビール分析： LウォルトのＨＧＢ（高濃度醸造（High Gravity Brewi GC-MSを用いて、新鮮ビール(fresh beer)を分析した。 ng））インフュージョンマッシング及び標準ロイターリ 【０２９８】 ングに基づいた。固定流量で実施したロイターリング中 GC-MSを用いて、化学的経時プロファイルを決定した。 、差圧を記録した（ロイターリング性能を評価するため 【０２９９】 のパラメータとして使用した）。全ての醸造原料を事前 結果及び所見：マッシング。 に（２４時間前に）粉砕し、水と接触させるまでは密閉 以下の条件でマッシングを実施した： 容器内に保管した。マッシング開始後、最初の３分以内 52℃で10分間（ミルを動かし、15 -20分間のマッシング に、全ての原料をマッシュケトルに投入した。酵素添加 をシミュレート）。 の前に、カルシウム及びpHの調整を行った。52℃休止後 10 65℃で40分間。 に、pH(20℃)を再確認した。72℃で10分後に、ヨウ素試 72℃で30分間。 験が正常であることを確認した。ロイターリングは、78 78℃で10分間。 ℃で実施した。 【０３００】 【０２９０】 温度勾配の工程は、全て１℃で実施した。グラフ表示は ロイターロング性能は、一番麦汁の回収中に、90 l/ H 図７に示す。 の固定流量で評価した。ス 【０３０１】 パージング及び薄いウォルトの回収の間は、流量を110 16°プラトー（ Plato）の醸造を目標とするこのマッシ L/時及び130 L/時に増加させた。 ング計画を用いて、全ての試験を行った。この工程に対 冷却ウォルトについて、化学分析を実施した。 する特記事項はなかった。 【０２９１】 20 【０３０２】 ウォルトの煮沸： 結果及び所見：ロイターリング。 煮沸は、外部加熱機を用いて、4∼5%の蒸発で行った。 ロイターリングは、2hlの醸造所において、150 kg / m ホップ抽出物は、ウォルト沸騰の最初から、最終ビール の負荷で実施した。これは、標 中で20 BUを目標として添加した。 準的な醸造所の操作の代表的なものである。ロイタリン 【０２９２】 グ工程の制御は、平均100リットル/時の固定流量で行っ 発酵 た。初期流速は、90リットル/時であり、薄いウォルト 50L： 2 全ての発酵を50Lのシリンドロコニカルタンク（cylindr の回収中は130リットル/時に増加させる。４回の醸造に iconical tank）で実施した。 ついて、差圧及びヘイズ（haze）のインライン測定を記 発酵は、標準的な操作手順に従って行った。ピッチング 録した。全てのロイターリング及びウォルト回収を約2 6 （酵母添加）は、15 x 10 生酵母細胞 / mlで行った。N 30 時間かけて行った。 ucleo counterを用いて、酵母数及び生存率を計算した 【０３０３】 。 X3/BglS (b)とX3/BglS (a)の試験がロイターリング性能 【０２９３】 が最も良かった試験であると示唆され、その次がX3/Bgl ビール加工： S (a)の試験であり、UF maxの試験は性能が最も悪かっ プレートとフレームのフィルタを一定の圧力で操作した た。 。流量評価は、重量で行った。 【０３０４】 【０２９４】 【表１９】 １枚のフィルタープレートの場合及び３枚のフィルタプ レートの場合からデータを収集した。 【０２９５】 40 醸造終了（Debrewing）： 全てのビールは、国際的なラガービールの基準と考えら れる5.0% ABV (アルコール（体積）（Alcohol By Volum e）)に達した時点で醸造終了とした。 【０２９６】 瓶詰（Bottling）： CO2 を5.0g / Lに調製した。全てのビールサンプルは、M 【０３０５】 cLennon自動充てん機で、シングルエバキュレーション 表中の「差圧」および「一番ウォルトの増加した圧力」 を用いて、33 clの標準ボトルに瓶詰めした。 は、cmWC (cm 水柱)で測定した（それぞれ(cm)及び(cm/ 【０２９７】 50 h)ではない）。 ( 31 ) JP 59 2015-527065 A 2015.9.17 60 【０３０６】 erowのKD7 (20cmx20cm)である。 結果及び所見：煮沸後の麦汁の分析 【０３１３】 冷却麦汁の分析は、各試験で似たような結果である。β １枚又は３枚のフィルタプレートによるろ過のろ過曲線 -グルカンの分析は、サンプル間でわずかな違いがある の全体像は、同じである。１枚のフィルタプレートによ 。 るろ過の記録は、敏感すぎて、実際の比率の違いを示す 【０３０７】 ことができないと考えられる。 【表２０】 【０３１４】 【表２３】 【０３０８】 【０３１５】 【表２１】 結果及び所見：最終ビール(final beer)の分析 試験ビールは、標準的な操作手順（EBC）に従って分析 し、表１８に示す。 【０３１６】 【表２４】 【０３０９】 結果及び所見：発酵 若ビール（green beer）の分析を、表１６に示す。 【０３１０】 【表２２】 【０３１７】 結果及び所見：ストレッカーアルデヒド及び最終ビール 中の「経時マーカー(age markers)」 【０３１１】 新鮮(fresh)ビール及び時間経過した(aged)ビールの両 若ビール（green beer）の分析は、試験間で高い類似性 がある。全ての試験は、比較的低いRDFを有するが、こ 者について、分析を実施した。 40 新鮮ビール及び時間経過したビールの両者について、GC れは、重量／重量(ww)基準で計算して22%の大麦を含む -MSにより、ストレッカーアルデヒド、及び「経時及び 場合に通常見られることである。 加熱マーカー(age and heat markers)」(2-Me-Pr (2-メ 【０３１２】 チルプロパナール)、2-Me-Bu (2-メチルブタナール)、3 結果及び所見：ビールろ過 -Me-Bu (3-メチルブタナール)、フルフラール、メチオ 固定圧力を使用し、プレートとフレームのフィルタを用 ナール、PheAcal (フェニルアセトアルデヒド)、及びT2 いて、ビールサンプルをろ過した。約15 kgの２つの樽 N(トランス-2-ノネナール))を分析した。新鮮ビールの をろ過した。個々の樽のろ過データを表１７に示す。第 分析のデータを表１９に示す。 １の樽は１枚のフィルタシートを用いてろ過し、第２の 【０３１８】 樽は３枚のフィルタシートを用いてろ過した。差圧は常 【表２５】 に0.5 バール(bar)であった。フィルタプレートは、Beg 50 ( 32 ) JP 2015-527065 61 A 2015.9.17 62 。 【０３２５】 配列： AtuXyn3, アスペルギルス・ツビゲンシス (Aspergillus tubigensis) (配列番号1), 302 aa QASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTKNSKTPAIIKADFGALTPENSM KWDATEPSRGQFSFSGSDYLVNFAQSNNKLIRGHTLVWHSQLPSWVQAIT DKNTLIEVMKNHITTVMQHYKGKIYAWDVVNEIFNEDGSLRDSVFYQVIG EDYVRIAFETARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKLTGMVSHVKKWIEAGI 【０３１９】 10 PIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTELDIAGASSTDYV ストレッカーアルデヒド分析の前に、試験ビールを37℃ EVVEACLDQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPAYTAIAN で2週間インキュベートした。 AL 時間経過させたビールサンプルのデータを表２０に示す 【０３２６】 。 TerXyn1, ゲオスミチア・エメルソニ (Geosmithia emer 【０３２０】 sonii) (タレロミセス・エメルソニ (Taleromyces emer 【表２６】 sonii)) (配列番号2) AGLNTAAKAIGLKYFGTATDNPELSDTAYETQLNNTQDFGQLTPANSMKW DATEPEQNVFTFSAGDQIANLAKANGQMLRCHNLVWYNQLPSWVTSGSWT NETLLAAMKNHITNVVTHYKGQCYAWDVVNEALNDDGTYRSNVFYQYIGE 20 AYIPIAFATAAAADPNAKLYYNDYNIEYPGAKATAAQNLVKLVQSYGARI DGVGLQSHFIVGETPSTSSQQQNMAAFTALGVEVAITELDIRMQLPETEA LLTQQATDYQSTVQACANTKGCVGITVWDWTDKYSWVPSTFSGYGDACPW DANYQKKPAYEGILTGLGQTVTSTTYIISPTTSVGTGTTTSSGGSGGTTG VAQHWEQCGGLGWTGPTVCASGYTCTVINEYYSQCL 【０３２７】 【０３２１】 AtuXyn4, アスペルギルス・ツビゲンシス (Aspergillus 表２０のデータは、ストレッカーアルデヒドレベルの予 tubigensis) (配列番号3) 想された増加を示している。フルフラール及びトランス EPIEPRQASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTKNSKTPAIIKADFGAL -2-ノネナールの増加は、予想されたレベルである。 TPENSMKWDATEPSRGQFSFSGSDYLVNFAQSNNKLIRGHTLVWHSQLPS 【０３２２】 30 WVQSITDKNTLIEVMKNHITTVMQHYKGKIYAWDVVNEIFNEDGSLRDSV 結論： FYKVIGEDYVRIAFETARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKLTGMVSHVKK パイロットスケール実験に基づいて、この実験で試験し WIAAGIPIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTELDIAGA たBglS及びX3の比率は、パイロットスケール醸造におい SSTDYVEVVEACLNQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPA て、リファレンスのUltraFlo Maxと同じように良好な、 YTAIANAL あるいはUltraFlo Maxよりもさらに良好な性能であると 【０３２８】 結論付けられる。 AacXyn2, アスペルギルス・アキュリエタス (Aspergill 【０３２３】 us aculeatus) (配列番号4) 300 mg/lのβ-グルカンを含有する麦芽と組み合わせて2 MVGLLSITAALAATVLPNIVSAVGLDQAAVAKGLQYFGTATDNPELTDIP 2%の大麦を含むというチャレンジングな原料を使用した YVTQLNNTADFGQITPGNSMKWDATEPSQGTFTFTKGDVIADLAEGNGQY 点から見て、この結果は驚くべきものである。この性能 40 LRCHTLVWYNQLPSWVTSGTWTNATLTAALKNHITNVVSHYKGKCLHWDV はマッシュ分離の結果において見られるだけでなく、ビ VNEALNDDGTYRTNIFYTTIGEAYIPIAFAAAAAADPDAKLFYNDYNLEY ールろ過においても見られる。BREW2（ペントサンのデ GGAKAASARAIVQLVKNAGAKIDGVGLQAHFSVGTVPSTSSLVSVLQSFT ータ）の場合に細胞壁材料の可溶化が低いことから、味 ALGVEVAYTEADVRILLPTTATTLAQQSSDFQALVQSCVQTTGCVGFTIW の悪さ及び安定性に関する品質問題を引き起こす可能性 DWTDKYSWVPSTFSGYGAALPWDENLVKKPAYNGLLAGMGVTVTTTTTTT のある細胞壁材料はより低レベルであると言える。 TATATGKTTTTTTGATSTGTTAAHWGQCGGLNWSGPTACATGYTCTYVND 【０３２４】 YYSQCL 更に、X3/Bgls (b)ではキシラナーゼ成分の使用量が20% 【０３２９】 増加されているにもかかわらず、評価パラメータのいず TreXyn3, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese れにも影響を与えず、このことから、X3/Bgls (a)は堅 i) (配列番号5) 牢な(robust)酵素の組み合わせであることが示唆される 50 MKANVILCLLAPLVAALPTETIHLDPELAALRANLTERTADLWDRQASQS ( 33 ) JP 63 2015-527065 A 2015.9.17 64 IDQLIKRKGKLYFGTATDRGLLQREKNAAIIQADLGQVTPENSMKWQSLE SISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQ NNQGQLNWGDADYLVNFAQQNGKSIRGHTLIWHSQLPAWVNNINNADTLR LASKYASQSRVWFGIMNEPHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISL QVIRTHVSTVVGRYKGKIRAWDVVNEIFNEDGTLRSSVFSRLLGEEFVSI PGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHA AFRAARDADPSARLYINDYNLDRANYGKVNGLKTYVSKWISQGVPIDGIG ECTTNNIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLN SQSHLSGGGGSGTLGALQQLATVPVTELAITELDIQGAPTTDYTQVVQAC QNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK LSVSKCVGITVWGISDKDSWRASTNPLLFDANFNPKPAYNSIVGILQ 【０３３５】 【０３３０】 TreGlu3, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese TreXyn5, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese i) (配列番号11) i) (配列番号6) QTSCDQWATFTGNGYTVSNNLWGASAGSGFGCVTAVSLSGGASWHADWQW QCIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYCNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKG 10 SGGQNNVKSYQNSQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDL WQPGTKNRVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPST FTAANPNHVTYSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGY GATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSV NGAMQVYSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTE NTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVSD PFTGSGTLNVASWTASIN 【０３３１】 【０３３６】 BsuGluS, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) TreGlu4, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese (配列番号7), 214 aa i) (配列番号12) QTGGSFFDPFNGYNSGFWQKADGYSNGNMFNCTWRANNVSMTSLGEMRLA HGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIVVGWTAADLDNGFVSPDAYQ LTSPAYNKFDCGENRSVQTYGYGLYEVRMKPAKNTGIVSSFFTYTGPTDG NPDIICHKNATNAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGD TPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNYYTNGAGNHEKIVDLGFDAANAYHTYAFD CETVDKTTLEFFKIDGVGLLSGGDPGTWASDVLISNNNTWVVKIPDNLAP WQPNSIKWYVDGQLKHTATNQIPTTPGKIMMNLWNGTGVDEWLGSYNGVN 20 GNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVSGSGSLQPSGVLGTDLYH PLYAHYDWVRYTKK ATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTVVSGLPTSVAQGSSAATATASATVPGG 【０３３２】 GSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYS TerGlu1, ゲオスミチア・エメルソニ (Geosmithia emer GPTRCAPPATCSTNPYYAQCLN sonii) (タレロミセス・エメルソニ (Taleromyces emer 【０３３７】 sonii)) (配列番号8) TreGlu6, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese APVKEKGIKKRASPFQWFGSNESGAEFGNNNIPGVEGTDYTFPNTSAIQI i) (配列番号13) LIDQGMNIFRVPFLMERMVPNQMTGPVDSAYFQGYSQVINYITSHGASAV AFSWKNVKLGGGGGFVPGIIFHPKTKGVAYARTDIGGLYRLNADDSWTAV IDPHNFGRYYNNIISSPSDFQTFWHTIASNFADNDNVIFDTNNEYHDMDE TDGIADNAGWHNWGIDAVALDPQDDQKVYAAVGMYTNSWDPSNGAIIRSS SLVVQLNQAAIDGIRAAGATSQYIFVEGNSWTGAWTWTQVNDAMANLTDP DRGATWSFTNLPFKVGGNMPGRGAGERLAVDPANSNIIYFGARSGNGLWK QNKIVYEMHQYLDSDGSGTSDQCVNSTIGQDRVESATAWLKQNGKKAILG 30 STDGGVTFSKVSSFTATGTYIPDPSDSNGYNSDKQGLMWVTFDSTSSTTG EYAGGANSVCETAVTGMLDYLANNTDVWTGAIWWAAGPWWGDYIFSMEPP GATSRIFVGTADNITASVYVSTNAGSTWSAVPGQPGKYFPHKAKLQPAEK SGIAYEQVLPLLQPYL ALYLTYSWWPDAQLFRSTDSGTTWSPIWAWASYPTETYYYSISTPKAPWI 【０３３３】 KNNFIDVTSESPSDGLIKRLGWMIESLEIDPTDSNHWLYGTGMTIFGGHD BsuGlu103FULL, バチルス・スブチリス (Bacillus subt LTNWDTRHNVSIQSLADGIEEFSVQDLASAPGGSELLAAVGDDNGFTFAS ilis) (配列番号9) RNDLGTSPQTVWATPTWATSTSVDYAGNSVKSVVRVGNTAGTQQVAISSD DDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMK GGATWSIDYAADTSMNGGTVAYSADGDTILWSTASSGVQRSQFQGSFASV WLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDW SSLPAGAVIASDKKTNSVFYAGSGSTFYVSKDTGSSFTRGPKLGSAGTIR HILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQ DIAAHPTTAGTLYVSTDVGIFRSTDSGTTFGQVSTALTNTYQIALGVGSG IKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFH SNWNLYAFGTGPSGARLYASGDSGASWTDIQGSQGFGSIDSTKVAGSGST FYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWID 40 AGQVYVGTNGRGVFYAQGTVGGGTGGTSSSTKQSSSSTSSASSSTTLRSS FMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKI VVSTTRASTVTSSRTSSAAGPTGSGVAGHYAQCGGIGWTGPTQCVAPYVC RESASIPPSDPTPPSDPGEPDPGEPDPTPPSDPGEYPAWDSNQIYTNEIV QKQNDYYYQCV YHNGQLWQAKWWTQNQEPGDPYGPWEPLKSDPDSGEPDPTPPSDPGEYPA 【０３３８】 WDSNQIYTNEIVYHNGQLWQAKWWTQNQEPGDPYGPWEPLN TreGlu7, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese 【０３３４】 i) (配列番号14) TreGlu2, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese HGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGWYAEDLDLGFISPD i) (配列番号10) QYTTPDIVCHKNAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYVVE QQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTITTSTRPPS CSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAGINYNTQVWAQQDLINQGNKWTVKIPSSL GPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPP RPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIAVTGSGTKALPAGTPATQ LKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNDDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDST 50 LYKPTDPGILFNPYTTITSYTIPGPALWQG ( 34 ) JP 65 2015-527065 A 2015.9.17 66 【０３３９】 TlaXyn1, サーモミセス・ラヌギノサス (THERMOMYCES L TreGlu8, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reese ANUGINOSUS) (配列番号20), 225 AA i) (配列番号15) AFPAGNATELEKRQTTPNSEGWHDGYYYSWWSDGGAQATYTNLEGGTYEI GKIKYLGVAIPGIDFGCDIDGSCPTDTSSVPLLSYKGGDGAGQMKHFAED SWGDGGNLVGGKGWNPGLNARAIHFEGVYQPNGNSYLAVYGWTRNPLVEY DGLNVFRISATWQFVLNNTVDGKLDELNWGSYNKVVNACLETGAYCMIDM YIVENFGTYDPSSGATDLGTVECDGSIYRLGKTTRVNAPSIDGTQTFDQY HNFARYNGGIIGQGGVSDDIFVDLWVQIAKYYEDNDKIIFGLMNEPHDLD WSVRQDKRTSGTVQTGCHFDAWARAGLNVNGDHYYQIVATEGYFSSGYAR IEIWAQTCQKVVTAIRKAGATSQMILLPGTNFASVETYVSTGSAEALGKI ITVADVG MVGFTPVALAALAATGAL TNPDGSTDLLYFDVHKYLDINNSGSHAECTTDNVDAFNDFADWLRQNKRQ 【０３４５】 AIISETGASMEPSCMTAFCAQNKAISENSDVYIGFVGWGAGSFDTSYILT TauXyn1, サーモアスカス・オーランティアカス (THERM LTPLGKPGNYTDNKLMNECILDQFTLDEKYRPTPTSISTAAEETATATAT 10 OASCUS AURANTIACUS); 310 AA (配列番号21), SDGDAPSTTKPIFREETASPTPNAVTKPSPDTSDSSDDDKDSAASMSAQG SPILEERQAAQSVDQLIKARGKVYFGVATDQNRLTTGKNAAIIQADFGQV LTGTVLFTVAALGYMLVAF TPENSMKWDATEPSQGNFNFAGADYLVNWAQQNGKLIRGHTLVWHSQLPS 【０３４０】 WVSSITDKNTLTNVMKNHITTLMTRYKGKIRAWDVVNEAFNEDGSLRQTV BsuGluC CBD, バチルス・スブチリス (Bacillus subtil FLNVIGEDYIPIAFQTARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKTQAIVNRVKQ is) (配列番号16) WRAAGVPIDGIGSQTHLSAGQGAGVLQALPLLASAGTPEVAITELDVAGA MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLV SPTDYVNVVNACLNVQSCVGITVWGVADPDSWRASTTPLLFDGNFNPKPA NRDGKAVQLKGISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADG YNAIVQDLQQ GYIDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIIDWHILNDGNPNQNKEKAKEFFK 【０３４６】 EMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNII SthXyn1, Ｓ．サーモビオラセウス (S. THERMOVIOLACEU IVGTGTWSQDVNDAADDQLKDANVMYALHFYAGTHGQFLRDKANYALSKG 20 S) (配列番号22), 295 AA APIFVTEWGTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISWVNWNLSDKQESS DTITSNQTGTHNGYFYSFWTDAPGTVTMNTGAGGNYSTQWSNTGNFVAGK SALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQ GWATGGRRTVTYSGTFNPSGNAYLALYGWSQNPLVEYYIVDNWGTYRPTG ENGISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTVDLKDVTARYWYKAKNK TYKGTVDSDGGTYDIYMTTRYNAPSIEGTKTFNQYWSVRQNKRTGGTITT GQNFDCDYAQIGCGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTG GNHFDAWAAHGMPLGTFNYMILATEGYQSSGSSNITVGDSGGDNGGGGGG NIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN GGGGGNTGGCTATLSAGEQWSDRYNLNVSVSGSDNWTVTMRVPAPEKVMA 【０３４１】 TWNVTASYPDAQTLVARPNGNGNNWGVTIQKNGSTTWPTVSCSVG BsuXyn3, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) 【０３４７】 キシラナーゼ変異体 (配列番号17) TfuXyn1, サーモビフィダ・フスカ (THERMOBIFIDA FUSC ASTDYWQNWTFGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPFRT A) (配列番号23), 296 AA INYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGTVKS 30 AVTSNETGYHDGYFYSFWTDAPGTVSMELGPGGNYSTSWRNTGNFVAGKG DGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDDTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHV WATGGRRTVTYSASFNPSGNAYLTLYGWTRNPLVEYYIVESWGTYRPTGT NAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQSSGSSNVTVW YMGTVTTDGGTYDIYKTTRYNAPSIEGTRTFDQYWSVRQSKRTSGTITAG 【０３４２】 NHFDAWARHGMHLGTHDYMIMATEGYQSSGSSNVTLGTSGGGNPGGGNPP BsuXyn4, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) GGGNPPGGGGCTATLSAGQQWNDRYNLNVNVSGSNNWTVTVNVPWPARII キシラナーゼ変異体 (配列番号18) ATWNIHASYPDSQTLVARPNGNGNNWGMTIMHNGNWTWPTVSCSAN ASTDYWQNWTDGYGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPFRT 【０３４８】 INYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGTVYS FoxXyn2*, フザリウム・オキシスポルム (FUSARIUM OXY DGGWYDIYTATRDNAPSIDGDFTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHV SPORUM) (配列番号24) NAWRSHGMDLGSNWAYQVMATEGYLSSGSSNVTVW 【０３４３】 MKLSSFLYTASLVAAIPTAIEPRQASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLL 40 GVAKDTAIIKADFGAVTPENSMKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNG ApuXyn1, オウレオバシディウム・プルランス (AUREOBA LKVRGHTVVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNVVGRYKGKIYAWD SIDIUM PULLULANS) (配列番号19), 343 AA VVNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYS TPTDYSTSSYSKNQGLAQAWTSKGRQYIGTALTIRDDPVEQGIIQSRTDF LDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTA NSITPENAMKWESTEPQRNNFTFAGADAVADFADRYNKEMRCHTLVWHSQ LANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNS LPAWVSQGNFDNKTLISIMENHIKKVAGRYKNKCTHWDVVNEALNEDGTY WRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAVVNALR RSSVFYNTIGEAFIPIAFRFAEKYAGSKTKLYYNDYNLEYGSAKALGAQR 【０３４９】 ILKLVQSYGVQIDGVGLQAHLSSEATASTGGGVTPDVQTLTNVLKLYTDL FveXyn4*, フザリウム・バーティシリオイデス (FUSARI GVEVAYTELDVRFTTPATDAKLKAQADAYARVVQSCINVKRCVGITVWGV UM VERTICILLOIDES) (配列番号25) SDKYSWIPGVFPTEGAALLWDENFNKKPAYSSVLKTIQSFRKS QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGK 【０３４４】 50 WDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNIND ( 35 ) JP 67 2015-527065 A 2015.9.17 68 KATLTKVIENHVTQVVGRYKGKIYAWDVVNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFG YATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAV NDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQ VNALR GVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPAND 【図１】 【図４】 【図５】 【図２】 【図６】 【図３】 【図７】 ( 36 ) 【配列表】 2015527065000001.app JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 37 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ───────────────────────────────────────────────────── 【手続補正書】 【請求項９】 【提出日】平成27年7月24日(2015.7.24) 食品製品、飼料製品、若しくはモルト飲料製品の製造に 【手続補正１】 おける、又はドウ製品若しくはベークド製品の製造にお 【補正対象書類名】特許請求の範囲 ける、又はパルプ若しくは紙の調製における、又はライ 【補正対象項目名】全文 麦、小麦、若しくは大麦等の穀物成分の調製のための、 【補正方法】変更 又はビールの製造若しくは醸造工程からの副産物の改変 【補正の内容】 における、又はワイン若しくはジュースの製造における 【特許請求の範囲】 、又はバイオエタノール等の第一世代若しくは第二世代 【請求項１】 のバイオ燃料の製造における、請求項１若しくは２に記 エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、 載の酵素、請求項５に記載の調製物、又は請求項６∼８ 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番 のいずれか一項に記載の組成物の使用。 号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19 【請求項１０】 、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、 デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、請 配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１ 求項１若しくは２に記載の酵素、請求項５に記載の調製 つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又 物、又は請求項６∼８のいずれか一項に記載の組成物で はその任意の機能性断片を含む酵素。 前記デンプン含有原料を処理する工程を含む方法。 【請求項２】 【請求項１１】 エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であっ 醸造工程においてロイターリング中に増加する圧力を軽 て、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、 減する方法であって、請求項１若しくは２に記載の酵素 配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配 、請求項５に記載の調製物、又は請求項６∼８のいずれ 列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つ か一項に記載の組成物で醸造用マッシュを処理する工程 と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又は を含む方法。 その機能性断片を含む酵素。 【請求項１２】 【請求項３】 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノ ＤＮＡ構築物を含む組み換え発現ベクターであって、前 ンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのよう 記ＤＮＡ構築物が請求項１又は２に記載の酵素をコード な穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を するＤＮＡ配列を含む、組み換え発現ベクター。 製造する方法であって、請求項１若しくは２に記載の酵 【請求項４】 素、請求項５に記載の調製物、又は請求項６∼８のいず 請求項３に記載のベクターで形質転換された細胞。 れか一項に記載の組成物でデンプン含有原料を処理する 【請求項５】 工程を含む方法。 請求項１若しくは２に記載の酵素、請求項３に記載のベ 【請求項１３】 クター、又は請求項４に記載の細胞を含む調製物。 醸造用マッシュを製造する方法であって、請求項１若し 【請求項６】 くは２に記載の酵素、請求項５に記載の調製物、又は請 請求項１に記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示 求項６∼８のいずれか一項に記載の組成物でデンプン含 す酵素を、任意の１種以上のβ-グルカナーゼ、例えば 有原料を処理する工程を含む方法。 請求項２に記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性 【請求項１４】 を示す酵素、と組み合わせて含む組成物。 バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃 【請求項７】 料を製造する方法であって、請求項１若しくは２に記載 請求項２に記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性 の酵素、請求項５に記載の調製物、又は請求項６∼８の を示す酵素を、任意の１種以上のキシラナーゼ、例えば いずれか一項に記載の組成物でデンプン含有原料を処理 請求項１に記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示 する工程を含む方法。 す酵素、と組み合わせて含む組成物。 【請求項１５】 【請求項８】 請求項１３又は１４に記載の方法によって得られた製品 前記エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及び前記エン 。 ド-1,4-β-キシラナーゼ活性が、少なくとも２種の異な 【請求項１６】 る酵素、例えば２つの異なる種（species）からの少な 請求項１５に記載の製品を含む組成物であって、前記製 くとも２種の異なる酵素、に由来する、請求項６又は７ 品が０．１％∼９９．９％の範囲で含まれるような組成 に記載の組成物。 物。 ( 38 ) 【国際調査報告】 JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 39 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 40 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 41 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 42 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ( 43 ) JP 2015-527065 A 2015.9.17 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｎ 9/24 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 9/24 ４Ｂ０５０ Ｃ１２Ｎ 9/00 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 9/00 ４Ｂ０６４ Ｃ１２Ｐ 7/06 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 7/06 ４Ｂ０６５ Ｃ１２Ｐ 19/14 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 19/14 Ａ２１Ｄ 2/26 (2006.01) Ａ２１Ｄ 2/26 Ａ２１Ｄ 13/00 (2006.01) Ａ２１Ｄ 13/00 Ａ２３Ｌ 1/10 (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/10 Ｈ Ａ２３Ｌ 2/00 (2006.01) Ａ２３Ｌ 2/00 Ａ Ａ２３Ｌ 2/02 (2006.01) Ａ２３Ｌ 2/02 Ａ２３Ｌ 1/00 (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/00 Ｃ１２Ｇ 1/00 (2006.01) Ｃ１２Ｇ 1/00 Ｃ１２Ｃ 5/00 (2006.01) Ｃ１２Ｃ 5/00 Ｃ１２Ｃ 7/00 (2006.01) Ｃ１２Ｃ 7/00 Ｃ１２Ｇ 3/02 (2006.01) Ｃ１２Ｇ 3/02 Ｃ１２Ｇ 3/12 (2006.01) Ｃ１２Ｇ 3/12 Ａ２３Ｋ 1/165 (2006.01) Ａ２３Ｋ 1/165 Ｃ１０Ｌ 1/02 (2006.01) Ｃ１０Ｌ 1/02 (81)指定国 １０１ ４Ｂ０３５ Ｚ ４Ｂ１１５ ４Ｈ０１３ Ｊ AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,T M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,R S,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB, BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,H U,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI ,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US, UZ,VC,VN (74)代理人 100123892 弁理士 (74)代理人 内藤 弁理士 (74)代理人 今井 小原 正信 100185535 弁理士 (72)発明者 千裕 100131082 弁理士 (74)代理人 忠雄 100169993 逢坂 敦 ソレンセン、ジェンス・フリスバック デンマーク王国、オーフス (72)発明者 ディーケー―８２００、ノードフェストパッサーゲン ミラー、ローン・ブロンド デンマーク王国、フィビー・ジェイ (72)発明者 ディング ２０ ２００４４４、ボーシャン・ディストリクト、スイート １３、チェンイン・ロード ２７０２、ビル ６５５ ユ、チェヨン 中華人民共和国、上海 ング (72)発明者 ディーケー―８２６０、ブローソンズフェィ チャン、ジェンホン 中華人民共和国、上海 (72)発明者 ９３ ２００４３４、ホンコー・ディストリクト、スイート １７、グゥワンギュ・ロード フー、リン １５０ ５０１、ビルディ ( 44 ) 中華人民共和国、上海 ング JP 2015-527065 ２０１１０２、ミンハン・ディストリクト、スイート ５８、グダイ・ロード Ｆターム(参考) 2B150 BA01 BB03 CE01 4B017 LK23 LP06 4B023 LK17 LP20 4B024 AA05 BA12 4B032 DK51 DP08 4B035 LC16 LG51 LP41 4B050 CC03 CC08 4B064 AC03 CA21 4B065 AB01 4B115 AG17 4H013 BA01 BA02 １１９９ CE02 CE04 DF11 DD01 DD02 DD03 LL02 CB07 CC01 CD22 DA16 AC14 CA31 CA41 CA42 CA54 NB02 NG14 NP01 CA02 LL05 LL10 A 2015.9.17 ５０１、ビルディ