デキストラン化学修飾による L αーグリセロ ホスフェート

九大農学芸誌 (
S
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.B
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ll
.F
a
c
.A
g
r
.，
区y
u
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h
uU
n
i
v
.
)
第4
8
巻 第1
・
2
号 3
5
4
0 (
1
9
9
3
)
デキストラン化学修飾による L αーグリセロ
ホスフェートオキシダーゼの安定化
清*・田中
松本
孝・筏島
豊
九州大学農学部食品分析学教室
(
19
9
3年 7月 3
0日受理)
S
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a
b
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l
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fL-αGlycerophosphateOxidase
byChemicalM
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hDextran
K
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iMATSUMOTO，TakashiTANAKA
andYutakaOSAJIMA
Laboratoryo
fFoodA
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KyushuU
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y4
6
0
9，Fukuoka8
1
2
緒
安定性を現状より高めることは酵素試薬の生産，流通
主主
仁
コ
段階でのコストダウンにつながり，そのメリットは大
酵素は温和な条件で触媒作用を示し，優れた反応選
きいものと考えられる.そこで，本酵素の化学修飾に
択性を有することから，食品及び化学工業でのバイオ
よる安定化を試みた.
リアクターをはじめ，分析，医療など多方面に渡って
一般に，熱安定性と長期安定性はパラレルな関係に
利用されている.しかしながら，酵素は安定性に欠け
あるといわれている.また，これまでに熱による酵素
るという致命的な欠陥を有するため，その利用には自
の失活は，酵素コンホーメーションにおけるアンホー
ずと限界がある.したがって，酵素の安定化がより広
ルディングによって起こることが知られている
範な利用への鍵を握っていると思われる.酵素の安定
(
K
l
i
v
a
n
o
v，1
9
7
9，1
9
8
3
)
. 一方，ポリオールの添加に
化を図る手段としては，大きく分けて二つの方法が考
よる蛋白質の安定化効果は，遊離酵素系に関して多く
えられる.一つは，まず好熱性微生物の検索を行い，
の興味ある知見を与えている(月向， 1
9
8
5
)
. そこで，
次に遺伝子操作などによる耐熱性遺伝子の発現などを
酵素分子表面にポリオール構造を導入すると同時に分
行う生物学的手段であり，もう一つは，化学的手段に
子内架橋を施すことにより酵素の安定化が期待される.
よって，酵素蛋白質を修飾しその安定性の向上を追求
本研究ではポリオール構造を有する高分子としてデキ
デキストラン複合体 (
L
e
n
d
.
9
7
6
)
. 生物学的手段
していく方法である(大島ら， 1
ストランを用い，酵素
による耐熱性酵素の開発例はすでにいくつか報告され
e
r
se
ta
l
.，1
9
8
5
) を調製し，その特性を評価した.
ているが，その数は現在のところ使用されている酵素
材料及び方法
数に対して少数に限られている.したがって，化学的
試薬
手段による酵素の安定化が相捕的手段として開発され
L- aー グ リ セ ロ ホ ス フ ェ ー ト オ キ シ ダ ー ゼ
る必要がある. L-a-グリセロホスフェートオキシダー
.1
.3
.2
1，A
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d
a
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s由来)
(GPO，EC 1
ゼ、(Ja
c
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s and VanDemark，1
9
6
0
東洋醸造(現旭化成工業)製を用いた.デキストラン
K
o
d
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.
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k
and Umbreit，1
9
6
9
) はトリグリセリドキットなど臨
は Sigma社 製 (
D
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x
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a
n T70)， 水 素 化 シ ア ノ ホ ウ
床用酵素試薬として広く応用されている.この酵素の
素ナトリウムはナカライテスク社製を用いた.その他
の試薬は特級試薬をそのまま用いた.
3
0
0， 恒 温 槽
装置:分光光度計は島津製作所製 UVはC
o
l
o
r
a社の CryothermostatEK5型を使用した.
*食品管理学研究室，
L
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活 性 測 定 法 :4ア ミ ノ ア ン チ ピ リ ン 1
3
5
3
6
松本
清・田中
ノ ー ル (5%) 0
.
2
m
l，DLーグリセロー3ーリン酸1.95g，
54U/mg) 4.63mgを混合し，
ペルオキシダーゼ (
孝・筏島
豊
法により行った.
熱安定性試験:調製修飾酵素標品 (GPO-Dextran
0.05% (W/V) トリトン X-100を含む 40mM トリス
G
l
y
) をそれぞれ一定量試験管に取り， 5
0'Cの恒温槽
.
0
) を用いて 50mlに定容し，反応、
塩酸緩衝液 (pH8
7
中で一定時間加熱処理した後，氷冷した.その後， 3
混合液を調製した.試験管に酵素溶液 (L-a グリセ
℃で平衡化して活性を測定した.なお，修飾後の残存
ロホスフェートオキシダーゼ)を 0
.
0
2
m
l取り， 37'C
活性が異なるため，熱安定性試験では酵素溶液のユニッ
の恒温槽中で 5分間保ち平衡化した.別に 3
7'Cで 平
.5U/mlに統ーして行った.
ト数を約 0
7'C
衡化した反応混合液1.0mlをこの試験管に加え， 3
結果及び考察
で1
0分間反応させた. 1
0分後， 0.25%ラウリルベン
ゼンスルホン酸ナトリウムを 2ml加え反応を停止さ
1
. 活性化デキストラン調製における酸化剤量の検
せ
， 500nmにおける吸光度を測定した.
討
GPO-デキストラン・グリシン複合体の調製:デキ
酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウムの量を変化させ
T
7
0
) 300mgを 6mlの 脱 イ オ ン 水 に 溶 解
ストラン (
種々の活性化デキストランを調製し，活性化デキスト
し，過ヨウ素酸ナトリウム 400mgを加え，室温で 7
5
ランに導入されたアルデヒド基を測定すると共に，酵
分間穏やかに撹排した.その後，脱イオン水中で 1時
素 と の 反 応 に よ っ て 調 製 さ れ た 複 合 体 (GPO-
間毎に脱イオン水を換え 4回透析を行った.このよう
Dextran-Gly) の 残 存 活 性 及 び 熱 安 定 性 を 測 定 し
にして得られた活性化デキストラン溶液 1mlと 0.2M
Table 1に示した.なお，修飾後の残存活性は修飾前
リン酸塩緩衝液 (pH8
.
0
) 1mlに GPO 2.5mgを溶
の GPOの活性を 100%として相対値で表示し，熱処
解した酵素溶液を混合し，水素化シアノホウ素ナトリ
理後の残存活性は未処理の複合体，すなわち，修飾後
ウム 16mgを添加し，
熱処理で行っていない標品の活性を 100%として相対
5'C
下で 1
6時間反応させた.
その後，未反応のアルデヒド基をブロックするために，
値で表示した.過ヨウ素酸ナトリウムの量が， 30mg
2
5
0 mg/ml)を 0
.
7
m
l加 え ， さ ら に
グリシン溶液 (
から 400mgへと増加するにつれて活性化デキストラ
3時間反応させた.その後， 5'C下で 1
0m Mリン酸
ンに導入されるアルデヒド基は増加した.また，導入
塩緩衝液 (pH8
.
0
) 中で透析を行った.なお，過ヨ
されたアルデヒド基が多いほど，修飾後の残存活性は
ウ素酸ナトリウムの量は目的に合わせて 30~400mg
低下するものの，熱安定性は増加する傾向が認められ
まで変化させた.また， GPO デキストランーグリシン
た.すなわち，熱安定性と修飾後の残存活性は相反す
複合体を GPO-Dextran
-Glyと表示した.
る傾向にあり，優れた熱安定性を有し，かつ高い修飾
アルデヒド基の定量:活性化デキストランに導入さ
，5 ジ ニ ト ロ サ リ チ ル 酸
れたアルデヒド基の定量は 3
後の残存活性を維持するためには，修飾段階での活性
低下を防止する必要があると思われた.
Table 1
. R
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C
30min
(%)
60min
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5
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.
3
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.
2
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42
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5
.
6
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9
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7
.
5
5
6
7.
40
8
0
.
1
0
L-Il'グリセロホスフェートオキシダーゼの安定化
3
7
2
. 還元剤の検討
ナトリウムに比べ強い還元剤であるので，高濃度では，
酵素と活性化デキストランとの反応はシッフ塩基を
GPOの補欠分子族である FADが 還 元 さ れ 活 性 が 失
介して行われると考えられるので，修飾後の残存活性
われた.また，水素化ホウ素ナトリウムはシッフ塩基
Table
及び熱安定性に及ぼす還元剤の影響を調べた (
だけを還元するのではなく，活性化デキストラン中の
2
)
. 修飾後の残存活性が低いものほど熱安定性は増加
アルデヒド基まで還元してしまうため，修飾反応が水
する傾向が認められた.還元剤無添加のものでは顕著
素化シアノホウ素ナトリウムの場合ほど進まず，顕著
な熱安定性は認められず，シッフ塩基の還元は熱安定
な熱安定性が認められないものと思われた (German
ta
l
.，1
性獲得には必須のものと思われた (Germane
e
ta
l
.，1
9
8
9
)
.
9
8
9
).水素化ホウ素ナトリウムは水素化シアノホウ素
Table2
. E
f
f
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c
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freducingagentonr
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GPO-Dextran-Gly.
Reducing agent
Concentrationo
f
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(mM)
1
2
7
.
3
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.
6
NaBH
CN
3
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，
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3
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(%)
6
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4
6.
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0
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3
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.
5
6
7
1
.7
4
1
9
.
7
9
3
6
.
3
4
3
. 修飾段階での活性低下の防止
.
3
3及 び 3
.
1
5倍高くする
FAD無添加のものに比べ， 2
6時間反応すること
GPOは活性化デキストランと 1
ことができた.これは， FAD添 加 に よ る 活 性 の わ ず
により，反応段階でその活性が約 80%低 下 し ， さ ら
かな増加に加え， GPOの補欠分子族である FADが 水
に，透析により約 10%低 下 す る こ と が わ か っ た . そ
素化シアノホウ素ナトリウムによる還元から保護され
こで，修飾段階での活性低下を防止するため安定化剤
たためと考えられた.
(2)硫酸アンモニウム添加効果
の添加を検討した.
透析段階での活性低下を防止するため 10%硫酸ア
(1)修飾段階における FAD添加効果
比較的優れた熱安定性を示した活性化条件である過
ンモニウム添加緩衝液中で透析を行った. Table 4に
ヨウ素酸ナトリウム量 240mg及び 400mgを用いて活
示すように，過ヨウ素酸ナトリウムの量にかかわらず，
性化デキストランを調製し， GPOの 補 欠 分 子 族 で あ
修飾後の残存活性を硫酸アンモニウム無添加のものに
(FAD) を反応
比べ約1. 5~ 2倍高くすることができた.さらに，遊
るフラビンアデニンジヌクレオチド
段階で 10mM添加して酵素との修飾反応を行った.
離の GPO及び GPO-Dextran-Glyに硫酸アンモニウ
Table 3に 示 す よ う に ， 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム 2
4
0
ムを添加し長期安定性を検討し， F
i
g
. 1に示した.
mg，400mgの何れにおいても，修飾後の残存活性を
F
i
g
. 1から明らかなように，両者とも 10%濃 度 で 優
Table 3
. E
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.0
2
いえる.この値を比較すると，過ヨウ素酸ナトリウム
¥20
GPO-Dntran-Gly
。
%
ヨz。
E
d
k
巨宮冒﹄冨忠臣。usa-2mE
岨 H川
%%%%
OAMao
。
111J
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b
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d﹃ 盲 目 ヨ 富 国
09
も
GPO-Native
240mg-10%硫酸アンモニウム添加緩衝液透析で得ら
れた修飾酵素は，遊離の 9
.
5
7に対し 3
7
.
3
1と最も優れ
ていた.さらに， FAD添加及び硫酸アンモニウム添
ig.2
加透析の残存活性及び熱安定性に及ぼす影響を F
にまとめて示した.修飾後の残存活性は，
a (
1
0
lOFO
F10A，FAD添加ー硫酸アンモニウム添加)， b (
A，FAD添加硫酸アンモニウム無添加)， c (
O
F
1
0
A，FAD無添加硫酸アンモニウム添加)， d (OFOA，
20
o
20
30
40
Time(day)
FAD無添加ー硫酸アンモニウム無添加)の順で低く
なった.熱安定性は， FAD添加または無添加の何れ
においても，すなわち， aと bまたは
C
と dの比較に
F
i
g
.1
. E
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yo
fm
o
d
i
f
i
e
dGPO.
おいて，修飾後の残存活性が低いほどわずかに優れて
れた長期安定性を示した.これは，調製段階における
が進み熱安定性が獲得されたものと思われた.一方，
透析中に酵素標品中に含まれていた安定化剤がはずれ，
硫酸アンモニウム添加または無添加の何れにおいても，
いた.これは，修飾後の残存活性が低いほど修飾反応
不安定化したものに，添加された硫酸アンモニウムが
すなわち， aと C または b と dの比較において，
安定化剤として作用したものと思われる.また，同じ
FADを添加した方が修飾後の残存活性が高く，熱安
10%濃度においては修飾酵素の約 5
0日後の残存活性
定性も優れていた.これは，修飾効果とともに， FAD
は遊離酵素が約 90%で あ る の に 対 し ， 修 飾 酵 素 は 約
が保護作用を示し，修飾後の残存活性が高くなり酵素
100%とその差はあまり大きくないものの，修飾によ
が安定化されたものと思われた.
る安定化効果が認められる.より苛酷な条件である熱
安定性試験では，両者の聞に顕著な差が認められたこ
とから，さらに長期的にみると熱安定性と同様に顕著
な差が認められると思われる.
5
. 修飾酵素の特性と
L-a
グリセロホスフェー卜
定量への適用
Table6に 修 飾 酵 素 の 特 性 を 示 し た . 至 適 pHは
9
.
8，至適温度は 4
0'Cであり，修飾による変化はほと
4
. 修飾酵素の評価
直は 2
4.1となり，
んど認められなかった.一方， Km{1
反応段階で 10mMFADを添加したものについて，
修飾により基質との親和性がやや低下した.
硫酸アンモニウム無添加と 10%添 加 し た 緩 衝 液 中 で
修飾酵素を凍結乾燥し， L-aーグリセロホスフェー
透析した修飾酵素の評価を熱安定性と修飾後の残存活
i
g
. 3に 見 ら れ る よ う に ， 濃
トの定量に適用した. F
性の二つの因子により行った. Table5において，修
度と吸光度 ω聞には良好な直線性が認められ，修飾酵
0
'
C， 6
0分 加 熱 処 理 後 の 残 存
飾後の残存活性を A，5
素の実用段階での問題はなかった.
活性を B とすると，
(AxB) は修飾前の GPO活 性
100%から換算した総合的な残存活性を示していると
要
約
3
9
L-a グリセロホスフェートオキシダーゼの安定化
T
a
b
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e5
. E
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C
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.
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トラン化学修飾による安定化を試み，修飾酵素の安定
トリグリセリドキットなど臨床酵素試薬として広
性を熱安定慢を指標として評価した.過ヨウ素酸ナト
く応用されている.この酵素の安定性を現状より高め
)で活性化し，アルデヒド基を導入し
リウム (NaI0
4
ることは，酵素試薬生産，流通段階でのコストダウン
たデキストランを調製した.これを酵素上のアミノ基
につながり，そのメリットは大きい.そこで，デキス
とシッフ塩基を介して架橋させた後，水素化シアノホ
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，
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松本
清・田中
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ウ素ナトリウムによる還元を行った.さらに，未反応
文
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長期安定性においても優れていた.しかしながら，修
飾後の残存活性が低いという問題があった.そこで，
PO-Dextran-Glyを得るために，反応の
より優れた G
各段階について詳細に検討した.デキストラン活性化
時の NaI0
4の量を変え修飾を行ったところ，導入さ
れたアルデヒド基量が多いほど，修飾後の残存活性は
低下するものの，熱安定性は増加する傾向が認められ
た.修飾段階での活性低下を防止するため補酵素
FADを 10mM添加することにより，また， 10%硫 酸
アンモニウム緩衝液中で透析を行うことにより，修飾
後の残存活性をそれぞれ1. 5~
3倍
，
1. 5~
2倍 高 く す
硫酸アンモ
ることができた. 10mMFAD添加， 10%
ニウム透析した G
PO-Dextran-Glyは，修飾後の残存
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GPO-Dextran-Glyの凍結乾燥品は，その優れた熱安
定性を保持し，実際に， L-aーグリセロホスフェート
の定量に使用可能であった.
豊
献
月向邦彦 1
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代の酵素化学(化学増刊 6
5)，化学同人，京都
Summary
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