H27-16

課題番号 H27－16
研究題目
Aire 欠損ゼブラフィッシュにおける病態解明
研究組織
研究代表者：中西照幸（日本大学生物資源科学部）
共同研究者：松本 満（徳島大学疾患酵素学研究センター）
研究分担者：宮澤龍一郎（日本大学生物資源科学部）
【1】研究の概要
[1-1] 本研究の目的・概要
Autoimmune regulator (Aire)は、胸腺の間質を
構 成 す る 髄 質 上 皮 細 胞 （ medullary thymic
epithelial cell: mTEC）に発現する転写因子であ
り、ヒトの遺伝性自己免疫性多腺性内分泌疾患
Ⅰ型の原因遺伝子として知られている。Aire 欠
損症は単一遺伝子の異常によって起こる病気
であるため、Aire 欠損マウスは自己免疫疾患の
研究における優れたモデルとなっている。しか
し、胸腺における自己反応性 T 細胞の除去（負
の選択：negative selection）における Aire の関
与が示唆されているが、その詳細なメカニズム
は不明である。松本教授らは、これまでに Aire
欠損マウス、Aire/GFP ノックインマウス、
Aire/Cre ノックインマウスなどの遺伝子改変マ
ウスを作製し、さまざまの視点から Aire の機能
解明を試みている。しかし、自己免疫寛容成立
過程における Aire の役割やメカニズムの詳細
については依然として不明である。また、松本
教授らは、Aire がマウス胸腺の mTEC だけでな
く、発生初期にも発現することを見出している。
一方、魚類は哺乳類と相同な免疫システムを
有する最下等の脊椎動物であり、免疫システム
においても哺乳類と同等の器官，組織を備えて
いる。また、魚類は体外発生を行い、ゼブラフ
ィッシュやメダカにおいては卵膜が透明なた
め、初期発生における形態異常が外部から容易
に観察できる。さらに、ゲノム解析も進んでお
り、発生速度や世代交代が早く、多くの突然変
異体が作製されている。このような理由から、
近年発生学のモデルとしてだけでなく、ヒト疾
患のモデルとして注目されている。
そこで本研究においては、Aire-KO ゼブラフ
ィッシュを用い、発生初期の形態形成等におけ
る Aire の機能を解明するとともに、Aire 欠損ゼ
ブラフィッシュにおける病態について、免疫学
的並びに病理組織学的観点から検討する。
[1-2] 研究の方法・経過
Aire-KO ゼブラフィッシュには 2 種類の系統
があり、Exon 2 の欠損を Aire1、Exon 5 の欠損
を Aire2 と名付けた。なお、Aire1 は Exon 2 に
-11bp の deletion が入っており、Aire2 は Exon 5
に+11bp の insertion（+11bp KO）あるいは-7bp
の deletion（-7bp KO）が入っているホモ個体及
び+11bp の insertion と-7bp の deletion の両方が
入っている複合ヘテロ個体（Compound hetero）
である。
抗ヒト ZAP70 抗体が魚類を含めた脊椎動物
の T 細胞に反応することが知られており、この
抗体を用いて組織、特に卵巣への T 細胞の浸潤
について凍結切片を作製し免疫組織学的に検
討した。
前年度に、ギンブナの CD4 及び CD8α に対す
るモノクローナル抗体がゼブラフィッシュの
リンパ球と交差反応を示し、それぞれヘルパー
T 細胞及び細胞傷害性 T 細胞を認識することを
報告した。そこで、本年度は病理組織学的観察
に加え、これらのモノクローナル抗体を用いて、
Aire-KO ゼブラフィッシュにおける T 細胞サブセ
ットの動態をフローサイトメトリーにより解析
した。
【2】研究成果
[2-1] 本共同研究で明らかになった研究成
果
12 ヶ月令以上の Aire-KO ゼブラフィッシュ、
特に Aire2 KO の Compound hetero 個体において立
鱗症状や腹水貯留を示す個体が高率に出現した
（30 尾中 20 尾）。病理組織学的検査を行ったとこ
ろ、発達した肉芽腫様組織が腎臓、肝膵臓及び腸
管等に認められ、特に腎臓に多数認められた。抗
酸菌染色を施したところ、肉芽種用組織内に多数
の抗酸菌が認められた。加齢の進んだ Aire-KO ゼ
ブラフィッシュにおいて立鱗症状を示す個体に
肉芽種様組織が多く認められ、野生型(Wild Type)
で立鱗症状を示す個体にもわずかに肉芽種用組
織が認められたが、Aire-KO に比べ有意に少ない
ことが判明した。
ミコバクテリア症などの抗酸菌感染症は、ゼブ
ラフィッシュにおいて日和見感染症として国内
外で問題となっており、ストレス等により抵抗力
の低下した個体において感染・発病することが知
られている。Aire-KO ゼブラフィッシュは、野生
型に比べ感受性が高くより重篤な症状を示すこ
とから、Aire-KO ゼブラフィッシュは免疫不全に
陥っていることが示唆された。
そこで、ギンブナの CD4 及び CD8α に対す
るモノクローナル抗体を用いたフローサイト
メトリー解析により、Aire-KO ゼブラフィッシ
ュにおける T 細胞サブセットの動態を解析した。
その結果、3 ヶ月令の Aire2-KO ゼブラフィッシ
ュにおいて CD4 陽性 T 細胞の有意な減少が認
められた。なお、CD8 陽性 T 細胞については
野生型に比べ違いは認められなかった。
また、Aire2-KO ゼブラフィッシュにおいて卵
巣の著しい委縮及び線維化が認められ、T 細胞
の卵巣組織への浸潤が認められた。
なし
2. 学会発表
宮澤龍一郎 松浦雄太 柴崎康宏 藪健史 中西
照幸，抗ギンブナリンパ球モノクローナル抗体
によるゼブラフィッシュ CD4 及び CD8α 陽性細
胞の同定，第 21 回小型魚類研究会，大阪大学
銀杏会館 9 月 19 日，2015 年
3. 成果資料等
特許出願：「ゼブラフィッシュCD4及びCD8
α抗原に対するモノクローナル抗体」
出願番号：特願2015-115621
出願日：平成27年6月8日
【4】今後の課題等
発生初期の形態形成等における Aire の機能
を解明するために、Aire-KO ゼブラフィッシュ
の胚発生を実体顕微鏡下で経時的に観察した
が、顕著な形態異常は認められなかった。今後
は野生型を用いて各発生段階における Aire の
発現部位及び発現レベルを調べるとともに、
Aire-KO ゼブラフィッシュにおける胸腺の成熟
及び自己免疫寛容の成立に関連する遺伝子の
発現解析を行う必要がある。
これまでのマウスを用いた研究より、
Aire-KO 動物においては、組織への T 細胞の浸
[2-2] 本共同研究による波及効果及び
潤や自己抗体の沈着が観察されている。今回、
今後の発展性
Aire-KO ゼブラフィッシュにおいて卵巣への T
本共同研究により、以下の波及効果及び発展
細胞の浸潤を観察したが、他の組織についても
が期待される。
広範囲に検討する必要がある。
1) 自己免疫寛容成立過程における Aire の役
また、自己抗体の各種組織における沈着につ
割について、魚類から哺乳類に至る脊椎動物に
いて検討するために、ゼブラフィッシュにおい
おける普遍的な機能の解明が期待される。特に、 ては IgM に対する抗体が存在しないことから、
Aire の発生初期の形態形成における機能につい
抗 IgM 抗体を作製する必要がある。
ては、体内発生を行う哺乳類では解析できない
さらに、Aire- KO マウスにおいて Insulin 自己
ため、Aire-KO ゼブラフィッシュを用いた研究
抗原 mRNA の胸腺における発現の低下が知ら
は重要な知見をもたらすと思われる。
れており、Aire-KO ゼブラフィッシュにおいて
2) 抗ギンブナ CD4-1 及び CD8α モノクローナ
も同様な減少が認められるかどうか検討する
ル抗体がゼブラフィッシュのリンパ球に交差
必要がある。
することが判明し、Aire-KO ゼブラフィッシュ
における T 細胞サブセットの動態解析にとどま
らず、今後ゼブラフィッシュをモデルとした感
染防御機構の解明やヒト疾患モデル魚におけ
る免疫機構の解析が飛躍的に進展することが
期待される。
【3】主な発表論文等
1. 論文発表