Title 液胞型ATPアーゼの阻害機構の解明を目指し

Title
Author(s)
液胞型ATPアーゼの阻害機構の解明を目指した標識化サ
リシリハラミドの合成研究
杉本, 賀規
Citation
Issue Date
Text Version ETD
URL
http://hdl.handle.net/11094/23464
DOI
Rights
Osaka University
ι
f
多
博士論文
液胞型ATP
アーゼ、の阻害機構の解明を目指した
標識化サリシリハラミドの合成研究
平成02 年度
杉本賀規
/3!
クδ
¥1l
寸ll寸l141
ノ
多
け
博士論文
液胞型ATP
アーゼの阻害機構の解明を目指した
標識化サリシリハラミドの合成研究
平成0
2 年度
杉本賀規
31 ク! 3
略語表
Ac
lyteca
ACMA
9・6-onima
aq
suoeqa
ATP
enisoneda
9-BBN
.3[olcycibarob-9
BCA
cininohcnicib
Bu
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Bz
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CGM
nifamorhc
CSA
camphor
cinoflus
CuTC
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)s(yad
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DMSO
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ATP esahtnys
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B
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TBS
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TEA
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-2
1
Ia yr
-tret
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lynoflusenahtemoroulfirt
TFA
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dica
TFAA
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THF
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SPIT
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TPAP
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Ts
lynofluseneulot-p
V-ATPase
raloucaV
WSCD
retaw
edimidobrac
proylamonium
epyt
elbulos
etanehturep
(W )- ATPase
edimidobrac
)edirolhcordyh
ro(
13-l・
yhte
)lyporponimal・
yhtemid-3(
目次
19
第 1章 序 論
ト1
液胞型ATP
2-1
V-ATPase
3-1
サリシリハラミドとベンゾラクトンエナミド系マクロリド
1・4
サリシリハラミドA の全合成研究
5-1
サリシリハラミドの A の、構造活性相関研究およびV-ATPase
1・6
固体NMR
1・7
フッ素による有機化合物の標識
1・8
研究目的
アーゼ
特異的阻害剤
と原子間距離測定
J
3
司
ウJ Q J
司コ
司
フッ素化サリシリハラミドA の合成
F3
3-2
司
，
ム
フッ素化サリシリハラミドA の合成計画
4 5 5 6I ζ J
2-
25
、
戸43
第 2 章フッ素標識化サリシリハラミドの合成
サリシリハラミドA の合成
推定阻害機構
3
参考文献
2 ・1
凶
61
参考文献
3 ・2
クロマフィン頼粒膜を用いた定量的アッセイ
3 ・3
活性試験結果の考察
弓
サル腎臓細胞を用いたイメージングアッセイ
ウJ A U
3 ・1
阻害活性試験
3A
6777
第 3 章フッ素標識化サリシリハラミドの V-ATPase
『
参考文献
第 4 章ピオチン化サリシリハラミドの合成
1-4
ピオチン化サリシリハラミドA の合成
57
参考文献
48
第 5章 結 論
58
第6 章 実 験 項
86
スベクトルデータ
901
謝辞
171
第 1章 序 論
1・1
液胞型 (W-)ATP
アーゼ)1
プロトンポンプである液胞型σι)ATP
アーゼ、 )esaPTA-V(
は、多くの細胞内小器官
に発現している、生理的に重要な膜タンパク質である。特にリソソーム、分泌頼粒、
エンドソーム、ゴ、ノレジ体、クロマフィン小胞、シナプス小胞などの中央空胞系lartnec(
raloucav
)metsy
pH 5.4
-5.6
に属するオルガネラの内部は、 V-ATPase
の働きによって、いずれも
と酸性に保たれている。そのため、これらのオルガネラは、細胞質とは異
なる環境を形成し、それぞれ分化した小器官に特有な機能を担っている。 V-ATPase
は、酵母の液胞において見いだされて以来、真核生物全般に広く分布していることが
明らかとなってきた。例えば、 V-ATPase
は、上述の中央空胞系オルガネラ以外に、破
骨細胞、がん細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、視覚の毛様体の上皮細胞および精巣上体
の上皮細胞の細胞膜にも存在し、それぞれ、骨粗しょう症、ガンの侵襲、尿細管性ア
シドーシス、緑内障に関与している。このため、 V-ATPase
を標的とした創薬研究が、
近年盛んに行なわれている )2 。
V-ATPase
は
、 ATP
の加水分解によって生じるエネルギーを』駆動力として、プロト
ンを濃度勾配に逆らってオルガネラ内に能動輸送する働きを持つ。この際に造りださ
れる膜内外の電気化学的なポテンシャル差、あるいは内部の pH の低下(酸性化)は、
それぞ、れのオルガネラが関与する種々の生理的活動に重要である。例えば、シナプス
小胞内への神経伝達物質の濃縮、あるいはリソソームにおける異物の分解やエンドソ
ーム内部のレセプターJ ガンド複合体の解離と再生、がん細胞の転移、破骨細胞に
よる骨の溶解・再吸収などに必要である事が知られている。
動物、植物、および真菌由来の種々のオルガネラから単離された V-ATPase
すると、いずれも構造的に高い相同性がある。このことは、 V-ATPase
を比較
の構造が、多岐
は、少なくとも 31 種類
の生物にわたって普遍的であることを示している。 V-ATPase
の異なるサブユニットから構成されている複合タンパク質である。さらに、個々のサ
ブユニットにもイソ型(アイソフォーム)が存在している。
定された構造推定された V-ATPase
V-ATPase
102
年および 7
02
の構造を、それぞれ、図 1・(1 右)、図 2-1
年に推
に示す。
は、大きく 2 つの部分、すなわち膜貫通部分 V o 部分と突出部分 V1 部分に
分けられる。 V1 部分は、サブユニットA， B ，C ，
D，
E ，F，
;G H の 8 つから構成されてお
'c ，
"c ，
Ac45
り
、 Vo 部分は、サブユニット a，d，e，c，
の 7 つから構成されている(表 1・)1
V 。部分はプロトンチャンネルを形成し、 V 1 部分は泊?加水分解触媒作用を
al ，
ld ，
o)el
有している。
と構造的に類似しているものとして、 ATP
V-ATPase
れている(図 1-1
左0) F -AT Pase
合成酵素 )esaPTA-F(
3)が知ら
は、ミトコンドリア内膜や葉緑体のチラコイド膜など
の細胞膜に存在し、呼吸や光合成によって形成されたプ ロ トンの濃度勾配を駆動力と
して ATP
平 ATPase
を合成している膜タンパク質である。複合体構造および機能に関する研究は、
に比べて F-ATPase
が先行しており、突出部位 IF 部分の高分解能 X 線結晶構
造解析 )4 および酵母菌 FoI
構造の低分解能 X 線結晶構造解析
を構成するサブ、ユニットの位置関係や F -ATPase
にされている。そこで、 F-ATPase
によって、 F -ATPase
5)
の機能発現機構は、おおよそ明 らか
との相同性を利用して、 V -ATPas
e の複合体構造お
よび機能発現に関する研究が展開されてきた。
V-A WaS
Fτ
A P' aso
9
珂P
...t DP -P ，
脂'IOlt!~
瀦
Vo
H2
図 1-.1
V-ATPase
右
(と
)
噌
F-ATPase
4悼
膜 内側
(左)の比較 102(
-2 -
細胞外
年に提出されたモデル)I
)C
N o n一回 初gOl U
O
5
'io n f
o sub n il A
v
細胞質側
1車内側
図 1・
.2
V -ATPase
の構 造 702(
-3 -
年 に提唱されたモデ ル
'))a
表 1・
.1
サブユニット
分子量
I kDa
明らかになっている e
saPTA-V
酵母遺伝子
の構成サブユニット比dl )，
el
晴乳類のアイソフォーム
サブユニットの機能
関連する疾患
(マウス)
突 出 部 分 V1
A
70
VMA1
B
60
VM A2
81 (腎臓，精巣上体)
82 (遍在的)
C
40
VMA5
C1 (遍在的) 腎
C精2巣
a，
上
b体
(肺
) ， 臓
，
D
34
VMA8
E
33
VM A4
F
14
VMA7
G
13
VMA10
H
50
VMA13
部位
ATPase
中心軸の固定子
非加水分解触操部位
アクチンやアルドラーゼ
の結合部位
中心軸の固定子
V-ATPase
の活性の
制御
周辺にある固定子
アクチンの結合部位
:18
難聴
原細管性
アシドーシス
回転軸の構成
中心軸の軸受け
日(精巣) 的
E2 (遍在
)
周辺にある固定子
RAVE
やアルドラーゼの
結合部位
回転軸の構成
ATPase
活性の促進
GG12( 遍
(在
経
臓
細
，
的
精
胞
巣
) )
神
G3( 腎
上体
周 辺lーある固定子
RAVE
結合部位
た別々にスプフイスを受け
い-A TPase
2 つの変異体が存在す
る
。
の活性制御
中心軸の固定子
FEJ¥I
の結合部位
膜貫通部分
V。
a
10
1 ル液ジ胞体
)
VPH {ゴ
STV1
(=ì)[;~fi$:)
a12 肉
((経
神
庄
臨
骨
細
細
細
!楕
胞
胞
胞
畢
)}
a3 破
(
(
上体)
a4 腎
プロトン輸送通路
発現場所の制御
アルドラーゼの結合部位
周辺の固定子
V 1 の ATP
d
38
VMA6
e
9
VMA9
c
17
VMA3
'c
17
VMA11
"c
21
VMA16
Ac45
45
1d (遍在的精)
d2 (腎臓
巣上体)
加水分解と
v。のロータ一回転との連
動
回転軸の構成
不明
日甫乳類に存在せず
酵母に存在せず
プロトン輸送
回転ローターの構成
プロトン輸送
回転ローターの構成
プロトン輸送
回転ローターの構成
酵母菌にのみ存在
不明
-4-
:3a
大理石
骨病
:4a 難 聴
原細管性
アシドーシス
サブユニット A とB は
、 ATP
加水分解酵素の機能を担っており、 ATP
を ADP
に加
水分解する o この時、サブユニット A と B は、コンホメーション変化を起こし、ひ
ずみエネルギーを蓄える。サブユニット A と B は、このひずみエネルギ}を解消し
ようとより安定な元の立体構造を取ろうとするが、この時、 V 1 部位と Vo 部位を連結
している中心回転軸を時計周りに回転させる力が生じる。中心回転軸は、サブユニッ
トD 、F 、d の 3 つから構成されており、サブユニット d の部分で、 Vo 部分の回転子(プ
ロテオリピド・リング)に結合している。この回転子は、サブユニット c，
ピ
ョ "c から構
成される 6 量体であり、中心回転軸の回転に伴って、時計周りに回転する。この際、
プロトンを、 Vo 部分のサブユニット a から回転子のサブユニット
C
へと受け渡される
ことによって、膜を挟んで能動輸送している。サブユニット a の膜突出部位と残りの
サブユニット C ，E ，q H は、固定子として機能している。すなわち、サブユニット A
と B が中[I二回転軸を時計回りに回転させる際に、 A と B が回転しないように固定す
るためのものである。この固定子が存在することで、サブユニット A と B で生じた
回転のトルクは、中心軸を介して、膜貫通部位の回転子へと伝えられる。このような
機構で、 Vl 部位における ATP
分子の ATP
加水分解と
v 。部分の回転子の回転が共役していて、
1
が加水分解されることにより、 2 個のプロトンが膜を介して能動輸送され
ると考えられている。
v 。部分のプロトンチャネルに関しては、以下の知見が明らかになっている。先ず、
サブユニット
C
から成る疎水性の高いプロテオリピド・リングがプロトン輸送に関わ
っていることは、酵母菌のサブユニット c，
'c ，
"c を用いた実験から明らかになった )6 。
ピ
， "c の膜貫通領域を、図 3-1
酵母菌のサブユニット c，
に重要なグルタミン酸は、緑色で表記している)。
-5 -
に示す(プロトンチャネル活性
N9
/
h¥
43
細 胞質側
/戸、¥
i ¥
TM2
TM3
i ¥
TM1
¥
サプユニ ットc
図 3-1
i
Nノ
C
TM 2 TM3
E18
TM4
)¥¥ー
サプユニ ットピ
(C
¥
1
TM4
Nノ 〉
膜内側
¥
t
脱貫通部川立
TM1
i
TM1
TM2
TM3
¥)ノ
c
TM4
¥ ーノ
サプユニ ッ ト"c
酵母菌のサプ、ユニット C ，
'C ，
"c の膜貫通領域の図 )6
個々のサブ、ユニット c は、クソレタミン酸残基をただひとつだけ有している 。このグ
ノレタミン酸を DCCD
でマス クすると、 V-ATPas
e のプロト ンポンプ活性は完全に阻害
されることから、この部位の周辺が、プロトン結合部位であると考えられている 。一
方で、プロトン輸送に 別 のサブ唱ユニ ッ トも関与すると考えられている 。酵母菌の
の V o 部位のサブ、ユニット a の膜貫通領域図を、図 4-1
V-ATPase
に示す(プロトンチ
ャネル活性に重要なアミノ酸を、赤色で表記している )。サブユニット a は
、 9 回膜貫
通部位を有する大きなサブユニットである 。変異導入実験により、 395
)395K(
、927
番および 347
アノレギニン残基(R 537
番ヒスチジン残基9
27H(
およ び R79 )9 、987
および )
347H
番グ、ルタミン酸残基)987E(
、537
番リジン残基
番および 97
番
は、プロトンチャ
ネノレ活性に重要な残基であると考えられているロなかでも 、7 番目 の膜貫通部位に存
735
在する R
R735
を変異すると、プロトンポンプ活性が完全に 阻害されることから、特に
がプロトン輸送に非常に重要であることが明らかにされている 句。
-6 -
NH
，
f六
細胞質側
(三
。
~\
@
長
議
膜貫通部位
2
膜内側
T M3
TM 4
犠
TM 6
〉乞) ( s
図 4-1
常 空
T MB
~三三
酵母菌のサブユニット a の膜貫通領域の図 )6
以上の点を考慮した結果、現在提唱されているプロトン輸送機構のモデルを、図 5-1
に示す
1吋。
-7 -
，
¥
，
•
¥
図 1・
5.¥んATP
ぉe
/
のプロトン輸送モデノレ 10)
プロ トンは、細胞質側プロトンチャネノレ
(サブユニット a の上半分)のある部分から、膜内のプロトンチャネ/レに入り(図
-1 )a5 、
膜内に入ったプロトンは、サブユニット C ，c'および "c のク、ルタ ミン酸残基に受け渡さ
れる(図 )b5-1
は 、V 1 部分における AT P
。一方、V o のプロテオリ ピド・リング(回転 子)
加水分解と共役して、時計回りに 回転している。 この回転に伴い 、グ‘ルタミン酸に結
合したプロトンは、 内腔仮J I プロ トンチャネノレ(サフゃユ ニット a の下半分)のアルギ ニン
残基に受け渡される(図)c5-1
。そして、アルギニ ン残基 に結合したプロトンは、サブ
ユニット a のプロ トン輸送路を介して、 内腔側に抜 ける 図
( )d5-1
-8 -
。
1・2 esaPTA-V
特異的阻害剤
生体分子(タンパク質，核酸，脂質など)が織り成す一連の生命現象を、化学反応に置
き換え、その現象の意義を分子レベルで、解明することは、科学者の最終的な目標であ
る。生命現象の意義を分子レベルで、解明する有効な方法論の一つは、特異的阻害剤を
用いた研究である )7 。
特異的阻害剤とは、生理的に重要な生体内の標的分子(タンパク質など)を、特異的
に識別することにより、その分子の機能を変化させ、結果、細胞機能や生体反応を変
化させる化合物のことである。よって、生体内の標的分子の機能発現および生きた細
胞や生体におけるその機能発現の意義を、優れた特異的阻害剤を用いることにより統
saPTA-V
一的に理解できるはずである。特に、 e
が果たした役割は大きい。 e
saPTA-V
の研究の進展において、特異的阻害剤
が関与している生命現象が広範に及ぶことが明ら
かになってきたが、それらはパブイロマイシンなどの e
saPTA-V
特異的阻害剤を用い
ることで同定された。すなわち、パフィロマイシンを添加することで影響を受ける生
saPTA-V
命現象は、 e
が関連している生命現象であると比較的簡単に同定できる
パフィロマイシン )9 は
、lrtS ψsecymot
ロリド系抗生物質であり、 e
saPTA-V
bl ，
)8 。
から抗菌作用を指標に単離されたマク
suesirg
を特異的に阻害することが B
owrna
らによって
発見された。また、類似の構造を有する 81 員環マクロリドであるコンカナマイシン
)01
も特異的阻害剤として知られている(図 )6-1
。
MeO
0 ，，-
OH
OH
人人
OH
OH
0
、、、/、~
r
OMe
パフィロマイシ Al
図.6-1
esaPTA-V
，. yesaPTA.
コンカナマイシン F
特異的阻害剤であるパブイロマイシン A 1 とコンカナマイシン F
を標的とした薬剤開発および e
saPTA-V
の機能発現機構の解明の観点から、
パフイロマイシンおよびコンカナマイシンの阻害機構の解明は重要である。現在まで
に明らかになっている阻害機構を、以下に紹介する。
パフィロマイシンは、出fのosCI
値で、-V唱
1A esaP
-9-
を特異的に阻害することから、 1分子
のバフィロマイシンで l分子のv・
ATPase
を限害していると考えられている 叱 比較的疎
水性が高いために、細胞外に加えても、細胞膜を通過して細胞内に入り、 -V 氾'P esa
を問害することができる 。また、パフィロ 7 イシンの mVIVO
は
、 ni ortiv
における V -ATPase
の阻害
で、の結果と異なり可逆的であり、培地を洗浄すると 30 分程度で、オルガネ
ラの内部が、限害斉IJ処理以前の程度にまで再び酸性化される 町。バフィロマイシンの
構造活性相関研究11 )の結果より、テトラヒドロピラン環構造および12 位のヒドロキシ
基は活性にあまり重要でなく、 7位のヒドロキシ基およひe ジエン構造を含むマクロラ
クトン構造が活性に重要であることが、明かにされている。この傾向は、コンカナマ
イシンの構造活性相関研究 12) からも得られている 。また、パフイ ロマイシンにはなく
コンカナマイシン A が有している糖側鎖は、阻害活性に殆ど影響がないことが明らか
になっている。これらのことから、バフィロマイシンおよびコンカナマイシンの疎水
7) )21 。
性の高いマクロラクトン部位が活性発現に重要である ことが示唆された(図 1・
この事は、両者が膜貫通部位に作用しているとしづ事実と矛盾していない。
OλMe
lA1
人
OH
、
テトラヒドロ ピラン環
ー
疎水性部位
OMe
パ フィ ロマ イ シ ン A
仏
，
!UJyOH
疎 水性 部{立
糖部分
.Me.';.:.. .
，
?:;
テトラヒドロ ピラン環 ー
図ト 7
コ J カナマイ エ
ノン A
|
相互作用に重要なパフィロマイシンおよびコンカナマイシンの部分構造21
パフイロマイシンおよびコンカナマイシンによる V -ATPase
)
阻害活性機構の詳細は、
まだ明らかではない。しかしながら、いずれも Vo 部分のサフ守ユニット c に結合部位を
有していることが、コンカナマイシンの光親和性標識体 13) である J・コンカノライドA
図
( )8-1
を用いた実験により明らかにされている )41 。パフィロマイシン、コンカナマイ
- 01 -
シンおよび、 -J コンカ ノラ イドA のATP 加水分解阻害活性 を表 1・2 に示す。
OMe
O~A A
OH
MeO
OH
0九 人 A
O
同N
一
丸9
2 -
HO
も
、
r
e
刈
ィ
フ
外
一側
一
一
イ
v
γ
u - ごb
-..ふ
.，
. "0 ，
コンカナマイ V ン ん
MeO
Q
入 人 人人
iOH
"0
r
O
¥イ司、
ノ
¥-'<-"
Jーコンカノライド A
CF
3
N= N
図 1-8
コンカナマイ シンの光親和l性標識体である Jーコンカノラ イ ドA
表 1-2. N asarc
esaPTA-V
および M se
tx a 由来 V -A
TPase
a
Ba 五mol yc
ni A I nacnoC
amyc
/μM
/ 凶4
0.5
N arc ss
a
0.20
.010
M atxes
a バフィ
に対す る ATP
in A I
J-C
nacno
加水分解阻害活性
eol
di
51 -2
0
ロ7 イシン、コ ンカナマ イシンおよび J-コンカノラ イ ドA の ATP
害活性を 1C
50
A
/μ
M
加水分解 阻
値 で示した。
さら に
、 バフ ィロマイ シンお よびコンカナマ イシン との結合 に重要な、サブ、ユニ ッ
トc の残基が、 Bowman
らによっ て特定された51 ) (図ト )9 。すなわち、変異導入によ
り調製 されたバフ イロ マイシンおよ びコンカナマ イシン耐性アカパンカ ビ菌株は、サ
ブユニ ット c 上のア ミノ酸配列 に変異を生 じていた。その結果
、 阻害剤が結合する 際
に重要な 9 つの残基 と して、23 番スレオニン残基)23T(
ン残基31( 9 お よび)451
お よび 041
341
、55 番パリン残基)5V(
番 ロイ シン残基(L1
番チロシン残基)34IY(
、031
23 および L1 )04 、631
が同定された (図 9-1
ー
1-
、93 番および 45 番 イ ソロイシ
番 メチオニ ン残基)
031M(
、231
番フェニルアラ ニ ン残基)631F(
番
、
左)ロま た、 これら 9 つのアミノ酸残
基うち、 M 130 ，
L132
，
F136
，
L1 40 ，
Y143
タミン駿残基(E )831
を含む、ヘリックス 4 に集中していた。この点と、サブユニット
の 5 つが、プロトン結合部位である 831
番グル
c のヘリックス 4 がサブ、ユニット a に空間的に近接していること(図 9-1 右)を考慮して、
パフィロマイシンおよびコンカナマイシンは、サブユニット c のプロトン結合部位の
近傍に結合し、プロテオリピドリングの回転を阻害することで阻害発現するというモ
デルが提唱された。
93
L
G
V
V
K
A
③2
3
G
Y
-AFGAALGALGVALGAGLQ1F
4355
S
K
P
V
M
A
S
A
G
O
L
c
G
T
F
V
G
V
L
v
A
A
Y
ヘリッ クス 1
M
S
o
L
c
p
v
s
c
v
G
M
L
A
s
G
F
F
D
P
T
Q
vy
0 631
w
A
v
⑬0
41
G
L
~ 143
G
L
2
3
V
A
N
s
2
サプユニット a
へリックス 3
アカバンカピ V -ATPase
のサブユニット c の、アミノ酸残基トポロジ}図(左)
および 4 つの膜貫通ヘリックスの配置モデル(右)
また、 Marsh
4
ヘ リックス 4
k
A T .L N T S C
A
3
4
L
L
M
L
0 糾 Y
ヘ リックス Z
図 9-1
0 231
Y
L
A
G
⑩0
31
T
A
膜貫通部位
QQPRLF
A
)Ji
P
0
A
RGADG Vl
M
A
T
G
V
G V L R
らは、 ESR
15
)
により回転相関時間 τを測定することで、 スピンラベル化
サブユニット c から 構 成 されるプロテオリピド・リングの回転が、 コンカナマイシン
AI
の添加により減速するこ とを示した )61 図
( 1・
)01 。すなわち、 ロ
( ブスター肝醇由来
ー
21 -
のe
saPTA-V
の)サブ ユニ ッ トc を
、 プロ トンチャネル活性に重要な 831
ミン酸(E )831
を NCCD
番目のグ‘ルタ
でスピンラベノレ化 し、回転相関時間 τを測定したところ、約 95
μ
s であった。そこに、阻害斉Jjであるコンカナマイシン
A J を作用させたところ、約 20
同 へと長くなった。この結果は、コ ンカナマイシン A J がサブ、ユニ ット c と相互作用
することで、サブユニット c の回転が抑制されていることを示している。 e
saPTA-V
阻害剤は、サブ、ユ ニット c のプロテオリングの 回転を止めることで活性 を発現すると
いう推測はなされていたが、実験的に証明された初めての例である。(表 3-1 ，回転相
() は、サブユニット c リングが 1 回転するのに要する時間と考えてよい)。
関時間τ
j
阻害剤
ラベ
ESR
回転相関時間 τ
()
(N CD をスヒ・ンラベノレ
として使用)
速い回転
遅い回転
(阻害押 l有り)
コントローノレ
(阻害剤無し)
コンカナマイシン AJ
τ= 59 t: 5μs
NCNC
τ= 02
t: 35μs
MeO
0 "， 人 A
トペム
o
、
OH
HO
f
E 041 のスピンラベノレ
イヒ試築
図 101 " ESR
ー
(阻害剤無し)
。
=や
NCD:
測定
コンカナマイ シン A J
による、ラジカノレ標識化サブユニット c-プロテオ リングの 回転の観測
- 31 -
3-1
サリシリハラミドとベンゾラクトンエナミド系マクロリド
)71)AS(A
サリシリハラミド
は、海綿 ilaH
/c
ona .ps から単離された 21 員環マクロリド
であり、サリチル酸部およびエナミド側鎖を含んだ特徴的な構造を有する(図 )1-1
saPTA-V
バフイロマイシン類とは異なり、晴乳類の e
的に阻害する事が特徴的である
)81
のみを 1 品 4 以下の IC
50
。
値で、特異
。また、ヒト腫蕩細胞に対して非常に強力な細胞毒
性を示し、また他の抗腫蕩性天然物と比較してより単純な構造を有していることから、
新たな抗ガン剤のリード化合物として注目を集めている。
。
H吋~
・
ー
)(edimalahilycilas
図1-1 .l
ー
edimalah(ilycilas-)
A )AS(
8 (S8)
抗腫蕩性マクロリドの SA およびサリシリハラミド B)BS(
その後、サリシリハラミドと類似した構造を有する一連の化合物、ロパタミド
)91
、
アピキュレリン )02 、およびオキシミジン )12 などが相次いで発見された(図ト )21 。これ
らはいずれも分子内にべンゾラクトン部分とエナミド部分を有していることから、ベ
ンゾラクトンエナミド系マクロリドと分類されている。興味深いことに、これら一連
の化合物は、がん細胞に対する成長阻害活性プロファイノレを共有していることが、ご
く最近明らかとなった。すなわち、非小細胞肺がん細胞、大腸がん細胞、脳がん細胞、
卵巣がん細胞、腎臓がん細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、白血病細胞およびメラ
ノーマ細胞などの NCI
06 細胞系列に対して、成長限害活性スクリーニングを行なっ
・
たところ、一連のベンゾラクトン系エナミドは、白血病細胞とメラノーマ細胞に対し
て
、 G I50 にして 1 品 f 以下と、特に強い抗腫蕩性を示すことが示された
- 14-
81 ，
)2
。
OH
。
β O h
e
ri¥=NJ
¥=N 、
OH
OH
0βOh
J
OH
OH
2
Lobatamide
Lobatamide
=
HN ーポ
6'
I
ー
=
:B R
H
:E R 2 = OH
川
¥=N
OMe
一一
I
R' 2
OH
2
Lobatmide
Lobatmide
:A R
H
:D R 2 = OH
ラ
=¥=N
o
:C R 2
:F R 2
Lobatmide
Lobatmide
=H
=OH
_~N--c
、
OMe
OH
OH
O
OR 3
Oximdne
Oximdne
1
J
べ
:A R 3 = H
:B R 3 Me
l¥IH
=¥=Nbwl
HO
HO
，
059
31-JC
図ト1
.2
なげ
753
，
種々のベンゾラクトンエナミド
回
=
間ぐ「RT
OH
OH
21-JC
neralucipA
neralucipA
II
51 -
a
M
UN
M
O
'
C-r
サリシリハラミド A の全合成の研究例
.4-1
サリシリハラミド A(SA)
は、他の抗腫療性天然物と比較してより単純な構造を有し
ていることから、新たな抗ガン剤のリード化合物として注目を集めている
ateR
。実際、
製薬会社では、サリシリハラミド誘導体が、新奇抗がん剤として臨床開発され
ている
)32
。ベンゾラクトンエナミドは、サリシル酸、マクロリド、エナミド側鎖を有
している。本質的に、真菌の e
saPTA-V
凶
)1
には殆ど作用せず、暗乳類性 e
saPTA-V
のみを
f レベノレで、阻害する。そのため世界各国で盛んに合成研究が行われており、 208
年
の時点で 9 つの研究グループによって全合成(または、形式全合成)が達成されている
2 ，
)42
。
SA は、構造上 2 つの部分、すなわち 3 箇所の不斉炭素を有するベンゾラクトン部
分、および高度に不飽和な N- アシルエナミド側鎖からなっている。これまでに行われ
ている全合成においては、ベンゾラクトン部分を先に構築し、構造的に不安定である
と予想されるエナミド側鎖を最終段階で導入するという手法がとられている。ベンゾ
ラクトン部分の構築には、閉環メタセシス反応 (RC 聞と光延エステル化反応が主に用
いられているが、鈴木カップリングや tS11i e カップリング、および交差エステル化反
応が用いられている例もある(スキームト )1 。
町
61 -
W
パ
M川
OM
スキーム 1・
.1
1
Me
yy
h 人 メ
~
川
ng
R 2 = Me
，MOM
，
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M
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…
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C
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，
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1
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M
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R'
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rI I/F}A C人 M GDr
、
、 MH 〆
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HO
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OMe
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へ./へ
一 一人
L ーー-)
0
~"ìγ/ 、 O H
'<:-、ノ弘、
/有』ノ
l
+汁
へ
、
〉
10
SA のベンゾラク トンの構築法
がアシルエナミド側鎖の導入には、 3 つの手法、すなわち、
i )ヨ ー ドオ レフ ィン
とアミドとのカップリング反応、 i i )イソシアネートとヘキサジエニル 金属試薬との
カップリング反応、iii ) アルデヒドとア ミドから 調製されるアミナ}ル の脱水反応が、
主に用いられている(スキーム 1・
)2 。以下、それぞれの合成法について概略を述べる。
- 17 -
+同 N
〈~
ucycooc
f
nifelodoi
UN
〉
j
OJ
1)
JN
r ¥=:f
lyneid
子
f
1)
noitanimile
)2talylised
旧n
latem
2 ) des noitaliyl
etanycosi
O
d
la deh
~--{ヘJ
yde
+
22: よNH1P
〈「J 一
O
.Z( )Z -amide
スキーム 2-1 . SA の N -アシルエナミド側鎖の導入法
Furstner
らは 24a) 、対応するサリ シノレ駿フラグメ ントとアルコ ールを光延エス テル化
反応により 連結し、続くGru sb
第二世代触媒を用いた RCM
によ りベンゾラク トン部
分を構築している。 その後、ヨー ドオ レフィンに変換し、チオフェンカノレボン酸銅(I)
を用いたカップリング反応を行うことで、
Z( ，
Z)ーエナミド側鎖 を立体選択的に構築す
ることに成功 して いる ス
( キーム 1・
)3 0 71 位のエナ ミド部位に関する立体異性体が高IJ
生するため (17E:17Z=2
.5:1)、望みの立体異性体を HPLC
により単離・精製す る必要が
あるものの 、
他のグループと 比較し て、短工程 E つ立体選択的に SA を合成 している。
ー
18
Milsunobu
~
noilacifirelse
M
OPMB
OMe
.N-Mes
lC !h.
.. _
0 ¥
¥f¥|
'd
F¥
N.
田
"IC
ぴ、
ム¥
OPMB
，Ph
KU~
1
一
一
PCY 3
RCM
グ #
{-H-2N
CuTC
O
バ
ヘJ
EH
ヘJ
:5.2
スキーム3-1 . renFu
tsr
らは 42 旬、
rentsruF
ぐ
γに
へ
+
，Rb 2C0 3，DMA
57%
De rednabarB
z
1
らに よる SA の全合成
らと 同様に構築したべンゾラクトンを、イソシアナ
ートへと誘導し、へキサジエニノレリチワムとのカップリング反応を行うことで、全合
成を達成している(スキーム 4-1 )。しか しながら、ヘキサジエニルリチウムを立体選
択的に調製することが困難なため、エナミド側鎖の立体選択的導入には問題があ り
、
さらに、続く脱保護反応は、エナミド部位の異性化を伴うため、得られるサリシリハ
ラミド A は、対応するイソシアナー トから 2 段階 20%
の低い収率で、側鎖の異性体
との混合物として得られている 。ま た、生成 した SA のエナミド部位と未反応のイソ
シアナートとがカップリングして生成する、 2 量体型誘導体が副生成物 として得られ
てくるため、効率的な合成法ではないと考えられる。
ー
91 -
Mitsunobu
-..，
.noitacifiretse
NCO
，- OPM
lChuC，，
cuPpd 3Y Ph
CI"
C
RCM
日
)
f~
HO
竹、
rO 之
町
O
〈
- N
u
F¥d ー
γOH
r γ ヘグ
neht
+
H F e-nidiryp
20%
2( )spets
、
、OH
ハν〈 口 ' ，
R
乙
= Z-he
xa
neid
ly (10%)
ro 乙lyneidaxh-E
スキーム 1・
4
，
らは 42 c)、De
Smith
らによる
De Brabander
SA
(10%)
2( )spets
2( spet
)
の全合成
らと 同様に構築したイソシアナートを、 一旦エナミン
Brabander
に変換した後、 Z(・
)，
Z へプタジエン酸塩化物とカップリングすることで全合成を達成
している(スキーム )5-1
。
Mitsunobu
/esterificat~?!!
NCO
NHTe
∞
HLR
イヘJ
イヘj
CI
OR
T』
ロM
c
u
ド =
一R
M
C
R
一
一
r- R=
I
noitalylised
丁目 S ，'R = Teoc
'- R= R '=H
スキーム 1・
.5
Labreque
Smith
らによる
SA
の全合成
らは d42 )、ベ ンゾラクトン部分 を構築した 後、アノレデ ヒドへ と誘導 し、Z(ー
)，
Z
'N ・
ビスア ミドへと変換し、続 く脱離反応
アミドとのカップリング反応により 一旦 N ，
) 。
によりエナミド側鎖を構築している (スキーム 1-6
- 20-
O
OBn
庁
T IPSO
0
一
一
、
O
H2N~
O
OTSDPS
TMSOTf
RCM ~'
1一
If=¥(N--
NγR
O
)1 NaH
(48%)
noital2)
ylised
52 - 40
スキ ーム 6-1 . euqrbaL
Herb
らも
24<
、
euqrbaL
)
ni( )2spets
%
らによる SA の全合成
らと同様にベンゾラク トン部分をアノレデ、ヒドへ変換 した後、
Z( ，
)Z ・
ア ミ ドとのカップリング反応により-!Lアミナールへ誘導し、続
よりエナミド側鎖を構築している(スキ ーム)7-1
Herb
く脱水反応に
。しかしながら、 La uqerb
e らおよび
)Z ー
ア ミドとのカップリング反応、続 く脱離反
らの方法論では、アノレデヒドと (Z，
応によるエナミド部分の構築の 2 段階収率が、それぞれ、 81 % 、27%
と低い。また、
エナミド部位を構築した段階で、生じた立体異性体をシリカゲノレカラムクロマトグラ
フィ ーにより分隊することが可能であるが、最終段階の脱保護反応で、エナミド部位
が高頻度で再び異性化するのに加え、収率は、それぞれ、 25-40%
-2 1 -
、69-75%
と低い。
Mltsunob
noitcaer
o
一
六
丁
目 50
0
日
H 2N
‘
々叫…
-0=I
NJ
enid
ぐ" = 1
「亡~
+
diryp-FH
(75%)
eni
I R = TBS
し R= H
(45 %)
スキーム 1-7
.
Herb
enidryp-FH
I
(69 %)
LR=H
R = 丁 目 (14%)
らによる SA の全合成
また、マクロ リド部分の新奇構築法として 、開環メタセ シス (RCM)
ー
宮浦カップリング、ellitS
カップリングを用いる方法が 、Maier
によってそれぞれ開発 されている(スキーム )8-1
択性の観点、から、光延エステル化反応と RCM
が優れている。
-2 -
の代わりに鈴木
ら 24 町、Ri ascaz
ら )g42
。しかしながら、収率および立体選
を併用するマクロラクトン構築法の方
reiaM
puorg
Mitsunobu
1，
--.
eslerificalion ~，
OMeO
OPMB
)1 9B- BN
)2 Pd (dpf)C
¥/
fγγyOMOM
OMe
，I
日
。、
HO
0
48%
~~~~
ascziR
OPM
E :Z=4
:1
puorg
074
+
。
H
グ¥ / ¥ J
¥、/〆
OPMS
へ 子 ¥〆¥
0'
Pd 2(dbah
，
TFP.
NMP
8nSU
3
-7
一
76~拍
COOH
一
一
NaH
64%
スキーム 1・8. reiaM
およびRi asacaz
らによる新規マ クロ ラクトン構築法
また、サリシリハラミドを含むベンゾラクトンエナミドの側鎖導入に有用な方法論
が
、 Colema
n らめにより報告 されている(スキームト )9 。すなわち、 チオフェ ンカノレ
ボン酸銅( 1 )
/6存在下、ヨードオレフインと、マレイミドから調製されるアミドをカ
ップリングして得 られるエナ ミ ドの TBS
基を除去後 、不安定イリドを作用 させるこ
とにより、エナミド側鎖を立体選択的に構築するというものである。
- 23 -
1
P
h HN アOTBS
， 、
CuTC
，diamne
K 3 P0 4 ，dioxane
24 h
90 oC ，
72 %
。
てJ
----l
=f，
-78
fわ
い
ot 0 。
C
94%
R =H
ニ1;
OTBS
56 %
TtMH
ロM
c
u
pnpn
市内出
nameloC
THF
己 R=TBS
TBAF
%49'
M W川
スキーム.9-1
3'1P
1.
己
f
O
らにより報告されたエナミド側鎖導入の新規方法論
以上のように、 SA の全合成において困難な点は、
Z( ，
)Z ーエナミド側鎖を立体選択的
に導入すること、および導入したエナミド側鎖の異性化を防止することある。後者に
関しては、エナミド側鎖導入後に、保護基の除去等の反応を行わなければ解決できる
可能性が高い。
- 24-
5-1
サリシリハラミド A の、構造活性相関研究および V -必'P ase
推定阻害機構
は関わっているため、ヒトドATPase
様々な生理現象に司I-ATPase
の阻害作用は、毒
性につながる。そのため、抗がん剤や骨粗しよう症治療薬などの医薬品として、 SA
そのものは使用できない。 V-ATPase
は、がん細胞、および骨粗しよう症に関与してい
る破骨細胞の細胞膜表面にも発現しているが、これらの標的細胞の V -ATPa
es
) 1 を開発することを目的に、サリシリハラミド A(SA)
選択的に作用する阻害斉
の構造活
のみに
性相関研究、および Rぶ~ATPase の阻害機構の解明研究が展開されている。
らは、 S A 誘導体 図
( 21-1
De Brabander
報告しており
2 ，
24b ，
)72
σ
ycilaS-}-(
グヘ/¥ー
lahil
〈~
に対するプロトン
f
R
JN
e
に示す。
OH
amide
を用いた構造活性相関研究を
、ウシ型脳クラスリン被覆小胞頼粒 V -ATPas
輸送阻害活性の結果を、表 4-1
JN
および図 )31-1
A)1( larutan(
)
イ。叩
d
R
〈も
ぐ¥ J
三~
HO
戸¥
一
、
O
。
，
白
、 OH
Twin edimalahilycilaS
、
川
"/.aS-)+(
iedimalahilyc
A )2(
図 31-1
(un aruta
Y
A
l)
De Brabander
らによる種々の SA 誘導体(1)
- 25 -
5
J Nも
ー
γ 0 '-./¥/¥/
=可
R
6
9
~~
7
Side
deifdom-niahc
、
i一 三 云 ーか Bu
sevitavired
、
ミp
8
人
Y〈しN~
HN - r
loretselohC
etagujnoc
1( 2 )
O
nitoiB
OJ
etagujnoc
)31(
H，N-{~'-"へ/\
d
O
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O
川 六f
O~ノ~
20
1-4.
De Brabander
der vievita
18
H，N -<~'-"へ/\
図
ked
HN ー込
)71(
19
sam-l
タ¥ / ヘ 〉 戸 ¥
H吋\~
Phenol-masked
A lcoh
12
らによる 種々の
- 26-
SA
誘導体 )2(
(1
)6
再構成されたウシ型脳クラスリン被覆小胞頼粒 V-ATPase
プロトン輸送阻害活性 2 ，
24b ，
)72
表 1・
.3
化合物
2
3
4
5
6
7
IC D5 I nM a
0.1<
072
7.3
2.1
0.3
0.1
<0.1
阻害形式
I nM
化合物 D5C1
不可逆
一
不可逆
8
9
01
11
21
31
41
0.1
6.1
8.1
> 01
081
> 01
032
阻害形式
に対する
化合物
一
不可逆
不可逆
一
51
61
71
81
91
02
12
CI D5 I nM
阻害形式
5.7
081
03
0.3
03
01
> 05
可逆
可逆
可逆
。サリシリハラミド誘導体のプロトン輸送阻害活性
化合物 1 は、天然型 SA であり、 1 凶f 以下の IC os 値という低い濃度で V-ATPase
を
阻害している。化合物 2 は、天然型 1 のエナンチオマーであり、阻害活性が 270
の IC os 値と、 1 より 270
品
在
倍以上低下している。化合物 3 ，
4 および 5 は、ベンゾラクト
ンエナミド部位を 2 箇所有している SA 誘導体(二量体型誘導体)である。化合物
3 ，4
および 5 は、二量体型誘導体のエナミド側鎖の構造において互いに異なっていて、そ
れらの阻害活性は、それぞれ 7.3 ，
1'品
1 .1 2 品1，3 nMの
IC os 値と、おおよそ 1 と同等の
阻害活性を保持している。化合物 6 から 13 は
、 1 とは異なるエナミド側鎖を有する
誘導体である。化合物 6 から 10 の阻害活性は、それぞれ1. 0 品在，<1.
nM，1.
0 品1，
.1 0 品1，
.1 6
8 仙 f の IC os 値と、おおよそ 1 と同等の阻害活性を有している。しかし、化合物
6 から 10 と比べて大きなエナミド側鎖を有する化合物 1 ，12 および 13 の阻害活性は、
それぞれ >100
，
1'凶
1
081
品生 >100
品f の IC os 値と、 1 より 01
倍以上低下している。
化合物 14 および 15 は、エナミド側鎖の代わりに α，
-s 不飽和カノレボニル構造を有す
る誘導体であり、それらの阻害活性は、それぞれ 230
、 1 よりも活性が 230
る。エステル 14 が
nMおよび
5.7
仙f
のosCI
値で、あ
倍以上低下しているのに比べて、ケトン 15
は 1 とほぼ同等の阻害活性を保持している。化合物 16 および 17 は
、 2 級アノレコール
およびフェノールをそれぞ、れマスクした誘導体である。化合物 16 および 17 阻害活性
は、それぞれ 081
凶4 および 30
nMの
IC os 値で、あり、 1 よりも 081
- 30
倍活性が低
下している。化合物 18 は、化合物 9 のマクロラクトンのオレフィン部位が還元され
た誘導体にほぼ対応しているが、その阻害活性は 0.3
- 27-
凶4 の IC os 値と、 1 と同等の活性
を保持している。そして化合物 19 は、化合物 9 のマクロラクトンのオレフィン部位
が還元されているだけでなく、エナミドがアミンに還元された誘導体にほぼ対応して
いるが、その阻害活性は 03
凶f
のsCI o値と、 1 と比較して大きな阻害活性の低下は見
られない。化合物 20 はエナミド側鎖をへプチルエステルに変換したものであるが、
その阻害活性は 01
21
凶4
のosCI
値と、 1 と比較して顕著な低下が見られた。化合物
は化合物 9 のエナミド部位をオキシムエ」テル様構造に変換したものであるが、
その阻害活性は 05
凶
f 以上の I
C os 値と、ほとんど活性を保持していない。
この構造活性相関研究から、 SA のesaPTA-V
の阻害活性について、以下に述べる傾
向が明らかにされた。先ず、 1 と化合物 6 ・10
との阻害活性の大きさが殆ど変わらな
いことから、活性発現には側鎖の構造はあまり重要ではないと考えられる。しかしな
がら、化合物 6-10
に比べて化合物 31-
の阻害活性の大きさが大きく低下している
ことから、ファルネシノーノレ、コレステローノレおよびピオチンといった大きな置換基
を側鎖に導入すると、 SA の活性が大きく低下することが分かつた。また、化合物 16
および 17 の限害活性が 1 と比べて 081
~
03
倍低下していることから、フェノーノレ性
ヒドロキシ基および 2 級アルコールは、活性発現に重要であることが分かつた。
また、化合物 18 は、マクロラクトン環の二重結合が還元されているが、 1 とほぼ
同等の阻害活性を示し、二量体型エナミド誘導体 3，
4 および 5 も 1 とほぼ同等の阻害
20 および 21 の阻
活性を示している。一方、エナミド部位を有していない化合物 19 ，
害活性は、天然物と比較して大きく低下している。これらの結果から、エナミド部位
の存在が、 SA の阻害活性発現に重要で、あることが分かつた。
まとめると、天然物 1 のジエン側鎖の構造は、阻害活性発現にとって不可欠という
ーわけではない。一方で、フェノーノレ性ヒドロキシ基とエナミド部位が保存されている
ことが、阻害活性発現にとって本質的に重要である。同様の知見が、同じくべンゾラ
クトン系エナミドであるロパタミド C の構造活性相関研究 )82 からも、得られている。
-s 不飽和ケトン 15 が
、 1 と同等の阻害活
また、エナミド部位を保持していないα，
性を有している。よって、エナミド部位そのものが、阻害活性発現にとって不可欠と
いうわけではない。すなわち、 -V
泊、P
ωe
の結合ポケットに適合し、結合する際に不可
欠な立体配座を構築することは、エナミド部位でなくとも、既日-不飽和ケトン部位で
可能であることを示唆している。
一方、 SA によるe
saPTA-V
関連して、 DerednabarB
saPTA-V
晴乳類性e
の阻害活性発現において、エナミド部位が果たす役割に
らは以下の結果を報告している。 SA の限害機構に関しては、
の膜貫通 v 。部分に不可逆結合していることが、示唆されている。
-28-
また、図 1・
11 およ び図 121
の SA 誘導体を用いた構造活性相関研究から、エナミド
9 および 10 は
、 V-ATPase
部位を有する 1 ，7 ，
に不可逆結合するが、エナミド構造を有
さない 5
1 ，91 お よび 12 は、天然物 1 と異なり、 V -ATPase
とが明かになった。よ って
、 SA が V- 沼'P esa
に可逆的に結合しているこ
に不可逆結合するためには、エナミド部
イ
立が必須であると考えられている。
らは、 化合物 9 の側鎖の末端が放射性同位体のトリチウムで
さらに、 De Brabnde
標識された、放射性誘導体 12 を調製して V-ATPase
程で、全体の 44% 阻害 された V-ATPase
阻害実験をおこない、その研究過
を単離した。この V-ATPase
からは、 トリチウ
ム由来の放射線が、全体の 18% に相当する線量でしか観測されず、残りの 26% に棺当
するとトリチウム線源は、消失していた 27
L
この結果は、 12 が V -ATPase
に結合する
際に、トリチウム標識化されている側鎖が脱離していることを示唆している。この結
果と上述の構造活性相関の結果(表 )3-1
SA による V-ATPase
を踏まえて、 De Brabnde
の阻害機構を提唱している
すなわち、 V -AT esaP
)72
らは、以下の様な、
図
( 1-1 )5 。
に存在するリジンやシステインなどアミノ酸残基に由来する、
求核性のアミノ基あるいはチオーノレなどが、 SA
のエナミン部位と交換反応を起こし
て、阻害斉1 1 と共有結合を形成する 一方、アミド側鎖が放出されるというものである。
しかし、こ の機構は推測の域を 出ておらず、今後より詳細な研究を行う必要がある 。
〈
岳③
H'
一
X = H; サ リシ りハラミドA 誘導体 (9 )
X = 3 H ; トリチウム標識化誘導体 (12 )
+
図ト.51
SA による V-ATPase
JN
色。
の推定阻害機構 内
92
ー
一方、同じくべンゾラクトンヱナミド類である、ロパタミド C の光親和性標識体が
調製されており(図 2)61_1
)8 、結合部位の解明に有効であると思われるが、それを利用
した研究は報告されていない。
OMe
Me
O~"
H
，
IC (o 仙の(ウ シ由来V-ATPa
ロノ〈タミド C
2nM
a
OMe
Me
0
a)es
非環状ロパタミド C 誘導体
01 nM
光親和性標識化誘導体
01
ウシ型脳 クラスリン被覆小胞頼粒 V -ATPase
図 ト1
6
V-ATPase
OMe
nM
に対するプロトン輸送阻害活性
ロパタミド C の光親和性標識誘導体とその V -ATPase
阻害活性)82
に対するサリシリハラミド A の結合部位に関する知見については、 Hus
らに よる、 1・
コ ンカノライド A との競合実験の結果(図 _1 )71 )41 から 明 らかにされてい
る。すなわち、コンカナマイシン、バフイロマイシン Al およびバフィロマイシン B 図
(J
1-1
)8 を、それぞれ共存させると、サブユニット c に対する -J コンンカノライド A の
結合が阻害された。一方、サリシリハラミド A を共存させても、 I コンンカノライド
A はサブユニット c に結合した。この結果から、 -J コンカノライド A 、コンカナマイ
シン 、パフィロマイシン Al およびバフイロマイシン B / 9)は
、 サブ、ユニット c に結合
するが、サリシリハラミド A は、それらとは異なる部位に結合することが示唆された。
- 30-
I
ド内
A
イ
フ
一
h
凡
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ザ ¥
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〉
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ン 一 イ ペ〈
コ
図 71-1
ハラ ミ ドA(SA)
AG E による 1・
コ ンカノラ イ ドA に対する結合阻害実験の結果 九阻害
Iーコンカノライド A を投与し、 UV 照射後に泳動
剤を作用させた後、終濃度1Of!Mの
することで得られた放射線写真図
14
)
左図，コンカナマイシンを阻害斉J I として選択し、
種々の濃度で添加;右図 ，
バフ イロ マイシン A I、バフ ィロマイシン BI およ び SA を阻
害剤として選択し、それぞれ 01 凶4 および 01 0 凶4 で添加
a
M
atxes
の中腸由来の V -ATPa
さらに
、 X ei と De rednabB
領域
es のサブユニ ッ トc への結合能を指標 とした
らにより、サリ シリ ハラミ ドA は
、 V-ATPase
の膜貫通
VO に結合 し、パフィロマイシンとは異なる 阻害様式を有 しているこ とが明らか
- 13 -
にされている
)72
晴乳類 e
saPTA-V
。
の特異的阻害剤であるサリシリハラミド A の阻害機構解明の研究
において、大腸菌を用いるタンパク発現システムや晴乳類 e
saPTA-V
saPTA-V
することは困難である。このため、 SA の e
の変異体を利用
阻害機構については、膜貫通部位
v。部分の、パフィロマイシンとは異なる部位に結合し、
V esaPTA
嗣
を阻害することは
明らかであるが、結合部位の詳細は明らかではない。
saPTA-V
以上述べてきたように、サリシリハラミドによる e
の阻害機構に関する研
究は、構造活性相関研究の結果をもとにして主に行なわれている。しかしながら、
V-ATPase
における SA の結合部位、 SA による V-ATPωe
詳細、および SA
とe
saPTA-V
の阻害機構の分子レベルでの
のつくる分子複合体の構造に関しては、ほとんど明ら
かにされていないのが現状である。
- 32-
1・6
固体Nl¥伎と原子間距離測定
近年、高分解能 NMR
を用いて、分子中の特定の原子間距離情報を精密に測定する
方法論が開発されており、一つの分子に対して得られた幾つかの原子間情報を基に、
分子の折れ曲がりの様子など、分子の立体構造を構築することが可能になってきた。
効果(N OE) から見積もられる水
溶液 N 乱恨の場合、核オーバーハウザー)resuahrevO(
素原子間距離を基に分子量 3 万程度までの蛋白質の立体構造決定が可能になっている。
しかしながら、膜タンパク質の場合は原子の位置がある程度固定しているため、溶液
では分子運動によって平均化されていた原子聞の磁気的相互作用が存在する。このた
め通常の NMR
測定では分解能が低く、二次元 NMR
法を用いても、分子内で多くの
原子間距離を同時に測定することは困難である。一方、固体 NMR
において測定され
る原子間距離の精度は非常に高い。さらに、直接磁気双極子相互作用を観測するので、
より遠い原子間距離測定も可能である。固体 NMR
によって原子間距離を測るために
は、従来、高速マジック角回転(MA )S によって消去されていた磁気双極子相互作用を
復活させる必要がある。この方法は、同種原子間距離を測る場合と異種原子間距離を
測る場合で、異なってくる。同種原子間距離を測る方法として、現在最もよく使われて
で、ある。この方法では、化学シフト値の
いる方法は回転共鳴法(Rlanoitato
)ecnaoseR
異なる 2 つの同種核(例えば C31
核)の共鳴周波数差の整数倍の周波数でローターを
回転させる。このことにより、同種核問磁気双極子相互作用が復活し、縦磁化の交換
速度が速くなる。この交換速度の増加の程度から原子間距離を決定する方法である。
異種原子間距離を決定する方法として、回転エコー二重共鳴法 (REDO
Echo
Double
)ecnaoseR
，R lanoitatoR
がよく使われる。この方法は、ローターの周期に同期して、 081
パルスを磁気双極子結合を持つ核の片方に照射する。このパルスの影響で回転エコー
の再結像が妨げられる。この回転エコーの減衰の程度から異種核問磁気双極子相互作
用の大きさを見積もることが可能となり、原子間距離の情報が得られる。距離測定の
目安として C ，
N 原子間距離であれば 5A 程度まで、 C ，
F 原子間距離であれば 51 A 程
度までの距離がそれぞれ土50.0
A および3.0
A の精度で測定できる。この固体高分解能
Nl¥伎による距離測定を生体分子に応用することにより、蛋白質ーリガンド複合体の結
合部位などの局所構造を精密に決定することが可能である。蛋白質ーリガンド複合体
への REDOR
法の適用例 )03 を以下に示す。
タキソールは制ガン斉uとして現在臨床的に用いられており、微小管を形成するチュ
ープリンに結合し、その脱重合活性を阻害することが知られている。 refeahcS
-3 -
らは、
タキソールaP( ilc exat )l の 13c 、IlN 、91 F 標識体を天然から誘導し、チュ ープリンに結合
した状態のコンホメーショ ンを 31 C{ 91 F }および lI N 9F}RE
D O R 測定によって推定し
e
ている(図 1-1 )8 。この場合、 19F と 13c の距縦はそれぞれ 9.6A
、01 4. A であると求め
られ、現在、距離情報から得られたタキソ ーノレのコンホメーションを基に、より親和
性の高い誘導体の調製が検討された。
0 =
惜
N
標識化タキソーノレ
図 1-18
天然型タキソ ーレ
ノ
チュ ーブリンタンパク質に結合したタキソ ーノレの分子内 REDOR
このように 、REDOR
測定 27
)
法は、標的タンパク質に結合したリガンドの立体配座を知る
上で有用な方法であると考えられる。しかしながら、 NMR
の測定核である
13C
、 IlN
は天然存在率が非常に少なく、また 91 F は天然の生体分子には含まれていないため、
標識体を調製するなどの工夫が必要になってくる 。タキソーノレの例は、天然物から容
易に誘導可能な側鎖の一部や官能基を標識したものであるが、標識位置が基本骨格か
らかなり速い位置にある。タキソールが独特な活a性を発現するのは、 チューブリンの
結合ポケットに丁度収まりよく基本骨格が適合するためであり、基本骨格の周辺部位
を標識した誘導体を用いて得られた結果を用いて、チューブ、リンとの結合の際に重要
な、基本骨格の立体配座を推定することは難 しいと思われる 。この問題を解決するた
めには、分子の基本骨格そのものを標識化する必要がある 。タンパク質やペプチド、
へ
3I
C や
IlN
を導入することは、 Pu
r eS
metsy
などの遺伝子工学的手法を用いることで比
較的容易であるが、 91 F についてはその報告例がない。また、非ペプチド性の天然物
の骨格構造に標識原子 を導入することは、天然物そのもの全合成に匹敵するため、非
常に挑戦的な課題である 3 1)。
- 34 -
1・7
フッ素による有機化合物の標識
含フッ素有機化合物は、医薬品や農薬、あるいは機能材料物質としての応用が期待
されているため、フッ素化合物の合成法、およびフッ素化反応の開発は、近年めざま
しい進展を遂げている )23 。求電子的なフッ素化試薬として、最近、ルフルオロピリジ
ニウム塩が広く用いられている 32
，
)a3
図
( 1・91 ，左から右へ行くほどフッ素化能は高く
なる)。この試薬は、従来の求電子的フッ素化試薬で、あるフッ素ガス
σ
)2 、ハイポフル
オライト (CF 3 0F)、硫酸セシウムフルオライト (CsSO~)、フッ化キセノン(XeF 2 ) などに
比べて爆発性、腐食性がなく、安全かっ簡便に扱うことができるという利点を有して
し1 る
。
点。
て
ご
「
lcyrlC
iご
L
CI~
IC
‘ N-
、 CI
F O fT
〉
フッ素化能低い[
図 1・.91
高い
種々の N- フルオロピリジニウム塩
これら試薬の特徴は、ピリジン環上の置換基の性質によりフッ素化能が変化するの
で、基質の反応性に応じて使い分けができ適用範囲が広い。例えば脂肪族化合物のフ
ッ素化においては、Gr drangi
試薬や活性メチレン化合物のナトリウム塩のフッ素化、
エノールエーテノレ類からの α- フルオロケトンへの変換、スルフィドからの α- フルオ
ロスノレブイドへの変換など広範囲に用いられている
- 35-
)3
(スキ}ム
1・)01 。
R~OR
司
人人 O 'R
σ
R
OSi
R~R
/S
R
、
CHR'
人
、/ IR
R
宮
ウ
ム
底
=;
N -7 ノレオロヒ
R/
S、
R - MgX
J
命
，
CH R'
21
スキーム 1・
10
.
N- フルオロピリジニウム塩を用いてのフッ素化反応
一方で、これらの試薬は芳香環の フッ素化にも広く応用されてい る。しかし、 ー置
換芳香環化合物のフッ素化においては、導入されるフッ素の位置選択性の低さが問題
となっていた。この問題に関して、 Umemoto
らは )a3 フェノーノレ、フシリノレフェノー
ノレエーテノレを 0 ・
選択的にフッ素化する試薬を開発した(スキーム -1 1l)。その
0・
選択性
は極めて高いため、この試薬を使用することで多置換芳香環化合物の 0 -選択的フッ素
化を行うこ とができると 期待されてい る。
3C
O
スキーム 1-1
℃lXc
， ，
α
h
C I CHCH
10 ・
C，
5.1
占@ +宮
68%
引%
フェノーノレの o イ立の選択的 フッ素化反応
- 36-
1-8 研究目的
V -ATPase
は
、 1・
1 節で述べたように生命活動に重要な役割 を担っており、骨粗し よ
、 ヒ ト腫療細
う症などの疾病にも深く関わ っている 。その特異的阻害剤であ る SA は
胞に対 して強力な細胞毒性を示し、新た な抗がん弗lのリ ー ド化合物として大きく注 目
されている
。 しかしながら分子レベルでの活性発現機構は、ほとんど明らかにさ
2，
23)
れていない。
saPTA-V
本研究の最終目的は、 SA による e
の阻害機構を解明するために分子複合体
6 節で述べた、フッ素 91
の構造解析を行うこ とである。構造解析の手段 とし ては、 1・
を利用固体 NMR
測定 (REDOR
法)を適用することにしたが、フッ素体が天然物と
同等の阻害活性を有 して いる かどうかを確かめる必要がある。
-ATPase
そこで、まず 4 位を 91 F で標識した SA の合成を行って、その V
。この標識位置は、ベン ゾラクトンエナ ミドの 共
を測定す ることを検討した(図)02-1
通部分が V -A
TPase
の阻害活性
阻害活性発現に重要であると考えられること、 及びフッ素導入の
容易さを考慮、して決定した。
J:ユぐ~ 25
円N~R1
ty
a-4s-F"91' ahilycli
図 1-20
そして、 SA
，
edilma
A
Comn
tnemgarF
4 位を フッ素 19 で標識したサリシリハラ ミド A
の結合部位 を明 らかにす るために、ピオチン標識化サリシリハラミド
を設計・合成し、その結合領域を明らかにすることを 目的とした 図
( )12-1
- 37-
。
HN
わ
J
ro ヤ目ん〉df
edimalahilycilas-detanitoib
図 2-1 .1
niAtoib(
S- )A
ピオチン標識化サリシリハラミド A のデザイン
ベンゾラクトン系エナミドは、 H甫乳類性 V-ATPase
のみを特異的に阻害することが
特徴的である。中でも、 SA は、構造が比較的単純であることから、 V-ATPase
が関連
する疾患のリード化合物として非常に有望視されている。しかしながら、 SA
による
V-ATPase
の阻害作用は、組織選択性がないため、毒性にもつながる。 SA
の様な
V-ATPase
特異的阻害剤を医薬品として用いるためには、その阻害機構を解明する必
要があるが、その詳細はほとんど明らかにされていない。
本研究により、阻害活性を保持しているフッ素標識化サリシリハラミドP( SA) を合
成することができれば、フッ素原子の特性を活かした研究法、例えば、 91 p _NMR
測定
輔
などにより、 SA
による阻害機構を、分子レベルで解明することにつながることが期
待される。また、ピオチン標識化サリシリハラミドを合成し、結合部位を特定するこ
とができれば、その限害機構の解明に著しく貢献することができるであろう。
- 38 -
参考文献
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， 田口武夫 フ ッ素の化学
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，60 ，5341
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-1
154
づ
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，
8，
第2 章
フッ素化サ リシリハラミドの合成
サリシリハラミド A の合成
1-2
第 1 章 4 節でとりあ げた全合成例およひe方法論を参考に、先ず、予備実験として 、
天然型サリシリハラミド、類の合成f レー トを確立することにした。スキーム 1-2
成計画を示す。エナミド側鎖の導入は、 Co lem an らまたは Furstner
らの方法により最
らの方法 1)ではヨードオ レフイン)5( と
終段階で行うことにした。すなわち、 Coleman
アミド)7( との
、 Furstner
に、合
らの方法 )2 ではヨ ー ドオレフィン(6
) とアミド (8
) との、チオフ
ェンカルボン酸鋼( 1 )を用いたカップリング反応、により導入することにした。マクロ
) および
ラクトン (5
s は、ジエン (9) から閉環メタセシス続 く高井オレフィン化反応に
より構築し、エステノレ(9
) は、サリシノレ酸(1
)0
とアルコ ール (1
)1 の光延エステル化反応
により連結すること にした
。
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ジヒドロキ シ安息香酸)21(
を作用させることで、サ リシル酸誘導体 (1
)3
- 42-
に対し、
を 97%
の収率で得た )4 。得られた 13 に対して T 色O を作用させてトリフラート)41(
に変換し
た後、アリルトリルブ、チルスズとの tSl1i e カップリングを行うことで、アリルベンゼ
ン誘導体)51(
を得た。得られた 15 に対し、Grdrangi
試薬とアリルアルコールから系内
にて調製したマグネシウムアリノレアルコキシドを塩基として作用させてアリルベン
ゾエート)61(
に変換した後、生じたフェノーノレ性水酸基をヨウ化メチノレでメチル化す
を得た。最後に、 Pd P( h34)P 存在下、モルホリ
ることで、メトキシベンゼ、ン誘導体)71(
反応 )5 を行い、アリノレエステル)71(
ンを用いて、辻ーtsorT
)3)9(
サリチノレ酸フラグメント
CEt
∞H
97%
3
。
在
h
0
12
tr ，
4 h
.，
DME
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20 C ，
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Pd 2(dbah
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を 6 段階 64%
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，
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サリシル酸フラグメント)01(
を参考に、市販の)R( ーグリシドール)81(
-n BU 3Sn / ¥
+
14
9R
CH 2=CHCH
20H
EtMgBr
，
THF
次に、マクロリドフラグメント)11(
)91(
o oC
80%
aceton
99%
)6
の収率で合成した。
fT 20 ，
enidiryp
13 4 )
スキーム 2 ・.2
のアリル基を除去することで、
の合成
の合成を行った(スキーム 2 0
・
)3
htimS
らの報告
のアルコ}ノレを -p メトキシベンジルエーテル
へと導いた後に、ピニルマグネシウムブロミドとヨウ化銅( 1 )から調製したピニ
)02(
ノレ銅試薬を作用させることで、エポキシドを開環して、アルコール
後
、 0
2 のヒドロキシ基を TBS
)7
。その
エーテノレとして保護して得られたオレフィン
)12(
に対
して、四酸化オスミウムを作用させてジオ」ル)2(
へと導いた後に、生じたジオ}ノレ
部位を過ヨウ素酸ナトリウムにより開裂することでアルデヒド)32(
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3 -
を得た
を得た。
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アノレデヒド)32(
に対する Brown
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を
、
で得た(スキーム 2 ・)4 。
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スキーム.4-2
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の合成
1 の分離不可能な混合物として、 2 段階収率 88%
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R =H
の不斉クロチル化反応 )8 を行ったところ、
望みの立体化学を有するアルコーノレ
)6)a42(
THF
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アノレデヒド)32(
に対して Brown
，
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，
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tr，18min
スキーム.3-2
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得られたアルデヒド)32(
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K2 0s0
，
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、/ぞ T
の不斉クロチノレ化反応
得られた 24 のヒドロキシ基を MOM
エーテル)52(
へと導いた後に、末端オレフィ
を
、 nitraM-seD
ンをヒドロホウ素化することで得られる一級アノレコール)62(
より酸化し、続いてgitiW
反応により増炭を行うことで、オレフィン)73(
試薬に
へと変換し
た(スキーム 2 ・
)5 。更に、 37 の P l¥侶基を酸化的に除去してところ、副生する
p ・メト
キシベンズアルデヒドを除去することが困難であったため、水素化ホウ素ナトリウム
によりアルコール
)92(
により 9
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を除去することでアルコーノレ
)82(
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;neht
=H
= MOM
THF.
.qa
TBSO
0 oC ot 同 1 h
，30%
NaHC03
OMOM
門 日 門
ドM jI O 、 / 人 ¥ . / - ¥ / へ
く
ー PMBO'-../人人~OH
H202
t
グ
27
)1 DDQ
，
CH 2lC r H 20 ，
ば
， 60 min
)2 NaB
91%
ト
14 ，
MeOH
•
2( )spets
OH
MeO~ν
、
，
:r--
陥 C
. I T山
、=
sepamble29qu
0 oC ，15 min
t
スキーム 2 ・
.5
メシラート)03(
続いて、シアン化カリウムを用いて、メシラート)03(
先ず、エントリー 1 として、鳥飼らの報告
)9
帆
の合成
のシアノ化を検討した(表 2 ・
)1 。
を参考に、 DMSO
カリウム、 1 等量の 81 同クラウン・6・エーテルを用いて、 .08
基質の分解反応が主に起こり、分子内環化体)a23(
、16%
.0
M
282
0
中
、 4 等量のシアン化
C で、反応を行ったところ、
およびエポキシド)b23(
がそれぞれ、
と得られるに留まった。そこで、エントリー2 では、反応温度を 45
較的低温で、行ったところ、 32
0
C と比
時間と長時間を要するものの、目的のニトリノレ)13(
の収率で得られ、また、原料 30 が 10%
72%
，
0 oC ，
15 min
)s
2( 5 ぬp
とえだし+
25%
OMOM
82%
TBSO
，CH 2IC 2，
50 min
)2 Ph 3PCH 3Br ，
IOuB-t
THF ，0 oC ，15 m
H
人
V¥/
MOMCI
，
DIPEA
， I :42 R
TBAI
，
CH 2IC 2，
7hI
~25: R
94%
88%
を得た。その後、一級アルコーノレをメシ
へと導いた。
ラートへ)03(
)1 DMP
へと還元した。そして、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
が
の収率で回収された。エントリー3 では、
溶媒への溶解度を向上させるために念入りにすり潰したシアン化カリウムを用い、
45
0
C で 27 時間反応を行ったところ、基質の分解反応が主に起こり、目的物 31 はほ
-45-
とんど得られなかった。そこで、エントリー4 として、溶媒を DMSO
から DMF
に変
更し、使用するシアン化カリウムと 81 ・クラウンー6・エーテルをそれぞれ 2 等量および
5.0
等量と少なくして、室温で、反応を行った。その結果、 37 時間と長時間を要するも
のの、目的物 31 が 69%
T8S0
..........Ms.O....
の収率で得られ、また、原料 30 が 21%
OMOM
KCN
人メ〉へ〆
，
18-crown
6-
の収率で回収された。
NC~人メ〉へ〆
snoitdnoc
T附
表 1-2
シアン化カリウムを用いたメシラート)03(
yrtne
tnevlos
2
3
48
aKCN
0.2(
m/et 。
c.p
time
/h
80
45
45
5.1
32
27
73
DMSO
DMSO
DMSO
DMF
)qe ，
nworc-81
tr
・
65.0(
からニトリル)13(
/%
dleiy
13
5
72
への変換検討
32a
25
11
11
69
32b
61
01
30
17
01
9
12
)qe
エントリー4 の条件でシアノ化反応を行った後、回収された原料を再びシアノ化反
応に供することを 3 度繰り返すことで、メシラート)03(
をニトリル)13(
率で変換することができた(スキーム 2・
)6 。得られた 13
して、アルコーノレ)23(
シナルジオール)3(
)3(
へと導いた後に、 TBAF
を得た。最後に、 DMF
を用いて TBS
へ
、 83%
の収
のシアノ基を 2 段階で還元
基を除去することで、ピ
中、水素化ナトリウムを
o oC
で、ジオール
に作用させて、そこに1. 10 等量の p- メトキシベンジルクロリドを添加することで、
1 級アルコール選択的に p- メトキシベンジルエーテル化を行い、マクロリドフラグメ
ントであるアノレコーノレ(刊
)3
を
、 76%
の収率で得た。
-46-
TBSO
OMOM
MsO~、~
KCN
18-crown
0.2(
eq)
・6 5
.0(
TBSO
eq)
ー
NC¥
入ゾんへ〆
83%
スキームエ.6
サリシル酸部)01(
でrentsruF¥
4( eq)
，
33
，
0 oC ，
90 min
)2 PMBCI
10.1(
eq)
DMF ，
tr ，30 min
，
マクロラクトンフラグメント(刊)の合成
とマクロリドフラグメント(刊)の両フラグメントが合成できたの
らの方法 )2 に従ってマクロラクトン)7( の合成を検討した(スキーム
カノレボン酸)01(
〆
93%
HO./'....人メ~
r :23 R = TBS .L 3: R = H
)1 Hal¥I
DMF
min
M ハ
O/
M¥
OE人
，
THF
OMOM
0
M
TBAF
o oC ，63
- 85 h
3( )selcy
H¥1
OE人 1
OR
MeOH
4，
)2 HBal¥I
DMF
，
吋 72
，CH 2IC 2
2・
9. - 70 oC ，70 min
)1 DIBAL
OMOM
とアルコール(刊)を光延エステル化反応
)01
η
L
。
により連結し、定量的に
エステル)8( へ誘導した。得られたジエン)9( に対し、第一世代のGru sb
触媒を用いる
閉環メタセシス反応 )11 を行ったところ、反応は 41 分と速やかに且つ高収率で、進行し、
望む E ・
体)43(
および異性体)53(
を
、 1:03
の混合物として、収率 96%
互いに分離不可能で、あったため、混合物のまま DDQ
により p-.J: トキシベンジノレ基を
と-z マクロリド)73(
除去したところ、望む E ・マクロリド)63(
で得た。これらは
をシリカゲ、ルカラムクロ
マトグラフィーにより分離することができた。そこでおのみを、 -seD
よりアルデヒド)83(
へと導いた。
嗣
47 -
nitraM
酸化に
OHA
er--K
叩l
J
、
聞
、
OH
OMOM
¥'0.r
...べ
.......γ
..
3
〉
tE 2 0
tr ，
8h
quant
11
01
，
PPh
DEAD
〈¥/¥メ¥/へ〆
+pMBO
r- OPMB
0 .<
OMe
OMOM
，
""，
!
~\、戸、
グ
F
9
OPMB
C叫
L，
l，
~，
U(" ニ
ゴ
=
1_ 代
CIPCY3
DDQ
+
CH 2IC 2
ば，
41 min
96%
OMOM
elbarpesni
30:
34
o oC
quan
1
冒
CH 2IC 2ト
，2' 0
ot ，
は0
3 min
ー
-
.t
35
OH
，
CH 2IC
DMP
+
30:
separbl
36
OMOM
1
，
此
2
03 min
•
quant
38
37
スキーム.7-2
アルデヒド)83(
の合成
続いて、 8
3 に対して、高井反応によるヨードオレフィン化反応の検討をおこなった
表
( )2-2
。アルデヒド)83(
に対し、 THF
中
、 OOC
で塩化クロム(1I)存在下にヨ}ドホルム
)5( とその立体異性体)93(
を作用させたが)a21 、望むE- ヨードオレフィン
として得られ、また 30%
と低収率で、あった。これらは、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーで、の分離が不可能で、あった。そこで、rentsruF
ジオキサン・THF
とZ・
体)93(
が3:4 の混合物
及び¥E snav
らの報告に従い 2)，
b21 、
の
1:6 の混合溶媒中で、行ったところ、高収率で反応が進行し、 E ・
体)5(
を
1:8 の選択性で得た。
-48-
=0
OMOM
21CrC
，
3IHC
noitdnoc
39
38
アルデヒド)83(
表 2・
.2
yrtne
ICr
tnevlos
1
2
に対する高井反応の検討
THF-dioxane
]1:6[
等量の Br3
を、その幾何異性体)04(
dleiy
/%
3/4
30
quan . t
2
12
4
16
1/8
の1:8
の混合物のジクロロメタ
3
qeL
)E( ・ヨードオレフィン)7( と(勾・ヨードオレフィン )93(
ン溶液に、・78 0C で 6.2
93/5
6
~
THF
CHI
emit
/h
3
2
を作用させたところ、目的のヨードオレフィン)6(
と共に 1:4
の比率で、 79% の収率で分離不可能な混合物とし
て得た(スキーム 2・
)8 。
O
の D
C-
3一
，
.-
4-
内
勺4
閣
一
UH
l一
C
MU
My
一円
一》
ト51 -)Z(
C
一
-qu
RM
一
'
B
一7
(E
+
6 2)
39
elbarpesni
:4 1
40
:8 1
スキーム 2・
.8
ヨードオレフィン)6( の合成
望むカップリング前駆体を合成することができたので、 Coleman
らが報告した方法
論 2)~こ従って、 N-アシルエナミド側鎖の立体選択的な導入を試みた。先ず、アミド (7)
の合成を行った(スキーム 2 ・
0)9
還元を行うことで、アミナ}ノレ )24(
CeCh
存在下、 N aBH4を用いてマレイミド
を得た。化合物 42
)14(
の 1，
2・
は極めて親水性が高く非極性
溶媒に難溶性であったため、メタノール"酢酸エチル系を用いる再沈殿法により精製
した。続いて、 42 のヒドロキシ基を TBS
エーテルとして保護することで、目的のア
- 49-
ミド)7( を 2 段階収率 21%
ー
スキーム 9-2
21%
，
elozadim
，
DMF
2( )spets
アミド)7( の合成
続いて、ヨードオレフィン)5( とアミド)7( のカップリング反応を検討した(スキーム
2)・
1)01
。すなわち、ベンゾフェノンケチルから蒸留したジオキサン中、塩基としてリ
ン酸カリウム、配位子として，N N' ・ジメチルエチレンジアミン、チオフェンカルボン
酸銅()14/ 存在下、ヨードオレフィン)5( とアミド)7( を反応させたところ、目的の(均四
エナミド)34(
とその立体異性体)4(
を、1: 1 の分離不可能な混合物として、収率 25%
で
得ることに成功した。尚、本反応は、基質 5 のスケールが 5 mg と比較的小さなスケ
ールでも、再現性よく進行することが分かつた。得られたエナミド)34(
TBS
基を、 THF
を 48%
中
・54
0
C で 21 分間 TBAF
の
を作用させることで除去し、アミナール)54(
と低収率ながら得ることができた。しかしながら、アミナール)54(
選択的gitiW
および 44
に対する(勾ー
反応を行ったところ、望みの反応は進行せず、原料のアミナーノレが回収
された。
- 50-
CM
，80 min
T8SCI
ロu
o oC
MeOH
4，
T
・
O
・
H7' 2 0 ，Na8H
HNVP
14
CeCI
。
。
て
ァ
。
で得た )31 。
〉
iて
!合
y ∞
c∞
O叩
∞
O cωu
σ
(03
c
u
，
T
O
HN
Y
。
7吋
5
K3P04
6( )qe
%)
25%
O Ht
Yh
+
4- 5.C'
48%
1 :1
el
mol
，
oid xa ne ，
95 "C ，
60 h
TBAF
ni separb
汁目/ (60
mol %) ，川
/ N'/.-
げ
ペミ
T
43
H
4
，
THF
12 min
45
Jfdぐ~
ヂ
主
|、
o'
46
スキーム 201 . nameloC
らの方法論を用いた、エナミド側鎖の立体選択的導入の検討
この理由 としては、平衡条件下でアミ ナールから発生するアルデ ヒドの周囲の立体
障害が非常に大きいために、反応点で あるアノレデヒド部位にイリドが接近できなかっ
たこと、あるいは、平衡がアミナール型に大きく偏っていることなどが考えられる
(スキーム )11-2
。
- 15 -
ペ( ミ害.
H01
OMe
esa8
0
Z
-.1
よγ
H-esa8
45
mrofdesolC
n
e
p
O
mrof
JhP ，
pd 一
hP 3 P d 一
」パ~
占5仁
onnoitcaer
46
スキーム 2 ・
.11
アミナール
)54(
は困難であったので、次に、 rentsruF
)74(
オーノレ
らの方法
)2
を検討した。先ず、 Labrequ
の合成を行った(スキーム 2・
)21 。市販の 2-sic
告 )51 を参考に、アミド
)2)8(
に対して、ジクロロメタン中、氷冷下で P
AT
終了後、氷冷下、 100~40
去し、アルデヒド)84(
・ベンテンート
酸化 )61 をおこなった。反応
を含む黒色濃縮残澄を得た。続いて、得られた 48
を用いた(勾ー選択的
HWE
望みの12( )Z ー不飽和エステノレ)05(
エステノレ)05(
らの報
m mH g で減圧濃縮を行うことで溶媒のジクロロメタンを留
に対し安藤
反応 )71 を行った。反応終了後、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより、前段階反応の
び)35(
反応における推定反応機構
らの方法論を用いて、 N- アシルエナミド側鎖を立体選択的に導入すること
Coleman
)94(
試薬
に対する
gittiW
PAT
由来の爽雑物のみを除去することで、
およびその異性体)15(
を混合物として得た。続いて、
および引を塩基加水分解することで得られる不飽和カルボン酸)25(
及
を、混合酸無水物を経由するアンモノリシスに供することで、。 lZ)・アミド )8(
とその立体異性体12( E) 圃アミド
)45(
を
、 1:3
の比率で、安藤試薬
)94(
収率で得た。
- 52-
から 4 段階 75%
の
白
HO
TPAP
六 =.1
，NMO 10.1(
5( mol%)
CH 2IC 2 ，
MS4A ，
0 oC
then deretlif
and detarnco
87-
THF
ー
ot 0 oC
・
H 20
Ba(OH)z
MeOH-H
20
，
吋 26 h
i
I
L
i=l.
RO ーポ
ι=
コ( '
~
，
2 h，
shading
rー
ローロ
，
TEA
，1 h
1) CICOOMe
THF ，
OOC
・ 円 -
75%
+
Me
，
{-
¥¥
'1=
f!
.
¥0
ト
、KHoム¥二人
I
0
OEt
、
48
)secxE(
)2 NH 3 )g( ，
同
12( ・
)Z 50
一1
2( 句-51
I一
0ー~
'=/
ta 0 OC
引
Na. l DBU.
)qe
U.
Jfl94
ぺ
「 よ?
371H
5( )spets
.:L L
12( 勾
・ 52 一 一
12( 司
・ 53:κ=H
スキーム 2・
.21
アミド(
)8 の合成
続いて、ヨードオレフィン)6( とアミド)8( のカップリング反応を検討した )2 。本反応
で用いるチオフェンカノレボン酸銅( 1 )は、水分や酸素に対して非常に不安定である。
例えば、マレイン酸ジn- ・ブチルスズ、続いて水素化カノレシウムから減圧蒸留し、使用
前に数度の凍結脱気法を施して酸素を除去した DMA
中においてですら、わずかに含
まれる酸素や水分によって銅試薬は不活性化してしまう。そのため、本反応は非常に
困難を伴ったが、 51 回の凍結脱気法を施し、溶存酸素を徹底的に除去した DMA
中で、
カップリング反応が進行することを見出した。その上で、以下の条件検討をおこなっ
た(表 )3-2
。先ず、エントリー 1 として、ヨードオレフィン(
)6 に対し、 DMA
として 3 等量の炭酸ルピジウム、チオフェンカノレボン酸銅( 1 )存在下、
中、塩基
3 等量のアミ
ド
)8( を作用させたところ、目的物は得られず、エナミド側鎖の異性体が合計 3% と得
られるに留まった。そこで、エントリー2 では、 Panek
らの報告 )81 を参考に、配位子
として 2 ，
-'2 ピピリジルを用い、カップリング反応を行なった。すると、反応性は向上
し、目的物である SA(1)
して側鎖の異性体)5(
を 8% の収率で得ることに成功した。しかしながら、依然と
が 14%
の収率で得られた。そこで、エントリー 3 では、使用す
る塩基とアミドの等量を 6 等量に増やして反応を行った。すると、収率は向上し、さ
らに側鎖の異性化を完全に抑制することができた。その結果、反応終了後の HPLC
製後の段階で、目的の SA(1)
，及びサリシリハラミド B )3()BS(
の収率で得ることに成功した。尚、合成した 1 および 3 の _H1
クトル，
uv
を、それぞれ 23%
Nl¥偲ヲ
-C31
とほぼ一致していた。
圃
35 -
、26%
R スベ
Nl¥偲ヲ
スベクトル、精密質量および旋光度は、報告されている天然物
精
)91
のそれ
H{，
-N-
S
，
ヘ
J
6 2)
、
1) ~ r C O
2)6
，
90
OH.
， evitida
Rb CO"
，
tr ，30 im n
・
C ，1 h
Jイ¥ J
E :Z = 4 : 1
，DMA
「えへ
+
ilas
cy malhi
las imalhiyc
di e A )1(
[αJ"91 = 3- 3 c( 0 .17 ，MeOH)
tnys(
he
)cit
[α]= -35 c( 7.0 ，MeO H )n( laruta )91)
表 3-2
rtne
同e
B (3 )
1[α
'] 8 = 9- 0 c( 0.25
，M eO H )tnys(
he
)cit
α
[J = ー73 c( 3.0 ，MeO H ) (n
laruta
)91 )
ヨードオレ プイン)6( とアミド)8( のカ ップリング反応の条件検討
y
products
evitda
バ
人 +Jf
55
2
。ゃ
1 (8%)
岡
56
y わ失一
(1 eq)
14 %
"3
命〈コ
1 (23%)
1( eq)
。6 等量の Rb
2 C0 3
お よびアミドを使用
- 54-
3( 制
3 (26%)
2-2
フッ素化サリシリハラミドの合成計画
2・2・l
フッ素標識体のデ、ザイン
サリシリシハラミド A )AS(
は、他のベンゾラクトンエナミド類と同様の、 N
CI
-6
0
細胞系列に対する成長阻害活性プロファイノレ、および、サリシノレ酸部位、マクロリド
骨格お よびエナミド側鎖といった共通構造を有している(図 )01-1
。サリシノレ酸部位 と
エナミド部位は、ベンゾラ クトンエナミドの共通の構造的な特徴であり、標的タンパ
ク質に対する結合モチーフであると考えられる 。 この点は、 SA およびロパタミド C
の構造活性相関研究からも支持されている 。一方、様々な求電子的フッ素化反応が開
発されており、フェノーノレ芳香環にフッ素原子を導入することは比較的容易で、ある。
しかしながら、標的タンパク質との水素結合に関与する可能性がある、フェノ ール性
ヒドロキシ基がサリシル酸部位に存在している 。従って、フッ素原子を芳香環に導入
することで、
阻害活性が保持されるかどうかについては不明であるが、この
V-ATPase
点および合成の容易さを考慮して、芳香環の 4 位にフッ素原子を導入した 4l. 9_F サリ
σ)2()ASシリハラミド A
を設計した(図 )
21 。
H，{N- ヘJ
=
X edimHalahilyci:las-)-(
X = Fedimalhil:ycilas-F91-4
~N-{九
日
計
A (1)
A )2(
図 21
=
X H :(ー
malaト
hilycilas
X = :Fedimalhilycilas-F91-4
edi
B (3 )
B (4)
common
pa 同
フッ素化サリ シリハラミドのデザイン
2・2-2 合成計画
本章 21 節で確立した方法論を、フッ素化サリシリハラミドの合成に適用すること
にした。スキーム 231
に)2(AS-F
の合成計画を示す。
-5 -
f:ff;芋-L
Taki
noItanIfelo
む∞
i
OCu
パ¥.=1
+ H
〉
-4 19edimalhilycilas-F
A )AS-F(
OPM
8
)2(
日
OH
、
可
門
口
k ¥、
f/ク
¥入
- .、
/
pe
頃仇久/に
M
亡二二会
0
。
OMe
Mitsunobu
noitacifiretse
+
OMOM
々
/ k
59
スキーム
.31-2
)2(AS-F
すなわち、側鎖の導入をヨードオレブイン)75(
の合成計画
とアミド)8( とのチオフェンカルボン
酸銅( I )を用いたカップリング反応により最終段階で導入することにした。マクロラ
クトン)75(
は 、 ジ エ ン)85(
より第一世代Gru sb
触媒を用いた閉環メタセシス反応
侭 C M)、続く高井オレフィン化反応により得られると考えた。エステル )85(
素化サリシノレ酸)95(
とアノレコーノレ)1(
は、フッ
との光延エステル化反応により連結することに
した。尚、本合成戦略において、サリシル酸部位にフッ素原子が導入されても、非標
識体と同様に、各段階の反応がうまく進行するかどうかが問題であった。
56 -
2・
3
2・
1-3
フッ素化サリシリハラミドの合成
芳香環フッ素化の検討
求電子的フッ素化試薬として、 6・トリフルオローN- フルオロピリジニウム塩)a06(
用いることにし(第 I 章 6 節を参照iO )、サリチル酸誘導体)4)31(
導入を検討した(表 )4-2
を
に対するフッ素原子の
。文献
)a02 を参考に、 1，
1，
2・トリクロロエタン中、 13 に対し 6・
トリプルオロメチルルフルオロピリジニウム塩)a06(
るフッ素化サリチノレ酸誘導体)a16(
を作用させたところ、目的とす
及びその異性体)b16(
をそれぞ、れ、 26%
率で得ることに成功した(エントリー )1 。しかしながら、 60a
、25%
の収
は現在市販されていない
ため使用試薬の変更を迫られた。そこで、エントリー2 では、入手可能なフッ素化試
)b02)b06(
薬として、 5・トリフルオロメチル N- フルオロピリジニワム塩
った。しかしながら、 60b
は 60a
を用い検討を行
よりも反応性が低いため、反応は殆ど進行せず原料
が回収されるだ、けで、あった。そこで、エントリ ~3 では、活性化剤として 20
mol%
の
トリプルオロメタンスルホン酸を加えて反応を行った)b02 。しかしながら、原料のア
セトニドの分解反応が主に起こり、目的物は殆ど得られなかった。そこで、溶媒とし
1，
2，
-2 テトラクロロエタンを用いて 641
て、より高沸点の 1，
目的とする 4 ・フッ素化体)a16(
及び'6 ・異性体)b16(
ることに成功した。
- 57-
0
C で、反応を行ったところ、
をそれぞれ、 20%
、35%
の収率で得
--x. _
: :xts
可
£ア
4~いo
¥Y
、
31
表 24
ey円rt
OH
@岳:
+
a06 :R
:b06 R
，
=H R 2 =CF 3
，
= CF 3 R ，
=H
a16
，
，
N- フノレオロピリジニウム塩を用いたアセトニド)31(
os tnlev
31
tnegaer
Iq
e
evitidda
に対する フッ素化の検討
cp emit
m/et 。
Ih
a16
26
1
C，I CHC
H CI
，
a06
1.2
01
71
2
IC C H CH 2 C I
60b
1.2
01
51
3
C，I CHC
60b
01
3
4
IC CHCHCI
14. 02( fT mOH
lo %)
1.2
741
3
，
，
H 2IC
，
梅本らの報告によると
b06
20
，
) 、λL フルオロピリジニウム塩)a06(
eiy ld I %
61b
c16
25
3
53
4
ecart
0.6)c16+b16+a16(
20
および 60b
を用いるフ
ェノ ールのフッ素化の位置選択性は、基質のフェノール性ヒドロキシ基と試薬のピリ
ジニ ウム塩の硫酸基との問に分子問水素結合を有する π
ーπ錯体 (6
)2
経由するため、高い
を遷移状態として
0 -選択性を示す。しかしながら、本反応におけるフッ素化のか，
p-
選択性はおよそ :1 1 であり、予想とは異なる結果であった。これは、サリチル酸誘導
体 (1
)3 のフッ素化反応で、は、アセトニド、のカルボニル基の酸素原子とフェノール性ヒ
ドロキシ基の水素原子の聞に水素結合が形成されていることにより、ヒドロキシ基が
ピリジニウム塩の硫酸基と相互作用することが困難である。そのため、分子間水素結
合を有する πーπ錯体)b36(
を形成することが困難に な り、フ ッ素化 のか選択性が減少
)41 。
したと 考えられる ス
( キーム 2 ・
- 58 -
O
FJ43
CIljzCHl
10
"c
+
，
nimoderp
26
£ft t
0Cl01C
H吋
今2CHCl
ザ
斗
レ口
-
tna
yrev
ronim
K 弓1
勺
13
63b
63a
州;。
61a
スキーム 2・41
フェノ ーノレとアセトニド)31(
フッ素化サリチノレ酸誘導体)a16(
のフッ 素化 における位置選択性の違い
およ び 61b
のそれぞれのフッ 素の導入位置に関し
ては、以下の実験の結果より 判断 した (スキー ム )51-2
。すなわ ち
、 61a
お よび 61b
の残りのフェノ ーノ
レ性ヒド ロキシ基をメ チル化することで得られる 、 メ トキ シ体
)a46(
および 64b
して、 64b
の lH _NMR
のメチノレ基のシグナノレが、 64a
では l 重線であるのに対
では 2 重線 (J= .1 5H )z であった。 この結果を、導入されたメチル基とフ
ッ素の空間的距離が、64a
におい てはより 長 く、一方
、 64b
のそれは短いことに 起因
していると考察した。すなわち、メトキシ基とフッ素原子の互いの位置関係を、 64a
で
、
はpイ
立
、 64b
では 0 -位とそれぞれ推定した。
- 59 -
ザ。
Mel
，K 2C0
3
¥可
fJA'r(
ν λII A人0'"
、γ"- 0
にd
enoteca
Mel
〆 『守 / "
、
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γ
人
、 _ /CH 3
U ....
a46
a16
ジ
く
。
ジ < 己 ジ <0
(D
叫 tel
¥
UH
，K 2 CO
一一二 →
enoteca
b16
1.5zH b46
スキーム 2・
51
フッ素化サリシノレ酸誘導体(6
)a1
2-3 2 フッ素化サリシノレ酸)95(
および 14
と3
1 の混合物に Tf 20 を作用させてトリフラート
に変換したところ、 シリカ ゲノレカラム クロマトグラフィーによりそれ
ぞれ分離する ことができた (スキーム )61-2
lli
ブチルスズとの eSt
(6
)6
に
、 irG drang
のメチル化反応
の合成
フッ素化サリチノレ酸誘導体)a16(
)56(
およ び 6
1b
。 トリア ラート)56(
に対しア リル ト
リ n・
カ ップリング 12を
) 行うことで得られるフッ素化アリルベンゼン
試薬 とアリノレアノレコールから調製したマグネ シ ウムア リルアルコキ
シドを作用 させてフ ッ素化アリノレベンゾエート)76(
ンゼンのオレフィン部位が異性化 した 6
8 が
、6
7 :68
へと誘導 した。こ の際、アリ/レベ
=
:7 1 の比で分離不可能な混合物
として得られた。生じたヒドロキシ基をメチル化することで得られるメトキシベンゼ
ン誘導体)96(
ノ
レエステノレ)96(
へと 変換し た
。 最後 に
、 Pd P( h34)P
存在下、辻・tsorT
反応
のアリノレ基を除去することで、フッ素化サロシノレ酸)95(
1)により、アリ
を合成した。
尚、アリノレエステル化反応にて 生 じた 69 に由 来する 70 は、この段階においても分離・
除去すること ができなかった。
- 60-
x
~ F，J
A
-1 1 1 :
A
_
+
v
、 グ 、 OH
x、
ノ
ト 1
v
elbarapesni
...¥...y
61a
的:
65
一
OH
7 :1
elbaraDesni
一
可
・
3
，
24 h
69
OMe
. . . .;esni
、T
0
ト
+
屯'i(
7:1
ra ョ
elb
Jf
59
スキーム 21 6
2-3
0
' γ、
f 、OH
人
"-'、
-"-/"
@ピ ゲ
，K 2C0 3
93%
‘ ト
，58 min
Mel
enoleca
'"グヘグ¥
OMe
THF
0・
tC o ，
同1
8 h
81%
0
68
mol%)
14
CH 2=CHCH
20H
EIMgBr
，THF
66
作 r人 。 ヘ グ
U
65
@己
主
)
iL IC ，
TFP 01( mOI%
)，
h
NMP ，0 'C 1018
84%
o〈 J +
67
34) 01(
quanl
OH
¥グヘ/旬、
THF
quanl
o 'C ，1 h
3 5( mol%
0
叫 ~人
Pd(Ph
morphine
enidiryp
OH
13
n-Bu3SnCH2CH=CH2
Pd 2abd( ，) CHCI
…
町
?:
fT 2 0
A
、OH
~、 ~'"ρ\
、
70
フッ素化サリシル酸)95(
の合成
フッ素化サリシリハラミドの合成
サロシル酸部とマクロリドフラグメントの合成が完了したので、フッ素化マクロラ
クトンの合成を行なった (スキーム 2-
17)
。 フッ素化カルボン酸(5
)9
とアルコール(1
を光延エステノレ化反応 01 )により連結し、 91% の高収率でフッ素化ジエン)85(
た。得られた 58 に対し、第一世代の Gru
sb
1)
へ誘導し
触媒を用いる閉環メタセ シス反応 lりを行
った ところ、反応は速やかに且つ 90% の高収率で進行し、望む(めーマ クロラクトン (72)
とその異性体(73)
を
、
:01
1
の選択性で得ることに成功した。尚、 本反応において、
70
由来のエステノレ(71) は反応しなかったため、目的物から容易に除去するこ とが できた。
(めー体
(72)
および(z)・体
(73)
は互いに分離不可能であったため 、混合物 のまま DDQ
より p -メ トキシベンジノレ基を除去して E ・
オレフ ィン)47(
-16 -
と-z オ レフィン (7
)5
に
を得た。
OMe
0
OMe
~人OH
-'人
"、
，
/'
+
OH
1!¥ 作「人OH
ヘ
，
"'
7 :1
elbarpsni
59
0
+
OMOM
OEAO
P 旧 O-'/
1 (0.
8 3 eq )
均ノ戸句
OH
両A
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開
kd i
OPMB
OMe
吋
um
z-一
OPMB
+
msepa
0
~人。
υ A
OMOM
ヘ
d.-"
掴e
lb
グ
OMOM
Ii
CH 2 CI 2 ，
12 min
90%
T
/' 17
OPMB
OOQ
+
01 :1
sni eparab
le
内
3
IE 20 ，
36 min
91%
4 声¥
70
，PPh
y
OMOM
，
十
七0 ，
CH
固
。C01 tr ，
35
2IC 2
min
97%
72
73
OH
(3
:01
+
1
lbarpesni
e
Wel j L f O
、
"V i
"'r
H
、
O MOM
74
75
スキーム 271
ア
ノレコーノレ)47(
を Des
フッ素化マクロラク トン)47(
-M
nitra
の :6 1 の混合溶媒中で高井反応
-z 体)87(
および 75 の合成
酸化 して得られるアルデヒド)67(
)2
を、ジオキサンー
THF
，凶)
を 行うととで、望む E ーヨードオ レフィン)7(
を 33. 1 の選択性で、 2 段階 80%
の収率で、シ リカゲノレカラムク ロマト グラフ
ィーで分隊不可能な混合物 として得た (スキーム 2 ・)81 。最後に、ー87
)7
作用 させることで保護基 を除去し、目的のカップリング前駆体(5
)9
その立体異性体(7
と
と共に 43 :1 の比率で得た。
- 26 -
oc にて Br3
を
、 76%
を
の収率で、
=0
OH
DMP
ト
ON
-nu 明V
414E
百
M
M
。
OH
用
e
l
hU
a
41
CH 2IC 2
OMOM
76
74
75
z
ICrC
2.IHC 3
dioxane
I THF
+
:3.3
tr .26 h
80%
2( )spets
.3rBB
7
CH 2IC 2.ー87
0
1
elbarpsni
87
C
+
:3.4
76% )detalosi(
msepa
57
スキーム 2・81
1
ョ
elb
79
カップリング前駆体)75(
S A(2)
天然型 SA の合成に用いた条件を、 F-
の合成
の合成に適用した(スキ ーム )91-2
なわち、アルゴ‘ン雰囲気下、凍結脱気を 51 団施した DMA
。す
中に、 I 等量のチオフェン
カノレボン酸銅( 1，) 3 等量のア ミド)8( ，3 等量の炭酸セシウムを加えて室視 ・遮光下 30
分撹枠した後に、ヨードオレフィン)75(
を加えて、 90 0 C で 1 時間反応させたところ、
反応は非標識体と 同様に進行した。反応後の精製は、天然型 SA と同様の条件で、行っ
た。すなわち、前処理としてシリカゲルカラムクロマトグラフィ ーで精製して得られ
た粗精製物を、 ODS
カラム(ナカライテ スク社， COSMOSI
正
L5CI
児B
て F'l王
l LC 精製を行つた o その結果、目的のフッ素化サリシリハラミ ドAσ-SA)(2)
びフッ素化サリシリハラミド B σ-SB)(4
をそれぞれ 15%
成功した。
- 36 -
、22%
およ
の収率で得ることに
ify ∞ 々 や い
2
+削 〈ヘJ
57
CU
DMA
，
09 C' ，1 h
;neht
acifrup-CLPH
noit
JN ぐ¥d一
+
-4 9'edimalhilycilaS-F
A (2 )
'9
'-4 edimalhilycilaS-F'
日)4(
22%
15%
[α]
82
ε282
= 05- c( 12.0
= 26.
X 10
4
，MeOH)
[α]
82
=ー
71 c( 03.0
(m
)'-mcL'-lo
E 28
= 22. 1 X 10
スキーム 291 . F -SA(2)
4
，MeOH)
(mo L'r cm
および F -SB
- 64-
，)
・
)4( の合成
参考文献
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ダイキン化成品販売株式会社ホームページを参照
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第 3 章フッ素化サリシリハラミドの V -ATPase
阻害活性試験
F-SB 、SA および SB)
合成したサリシリハラミド類 σ-SA 、
サ/レ腎臓 培養細胞 (COS
の 平沼'P esa
阻害活性を、
-7
) )1およびブタ属
']1 脅から調製したクロマフィン頼粒膜 )2 を用い
て
、 pH 感受性蛍光色素による pH 変化により評価した。
3-1 サノレ腎臓細胞を用いたイメージングアッセイ
サリシリハラミドの生物活性は、サノレ腎臓細胞内の酸性コンパートメントであるリ
ソソー ムの内部 pH を測定するこ とで見積った。すなわち、日ソソ ーム の細胞膜には
V -ATPase
が発現 しており、リソソ ーム内部は、プロトンの能動輸送によ って酸性に保
たれている 。し たがって、リソソーム膜上の V -ATPase
の機能が阻害され、膜内への
プロトンの供給が遮断されると、 プロトンの受動拡散 によ り、膜内 pH は外部環境の
それと等しくなる 。 ここに 、酸性環境で蛍光を発す る LysoSenr
ンサ ーを共存 させていると、 内部 pH
Gr ne めなどの pH セ
が上昇するにつれて蛍光の退色が観測される
図
( 3・
)1 ロ
+
MH
V -ATP
時十一ー』ー‘
H+
阻害弗l
亡 二 コ
蛍光色素
酸性 コンパートメントー
pH の上昇
Y( ソソームなど)
蛍光の消失
図 3-.1
ー
pH 感受性蛍光色素と リソソ ーム膜内 pH の関係
実験は以下の手順で行った。すなわち、 l 凶4 の SA 、SB 、F ・SA 、F -SB それぞれを、
サル腎臓細胞に投与して 5 時間インキュベートした。さらに 、1 凶4 の LysoSe
- 67 -
ns
ro Gr ne
を加え、細胞を 1 分間インキュベートした後、過剰な蛍光色素を除去し、蛍光を観測
した。図 2-3
のパネノレ A は、コントロールとして未処理の細胞を示しており、局所的
に強い蛍光が観測された。これは、リソソーム内部が酸性化されていること、すなわ
ち、リソソーム膜の V-ATPase
は機能していることを示している。蛍光強度は、青→
緑→赤の順に強くなるように着色しである(同図のパネル C) 。また、図中のアスタリ
スクは、リソソームの局在位置を示しており、スケ}ルパーの大きさは、
20μm
に対
、 SA で処理して得られた結果であり、蛍光量の減少が
応している。パネル B と C は
観測されることから、 V-ATPase
の機能は阻害されていると判断できる。パネノレ D とE
は
、 SB で処理して得られた結果であり、蛍光量の減少が観測された。 SB は
、 SA と
共に天然から得られてくるものの極微量であったために、 V-ATPase
の報告はなされていなかったが、今回の活性試験で V-ATPase
阻害活'性について
阻害活性を有している
ことが初めて明らかになった。パネル F と G 、パネル H と I は、それぞれ、 F-SA
F-SB
、
で処理して得られた結果である。いずれのパネノレも、蛍光量の減少または消光
が観測された。また、結果を図示しないが、各種阻害剤で処理したサル腎臓細胞が、
トリパンブルー染色で、染色されないことから、阻害剤被処理細胞が、生存しているこ
とを確認した。すなわち、蛍光量の減少および消光が引き起こされたのは、添加した
薬剤により直接 V-ATPase
の機能が阻害されたためであるといえる。
以上の結果から、培養細胞を用いた実験では、天然物の SA 、SB だけでなく、フッ
素化体 F-SA
、
F-SB
も確かに V-ATPase
阻害活性を有していることが明らかになった。
- 68-
A
B
*
，. .
•
会
C
女
女
女
*
女
女
一
D
m
，
fi( dltill
E
づ
t
*
安
m
F
*
女
* *
女
*
*
*
H
*
*
*
m
安f
3 3:
G
*
，. .
*
~
女
*
女
*
*
*
，. .
~
図 2-3
各種限害剤(1凶1)で処
女
J;)SI;[
理したサル腎臓細胞内の LysoSe
- 69-
~"'ßl
resn
Gr ne
の蛍光強度
32
クロマフィン頼粒膜を用 いた定量的アッセイ
の阻害活性の評価法では一般的に、ウシ副腎髄質由来クロマフィン頼粒膜
V -ATPase
を用いた AT P 依存的プロトン輸送を指標にする方法が用いられる
2)。しか
しなが ら、
新鮮なワシの組織を入手することが困難であ ったため、本研究では、ブタ高
J I 腎髄質由
来クロマフィン頼粒を用 いた c クロマフイン頼粒膜へのプロトン輸送能は、 pH 感受
2
性蛍光色素である ACMA
，
4)の蛍光の退色を指標として測定した。なお、
A CMA
は
、
酸↑生環境で消光し、中性付近で強い蛍光を発する 。
実験は以下の手順で行った。すなわち、クロマフィン頼粒膜に対し、 ACMA
、バ リ
ノマイシンを加 え
、 OC
O で 01 分間イ ンキ ュベー卜した後に、各種阻害剤を添加 して
、
さらに 37
0
C で 3 分間インキュベートした。そこへ、 MgATP
を加えることで、クロマ
MgATP
フイン頼粒への A TP 依存性プロトン輸送を 開始させた。
プ ロトノフォアである FCCP
に
、 01
仙
を加え、頼粒膜内外のプロトン勾配を解消させた。図 -3 3
f の SA を作用させたときに得られた ACMA
の結果を示すe なお、同 図の縦軸は
、 FCCP
の相対蛍光強度であり、横軸は、 ATP
凶4
，0)ces
FCP
dne(
ιι
100 -
添加時を開始時刻 とした時の時間経過を示す
。
を添加 した際に得ら れた曲線であ り、桃
-
ー ・ 田 園 田 由 回 、-
•-
)ces
，1
20
10 ....
圃
E9 5 t
"
と したとき
の SA を作用させた際に得られた曲線である 。
ATP
trats(
，
Q
8
-"
ー- 10nMSA
~
.u
の蛍光強度およびその日寺間推移
を添加 した後の蛍光値を 01
また、 青線は 、コン トロールとして DMSO
色線は、 01
の添加から 2 分後に、
90
59
-
・-
10 nM SA
- DMSO
.u 90
.u
- DMSO
tム
85
08
o
50
01
150
08
20
ces
図 3-3
. 01
凶
。
02
40
ces
f の SA を作用 させて得られた相対蛍光強度とその時間推移
(左図.測定全体の蛍光強度右図:
ー
ATP
70
添加直後の蛍光強度の拡大図)
ATP
を添加すると、クロマブイン頼粒膜上のesaPTA-V
輸送を行う。その結果、膜内 pH は低下し、 ACMA
CP
ォアである F
が
、 A
TP
の蛍光量は減少する。プロトンフ
を添加すると、膜内外の pH 勾配、すなわち、esaPTA-V
された酸性環境が解消される。そのため、膜内 pH は A
TP
ACMA
依存的にプロトン
により形成
を添加する直前まで上昇し、
由来の蛍光が観測される(図 3・3 : SA 非添加時の青色曲線)。一方、クロマフ
イン頼粒膜上のesaPTA-V
の機能が阻害剤処理により阻害されると、 A
TP
を添加して
も膜内へのプロトンの供給はもはや起こらず、膜内と外部環境の pH が等しくつりあ
うまで、膜内のプロトンは受動拡散の働きにより膜外へ拡散する。よって、 ACMA
由
来の蛍光量の減少は観察されない(図 3 ・3 : SA 添加時の桃色曲線)。
このような実験を、各種限害剤について濃度を変えて行った。その結果を、図 4-3
に示す。尚、同図において、各点につき 3 回測定し、測定誤差のばらつきはエラーパ
ーで表示している。また、得られたosCI
'
B
e
t
a Z自
Tat+。『よ
50
-守一
S8
...0-...
FSB
軍
占
・0
'
e
T
a
a
晶
0
10.0
1.0
rotibihnI
図.4-3
一合一
SA
FSA
一畳間
，
(JChH
宮一吉〈
企合争由
01
値の結果を、表 3・1 に示した。
01
tarneco
01
. io
n
合成したサリシリハラミド類の濃度依存的esaPTA-V
- 17
・
01
(nM)
プロトン輸送阻害曲線
〈下f
JN
s-)-(
cal
i ahily
dimal
e A )A5(
〈~
JN
F9'-4
表 1-3
-s
ai lychil edimal
ー
yci(las-)
edimalahil
f
A (F -S )A
Ni1
℃九
edimalahi
B F(
-49
ycilas'
-F"
合成したサリ シリハラミド類の、 V -ATPase
yrtne
a IC
compound
B )65(
プロトン輸送阻害活性 a
CI 501nM
1
1 a (SA)
0.7 :t: 3.0
2
2a (F -SA)
6.1
3
1b (S8)
4
2b (F-S8
+ 01.
28:t: 6
)
15:t: 10
i 1一
直は、 3 回の測定値の平均値で ある
so
SA は、文献 )5 で報告されているよ うに、 約 1 凶 4 以下の IC
強力な阻害活性を有していた。 F-SA
V -ATPas
も
、 SA
05
値 I( C os = 7.0
巴に対する強力な阻害活性を保持 して いた (IC os
=
2 n M) 。一方 、 SB は
、 SA
、 30
いての報告はなされていなかった。今回の測定で、 SB は
いることが初めて 明 らかになった。 また、 F-SB
と同等の活性を有し ていた。
- 72-
仙のと、
と比較して若干弱いも のの、期待通り、
と共に天然から得られてくるものの、極微量であったために、 V -ATPase
SB
-S )
6
凶4
阻害活性につ
の IC so 値を有して
の阻害活 性は
、 10 ゆ f の IC os 値と、
3 ・3
活性試験結果の考察
合成したサリシリハラミド類の阻害活性試験結果から、サリシリハラミド類の構造
と阻害活性について、以下の結論が導かれる。 )1 SA I( Cos
仙の、および SB I( Cos = 30 凶)11 とF-SB
CI( os
仙のと F-SA
= 7
.0
= 01 仙のの V-ATPase
I( Cos
= 2
阻害活性の大きさは、
3 倍程度しか違っていないことから、芳香環の 4 位にフッ素原子を導入しても、阻害
活性はほとんど影響を受けない。このことは、晴乳類性 V-ATPase
の限害機構を、フ
ッ素原子の特性を利用して解明する研究において、合成した F ・SA および F-SB
な分子プロ}ブであることを示唆している。
=30
)2 一方で、 SA I( Cos
仙のの阻害活性は、約 40 倍の差があり、 F-SA
I( osC
= 7.0 仙のと
= 2 仙のと F-SB
が有用
SB I( Cos
I( Cos = 01 仙の
の阻害活性も、 5 倍程度だが差が認められる。このことから、 71 位のエナミドの立体
化学の違いが、阻害活性に影響を与えることが示唆された。
- 37 -
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，297 ，
第4 章
ピオチン化サリシリハラミドの合成
ピオチン化サリシリハラミド A の合成
1-4
4 ・2 ・1
ピオチン化サリシリハラミドの設計
第 1 章で述べたように、サリシリハラミド A (
SA)
部位
V-ATPase
は、日甫乳類型 V-ATPase
の膜貫通
V o 部分に、非可逆的に結合することが明らかにされている。しかしながら、
が多くのサブユニットからなる複合タンパク質であることもあり、その結合
領域の詳細については未解明である。そこで、 SA の結合部位を特定するための分子
プローブを調製することにした。ピオチンーアピジン相互作用を併用した化学発光に
より、分子プロープの結合ドメインを検出することにし、情報基としてピオチンを選
択した(図
V-ATPase
4・)1 。すなわち、ピオチン標識化サリシリハラミドを投与し、 SA 部分を
の Vo の標的タンパク質に結合させることで、先ず作用標的部位をピオチン
で標識する。次に、ピオチン標識化サブユニットを SDS-PAGE
西洋ワサビベルオキシターゼ、
hsidaresroh(
によって分離した後、
，HRP)
が導入されたアピジンを投
与し、ピオチンーアピジン相互作用によりピオチンを HRP
で標識する。ここに、過酸
esadixorep
化水素水とルミノ}ルを作用させると、 HRP
による過酸化水素の分解に伴いルミノー
ノレ由来の蛍光が観測される。すなわち、ノレミノーノレ由来の蛍光が観察される分子量バ
ンドが、 SA の作用標的部位を含んでいるサブユニットであると同定することができ
る
。
-75
-
ピオチン部位
/戸
nl~1
J'
~nnh.
SDS
-PAGE-
J
--
- r s:
分子量マーカー
ー
-
-. .
ー
-
ベ初
側，
、町
旭〉 機
膜貫通領域 (v )o
分子プロープ無
. ， ム ピジ
-B
-
分子プロ)プ無
有
蛍光
有
図 4-1 ビオチンー
アピジン相互作用を基盤とした SA の結合部位 の同定
サリシリハラミド A (SA)
は、官能基の導入が可能な 2 つのヒド ロキシ基、すなわち
フェノール性(3 位)およ び 2 級アノレコ ーノ
レ(1
3 位)を有している。また、
SA の構造活性
( l 章 4 節を参照)から、 3 位および 31 位のベンソ、エート誘導体の 阻害
相関の研究 1) 第
活性の強さは、天然型 SA と比較して、それぞれ、 30
凶1，081
ゆ 4 と大きく低下して
いるものの(表 4-1
) 、未 だ 凶f のレベルで活性を保持していることから、フェノー/レ
ヒドロキシ基および 2 級アルコ ーノレの官能基変換は、 V -ATPase
阻害活性においてある
程度許容されると考えられた c また、第 l 章で述べた様に、フェノール性 ヒ ドロキシ
基は、ベンゾラクトンエナミド系天然物の共通部分であるため、 2 級アルコ ールへの
官能基導入を計画した。そして、 2 級アルコールに PEG
ン化誘導体(8
)a2
およ び 82b
を設計した(図 4-2
) 。
- 76-
リンカ一部分を有するビオチ
〈主f
NJ71
んぺ引
工作
。 h
17E cilas削
detanito
17Z edimalahbilycila
旧
s-detanit
図 4-2
H
edyl
imalahi
A ()a28
B (82b )
common
ビオチ ン化サリシリハラミド (82a)
およ び 82b
の設計
一一
JN も
ー一
円N-t~
O
O
ーゴ
pa 同
〕
&'、百
O 、 ノ句、)J
O
フェノ ーノレベンゾ エート誘導体(80 )
ー
() ー
サリシリハラミドA (1)
表 4 -.1
SA
アノレコ ーノレベンゾェート誘導体(81 )
のフェノ ーノレおよ びアルコーノレベンゾエー ト誘導体 0) V-ATPase
SA )1(
CI
50
I nM
8
< 0.1
80
18
30
180
阻害活性
α ウシ脳クラスリン被覆小胞頼粒におけるプロトン輸送阻害活性 1)
4-2-2
モデノレ基質を用いたビオチン化反応の検討
まず、エナミド側鎖を有していない、ヨードオレフィン (6)をモデル基質として用い、
ビオチ ン化カ ノレボン酸(8
)3
とのエステノレ化反応を行ったc カノレボン酸)38(
は
、 ジクロ
ロメタンやベンゼン等の非極性溶媒への溶解性が非常に悪かったので、 D MF
キサンを反応溶媒として用いてエステル化反応を行った 表
( 4-2)
先ず、 D MF 溶媒中で TEA
存在下、 HOBt
と WSCD
ら活性化エステノレを調製しめ、そこに、基質)6( の DMF
やジオ
。
を作用させてカルボン酸)38(
か
溶液を加えて室温で 30 分反応
させた(スキーム 4 ・
)1 。 しかし、目的物は得られず、フェノ ーノレ性ヒドロキシ基にビ
オチン部位が導入されたヨ ー ドオレフイン (84)
-7 -
が収率 4 7 % で得られるのみであ った
。
また、原料 6 が 60%
OH
で回収された。
寸
手
五
+可作 γ
Jho
，
HOBt
EDCI
，
DMF
•
，
は 30 min
47%
6
(60%
fo 6 was
)dervoc
五州。宅
スキーム 4 ・.1
EDCI-HOBt
によるアルコール)6( とカルボン酸)38(
)2
次に、ジオキサン溶媒中で山口エステル化反応を試みた(表 4 ・
ン中、 TEA
存在下、カノレボン酸)38(
のエステノレ化反応
)3
。先ず、ジオキサ
と 2えL トリクロロベンゾイルクロリドを、室温
で 31 時間反応させて、混合酸無水物を調製した。そこへ、基質 6 と DMAP
のジオキ
サン溶液を加えて室温で 6 時間反応させたところ、フェノーノレピオチン化誘導体)48(
が 63%
れた 86b
の収率で得られた。また、 6 のフェノーノレ性ヒドロキシ基がベンゾエート化さ
が、原料 6 との混合物として得られた。
そこで、エントリー2 として、基質 6 と DMAP
のジオキサン溶液を加えた後 10
で 42 時間反応させたところ、 84 は得られず、目的のピオチン化誘導体)58(
のフェノーノレ性ヒドロキシ基がベンゾエート化された 86a
て、収率 15%
を
、 1 :3.0
で得ることに成功した。また、ベンゾエート体)b68(
0
C
および 85
との混合物とし
が、原料 6 との混
合物として得られた。収率向上を目的に、エントリー 3 では、ジオキサン溶媒中で椎
名法 )4 を行った。結果、エントリー2 と同様に 85 を
、 85 のフェノーノレ性ヒドロキシ
基がアシル化された 87a
との 1 : 1 の混合物として得ることができが、この条件では、
エントリー2 よりも、混合酸無水物による 2
8 のフェノーノレ性ヒドロキシ基のアシル
化が起こりやすかった。
-78
-
+可作 h
ケぺ珂
H
6
TEA
，
DMAP
。工作ヤ目ん〉ぢHJ
，
dioxane
snoifdnoc
かん汁日外斗
表.2-4
アルコーノレ)6( とカルボン酸)38(
cp emith/
me/t 。
stnegaer
yrtne
T
lyozne2borol，
h2cirt，
-2
2
2lyo，
z2nebo，
ro2lhc・irt
3
MNBA
とのカップリング反応
6
edirolhc
tr
edirolhc
01
42
01
42
orh ん〉切手
:a6 =R な
ごj
:a R
=訳、
stcudorp
48 )%36(
+ 65.1[ :]1
，
a68+5
1[ ]:3.0 )%51(
6+b8
:2[ ]1
a78+5
1[ :]1 )%51(
，
6+b78 ]1:5.3[
b68
:b
:b
- 79-
R=βfi
=R
な
に
;
エントリー l と2 において、ヨードオレフィン(
)6 とピオチン化カルボン酸(
)38
との
エステノレ化反応を、室温で行うと、フェノールピオチン化ヨードオレフィン)48(
が優
で行うと、アルコールピオチン化誘導体(
)58
先的に得られ、一方、加熱条件下(1 0C)
および 86a
が優先的に得られた。この実験結果は以下のように説明される(スキーム
4 ・)2 。分子内の 2 つのヒドロキシ基のうちフェノールは、相対的に酸性度が大きく、
塩基(D MAP
または TEA)
による脱プロトン化を受けてフエノキシドイオンになりやす
い。フエノキシドイオンの求核性は、アルコールのそれよりも大きいため、フェノー
ルのアシル化が速度論的に優先して起こり、室温では 84 のみが得られたと考えた。
一方、 84
は、弱酸であるフェノールとカルボン酸の混合酸無水物で、あり、ある程度
活性化されていると考えられる。そのため、加熱条件下では、 84
在している求核触媒の DMAP
は、反応系中に存
による求核攻撃を受け、再び生じた活性中間体 5
2 を生
成する。これとアルコールから形成されるエステノレ(
)58
は熱力学的に安定であるため、
加熱条件下では、 85 を優先的に与える方に平衡が偏ったと考えられる。
幽
80 -
O
R
人OH
o
l Cf沿
R
+
0
IC
IC '
、V
入
。
へ
へ
入
、
IC
52
51
4F
。
/
いヤ作
。
/
〈
。
人
OH
0
lJ
52
o
R
，
1
人O
+
+
A
2 一
11El
i-
勾
，
CM
一
ヘU
TH
11
fム
A
G一
一
84
85
スキーム 3-4
表 2-4
エ ントリ ー 1 およ び 2 の実験結果の説明
- 18 -
ひ〈
4 ・2 ・3
ビオチン化サリシリハラミドの合成
4 ・2 ・2 で見出した条件を、ピオチ ン化サ リシリハラ ミド A の合成に適用した。すな
わち、ジオキサン中、 TEA
ロリドを、 30
存在下、カルボン酸)38(
oC で 31 時間反応させて混合酸無水物を形成させた。そこに、基質と
のジオキサン溶液を加え、室温で 21 時間反応させ、その後、 01
DMAP
反応させた。反応終了後、 HPLC
82b
と 2，
2，
-2 トリクロロベンゾイノレク
0
C で 31 時間
精製を行って、目的のアノレコール ビオチ ン化誘導体
を
、 2% の収率と、わずかながら得ることに成功した (スキーム )3-4
。
JF-F\~
152+
同十
5A )1( + 58 )3(
5A : 58 = 1 : 5.1
1
)β 〉
lT-
oid xa ne ，30 'C ，13 h
)2 SM ，DMAP
，10
)3 HP LC-pu noitacifir
'C ，13 h
スキーム 4-
O~~
FS-
ミ丈工作竹ん
ピオチン化サリシリハラミドの合成
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，2，
;.7132-2132
.372-932
-38 -
20
anihS
，
34 ;.，
9357-5357
，
.I Chem.
)b( anihS
Re.v 207
;，
.I
，107 ，
第5章 結 論
19p ・N
乱iJR測定を用いた
esaPTA-V
阻害機構解明に有用であると思われる、 4 位にフ
ッ素原子を導入したサリシリハラミド A および B の合成に成功した
そして、
の細胞毒性試験およびクロマフィン頼粒膜を用いた定量的阻害活性
試験によって、合成した 4)9 p _サリシリハラミド類は、天然型サリシリハラミドと同
等の V
-ATPase
mVIVO
阻害活性を保持していることを明らかにした。
サリシリハラミド類の結合部位特定を志向した、ピオチン標識化サリシリハラミド
A の合成に成功した。
サリシリハラミド A による e
saPTA-V
限害発現機構の詳細は、明らかにされていな
いが、今回合成した分子プローブを応用することで、サリシリハラミド A による
V-ATPase
の阻害機構を分子レベルで、解明することが期待でき、 e
saPTA-V
た創薬研究に大いに貢献することができるであろう。
- 84-
を標的とし
第6 章 実 験 項
yrtsimehC
Genr
α
，1.
serudecorP
Al leht stnevlos
dna slacimehc
The gniwolof
stnega
stnevlos
detacidni
匂
enodilory
DMA
was
eruserp
yhpargotamorhc
(TLC)
(0.25-m
.)ssenkciht
10-210μm)
dedrocer
Merck
合
waht-nezo
was
demrofrep
on a JASCO
FT-IR
lH ，C31
D 品ιECA500
enalislyhtemartet
leg
剛
91 F .R[V.JN
)92.5(
era desu
tetrauq
dna
QSTAR
etilE
Yanco
m
30E
児島e
cner
CHN
CORDER
.snoitidnoc
)0.77(
，C6D
σ
artceps
noitsubmC
latnemele
MT ・.3
-8
5
田
JNM-GSX500
ro
ni ppm
CHCh
)42.7(
，
lacimehc
from
，C 6HD 5
stfihs
of
ni D 2.0 The gniwolof
，d =telbuod
虫 MS)
wer
derarfni
era detroper
)5.67-(
s =telgnis
mas
mrofsnart
6])821(
，
wer
IR artceps
¥lN，
Hl[ 低
ot CF 3COOH
:sehtiticilpitlum
t.回 g
hnoituloser
ESI-TOF
CDCh
l，
artuen
)yhpargotamorhc
on a JEOL
tnevlos
setalp
60N lacirehps(
column
.R[V.JN
esu ，
eht
reyal-niht
.retemiralop
C31
1Ii de revo
06 452F detaoc-erp
leg
dedrocer
laudiser
dna.dellitsid
tsi，
d-er
reiruoF
fo lH dna
C31 偲
¥lN，
otetangised
rednu
erw
stfihs
htiw
01-P
.)gM(
Alnacityla
leg
dna
， dna
3 syad
01 .semit
hsalf
，EhO
MS4 .A erofeB
FT-IR420S
artceps
，HOD ;)08.4(
=e
lpitlum
rof
acilis
阿n ，
rof
ro JASCO
otlanretni
ni ppm
・
36
eht gniyrd
lonahtem
etalirualid
acilis
on a JASCO
.r lacimehC
era detroper
snoitaiverba
06 04(
91 F_.R[V.JN
htiw ecnerefer
，CHDCh
dna
fodetavitca
，o
tnaK
yhpargotamorhc
revo
e，
nimalyhteirt
MS4A
.E Merck
.detats
THF
lohocla
revo
esiwrehto
:erehpsomta
，
enidiryp
ni eht ecneserp
dedrocer
dna
etemortceps
nogra
revo detavitca
gnisu
acilis
wer
.retemortceps
nobyitallitsid
rednu
method
nmuloc
snoitator
sselnu
was tsid l1i de revo .n-idnitlytub・
.
by
roF
，dna
lacitpO
deird
，
dna dekcots
desaged
deifirup
wer derrefsnart
was
(D MA)
decuder
wer
tnemtaert
(LiAl~)， lylla
edimateca
C aH 2rednu
白
rehtr
， 1，
1，
2enahte，
oro2lhcar・tet
(NMP)
，Nlyhtemid-'N
gnisu
dna
(C aH )2 ，
enahtemorolhcid
)htem-N
tuohtiw
desu
(M b/g e回 )enoehpo
enilohprom
)51.7(
desu
dna slacimehc
nisesehtnerap
oid-4
1enax，
.desu
wer
erw
sesylana
，tte=lpirt
dedrocer
，q
=
on na AB
wer
demrofep
MOM rehte
was
.52
dea
anoitulos
DIPEA
642.0(
was
To eht
ta rom
suoeqa
cinagro
was
rednu
decuder
1:02(
ot 1:01 1yhte/enaxeh
，316
1( H ，d，
J= 9.6
H15)
，
87.3
，
.1 70 ，
H1(
(3H ，d，J
0.951
9.52
，
1.81
，
6.031
，
1.921
was
reya1
107.0
dewola
H202
28.0(
adetarutas
was
Na 2S04 dere，
tlif
aci1is
1eg
mmo1
.etateca
，9
17
The
dna detartnecnoc
yhpargotmrhc
sa 01oc 1rsse io. 1
，94%)
IR 五( )m1
3592
，538 ，76
，29
，28
cm ;・1 1H NMR
(2H ，d，J = 2.5 ，
zH
05(
H10b)
，
zH
，
.1 16 ，
H1(
3(，H )s ，
30.0
，
6.31
，
0.69
td ，J
=
(3H ，
;)s C31
，
3.77
，
5.47
，
8.27
，
43.3
2.41
，
1.96
，
，
26.4
厄
，
(3H ，
)s ，2 必(1 H ，
，
6.6 ，
zH
521(
Nl¥偲
，
d ，J= 0.71
57.5 ，
H1(
1( H ，d，J = 6.01
H Ol )a ，
0.5
H14a)
washed
yhpargotamrhc
，82%)
213(
mg ，
.1 8
2 mo1)
叫 ) was
dea
H14b)
，
.1 30
阻王z，CDCh)
，
7.5
，
3.5
，
9.04
was
)Lnr
derrits
dehcnuq
htiw
esiwpord
htiw detarutas
ta 0 oC ，dna
ta rom
瓜
o
，
3.63
eht gnitluser
noitulos
was
decuder
Na2S03
.erusserp
1:5(
htiw
，retaw
The eudiser
ot :1 1yhte/enaxeh
)etateca
32
5.2- c( .1 05 ，CHh);
sa 01oc 1rsse io. 1 α
[D]
- 86-
erutarepmet
ot rom
erutxim
1yhteid
dna
enirb
was
.rehte
ヲ
The
deird
was deifirup
ot droffa
dna
)Lnr
dewola
，
eht noitcaer
thgimevo
suoeqa
ta rom
N aH C0 31.6(
ta 0 oC ，dna detcartxe
detarutas
anoitulos
o oC rof 20 ces ，dna eht
derrits
suoeqa
erutarepmet
Na2S03
rednu
iri THF .1( ，
3)Lnr
tfA re gnieb
ot rom .erutarepmet
suoeqa
dna detartnecnoc
co1umn
remid
ni T 町 9.0(
erutxim
htiw
cinagro
，
9.5 ，
zH
，
1.51
mo1)
A 丘re gnieb
dehcnuq
2.41
of 9-BBN
2 h，
eht noitcaer
.erutarepmet
1yhte
co1umn
mmo1
htiw
・
，3.4 .，
8.4-
noitulos
30%
dehcnuq
H16)
，
73.3
9(，H )s ，
40.0
358.0
mg ，
suoeqa
was
(lH ，m ，H13)
68.0
To anoitulos
473(
.erutarepmet
mo1)
(lH ，d仇 J = 6.5 ，
6.5 ，
6.5
9.6 ，
)zH
，
1.51
1eg
(2H ，d，J= 5.8 ，
)zH
胞
，
) 48.6
ot rom
dna
(lH ，d ，
J = 9.6 也
，
) 44. 3οH ，
)s ，
29.3
=
.62
gnit1user
rof
=
，9301
029.0
d4ere，
tlif
MgS0
;)etateca
，1
09
，
Lnr
htiw
mg ，
475.0
25 252(
，9421
td ，J
，
1.041
1A 1ohc
of25
也
，
) 85.4
dewola
by hsalf aci1is
d，J = 0.71 ，
zH
，
10.5 ，
H1(
3(，H )s ，
16.3
m ，H12)
，2031
960.0(
erutxim
revo
1:5( 1yhte/enaxeh
(2H ，d，J= 5.8
H1)
，
deird
ot droffa
，2631
.1( 2
0 )Lnr
ta 0 oC ，dna detcartxe
dna enirb
56.0
was
mmo )l
54( 4. mg ，
321.0
，MOMC1
7 h，
eht noitcaer
was deifirup
Rf=
，3641
o 32.7
，74. ，
zH
retaw
TBAI
nienahtemor01hcid
noitulos
Na 2302S
)etateca
，4
15
mo1)
erutxim
rof
The eudiser
c( .1 40 ，CHCh);
阻王z，CDCh)
6.01
erutarepmet
htiw
.erusserp
α
[D] 32 2.7-
2856
washed
htiw
mg ，
316.0
eht gnitluser
N aH C0 3 dna
reya1
degrahc
To eht noitcaer
ta 0 oC ，dna
derrits
detarutas
ksalf
24 24(
.1 14 .
)1om
esiwpord
tf:A re gnieb
dekcn-owt
fo 1ohocla
，
Lnr
dea
20 Lnr
revo
by hsalf
26 023(
Rf = 04. 8 1( 1:1yhte/enaxeh
mg ，
IR 日( )m1
;)etateca
8301
，538
，76
3428
，3
592
，2
930
，286
cm ;・1 1HNMR(500
，2856
阻王z，CDCh)
6.8 血
，
) 16.4
1(，H d，
J = 9.6 胞
，
) 85.4 ，
Hl(
6.5 ，
6.5 ，
zH
H15)
，
87.3
，
35 ，
Hl(
3-16.3
，3641
54. ，
zH
=
，
3.6
H16)
，64. 64.，
zH
1.951
1.81
，
5.031
，
1.51
nife10
Des
，921，2. 7.31
.72
To
nitraM
50 min ，
eht noitcaer
Na 2302S
，retaw
eruserp
noitcaer
，
2.96
白
rehtr
，
6.06
(1H ，m ，H13)
，
，J = 4，
13. 2.7 ，6 .2也，
H14b)
，
，
3.6 ，
3.6 ，
zH
，
8.5
，
3.55
521(
Hlb)
，
8.53
，
7.43
，
39.0
CDCh)
阻
，
zI
enirb
，
deird
revo
sa e1ap
thgirb
edyhed1a
.noitacifirup
To
ta 0 oC ，dna
eht user t1gni noitu1os
，anoitu1os
tfA re gnieb
derrits
detarutas
~C1 ta
suoeqa
htiw
detarutas
detartnecnoc
rednu
o
，
6.23
，
9.52
7.4(
，
)Lm
，
，29
，28
05(
班王z，CDCh)
，，
102. 2.7
，2856
，316
o 32.7
臨， ，
H)Ol
)s ，44. 4 (2H ，
)s ，
59.3
(2H ，
was derrits
，
retaw
，CHCh);
，415
，3641
was
deird
Rf
05.0
=
，9421
，9301
H9a)
(1H ，
dtd ，
J = 6.7 ，
2.5 ，
3.4 ，
zH
- 87-
，
59.4
H15)
aci1is
1eg
mm01
was
37.5
(3H ，
)s ，
35.3
dna
co1umn
，8%)
sa
IR 自( )m1
;)etateca
，538 ，76
o.Co
dna
ift1dere
4，
(1H ，d，
J. = 2.01
，
87.3
enoteca
reya1
MgS0
mg ，
.1 32
，9
16
叫
The cinagro
(2H ，d，J = 6.8 ，
)zH
58.6
To eht woley
htiw
1:5( 1yhte/enaxeh
，901
l( H ，d，J = 2.71 ，
zH
dehcnuq
txen
mo1)
esiwpord
by hsalf
27 95(
ni eht
mg ，
35.3
dea
revo
フ
was deifirup
2(，H d，J = 6.8 ，
)zH
89.4
01 .nim
1yhte .etateca
ot droffa
desu
ta 0 oC rof
was
rednu
was
693(
dna enirb
daetarutas
dna detartnecnoc
七
edixotu
mL)
N aH C0 3
htiw
t1muinohpsohp1ynehpir
erutxim
htiw
)etateca
washed
methy
.tret
muisatop
The eudiser
1:02( 1yhte/enaxeh
52 6.7+
o10c 1rsse io. 1 α
c( 598.0
[D]
was
of
ta rom
suoeqa
1io ，whic
ni THF 7.4(
Na2S03
.erusserp
reya1
woley
0 oC ，dna detcartxe
yhpargotmrhc
2954
9( 4.，
)Lm
derrits
htiw detarutas
Na 2S04 ，五t1 detar
51 min ，
eht noitcaer
suoeqa
decuder
dehcnuq
a noisnepsus
fo eht edyhed1a
ta 0 oC rof
ni enahtemor01hcid
ta 0.Co tfA re gnieb
dea
ehte .r The cinagro
htiw
ni THF
noitu1bs
was
was
.1( 15 g，42. 3 mo1)
dea
washed
m01)
erutxim
，dna
ot droffa
tuohtiw
edimorb
2.71
，
9.27
l( H ，
td ，
J = 6.5 ，
，
(3H ;，
)s 叱 NMR
mg ，14. 1 mo1)
mg ，
21.2
ta 0 oC ，dna detcartxe
Na2S03
noitcaer
，
3.47
fo 26 246(
98(
rof
suoeqa
was
anoitu1os
enanidoirep
・
decuder
，
5.87
(2H ，d，
J=
58.6
・
，4
，
・
4. .8.4
erutarepmet
dna
，
9.59
，
m ，H12)
，
.1 54 l( H ，
tdd ，J = 0.41
3(，H )s ，
230.0
(9H ，
)s ，
530.0
，6901
(3H ，
)s ，
.1 09 ，
Hl(
，
43.3
.1 65 (1H ，
td ，J = 0.41
Hla)
，9
421
肱
， H Ol )a ，
85.3
吟
， .1 37 l( H ，
rb sー
，0 町
， .1 46 l( H ，d
也
，
) 68.0
，2031
2(，H d，
J= 6.8 ，
)zH
o32.7
.1 7
0 l( H ，m ，H14
.1 87 ・
J = 9.6
(3H ，d，
，2631
d，
J = 9.6 胞
，
) 44. 3 2(，H )s ，
29.3
2(，H d，J
，
93.3
，4
15
(1H ，
td ，J = 7.01
(3H ，
)s ，
86.3
m ，H10b)
，316
cm ・1;lH
NhfR
(IH ，d ，J =
也
， H9b)
，
85.4
l( H ，
td ，J =
2.8 ，
9.3 ，
zH
43.
，34. 0 1(，H d ，
J= 9.9 ，
3.4 ，
zH
H13)
(3H ，
)s ，
70.2
dd ，J= 2.41
7.6 ，
)zH
，
，
74. 2.4 ，
zH
78.0
9.52
，2.921
，
2.81
.82
To
enahtemorlhcid
was
quenchd
ta 0 .Co
reyal
Na2S04
detar，
tlif
which
was
2，
35-oro・
lhcid
tfA re gnieb
derrits
gnitluser
noitulos
.detarutas
suoeqa
washed
Sodium
，
)Lm
suoeqa
NMR
，9.27
，m ，HI2)
HI4b)
，6
9，4. 8.5
3(，H d，J=
，
8.0
，2.5
，
，
.1 70 ，
H1(
1( 25 阻王z，CDCh)
，0
461
a 0.951
，
9.63
，
0.63
，
3.53
0 oC ，dna detcartxe
，
H9b)
，
zH
HI5)
d ，J=
，
85.3
H13)
，34. 8，
H1(
HI2)
，
.1 87 圃
.1 8
0 1( H ，m ，H1b)
70.0
，
8.52
，
0.81
，8301
，
9.6 ，
zH
，
8.31
revo
，9
16
，
H)Ol
0.5
HI6b)
，
1.2
，
.1 64 2(，H t，J = 2.6
521(
阻王z，CDCh)
・
，5.4 .，
7.4-
同
8 -
woley
胞， HI4)
a 0.61
dehcnuq
was
woley
IR )mlif(
3468
，2
95
05(
也 H9a)
a
washed
.
m ，Hla)
io.1
，2930
，
CDCh)
，
zHM:
1(，H d，J
，
89.4
44. 4 (2H ，
)s ，
49.3
，
0.87
eht
htiw
sa elap
，
8.0
，
9.59
neht
，91%)
，
15.3 ，
H1(
・
10.2 ，
H1(
lio ，
dna detartnecnoc
cm ;・1 lH NMR
HI6a)
dna
yhpargotmhc
(IH ，d，J= 9.61
revo
lohocla
column
mg ，
.1 3 mmol
，76
dea
reyal
leg
1( H ，d，
J= 0.7 ，
)zH
95.4
sa elap
was
;)etateca
，6
38
，
deird
Na 2S04 detar，
tlif
by 1fhsa acilis
1( H ，d ，
J= 1.1 3，44. ，
zH
1.1 3，
2.5 ，
zH
6(，H ;)s 31 C NMR
The cinagro
ehte .r
enirb
ehtfo
was
htiw
1:5( lyhte/enaxeh
1(，
H d，
J= 0.7 ，
)zH
，
36.4
J= ，54. ，54. 54.，
zH
，
2.01
72.0
mol)
erutxim
28 24(
erutxim
To anoitulos
.rehte
mol)
htiw
1alohc
ot droffa
ni
mL)
，91.2
，d
na
eht noitcaer
，
deird
ot drofa
，6
801
，
retaw
73( 4. mg ，9.0
was deifirup
l( H ，d ，J= 9.61
Na2S03
20 .nim
83.0(
ta 0 oC ，dna detcartxe
Na 2302S
eruserp
The eudiser
retaw
62 min ，
eht noitcaer
rof
白
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ta 0 oC rof
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mg ，
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0.7 ，
)zH
o32.7
89.4 ，
H1(
(2H ，
.d J
d，
)7.61=J
=
，
79.4
1( H ，d，J = 1.1 1
，
)zH
，
J= 0.8 ，
2.4 ，
zH
(lH ，d
d ，J = 8.21
，
H1(
1.7 ，
zH
d
Hlb)
，
J = 6.41
，
7.3 ，
7.3 ，
zH
emalf
rednu
decuder
erhpsomta
nogra
sag retfa
gniloc
1( 9 mg ，
01.0
mL)
desaged
litnu
yletaidenrnri
erutarepmet
eruserp
rof 01 min
yna
elbub
was
noitcaer
noitulos
etahpsohp
refub
，retaw
refub
.erusserp
elbub
enirb
，dna
B )3( .11(
:nmuloc
nm;
MeO HlH
20 =
3/7 ，0 - 01 :nim
041
The
Rt y
cilasfo
iIedimalh
was detarapes
，washed
ecnatsbus
:etar
(N ACALAI
MS-I
・
0.2 ;nim/lm
MeO HlH
noitule
20 =
β
7 → MeOH
A )1( dnaedimalahilycilas
epser
min .ylevitc，
- 92-
thgil
was
dehcnuq
litnu
，
eht
htiw
pH 7
pH 7 etahpsohp
，
whic
decuder
was deifirup
mg ，320.0
by
mol ，23%)
wax .ylevitc，
epser
，01 x 250
atneidarg
tnevlos
- 021 :nim
B )3( wer
dna
HPLC
，
).CNI
TESQUE
，01
whic
gnidleihs
htiw
mg)
htiw
ta rom
desaged
lyhte/enaxeh(
sa aoloc 1rsse
，26%)
was
mL)
yhpargotamorhc
3.85(
mg ，
21.0
03 min
rednu
A )1( 1.01(
mmol
rof
dna detartnecnoc
column
htiw
erutxim
ni DMA 6.0(
，dna
edimalahilycilas
5C18
derrits
erutarepmet
deifirup
degrahc
eht gnitluser
mol)
rednu
02(
1 h ta 09 oC htiw
i1si ac leg
by hsalf
dea
etalyxobrac
was yletaidemi
Na 2 S04 ，
ift1dere
4 mg ，
620.0
wolf
rof
ta rom
revo
COSMOSIL
detection:λ280
;nim
deird
mg ，
01.0
eht user t1gni noitulos
derrits
was
dna enid2irypib，
-'2
tfA re gnieb
4(
by gnitaeh
り( enehpoiht
neht
was
deird
mol)
，
repoc
人dna
ton .dnuof
reyal
eht ylhguor
ot droffa
，
.1 15 ，
H1(
rof 51 min ，dna
mol)
MS4
of6
rehte
was deifirup
HPLC
:snoitidnoc
was
dna
The cinagro
= 1/3 ot 1β) ot droffa
edimalahilycilas
revo
ta 0 .Co
，
1.7 ，
siht noitcaer
ksalf
mg ョ06.0
eruserp
was deird
htiw
dna
eht evitaraperp
decuder
mg ，
06.0
was detulid
The eudiser
etateca
Rb 2 C0 3 931(
fo 8 57(
tfA re gnieb
ton .dnuof
(3H ，
)s ，
H14a)
nidesu
20 mL knelhcS
To siht ksalf
dea
，
63.3
，
3.9 ，
2.8 ，
zH
(D MA)
To eht
rednu
，
naoitulos
MS4 ，A was
revo
01 .semit
by areird
htiw thgil gnidleihs
was deird
edimateca
revo
hciw
ni DMA 9.0(
，
36.3
(3H ，d，
6.6 .)zH
method
，
H17b)
H13)
，
.1 4
8 1(，H d ，J = 1.31
，
J= 5.41
，
.1 36 1(，
H d
B .)3( ，Nlyhtemid-'N
，anoitulos
，
J = 9ペ0.6 ，
0.6 ，
zH
，
.1 9
8 1( H ，m ，H12)
ot rom .erutarepmet
mol)
44. 3 (2H ，
)s ，
39.3
J= ，94. 6.3 ，
6.3 ，
zH
1( H ，
;dd
1( H ，d
H1a)
，
78.0
，dna deird
nogra
yna
H14b)
zw
oht-ne
by 企o，
desaged
H17 札 85.3
(lH ，
J = 8.6 ，
)zH
匝
，
) 06.4
3(，H )s ，
6.3
，46. 64.，
zH
A )1( dna
)lomnr
，
87.3
，
.1 0
8 ・
.1 86 (
2H ，m ，H16)
edimalahilycilaS
htiw
H15)
，
J= 7.9 ，
2.6 ，
2.6 ，
zH
1( H ，d
0.2
1( H ，d，J = 8.6
86.4
2.46
mm;
:metsys
MeOH
min
，120-
dna
8.1 0
91 = 6.23-
↑α
[D]
2964
，0
71
，3561
，9
851
，3251
，4
61
，3921
O 1.1 5 1(，H rb s C3 ・OH)
M 王Z ，)
6DC
05.6 ，
H1(
H18)
，
9.6
1( H ，brd
，
J= 41，3. 7え 7，
zH2.
H5)
(lH ，d ，J = 5.31
，
9.8 ，
zH
H6)
，
28.0
)6DC
O 71 .1 2 ，0.071
6.321
，7.91
，
1.71
，
0.361
，
9.261
H8b)
，
71.2
H1a)
，
7.41
，
0.701
，
50.2
E( SI-TOF)
m/z dclac
:3 α
[D] 02 ・
= 90 4. c( 520.0
HRMS
2960
，2
94
，5
961
，3561
05(
阻 王Z ，C 6D
rof C26H
，MeO 町; Rf 52.0
，7
851
，7
051
，4
61
1( H ，d ，J=1 .1 4，1.1 4，
9.0 ，
zH
H15
dna
，
zH
H2 )3 ，54. 4，
H1(
3.51=
，
2.7 ，
2.7 ，
zH
3.5 ，
zH
H8a)
H9)
，44. 81( H ，d
1( H ，d ，J= 0.41
.1 4
8，
H1(
回 )4 ，
d ，J 3.41=
7.41=
，
7.01
H14a)
H14b)
，
28.0
)6DC
O 0.271
，
zH
，
9.261
，
6.431
，
dnuof
9.6 ，
zH
H14a)
，
.1 6
2
，
6.8
Hz;
1( 52 MI 王Z ，
，
0.621
，
8.02
=;)111
，9
1
肱，
，
9.421
，
0.41
，
，
;9.31
.352.264
etateca
，2
301
IR )mlif(
，6
9
H8b)
4，
9.6-89.6
3286
1
-mc
，
lH NMR
;
H17)
H6) ，
62.5
H16a)
70.5 ，
H1(
ョ
H)Ol
，
8.231
，
8.621
厄， H13)
.301
回
，
1.2
，
幽
.1 9
，
dt ，J= 6.7 ，
6.7 ，14. ，
zH
H2 ;)5 C31
，521，4. 9.421
d ，J
1( H ，rb d ，J = 5.61
，
65.3
，
.1 7
2，
H1(
，
.1 91 1( H ，d ，J = 2.51
(3H ，t，J = 74. ，
zH
(2H ，m ，
・
dna
，
.1 4
9 (2H
H12)
，
，
7.7 ，
7.7 ，
.1 3，
.1 3
，
.1 -7 .1 86 1( H ，m ，H
1b)
肱， H16b)
21.5
H5)
，
J= 8.01
1( H ，
rb d，J= 7.9
，
12.3
- 39
(2H ，m ，H4 dna
2(，H m ，H15
21.5
・
，14. 5 1( H ，rb q，J = 8.6 ，
zH
，41 .1 9，
3.731
，
;9.6
NMR
，3
6，4. 5.53
1( H ，d
，
26.5
，
，
74. 74. ，
zH
H2 )6 ，
7.0
，
2.7 ，
2.7
，
zH
，
1.721
，d 3，
.6 ，
6.2 ，
zH
，J = 0.8 ，
0.8 ，
0.8 ，
zH
，
7.7 ，
7.7
(3H ，d，J = 9.6 ，
zH
H18)
，
zH
H6)
H2 )0 ，
52.5
1( H ，rb d，J= 9.61 ，
zH
，
40.2
，
121
H2 )1 ，64. 5 (lH
d，J= 1.1 5，
zH
，
42.3
1( H ，m ，H1a)
/lyhte
，
0.01
d ，J= 6.6 ，
3.2 ，
zH
，64. 8，
H1(
，
6.73
enaxeh(
，7
421
，
7.231
，d ，
(lH ，
rb d ，J= 11，4. 1.1 4 Hz，回 )2 ，
75.7 ，
H1(
(lH ，d ，J = 0.01
26.6
，
0.431
652.64
，4
921
，
8.01
H2 ;)5 C31
7.4
，34. 4 (lH
，
.1 2
7 1( H ，d ，J = 9.41
例 +Na)
rb ，
C3 ・0 町
， 79.7
6) o 1.1 81( H ，
rb d，J= 2.9 厄， -N 町
， 13.7
H10)
NNaOs
3
，
3.4 ，
3.4
，
H)Ol
d ，J= 0.41
;Hl(
H2 )1 ，
，
7.7 ，
7.7 ，
，
9.6 ，
9.6 ，
zH
d ，J = 1.51
，
6.83
05(
(lH ，d ，
，
J= 5.51
H8a)
，
3285
lH Nl¥偲
，J= 8.01
(lH ，d ，J = 0.41
，41 .1 7，
9.631
，57，
3. 7
0，4. 3.93
;
H2 )2 ，
21.7
，53.，
zH
(3H ，t，J = 7.7 ，
zH
，
6.241
-mc
，52. 8 1(，H d
H15)
1( H ，
rb d ，
J= 5.61
，
26.3
H2 )6 ，
7.0
，179
1( H ，d
，
26.5
，
.1 6
5 聞
.1 5
4 1( H ，m ，H12)
(3H ，d，
J = 9.6 ，
zH
H14b)
，60
1
1
1( H ，
rb d ，J= 6.41
H2;)0 50.5
，
7.5 ，
7.5 ，
zH
H1b)
= /1;)1 IR 日( )m1
1( H ，d ，J=1 .1 6，1.1 6，
zH
，
26.6
，
.1 9
7 2(，H dt ，J= 6.7 ，
6.7 ，
.1 4 匝，H2 )4 ，
.1 6 ，
H1(
H16b)
etateca
rb d ，J = 1.1 4 ，1.1 4，
zH
rb d，J= 0.61 ，
zH
，J = 3.21
，321
，
6.6 ，
6.6 ，
zH
H17)
，
23.3 ，
H1(
H13)
1( H ，d
H16 吟
， 21.2
，6
12
(2H ，m ，H4 dna
・
(lH ，
rb d，J= 9.01 ，
zH
J= 3.8 ，
9.2 ，
zH
，8
421
1( H ，d ，J= 0.01
H2 )3 ，
45.5
H9) ，
01.5
/lyhte
64. 81( H ，d ，J= 6.6 ，
3.2 ，
zH
rb d，
，
)HN-
.1 3，
zH
.1 3 ，
49.6
enaxeh(
，
39.7 ，
H1(
ヲ
J= 41，3. 9.01 ，
zH
，
zH
Rf 52.0
，MeO ;)H
c( 961.0
，
7.321
NMR
，
5.91
d ，J
，
6.8 ，
zH
1( 52 MI 王Z ，
，
2.71
，
detaniroulF
etalfirt
orulf-N
2-muinidiryp)・
lyhte5moroul・
firt(
noitulos
of latca
.56
erutxim
deretlif
was detulid
ta 0 oC ，dna detcartxe
suoeqa
Na 2302S
rednu
yhpargotmrhc
dervocer
04. 0 1( 1:0 lyhte/enaxeh
d ，J = 7.9 ，
7.9 ，
)zH
王z，CD2Ch)
h征
05(
班王z，CDCh)
u 89.9
05(
悶王z，CD 2Ch)
u 69.9 ，
H1(
90.2
of61a
mol)
noitcaer
erutxim
.rehte
The cinagro
revo
hsalf
acilis
g，
11.3
mmol
dea
was
dehcnuq
mmol
htiw detarutas
column
was
washed
yhpargotamrhc
:03(
，16% ，
two )spets
，
27% ，
two .)spets
，5931
81.0
，7941
301
，97 ，907 ，658 ，82 ，946 ，395
59.6
，3041
Rr=
1632
，
)zH
，914
:56
sa ssaelroloc
，1831
1( H ，d ，
J= 2.9 ，
6.3 ，
)zH
suoeqa
decuder
~Cl，
.erusserp
dilos
lyhte/enaxeh
，913
，
1031
o oC rof 1.h The
whic
，6821
NE 在R 05( ，
任
z¥I1
.1 08 6(，H ;)s C31
，
deird
was deifirup
企om
by
65 .1( 07
ot droffa
was detarapes
，4621
htiw
w 剖re ，dna enirb
)etateca
;)etateca
- 94-
剖
The eudiser
1ot :01 ly1hte/enaxeh
1:01(
cm ・1;H
was derrits
1( .1 0
N aH C0 3ta 0 oC ，dna detcartxe
htiw detarutas
rednu
.1 76 (6H .，
)s
edirdyhna
suoeqa
dna detartnecnoc
1H Nl¥依
.1 8
7 6(，H ;)s 1HNMR
叫
，
c)inoflusenahtemoroulfirt
81(
ta 0 oC ，
dna eht erutxim
esiwpord
reyal
leg
13 nienidiryp
ni;)eciwt
d ，
J= ，
013 . 3.01 ，
)zH
rb )s ，
72. 0，
H1(
05(
d ，J = 2.9 ，34.
93.6 ，
H1(
，
0.01 ，
)zH
63.0
1( H ，
rb )s ，
u3.01
=，
011/ depolevd
1(，H d ，
J= 0.01
紅
.1 37 6(，
H ;)s 1H NMR
，
0.6 ，
)zH
etateca
1( H ，
rb )s ，
81.7
dna
was
der，
etlif
MgS04
d ，J = 9.01
1( H ，
U 9.
9
阻王z，CDCh)
05(
dna
61 .c 61 :a Rr =
.1 8
7 6(，H .)s 61b:
63. 7 1( H ，d ，J = 6.8 ，
9.2 ，
)zH
Rf 03. ly6hte/enaxeh(
，
.)s :c16
To anoitulos
1H NMR
rb )s ，
52.7 ，
H1(
u 3.01 ，
H1(
.1 70 (6H
，
Lm
ni;)eciwt
leg
fo 61a
班王z，CDCh)
1( H ，d ，
J= ，29. 34.，
)zH
89.5
Na 2S04 ，
by acilis
a erutxim
05(
htiw
revo
fo 61 b dna
1H Nl¥依
ni;)eciwt
，
depolevd
etateca
，
H1(
，
)zH'
，
depolevd
，
washed
was deifirup
aerutxim
eht
detarutas
was
，
deird
ot droffa
a
dna
htiw
reyal
The eudiser
)etateca
dea
erutarepmet
dehcnuq
，dna enirb
，dna
(lH ，d ，
J= 7.9 ，
7.9 ，
)zH
1( 1:0 lyhte/enaxeh
42.7
.erusserp
ot 1:5 lyhte/enaxeh
etateca
ot rom
The cinagro
noitulos
1，
2enah，
teo2rolhca・
rtet
1，
13 gniniatnoc
rb )s ，
62.7
refub
was
94( ，
)Lm
tfA re gniloc
.rehte
htiw
mol)
1ム2enah，
teo2rolhcar・tet
)Lm
09( ，
htiw
degrahc
g，
2.61
89.3(
enahtemorlhcid
decuder
1:05(
ksalf
thgil .gnidleihs
，pH 7 etahpsohp
dna detartnecnoc
column
htiw
dekcn-owt
)b06(
ni yrd
rof 4 h htiw
Na 2302S
detarutas
mL
30
g，91 4. mol)
13 37.3(
was dexulfer
eht noitcaer
eht
eta・
nohplus
user t1gni erutxim
suoeqa
To
14 .1( 71g ，
52.5
IR 自( )m1
3092
，
2986
，9471
，
，912
，281
，
141
，8601
，
，921
CDCh)
u 93.7 ，
H1(
NMR 1( 52 任
王
¥1 z，
t，
J = 0.9
，
dnuof
5789.63
detaniroulF
deird
by
.789.63
lylla
enzb
.6 muihtiL
gnieb
detaeh
rednu
)0( enlyhtem
edirolhc
聞
1.3
g，
mol)
repmt
was
complex
esiwpord
dna
フ
detarutas
wer
dea
0.4(
mL)
noitulos
KF ，retaw
，5641
05.0
，9241
，1931
任
王z，
CDCh)
，
3.01
1.71
，
3.3 ヲ
.1 7 肱
，
) 28.3
2.951
d( ，ゐ= 4，
)zH
631，4 . 0.421
d( ，
FCJ
074(
CDCh)
，
zHM
=
detaniroulF
etaozneb
anoitulos
esiwpord
，
6)zH
21 .1 6 d( ，
JFC
o ・5.831
d( ，J
6470.952
= 247
，
dnuof
rehte
，dehcnuq
，9361
=
，
6.31
9.9 ，5.4
;)zH
HRMS
1
hsinerg
，61
，
19
，4951
，
cm .・1
，328
(IH ，d ，
J= 6.8 ，
7.4 ，
)zH
1( H ，d ，
J=
10.5
1( 52 ，
zHM
，
3.601
CDCh)
o
d( ，
JFC = 5，
)zH
= 31 胞
，
) 1.041
2.61
fo 2lo-l-eneporp
4.1(
同
ni THF
noitulos
ヲ
7.73
，
;6.52
91 F NMR
m1 z dclac
E( )FOT-IS
mg ，
85.2
ta rom
suoeuqa
erutarepmet
~Cl ta
- 59
圃
0，
Lm
6.02
0( 4. 9 M ，2.1 1，
Lm
was derrits
fo 6 016(
htiw
sa a elap
，97 ，982
8.6
71，
)zH
=
edimorb
derrits
:02(
rof
.7470.952
To anoitulos
tfA re gnieb
d( ，
FCJ
胞
，
) 1.541
htiw
yhpargotamrhc
，0471
，031
washed
rednu
，84%)
，294
removd
dna detartnecnoc
.1 37 (6H ，
;)s 町 NMR
6.
4，
)zH
=
，5601
was
(IH ，d ，
J= ，
012 . 9.2 ，
.1 ，
3)zH
40.5
d( ，
FCJ1
，anoitulos
erutxim
ta 0 .Co
htiw
1( H ，
.dd J= 6.9 ，
6.8 ，
)zH
，
5.6 ，
)zH
，051
2956
was
erutxim
wer
reyal
mmol
mol)
eht noitcaer
8 h，
g1e column
o 42.7
dna eht gnitluser
ta 0 oC ，
To eht noitcaer
etlif
4der，
，261
fo muisengamlyhte
esiwpord
MgS0
ta rom
37.3
setatipicerp
cinagro
，4021
neht derrits
rof
IR 五( )m1
fo 65 .1( 07
.1( 41 ，
Lm
mg ，
26.2
was
mg ，
23.0
naoitulos
dna
ehte .r The
66 026(
7.941
.76
dea
，
1821
(2H ，d，J
在
¥l( +Na)
30aN4F1HC
was
by hsalf acilis
;)etateca
，
1831
，
dna
ot eht ksalf
erutarepmet
revo
ot droffa
1:5( lyhte/enaxeh
J= 9.61
td ，
89.5 ，
H1(
，
deird
was deifirup
)etateca
io. 1 Rf=
ta rom
htiw
，
enirb
The eudiser
3.47(
ly，
lla irt ーか
nitlyhtub
derrits
ksalf
muidalapid)
eht gnitluser
KF ta 0 oC ，
was detcartxe
1HN 乱 依 (501
detulid
mL)
ehtetartlif
.erusserp
woley
dea
2.2(
suoeuqa
ot 1:01 lyhte/enaxeh
，
)Lm
mol) enihpsohp)lyruf-，
2(sirt
htiw detarutas
suoeqa
decuder
3051
mg ，
61.0
To eht derrits
ni a knelhcS
(sirT enotecaenedilyznebid
61(
ta 0 .co tfA re gnieb
dehcnuq
noitartlif
.erusserp
nienodiloryplyhtem-N
er rof 21 .nim
仰
mg ，93. 3 mol)
593(
decuder
，dna enodiloryplyhtem-N
mol)
dea
edirolhc
ta rom
mol)
ni THF
3.01
mol)
erutarepmet
mol)
ni THF
rof
eht noitcaer
71 h，
0 oC ，dna detcartxe
1(
was
rof 20 .nim
3( mL)
was
erutxim
htiw .rehte
dea
was
The
cinagro
reyal
deretlif
was
washed
htiw detarutas
dna detartnecnoc
column
yhpargotmhc
81%)
sa aelap
etateca
rednu
hsinerg
，
depolevd
1307
1.11
decuder
，171
ot 1:01 lyhte/enaxeh
woley
1oi1:7(
，389 ，918
，
0.6 ，
)zH
43.5
d，J= 5.01 ，
)zH 00'.5
29.5
.l 4，
)zH
(2H ，
td ，J = 0.6 ，
68.4
071 4. d( ，
JFC = 2，
)zH
8.6
，
;7.93
おr F
31HC
detaniroulF
methoxy
.deda
A 丘re gnieb
:02(
l1yhte/enaxeh
io.l Rf=
56.0
lyhte/enaxeh
，721
，591
u 50.7
J = 2.71
，
9.5 ，
)zH
J= 9.61
NMR
246 ，
)zH
21 .l 2 d( ，
FCJ
8.831
6470.952
，
dnuof
To anoitulos
dna
mg ，
40.2
edidoi
IR 自( )m1
298
，3401
，294
1.91
間王z，CDCh)
d( ，
FCJ
d( ，
FCJ
，
9.71
u ・5.31
(M+Na+)
521(
阻む， CDCh)
0.631
，
7.31
= 91 胞
，
) 5.61
b( r dq ，J 1.1=
309.372
，
dnuof
29.3
u 5.61
，
0.26
，
5.4 ，
.l 8 ;)zH
.920.372
- 96-
，0461
hsinerg
woley
，601 ，0941
-mc 1; lH m
9.5
，
0.3 ，
.l 3，
)zH
d( ，
FCJ
= 4，
)zH
31 .l 7，
1.921
d( ，JFC = 5，
)zH
HRMS
)FOT-ISE(
;0.73
05(
(IH ，d ，
-OMe)
6.351
，
7.421
依
，
，
9.2 ，
.l 4
20.5
3(，H d，J= .l 9，
zH
，8541
1( H ，
td ，
d ，
J= 2.71
5.
4 ，
1H1(
wer
yhpargotmhc
sa aelap
，4371
d( ，
JFC = 5，
)zH
，
1.6
column
(IH ，d ，
J= 5.8 ，
5.4 ，
)zH
(2H ，d ，J= 9.5 ，
.l 4，
)zH
= 21，
)zH
was detartnecnoc
，93%)
1( H ，d ，
J= 2.01
7.41
erutxim
leg
，2.
4 .l 3 厄
，
) 40.5
NMR
，
0.4( ，
)Lm
20 4. mol)
，986 ，92 ，028 ，734
68.6
ni enoteca
.l( 27 ，
Lm
by 1fhsa acilis
mg ，
.l 8 mmol
，501
，
6.51
E( SI-TOF)
HRMS
)lom
rof 32 h，
eht noitcaer
69 174(
，431
184(
lyhtem
was deifirup
0.021
.9570.952
of67
mol)
= 31，
)zH
d( ，J = 9.9 ，
5.4 ;)zH
・
u
d( ，
JFC = 5，
)zH
7.731
d( ，
FCJ
= 6也
，
) 1.021
1( H ，d批，
J=
1( 52 阻王z，CDCh)
051 4. d( ，
Jl Fc = 243 ，
)zH
= 21，
)zH
J= 3.01
1( H ，d ，
C31
C 1JIlsFNa03
C31
，，
012 . 6.6 ，
)zH
J= 7.6 ;)zH
(2H ，
rb d，
，
匝
);
2(，H rb d，J = 2.6 ;)zH
1( H ，
td ，
J= 9.61
97.4
u
，3.
4，
)zH
;)etateca
，
，
3.
4 .l 7，
)zH
lyhte/enaxeh
1( H ，d ，J= 0.71
58.5
，
5.01
1:02(
29.4
1( H ，d ，
J= 1.l 2，
5.8 ，
)zH
h征
王z，CDCh)
，961
73.0
，
0.3 ，
)zH
erutarepmet
，061
，
，4371
Rf=
(IH ，d ，J= 2.01
ot droffa
1:02(
，516 ，591 ，0941 ，2341 ，371
1
Rlt 05( ，
任
¥王
J z，CDCh)
-mc ; lH N 乱
dna .)86
，
6.2 ，
)zH
The eudiser
)etateca
，
5.
4 2 (lH ，d ，J= 0.71
CDCh)u
ta rom
mmol
of67
mg ，
90.2
67 49(
，
3.6 ，
)zH
mg ，
56.2
derrits
leg
，
2.01
.96
.erusserp
，9531
，
胞
); 82.5
(M+Na+)
t :e 63(
anobrac
decuder
止30a{
enzb
muisatop
rednu
阻
，
zI
4，
(IH ，d ，
J= ，48. 0.5 匝
，
) 10.6
46.3
074(
MgS0
by 1fhsa acilis
ot droffa
，79 ，76
revo
6.6
51 .l 0 d( ，
FCJ
91 P NMR
m/ zdclac
124
，82 ，18
JFC = 6，
)zH
，31 .l 0，21 .l 2 d( ，
3.731
，298
(IH ，
td ，J= 0.71
71，2. 5.01
，
H1(
308
，
deird
was deifirup
)etateca
J= 8.9 ，
7.8 ，
)zH
1( H ，d ，
(lH ，
)s ，
41.7
，
dna enirb
The eudiser
erutxim
IR 日( )m1
，341
N}4 lC ，
retaw
.erusserp
1:04(
ni;)eciwt
，1521
suoeqa
，
23.3
d( ，
FCJl
=
d( ，
JFC = 7
吻 NMR
m/ z dclac
074(
rof
detaniroulF
etalycilas
.95
mg ，7.2μmol)
，anoitulos
1 h，eht noitcaer
rof
deifirup
0.5%
ot droffa
1.1 2 ，
3.8 ，
)zH
;)zH
IR 五( )m1
91
，461
6.721
rof
F03
lO
79.0
，
Lm
noitcaer
mol)
reyal
acilis
leg
86.0
mmol
lyhte/enaxeh
，8421
8.5 ，
H1(
rb( dq ，
J= 8.01
，
2.2
noitulos
tfA re gnieb
htiw detarutas
ot 1:5 enaxeh
，791
，371
o 52.7
td ，
J = 0.71
hsinerg
，931
，6肱
，
4).;
H15)
1( H ，d，
J= 9.6 ，
)zH
，721
，0461
，7901
17.5
，
50.5
1( H ，d ，
J= 7，
12. 2.3 ，
)zH
，5241
NMR
1( H ，
，0821
，
1( 52 阻
，
zI
，431 4. d( ，
JFC = 4，
)zH
d( ，JFC
=
6，
)zH
;3.73
91 F
ac c1detalu
zlm
MS E( -IS TOF)
叫)ョ
抗
rom
，59
(40%
repmt
伽
The eudiser
was deifirup
，579
，7
19
ot droffa
，0
28
，
0.3 ，
)zH
d ，
J= 0.01
09.4 ，
H1(
44. 51( H ，d，
J= 1.1 5，
)zH
- 97-
，
0.01
44. 1，
H1(
，
.1 9，
)zH
ehte .r
，
deird
revo
by hsalf
mg ，
05.0
Rf=
，2
41 ，1241
-mc 1; 1H 依
¥.JN:
1( H ，d ，
J = 1.1 2，
5.8 ，
)zH
1( H ，d ，
J= 2.01
36 min ，
eht
58 863(
，CHCh);
，8541
，04. 4
htiw
，dna enirb
，0941
(lH ，
tdd ，
J= 0.71
er rof
0 oC dna detcartxe
，415
，59
mol)
ni eneulot
retaw
~Cl，
，
316
，9301
mg ，
79.0
DEAD
/lyhte )etateca
7
2
io. 1 α
[D]
36.3+
c( 23.0
(2H ，
.d J = 6.8 臨
，
) 30.7
，
2.01
6.3(
.erusserp
woley
，51
，
2.26
suoeqa
1:01(
2935
7.61
~Cl ta
yhpargotamrhc
IR 五( )m1
31 胞
，
) 0.631
452(
suoeqa
decuder
sa aelap
=
derrits
rednu
，91%)
，2641
・
ofenihpsohplynehpirt
ta 0 .Co
washed
50.5
34. 7 2(，H rb d，J= 9.6
cm ;1 C31
Hz);皿
(2H ，d ，
J=
.9360.902
htiw detarutas
2.6 ，
0.6 ，
0.6 ，
0.6 ，
0.6 ，
zH
49.4
d( ，Jヒ
F = 8
1，
)zH
dna detartnecnoc
;)etateca
阻王z，CDCh)
6.4
column
d( ，
JFC
1.541
of59
，6.
3，
)zH
，1941
，86
erutxim
o 01.7
，
0.01
was
，
gniniatnoc
lio 1:7(
，951
，807
et 抑 制eru
etateca
閲王z，CDCh)
，601
，867
mmo )l ni rehte
dehcnuq
was
，0
28
mg ，
27.0
dea
was
，
ift1dere
MgS04
1 452(
，0461
by
The eudiser
(3H ，d，J= .1 7，
)zH
89.3
246 ，
)zH
To daerrits
was
erutxim
The cinagro
，
)zH
.85
.erusserp
1( H ，
td ，
J = 0.71
09.5
，701
，
dnuof
ta nior
sa ssaelroloc
05(
dewolof
，
)Lm
derrits
decuder
1H NMR
，129
6.81
3160.92
，dna
=
o ・1.31
(M-H)
eneid
mol)
，869
7，
)zH
=
阻王z，CDCh)
CUH
68.0(
，94
d( ，
J1Fc
d( ，
FCJ
detaniroulF
=
，2401
o 71 .1 7，
7.351
A 丑re gnieb
mg ，6.1if2fl! lo ，85%)
，1632
官 官 3.2(
:1( 1lyhte/enaxeh
1( H ，d，J= 2.71 ，
)zH
，2654
ni
rednu
;)etateca
，2946
，14
NMR(470
.esiwpord
yhpargotamorhc
59 1( 9.2
40.5
305
，
1.521
dea
column
3.8(
mg ，7.1 9μmol)
2(，H d ，
J= 6.8 ，
6.4 ，
)zH
29.6
d，J= 3.01 ，
)zH
CDCh)
was
04. 4:1( lyh1te/enaxeh
Rf=
muidalahtpiw)enihpsohplynehpirt(sikartet
was detartnecnoc
i1si ac leg
HCOOH)
dna .)07
mol)
erutxim
by hsalf
degrahc
fo 69 1( 0.8
LJ! 27.0
7.26( ，
enilohprm
5721
To aksalf
28.6-78.6
1:3(
，2631
05(
(3H ，m) ，
，
J
，
0.7 ，
)zH
54. 2 1( H ，d
0.5 ，
H1(
d ，J= 0.71
86.4
1( H ，d，
J= 9.6 ，
)zH
d，
J= 1.1 5，
)zH
，
09.3
，
3.3
(3H ，d，
J=
0.2 ，
zH
6.3
-OMe)
恥 H13)
，
)zH
03.3
0.41
，
0.6
(lH ，d ，
J= 5.9 ，
9.6 ，
9.6 也， H17b)
，
5.3
2(，H rb d，J= 64.，
)zH
NMR
，
6.8 ，
9.7
o6.61
王
fM z，CDCh)
521(
，631，2: 31 3. d( ，
FCJ
1.731
71 匝
，
) 6.61
7.63
，
3.63
;)zH
HRMS
，
9.51
，
3.53
m/
)E( nifelognirrits
.27
(CY3P)2ChRu=CHPh
ta rom
rom
erutarepmet
desopx
rof
ot ria rof
eudiser
was deifirup
)etateca
ot drofa
sremosi
ta .)9C
31 h htiw
2954
，2
93
，5271
，316
，7
851
142
，90
1
，7
601
，041
，579
79.6
肱
，
) 05.5
・
54. 0 (2H ，m ，H15
d，J= .1 9，
)zH
7.6 ，
zH
H17)
87.3
dehcnuq
i1si ac leg
column
，415
，9841
，6541 ，714
-mc 1; lH NMR
，2
8
，
H)Ol
H1a)
H16a)
，
.1 9
0，
H1(
d
521(
noitulos
92.5
05(
44. 5 (2H ，
)s ，
60.4
，
10.2 ，
H1(
，J = 2.41
，
2.7 ，
2.7 ，
6.4 ，
zH
H16b)
，1.1 6，
zH
班王z，CDCh)
，8421
d
，
.1 4
6 1( H ，d ，
J= 5.51
o 9.61
，
1.951
- 98-
，51
2(，H .d J
，
=
d ，J=8 ，4. 5.4
1( H ，d，
J
H9) ，
48.4
H13)
，
28.3
3(，H
2(，H t，
d ，J= 7.6 ，
，
16.3
1( H ，rb d ，J
，
82.2
，
J= 2.41
，
.1 7
2，
H1(
，371
o 52.7
87.6 ，
H1(
H8b)
IR )mlif(
，7
021
，
5.9 ，
2.2 ，
zH
H1b)
，
x6.351
fo E
:Z
;)etateca
td ，J =16，4. 6.4 ，
6.2 ，
zH
，
)Lm
The
lio 1( 1:0 erutxim
H8a)
ta
ot 1:5 lyhte/enaxeh
(lH ，d ，
J= 5.9 ，
7.3 ，
zH
1( H ，m ，H12)
dea
.erusserp
征
¥王
1 z，CDCh)
1( H ，
rb d ，
J= 6，
14. 0.01 ，
zH
dna
was derrits
decuder
，5721
1( H ，d出，
J= 2.51
mL)
2.3(
1:3( lyhte/enaxeh
，9531
rednu
wer
htiw enimalyhteirt
6，
0.2-71.2
H14 吋，1. 86 1( H ，d ，
J= 1.41
NMR
eht gnitluser
(2H ，
.d J= 6.8 ，
)zH
58.6
mL)
mL)
36(
，
.1
76(
sa a p1a e yarg
Rf = 82.0
dna
ni enahtemorlhcid
1( 1:0
，CHCh);
，
5.73
，
5.4 ，
.1 8
81(
yhpargotamorhc
，90%)
，
3.5
372.765
enahtemorlhcid
rednu
c( 12.0
，9
17
，
dnuof
，dna detartnecnoc
mmol
，34. 1 3(，H )s ，
82.3 ，
H1(
，
7.5 ，
3.3 ，
zH
C31
was
gnirrits
(3H ，
)s ，
36.3
0.41=
J =;)9.6
The noitcaer
1(，H d，
J= 9.6 ，
)zH
67.4
mol)
，dna
1(，
H d ，J= 1.1 3，
3.8 ，
)zH
6.8 ，
)zH
= 9.6 ，
)zH
mg ，
6.0
26 min
mg ，
95.0
72 603(
62 5.44α
[D]
htiw
revo
suorogiv
by hsalf
degrahc
8.5
rb( dq ，J = 8.01
mmo )l ni enahtemorlhcid
erutarepmet
12 .nim
o・
6.31
d( ョJFC =
7.71
，7.1 3，6，4. 6.1 7 d( ，
JFC = 7，
)zH
To aksalf
mg ，5940.
d( ，
JFC = 21，
)zH
d( ，
JFC = 7，
)zH
，
5.421
，
(3H ，d，
J= 7.6 ;)zH
匝
，
) 3.41
柾
¥王
l z，CDCh)
1( H ，d ，J =
，
.1 39 ・
.1 58 1( H ，m ，H12)
H16b)
，351 4. d( ，
JlFC = 246
，
3.921
，
(2H ，
rb d，J = 64.
ゆ
， 30.2
C31~lFNa07 仰+Nぷ) 4372.65
fo 58 853(
14(
H11
，
78.0
，
7.27
rof
enotcal
，anoitulos
ylsuoenatlumis
，
2.87
主
dclac
，
9.6 ，
7.5 ，
zH
，
6.921
91 F N 乱iJR 074(
，
;7.31
E( )FOT-IS
detaniroulF
suorgiv
，
7.69
5.031
，
6.6 ，
zH
，
.1 37 ・
.1 6
9 (2H ，m ，H14)
，
1.951
= 5，
)zH
，
7.31
，
1.53
恥 H1b)
1( H ，
td ，
J = 0.01
H17 吟
， 06.3
，33. 8 (3H ，
)s ，
03.3
d ，J= 9.31
50.2 ，
H1(
，
.1 9
7 1( H ，d ，J= 0.41
H16a)
，
zH
.1 8
0 1( H ，d ，
J= 9.31
C31
d ，
J= 5.9 ，84. 9.5 ，
zH
(3H ，
)s ，
16.3 ，
H1(
，
87.3
，
3.8 ，
0.6 ，
0.6 ，
zH
d ，J = 6.51
，
5.9 ，H14b)
d( ，
JlFC = 246 ，
)zH
，
9.8 ，
zH
，
48.0
3(，H d，
7.41
J( FC =
21 ，
)zH
1.431
，
31 .1 5 J( Fc
91 ，
)zH
7.31
，
8.69
，
3.97
，
8.27
，
6.27
1A lohoc
.47
To
enahtemorlhcid
was
dea
was
dehcnuq
C29H
anoitulos
fo
1( 1，
)Lm
2，
35-oro・
lhcid
The cinagro
，
deird
revo
Na2S04
by hsalf
acilis
was deifirup
drofa
5.0
mg ，
74 02(
α
[D] 72 8.73-
ta .)9C
，5271
，9
17
，2
8
，9841
，71
-mc
，11
. 5，
6.2 ，
zH
08.4
1(，H d，J = 8.6
，
6.9 ，
zH
H8a)
9.5 ，44.，
zH
2.8
If)b41
厄"
H16a)
FCJ
= 7匝
，
) 3.71
3.73
，
5.53
HRMS
，
1.43
E( -IS TOP)
ot :1 l1yhte/enaxeh
:1( l
1yhte/enaxeh
3.41
d( ，
FCJ
d( ，
JFC = 21，
)zH
= 91 ，
)zH
，31;4. 91 p NMR
m/ zdclac
o 89.6
1( H ，d ，J = 11
. 5，
5.8 ，
)zH
H13)
0.79
074(
rof C21H
，51
H1b)
間 王z，CDCb)
1.431
d( ，
JFC = 3，
)zH
，
5.37
，61
. 9 d( ，
FCJ
阻王z，CDCb)
92 FNa06
，2
41
H15)
o ・8.231
仰 +N ぷ) 6481.94
- 9-
，
，201
，1401
，
(lH ，d，J = 8.6 ，
)zH
(3H ，d，J = 0.2 ，
)zH
H17b)
H8b)
，
.1 46 (lH ，d ，J= 6.51
d( ，
FCJ
31 .1 6，
9.921
= 7，
)zH
qd(
，
5.9 ，
d ，J= 6.51
，
.1 57 ，
H1(
o1.761
，
92.2
，
J= 5.41
，
.1 94 1( H ，d
28.3
ヲ
36.3 ，
H1(
，42 . ，
24 . 24.，
zH
H16b)
08.6
，54. 6 1( H ，
td ，J =
，
58.4
，
29.3
，
J= 5.61
143
IR )mlif(
，791
(lH ，m ，H12)
521(
ot
fo :E Z sremosi
d ，
J = 11
. 2，
0.6 ，
.5 3，
zH
，11
. 6，11
. 6，
zH
NMR
Hz);叱
)etateca
，1321
H9)
，
The eudiser
;)etateca
，
6.9 ，
2.2 ，
zH
，
dna
，
retaw
.erusserp
，J = 5.8 ，
5.8 ，
7.4 ，
7.4 ，
zH
・
70.2
erutxim
ta 0 oC
lio O1( erutxim1:
，
J= 4，
14. 7.7 ，
7.4 ，
7.4 ，
zH
，
.1 48 1( H ，d
(3H ，d，J= 7.6
Jl cF = 247 ，
)zH
d( ，
1:3(
(lH ，d
ni
mL)
Na2S03
yhpargotamrhc
，
81.2
H14 札1. 69 (lH ，d ，J= 3.41
，
58.0
suoeqa
decuder
，34. 3 (3H ，
)s ，
92.3
1虫 MS
75.0(
Na 2302S
rednu
woley
，
1( 28 mg ，0，
08 mol)
htiw detarutas
，
57.3 ，
H1(
H1a)
retaw
suoeqa
d ，
J =，94 . 34.，
zH
H17a)
，63ヲ4. 5.53
rof 35 min ，
eht noitcaer
washed
1(，H td ，J = 2.51
，
3.73
~ゐ=
.6242.935
dna detartnecnoc
54. 8 1(，H d
1( H ，d ，
J= 4，
14. 6.5 ，
2.3 ，
zH
，
dnuof
1.71
11
. 7，
5.4 ，
.1 8 ;)zH
enoiuqozneb
Rf = 92.0
肱
，
) 80.4 ，
H1(
=
，
7.73
・
sa aelap thgirb
，CHb);
，
3.55
，J
erutarepmet
was
column
J = 11
. 6，
7.7 ，44.，
zH
(lH ，d ，
d ，J
=16.5
ta rom
7，
)zH
mmo )l dna
，
6p-・
onaycid
，97%)
，
03.5
dq
mg ，75.0
，7541 ，714 ，2831 ，8431 ，5721
1; lH Nl¥低
05(
阻王z，CDCb)
H10)
6.5
935 2. 124
692(
=FCJ(
，
5.521
N aH C0 3 dna detarutas
leg
)zH
(lH ，d ，J =，84. 5.4 ，
2.51
72
reyal
mmol
，
3.821
rb(
(M +Na)
detar，
tlif
c( 62.0
，5061
o ・0.31
suoeqa
htiw .rehte
，
1.921
，61
. 6 ~ゐ= 7，
)zH
derrits
htiw detarutas
dna enirb
，
3.6
73 FNa07
ta 0 .oc tfA re gnieb
detcartxe
，
2.031
阻 王z，CDCb)
m/ z c1a d
c rof
E( SI-TOP)
975
2臨
，
) 6.031
，31;4. 91 p N 乱1R 074(
0.43
2954
=
=
，
3.9 ，
zH
2匝
，
) 5.351
，
2.821
95，4. 6.5
，
7.521
，
9.83
d( ，
，
6.73
，J = 11
. 7，
5.4 ，
.1 8 ;)zH
，
dnuof
681.94
，
.1
，
nifelodoI
.7
Des
nitraM
To
93(
mg ，
08.0
rof 37 min ，
eht noitcaer
dna detarutas
suoeqa
washed
htiw detarutas
detartnecnoc
rednu
was
desu
63.6
fo eht
mrofdi
nworb-hsider
mol)
erutxim
erutxim
fo rehte
detarutas
was detulid
1( 2 mL)
acilis
leg
NMR
J= 8.41
rednu
yhpargotamrhc
1( 1:5 ot 1:5 lyhte/enaxeh
sa aelap
woley
lio 3.3(
3721
= 5，
12. 6.9 ，
1.2 ，
1.2 ，
zH
)s ，
82.3
胞
， H13)
1( H ，d
H16a)
，
3.2
71.2
・
，
zH
H1b)
，123~
70.2
h 任王z，CDCh)
H10)
33.5
ヲ
3(，H d，
J= 0.2 ，
)zH
1( H ，m ，H12)
，
J= 9.41
o 9.61
=
d( ，JCF
，
6.8 ，
zH
H14a)
H14b)
，
48.0
5，
14 . 5.9 ，
zH
=
4，
)zH
H16b)
d( ，J1 cF
6.351
41 .l
- 01
-
，
92.2 ，
H1(
H18)
=
246 ，
)zH
，9841
，
82.5
1( H ，
d
50.4 ，
H1(
，
5.9 肱
， H8a)
，
J= 6.41
9.6 ;)zH
8.41
，
，
J
d ，
，34. 3 3(，H
，
0.8 ，
3.6 ，
.l 5 抱
，
rb d，
J= 2.41 ，
zH
=
，
，54. 51( H ，d
，
.l 76 1(，H d ，
J= 2.41
3(，H d，J
c(
579 ，91~ 128 ，18
(lH ，d，
J= 7.6 ，
)zH
，24. 5 (lH ，d
，28. 6.4 ，
9.0 ，
zH
，
.l 86 d( ，
J= 1.51
，
.l 40 1( H ，d ，J
H8b)
，601
mg ，
(lH ，d ，
J = 5.8 ，
44.
恥 H15)
1( H ，d ，
J= 3.61
26.3
revo
by hsalf
，721
，
5.8 也
，
) 87.6
，
zH
，
deird
77 12(
α
[D] 72 5.48-
剖.
)71C
110~ 104~
，
J= 3.8 ，
3.8 ，
6.4
1( H ，d
ot droffa
1( H ，d，
J=14.5
，
51.6
，
J= ，
614. 9.3 ，24 . 24.，
zH
1(，H d
，113~
a
，washed
was deifirup
，293
，
otni
was detarapes
The eudiser
592
a
gnidahs
deruop
，dna enirb
1(，H d，
J= 7.6 匝
，
) 87.4
H9) ，
58.4
，
69.3
H17)
was
N aH C0 3，
retaw
1( H ，d ，
J =5.11
o 9.6
dna
ta 0 oC ot evig
)etateca
51
To a
fo eht edyhedla
reyal
IR 自( )m1
mg ，
287(
rof .nim51
fo E:Z sremosi
119~
)II(
eht noisnepsus
.erusserp
1: erutxim
lio ，whic
woley
dea
The cinagro
;)etateca
阻 王z，
CDCb)
05(
，1，
14. 7.2 ，
7.2 ，
zH
J= ，
94. 7.3
ta 0.Co
dna
rof 62 h htiw thgil
dna
mL)
decuder
was
was
detar，
tlif
eruserp
erutarepmet
suoeuqa
(lH ，d ，
J=14 ，4. 2.8 ，
2.6 ，
zH
96.6
，
)zH
mL)
63(
Rf = 04. 9:3( ly1
hte/enaxeh
1H
・
;1
23(
de，
tarutas
145~ 142~ 141~ 138~ 134~
cm
rehte
dna detartnecnoc
，80%)
，CHCh);
ta rom
retaw
Na 2302S
column
04. 3 mmol
12.0
dna
suoeqa
tlif
Na 2S04 dere，
derrits
reyal
Na2S04
anoitulos
mL)
N aH C0 3
edirolhc
decuder
)Lm
ni T 旧 6.4( ，
6.72(
htiw
revo
Chromium
rednu
ta rom
The cinagro
76 sa elap thgirb
ni enaxoid
A 丘re gnieb
derrits
suoeqa
htiw .rehte
emalf
)II(
tfA re gnieb
，
deird
叫)
11(
htiw detarutas
edyhedla
htiw
edirolhc
.noisnepsus
eht noitcaer
detaeh
o.Co
瓜
rehtruf .noitacifirup
by gnieb
mg ，21.2
538(
dea
，dna enirb
ot droffa
tuohtiw
ni enahtemorlhcid
dehcnuq
，
retaw
eruserp
chromiu
was
was
302SaN
decuder
mol)
ta 0 oC ，dna detcartxe
suoeqa
was deird
noisnepsus
mol)
erutxim
Na 2302S
ni eht txen noitcaer
mol)
mg ，
35.0
fo 74ο11
enanidoirep
・
erutarepmet
htiw
anoitulos
C31
d( ，JCF
H11
札
，1.l 5，1.l 5
N 乱低(1 52
=
21 ，
)zH
91 F N 乱1R 074(
dclac
rof
C22 H82 FINaOs
gnilpuoC
.75
54( ，
)Lm
60.1
mol)
was
was
dewola
ot warm
revo
Na2S04
hsalf
acilis
96.0
，CHCh);
2359
，3071
and detartnecnoc
Rf = 72.0
1; lH NMR
H18)
6.4 ，
zH
H9)
95.3
05(
6.01
powder
，5241
rb d ，J 2.51=
(lH ，
rb d ，J= 7.61
，
5.051
，
8.8 ，
.1 0，
zH
d( ，JFC = 7，
)zH
0.91
;6.31
91 F 在
¥lN
R 074(
阻
，
zI
(M +Na)
540.38
22 FINa04
-4 可
edimalahilycilaSdesaged
by 企woht-nez
elhcS
:kn ksalf
was
ot rom
，
9.5 ，
9.5 ，
.1 0，
zH
H15)
，54. 0，
H1(
deird
repmt
= 71 ，
肱
);
78，4. 7.37
o ・1.931
rb( ;)s
，
dnuof
methode
叫e
ru
，
∞rep
，J= 41
，3. ，31.
dd ，J = 5.51
，
2.9 ，
2.9
匝); C31
NMR
，
6.4 ，
HRMS
ISE(
，
，24. 2-7 4. 1
d ，J = 0.51
，
，
.1 3
肱， H1b)
9.531
田
H13)
1( 25 阻王z，CDCh)
，4.1 4，
5.83
，
5.07
H8b)
，
.1 39 ，
H1(
H1a)
，6
23
，0.231
，2.83
，1
27，4.
，37，4. 2.53
mJ z dclac
TOF)
，
rof
.7540.384
B.)4( lyh
Ntemid-，
'N
by gnitaeh
，69
，
Hz) ，
36.6 ，
H1(
(lH ，d
d( ，JFC = 5ヲ
)zH
，
8.631
，76
，
0.2 ，
0.2 ，
zH
，J= 6.31
3(，
H d，
='J 9.6
941，4. 7.041
CDCh)
dna
，J= 8.61
，
.1 79 (lH ，d
，820
，2956
(lH ，d ，
J = 7.8 ，34.，
zH
，
96.3
，
7.6 ，
.1 8，
.1 8，
zH
，
09.0
d( ，
FCJ
A )2(
was
gniloc
，
81.6
，34. 0 (lH ，d
H14b)
d( ，
JlFC = 241 ，
)zH
3.21
C19H
H17)
H10)
3469
1( H ，d ，
J = 5.8
，
，
74. 74. ，
zH
，J = 5.31
1(，
H rb dd
(lH ，dd ，
J= 1.51
o 7.961
H8a)
IR )mlif(
，968
by
57 831(
mg ，
α
[D] 72 +19 4. c(
ta .)71C
，8201
，
deird
enirb
ot drofa
ni;)eciwt
，14
ta
mL)
was deifirup
)etateca
，861
07(
htiw
The eudiser
，
depolevd
，
3.9 ，
3.5 ，
zH
，
1.5 ，
zH
washed
er of E Z: sremosi
erutxim
retaw
陶
was
(lH ，
rb sー
，O 町
， 01.7
ョ
.1 -48 .1 92οH ，m ，H12)
H14a)
，
zH
別
，1
274
o1.01
，J = 6.01
dd
，
H1(
，
3.2
，192
(lH ，d ，3
.41=J
75.6
，
21.5 ，
H1(
mi
eci dloc
.erusserp
etateca
CDCh)
reyal
ot 1:3 lyhte/enaxeh
1:4(
，1
356
56 min ，
eht noitcaer
htiw
cinagro
ni
.1( 0 M ，
.1 06 ，
Lm
quenchd
decuder
1:5(
，
zHM
，
25.5
(2H ，m ，H16)
rednu
:3( 1lyhte/enaxeh
，194
d ，J= 3.8 ，
0.5 ，
)zH
.1 3，
zH
，
neht
yhpargotmc
mg ，04. 1 mol)
of 77 12(
ta ・87 oC rof
The
sa saselroloc
，162
noitulos
ni enahtemorlhcid
.enahtemorlhcid
column
，76%)
derrits
erutarepmet
mJ z
54 .1 08 .1
enarobmirtfo
up ot rom
，
ift1dere
03. 0 mmol
aylsuorogiv
anoitulos
htiw
leg
，
dnuof
ta ・87 .Co tfA rederitsgnieb
ade
5- oC and detcartxe
cm-
To
1武 MS E( SI-TOF)
，J = 1.1 3，
5.4 ，24. ;)zH
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54 .1 0863
(M+Na+)
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enahtemorlhcid
o ・7.231
CDCh)
，
zHM
revo
htiw
edimateca
01 .semit
areird
rednu
)I(etalyxobracenhpoiht
ρMA)
Rb 2C0
decuder
-
931(
ni siht noitcaer
mg ，06.0
mol)
eruserp
91(
- 101
3
desu
mg ，
01.0
rof
mol)
51 .nim
was
ni a
tfA re
ade
ni ebolg
.xob
enid2irypib，
-'2
mg ，
21.0
02(
mo1)
dea
dna
eht user t1gni erutxim
e1bub
was
ton .dnuof
anoitulos
e1bub
was
erutxim
dna
htiw
，dna deird
enirb
eudiser
was deifirup
)etateca
ot droffa
evitaraperp
rehte
ta rom
by hsalf
acilis
y1hguor
0.2
:nmu1oc
，MeOH);
c( 312.0
自( )m1
，028
Rf=
，3692
1823
，876
16.6
1( H ，
d
H6)
，
36.5 ，
H1(
，1961
H2 )2 ，
80.7
1( H ，
rb d
，
J= 6.41
rb d，J= 6，
0，
zH
H1a)
(lH ，m ，
，ο
73.
，
80.2 ，
H1(
，92.，
zH
521(
H14b)
阻 王Z ，C 6D
Z，
)6DC
ax
H18)
，8421
，812
by eht
mo1 ，15%)
280
，
27.6
dna
nm;
wolf
，
20)iR
nm (ε=26
，831
，1801
，7201
1(，H d ，
J= 7.9 ，
3.8 ，
zH
d ，
J=8.3
91.6 ，
H1(
d ，
J= 3.41
，H m ，H8)
，
12.2
1( H ，d ，J = 3.41
m，
H15)
30.5
・
1(，H m ，H10)
，7ペ74.，
zH
H5)
，
，
6.4 ，
zH
，
32.5 ，
H1(
，
2.7 ，
2.7 也
， H17)
，
rb d ，
J=
rb ，
C3 ・，
O)H 19.7 ，
H1(
，
58.4 ，
H1(
，
86.3
H16a)
d ，
，
50.5
1( H ，
，
21.2
，
.l 79 2(，H dt ，
J= 6.7 ，
6.7 ，14.，
zH
，
9.9 匝
， H14 ゆ
， .l 56 ・
.l 35 2(，H m ，
H1b
(3H ，d，J = 9.6 Hz，回 )6 ，
7.0
- 102-
ot 3:1 1yhte/enaxeh
，
03. .nim
82 0.05:2 α
[D]
H2 )3 ，
35.5 ，
H1(
H16b)
The
wax .y1evit，
cepser
H) 28
H10)
6) u
.erusserp
，20 min ，
0:01
(MeO
，821
，
retaw
refub
mm; :noitceted
(lH ，
rb s，
，
)HN-
，
0.6 ，
0.6 ，
zH
pH 7etahpsohp
sa saselro1oc
u5.01 ，
H1(
H2 )1 ，
65.6
d ，
J= 6.31
，
38.0
，
1641
，
6.01 ，
zH
，
eht noitcaer
mg ，
510.0
1( H ，
rb d，J= 1.1 5 也，回)0 ，
31.5
，
9.6 ，
9.6 ，
zH
H13)
Am
，
7.7 ，
7.7 ，
.l 3，
.1 3，
zH
，
01.5
H9)
H2 )4 ，
.1 6 1( H ，d ，
J = 0.51
J = 6.41
王
lM
，2941
1( H ，
d ，
J= 3.41
，
J= 9.01
，
7.4 ，
7.4 ，
zH
J= 5.51
05(
，
161
yna
37 4. min .y1evitc，
epser
dna
;)etateca
，
J=1 .l 5，1.1 5，
9.0 ，
zH
d
36 4. min
1itnu
was deifirup
，07 3: 0→0:01
min
niaga
decuder
，h
ciw
，01 x 250
圧
も 0 ，01
4 wer
，651
1H NMR
，2%)
，
was
pH 7etahpsohp
mg)
yna
MS4A
htiw
A )2( 1.7(
:1( 1yh1te/enaxeh
43.0
dehcnuq
1:3(
mmo1
1itnu
revo
revo
rednu
92(
niaga
thgi1 gnid1eihs
htiw
ecnatsbus
mg ，
20.0
MeOH
dna
yhpargotamorhc
5C 81 ISM-
fo 2 dna
，1392
cm-¥
1.l 5，1.l 5，
zH
03:07
)Rt(
semit
co1umn
COSMOSIL
:t，
neu1e
nim/1
The noitneter
NMR
1eg
B )4( 1( 1.0
HPLC :snoitidnoc
，washed
revo
dna
MS4 ，A was
revo
was deird
dna detartnecnoc
deifirup
_4 1ed乍
ima1ahi1yci1as
田 LC ot droffa
whic
was
mo1)
htiw thgi1 gnid1eihs
1 h ta 09 oC htiw
was detarapes
deird
dna
revo
，dna
Na 2S04 detar，
tlif
revo
eht
mL)
erutarepmet
mg ，06.0
erutarepmet
desaged
i:
tsrrde rof
reya1
-4edima19ahi11yci1as-F
179
ni DMA 7.0(
revo
ta rom
was y1etaidemi
ta 0 .
oc The cinagro
:etar
mo1)
tfA re gnieb
ton .dnuof
was detu1id
refub
rof 30 min
，
01.0
was
desaged
derrits
eht user t1gni noitulos
，d
na
叫 ) whic
ni DMA 7.0(
was y1etaidemi
tfA re gnieb
fo fo 57 (46mg
dea
8 57(
fo (2Z ，
4)Z ・2，
4edimane・idatpeh
A noitulos
dna
H12)
(3H ，t，J = 6.7
，
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Hz，回 )5 ;C31
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8
2
7- .1 0 c( 03. 10 ，
α
[D]
MeO ;)H
= 2 ;，
)01
1032
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，973
，678
HI0)
Hz，回 )3 ，
15.5
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1.2
・
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，
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H12)
，
zH
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m，
Hl1a)
，
.1 30 ，
H1(
H2 ;)5
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J= 9.41
C31
02(
ade
ta rom
.erutarepmet
was detulid
and
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DMAP
The cinagro
reyal
rednu
yhpargotmc
叫 e，
and
teca
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.1 5μmol
，15%)
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mJ l
onahtem
sa
H5) ，
57.6
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J= 74.，
zH
a etihw
，
0.41
H16 め
，
，
.1 56 ・
.1 5 (IH ，
m，
3(，H t，
J = 7.7
，
H2 )6 ，
87.0
，
6.31
，731，4 .
0.241
，
3.81
3( ehtfo
d( ，
JCF = 71
2PS snobrac
E( SI-TOF)
HRMS
wer
mJ z dclac
edirolhc
ta 30 oC rof
rof
dehcnuq
htiw
，washed
htiw
pH 7 etahpso
was deifirup
ni;)eciwt
1H NMR
05(
(IH ，
d ，
J= 5.41
，
7.8 ，
9.5 ，
zH
- 301
H18)
-
by hsalf
dna
.)a68
，
05.5
86.6 ，
H1(
ョ
ade
erutxim
refub
ta rom
Na2S04
，
ift1der
acilis
leg
Rf = 56.0
:28
30D)
column
85 .1( 4 mg ，
8 70.7
1:9(
1( H ，d ，
J=
d，
J = 0.8 ，
zH
54. 11( H ，
m，
，
H)Ol
・
ta rom
ot drofa
阻 王z，
CD
H17)
was
revo
mJ )lonahtem
fo 85
H6) ，62. 4 1(，H d，
J= 5.41 ，
zH
，
deird
enirb
，6 4( 4.
，
eht noitcaer
gnidleihs
ot 1:9 roforolhc
1( 3:0
ドL ，1.1 9μmol)
noitulos
~)
thgil
htiw
The eudiser
etateca
05(
24 h htiw
ni enaxoid
58.1(
31 .h To eht noitcaer
ni enaxoid
oC rof
was
mg ，12μmol)
of 83 0.6(
erutxim
，
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rb d，
J = 7.51
，
2.7 ，
2.7 ，
zH
0.41
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，
) 6.91
2lyo人
zneborolhcirt-6
.erusserp
wax
，
9.7 ，
2(，
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，51 .1 2 d( ，1J C F = 246 ，
)zH
noitulos
was detarapes
1:3( lyhte/enaxeh
1( H ，
，
J= 9.01
，33. 4，
H1(
=
，
76.
H5)
，
80.5-02.5
(3H ，
d，
J= 6.9Hz
mg ，38μmol)
ta 01
，
.2612.084
and derrits
9.4(
derrits
lyhte
and detartnecnoc
and
剖e
ru
tfA re gnieb
.erutarepmet
2.8 ，
7.7 ，
zH
，36μmol)
，137
，
.1 97 (2H ，
dt ，
J= 6.7 ，
6.7 ，
.1 4
HI6b)
8 ・831 4. ;)s(
，
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261.084
tempr
d ，J
，3.1 9，
8.02
阻 王z，C
6D)
074(
(5.0μL
mg ，9.9μmol)
，
3.63
nm ε(
，071
1(，H rb d
1( H ，m ，H13)
，
0.461
ぬ
iω
doO i∞
felo 五
ni符(85め
.) To daerrits
剖O
叫
anit 瓜det
~)， τEA
，
58.0
28
，1207
，
.1 -27 .1 56 (IH ，
m，
Hl1b)
H14a)
8 0.071
，
8.73
，
36.5
H6)
，
71.2 ，
H1(
H14b)
C6D)
，
3.83
(M +Na)
FNNa05
，
06.3
d( ，
JCF = 21 臨
，
) 2.21
，7.1 3，
5.83
91 F NMR
32
，
9.8 ，
zH
，
9.421
501，2 . 2.67
，
0.01 ，
zH
，8421
(1H ，
m ，HI5)
rb d ，
J= 5.41 ，
zH
25 ，
zHM
Nl¥底(1
，31 日
， 9.821
Al ∞
c-loho
was
，
60.2 ，
H1(
，1274
(M eOH)
ax
1( H ，d ，
J= 7.9 ，
7.9 ，
zH
Hz，回 )0 ，
63.5
H8b)
nrA
1(，H d ，
J = 1.1 5，1.1 4 Hz，回 )2 ，
17.7
，
27.6
HI7)
458 2. 34 .1 :4
，d
nuof
=;)111
，194
8 09.7
HI8)
7.51 ，
zH
=
，1590
d ，
J= ，28 . 6.4 ，
zH
1(，H d，
J= 9.01
，33. 0 (IH ，rb d，J
;)dedresbo
C26H
H2 )1 ，
71.6 ，
H1(
H2 )4 ，
.1 76 1( H ，d ，
J= 9.41
7.631
，
)zH
d ，
J= 9.9 ，
zH
(IH ，d ，
J =，3
8 . ，38. 0.8 ，
zH
，
56.4
，
zH
，1654
MI 王
z，
C6D)
05(
・
d ，
J= 1.1 7，1.1 7，
zH
，701
342.854
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，
，
2931
cm ;1 1H NMR
C 26H33 町 05 (M+f)
03. 4 h(lyhte/enaxe
Rf=
，2964
357
(IH ，
rb s，
-N 町
ヲ 62.7 ，
H1(
9.7
rof
13.5
H4)
，
06.6
1(，
H d ，
J= 3.9 ，
3.3 ，
zH
(1H ，d ，J
ralugna
H13)
，
43.5
，34. 6 2(，H t，J = 3.5 ，
zH
肱，)nitoib
oib 叫
nit 仏2-85.2
nitoib
)reknil
4，
0.2-31.2
)reknil
Al lohoc
，
08.0
detanitoib
02( ，
)L!-!
μ
)lom
was
ta rom
4( 4. mg ，9.μmol)
dna
H2 .)6
htiw
.erutarepmet
lyhte
ot drofa
measurnt
reyal
-MSI
min ，03:07
2.07μmol
noitneter
emit
ni;)eciwt
)Rt(
fo 82b
lHNMR
J= 3.8 ，
6.7 ，
zH
凹
)8 ，
26.6
H20)
，
87.5
05(
H5)
701 .nim
7.6 ，
zH
H15)
，
49.4
)notorp
d
washed
，0
5 min
，J= 3.51
:b28
H2 )1 ，
17.6
，
0:01
1( H ，d
，
28.5
54. 11( H ，m ，H10)
1( H ，d ，
J= 8.7 ，
3.4 ，
zH nitoib
嗣
03:07
，1.1 0，
zH
・
H17)
，
80.5 ，
H1(
，44. 2 (1H
ralugna
HPLC
Nl¥偲
MeOH
圧12 0 ，
，40 .nim
The
，
depolevd
H6)
H9)
ta rom
COSMOSIL
:9( lona1htemlrofrolhc
0.2 ，
0.2 ，
zH
- 401
:nmuloc
，01 min
(1H ，d ，
J= 0.21
1王
)32 ，
15.5
erutxim
by eht
:t，
neule
→0:01
56.0
Rf=
U6
2.7
，
.0.9
was denimretd
.1 5 nim/l
，41:68
ta rom
Na 2 S04 ，
ift1dere
revo
HPLC :snoitidnoc
nm; 日: ow:etar
dea
，6
by eht evitaraperp
tI sdleiy
，
noitulos
refub
，
deird
enirb
H14a)
ni
，
eht noitcaer
was deifirup
.xaw
匝"
.1( 58 ドL ，1.1 9
pH 7etahpsohp
htiw
(1H ，d ，J= 9.8 ，
9.8 ，
3.7 ，
zH
，
32.4
htiw
吟
，13.2
mg ，12μmol)
尚 was
05(
thgil gnidleihs
htiw
コ
羽田
H4) ，64. 91( H ，d，J= 6.7 ，
zH
1( H ，
rb td ，J= 11
. 0，
6.7 ，
zH
，
03.5 ，
H1(
oC rof 31 h htiw
dehcnuq
0.6(
30 oC rof 31 .h To eht noitcaer
1( H ，d ，J= 1.1.7 1.1 6，
zH
1(，H d，J= 3.8 ，
zH
H13)
ralugna
wer
，41:68
of83
edirolhc
ni oid
sa aetihw
MHz ，CD 3 0D)
，
38.6
3.3 ，
zH
剖
The eudiser
280
，01 min
noitulos
匝
王
也
z，
，
td ，
3.7 ，
3.7 ，
zH nitoib
2 人lyozne6borolh・
cirt
of DMF .gnitsixeoc
mm; :noitceted
→41:68
dna
.erusserp
，02. 3l!mol ，2%)
(210μg
，01 x 250
51
was
，
.1 3
7 (2H
To dearrits
was detarapes
decuder
htiw
81
，dna
etateca
rednu
82b
ta 01
ロ
12.7H
(2H ，t，
J= 6.7 ，
zH
，
51.2
，
J= 5，
14. 51，4. 7.8
，d
PEG
PEG il此)re ，
31.3 ，
H1(
m ，Hl1a)
)reknil
mg ，38μmol)
9.4(
derrits
The cinagro
dna detartnecnoc
“
dna derrits
DMAP
tfA re gnieb
was detulid
nitoib
(3H ，d，
J= 9.6 ，
zH
erutarepmet
0.8 ，44. ，
zH nitoib
吟
， 6.2 臼3ο
1( 旦 d，J=
，
0.5 ，
zH itoib
，
.1 87 (1H
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dea
.erutarepmet
m ，H12)
ド
L ，63l11l! )10
，44. 1
1( 4H ，m ，H8 dna
，t，J= 54. ，
zH
，2.
3 0・2.2 ，
H1(
cilahpila
TEA 0.5(
=
H15)
，
ω
dd d，
J= 臼
10.5 ，
9.6 ，
9.6 ，
.1 5 也， H16
dna nitoib
edimalahilycilaS
陶
enaxoid
，H14b
d ，J
2，
5.3-26.3
，3.28οH
H16b)
，
H1(
，42. 3，
H1(
PEG )reknil
PEG )reknil
，
0.9 ，
3.5 ，
7.0 ，
zH
8 ・
.1 47 6(，H m ，H1b
.1 7
cilahpila
)notorp
，凪
m， 児
PEG引ilは此，
的
e)rの 判
24. ο
(OH1
，
J = 0.51
cilahpila
ralugna
，
J = 0.8 ，
0.8 ，
3.5 ，
zH
1( H ，d
1( H ，d ，J = 7.21
，
58.2
♂
5.2 匁ο
(2H2
(1H ，d
，
50.5
2(，H dt ，J= 0.6 ，
.1 0，
zH
，
17.3
0.9 ，
9.5 ，
5.4
m ，H9)
，
H1(
0.8 ，
0.5 ，
9.0 ，
zH nitoib
=
)notorp
)reknil
5C
・
62.5
，d
)notorp
H2 )2 ，
20.7
1( H ，d ，
，
J= 2.9 ，
.1 2，
.1 2，
zH
1(，H rb d，J= 0.21
，
73.5 ，
H1(
，
zH
d ，J= .0.9
rb d ，J= 2.51
，
7.6 ，
，J= 9.7 ，
0.5 ，
9.0 ，
zH
，
17.3
2(，H rb t，
J=
3.6 ，
zH
PEG )reknil
，
92.3
)reknil
J= 7.21
2-05.2
51.2
，
26.3
25.3
・
(2H ，t，J= 6.5 ，
zH
，
0.5 ，
zH )nitoib
3. 9 (2H ，m ，H16)
，
36.2
H14a)
nitoib
cilahpila
，
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謝辞
本研究は大阪大学大学院理学研究科化学専攻生体分子化学研究室で行なわれたも
のであり、本テーマを与えて下さり、研究生活の様々な面で暖かい御指導、御助言を
賜りました村田道雄教授に心から御礼申し上げます。実験操作をはじめとして、本研
究の遂行にあたり直接の御指導、御鞭援を賜りました大石徹准教授に深く感謝申し上
げます。数々の御助言、御協力を賜りました松森信明、出村哲夫両助教に深く感謝し 1
たします。フッ素化サリシリハラミド類の生物活性試験の御指導、御助言を賜りまし
た、本学大学院理学研究科生物専攻膜機能学研究室の松下昌史助教、金津浩教授、
此木敬一博士(現・東北大学大学院農学研究科准教授)に心から感謝申し上げます。よ
き先輩として、実験生活のみならず日常生活でも大変お世話になりました蓬台俊宏博
士(現・住友化学)、葛西佑介博士(現・東北大学)、土川博史博士(現・関西学院大学)、
鳥飼浩平博士(現・東京大学)、丸吉京介博士(現・第一三共製薬)、渡部浩史博士(現・
武田薬品工業)に深く感謝いたします。快適で、明るい雰囲気を作り出して頂いた生
体分子化学研究室の学生の皆様に深く感謝し、たします。最後に、大学院での研究室を
経済的に、精神的に支えて下さいました両親に深く感謝致します。
平成 12 年 3 月
- 171
-
付録
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MHz ，CDCh)
o 3.01 (IH ，
rb )s ，
42.7
(IH ，d ，
J 7.9 ，
7.9 )zH ，
73.6
(IH ，
d ，
J = 8ム9.2 H
z) ，
7.1 3 (
6H ，
;)s HI NMR 05(
MHz ，
CD 2Cz!)δ10.3
(1H ，
rb )s ，
52.7
(IH ，d ，
J 9.01 ，
0.6 Hz) ，
93.6
(1H ，d ，
J = 2.9 ，34. Hz) ，
.1 70 (6H ，
.)s :c8 rR 63.0
hl
(yhte/enaxe
etateca
1α1 ，
ved 巴depol
ni;)eciwt
HI NMR 05(
MHz ，
CDC1
3)
o 89.9
(IH ，
rb )s ，
7.
1 8 (IH ，
d ，
J 0.01 ，
0.01
Hz) ，
.1 87 (6H ，
;)s
H' NMR 05(
MHz ，
CD 2Cz!)δ9.6
(IH ，
rb )s ，
02.7
(1H ，
d ，
J=
3.01 ，
3.01 )zH ，
7.1 6 (6H ，
.)s
lfirt
To anoitulos
fo 12a dna
01 ni enidiryp
81( mL) -ou，
ciloflusenahtemor
a曲 y批edi 1( .1 0，
Lm 90.2
')lom
was dea
esiwpord
ta 0 oC ，
and eht erutxim
was nits ・
de ta 0 oC rof 1.h The
noitcaer
erutxim
was dehcnuq
htiw detarutas
suoeqa
NaHC0
3
ta 0 oC and detcartxe
htiw .rehte
The cinagro
reyal
was washed
htiw detarutas
suoeuqa
NILCl
，
retaw
，
and enirb
，
deird
revo MgS0 4，
deretlif
，
dna detartnecnoc
rednu
r巴decud .erusserp
The eudiser
was
ifimp
巴d y
b hsalf is1i ac leg column
yhpargotamorhc
:03( 1 ot :01 1
lyhte/enaxeh
)etateca
ot drofa
31 .1( 70 g，
11.3
m叩mol ，凶
16% ，two
ts飽
巴s
p吟
) sa saselroloc
dilos
hciw
was es句pa 也
taI工. 巴d from
41 .1( 17 g，
52.5
mmol
，27% ，two .)spets
:31 rR
81.0 1(
=
=
=
=
=
detaniroulF
A 問 seugol
edfoimalahilycilaS
uoJ
11l
la fo lanicdeM
yrtsimehC
，
XXXX
，Vo. l，
x以
: .oN
x
E
NMR 05(
MHz ，
CDCI 3)δ7.24
(IH ，
.dd J== 9ム6.8 Hz) ，
8.6
05(
MHz ，CDCI 3)δ7.10
(2H ，d ，
J== 11 ム3.8 H
z) ，
29.6
(2H ，
(IH ，
d ，
J== 6.8 ，
7.4 Hz) ，
89.5
(IH ，
td ，
J== 9.61 ，
3.01 ，
5.6 )zH ，
d ，
J== 6.8 ，
6.4 Hz) ，
09.5 l( H ，
td ，
J== 0.71 ，
0.01 ，
3.6 Hz) ，
50.5
40.5
(IH ，d ，
J== ，
012 . 9.2 ，
3.1 )
zH ，
10.5
(IH ，d ，
J== 1.71 ，
(IH ，
d，
J== 3.01
Hz) ，
40.5
(IH ，
d，
J== 71 2. H
z) ，
89.3
(3H ，
d，
J==
，3 . .1 7 Hz) ，
28.3
(2H ，d，J== 64. Hz) ，
.1 37 (
6H ，
日
;) C3J NMR
.1 7 H
z) ，
34. 7 (2H ，
rb d，
J== 9.6 ;)zH
IR if( )mI 350
，
2946
，
2654
，
521(
MHz ，
CDCh)δ159.2
d( ，
JC 'f== 4 H
z) ，
7.941
d( ，
CJJ 'f== 2
47
1632
，
701 ，
0461 ，
601 ，
951 ，
1941 ，
2641 ，
5241 ，
0821 ，
91 ，
461 ，
141 ，2401 ，94 ，968 ，
129 ，820 ，768 ，807 ，68 cm 一
;J C3J NMR
Hz) ，
1.541
d( ，
CJ 'f== 31 H
z) ，
1.041
d( ，
CJ 'f== 5 )
zH ，
631，4 . 0.421
521(
MHz ，CDCh)δ17
CJ 'f== 6 H
z) ，
21 .1 6 d( ，
CJ 'f== 71 )
zH ，
2.61
，
6.31
，
3.601
，
7.73 ，
，
7.1 7.351
d( ，
CJJ 'f = 2
46 Hz) ，
1.541
d( ，
d( ，
;6.52
"J
p9 NMR 0
74(
MHz ，CDCh)δ-138
5. d( ，J== 9.9 ，45.
CJ 'f = 31 )
zH ，
0.631
，
431 4. d( ，
CJ 'f = 4 H
z) ，
6.721
，
1.521
d( ，
CJ 'f =
;)zH
HRMS
但S
I-TO
町 z/m dclac
rof CJ3HJ3F~a03 仰+ Na+)
7 Hz) ，
6.81
d( ，
CJ 'f = 81 H
z) ，
7.61
，
2.26 d( ，
CJ 'f = 6 H
z) ，
;3.73
6470.952
，
dnuof
.7470.952
lや NMR
074(
MHz ，
CDCI 3)δ-13.1
rb( dq ，
J = 8.01 ，
22. ;)zH
HRMS
E( SI-TO
町 zlm detaluclac
rof C JHJ ){J F0 3 (M )-H 3160.902
，
2-orulF
・
hydrox-6
・
2( ・
ozneb)lynepor
Ci Acid
2♂lynepor
3・
dnuof
.9360.902
retsE
.)61(
To anoituIos
fo10-l-eneporp-2
.1( 40 ，
Lm 6.02 moI)
ni THF l( ，
)Lm
anoituIos
fo muisengamlyhte
edimorb
ni THF
orulF
・
2 ・methoxy
・
6・
2( )・
lyneporp
・
benzo
Ci dica SI( ，
3R ，
)S4 ・
3・
0( 4. 9 M ，21.1 ，
Lm 3.01 moI)
was dea
esiwpord
ta 0 oC ，
dna
3・(me 曲1-)yxohtemyxo
4([・
-2[ ]lyhte]yxohtem)ly・
nehpyxohtem
・
-4
出 er g
巴
ni，
tluB
noituIos
was derrits
ta rom erutarepmet
rof 20 .nim
6-lyhtem
・
lynetpeh
retsE
.)81(
To aderrits
noituIos
fo -ehpirt
enihpsohplyn
452(
mg ，
To 血巴noitcaer
erutxim
，anoituIos
fo 51 016(
mg ，
25. 8 moI)
ni
79.0
moI)
，7 68.0(
mol)
，and 9ρ54
THF 3( mL) was dea
esiwpord
ta 0 .Co retfA
gnieb
tslIdeT ta
mg ，
27.0
moI)
ni rehte 6.3( ，
)Lm
DEAD
(40%
ni eneulot
，
4.0
rom
temp
巴
tar 町 e rof 71 h ，
eht noitcaer
erutxim
was detulid
htiw
，
Lm 79.0
moI)
was dea
ta 0 .Co retfA
gnieb derrits
ta rom
e也巴r，
dehcnuq
htiw suoeqa
NH 4IC ta 0 oC ，
組d.e王位detca
htiw
erutarepmet
rof 63 min ，
eht noitcaer
erutxim
was dehcnuq
htiw
suoeqa
N 4H IC ta 0 oC and xe 位detca
e血
.re The gro 削 creyaI
was washed
iw 血
detarutas
suoeuqa
N 4H IC ， detarutas
htiw hte ，
巴
.r 百el
retaw
，
dna enirb
，
deird
revo MgS0 der4et，
lif
，
dna detartnecnoc
rednu
cinagro
reyaI
was washed
htiw detarutas
suoeqa
N 4H IC ，
retaw
，
decuder
.erusserp
The eudiser
was pUdleifi
yb hsaif acilis
leg nmuloc
dna enirb
，
deird
revo
MgS0 4，
ift1dere ，dna detartnecnoc
und 巴1・
yhpargotamrhc
1:04(
ot 1:01 Iyhte/enaxeh
)etateca
ot droffa
61
reduαd
erusserp
百eleudiser
was deifirup
yb hsaif acilis
leg nmuloc
49(
mg ，
90.2
mmoI
，81%)
sa a elap ey-hsinerg
lI ow io.l rR ==
yhpargotamorhc
1:01(
ot 1:5 lyhte/enaxeh
ca )e巴
tat otdroffa
81 863(
73.0 :02( 1 xeh 組ecalyhte/e
飽et ，
depoleved
ni;)eciwt
IR if( )mI 308 ，
mg ，
86.0
mmoI
，
19 %) sa aelap woIey-hsinerg
io.l α
[0] 27 36.+
298
，
4371 ，
961 ，
516 ，
591 ，
0941 ，
2341 ，
371 ，
7031 ，
1521 ，
171 ，
c( 23.0 ，CHCh);
rR == 05.0 1:3( xeh 姐lyhte/e
;)etateca
IR if( )mI
341
，983 、918 ，82 ，
;18
79 ，76 cm- J; HJ NMR 05(
MHz ，
5392
，
721 ，
0461 ，
316 ，
415 ，
0941 ，
8541 ，
241 ，
1241 ，
2631 ，
5721 ，
CDCI
)s ，
41.7
(IH ，d ，
J==;8.9 7.8 H
z) ，
6.6
(IH ，
8421 ，791 ，371
，51 ，931 ，7901 ，9301 ，59 ，975 ，917 ，820
3)δ1 1.1 (IH ，
d ，
J==，
48. 0.5 Hz) ，
10.6
(IH ，
td ，
J== 2.71 ，
，
015 . 0.6 Hz) ，
29.5
(2H ，
.d J = 6.8 Hz) ，
cm- J; HJ NMR 05(
MHz ，CDCI 3)δ7.25
(IH ，
td ，
J== 0.71 ，
，
012 . 3.6 Hz) ，
54. 2 (IH ，
d ，
J== 0.71 ，
6.2 Hz) ，
30.7
(IH ，d ，J
1.1 2 ，85. Hz) ，
28.6-7
(3H ，m) ，
8.5
(IH ，
43.5
(IH ，d，
J==. 105. H
z) ，
0.5
(IH ，
d ，
J== 2.01 ，
0.3 Hz) ，
29.4
td ，J== 0.71 ，
2.01 ，64. )zH ，
17.5
(IH ，
td ，J = 0.71 ，
0.01 ，
0.7
(IH ，d ，
J== 0.71 ，34. H
z) ，
68.4
(2H ，
td ，
J== 0.6 ，
.1 4 )
zH ，
46.3
)zH ，54. 2 l( H ，d
，J = 2.6 ，
0.6 ，
0.6 ，
0.6 ，
0.6 Hz ，HI5)
，
50.5
rb d，
J== 2.6 ;)zH
C3J NMR 521(
MHz ，
CDCI 3) d 4.071
d( ，
(2H ，
(IH ，
d ，
J = 2.01 ，
0.3 )zH ，
0.5
(IH ，
d ，
J = 0.71 ，
3.3 Hz) ，
49.4
CJ 'f== 2 H
z) ，51 .1 0 d( ，
CJ 'f== 21 H
z) ，051 4. d( ，
CJJ 'f== 3
42 Hz) ，
(IH ，
d ，
J = 2.71 ，
2.3 )zH ，
09.4
(IH ，
d ，
J = 0.01 ，
.1 9 H
z) ，
86.4
7.731
d( ，
CJ 'f== 5 H
z) ，
3.731
，
31 .1 0，21 .1 2 d( ，
CJ 'f== 6 H
z) ，
21 .1 2
(IH ，d，J = 9.6 Hz) ，
6.4
(IH ，d，
J = 9.6 H
z) ，
44. 5 (IH ，d，
J
d( ，
CJ 'f== 6 H
z) ，
1.021
d( ，
CJ 'f== 31 H
z) ，
0.021
，
6.51
，
8.6 ，
;7.93
1.1 5 Hz) ，44. 1 (IH ，d，J = 1.1 5 )zH ，
09.3
(3H ，d，J== 0.2 Hz ，
"J
p9 NMR 0
74(
MHz ，CDCh)δ-138.8
d( ，J== 9.9 ，
5.4 ;)zH
ーO
Me)
，
87.3
(3H ，
)s ，
16.3
(IH ，
d ，
J 5.9 ，48 . 9.5 Hz ，
HI7a)
，
HRMS
E( -IS TO 町 z/m dclac
rof C 3J 30aN4FJH
(M + N
a+)
06.3
(IH ，
td ，
J = 0.01 ，
6.3 Hz ，
H1 )3 ，
35. 5 (IH ，
d ，
J== 5.9 ，
9.6 ，
6470.952
，
dnuof
.9570.952
9.6 Hz ，
H17b)
，
83.3
(3H ，
)s ，
03.3
(2H ，
rb d，
J = 64. H
z) ，
03.3
(2H ，
rb d，
J = 64. H
z) ，
50.2
(IH ，
d ，
J = 9.31 ，
6.6 Hz ，H1a)
，
30.2
3 ・orulF
・
2 ・methoxy-6
・
2( ciozne・
b)lyneporp
Acid
lyneporP-2
(IH ，d ，
J== 0.41 ，
0.6 0.6 Hz ，
日)a61 ，
.1 7
9 (IH ，
d ，
J = 0.41 ，
retsE
.)71(
To anoituIos
fo 61 184(
mg ，
40.2 )Iom ni enoteca
0.4(
9.6 ，
7.5 Hz ，
H1 )b6 ，
.1 93- .1 58 (
IH ，
m，
H1 )2 ，
.1 8
，
)Lm muisatop
tanobrac
巴6
3(
mg ，
56.2 moI)
，
dna Iyhtem
edidoi
.1( 7
2 ，
Lm 20 4. moI)
wer
eda
=
=
=
F
Joumal
fo lanicdeM
yrtsimehC
，XXXX
，Vo.l x ，
.oN
x
2.2 Hz ，
H9) ，
48.4
(IH ，d，
1 = 9.6 )zH ，
67.4
(IH ，d，
1 = 9.6 )zH ，
44. 5 (2H ，
)s ，
60.4
(IH ，d ，
1 = 5.9 ，
7.3 Hz ，H13)
，
28.3
(3H ，d，
1
= .1 9 Hz) ，
87.3
(3H ，
)s ，
36.3
(IH ，
rb d ，
1 =，
41.6 0.01 Hz ，
)a8H
，
16.3
(2H ，
t，
d ，
1 = 7.6 ，
7.6 Hz ，
HI7)
，34. 1 (3H ，
)s ，
82.3
(IH ，
tdd ，
1 =，
41.6 6.4 ，
6.2 Hz ，H8b)
，
82.2
(IH ，
rb d ，
1 = 0.41 ，
7.5 ，
3.3
60.2-71.2
1( H ，m ，H
I2)
，
10.2
(IH ，d
，1 = ，
412 .
Hz ，H1 )a1 ，
3.8 ，
0.6 ，
0.6 Hz ，
HI6a)
，
.1 9
0 (IH ，
d
，
1 = 2.41 ，
2.7 ，2
7 . 6.4 Hz ，
H1 )b6 ，
.1 72 (
IH ，d ，
1 = 6.51 ，
9.8 Hz ，
)a4IH
，
.1 86 (
IH ，
d ，
1=
1.41 ，1.1 6 Hz ，H1b)
，14. 6 (IH ，d ，1 = 5.51 ，
5.9 ，HI4b)
，
48.0
C31 NMR 1( 52 MHz ，CDCh)δ166.9
，
1.951
，
(3H ，d，1 =;)9.6
x6.351
d( ，
11 Fc = 246 )zH ，
7.41
rc1( = 21 )zH ，
1.431
，
31 .1 5 1( rc
6.031
，
2.031
，
1.921
，
3.821
，521 5. 1( FC = 7 )zH ，
1.711
= 2 Hz) ，
1( FC = 91 Hz) ，
7.31
，
8.69 ，
3.97 ，
8.27 ，
6.27 ，
3.6 ，6.1 6 J( rc = 7
6.5 ，
3.5 ，
7.73 ，
3.73 ，
43.6 5.53 ，
0.43 ，31;4. 19F NMR 074(
Hz) ，
rb( dq ，1 = 1.1 7，
5.4 ，
.1 8 ;)zH
HRMS
MHz ，CDCh)δ-133.0
但-IS TOF)
zlm ac c1 drof σ
70aNF3H92C
1t + Na+) 1242.935
，
dnuof
.6242.935
S3( ，
5R ，
6S ，
8E) ・3，
4，
5，
6，
7，
01 ・Hexahydro
・
3 ・0 ・
yhtexordyh
)l-31・
41 ・methoxy
ふ)
yxohtem(
・
6・
lyhtem
・
1 H ふxozneb
oroulf
eno-1-nicedodolcyca
.)02(
To noaitulos
fo 91 692( mg ，
05. 7 mo1)
and retaw
75.0(
mL) nienahtemorolhcid
1( 1，
)Lm
-or2olhci，
d-3
5p-onay，
cid-6
“e
b lIenoiuqoz
281(
mg ，
0，
08 mol)
was dea
ta 0
noitcaere
.Co retfA
gnieb derrits
ta rom erutarepmet
rof 35 min ，出
erutxinr
was
dehcnuq
htiw detarutas
suoeuqa
NaHC0
3 dna
and det巴
cartx
htiw .rehte
The
suoeuqadetarutas
302SaN
ta 0 oC ，
cinagro
reya1
was washed
htiw detarutas
uqa 巴suo 302SaN
，
taw 巴r，
dna enirb
，
deird
revo
Na2S04
，
iftIdetar
，dna cnoc 巴dlIetart
rednu
decuder
τ
.erusserp
h' eudiser
was deifirup
ybhsaif acilis leg nmuloc
yhpargotamorhc
:3( 1ot :1 y1hte/enaxeh
)et1ateca
otdroffa
20 02(
mg ，
5.0
mmol
，
97%)
sa ae1ap woley-thgirb
o1i 1(1:0 erutxinr
fo
E:Z sremosi
ta .)9C
α
[0] 72 8.73CHCh);
rR = 92.0 1:1(
c( 62.0 ，
，
4592
，
5271 ，
5061 ，
9841 ，
7541 ，
lyhte/enaxeh
;)etateca
IR (自加 143)
714
，
2831 ，
8431 ，
5721 ，
1321 ，
791 ，
51 ，
241 ，
201 ，
1401 ，
579 ，
719 ，28 ，
71 cm- I; HI NMR 05(
MHz ，
CDCh)δ6.98
(IH ，
d ，
1 = 1，
15 . 5.8 )zH ，
08.6
(IH ，
d ，
1 =，48. 45. )zH ，
54. 8 (IH ，
d ，
1 =，58. 5.8 ，
7.4 ，
7.4 Hz ，
HI5)
，54. 6 (IH ，
tdd ，
1 = 2.51 ，1.1 5，
6.2
Hz ，
，
H)O1 03.5
(IH ，
td ，
1 = 2.51 ，9ム2.2 Hz ，H9) ，
58.4
(IH ，
d，
1 = 8.6 Hz) ，
08.4
(IH ，
d，
1 = 8.6 )zH ，
80.4
(IH ，d ，
1 =，49 . 34.
Hz ，
H13)
，
29.3
(3H ，
d，
1 = 0.2 )zH ，
28.3
(IH ，
d ，
1 = 1.1 6，
7.7 ，
44. Hz ，
HI7a)
，
57.3
(IH ，
d ，
1 = 2.11 ，
0.6 ，
3.5 Hz ，
HI7b)
，
36.3
(IH ，
d ，
1 = 5.61 ，
6.9 Hz ，
H8a)
，34. 3 (3H ，
)s ，
92.3
(IH ，
d ，
1=
615 . 2.4 ，4
，
2 . 24. Hz
otmiguS
te .al
23( ，
)Lm
dna eht noisnepsus
was deruop
otni aerutxim
fo e血re
21( mL)
dna retaw
63( mL) ta 0 .co The cinagro
reyal
was
htiw detarutas
suoenqa
302SaN
d，
etarutas
pes d創eta: ，washed
，
retaw
，dna enirb
，
deird
revo
Na2S04
I，
ifderet
，
suoeuqa
NaHC03
dna detartnecnoc
rednu
cuder
巴d r
p .e巴
russ
百eleudiser
was ifirup
巴d
yb hsaif acilis
leg column
yhpargotamorhc
1:51(
ot 1:5 lenaxeh
巴血l
y)etateca
ot droffa
12 12(
mg ，
04. 3 mmol
，80%)
sa a-elap
c(
fo Z
:E sremosi
ta .)7IC
α
[0] 72 5.48woley
oIi1:3.3( erutxinr
12.0 ，
CHCI ;3) rR = 94.0 1:3( lyhte/enaxeh
;)etateca
IR)mlif(
592
，
239 ，
721 ，
601 ，
9841 ，
6541 ，
6241 ，
714 ，
2831 ，
7431 ，
3721 ，
0321 ，
691 ，
51 ，
931 ，
201 ，
2401 ，
579 ，
719 ，
128 ，
18 cm- I; HI NMR
05(
MHz ，CDCh)
d 9.6
(IH ，d ，
1 = 1.1 5，
5.8 )zH ，
87.6
(IH ，
d ，
1 =，58. 4.4 )zH ，
96.6
(IH ，
d ，
1= ，
414 . 2.8 ，
2.6 Hz ，
H17)
，
51.6
(IH ，d，
1 = 41 5. Hz ，HI8)
，54. 5 (IH ，d ，
1 = 8.41 ，1.1 4 ，
7.2 ，
7.2 Hz ，
HI0)
，
3.5
(IH ，
d ，
1= 3.8 ，
3.8 ，
6.4 Hz ，
HI5)
，
82.5
(IH ，
d
，1 = 2.51 ，
6.9 ，
1.2 ，
1.2 Hz ，H9) ，
58.4
(IH ，d，1 = 7.6
87.4
(IH ，d，1 = 7.6 )zH ，
50.4
(IH ，d ，1 = ，4
9 . 7.3 Hz ，
)zH ，
H13)
，
69.3
(3H ，d，1 = 0.2 )zH ，
26.3
(IH ，d ，1 = 3.61 ，
5.9 Hz ，
)a8H ，34. 3 (3H ，
)s ，
82.3 1( H ，d ，1 =，
41.6 9.3 ，24 . 24. Hz ，
)b8H
，
24. 5 1( H ，
d
，
1= 6.41 ，
0.8 ，
3.6 ，15Hz
，
H1 )a6 ，
23. 3 1( H ，
d ，
1 = 9.41 ，
2.8 ，
6.4 ，
9.0 Hz ，HI6b)
，
92.2 l( H ，
rb d，
1 = 2.41
)a1H
，
70.2-71.2
(IH ，
m，
日)21 ，
.1 8
6 d( ，
1 = 1.51 ，
6.8 Hz ，
Hz ，
)a4IH
，
.1 7
6 (IH ，
d ，1 = 2.41 ，1.1 5 ，1.1 5 Hz ，H1b)
，
.1 40 (
IH ，
d ，
1= ，
514 . 95. Hz ，
HI4b)
，
48.0
(3H ，d，
1 = 9.6 ;)zH C31 NMR
521(
MHz ，CDCI 3)δ16.9
d( ，
rc1 = 4 )zH ，
6.351
d( (，
11 じr= 246
8.41
d( ，
rc1 = 21 )zH ，
41 .1 17 ，
，
319.6 1.431
d( ，
rc1 = 5 )zH ，
)zH ，
31 .1 5，
3.821
，
521 4. d( ，
1FC = 7 )zH ，
2.71
d( ，
1FC = 91 )zH ，
，
791 .
97 ，
.47.7
6，
8.37 ，
6.1 9 d( ，
1FC = 7 )zH ，
7.5 ，
，
424 . 73 ム2.73 ，
1.53 ，
1.43 ，
;3.31
1p9 NMR 074(
MHz ，
CDCI
qd( ，
1= ，
31.1
3)δ-132.7
4 ム 24. ;)zH
HRMS
但S
I-TO
町 zlm ac c1 d rof sOaNIFs2HC
(M
+ Na+) 54 .1 3680 ，dnuof 45 .1 08 .1
S3( ，
5R ，
6S ，
8E) 3，
4，
5，
6，
7，
01 ・-31ordyhaxeH
姐u
or σ
(・
3-3 i句
2-od
orp 叩peny 刊刊
)15
-yxordyh-41・
)yxohtemyxohtem(
6-・
lyhtem
1H・ 2 ・
ben ・
nicedolcyaxoz
・
1・one .)22(
To aylsuorogiv
derrits
noitulos
fo
12 12(
mg ，04. 1 mol)
nienahtemorolhcid
54( ，
)Lm
naoitulos
fo 紅
enarobmorbi
泊e
morolhcid
血
ena. .1( 0 M ，
.1 6
0，
Lm .1 60 mo1)
was dea
ta -78 .Co retfA
gnieb derrits
ta ー87 oC rof 56 min ，
eht noitcaer
erutxim
was dewola
ot ・IW:a m pu ot rom erutarepmet
，
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ehcnuq
htiw dloc-eci
retaw
07( mL) ta -5 oC 岨 tdcartxe
巴d
htiw .enahtemorolhcid
The cinagro
reyal
was washed
htiw enirb
，
deird
revo
Na2S04
，
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聞
開
開
圃
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mg '
，01.0
mo1)
，anoitulos
fo (2Z ，
42 り
2- ，
-4
8 57( mg ，
0 后o mo1)
and 2，
ρ
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，
mo1)
ni DMA 9.0( ，
)Lm
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was deird
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，and
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was y1etaidemi
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litnu
no
w r巴
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retfA
gnieb derrits
rof 03 min ta rom
町e w
i 也thgil gnid1eihs
，anoitulos
fo 23 4( mg ，
01.0
ni DMA 6.0( ，
)Lm
whic
was deihc
revo MS4A
，
was dea
叩 d 也e
gnitluser
noitulos
was y1etaidemi
desaged
litnu
no
se1bub
erw .dnuof
tfA 巴rgnieb deTIits
rof 1 h ta 09 oC htiw thgil
gnid1eihs
，出enoitcaer
noitulos
was detulid
htiw
e血re ta rom
rutarepmet
，且n
d was dehcnuq
htiw
pH 0.7 etahpsohp
refub
ta 0
。
.C The cinagro
reya1
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washed
htiw pH 0.7 tahpsohp
巴
refub
，retaw
and enirb
，and deird
revo
Na2S04
der，
et1if
，dna
detartnecnoc
rednu
decuder
.erusserp
The eudiser
was ifirup
巴d y
b
hsaif acilis
leg nruloc
yhpargotamorhc
1yhte/enaxeh(
eca 泊 陰 口
113 ot 1β) otdroffa
eht ylhguor
deifirup
ecnatsbus
3.85(
mg) ，
hciw
was ifirup
巴d b
y eht evitaraperp
HPLC
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A )al( 1( 1.0 mg ，
320.0
mo1 ，23%)
andedima1ahilycilas
B )bl(
11( 4. mg ，
620.0
mmo1
，
26%)
sa ssealr01oc
wax vitce，
pser
巴1
y.HPLC
:snoitidnoc
:nnru1oc
COSMOS
Ll 5C l-SM-81
(N ACALAI
TESQUE
，
町 C ふ0
1 m m x 250 mm; λ
:noitced=
280 nm; woif :etar 0.2
mL ;nim/ noitu1e
htiw
atneidarg
tnevlos
:metsys
MeO H/H 20 = ，
73/
0-10
:nim
MeOH /H 20 = 3/7 → MeOH
，10-120
:nim
MeOH
，
120-140
;nim
百el Rt ilf
iolycilas
1a edima
A )al( and -a1as1
ilai1yci
mide
B )bl(
wer
2.46
and 8.1 0 min .y1evitc，
epser
rR 52.0 1yhte/enaxeh(
.al α
[0] 91 = -32.6
c( 01. 96 ，MeOH);
etateca
=;)111
IR 員( )m1 5823
，
2964 ，
071 ，
3561 ，
9851 ，
3251 ，
461 ，
3921
，8421 ，612 ，321 ，601 ，179 cm- 1; H1 NMR 05(
MHz ，
C 6D 6)δ1 .1 5 (IH ，
rb ，
C3-0H)
，
39.7
(IH ，
brd
，J= 1.1 4 ，1.1 4 Hz ，
H2)
，
21.7
(IH ，
d ，
J = 3.41 ，
9.01
Hz ，
H18)
，
49.6-9.6
(2H ，m ，
H4 剖dl H5) ，
26.6
(IH ，
d ，
J = 1.1 6 ，1.1 6 Hz ，
H21)
，65. 0 (1H ，
rb
d，-NH)
，64. 8 (1H ，d ，J = 6.6 ，
3.2 Hz ，
H6) ，
26.5
(IH ，d
，J
= 8.01 ，
7.7 ，
7.7 ，
3，
.1 3.1 Hz ，H23) ，
HI(45.
，d ，J = 0.01 ，
6.6 ，
6.6 Hz ，
H15)
，
82.5
(lH ，
d ，
J= ，
515 . 3.4 ，
3.4 Hz ，
H9) ，
01.5 1( H ，
rb d，
J = 9.01
Hz ，H20)
，
50.5
(lH ，
rb d ，
J = 6.41 ，
9.6 ，
9.6 Hz ，
H10)
，
7.4
(IH ，
rb d ，
J= 3.41 ，
2.7 ，
2.7 Hz ，
Hl )7 ，
26.3 1( H ，
rb
d ，
J= ，
615 . 3.5 Hz ，H8a)
，
4.3
(lH ，d ，
J = 3.8 ，
9.2 Hz ，H13)
，
23.3
(IH ，
rb d，
J = 0.61
Hz ，
H8b)
，
71.2
(IH ，
d ，
J = 0.41 ，
2.7 ，
2.7 Hz ，H16a)
，
21.2
(IH ，d ，
J = 3.21 ，
7.5 ，
7.5 Hz ，
H1a)
，
50.2
(IH ，d ，J = 0.41 ，
9.6 ，
9.6 Hz ，H16b)
，
.1 7
9 (2H ，
dt ，J = 6.7 ，
6.7 ，14. Hz ，H24)
，
.1 6 (IH ，
d ，
J = 1.51 ，
8.01
Hz ，H14a)
，
.1 6
2
(IH ，
d ，
J
eta1yxobrac
edimaneidatpeh
21.0
neht
se1bub
tarepmet
mo1)
91(
lanruoJ
fo lanicdeM
yrtsimehC
，
XXXX
，
.loV
x ，
.oN
x
G
_491edinrFalahilyc・
ilaS
A )a6(
and
B .)b6(
N lyht，
emid-'N
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i，
tc.
was desaged
yb 企waht-ez
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revo
01 .semit
Rb 2C0 3 931(
mg ，
06.0
mol)
ni a lhcS 巴nk
ksaif
was deird
by gnitaeh
htiw
areird
rednu
decuder
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rof
51 .nim retfA
gniloc
ot rom erutarepmet
)I，
(repoc
也
-nehpoi
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91( mg ，
01.0
mol)
was dea
ni evolg
.xob
A
noitulos
fo (2Z ，
42り
2- e，
dima4neidatpeh
8 57( mg ，
06.0
mo1)
and
enidir2ypib-，
'2
02( mg ，
21.0
mol)
ni DMA 7.0( ，
)Lm
whic
was
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MS4A
，was dea
dna eht gnit1user
erutxim
was
yletaidemi
desaged
revo
dna revo niaga litnu
on selbub
wer
.dnuof
retfA
gnieb
tsTIi de rof 03 min ta rom erutarepmet
htiw
thgil gnidleihs
，anoitulos
fo fo 2 64( mg ，
01.0
mol)
ni DMA
7.0( ，
)Lm
hciw
was deihc
revo MS4A
，
was dea
and 白g巴
nitluser
noitulos
was iiffmi yle巴
taid
desaged
revo
and revo niaga litnu
no
selbub
erw .dnuof
reitA
gnieb
tsIideT rof 1 h ta 90 oC htiw thgil
gnid1eihs
，
eht noitcaer
erutxinr
was detulid
htiw
巴
reht ta rom
erutarepmet
and was quench
巴d h
tiw
pH 0.7 etahpsohp
refub
ta 0
.Co 百el agro 凶creyal
was pes 紅deta ，
washed
htiw pH 0.7 etahpsohp
refub
，
retaw
and enirb
，dna td ・
i巴d revo
Na2S04
，
ift1derer
，and
detartnecnoc
rednu
decuder
.erusserp
The eudiser
was deifirup
by
hsaif acilis
1eg column
yhpargotamorhc
1:3( ot 3:1 naxeh
ly巴hte/
)etateca
ot droffa
eht ylhguor
deifirup
ecnatsbus
92( mg) ，
whic
was deifirup
yb 白earaperp
姐e
v HPLC
ot droffa
4s s-F 1ahilyci
1a-a
edinr
A )a6( 7(1. mg ，
510.0
mol ，
15%)
and -4 1p9 s-1ediamlahilyci
B )b6( 1.01(
mg ，
20.0
mo1
，
2%)
sa aoloc 1rsse wax.ylevitce，
pser
，
01 mm x 250
HPLC :snoitidnoc
:nmuloc
COSMOSIL
5C S1 ISMmm; :noitceted
280 nm; woif :etar
0.2 m Ll min ，
neule :t 03:07
MeO H/H 20 ，
01 min ，
03:07
→ 0
:01
，
20 min ，
0:01
，03 .ninr The
noitneter
semit
t()R fo 6a a
nd
6b wer 巴， 36 4. and
37 4. ninr
.ylervit巴
ceps
:a6 α
[0] 82 0.5c( 312.0
，MeOH);
rR = 43.0 1:1(
lyhte/enaxeh
λ
;x)aemtateca
(M eOH)
28 nm (ε= ;)0262
IR)mlif(
1823 ，
3692
，
1392
，
1961 ，
651 ，
161 ，
2941 ，
1641 ，
821 ，
8421 ，
812 ，
831 ，
1801 ，
7201 ，
179 ，
820 ，
876 cm- 1;H1 NMR 05(
MHz ，
C 6D 6)
δ10 5. (IH ，
rb ，
C3-0H)
，
19.7
(IH ，
rb d ，
J = 1.1 5，1.1 5 Hz ，
H2)
，
80.7
(IH ，
d ，
J = 3.41 ，
:01 6 Hz ，H18) ，
27.6
(IH ，
d ，
J = 7.9 ，
83.
Hz ，
H5) ，
16.6
(lH ，
d ，
J = 1.1 5 ，
1.1 5，
9.0 Hz ，
H21)
，
65.6
(lH ，
rb
s，-NH)
，
91.6
(IH ，d ，
J = 3.8 ，
6.4 Hz ，H6) ，
36.5
(IH ，d
，
J
=10 ム7.7 ，
7.7 ，
3，
.1 3.1 Hz ，H23) ，55. 3 (IH ，m ，H15) ，
32.5
(IH ，
d ，J = ，
515 . 7.4 ，
7.4 Hz ，H9) ，
01.5
1( H ，
rb d，J = 1.1 5 Hz ，
H20)
，
30.5-31.5
(IH ，m ，
H10)
，
50.5
(IH ，
rb d ，
J = 4
1 ム9.6 ，
9.6 Hz ，，
H)Ol .4
司
H
Journal
of Medicnal
ytsimehC
，XXXX
，Vo .l x以 No.xx
Sugimot
te a.l
3.81
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，
2.67 ，
，
37.1 5.83 ，
3.83 ，
8.73 ，
3.63 ，
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02( mM MOPS
，
pH 5.7
3.1 9 ，8.02 ，0.41 ，6.31 3( fo 血巴 2PS snobrac
wer ;)dedresbo
F91
，25% lorecylg
，5 m M Na2ATP
，5 mM mO 1-cy
ll
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NaOH
NMR 074(
MHz ，
lore ，
)6DC
d -138 4.;)s( HRMS
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dna 10μg/ mL fo eht esaetorp
.)srotibihni
The gnitluser
noitulos
261.084
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.2612.084
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，
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(M + Na+)
Oc 1liat 1l ed 4-8 mg fo 也巴 membrane
iB .ygolo
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A Il也巴 lacimehc
desu
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htob ehtevitatitnauq
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，and eht Westrn
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was deifirup
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tsniaga
tinubus
b on ht 巴 V domain
of V-ATPase.
eropiliM(
.cnI ，
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，
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百e1
Theprep
紅e
d CGM was denpsu
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noitartnecnoc
fo
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desu
ni 血si locotorp
wer
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5MB
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los 1loit 1l and tpek nezorf
ta -80 .Co
5 mg/ mL ni eht MOPS
，5 m M EDTA ，01 m M MOPS
and pH 75.
refub
3.0( M esorcus
Asay
fo citehtnyS
sedimalhilycilaS
ni eht yrotibhnI
wi 仕1 NaOH)
n，
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A 1( 0 mg/ mL ni hte 剖)101 ，
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01(
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Chromafin
Granule
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V-ATPase.
百1
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0( 3.
mg/ mL ni e血 組)10 o，
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巴
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2-orol 与M esorcus
，40 m M KC1 ，5 mM位 enici
，and pH 0.8 htiw
NaOH)
，
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(ACMA)
1.0( M ni)lonahte
，
，
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1l
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noitulos
was i1ldetabuc
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m M Na2HP04
，
2.4 m M KH 2P04 ，
2.4 m M NaHC0
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ni DMSO perp(
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巴
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pip-I-)ly
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fo DMSO)
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ta 37 oC
1lci )
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pH 74. htiw
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was ade
and
Asay
fo dezishtnyS
sedimalhilycilaS
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1ls
tneidarg
made
by eht V-ATPase
detabucni
rof 2 .nim
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.lleC
naimS
(Cercopithus
)spoihtea
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ni eht mebranes
wer
delcnac
by noitida
fo 34. μL of 1 m M
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ni Dulb 巴s'oc
deifdom
Ea elg medium
gniniatnoc
FCP.τ
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gnihceuq
ni eht ecnesrp
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10% latef
flac
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ta 37 oC ni 5% CO 2/95%
ria htiw
a CO 2
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by amoruifortceps
巴
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an 巴no:xitatic
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S?rotabucni
百四 e
c1l s wer
des
onenisyl-L-Y10P
detaoc
-revoc
ta 480 nm. 百e1itini 1a etar fo gnihceuq
fo 412 nm 組 d noisme
，
eht Ys 1dleziseht
edimalahilycilas
was
.spils
retfA
thginrevo
erutluc
h~ce d
emrotp
on
was detamitse
sa eht epols
fo 由巴 gnihceuq
ade
otni eht erutluc
media
ot evig
alanif noitartnecnoc
fo 1μM ， stes fo 20 stniop
sa 血e
02( s of gnihceuq
)ecart
and si rpxe 巴des
a1l ddetabucni
ta 37 oC rof 5 .h The ，1l eht sllec
wer
deaol
htiw
百e1 notrp
紅
tropsna
itca ytiv si deserpxe
etar of euq 1.lnim/gnihc
pH rotacidni
LysoSenr
Gren
DND-189
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，
raluceoM
sa eht egatnecrep
susrev
DMSO-matched
slortnoc
htiw dradnats
seborp
92) ta alanif noitartnecnoc
of 1μM. retfA
1 min ，an secxe
noitaived
from
et位
acilpi
.stnemirepxe
IC 05 seulav
wer
deniatbo
was
washed
tuo htiw
HBS.
Th 巴 C s巴
11 wer
of eht i1rlotacid
仕組
trops susrev
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bygnittolp
eht tnecrep
ytivitca
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巴
， a
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wer
devrsbo
gnisu
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fo eht rotibihni
.snoitartnecnoc
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gnisu
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，
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htiw dleif-thgirb
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nifamorhc
elunarg
mebranes.
百
su. work
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from
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.sdnalG
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fo nifamorhc
elunarg
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，
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(CGM)
from
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lanerda
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was detarepo
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