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SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル： (J)
SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 英語版 Version 4.1 対応 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 もくじ 1. 必要機器・試薬など ........................................................................................................................................ 3 1.1. SeqCap EZ ライブラリ同梱品 ............................................................................................................... 3 1.2. 一般実験機器 .......................................................................................................................................... 4 1.3. Roche Applied Science から販売されている試薬・消耗品.................................................................. 5 1.4. 一般研究用試薬・消耗品 ........................................................................................................................ 6 1.5. カスタムオリゴ DNA .............................................................................................................................. 7 2. はじめに .......................................................................................................................................................... 8 2.1. ワークフロー .......................................................................................................................................... 8 2.2. 更新箇所 ................................................................................................................................................. 9 2.3. 本マニュアルで使用されている用語 ...................................................................................................... 9 3. 実験の前に .................................................................................................................................................... 10 4. ライブラリ調製 ............................................................................................................................................. 11 5. Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 .............................................................................................. 12 5.1. TS-PCR オリゴの準備 .......................................................................................................................... 12 5.2. LM-PCR の準備 .................................................................................................................................... 13 5.3. PCR 増幅 .............................................................................................................................................. 14 5.4. DNA Purification Beads を用いた Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 ............................................... 14 5.5. Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 ................................................................................................ 17 6. ハイブリダイゼーション............................................................................................................................... 18 6.1. SeqCap EZ ライブラリ の分取および保存 .......................................................................................... 18 6.2. Pre ライブラリプール溶液の準備 ........................................................................................................ 19 6.3. HE オリゴの準備 .................................................................................................................................. 20 6.4. HE オリゴプール溶液の調製 ................................................................................................................ 21 6.5. ハイブリダイゼーションの準備と開始 ................................................................................................. 24 7. 洗浄と回収 .................................................................................................................................................... 27 7.1. 洗浄用バッファーの準備 ...................................................................................................................... 27 7.2. Capture Beads の準備 ......................................................................................................................... 28 7.3. Capture Beads と DNA の結合 ............................................................................................................ 30 7.4. DNA が結合した Capture Beads の洗浄 ............................................................................................. 31 8. Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 ............................................................................................ 34 8.1. LM-PCR の準備 .................................................................................................................................... 34 8.2. PCR 増幅 .............................................................................................................................................. 36 8.3. DNA Purification Beads を用いた Post-Capture LM-PCR 産物の精製 ............................................. 36 8.4. Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 .............................................................................................. 40 9. エンリッチメントの確認............................................................................................................................... 41 9.1. qPCR の準備と開始.............................................................................................................................. 41 9.2. qPCR データの解析.............................................................................................................................. 45 10. 付録 ............................................................................................................................................................... 48 10.1. Pre-Capture LM-PCR 産物の qPCR による品質確認 .......................................................................... 48 10.2. トラブルシューティング ...................................................................................................................... 50 2 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 1. 1.1. 必要機器・試薬など SeqCap EZ ライブラリ同梱品 構成品 CD/DVD 1. 2. 備考 デザイン情報・アノテーション情報が記載されたファイル (.gff 1 /.bed 2) やユーザーズガイド (.pdf) が保存されています。 拡張子 gff (general feature format) のファイルは Roche NimbleGen SignalMap ソフトウェアで内 容を確認できます。(www.nimblegen.com/products/software/signalmap/) 拡張子 bed のファイルは、UCSC ゲノムブラウザにより内容を確認できます。 (http://genome.ucsc.edu/) 3 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 1.2. 一般実験機器 機器 販売元 DNA 遠心濃縮機 (1.5 ml チューブが使用可であること) 指定なし DynaMag-2 Magnet (16 x 1.5 ml tube holder) Invitrogen 123-21D MagnaBot II Magnetic Separation Device Promega V8351 ヒートブロック 指定なし ウォーターバス または オーブン (インキュベーター) 指定なし 1.5 ml チューブ遠心機 (16,000 x g で遠心できること) 指定なし PCR プレート遠心機 備考 どちらか 指定なし (PCR、qPCR でプレートを使用する場合) Spectrophotometer NanoDrop Bioanalyzer 2100 Agilent LightCycler® 480 Instrument II Roche Applied Science サーマルサイクラー 指定なし ボルテックス ミキサー 指定なし ピペッター 一式 (2-1000 μl) 指定なし Covaris S2 System, or Covaris E210 System 品番 注） Covaris ND-1000 以降 5 015 243 384-well 5 015 278 96-well #S2 or #E210 注）Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit によるライブラリ調製のステップで使用します。 上記リストはライブラリ調製の工程で必要となる試薬の一部を含んでいない可能性があります。ライブラリ調製 キットのプロトコールを必ずご参照ください。 4 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 1.3. Roche Applied Science から販売されている試薬・消耗品 機器 品番 仕様・備考 LightCycler® 480 Multiwell Plate 384, white (with sealing foils) 4 729 749 5 x 10 プレート LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2X Mix) 4 707 516 5 x 1 ml 5 634 261 24 反応 5 634 253 96 反応 SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit 24 反応 SeqCap EZ Accessory Kit 6 776 302 SeqCap EZ HE-Oligo Kit A 6 777 287 各 96 反応 SeqCap EZ HE-Oligo Kit B 6 777 317 (12 インデックス×8 反応) 注） SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit 6 977 952 24 反応 SeqCap EZ Developer Reagent 6 684 335 PCR grade water 3 315 843 注） (LM-PCR 72 反応分) 1 ml (100 反応) ※ヒト以外の実験の場合のみ 4 x 25 ml これらのキットにはライブラリに付加したアダプター配列同士のハイブリダイゼーションをブロッ クするための HE オリゴが含まれています。実験条件により必要な HE オリゴは異なりますのでご 注意ください。本紙 21 ページの対応表をご参照ください。 5 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 1.4. 一般研究用試薬・消耗品 機器 販売元 品番 備考 Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit Illumina Agilent DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 1 kit (25 chips) Ethanol, 200 proof (absolute), for 注） molecular biology Sigma-Aldrich E7023-500ML 500 ml チューブ類 指定なし フィルターチップ 指定なし FC-121-2001 (v2, Set A) いずれか FC-121-2002 (v2, Set B) 注）Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit によるライブラリ調製のステップで使用します。 上記リストはライブラリ調製の工程で必要となる試薬の一部を含んでいない可能性があります。ライブラリ調製 キットのプロトコールを必ずご参照ください。 6 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 1.5. カスタムオリゴ DNA IDT 社 (Integrated DNA Technologies, Inc) または他の DNA オリゴ合成会社へ合成を依頼してください。 オリゴ DNA は PCR grade water に溶解してください (高濃度ストック溶液を調製する場合には TE buffer も可)。 注） これらのプライマーはヒトゲノムを用いた実験の際の qPCR によるエンリッチメントの確認のス テップで使用します。ヒト以外の生物種の実験を行う場合には、これらの配列のオリゴ DNA ではな く、ご自身で設計したプライマーセットをご準備ください。 精製グレードは脱塩グレード以上でご発注ください。 オリゴ名 使用濃度 配列 qPCR NSC-0237, forward, Oligo 2μM 5' ‒ CGC ATT CCT CAT CCC AGT ATG - 3' qPCR NSC-0237, reverse, Oligo 2μM 5' ‒ AAA GGA CTT GGT GCA GAG TTC AG - 3' qPCR NSC-0247, forward, Oligo 2μM 5' ‒ CCC ACC GCC TTC GAC AT - 3' qPCR NSC-0247, reverse, Oligo 2μM 5' - CCT GCT TAC TGT GGG CTC TTG - 3' qPCR NSC-0268, forward, Oligo 2μM 5' - CTC GCT TAA CCA GAC TCA TCT ACT GT - 3' qPCR NSC-0268, reverse, Oligo 2μM 5' - ACT TGG CTC AGC TGT ATG AAG GT - 3' qPCR NSC-0272, forward, Oligo 2μM 5' - CAG CCC CAG CTC AGG TAC AG - 3' qPCR NSC-0272, reverse, Oligo 2μM 5' ‒ ATG ATG CGA GTG CTG ATG ATG - 3' 7 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 2. はじめに 本マニュアルでは、SeqCap EZ ライブラリとライゲーションを介した PCR (LM-PCR：Ligation-Mediated PCR) によるマルチプレックス DNA サンプル ライブラリ プールの増幅物を用いたゲノム DNA (gDNA) のキャプチャ ー手順を示します (下図ワークフロー)。特に、本マニュアルは、SeqCap EZ Human Exome ライブラリもしくは SeqCap EZ Choice ライブラリを用いた Illumina 社の TruSeq DNA サンプル ライブラリのマルチプレックス キ ャプチャーを可能にするシークエンス キャプチャーの方法と、SeqCap EZ Accessory Kit・HE-Oligo Kit・Pure Capture Bead Kit を用いたサンプル ライブラリとキャプチャーされたサンプルの処理方法について示されていま す。本マニュアルは、Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit により準備された gDNA ライブラリから始ま り、Illumina Genome Analyzer II もしくは HiSeq で直接シークエンシングか可能なキャプチャーされた gDNA 断 片が調製されて終了します。 2.1. ワークフロー SeqCap EZ ライブラリを用いた実験は以下の手順も含みます： ① Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit を用いて gDNA ライブラリを準備 ② キャプチャーされた gDNA 断片を Illumina Genome Analyzer II もしくは HiSeq でシークエンシング 下図は SeqCap EZ ライブラリを用いた実験のワークフローになります。 各ステップ横に記載されている所要時間は、１キャプチャー反応を実施する場合を想定しています。各ステップ の所要時間の間に記載されている時間はインキュベーション時間を示しています。 手順 所用時間 ライブラリの準備 (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit) 6 時間 LM-PCRによるサンプル ライブラリの増幅 2 時間 増幅したサンプル ライブラリを混合 （マルチプレックスでキャプチャーを実施する場合のみ） 0.5 時間 サンプルライブラリとSeqCap EZライブラリを ハイブリダイゼーションする準備 1 時間 3 日間 インキュベーション 洗浄とキャプチャーされたDNAの回収 2 時間 LM-PCRによるキャプチャーされたDNAの増幅 3 時間 qPCRによる濃縮効率の測定 2 時間 シークエンシングへ 図：Illumina Genome Analyzer II もしくは HiSeq を用いた SeqCap EZ ライブラリ実験のワークフロー 8 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 2.2. 更新箇所 SeqCap EZ Accessory Kit・HE-Oligo Kit と併せて使用する、新発売の SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (内容 物：DNA Purification Beads と Capture Beads) の使用方法が記載されています。 Note：本プロトコールは SeqCap EZ ライブラリの全ての製品群に適用可能です。 お使いのマニュアルが最新のものかどうかにつきましては、www.nimblegen.com/lit/ か http://rochebiochem.jp/products/2010/08/sequence-capture.html でご確認ください。 2.3. 本マニュアルで使用されている用語 LM-PCR： Ligation Mediated PCR の略。本マニュアルでは、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用し た PCR を指します。 シークエンスキャプチャー： ゲノム DNA からターゲットとした領域を濃縮する実験。本マニュアルでは、増幅したサンプルライブラリと SeqCap EZ ライブラリのハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄の工程を指します。 SeqCap EZ ライブラリ： シークエンスキャプチャー (SeqCap EZ Human Exome や SeqCap EZ Choice) を実施する為の Roche NimbleGen から供与されるビオチンが付与された長鎖のオリゴヌクレオチドのセット。 サンプル ライブラリ： ゲノム DNA を断片化し、シークエンシングのプラットフォームに即した特異的リンカーがライゲーションされ たショットガン ライブラリ。本マニュアルでは、シークエンスキャプチャー前に LM-PCR で増幅される前の状 態を指します。 Pre-Capture LM-PCR 産物 (シークエンスキャプチャー前に増幅されたサンプル) ： シークエンスキャプチャー前に LM-PCR により増幅されたサンプルを指します。 Pre ライブラリプール： 複数の Pre-Capture LM-PCR 産物を混合した、シークエンスキャプチャー前のサンプルを指します。 Post-Capture LM-PCR 産物 (シークエンスキャプチャー後に増幅されたサンプル) ： シークエンスキャプチャー後に LM-PCR により増幅されたサンプルを指します。 9 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 3. 実験の前に ・ サーマルサイクラーにプログラムを入力しておきます。プログラムは 14 ページ・26 ページ・36 ページに 記載されています。 ・ SeqCap EZ ライブラリの保存方法に関しては、18 ページを参照ください。 ・ SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (Roche、5 634 261 or 5 634 253) と SeqCap EZ Accessory Kit (Roche、6 776 302) 、SeqCap EZ HE-Oligo Kit (Roche、6 777 287 and/or 6 777 317) は、使用するま で-15 ∼ -25 ℃で保存します。 ・ SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (Roche、6 977 952) は使用するまで+2 ℃∼+8 ℃で保存します。 SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit は凍結させないでください。 ・ コンタミネーションの防止のために実験用手袋 (パウダーフリー) を着用してください。 ・ 全ての遠心操作は特に記載の無い限り +15 ∼ +25 ℃ の設定で行ってください。 ・ ターゲット領域サイズがそれほど大きくないシークエンスキャプチャーの場合には、Double Capture 法が 有効となる場合があります。本マニュアルに記載の方法とは若干手法が異なります。Double Capture 法の 詳細については、http://roche-biochem.jp/products/2010/08/sequence-capture.html でご確認ください。 10 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 4. ライブラリ調製 本章では、LM-PCR による増幅前のサンプルライブラリの準備とその品質確認 (QC) 方法について記載します。 下図は、Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit を用いたライブラリ調製フローの概略を示しています。製 品付属のプロトコール ( Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide (revision C, June 2012) )の Fragment DNA の項から Ligate Adapters の項までの指示に従ってライブラリを調製した後、本チャートに従って品質 確認をしてください。 サンプル DNA "Fragment DNA" "Perform End Repair" インプットゲノム DNA； ・ Qubit や PicoGreen などにより正確に定量してください ・ (推奨量) 1μg ・ OD260/280 ： 1.8∼2.0 ・ 分解、RNA のコンタミネーション、不純物の混入などが無いこと Covaris Water Bath Sonicator により、ゲノム DNA を断片化します。 エンドリペア反応後、AMPure XP Beads を利用して低分子断片を除去しま す。アガロースゲルからフラクションを切り出す場合には、このステップでは 低分子断片は除去されませんので、アダプターを結合させた後に Purify Ligation Products (gel method only) を実施してください。 キャプチャーターゲットのタイプ (短いエクソンか、連続的に長い領 域か、など) や、シークエンシングリードの長さによっては製品付属 のプロトコール通りに調製したライブラリフラグメントのサイズは 適当ではないかもしれません。サイズを調節する必要がある場合に は、 AMPure XP Beads での精製工程を最適化してください。ライ ブラリフラグメントのサイズは Enrich DNA Fragments ステップ または本紙５章５項 (17 ページ) で確認します。 "Adenylate 3' Ends" "Ligate Adapters" 実験計画に従って適切な DNA Adapter Index をご利用ください。 Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide では 20μl のサンプルを分取 (回収) するよう指示されていますが、21μl の Resuspension Buffer に溶解さ せたライブラリ DNA を回収してください。 (1μl) Enrich DNA Fragments ライブラリ品質確認用 PCR、電気泳動による品質確認 (21μl) ライブラリ産物 1μl を使用して Enrich DNA Fragments ステップを実施してください。 この工程は調製したライブラリの品質の確認にのみ利用します。このため、 増幅させたサンプルは後の操作には使用しませんのでご注意ください。 増幅させたサンプルのうち、1μl を Agilent DNA 1000 chip で泳動すると、 ピークの中心サイズは 150∼400 bp となります。この基準を満たしたサンプ ルのライブラリ溶液 (残りの 20μl ) を次の工程に進めてください。 (20μl) ５章 Pre-Capture LM-PCR へ 11 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 5. 本章では、SeqCap EZ Accessory Kit を用いたハイブリダイゼーション用のライブラリ調製方法について記載し ます。増幅後の溶液は SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (または QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。 TS-PCR オリゴの準備 5.1. ① ・試薬 SeqCap EZ Accessory Kit (冷凍) 必要試薬を氷上で溶解させます。 PCR Grade Water (バイアル ②) SeqCap EZ PCR Master Mix (バイアル ③) SeqCap EZ PCR Master Mix および本試薬を含むマスターミックスは温度に対して敏感です。必ず 氷上で溶解、調製を行ってください。 ② TS-PCR Oligo 1 & 2 (バイアル ④) をスピンダウンします。 開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。 1 本のバイアルチューブにフォワードとリバースのプライマーの両方が含まれています。 ③ PCR Grade Water (バイアル ②) 400μl を TS-PCR Oligo 1 & 2 (バイアル ④) に加えます。 400μl PCR Grade Water (バイアル ②) ④ TS- PCR Oligo 1 & 2 (バイアル ④) Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。 -15 ∼ -25 ℃で保存できます。 12 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 5.2. ① LM-PCR の準備 Pre-Capture LM-PCR マスターミックスを調製します。 ネガティブ、ポジティブコントロール を同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確認 されているライブラリ溶液をご利用ください。 Pre-Capture LM-PCR マスターミックス 1 反応あたりの容量 SeqCap EZ PCR Master Mix (バイアル ③) 50μl PCR Grade Water (バイアル ②) 25μl TS-PCR Oligo 1 & 2 溶液 (バイアル ④) 5μl total 80μl マスターミックスは必ず氷上で調製してください。 マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 10% 程度を増量 して計算してください。 ② マスターミックスをよく混合し、スピンダウンします。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 ③ Pre-Capture LM-PCR マスターミックスを 80μl ずつ、新しい PCR 用チューブに分注します。 Pre-Capture LM-PCR マスターミックス ④ 80μl 上記 ③ の PCR チューブに 20μl のサンプルライブラリ溶液を添加します。 サンプルライブラリ溶液 (または) PCR grade water 20μl ⑤ 5 回、ピペッティングすることでよく混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 13 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 5.3. PCR 増幅 サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 5.4. ① 温度 時間 94℃ 2 min 94℃ 10 sec 60℃ 70 sec 72℃ 45 sec 72℃ 7 min 4℃ Hold サイクル 100μl 8 サイクル DNA Purification Beads を用いた Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap EZ Purification Beads (ボトル ②) を室温に置きます (使 用する 30 分前)。 ・試薬 SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (冷蔵) 80％エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。 SeqCap EZ Purification Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製す ることも可能です。この場合、QIAquick 付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは Buffer EB ではなく PCR grade water を使用してください。 ② 各増幅後の溶液を新しい 1.5 ml チューブに移します。 100μl 全量 新しい 1.5ml チューブ ネガティブ、ポジティブコントロールサンプルについても同様に操作してください。 ③ SeqCap EZ Purification Beads を Vortex でよく混合し、180μl を上記 ② の 1.5ml チューブに添加します。 180μl (1.8 倍量) SeqCap EZ Purification Beads 10 秒間 14 / 51 (100μl) ：増幅後溶液 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ④ Vortex で混合し、室温で 15 分間インキュベーションします。 室温、15 分間 ⑤ チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明になった ら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑥ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80％エタノール (用時調製) ⑦ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑧ 上記 ⑥ ∼ ⑦ を繰り返します。 15 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑨ チューブの蓋を開けた状態で 15 分間、室温でインキュベーションします。 ビーズが乾燥するまで。 ピペットによる上澄み除去後、軽くスピンダウンしてから再びマグネットラックに戻すと余分なエ タノールを除去でき、乾燥時間を短縮することができます。 乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。 ⑩ チューブをマグネティックラックから外し、PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸 濁します。 52μl PCR Grade Water Buffer EB や 1x TE ではなく、 必ず PCR Grade Water を使用してください。 タッピングからのスピンダウンも可。 ⑪ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分間 ⑫ チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込みます。 ⑬ チューブ内の溶液が透明になったら 50μl の上澄みをピペットで吸い取り、新しいチューブに移します。 50μl 新しい 1.5ml チューブ 16 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑭ 5.5. ① 約 50μl の Pre-Capture LM-PCR 産物が調製されました。 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 濃度を測定し、吸光度測定上での品質基準を満たしていることを確認します。 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質 A260/280 比 基準 1.7 - 2.0 1.0μg 以上 収量 ネガティブコントロールでの収量 ごく微量 Pre-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 20 ng/μl 以上の濃度で測定されると見 込まれます。 各ライブラリで均等なシークエンシングデータ (リード) を得るためには、正確な定量が非常に重 要となります。吸光度測定以外の方法で評価することが有効である場合があります。 ② 1μl の Pre-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物 を Agilent DNA 1000 Kit で泳動し、 泳動上での品質基準を満たしていることを確認します。 DNA Marker Reference Peak Amplified Sample Library 150 ∼ 500 bp ネガティブコントロール産物でピーク見られないことをご確認ください。 150 bp 以下のサイズに 1 本以上のシャープなピークが見られる場合がありますが、LM-PCR 前の ステップからのオリゴヌクレオチドなどのキャリーオーバー等と考えられます。こうしたピークが 見られる場合でも、キャプチャー反応に影響はありません。 17 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 6. ハイブリダイゼーション 本章では、SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit、SeqCap EZ Accessory Kit の構成製品である COT-1 Human DNA または SeqCap EZ Developer Reagent (ヒト以外の生物種での実験の場合) 、SeqCap EZ HE-Oligo Kit を用 いたハイブリダイゼーション溶液の調製方法と、SeqCap EZ ライブラリとのハイブリダイゼーションの手順に ついて記載します。 ハイブリダイゼーションには、47℃を 64∼72 時間キープできるサーマルサイクラーが必要です。 温度制御可能なヒートリッドが付属している機種を推奨しています。 6.1. ① SeqCap EZ ライブラリ の分取および保存 氷上で SeqCap EZ ライブラリを溶解させます。 ・試薬 SeqCap EZ ライブラリ (冷凍) SeqCap EZ ライブラリ ② 3 秒間 Vortex します。 3 秒間 ③ 10,000 x g で 30 秒間遠心し、SeqCap EZ ライブラリ溶液をチューブの底に集めます。 ④ 4.5μl ずつ PCR チューブに分注します。 4.5 μl ずつ SeqCap EZ ライブラリ ハイブリダイゼーションに使用するサーマルサイクラーに対応したサイズの PCR チューブに分注 してください。 4.5μl は 1 回分の使用量になります。 凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。 SeqCap EZ ライブラリは製品反応数の容量より若干多く梱包されています。このため、分注操作 後、元の製品チューブに多少溶液が残ることがあります。 18 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑤ -15 ∼ -25 ℃で保存します。 SeqCap EZ ライブラリは凍結融解を繰り返さないでください。 6.2. Pre ライブラリプール溶液の準備 ＜ライブラリ毎に個別にキャプチャーハイブリダイゼーションする場合＞ 1μg に相当する Pre-Capture LM-PCR 産物の容量を算出しておきます。 1μg に相当する 溶液量を算出しておく Pre-Capture LM-PCR 産物 ＜ライブラリを混合してからキャプチャーハイブリダイゼーションする場合＞ それぞれの Pre-Capture LM-PCR 産物を一定量ずつ新しいチューブに分取し、「Pre ライブラリプール溶液」 を調製します。 例） 6 サンプルを混合する場合 Sample 1 AD002 Sample 2 AD004 Sample 3 AD005 Sample 4 AD006 Sample 5 AD007 Sample 6 AD016 等量ずつ (1.1μg 相当量ずつ) 新しいチューブ 「Pre ライブラリプール溶液」 各ライブラリで均等なシークエンシングデータ (リード) を得るためには、正確な定量、正確な容量 の分取が非常に重要となります。 1μg 相当をハイブリダイゼーションに使用しますので、上記の 6 サンプルを混合する例では、総 容量の 6.6 分の 1 の容量を使用します。 この溶液は後日、約 60 ng をエンリッチメントの確認のための qPCR に使用します (９章) 。 -15 ∼ -25 ℃で保存しておいてください。 19 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 6.3. HE オリゴの準備 ① PCR Grade Water (バイアル ⑭) を解凍します。 ② 乾燥オリゴの封入された各バイアル (バイアル ①∼⑬) をスピンダウンします。 ③ TS-HE Universal Oligo 1 (バイアル ①) には PCR Grade Water (バイアル ⑭) 120μl を、その他のバイアル チューブ (バイアル ②∼⑬) には 10μl を加えます。結果、各バイアルのオリゴ濃度は 1000μM となります。 ・試薬 SeqCap EZ HE-Oligo Kit A and/or B (冷凍) 開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。 120μl PCR Grade Water (バイアル ⑭) 10μl TS-HE Universal Oligo 1 (バイアル ①) PCR Grade Water (バイアル ⑭) バイアル ②∼⑬ ピペッティング誤差を防ぐために、更に 1/10 希釈した溶液を調製しても構いません。希釈した場 合には次の工程で 10 倍量を使用するようご注意ください。 ④ Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。 -15 ∼ -25 ℃で保存できます。 凍結融解を繰り返さないために、少量ずつ分注していただくことをお勧めいたします。 凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。 20 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 6.4. ① HE オリゴプール溶液の調製 各 HE オリゴ溶液が凍結保存されている場合には、適宜融解させます。 TS-INV-HE Index # Oligo の # にはインデックス配列の種類を示す数値が入ります。 TS-INV-HE Index # Oligo は以降の記述で HE Index オリゴと総称しますが、ライブラリに使用され た Index に対応したものを必ずご使用ください。 ② TS-HE Universal Oligo 1 は使用する Illumina TruSeq DNA Adapter Index の番号に関わらず使用します。こ れに加えて使用する TruSeq DNA Adapter Index に対応する HE Index オリゴを確認します。 共通 TS-HE Universal Oligo 1 と、下記のいずれかの HE Index オリゴを組み合わせて使用します。 SeqCap EZ HE-Oligo Kit A (Roche, 6 777 287) SeqCap EZ HE-Oligo Kit B (Roche, 6 777 317) Illumina TruSeq DNA Adapter Index # HE Index オリゴ Illumina TruSeq DNA Adapter Index # HE Index オリゴ AD002 TS-INV-HE Index 2 Oligo AD001 TS-INV-HE Index 1 Oligo AD004 TS-INV-HE Index 4 Oligo AD003 TS-INV-HE Index 3 Oligo AD005 TS-INV-HE Index 5 Oligo AD008 TS-INV-HE Index 8 Oligo AD006 TS-INV-HE Index 6 Oligo AD009 TS-INV-HE Index 9 Oligo AD007 TS-INV-HE Index 7 Oligo AD010 TS-INV-HE Index 10 Oligo AD012 TS-INV-HE Index 12 Oligo AD011 TS-INV-HE Index 11 Oligo AD013 TS-INV-HE Index 13 Oligo AD020 TS-INV-HE Index 20 Oligo AD014 TS-INV-HE Index 14 Oligo AD021 TS-INV-HE Index 21 Oligo AD015 TS-INV-HE Index 15 Oligo AD022 TS-INV-HE Index 22 Oligo AD016 TS-INV-HE Index 16 Oligo AD023 TS-INV-HE Index 23 Oligo AD018 TS-INV-HE Index 18 Oligo AD025 TS-INV-HE Index 25 Oligo AD019 TS-INV-HE Index 19 Oligo AD027 TS-INV-HE Index 27 Oligo ご使用になる Index の数により、Index の組み合わせが指定の場合が有ります。例えば、Index が 異なる 2 サンプルをプールしてハイブリダイゼーションしシークエンスする場合では、AD006 と AD012 か AD005 と AD019 の組み合わせが推奨されています。 詳細につきましては、Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide (revision C, June 2012)をご 参照ください。 21 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ③ 1000μM TS-HE Universal Oligo 1 と、該当の 1000μM HE Index オリゴ溶液 を等量ずつ混合 (例 1) 、また は、1000μM TS-HE Universal Oligo 1 と、1000μM となるよう混合した HE Index オリゴ混合溶液 を等量 ずつ混合 (例 2) し、HE オリゴプール溶液を調製します。 例 1）AD002 インデックスを付加したライブラリのみでキャプチャーハイブリダイゼーションを行う場合 Illumina TruSeq DNA Adaptor Index # HE Index オリゴ溶液 分取量の例 共通 1,000μM TS-HE Universal Oligo 1 1μl AD002 1,000μM TS-INV-HE Index 2 Oligo 1μl TS-HE Universal Oligo 1 1μl TS-INV-HE Index 2 Oligo 1μl 新しいチューブ キャプチャー反応数が少ない場合には「HE オリゴプール溶液」を調製せず、24 ページ③のステッ プで上記 2 種類を 1μl ずつ添加してください。 例 2）下記インデックスの 6 サンプルを混合してからキャプチャーハイブリダイゼーションを行う場合 Illumina TruSeq DNA Adaptor Index # HE Index オリゴ溶液 分取量の例 共通 1,000μM TS-HE Universal Oligo 1 6μl AD002 1,000μM TS-INV-HE Index 2 Oligo 1μl AD004 1,000μM TS-INV-HE Index 4 Oligo 1μl AD005 1,000μM TS-INV-HE Index 5 Oligo 1μl AD006 1,000μM TS-INV-HE Index 6 Oligo 1μl AD007 1,000μM TS-INV-HE Index 7 Oligo 1μl AD016 1,000μM TS-INV-HE Index 12 Oligo 1μl TS-INV-HE Index オリゴは等容量ずつを混合します。TS-HE Universal オリゴは TS-INV-HE Index オリゴの合計容量と等量を添加します。 1 回のハイブリダイゼーションで 2μl ずつ使用しますので、上例の場合、最大 6 回分使用できると 見込まれます。 (次ページに続く) 22 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 (前ページより引き続き) TS-HE Universal Oligo 1 6μl TS-INV-HE Index 2 Oligo, 1μl TS-INV-HE Index 4 Oligo, 1μl TS-INV-HE Index 5 Oligo, 1μl TS-INV-HE Index 6 Oligo, 1μl TS-INV-HE Index 7 Oligo, 1μl 新しいチューブ TS-INV-HE Index 16 Oligo, 1μl 「HE オリゴプール溶液」 ライブラリ調製時に使用したアダプターに対応した HE Index オリゴ溶液を混合してください。実 際に使用しているインデックス以外の HE Index オリゴ溶液を混合することで様々なインデックス 混合パターンに対応させることはできません。 例えば 1μl 以上ずつのように、ピペッティング誤差のない容量で調製していただくことをお奨め いたします。 ④ HE オリゴプール溶液を Vortex でよく混合し (10 秒間) 、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 10 秒間 遠心、10 秒間 -15 ∼ -25 ℃で保存できますが、凍結融解を繰り返さないようにしてください。 23 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ハイブリダイゼーションの準備と開始 6.5. ① ヒートブロックを 95℃ に加温しておきます。 95 ℃ ② ・試薬 SeqCap EZ Accessory Kit (冷凍) SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (冷凍) 必要試薬とサンプル溶液を氷上で溶解させます。 SeqCap EZ Accessory Kit の バイアル ① Pre ライブラリプール溶液 または Pre-Capture LM-PCR 産物 (５章５項②) HE オリゴプール溶液 (６章４項④) SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit の バイアル ⑤ と バイアル ⑥ 分注した SeqCap EZ ライブラリ (６章１項⑤) バイアル ① HE オリゴプール溶液 バイアル ⑤ Pre ライブラリプール溶液：1μg 相当 (または) Pre-Capture LM-PCR 産物：1μg 相当 バイアル ⑥ SeqCap EZ ライブラリ ヒト以外の生物種での実験を行う場合には、バイアル ①の代わりに生物種に対応した COT DNA または SeqCap EZ Developer Reagent (6 684 335) をご使用ください。 ③ 新しい 1.5 ml チューブに、COT-1 Human DNA 5μl 注）、Pre ライブラリプール または Pre-Capture LMPCR 産物 1μg 相当量、HE オリゴプール溶液 2μl を分注します。 5μl 注） バイアル ① COT DNA 注） 2μl ＊μl Pre ライブラリプール溶液 (または) Pre-CaptureLM-PCR 産物 ハイブリダイゼーションコンポーネント HE オリゴプール溶液 新しいチューブ 混合容量 バイアル ① (COT-1 Human DNA) 5μl Pre ライブラリプール溶液：1μg 相当 (または) ＊μl Pre-Capture LM-PCR 産物：1μg 相当 HE オリゴプール溶液 2μl (次ページに続く) 24 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 (前ページより引き続き) 注） ④ ヒト以外の生物種の実験では、COT-1 Human DNA の代わりに SeqCap EZ Developer Reagent を 10μl を加えます。詳細は SeqCap EZ Library: Technical Note (May 2012) をご参照ください。 18 -20 ゲージ以下のサイズの注射針で③のチューブの蓋中央に穴を開けます。 乾燥工程中でのコンタミネーションを防止するために、このような方法を推奨しています。 複数のサンプルを乾燥させる場合にはチューブ毎に新しい注射針を使用してください。 注射針は感染性廃棄物となります。施設の廃棄方法に従って適切に廃棄してください。 ⑤ 真空乾燥機にセットし、溶液を完全に乾燥させます。容量により乾燥時間を調節します。 後の工程で熱変性を行うことから、このステップで加温 (60℃以上) しても問題ありません。 ⑥ 7.5μl の 2x Hybridization Buffer (バイアル ⑤) と、3μl の Hybridization Component A (バイアル ⑥) を⑤の チューブにそれぞれ添加します。 7.5μl 2x Hybridization Buffer (バイアル ⑤) 3μl Hybridization Component A (バイアル ⑥) 正確な容量を添加してください。 ⑦ チューブの蓋の穴をステッカーかラボ用テープ片で塞ぎます。 (10.5μl) 25 / 51 ⑤のチューブ SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑧ Vortex でよく混合し (10 秒) 、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 10 秒間 ⑨ 遠心、10 秒間 95 ℃ のヒートブロック上で 10 分間の熱変性を行います。 10 分間 95 ℃ ⑩ 最高速度設定で 10 秒間遠心します (室温) 。 ⑪ 全量 (10.5μl) を 4.5μl ずつ分注した SeqCap EZ ライブラリ溶液に移します。 (10.5μl) ⑫ SeqCap EZ ライブラリ 4.5μl Vortex で 3 秒間混合し、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 3 秒間 ⑬ 遠心、10 秒間 47 ℃ で 64 ∼ 72 時間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。 64∼72 時間 47 ℃ サーマルサイクラーのヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう 設定してください。 26 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 7. 洗浄と回収 本章では 、SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit、SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit を用いた非特異的ハイ ブリダイゼーションの洗浄およびキャプチャー産物の回収の方法について記載しています。 7.1. ① 洗浄用バッファーの準備 47 ℃ のインキュベーターを準備します。 このインキュベーターは、洗浄用バッファーを予加温、Stringent Wash バッファーでの洗浄時の保 温に使用します。 実測値として 47 ℃ が保持されるウォーターバス、サーマルサイクラー、ヒートブロック、オーブ ン (インキュベーター) 等をご用意ください。温度は温度計を使用してご確認ください。 ② SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit のバイアル ①・②・ ③・④、ボトル ⑦を溶解させます。 ・試薬 SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (冷凍) 10X Wash Buffer I (バイアル ①) は、18 ℃以下で析出します。25 ℃ で 5 ∼ 10 分間加温して完全 に溶解させてからご使用ください。同様に、10X Stringent Wash Buffer、2.5X Bead Wash Buffer についても低温で析出することがありますので、完全に溶解させてご利用ください。 ③ ②の各溶液を希釈します。 SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit PCR grade water 1x 溶液の 必要量 使用温度 10x Wash Buffer I (バイアル ①) 10μl 90μl 100μl 47℃ 10x Wash Buffer I (バイアル ①) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Wash Buffer II (バイアル ②) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Wash Buffer III (バイアル ③) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Stringent Wash Buffer (バイアル ④) 40μl 360μl 400μl 47℃ 2.5x Bead Wash Buffer (ボトル ⑦) 200μl 300μl 500μl 室温 上記の容量は、ハイブリダイゼーションサンプル 1 本あたりに必要となる容量です。複数本の実験 を行っている場合には適宜増量させてください。 希釈後の溶液は室温 ( +15 ∼ +25 ℃) で 2 週間保存可能です。 ④ ③で調製した 1x 溶液のうち、 100μl 1x Wash Buffer I と、400μl 1xStringent Wash Buffer を 47 ℃ に加温 します。 実測値として 47 ℃に設定されたインキュベーターを使用してください。 少なくとも 2 時間は加温し、温度を安定化させてください。 27 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 7.2. Capture Beads の準備 ① SeqCap EZ Capture Beads (ボトル ①) を室温に置きます (使用 する 30 分前) 。 ② SeqCap EZ Capture Beads を Vortex でよく混合し、100μl を新しいチューブに分注します。 ・試薬 SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (冷蔵) 100μl SeqCap EZ Capture Beads 15 秒間 新しいチューブ 例えば 4 反応量の場合、400μl を分取して複数サンプル分をまとめて準備することも可能です。 ただし、分取量は 1 チューブに 6 反応量までとしてください。 ③ ②のチューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明にな ったら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 DynaMag-2 を使用する場合には、通常、5 分以内に溶液は透明になります。MagnaBot II Magnetic Separation Device (96 ウェルプレート用マグネティックラック) を使用する場合には 1 分間置いて ください。 以下では 1.5 ml チューブを用いて洗浄する方法について説明します。 96 ウェルプレートを使用す る場合は、SeqCap EZ Library SR User’s Guide (Version4.1、英語版) の Appendix C をご参照くだ さい。 上澄みを捨てる際にビーズに触れないようご注意ください。多少の上澄み溶液の残存は次のステッ プで取り除かれます。 上澄み溶液を捨てた後はビーズが乾燥しないよう手早く次のバッファー等を添加してください。 懸濁中に溶液がチューブの蓋裏に付着してしまった場合には軽くスピンダウンを行ってから次のス テップに進んでください。 28 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ④ 200μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、十分に懸濁します。 200μl 1x Bead Wash Buffer (室温) 10 秒間 ③のチューブ まとめて準備している場合、例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、800μl の 1x Bead Wash Buffer を添加します。 ⑤ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ⑥ ④∼⑤をもう一度繰り返します。 ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 2 回洗浄します。 ⑦ 100μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、Vortex またはピペッティングでよく懸濁します。 100μl 10 秒間 1x Bead Wash Buffer (室温) ＜サーマルサイクラーに対応していないサイズのチューブを使用している場合＞ 47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズのチューブに 100μl ずつ分注します。 100μl ずつ 47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズの新しいチューブ 例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、400μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、 Vortex でよく懸濁した後、 100μl ずつ 4 本に分注します。 96 ウェルプレートを使用している場合には、ピペッティングにより充分に懸濁してください。こ の場合には移し変えなどの操作は必要ありません。 29 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑧ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 3 回洗浄します。 多少の洗浄溶液の残存は後のストレプトアビジンとビオチンの結合反応に影響を与えません。 上澄みを除去した後は、直ちに次のステップへ進んでください。Capture Beads を乾燥させないよ うにしてください。 7.3. ① Capture Beads と DNA の結合 洗浄済みの Capture Beads にハイブリダイゼーション溶液の全量を加え、10 回のピペッティングにより充 分に懸濁させます。 15μl (全量) 47 ℃ ハイブリダイゼーション溶液 洗浄済み Capture Beads (ビーズペレット) 手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。 ② 47 ℃ のサーマルサイクラーに入れます。 ①のチューブ 約 15μl 47 ℃ ヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう設定してください。 ③ 15 分毎に 3 秒間の Vortex をしながら、45 分間 47 ℃ でインキュベーションを行います。 15 分間 3 秒間 47 ℃ 30 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 7.4. ① DNA が結合した Capture Beads の洗浄 47 ℃ に加温した 1x Wash Buffer I を 100μl 添加し、Vortex でよく懸濁します。 100μl 10 秒間 1x Wash Buffer I 47℃ ＜0.2ml チューブで操作している場合＞ 全量を新しい 1.5ml チューブに移します。 全量 (約 115μl) 新しい 1.5ml チューブ 1.5 ml チューブに移し替えることにより、以降の洗浄ステップでマグネティックデバイスのサイズ とチューブサイズが一致し分離操作が容易になり、また、洗浄バッファーの容量に対して充分なチ ューブ容積を持たせることができるようになります。 サンプル数が多く、移し替えに時間が掛かる場合には、数本ずつ操作を行うことで温度の低下を防 いでください。 ② マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。 ③ 47 ℃ に加温した 1x Stringent Wash Buffer を 200μl 添加し、10 回のピペッティングでよく懸濁します。 100μl 1x Strigent Wash Buffer 47℃ 手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。 ④ 47 ℃ で 5 分間加温します。 31 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑤ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。 ⑥ ③∼⑤を繰り返します。 1x Stringent Wash Buffer での洗浄は合計 2 回です。 ⑦ 1x Wash Buffer I を 200μl 添加し、2 分間 の Vortex でよく懸濁します。 200μl 2 分間 1x Wash Buffer I 室温 ⑧ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ⑨ 1x Wash Buffer II を 200μl 添加し、1 分間 の Vortex でよく懸濁します。 200μl 1 分間 1x Wash Buffer II 室温 32 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑩ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 サンプルが複数本の場合には、⑩∼⑬までの操作を 1 本ずつ進めてください。 ⑪ 1x Wash Buffer III を 200μl 添加し、30 秒間 の Vortex でよく懸濁します。 200μl 30 秒間 (厳守) 1x Wash Buffer III 室温 ⑫ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 手早く操作してください。Wash Buffer III に長時間置くと回収率が低下したり、Complexity が損な われる恐れがあります。 ⑬ PCR grade water を 50μl 添加し、よく懸濁します。 50μl PCR grade water サンプルが複数本あり、1 本ずづ操作している場合には、⑩に戻り残りのサンプルの操作を 1 本ず つ進めてください。 次の章に進めるサンプルは 、この Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) です。ここで上澄みを捨 てる操作は絶対にしないでください！ ⑭ -15 ∼ -25 ℃で保存するか、次の章へ進めてください。 33 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 8. 本章では 、SeqCap EZ Accessory Kit を用いたキャプチャー後のサンプルライブラリを増幅する方法について記 載しています。増幅後の溶液は SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (または QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。 LM-PCR の準備 8.1. ① ・試薬 SeqCap EZ Accessory Kit (冷凍) 必要試薬を氷上で溶解させます。 PCR Grade Water (バイアル ②) SeqCap EZ PCR Master Mix (バイアル ③) TS-PCR Oligo 1 & 2 溶液 (バイアル ④) Capture Beads 結合キャプチャー溶液 SeqCap EZ PCR Master Mix および本試薬を含むマスターミックスは温度に対して敏感です。必ず 氷上で溶解、調製を行ってください。 ② Post-Capture LM-PCR マスターミックスを調製します。1 本のキャプチャーサンプルにつき、2 反応を行 います。 ネガティブ、ポジティブコントロール を同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確 認されているライブラリ溶液をご利用ください。 Post-Capture LM-PCR マスターミックス 2 反応 (1 キャプチャーサンプル) あたりの容量 SeqCap EZ PCR Master Mix (バイアル ③) 100μl PCR Grade Water (バイアル ②) 50μl TS-PCR Oligo 1 & 2 溶液 (バイアル ④) 10μl total 160μl マスターミックスは必ず氷上で調製してください。 マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 10% 程度を増量 して計算してください。 ③ マスターミックスを良く混合し、スピンダウンします。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 34 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ④ Post-Capture LM-PCR マスターミックスを 80μl ずつ PCR チューブに分注します。 80μl ずつ Post-Capture LM-PCR マスターミックス ⑤ ７章４項⑭ (33 ページ) の Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) を Vortex でよく混合します。 ⑥ 20μl ずつ の Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) を④の Post-Capture LM-PCR マスターミックス分注チ ューブに添加します。 20μl ずつ ⑦ Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (または) PCR grade water (negative control) ライブラリ溶液 (positive control) ピペッティングでよく混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 残りの Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (約 10μl) は、-15 ∼ -25℃で保存します。 35 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 8.2. PCR 増幅 サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 94℃ 2 min 94℃ 10 sec 60℃ 70 sec 72℃ 45 sec 72℃ 7 min 4℃ Hold サイクル 100μl 18 サイクル Pre-Capture LM-PCR でのプログラムとはサイクル数が異なりますので、実行プログラムを間違え ないようご注意ください。 反応終了後は 4 ℃で保存し、72 時間以内に精製の工程へ進んでください。 8.3. ① DNA Purification Beads を用いた Post-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap EZ Purification Beads (ボトル ②) を室温に置きます (使用する 30 分前)。 ・試薬 SeqCap EZ Pure Capture Bead Kit (冷蔵) 80％エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。 SeqCap EZ Purification Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製す ることも可能です。この場合、製品付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは Buffer EB ではなく PCR grade water を使用してください。 ② 各増幅後溶液を新しい 1.5 ml チューブに移します。 200μl (全量) 増幅後溶液 新しい 1.5ml チューブ ネガティブ、ポジティブコントロールサンプルについても同様に操作してください。 36 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ③ SeqCap EZ Purification Beads を Vortex でよく混合し、360μl を ② のチューブに添加します。 360μl (1.8 倍量) SeqCap EZ Purification Beads 10 秒間 ④ ②のチューブ Vortex で混合し、室温で 15 分間インキュベーションします。 室温、15 分間 ⑤ チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明になった ら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑥ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80 % エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80％エタノール (用時調製) ⑦ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 37 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑧ 上記 ⑥ ∼ ⑦ を繰り返します。 80 % エタノールにより合計 2 回洗浄します。 ⑨ マグネティックラックから外し、チューブの蓋を開けた状態で 5 ∼ 10 分間、37℃でインキュベーションし ます。 乾燥のさせ過ぎは収量の低下につながりますのでご注意ください。 ⑩ PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸濁します。 52μl PCR Grade Water Buffer EB や 1x TE ではなく、 必ず PCR Grade Water を使用してください。 タッピングからのスピンダウンも可。 ⑪ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分間 ⑫ チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込みます。 38 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑬ チューブ内の溶液が透明になったら 50μl の上澄みをピペットで吸い取り、新しいチューブに移します。 50μl 新しい 1.5ml チューブ ⑭ 約 50μl の Post-Capture LM-PCR 産物が調製されました。 ８ 章４項・９章で品質が確認された場合には、このサンプルがシークエンシング反応に進める溶 液となります。 39 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 8.4. ① Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 濃度を測定し、吸光度測定上での品質基準を満たしていることを確認します。 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質 基準 1.7 - 2.0 A260/280 比 500 ng 以上 収量 ネガティブコントロールでの収量 ごく微量 Post-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 10 ng/μl 以上の濃度で測定されると見 込まれます。 ② 1μl の Pre-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物 を Agilent DNA 1000 Kit で泳動し、 泳動上での品質基準を満たしていることを確認します。 DNA Marker Reference Peak Amplified Sample Library 150 ∼ 500 bp ネガティブコントロール産物でピーク見られないことをご確認ください。 吸光度測定上の品質基準を満たしていない場合には、もう一度精製を行って下さい。電気泳動上で の品質基準を満たしていない場合にはトラブルシューティングをご参照ください。 40 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 エンリッチメントの確認 9. 本章では、キャプチャー前後でのサンプルのエンリッチメント倍率を qPCR を用いて算出する方法について記載 しています。この操作はサンプルのプロセシングとは直接関係ありませんが、シークエンスを実施する前に調製 されたサンプルの品質を確認するために実施していただくことをお奨めします。 シークエンスキャプチャー製品のうちヒトゲノムを対象として設計された SeqCap EZ ライブラリは、 NimbleGen が設定したコントロール loci もキャプチャーされるように製造されています。このため、ヒトゲノム を用いた実験では本マニュアルまたは製品添付のユーザーズガイドに記載されているプライマーセットをそのま ま利用していただくことが可能です。ヒト以外の生物種での実験の場合には、任意のターゲット領域から qPCR 用プライマーセットを複数箇所ご自身で設計し、本章で記述している方法と同様の方法を実施してください。ヒ トゲノムを用いた実験の場合でも、特定のゲノム位置の正確なエンリッチメント倍率を求める場合にはその領域 に特異的なプライマーセットを設計してください。これは、コントロール loci のエンリッチメントは実験全体の 成否の概算として考えるよう設計されているからです。 本章では、Roche Applied Science の LightCycler® 480 Instrument II を用いて、LightCycler® 480 Multiwell Plate 384, white (with sealing foils)、LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2x Mix) を使用する場合の操作を概説し ています。詳細は製品付属のマニュアル類を参照してください。 qPCR の準備と開始 9.1. ① 必要試薬等を氷上で溶解させます。 ② ・試薬 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2X Mix) (冷凍) LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2x Mix) PCR grade water で 2μM に希釈した qPCR 用プライマー Pre ライブラリプール または Pre-Capture LM-PCR 産物 Post-Capture LM-PCR 産物 LightCycler 480 にプログラムを入力します。 Program Name Cycles Pre-incubation 1 Amplification Melting Curve Cooling 40∼50 1 1 Analysis Mode None Quantification Melting Curves None Target (℃) Hold (time) 95 10 min 4.8 - Non 95 10 sec 4.8 - Non 60 1 min 2.5 - Single 95 10 sec 4.8 - None 65 1 min 2.5 - None 95 - - 5 Continuous 40 10 sec 2 - None Ramp Acquisition Acquisitions Rate Mode この qPCR プログラムは LightCycler 480 Instrument II と LightCycler 480 SYBR Green I Master で 最適化されたものです。その他の機器・試薬で最適な結果を得るには qPCR プログラムを変更して いただく必要がある可能性があります。 41 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ③ 反応数を確認し、マスターミックス作成量を決定します。 ＜必要なウェル数について＞ 1 対のプライマーセットにつき、3 ウェルずつ反応を行います。これをキャプチャーの前後のサンプルをテ ンプレートとして行いますので、1 サンプル・1 対のプライマーセットにつき 6 ウェル分のマスターミック スを調製する必要があります。つまり、4 対のプライマーセットを用いますので、1 サンプルにつき 24 ウ ェルが必要ということになります。 この他に、ネガティブ・ ポジティブコントロール用にそれぞれ 1 対のプライマーセットにつき 3 ウェルず つが必要ですので、これらのウェル総数のマスターミックスを調製します。つまり、4 対のプライマーセッ トを用いますので、コントロールとして 24 ウェルが必要ということになります。 ＜マスターミックスについて＞ 例えば、3 サンプルの実験を行っている場合には、下図の赤い四角のように、各プライマーセットについて、 24 ウェル分＋αのマスターミックスを作成します。4 対のプライマーセットがありますので、4 本のマスタ ーミックスが作成されることになります。 42 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ④ Pre ライブラリプール または Pre-Capture LM-PCR 産物、Post-Capture LM-PCR 溶液、ゲノム DNA 溶液 (ポジティブコントロール用) の一部を分取して 5 ng/μl 溶液を調製します。 Pre ライブラリプール (または) Pre-Capture LM-PCR 産物 5 ng/μl 溶液を調製 Post-Capture LM-PCR 産物 希釈には PCR grade water を使用し、2 本で差が出ないように正確に希釈してください。 これらの 5 ng/μl 溶液は qPCR によるエンリッチメントの確認の工程以外では使用しません。また、 qPCR 反応産物を以降の実験に使用することもありません。 ⑤ マスターミックスを調製します。 コンポーネント 1 ウェルあたりの容量 PCR grade water 5.9μl 2μM フォワードプライマー 0.3μl 2μM リバースプライマー 0.3μl SYBR Green Master (2x) 7.5μl total 14μl それぞれのプライマーセットでマスターミックスを調製してください。4 本のマスターミックスが 作成されることになります。 ⑥ マスターミックスを 14μl ずつ分注します。 43 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑦ ④で 5 ng/μl に調製したテンプレート溶液をそれぞれ 1μl ずつ分注します。 5 ng/μl に調製した溶液を分注してください。希釈前の溶液を分注しないようご注意ください。 ⑧ Sealing foils を張り、スピンダウンします。 ⑨ LightCycler 480 にプレートを入れ、②で入力したプログラムを実行します。 Roche Applied Science LightCycler® 480 Instrument II の付属のソフトウェアで Crossing point (Cp) を算出 します。Cp 値はバックグランドレベルを超える量の増幅産物が合成された時点の反応サイクル数 (立ち上 がりサイクル数) を示しています。テンプレートに含まれる分子の量により増減しますので、キャプチャー 反応により特異的なゲノム領域を抽出した後は Cp 値は小さくなり、テンプレート溶液中にターゲット分子 数が多く含まれることを意味します。機器の操作法およびソフトウェアの使用方法の詳細は製品付属のマニ ュアル類を参照してください。他の機器・ソフトウェアを用いた場合には Threshold Cycle (Ct) を同様の意 味で利用することができます。 44 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 9.2. ① qPCR データの解析 ランの終了後、LightCycler 480 のソフトウェアの melting curve (dissociation) analysis を開き、解析を実行 します。 それぞれのプライマーセットで検出されるピークが 1 つであることを確認します。2 つ以上のピー クが観察される場合には非特異的増幅産物、プライマーダイマー、その他のアーティファクトによ り、以降の解析で算出される Cp 値が信頼できない値である可能性があります。 良い例 ② 悪い例 LightCycler 480 のソフトウェアの Absolute Quantification Analysis Module で、2nd Derivative Maximum Method を開き、解析を実行します。 エンリッチメントの確認のためには、標準曲線を作成するような絶対的な定量を行うことは必ずし も必要ではありません。 ③ Cp 値をテキストファイルとして保存します。 データテーブルウィンドウ上で右ボタンクリックし、「Export Table」をクリックします。 ファイルの保存先を求めるダイアログが表示されますので、任意の保存先を選択し、任意のファイル名称を 入力した後に、「Save」ボタンをクリックします。 45 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ④ エクスポートされたテキストファイルを Microsoft Excel などで開き、レプリケート (3 ウェルの) データの 平均値と SD を算出します。 エクスポート前に LightCycler 480 付属ソフトウェアを利用して平均値を算出している場合にはこ こでの計算は必要ありません。 レプリケート内での SD 値が 0.2 を超えている場合には qPCR 実験をやり直す必要がある可能性が あります。 ⑤ ネガティブコントロールの Cp 値を確認します。 測定できていないか、非常に大きい値( 34∼35 )であることを確認してください。 ⑥ それぞれの組み合わせのサンプルでプライマーセットごとに Pre-Capture Cp 値から Post-Capture Cp 値を 引き算します。 例）あるサンプルの NSC-0268 プライマーセットのデータが… Pre-Capture サンプルでの平均 Cp 値 = 28.4 Post-Capture サンプルでの平均 Cp 値 = 17.5 28.4 - 17.5 (Delta-Cp 値) ＝ 10.9 ⑦ PCR Efficiency (E ) 値から、エンリッチメントフォールドを算出します。 Tm (℃) Product Length (bp) qPCR Efficiency (E ) NSC-0237 81.15 80 1.84 NSC-0247 81.03 74 1.80 NSC-0268 78.99 75 1.78 NSC-0272 82.23 71 1.93 例）あるサンプルの NSC-0268 プライマーセットのデータが… Delta-Cp 値が 10.9、E 値が 1.78 なので、 Delta-Cp E ＝ (1.78)10.9 ＝ 537 ヒト以外の生物種での実験を行う場合には、予め E 値を算出しておいてください (場合によっては 理論値 2 を代入します) 。 Microsoft Excel でべき乗を算出するには、「^」を利用します。 46 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑧ qPCR 結果の解釈をします。 ＜結果を解釈する上でのヒント＞ エンリッチメントフォールド値は、キャプチャーするゲノムサイズ (ターゲットサイズ) により大きく変動 します。例えば、ヒトエクソーム (v3.0 であれば 64Mb) の場合には理論的なエンリッチメントフォールド 値は約 50 倍程度に、1 Mb のヒトカスタムターゲット領域の場合は約 3000 倍、250 kb のヒトカスタムタ ーゲット領域の場合は約 12,000 倍となります。 しかし、多くの場合、現実的なエンリッチメントフォールド値は、上述のような理論的に予測される値とは 一致しません。また、ターゲットサイズが同じでもターゲットゲノム位置が異なる場合にはエンリッチメン トフォールド値が同じ値にならないことが普通です。 ヒトキャプチャー用コントロール loci は、正確なエンリッチメント値を算出するという意図ではなく、シー クエンシングに進めるべきではないサンプルを割り出すことを意図して設計されています (実際のターゲッ ト領域へのプローブ設計アルゴリズムとは異なるアルゴリズムでプローブが設計されています) 。このため、 ヒトコントロールプライマーセットで算出されたエンリッチメントフォールド値は実際のターゲット領域の エンリッチメントフォールド値を反映しない可能性があります。例えば、ヒトエクソーム実験の場合、理論 的な最大エンリッチメントフォールド値よりも高い値が算出されます。実際のターゲット領域のエンリッチ メント値を概算する必要がある場合には、ターゲット領域内に qPCR 用のプライマーセットを設計して実 験を行ってください。 Roche NimbleGen で行った様々なカスタムゲノム領域のキャプチャー実験によると、カスタムゲノム領域 のキャプチャー実験の場合にはエンリッチメントフォールド値が少なくとも 10 倍以上でなければシークエ ンシングに進めるべきではありません。 一方で 10 倍以下のエンリッチメントフォールド値を示したとしても、それがエンリッチメントの失敗であ るとは断定できません。これは qPCR の技術、E 値の正確さ、適切なコントロールを取っているかなどの 様々な条件によって変動する可能性があるからです。 また、コントロールプライマーセットを用いた場合に 10 倍以上のエンリッチメント値を示したとしても、 満足なシークエンシング結果が得られると保証するわけではありません。 コントロールプライマーセットを用いた場合でも、4 つのエンリッチメント値は一定ではなくバラつくのが 普通です。これは、主に下記の理由により生じます。 1） loci が異なるとキャプチャー効率が異なる 2） qPCR による増幅効率の違い このことから、エンリッチメントフォールドを算出する場合には複数の loci に対して実施することが重要と なります。 47 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 10. 付録 10.1. Pre-Capture LM-PCR 産物の qPCR による品質確認 下記の操作による Pre-Capture LM-PCR の品質確認は、必ずしも必須の操作ではありませんが、 SeqCap EZ ライブラリを使用した実験に慣れていない場合 材料となったゲノム DNA の品質に懸念がある場合 調製した Pre-Capture LM-PCR 産物をハイブリダイゼーションに進めても良いか自信が無い場合 には、Pre-Capture LM-PCR 産物の qPCR による品質確認を行っていただくことをお奨めしています。この方法 では、多少の品質不良などを検出するには不向きですが、著しく不良でハイブリダイゼーションプロセスに進め るべきではないサンプルを発見することができます。 ① Pre-Capture LM-PCR 産物の一部を分取し、5 ng/μl の希釈溶液を調製します。 ② ゲノム DNA (増幅等を行っていないもの) を、同様に 5 ng/μl に希釈します ③ 上記①・②の希釈溶液とネガティブコントロール (水) をテンプレートとして利用し、９章に記載の qPCR を実施します。反応サイクル数を 40 サイクルより多く設定した方が良い場合があります。 ④ ネガティブコントロール (水) でほとんど増幅が起こっていないことを確認します。 ⑤ Pre-Capture LM-PCR 産物の Cp 値と、ゲノム DNA の Cp 値から、% difference in Cp を算出します。 式： (pre-Capture Cp ‒ Genomic Cp) / Genomic Cp 48 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ⑥ データを評価します。 ＜評価原理＞ フラグメント化してアダプターを結合させた後のライブラリの 70% はゲノム DNA、30% がアダプター DNA です (ゲノム断片サイズの分布とアダプターダイマーの量に依存して変動します) 。このため、ゲノム DNA のテンプレート溶液には Pre-Capture LM-PCR 産物のテンプレート溶液よりゲノム DNA 由来の核酸 量がやや多く含まれ、ゲノム DNA の Cp 値は Pre-Capture LM-PCR の Cp 値よりやや小さくなります。ゲ ノム DNA に由来しない核酸 (プライマーダイマーやアダプター由来断片など) 含量が大きなライブラリや、 品質が正しく評価されていないゲノム DNA をライブラリ調製に使用したためにゲノム DNA に由来する核 酸含量が低いライブラリなどは、それぞれの Cp 値の差 ( % difference in Cp ) が大きくなります。また、品 質の良いライブラリでは、全ての Loci で同じポピュレーションが維持されていると考えられ、理想的に は % difference in Cp は Loci に関わらず一定の値となるはずです。 ＜評価基準＞ それぞれのプライマーセットの % difference in Cp から、Pre-Capture LM-PCR 産物の品質を評価します。 良好な品質の Pre-Capture LM-PCR 産物が調製されている場合には、% difference in Cp は典型的には 10% 以下となります。２つ以上のプライマーセットで、% difference in Cp が 15% 以上である場合にはそのライ ブラリをハイブリダイゼーションに進めるべきではありません。もう一度ライブラリを調製してください。 49 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 10.2. トラブルシューティング ＜ライブラリ調製＞ 症状 原因 / 対処法 もう一度泳動を実施して結果を確認してください。必要であれば ライブラリサイズのピークが 150∼400 bp に入っ ライブラリ調製をやり直してください。ゲノムの断片化の条件 ていない。 と、SeqCap EZ Purification Beads でのサイズ調製のステップで の操作にご注意ください。 １０章１項の「Pre-Capture LM-PCR 産物の qPCR による品質確認」の実験結果で、2 つ以上 のコントロール Loci において増幅後産物の Cp 値 が ゲノム DNA の Cp 値より 15 % 以上大きい。 調製した LM-PCR 増幅済みのライブラリはハイブリダイゼーショ ンに使用するのに適していません。もう一度１０章１項 の実験を 実施して結果を確認してください。必要であればライブラリ調製 をやり直してください。 ＜Pre-Capture LM-PCR 産物＞ 症状 収量が 1μg 未満である。 原因 / 対処法 ライブラリ調製の操作に間違いがあった、使用した試薬が劣化し た、PCR プログラムが間違っていた、プライマーの希釈に TE を 使用したなどの可能性があります。LM-PCR 用の試薬・プライマ ーについては、評価済みのサンプルをポジティブコントロールと して使用してください。PCR プログラムを確認してください。必 要であればライブラリ調製をやり直してください。 適切にゲノムが断片化されていなかった可能性があります。ライ ブラリ調製をやり直してください。ゲノムの断片化の条件と、 Agilent DNA 1000 chip の結果において、増幅産物 SeqCap EZ Purification Beads でのサイズ調製のステップでの操 の平均長が 150∼500 bp でない。 作にご注意ください。ゲルからのフラクションの切り出しが有効 な場合もあります。 A260/280 比が 1.7 未満である。 サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し てください。 LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ ーによるものと考えられます。こうしたキャリーオーバーは 150 bp 以下のサイズに 1 本か複数のシャープなピークとして観察さ れます。こうした短い核酸はコンタミネーションとはみなされ LM-PCR のネガティブコントロールで、バックグ ず、キャプチャーの工程にも影響を与えません。しかし、ネガテ ランドレベル以上に吸光度測定値が観察された。 ィブコントロールからの LM-PCR 産物の吸光度測定値がかなり高 い値を示す場合にはサンプルライブラリのコンタミネーションが 起こっている可能性があります。必ず電気泳動で核酸サイズ分布 を確認し、必要であれば LM-PCR /ライブラリ調製をやり直して ください。 150 bp 以下に 1 本か複数のシャープなピークが 観察される。 LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ ーによるものと考えられます。こうした短い核酸はコンタミネー ションとはみなされず、キャプチャーの工程にも影響を与えませ んが、吸光度による濃度測定が過大評価されてしまいます (実際 のライブラリ濃度は吸光度測定値よりも低濃度となります) 。低 分子断片の除去をゲルからの切り出しで実施する場合にはこのよ うなピークは観察されません。 LM-PCR のネガティブコントロールで、150∼ 500 bp のサイズで増幅産物が観察される。 増幅サンプル間でのクロスコンタミネーションが原因である可能 性があります。ライブラリ調製試薬のコンタミネーションが無い かどうかを確認し、必要であれば新しいキットでライブラリ調製 をやり直してください。 50 / 51 SeqCap EZ Library SR 日本語マニュアル v4.1 ＜Post-Capture LM-PCR 産物＞ 症状 原因 / 対処法 ハイブリダイゼーションか洗浄のステップでの温度が適正ではな かった可能性があります。それぞれの機器の温度を実測で測定 し、正しい温度でもう一度実験を繰り返してください。 収量が 500 ng 未満である。 PCR 用の試薬が劣化していた可能性があります。ポジティブコン トロールを用いた場合に充分に増幅されるかどうかをご確認くだ さい。ポジティブコントロールでの増幅が確認できなかった場合 には、ハイブリダイゼーションをやり直し、新しい PCR 試薬で 操作を行ってください。 ターゲット領域の設定が小さい場合 (特に特定の遺伝子のみのエ クソン領域をキャプチャーするような設計の実験で) は収量が充 分に得られない場合でも十分なシークエンス結果が得られる場合 があります。コントロール loci でのエンリッチメントフォールド 値と合わせて結果を評価してください。 適切にゲノムが断片化されていなかった可能性があります。ライ ブラリ調製をやり直してください。ゲノムの断片化の条件と、 Agilent DNA 1000 chip の結果において、増幅産物 SeqCap EZ Purification Beads でのサイズ調製のステップでの操 の平均長が 150∼500 bp でない。 作にご注意ください。ゲルからのフラクションの切り出しが有効 な場合もあります。 A260/280 比が 1.7 未満である。 サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し てください。 ＜qPCR によるエンリッチメントの確認＞ 症状 原因 / 対処法 3 ウェルの Cp 値 (Ct 値) の SD が 0.5 より大き い。 ピペッティング操作のエラーが疑われます。もう一度 qPCR を実 施してください。 ネガティブコントロールの Cp 値が小さい。 ウェル間でのクロスコンタミネーションか、試薬のコンタミネー ションが疑われます。もう一度 qPCR をやり直してください。 エンリッチメントフォールド値が低い場合、キャプチャーの特異 1 つ以上のプライマーセットのエンリッチメント 性が低く、シークエンシングの結果の「On target リード率」が 倍率、または 4 つのプライマーセットでのエンリ 低くなる可能性を示唆しています。qPCR をもう一度やり直し、 ッチメント平均倍率が 10 倍よりも低い。 エンリッチメントフォールドを再度検証してください。必要であ れば最初の工程からやり直してください。 51 / 51 R ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 〒105-0014 東京都港区芝 2-6-1 TEL: 03-5443-5287 FAX: 03-5443-7098 MAIL: [email protected]