Title ヒト精漿および精子内のクレアチンキナーゼアイソザイムについての

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ヒト精漿および精子内のクレアチンキナーゼアイソザイムについての検討
宮地, 系典(Miyaji, Keisuke)
村井, 勝(Murai, Masaru)
慶應医学会
慶應医学 (Journal of the Keio Medical Society). Vol.82, No.3 (2005. 9) ,p.T207- T215
Journal Article
http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=AN00069296-20050901
-0207
慶 曜 医 学 。82(3):T207∼T215,2005
学位論文
ヒ ト精 漿 お よ び精 子 内 の
ク レア チ ンキ ナ ー ゼ ア イ ソザ イ ム に つ い て の検 討
慶 慮義 塾 大学 医学 部泌尿 器科 学 教室
(指導:村 井 勝 教授)
ろ や じ ゆい ずけ
宮 地 系 典
(平 成 且6年2月17日
Key Words:male infertility, human sperm, seminal plasma, 受 付)
creative kinase isozyme
不 妊 夫 婦 の 数 は増 加 傾 向 に あ り,最 近 で は お よ そ15
リ ン酸 シ ャ トル の 関 与 を 解 明 す る 一 端 と し て,精
%の カプ ッルが 不 妊 で あ る との 報 告 が あ るD.ま
に お け るATP儂
全 体 に 目 を 向 け る と約20年
た社会
前 よ り人 工 構 成 の 少 子 高 齢
目 し た.CKア
度 維 持 に 主 要 な 役 罰 を 果 た すCKに
イ ソ ザ イ ム に は, CK-MM, 類 が あ り,精
着
CK・BB, CK・
化 が 進 み,社 会 問 題 に ま で 発展 して きた.こ の よ う な出
MB, CK-MiMiの4種
生 率 の 低 下 を 防 ぐた め に種 々 の 方 策 が と られ て い るが,
較 し て 大 凪 のCK・BBが
その 中で 不妊治 療 の充 実 化 を図 るこ と も極 めて重 要 に な っ
来,体
て き た.不 妊 治 療 の 中 で女 性 の 治療,生
の 関 連 に つ い て の 報 告 が な さ れ て い る が,ア
殖 補 助 技 術 に関
子 尾部
漿 中 に13#ii子 中 と比
荏 在 す る と い わ れ て い る4.n.従
外 受 精 に お け る 受 精 率 と ヒ ト精 子 内 ア イ ソ ザ イ ム
イ ソザ イ ム
して は近 年 急 速 な 進 歩 が み られ る の に 対 して,不 妊 原 因
パ ター ンに 関 して は諸 家 に よ って 報 告 が 異 な る。 本 研究
の約50%占
で は 最 初 に,精
め る男 性 不 妊iでは有 効 な 治 療 法 が 少 な いの
子 内 に は な く精 漿 に 多 量 に 含 ま れ る 酸 性
が 現 状 で あ る.精 子 機能 の一 っ で あ る,精 子 運 動 は卵 へ
フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ(ACP)活
の 侵 入,受 精 に不 可 欠 で あ り,精 子 迎 動 率 が50%以
体 に 精 漿,精
下
性 を 指 標 と し て,精
子 検
液 内 他 細 胞 が 混 在 しな い よ うな精 子 精 製 法
の糟 子 無 力 症 は男 性 不 旺 に大 きな割 合 を 占 め,そ の 原 因
を 検 討 し た.さ
究 明 が 必 要 で あ る.
内 のCKア
ら に そ の 方 法 を 使 っ て,精
子 お よ びtifggf
イ ゾ ザ イ ム の 同 定 と そ の 活 性 測 定 を 行 っ た.
ク レア チ ン リ ン酸 塩 は 高 エ ネ ル ギ ー リン酸 塩 と して 貯
蔵 され,ア
デ ノ シ ン3リ
ン酸(ATP)を
補給す るため
材料と方法
の エ ネ ル ギ ー緩 衝 剤 と して 利用 さ れ る.筋 肉 内 で は ク レ
ァ チ ン リン酸 シャ トル が ミ トコ ン ド リアか ら筋 原 線 維 へ
東京 歯 科 大学 市 川 総 合 病 院 泌 尿 器 科 お よ び産 婦 人 科 に
高 エ ネ ル ギ ー リン酸 を 輸 送 し,か っ 高 エ ネ ルギ ー リ ン酸
お け る 不 妊 外 来 患 者112名
の レベ ル を一 定 に保 つ た め に緩 衝剤 に な って い る と考 え
供 に は 患 者 本 人 に 十 分 な イ ン7オ
られ て い る2,.Tombesら
い,同
は精 子 細 胞 内 で も筋 肉 細 胞 で
意 を 得 て 使 用 し た.精
の 精 液 を 用 い た.精
に て 採 取 さ れ,精
ATPが
輸 送 さ れ て い る こ とを 示 唆 して い る,す な わ ち
た.精
ATPの
高 エ ネ ル ギ ー リ ン酸 結 合 は ミ トコ ン ドリア の ク
て 施 行 し たB》.精 子 濃 度 はMakler よ り ク レア チ ンに転 移 され
る と同 時 に ア デ ノ シ ン2リ ン酸(ADP)が
ADPは
酸 化 的 リ ン酸 化 に よ っ てATPに
い っぽ う,ク
生 じ,こ の
変 換 され る.
レア チ ン りン酸 は 精 子 尾 部 鞭 毛 の 紬 糸 の ダ
イ ニ ンーATPaseに
よ って分 解 され,再 びADPに
な る3卜.
申講 者 は精 子 運 動 機 構 お よ びill子無 力 症 へ の ク レア チ ン
一T207一
液 検 査 施 行 後 の 余 剰 精 液 を 実 験 に供 し
液 検 査 は 液 状 化 後,WHOの
(SEFI-MEDICAL で 計 測 し,精
ー ム ドコ ン セ ン トを 行
液 は 患 者 自身 に よ る用 手 法
提 唱 さ れ て い る ク レ ア チ ン リ ン酸 シ ャ トル に よ って
レア チ ンキ ナ ー ゼ(CK)に
INSTRUMENTS, 子 運 動 率 は37℃
ガ イ ドラ イ ンに沿 っ
Counting 用 し 計 測 し た.精
子 奇 形 率 はKruger's に 沿 っ て 評 価 し た.
子精 製法の検討
Chamber
New York, USA)
でcomputer motility analyzer(C-men;Compix, 1.精
液 の提
assisted
PA, USA)を
使
strict criteria"
慶 晦 医 学 82巻3号(平
IUHaszarら
の 精 子 精 製 法1。},121Clausら
法 」D,131$rビ
法 ゆ,{5)キ
4℃ で10分
の精子精 製
ラ ー ル 撹 絆 密 度 勾 配 法is.1`',141swim up
ャ ピ ラ ー ル 撹 搾 密 度 勾 配 法 お よ び 修 正swim
up YZを 合 わ せ た 精 製 法,を
そ れ ぞ れ 施 行 し,精
子を精
洗 浄 液10m1に
混 和 し,2000xg,4℃
分 離 し,上ri'fを
除 去 し た.沈
10分
ui Huszarら
の生 理 的 食 塩 水 に よ る精 子 精 製 法101
荊 液 を15倍
量 の0.03Mイ
ナ ト リ ウ ム 溶 液(pH ミ ダ ゾ ー ル 加0.15M塩
7.0)で
希 釈 し,2000×g,4℃
間 遠 心 分 離 後 上 清 を 除 去 し た.残
0.03Mイ
ミ ダ ゾ ー ル,10%グ
threitol(Sigma Chemical Triton X-100を
加 え た0.15M塩
量 に 再 懸 濁 し,20紗
×gでis分
間 遠 心 分 離 し,上
121Clausら
で
Dithio-
ウ ム 溶 液(pH8,0:洗
40Nmナ
撹 搾 後,4℃,5000
浄 液)10mlを
X-100
間 撹 搾 し,5000xg,
殿 はmOμ1の
移 した
抽 出 液 に 混 和 し5分
間 遠 心 分 離 し,上
清 を最初の
ラ ー ル 撹 搾 密 度 勾 配 法2.川(図1)
mMHepes緩
化 ナ ト リウ ム 溶 液
衝 化0.l M塩
衝 化 ハ ン ク ス 液(ハ
イ ロ ン メ ッ シ ュ フ{ル
溝 過 精 液).20mg/mlア
ル 液(pH ル ブ ミ ン 加20
ン ク ス 液)を
濾 過 梢 液 を2ml晒
加 え て2000xg,
℃,1000Xgで30分
間 遠 心 分 離 し た.精
)
4
)
3
)
2
)
1
⊆
駈買
藤
灘
ニ
ニ
ニ
ψ
キ ャ ビラ ー ル概 搾密 度 勾 配法
写 真 は,1)20mg/mlア
と こ ろ を 示 す.2)40ｵmナ
ル ブ ミ ン加 等 張 化80%パ
ikli4のF'ri 7fr吸
引,回
ー コ ー ル 液(pH 7.4)5mlに
イ ロ ン メ ッ シ ニ フ ィ ル タ ー で 濾 過 し た 柵 液2mlを
連 続 密 度 勾 配 を 作 成 し た.3)4℃,1000Xgで30分
撹 搾
子 は管 底 に濃
姻
ー コー
棒 で 数 度 撹 搾 す る こ と に よ り遮 続 密 度 勾 配 を 作 成 し,4
曹
図1 下
積 し.キfiビ
ラ ー ル を 挿 入 し た 後 に 精 液 と パ ー コ ー ル 膨 をL型
化 ナ トり
加 えて
タ ー で 濾 過 し た(以
ル ブ ミ ン加 等 張 化80%パ
7.4)5mlに
圏
r
間遠心
をEppendor(tubeに
精 液 全 鼠 に 等 量 の4.Omg/m1ア
清 を 検 体 と し た(n=5).
M Tris緩
でio分
精 子 抽 出 液 互に 加 え た も の を 検 体 と した(n冒5).
131キrピ
の 生 理 的 食 塩 水 に よ る精 子 精 製 法m
精 液200Nlに0.05 殿 を再度
殿 を1%Triton 混 和 し て5分
間 撹 搾 後5000xg,10分
化
Co, St. Lous, MO),0.1%
(pH 7.0)同
出 液)に
間 遠 心 分 離 し,..L清
(精 子 抽 出 液1).沈
った精子検体 は
リセ リ ン,5mM 間 遠 心 分 離 し 上 清 を 除 去 した.沈
加 洗 浄 液(抽
製 し た,
10分
成17卑9月)
キ ャ ビ ラ ー ル を 挿 入 して い る
層 穣 し, L字
撹 絆 揮 で 数 回 擬 絆,
逮 心 分 離. IYII(に 成Sara rが 沈 殿 して い る の を 示 す.4)
収 し て い る,
一T208一
;;地:ヒ
トrasp・
槽 子 内 ク レア チ ンキ ナ ー ゼの 解 析
.沈 坦 ...
ア
過 解爵
・
翔.轟 並.
類
図2 Swim up法
写 奥 は 、Swim up法
態 を 示 して い る.修ti に お い て1%ア
swim up法
ル ブ ミ ン加 ハ ン ク ス 液10mlの
の 場 合 は40%パ
管 底 にflifi2iを層 稿 し た 状
ー コ ー ル 液 を4ritLにleyFdし,そ
の下に柵液 を
層 概 した.
縮 さ れ,キ
ャ ピ ラ ー ル か ら吸 引 して0.5mlに
再懸濁 し
て 検 体 と した(n=5).
討 に 用 い た.ACP活
ル ブ ミ ン加 ハ ン ク ス 液10mlの
管 底 に ゆ っ く り と 精 液 を 層 積 した.2時
ハ ン ク ス 液8mlを
れ に よ っ て 精 漿 残 存 率 を 求 め,精
も純 粋 に 精 製 で き る 方 法 を 決 定 し,そ
i41 swim up法li:(図2)
1%ア
性 を 測 定 し,そ
吸 引 し,ク
入 った ガラス
悶 後 に..ヒ
層部 の
ッ シ3ンv4161で
再濃縮後
性 はAcid (Wako, Osaka. Japan)を
波 長500nmの
(HITACHI, の方 法 を 以 下 の 検
Phospha-KO-test
使 用 した.測
分 光 光 度 計1100 Tokya,』apan)を
定 は37℃
使 用 し た.活
牲 はKing・
Armstrong単
S51キ
ャ ピ ラ ー ル 撹 絆 密 度 勾 配 法 お よ び 修iF swim
精 製 法 に よ る 精 子 懸 濁 液 中 の 精 漿 残 存 率 は,精
を 合 わ せ た 精子 精 製 法
(%)=精
up法
1%ア
ル ブ ミ ン加 ハ ン ク ス 液3mlの
底 に ま ず40%パ
ー コ ー ル を03miゆ
そ の 下 層 に 前 述 の キ7ピ
入 っ た ガ ラ ス管
ラー ル撹 絆 密 度 勾配 法 に よ って
吸 引 し,ク
濃 縮 後 精 子 を 回 収 し て 検 体 と し た(精
性 値 ×ioO/原
精子
漿残存率
精 漿ACP活
性 値 と して 求 め た.
間後に
ッ シ ョ ン法 で 再
3.iii'製 精 子 か ら のCKの
100加0.15M塩
と した.撹
製 精 子,n=5),
稲 精 製 法 で の 精 漿残 存 率 の測 定 お よ び 精 子 精 製 法
の決定
X-
化 ナ ト リ ウ ム 液 を 加 え て 総 撤 をlm1
搾1分
間 後,液
体 窒 素 に よ る 凍 結 融 解 を2回,
検 上90%以
間 遠 心 分 離 を 行 い,上
し実 験 に 供 し た.
一T209一
よ び1%のTriton 上 の梢 子の頭 部
と 尾 部 が 分 離 して い る こ と を 確 認 し た.2000Xg,4℃
でio分
前 述 の5っ の 方 法 で 得 られ たt..子懸 濁 液 中 のACP活
抽 出
採 取 し た の 精 製 精 子 にD.1%お
7分 間 の 超 音 波 処 理 後,鏡
2,各
表 しt:..各
っ く り と 注 入 し,
得 ら れ た 精 子 混 濁 液 を ゆ っ く り と 層 積 し た.2時
上 閣 部 の ハ ン ク ス 液2m1を
下K・A U/m1)で
子 懸 濁 液 中ACP活
で,
spectrophotometer
精 子 を 回 収 して 検 体 と し た(n=5).
位(以
子を最
清(精
子 抽 出 液)を
採取
慶纏医学 82巻3号(5F成n年9月)
4.橘
7.セ
漿 のpry法
液 状 化 し た 精 液1mlを
CKア
取 り,4℃,2000×g,10分
間 遠 心 分 離 し て 上 清 を 採 取 し,0.4ｵmメ
ル ロ ー ス ア セ テ ー トメ ン ブ ラ ン 電 気 泳 動 に よ る
ンブ ランフ ィ
ル タ ー で 残 存 す る 精 液 内 異 物 を 濾 過 し て 実 験 に 供 した.
イ ソ ザ イ ム の測 定
32検
体 の 精 子 お よ び精 漿 の それ ぞれ に つ いて セ ル ロー
ス ア セ テ ー トメ ン ブ ラ ン電 気 泳 動 を 行 っ た.泳
動後の セ
ル ロ ー ス メ ン ブ レ ン はfatro set CK-S(!atron 5.CK活
性 の計 測
Tokyo, Japan)を
精 子 抽 出 液(nヨ3Dお
つ い てCK活
Japan)で
で37℃
よ び精 漿 抽 出 液(n=37)に
性 をIatro set CK-S(latron 測 定 し た,測
定 に は37℃,波
Co. Tokyo,
使 用 し た.活
得 ら れ た 結 果 は,平
6.イ
均 ±SDと
比 較 を 行 い,CKア
性 値 はIU/1で
漿 の
Whatman Ltd., England)を
に 滴 下 し,DEAEセ
作 製 した.34検
0.02%Tris緩
0.02%Tris緩
り,そ
れ ぞ れ のCK活
成 しCKア
の 精 子 糟 製 法, f21Clausら
混 和 し,カ
ラ ム に 滴 下 して
化 ナ ト リウ ム を加 え た
出 液 を1m量
性 を 計 測 し,ク
せ た 精 子 精 製 法 に つ い て,そ
ず つ 試 験 管 に取
ロ マ トグ ラム を作
イ ソ ザ イ ム を 求 め た.
懸 濁 液 中 のACP活
漿 のACP活
で あ り,各
性 値 は そ れ ぞ れ{1}29.0±0.7x10'K-
あ っ た.こ
の 結 果,精
疑 残 存率 は それ
ぞ れ(1191.0±4.6%,(215.8±i.a%,〔313.9ｱ1.7%,(419.9
〔5肛.4±L3×103%で
あ り,キ
雛
鐡
ャ ピラ ー ル概 絆
1
7
' . ピ ・ゴ
覧 、. ビ .¶
響赫 怠
∼
﹁窩懸
饗膨餐 5
焦 ﹁
繍 羅殺
け でアン
ロ コ ほ
ひ ワコ
織li
つ
ご
・i.
4
.雛難 欄
舞1
購騨
aii ClausとHuszarら
性 殖 は3.2:±
精製法 で 調製 した情子
b
鷹
を合わ
IO'K-AU/m且,(4)3.2±0.2×isK-AU/ml,1514.3±
2.lK・AU/mlで
8
図3 捕 製 後 の精 液 橡 の 比 較(Diff・Quik染
up法
亀 ×400)
の 方 法 で 碍 た 梢 子 像 で あ り,輌 子 と他 細 胞 が 混 在 して い る. bは キ ャ ビラ ー ル撹 搾 密
度 勾 配 法 で 得 られ た傭 子 に 修 正Swim up法
を行 って 得 たm子 像 で あ り.講 子 の み が観 察 され る.
一T210一
ャ
AU/m1,12}1.9ｱ0.2xionK-AU/m1,13}L3±03x
±1.2%、
ダ
の 精 子 精 製 法,
れぞれの精子懸濁液中の残
性 値 を 測 定 し た.精
1.6×10'K・AU/m且
衝 液20 m且 を 徐 々 に 濃 度 が 上 昇 す る よ う
に カ ラ ム 内 に 滴 下 し た,溶
顛 精 子 精 製 法 に お け る精 漿 残 存 率 の 比 較
存ACP活
漿 そ れ ぞ れ の 検 体1mlを
吸 着 さ せ た.OM∼0.6M塩
イ ソ ザ イ ム を 測 定 した.
ビ ラ ー ル 撹 絆 密 度 勾 醗 法 お よ び 修 正swim ル ロ ー ス(DE23;
混 和 して ガ ラ ス製 円 柱 筒
体 の 精 子,椿
泳 動 パ ター ン との
f31キ ャ ピ ラ ー ル 撹 絆 密 度 勾 配 法, i4)swim up法,151キ
ル ロ ー ス カ ラ ム(L5XlOcm)を
衝 液IOmlに
1.各
11)Huszarら
8.0にDE23セ
latro set
結 果
し て 表 し た.
0.02%Tris(hydroxymethyl)aminomethane(以
衝 液pH 準 血 清(CK-MM;991U/1, 表 し た,
イ ソザ イ ムの 測 定
下Tris)緩
行 い,標
色す るま
色 後 の 電 気 泳 動 像 はdensito-
CK・S, latron Co, Tokyo. Japan)の
長660 nmの
オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ る精 子,精
CKア
で 保 温 し た.発
metryを
分 光 光 度 計1100spectrophotometer(HITACHI,
Tokyo, Japan)を
用 い て 活 性 染 色 を 行 い,発
Co.
宮 地:ヒ
CK活
イオ ン交 換 ク ロマ トグラ フィー
性値
(IUの ト請 漿 ・精 子 内 ク レア チ ン キナ ー ゼの 解 析
電気泳動
15
血漿
io
血漿
5
ハU O
a
. 4.0
一
糟子
精子
(0.1%Triton)
(0.1%Triton)
s.a
0 0
0 6
4.0
糀子
精子
(1%Ttiton)
(1%Triton)
z.a
oa
20
精漿
精漿
io
0
10 20 30
溶 出 番 号
図4 ヒ ト血 漿,精
漿,精
製 精 子 に お け るCKア
イ ソ ザ イ ム の比 較
図 左 側 は イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に お け るCK活
よ るCK$'i気
泳 動 像 を 示 し て い る.精
内 に はCK-BBがasめ
(Miyaji K et al:Arch (+)
(一1
性 の 溶 出 態 度 を,図
子 内 に はCK-MM, MiMiと
Androl 46:亘27一134,2001のFigurc 漿
lを 許 可 を 得 て 転 載)
3.イ
漿 残 存 率 が 最 も低 値 で あ った.
漿 のCKア
オ ン交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る 精 子 お よ び 精
イ ソ ザ イ ム 測 定(図4)
精 子 お よ び 精9k34検
標 準 血 清 のCKア
種 精 子精 製 法 にお け る精 子 像 の 比 較(図3)
Huszarら
忽 め ら れ.精
ら れ た.
密 度 勾 配 法 と修正swim up法 を組 み 合 わ せ た 方 法 の 精
2.各
右側 は活 性 染 色 に
微 鼠 の 一MBが
の精 子 精製 法 お よ びClausら
の梢子糀製法
較 検 討 し た,精
イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン(CK・MM)と
子 で は,抽
は単 な る希 釈遠 心 分 離 法 で あ り,精 液 内 の 細 胞 は沈 澱 に
(Triton X-100)濃
回 収 され,3-a図
同 様 に 溶 出 番 号11で
に 示 す よ うに 綱 子 の み な らず 白 血球 や
尿 路 上 皮 細 胞 な どの 他細 胞 や 異 物 が 槻 察 され た.い
っぽ
っ ぽ う,Triton %と
3-b図 に示 す よ うに精 子 の み が 観 察 さ れ た.以 上 の 結 果
が 認 め ら れ,CK・MMお
よ り,精 漿 を ほぼ完 全 に除 去 で きる と と もに 精 子 の み を
れ た.精
選 択 的 に採 取 す る こ とが で きる精 子 精製 法 と して,キ
で あ る と 考 え ら れ た,
ピ ラ ー ル撹 絆 密 度 勾 配 法 お よ び 修 正swim up法
場 合 に は,標
準血清 と
ピ ー ク が 認 め ら れ.CK・MMで
る と 考 え ら れ た.い
し た 場 合 に は,溶
比
出 の 際 に使 用 した 界 面 活性 剤
度 が0」%の
うキ ャ ピ ラー ル撹搾 密 度 勾 配 法 お よびswim up法 で は,
ャ
体 に つ い て の ク ロマ トグ ラム を
X-100の
あ
濃 度 を1
出 番 号9^一11に
二 双 性 の ピー ク
よ びCK-MiMiで
あ る と考 え ら
漿 で は 溶 出 番 号33に
ピ ー ク を 認 め,CK・BB
を合わ
4.セ
せ た 精 子 箔製 法 を採 用 した.
子,精
ルv一
ス ア セ テ ー ト メ ン ブ ラ ン電 気 泳 動 に よ るPAY
漿 のCKア
イ ソ ザ イ ム測 定
精 子 お よ び 精 漿32検
一T211一
体 の 泳 動 パ タ ー ンを 標 準 血 溝 の
慶 慮 医学 82巻3号(平
成 且7年9月)
精 子 内CK活 性 値
(lu乃)
鱒o
0 8
R=0.917
0
,m
0
00
0
Boa
m O
00
BO
O
oiso
60
40
R:相 関係 敬
0
OO
a
800
8/ a
za
100
xo a eo eo
a
縞 子 濃 度(106/ml)
図5 精 子 内CK活
性 値 とr,7子 濃 度 と の 帽 関
柄 子 内CK活
性 値 と 精 製 輌 子 濃 度 の 間 にii/9関
関 係 が 詔 め ら れ た.運
動 精 子 中 のCK活
性 はほ
ぼ 一 定 で あ る と思 わ れ る.
(Miyaji K et al:Arch Androl A6:127-134,2001のFiSure 2を 許 可 を 得 て 転 載)
精 漿CK活
精漿C【活 性 値σU1り
性 値(1Uノリ
鵠oo
IAOO
闘
R冒 凋〕.II3
・o.on
O
e a
O
0 0
闘
a
0
1」◎o
e
e a
0
a
0
o
a
9ρoo
0
0
o
㎝
R冒
,m◎◎
e
O p
0
崩
糊
0
0
伽
櫛
00
0 0
a
eee
O
oo
・
8●
O
O
0 00 0
蜘 8
関臨
o
0
Ut o
即
Pt o o g o o
O O O
200
0 0 0
蹴
o 卸 ω 60 80 tp●
1 3 3 4 s 6
緬 子 奇 形 串(%)
柵 漿 のCK活
澱
崩
0
。。騨
細
oo
1.000
0
8
O
O
uoo
精 漿 のCK活
・肝
O
O
O
O
R口4.065
0
9♂600
¶ρロ
図6 2
9
層ρ39
㌦籾o
0
櫓
oo
噛
喀9
●◎ %
O
加
80
R
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耶
動
60 運
子
絹
澱
1400
0 0ｰ 00
0 u
O
O p
o ｰ
O
拗
a
欄
憐
㎝
緬 液量〔mO}
性 殖 と 精 液 所 見(Ffl液
最. fry子 演 度,請
子 巡 動 率,奇
形 串)と
R=相 鯛 係数
の 携関
性 と綱 液 所 見 と の 聞 に は 帽 関 関 係 が 羅 め ら れ な か っ た.
(Miyaji K el al:Arch Andro146:127-134,2001のFigurc 一T212一
3を 許 可 をi5て 転 載)
宮 地:ヒ
CKア
イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン(CK-MM)と
精 子 抽 出 の 際,Triton 精 子 のCKア
X-100の
場 合 に はCK・MMとCK-MiMiが
中 のCKア
場 合 には
中,30例
で はCK・MBが
っ ぽ う,Triton 椿 子 内 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ のA41fi
比 較 検 討 した.
度 が0」%の
イ ソ ザ イ ム は32例
だ け で あ っ た が,2例
ら れ た,い
X-ioa濃
トR99A・
でCK。MM
MiMiは
ミ ト コ ン ド リ ア 内 膜 内 に 存 在 す る19 dll.ま
漿 内 に はCK・BBが
子 お よ び 精 漿 のCK活
#.7子内CK活
嚢 由 来 と い わ れ て い るJ-ll, Asseoら
漿 中CK活
した
み で あ っ た(図4).
動 精 子 内 のCK活
原 精 液 の 所 見(精
全 運 動 精 子 数,精
あ っ
あ っ た.精
製
性 に は 相 関 関 係 が 認 め ら れ.運
液 量)と
動 率,奇
精 漿CK活
形 率,全fil子
数,
存 在 す る と 報 告 し て お り9D,い
CK・MM/CK-BB比
で,微
MiMiが
考 察
現 在 ま で の知 見 で は精 子 内 に存 在 す るCKア
が10%以
上 の 場 合,体
イ ソザ イ
外受 精 にお
れ に対 して 本
部 分 がCK-MM
製 条 件 に よ っ てCK-
併 存 す る と い う結 果 で あ っ た.こ
の よ うな 成 綴
精 製 法 の 相 違 に よ る も の と 考 え ら れ る.#if
漿 巾 に はCK-BBが
大 量 に 存 在 す る こ と が 知 ら れ て お り,
C】ausやHuszarの
方 法 で 碍 ら れ た 成 績 は,精
が 不 完 全 な た め,CK・BBを
た と考 え ら れ る.以
あ る,そ の た め 本 研究 で は最 初 に,精 子 精 製 法 の 検 討 を
て 初 め て,4r`i子 内 のCKア
行 った.こ れ ま で に報 告 の あ った,Huszarら
可 能 と な り,大
の 方 法,
認 め ず,大
認 め られ,糟
ム に つ い て統 一 さ れ た 見解 が 得 られ て い な い のが 現 状 で
漿の除 去
精 子 内 の もの と して 計 測 し
上 よ り,申
請 者 のfn子 精 製 法 を 用 い
イ ソザ イ ム を測 定 す る こ とが
部 分 がCK-MMで
あ る こ とが 確 認 さ れ
た と い え る.
の 方 法 お よ び キ 却 ピ ラー ル撹 絆 密 度 勾 配 法,修
れ らの併 用 法 に よ って#.f子を謂 製 し,
精 漿 の み に 存 在 す るACPを
存 在 し。 精 子 内 の
性 値 に よ っ て 乏 精 子 患 者 の 人 工.
量 のCK・MBが
の 違 い13id子
正swim up法,そ
つ ぼ う, Huszar
け る 受 精 率 が 良 好 で あ り,。レ,精 液 所 見 と 精 子 内CK活t'F:
研 究 で は 精 子 内 にCK-BBは
性 埴 との 相 関 関 係
精子症 の 精
性 値 との 関 巡 は 見 られ
受 輌 率 を 予 見 で き るzaiと報 告 して い る.こ
は な か っ た(図6).
Clausら
は,乏
は ヒ ト精 子 内 に はCK・BBとCK・
値 は 反 比 例 しn,CK活
性 は ほ ぼ 一 定 で あ る と思 わ れ た(図5).
子 濃 度,運
立 腺 由 来 ま た はto
ら は 精 子 内 に はCK・BBとCK・MMが
性 は2.0±0.7×10`IU,/且0"spermで
た鮒
性 は 健 常 者 よ り 低 い と 報 告 し て い る ㈲ が.本
研 究 で は 精 液 所 見 と 精 漿 巾CK活
な か っ た.Clausら
性
た.Piigk CK i&性 は6.6ｱ3.6x10'IU/1で
精 子 濃 度 とtti子 内CK活
大 量8こ存 在 し,前
濃 度 を1%に
MiMiが
5.精
細 胞 質 上 清 に 存 在 す る が, CK-
ご くわ ず か に 認 め
等 量 認 め ら れ た. FNiK
イ ソ ザ イ ム はCK・BBの
CK-MM,一MB,・BBは
指 標 と して1"N子懸 濁 液 中 の
CK-MiMiに
関 し て は,精
子 中 片 に ミ トコ ン ドリ ァが
豊 窟 で あ る こ と が 知 ら れ て お り,CK・MMが
細胞 質に存
梢 漿 残 存率 を算 定 して請 子 精製 法 を検 討 し た.そ の結 果、
在 す る の に 対 し て,CK-MiMiは
精 漿 を ほ とん ど含 まな い精 子 稿製 法 は キ ャ ピ ラー ル撹 搾
在 す る た め 。tt;子 の 処 理 法 の 違 い に よ っ て 成 績 が 異 な っ
密 度 勾 配 法 と修Fswim た も の と 思 わ れ た.す
up法 の 併 用 で あ る こ とが 判 明
な わ ち,CKを
した.キ ャ ピ ラー ル撹 搾 密 度 勾 配 法 は,精 子 が 成熟 の過
るTriton 程 で 形 態 が 変 化 し,そ の 時 期 に よ って 細 胞 密 度 が 異 な る
と ミ ト コ ン ド リ ア 内 のCK-MiMiも
ζ とを 利 用 した もので あ る.す な わ ち未 成 熟 な 精 子 は細
%で
胞 小 滴 が 存 在 す るた め に細 胞 密 度 は低 い が,成 熟IN子 で
る.
は そ れが 消 失 して い るため 密 度 は上 昇 す る.ま た死 滅 し
X-100の
ミ ト コ ン ド リア 内 に 存
柚 出 す る際 に 用 い
濃 度 をC巳ausと
同 様 に1%に
曲 出 さ れ る が,0.1
は それ が 起 こ らず 検 出 さ れ な か った もの と考 え られ
糟 漿 内 に は,大
爺 のACPお
よ びCK-BBが
お り,両
に浸 透 す る た め に密 度 は低 下 す る.そ こ で濃 度 を調 整 し
チ ン,ク
た パ ー コー ル液 を添 加 す る こ とに よ って 運 動 精 子 と,精
精 子 内 取 り 込 み が 細 胞 内 ク レ ア チ ン濃 度 維 持,ひ
漿 お よ び 非運 動 精子(ま
精 子 運 動 に 関 与 す る と 報 告 し,精
を分離す るこ
者 と も リ ン酸 代 謝 に 関 与 す る.精
存 在 して
た精 子 で は細 胞 膜 の透 過 性 が 変 わ り,細 胞 外 液 が細 胞内
た は死 滅 精 子)と
す る
漿 には クレア
レ ア チ ン リ ン酸 が 厚 在 し,Leeらxuは
漿CK・BBは
これ らの
いて は
精 漿内 ク
とが で き る.ま た 修 正swim up法 は 精 子 自身 の運 動 性
レ ァ チ ン濃 度 維 持 お よ び 精 子 細 胞 表 面 に お け るATP を 利 用 した もの で あ り,こ れ ら2法 を併 用 す る こ と によ
生 産 に 寄 与 す る と し て い る が,fHgR CK-BBの
り精 漿 を ほ とん ど含 まな い運 動 梢 子 を選 択 的 に採 取 す る
す る 生 理 的 意 義 は 不 明 な 点 が 多 い.ACPに
こ とが 可 能 と な ったm.CKに
理 的 意 義 は 不 明 で あ る.
BB. CK-MiMiと
はCK・MM, CK・MB, C&
呼 ば れ て い る,大
ア イ ソ ザ イ ム が 存 在 す る.CK-MMは
MBは
心 筋 に特 異 的 で, CK-BBは
き く分 け て4種 類 の
主 に 筋 肉, CK
脳,腎.膀
胱 に あ り,
一T213一
Na・K ATPaseのalpha4ア
H'を
fs1
精 子 に対
つ い て も生
イ ソフ ォームは細胞 内 の
調 節 し て25精 子 運 動 に 関 与 し,乏
精子 症 にお いて
は そ の 酵 素 活 性 が 低 下 して い る 凶 と 報 告 さ れ て い る.ヒ
慶晦医学 82巷3号(平
ト精 子 に お い てCa・ATPaseの
阻害 剤は用凪依存的精子
成17軍9月)
CK・MMと
微mのCK・MBで
運 動 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い るfi;m Ca"の
CK-MiMiが
精 子 運 動 に 対 す る 作 用 は 動 物 種 に よ り 異 な り.ヒ
漿 のCKア
マ ウ ス,モ
い.ウ
ル モ ッ トで はCa"は
シ.イ
阻 害 し,ハ
ヌ,チ
ほ とん ど影 響 を与 え な
ンパ ン ジ ー で はCa2'は
ム ス タ ー,ラ
ツ ジ,
精子運 動 を
ッ トで は 精 子 運 動 を 活 性 化 す る.
そ の 作 用 は 阻 筈 的 で あ っ た り,促 進 的 で あ っ た り種 に よ っ
MMで
子 内CKア
イ ソ ザ イ ム は 大 部 分 がCK-
あ っ た が, CK-MMは
鞭 毛 の 軸 糸 は チ ュ ー ブ リ ン,ダ
(中 心 小 管 を)骨
を 行 うxi. Kamimuraら
300Hzの
元,3次
x 10.61U/LO"sperm
性 値 は6.6±3.6xlO'IU/且
れ ら の 結 果 は 今 後,精
る と 考 え ら れ た.ま
で あ っ た.
子無力症の研究の一助 とな
た 精 子 精 製 法 に つ い て は,精
液中
ィル ス等 の 異物 除 去 に応 用 で き るよ う さ ら
造 で,ダ
は0.5 mM ATP存
イ
在下 で約
の 振 輻 数 はATP濃
依 存 的 に 変 化 し た と 報 告 し て お り3。
》,CK・MMは
本 稿 を終 え る に あ た り,御 指 導,卸 高 閲 を 賜 り ま し た
な る謝 意 を 表 しま す.ま た,貴 重 な御 助 言,御
の 中心 微 小 管
元 の 周 期 的 な 屈 曲運 動
鞭 毛 振 幅 を 観 察 し,そ
お け るATPの
性 値 は,2.0±0.7 漿 のCK活
慶 慮 義塾 大 学 医 学 部 泌 尿 器 科 学 教 室 村 井 勝 教 授 に 深 甚
た,#r7子
イ ニ ン で 構 成 さ れ,9本
辺 微 小 管)と2本
格 と す る い わ ゆ る9+2構
ニ ンが 中 心 と な り,2次
あ っ た.
な る 改 良 の 検 討 が 必 要 で あ る と 考 え る.
オ シ ン フ ィ ラ メ ン トに 関 与
構 成 蛋 白 と い わ れ て い るni.ま
の ダ ブ レ ッ ト微 小 管(周
9.こ
検 出 さ れ な か っ た.精
イ ソ ザ イ ムt3 CK-BBで
子 のCK活
で,精
出 条 件 に よ って
骨 格 筋 に お い て, ATPの
産 生 と 輸 送 を 担 っ て お り,ミ
す るM-bandの
併 存 し, CK・BBは
の 細 菌,ウ
て さ ま ざ ま で あ るzee.
本 研 究 で は,柄
3.精
あ り,抽
度
協力を い
た だ きま した 東京 歯 科 大 学 市 川 総 合 病 院 泌 尿 器 科 産 婦
人 科 各 位 に 厚 く御 礼 を 申 し上 げ ま す.
本 研 究 の 一 部 は,第42回
年11月
日本 不 妊 学 会総 会(1997
東 京),Third Asian and Oceanic Congress OF
Andrology(2000年5月
幕 張)に
お い て 発 表 した.
尾部に
局 所 再 生 を 通 して 精 子 速 動 維 持 に 寄 与 し
文 献
て い る と 考 え られ る.
1)Howards 以 上 よ り,こ
れ ら の 結 果 は 今 後,精
子 内 のCK濃
SS:Treatment ア イ ソ ザ イ ム パ タ ー ンを 調 整 す る こ と に よ る 精 子 無 力 症
Eng 2)鈴
J Med 精 子 学(毛
と考 え た.ま
issa
液 中 の 細 菌,
ウ ィ ル ス等 の 異 物 除 去 に 応 用 で き る よ う さ ら な る 改 良 の
検 討 が 必 要 で あ る と 考 え る.
総 括
ア イ ソザ イ ム お よ びCK活
性 憤 を 明 らか に した.
1.精
漿 に 多量 に含 まれ るACP活
3)Tombes RM, A Energy chondion 性 を 指 標 と して,ヒ
Fer[68:51-56.1983
イ ソザ イ ムお よび 活性 値
を 計 測 した と こ ろ,精 子 内 のCKア
イ ソザ イ ム は.
一T219一
High
sperm seminal C:Crealine fluid and kinase prostatic Mito-
and Hemmer tissues and cells. lllol Cell Biochem 134:193-220.1994
T. Moser Eppenberger spermatozoa. W:Creatine H, Zurbriggen HM:Creative J Muscle IC:Crea[ine kinase in
kinase in
133-
B. Wegmann G,
iscenzymes in
Res Cell Motil T=25-34,1966
kinase sma:activity,origin ATP Fluid. J Reprod
T, and in human seminal and isoenzymes.Clin Chem pla25
1183-1184.1979
8)World セ ル ロー スア セ テ ー トメ ン ブ ラ ン電 気 泳 動 法 を 用 い て
between non-muscle ロ ース カ ラム を用 い たイ オ ン交 換 クロ マ トグ ラ フ ィー,
Transport to Mediate 本研 究 で 確 立 した ヒ ト精 子 精製 法 は,非 運 動精 子,他
ル
Channeling
Shuttle 5)Wallimann 法 を組 み合 わ せた方 法 が 有用 で あ る とい う桔 果 を褐 た.
子 を選 択 的 に分 画 す る ことが で き た.
子 の エ ネ ル ギ ー 代 謝.
京 大 学 出 版 会,ias一147,
BM:Metabolite Darby T)Soufir の 精 製 法 で 精 子 と精 漿 を 分 離 して.DEAEセ
New
and Tail. Cell 41=325-334,1985
human ヒ ト精 子 内,精 漿内 のCKア
Shapiro Phosphate 討 し,キ ャ ピラ ー ル撹 搾 密 度 勾 配 法 と修iEswim up
細 胞 の排 除 と と もに情 漿 を ほぼ 完 全 に除 去 し,運 動 精
紀:精
Phosphorygcreatine 6)Wallimann ト精 子 検 体 にYf31fが混 在 しな い よ うな精 子 精 製 法 を検
2.こ
沢 正 昭.N元
利 秀 雄 監 修).稟
4)Kavanagh)P, 本 研 究 は ヒhh7子 を精 漿 よ り高 度 に 分 離 す る こ とに よ
り,精 子内 と精 漿 内 のCKの
infertility. 332(5):312-317,1995
木 範 男,森
に 対 す る治 療 法 や69子 運 動 に っ い て の 研 究 の 一 助 と な る
た 精 子 精 製 法 に っ い て は,請
of male 度や
Health Organization:Laboratory manual the examination o[semen and sperm<ervica]mucus
interaction.3rd ed. New York. sity Press,1993
9i Kruger TF. Menkvcld Franken DR:Sperm agreement ria)and Steril 63:135-141,1995
between the sperm Cambridge R, Thomas Univerv
C,Lombard morphology:assessing the manual morphology CJ,
the
method〔SlflCi analyzer for
IVOS. crite・
Fertil
宮 地=ヒ
10)Hustar G, Vigue phosphokinase M-isoform tential of men. 11)Claus L. Morshedi ト橘 漿 ・精 子 内 クレ ア チ ンキ ナ ー ゼ の解 析
M:Sperm ratios and creative
fertilizing iscenzyme po-
Fartil Steril 5T:882-888,1992
R, Hermann MB, Trevor N:Creative kinase activity and seminal plasma lacks in human 20)Smeitink J, Wevers Treijbels F. Korenke spermatozoa
quantitative fertility in in vitro fertilization. value for male
kinase Fertil S[eri169:727-
H.Iizuka S, Kobanawa R=Pu而fication continuous Percoll oぼhuman density column. Biol Regrod 13)Kaneko S, Sato H. Kobanawa T,lizuka band's motile semen. using[he Andol 15)Andolz with Gradient ol prQ・
with hus・
application of sperm using quality a modi[ied to
J
野 澤 志 郎;ヒ
トto子
17)Miyaji K. Hayakawa M:Creatine 田 高 久,小
Kaneko 林 俊 文,吉
村 泰 典,
温 医
Ishikawa M, Oohashi isoforms human PP, Panidis H, Aoyagi M, Izawa Arch Andol T,
DIC, Papadimas]S, kinase in seminal Activity W, and isoenzymes. kinase brain evidence and M:Sperm creative
infertile oligospermic
M:Phosphocreatine compound, fluid of the seminal F, Lingrel motility.. vesicles B:Roles and in the
in mice and
sperm of the Na. K・
the Na'/H-exchanger
Mol Repro G. Aykac in human an
is found Sci.85:7265-7269,1988
4 isoform 27)Williams plasma
28)森
46:127-
plasma lkkos of in[ertile Inl J Androl K, Ford Dev 621348-356,2002
G:The motility. W:Eff㏄Is role of Na, K・
Int J Androl 沢 正 昭.森
沢 幸 子,星
利 秀 雄 監 修).東
E.Anflous men
kinascs 41431ト439,
Klingenberg M:High in mitochondria for a separate from 30)Kamimura activity
muscle axonemes 一T215一
activity 25
元 紀:ra子
R, KuznMSOv Nature motility 運 動 の 調 節.請
A, Veksler and V. Boehm
of tissue creatinc
specificity.
184:231-247,1998
Kamiya vibration R 二High・frequency
in 'quiescent' 340:476-478,1989
of
26;366-371,2003
coupling in muscles:Species S, inhibitors
and 京 大 学 出 版 会,104-120,issa
K:Functional 皿anorne巳re・sca量e and
mitochondria)
of Ca・ATPase Int l Androl 29)Ventu【a・Clapier DG
calcium spermatozoa. Mol Cell Biochem of creative lyengar high。energy alpha human 1981
HW. sperm
oligoz◎o・
Res 19:67-75,1988
on the intracellular A, Murai
in the seminal sperm. Creatine H. Heldt and and L, Corcales N, Akian 学(毛
18)Asseo between
activity in fertile and L,}ames ATPase L:Corcelation I!:40-46,且990
J. Fillers 26)Kocak 134,2001
19)Jacobs activity sites.
180-185,2002
K, kinase and the purified Ga皿ete J Androl ATPase Hum
ig96
K. Hata men. G, Vigue VK,
of octameric
in the contact phosphokinase 23)Huszar 24)Lee T, Nalam in normozoospermic spermic 25)Woo semen
procedure. 凍 結 保 存 と 不 妊 症 へ の 応 用.低
学,22:IA7-152, crea[ine concentrations in sperm 慈 直 昭,小
Clin Siochem
1061:215-225,1991
M, Yigue rats. Proc. Nati. Acad. Feb 2:99-101.1987
子 智,久
Ann regulation kinase Acta sperm intraccllar J, Egozcue in abnormal swim-up muscle. and Biophys ex[racellular A, Benet R,
T二Amethod[or
V, Wallimann creative G, Corrales men. semen(AIH).1.
Adams 22)Huszar kinasc Soc.66:845-856.1989
Improvement Peprod cen・
cryopreservation
husbands Res
of mitochondria]creatine
skeletal D:Location Biochim 19=75-84,1987
P, Bielsa h1A. Genesca samples mitochondria) S, Kobayashi
dry ice pellet method:ils Keio Med. by a dis・
concentration sperm M, Brdizka an innerv
for insemina1ion on human artificial insemination 16)兼
K, Ohsio density spem Arch K:Studies with Biophys J, Lith T, Sengers C. Wallimann measurement T. Mohri
35:1059-1063,1986
「or [he selective gressively spem gradient R:Co飢inuou趣step trifugation t4)Lee K, Kobayashi R, Hulshof in human 21)Koitke S, Oshio Bicehem 29:196-201.1992
734,1998
12)Kaneko kinase. I6:SI6-521,1964
K, Eberhard
C, Brigit predictive of creative Commun flageflar
子