学 位 論文 題 名

博士 （ 理学 ） 伊 藤
透
学位論文題名
Nuclear Basic Proteins in Sperm of An Anuran
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in Condensed State of Chromatin
（無尾両生類Ran
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の精子核塩基性タンパク質の構造及びクロマチン凝縮における役割）
学位論文内容の要旨
通常 、 動物 の精子核が体細胞 核に比べて強く凝縮してい るのは、精子核ク口マチンを 構成
す る塩 基 性夕 ンパ ク質 が体 細 胞核 のそ れと は 異な るた めで ある と考えられている。す なわ
ち 、一 般 に体 細胞核のクロマチ ンが生物種を越えて普遍的 なヒストン群から構成される のと
は 対 照 的 に 、 精 子 核 塩 基 性 夕 ン バ ク 質 (sperm nuclear basic protem， SNBP） は 単 に
ヒ ス卜 ン と異 なる のみ なら ず 、動 物種 ごと に さま ざま なタ イプ が存在するという特徴 を持
つ 。し た がっ て、 多種 多様 な SNBPの性 質を 明 らか にす るこ とは 、精子核凝縮の機構と 生物
学 的 意 味 を 知 る う え で 重 要 で あ る 。 無 尾 両 生 類 の う ち 、 ニ ホ ン ヒ キ ガ ェ ル （ Bu′ 〇
Jap〇 nJcuみ の SNBPは ア ル ギ ニ ン を 40％ 以 上 含 む典 型 的な プロ タミ ン、 ア フリ カツ メガ
エ ル（ Xen〇pusぬ eWs）の それ はア ル ギニ ンを 比較 的多 く 含ん だヒ スト ン とプ ロタ ミン の
中 間型 の タン バク 質で ある こ とが 分か って い る。 しか し、 他の 無尾両生類、例えばRana属
で は、 電 気泳 動的解析や組織化 学的観察からプロタミンと は著しく異なる「精巣特異的 」な
タ ンバ ク 質が 存在することが示 唆されてはきたが、このタ ンパク質の詳細は不明であっ た。
本 研究 で は、 ウシ ガェ ル（ RaJlacaCes6ejana）及 びDjc（ ）び 〇ssuspjcCusの 成熟 精子 に
含 まれ る 塩基 性夕ンバク質を分 離、同定するとともに、ウ シガェル精子核クロマチンの 特性
を 明ら か にし 、ま た卵 細胞 質 によ る体 細胞 型 ク口 マチ ンへ のり モデリングの誘導を通 じて
SNBPの 精 子核 凝縮 にお ける 役 割の 解明 を試 み た。
I．無 尾両 生類 の 精子 核塩 基性 夕ン パ ク質 とク ロマ チン 構 造
ウ シ ガ ェ ル 及 び Dロ cCUsの 成 熟 精 子 核 か ら 塩 基 性 夕 ン バ ク 質 を 酸 抽 出 し 、 酸 /尿 素
/′rntonx‐100ポ リア クリ ル アミ ドゲ ル電 気 泳動 によ り体 細胞 の核夕ンパク質と比較 した
と ころ 、 前者 では体細胞核のコ アヒストン群と同じ移動度 のタンパク質及び体細胞型の ヒス
ト ン H1よ り も や や 移 動 度の 大き い 分子 から なり 、後 者 はヒ スト ンを 含め て これ まで SNBP
と して 報 告さ れて いる どの タ ンパ ク買 とも 移 動度 を異 にす る7つの 成分 か らな るこ とが 分
か った 。 した がっ て、 これ ら のSNBPは ヒキ ガ ェル 、ア フリ カツ メガエルのいずれとも 異な
る ユニ ー クな もの であ ると 言 える 。ウ シガ ェ ルの SNBPを逆 相ク ロマトグラフイーで分 画後
各 分画 に つい てア ミノ 酸組 成 を調 べた 結果、体細胞と同一 の4種のコアヒストン（ヒス トン
H2A、 H2B、 H3、 H4） が 確 認 さ れ 、 そ の ほ か に ヒ ス ト ン Hlと ア ミ ノ 酸 組 成 は類 似す るが
り ジン を 25％ 以上 含む より 強 塩基 性の 特殊 な タン バク 質が 見出 された。後者をトリプ シン
で 消 化 し た と こ ろ 、 ト ルプ シン 耐 性部 位を 持ち 、か つ その 耐性 部位 はヒ ス トン H1フ ァミ
リ ーに 特 徴的 なア ミノ 酸配 列 を示 した 。以 上 から 、ウ シガ ェル のSNBPは体細胞型コア ヒス
ト ン と 、 リ ジ ン に 奮 む 精 子 特 異 的 な ヒ ス ト ン H1か らな ると 結 諭し た。 一方 、DpjcCUsの
ー 25− ・
SNBPに つ いて も同様 にアミ ノ酸組 成を調 べたと ころ、 非常に多 くのヒ スチジ ンを含 む大量
のタ ンバク 質とそ れより 比較的 量が少 なく塩 基性ア ミノ酸の 含量も 低い6種 類のタンバク質
から なるこ とが分 かった 。これ らはど れも既 知のタ ンバク質とは異なっており、さらに詳し
い研 究が必 要であ ろう。 さらに 、ウシ ガェル の精子 核についてはコアヒストンが存在するこ
とか ら、通 常精子 核には 無いと される ヌクレ オソー ム構造を持つことが推測された。そこで
精 子 核 ク ロ マ チ ン を ミ ク ロ コ ッ カ ス ヌ ク レ ア ー ゼ (micrococcal nuclease、 MNase)
で 消 化 し核 か ら 遊 離す る DNA断 片を 電 気泳動し たとこ ろ、ヒ キガエ ルやア フリカ ツヌガ ェ
ル の 精 子核 ク ロ マ チン は MNaseに 耐 性 で ある の に 対 し、 約 180塩 基対の 大きさ の断片 が得
られ たが、 体細胞 核クロ マチン を消化 した際 現れる 梯子状のバ夕一ンは見られなかった。ま
た透 過型電 子顕微 鏡によ ルクロ マチン を観察 すると 、ウシガェル精子核ク口マチンはヌクレ
オソ ームを 持っが 、体細 胞核ク ロマチ ンとは 異なル ヌクレオソームが不規則に並んだ構造を
して いた。 これら のこと は、ウシガェルの精子核クロマチンは体細胞のそれに近bゝが、リン
カー ヒストン の特性が 特異な核 凝縮をもた らしてい ることを 示唆して いる。
n． ヌクレオ プラズ ミンに よる精 子核ク ロマチ ンのり モデリ ング
受 精する と、凝縮 した精 子核ク ロマチ ンは卵 内で脱凝縮し、ヌクレオソームが等間隔に並
ぶ体 細胞型 クロマ チンに りモデ リング される 。最近 このりモデリングの過程には、アフリカ
ツメ ガェル やヒキ ガェル の卵内 に大量 に存在 する熱 耐性の酸性夕ンパク質、ヌクレオブラズ
ミ ン (NP)が 関 わ る こ と が 報 告 さ れた 。 NPによ っ て 核 クロ マ チ ン から 除 去 さ れる こ と が
SNBPの 特 性 で あ る と 予 想 さ れ た の で 、 NPに よ る SNBPの 除 去 の 有 無 を 調 ぺ た 。
ヒ トの精 子核を還 元剤処 理した 後にア フリカ ツメガェルの卵内に注入すると、精子核は脱
凝縮 して前 核を形 成する ことが 知られ ている 。その 際ヒトの精子核に含まれるプロタミンが
ど の よ う な 振 る 舞 い を す る の か を 知 る た め に 、 ア フ リ カツ メ ガ ェ ルの 卵 細 胞 質(eggextract)中 で還 元剤処 理した ヒト精子 核をイ ンキュ ベート したと ころ、 ヒトプ ロタミ ンは
核 か ら 完全 に 除 去 され 、 代 わ りに 核 にコア ヒスト ンと卵 割期特 異的ヒ ストンHl(Hl.X)が
結 合 し た。 精製 したア フリカツ メガェ ルのNP中 でイン キュベ ートす ると、 核から 除去さ れ
て NPと複 合 体を形 成した プロタ ミンが 確認され た。こ の条件 にさら にコア ヒスト ンを加 え
て イ ン キュ ベ ー ト した 後 核 を MNaseで消 化する と、梯 子状パタ ーンが 現れ、 ヌクレ オソー
ムを 含む体 細胞型 クロマ チンが 再構築 された ことが 分かった。同様に、ウシガェル精子核を
ヒ キ ガ ェル の egg-extract中 で イン キ ュベー トしたと ころ、 精子核 は脱凝 縮しHl.Xが 結合
し た が 、精 子 特 異 的Hlは 完 全に は 除去 されな かった 。この クロマ チンを MNaseで消化 して
遊 離 レ たDNA断 片 を 電気 泳 動 し たと こ ろ 、 成熟 精 子 核 とは 異 なり約 180塩基対 を基本 単位
と し た 梯子 状パ ターン を示し、 精子特 異的Hlを 部分的 に持っ たまま クロマ チンが 体細胞 型
へ と 再 構築 され たこと が確かめ られた 。また 、ウシ ガェル の精子 核を高 濃度の 精製NP中 で
イ ン キ ュペ ート すると 、核の脱 凝縮と ともに 精子特 異的Hlが 選択的 に除去 された が、こ の
Hlの 除 去 は 完 全 に は 起 こ らな か っ た 。NPと SNBPの 結合 は NPのポ リ グ ル タミ ン 酸 領 域を
介 す る と考 えら れてお り、カェ ルNPに より生物 種の違 いを越 えてヒ トプロ タミン が完全 に
除 去 さ れた のに 対し、 ウシガェ ル精子 特異的 Hlの除去 が不完 全であ ったの は、後 者の塩 基
性 が 比 較的 弱く 前者に 比べてNPに対す る結合カ が小さ いため である と思わ れる。 しかし 、
Hlが 部分 的 に除去 されて はじめ て精子 核クロマ チンの 脱凝縮 とりモ デリン グが誘 導され た
こ と は 、精 子核 の凝縮 した状態 を保つ ために はSNBPが 不可欠で あるこ とを示 してお り、ま
た SNBPが 少な くとも 胚の初 期発生 におい て部分 的にり ンカーヒ ストン として の役割 を持つ
可能 性があ ること を示唆 してい る。
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学位論文審査の要旨
主査 教 授 片桐干明
副査 教 授 鈴木範男
副査 教 授 高橋孝行
学 位 論 文 題 名
Nuclear Basic Proteins in Sperm of An Anuran
Amphibian,RaTzacatesbeiana:T
heirStructu
reandRole
in Condensed State of Chromatin
（無尾両生類R
an
acat
es
be
ian
aの精子核塩基性タンパク質の構造及びクロマチン凝縮における役割）
動 物 の成 熟 精 子核が著 しく凝縮し ているの は、体細 胞核に普 遍的なヒ ス卜ン群 を
欠き し た がっ て ヌクレ オソーム構 造をとら ないこと と共役し ていると 信じられ てい
る 。 し か し こ れ ま で 断 片 的 に 報 告 さ れ て い る 精 子 核 塩 基 性 夕 ン バ ク 質 (SNBP)の 多
様性 か ら みて 、 典型的 な強塩基性 核夕ンバ ク質であ るプロタ ミンをも つ魚類、 哺乳
類な ど の 精子 核 につい て提唱され た上記仮 説が一般 性をもち うるか否 かは検討 を要
す る 。 伊 藤 透 提 出 の 学 位 論 文 は 、 無 尾 両 生 類 Rana catesbeianaの SNBPの 組 成 と
ク口 マ チ ン構 造 を解明 し、さらに これを体 細胞型ク 口マチン ヘと転換 させる試 みを
通 じ て 精 子 核 凝 縮 の 仕 組 み の 解 析 を 試 み て お り 、 以 下 の 諸 点か ら 評 価さ れ る 。
ま ず 、 申 請 者 は こ の 動 物 の SNBPが り ジ ン に 富 む 精 子 特 異 的 な Hlと 位 置 づ け ら れ
る塩 基 性 夕ン パ ク質を 除けば体細 胞におけ るそれと 区別のつ かないコ アヒスト ン群
を 含 む こ と 、 ま た 平 行 し て 行 わ れ た 同 様 の 解 析 か ら 他 の 両 生 類 Discog＾ ） Ssus皿 ms
の SNBPが ヒ ス チ ジ ン に 富 む こ れ ま で に 報 告 の な い ユ ニ ー ク な 塩 基 性 夕 ン パ ク 質 を 含
む こ と を 見 出 し た 。 こ れ ら の 発 見 自 体 、 新 し い SNBPの 組 成 を 提 示 し た と い う 価 値 を
も っ も の で は あ る が 、 申 請 者 は さ ら に R． ca絶 sぬ ぬ na精 子 の ク ロ マ チ ン が ヌ ク レ オ
ソー ム 構 造を も つこと を直接証明 する電子 顕微鏡像 を提出し ている。 これらに 基づ
い て 提 唱 さ れ て い る 、 お そ ら く SNBPの り ン カ ー と し て の 特 性 の ゆ え に ヌ ク レ オ ソ ー
ムコ ア が 不規 則 な間隔 で並びそれ が精子に 固有の高 度の凝縮 をもたら すという モデ
ルは 、 精 子核 の 凝縮の 仕組みに一 石を投ず るもので ある。つ いで申請 者は、精 子核
の脱 凝 縮 と体 細 胞 型ク ロ マチ ン ヘ のり モ デリ ン グ の相 関 を無 細 胞 系を 用 いて 解析
し、 典 型 的な プ ロタミ ンのみから なるヒト 精子では 両者が強 い相関を 示すこと 、ま
た その際 ヌク レオプラズミン(NP)によるSNBPの完全な除去が伴うことを証明し
た。ところがR． catesbeianaでは、脱凝縮が誘導された精子核であってもNPを非生
理的濃度に高めた条件下ですら精子特異的H1は完全には除去されず、むしろ後者を
部分的に残したまま完全に体細胞型クロマチンヘの転換が起きる得る、という証拠
を提出している。この観察は、ここで見出された精子特異的Hlが精子クロマチンの
凝縮および初期胚におけるりンカーとして、2重の役割をもち得ることを示唆する
ものとして注目される。
以上の研究成果は、新しいタイプのSNBPを提示するのみならず、それを通じて精
子核に固有のク口マチン凝縮機構について新たな提案を含んでおり、精子核ク口マ
チンの研究に重要な貢献をするものである。申請者に対する最終試験は、平成9年
6月12日に多数の大学院担当教官の出席のもとに論文の口頭発表と質疑応答の形
で行われ、満足すべき結果であった。したがって、審査員一同は申請者が博士（理
学）の学位を受けるに十分の資格があるものと認める。