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研 究 報 告

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研 究 報 告
一27-一
昭 和60年11月(1985年)
研 究 報 告
納 豆 製 造 過 程 に お け る成 分 変 化(第2報)
水 溶 性 タ ン パ ク質 に つ い て 一
池 田
ひ ろ*,津
野
貞 子**
The Componential Changes During the Manufacturing
Process of Natto (Part 2)
—On the Water Soluble Proteins—
Hiro
1緒
Ikeda,
Sadako
Tsuno
豆 および粉末大 豆使 用納豆 につ いてゲ ル ロ過 および電
言
納 豆 は 蒸 煮 大 豆 に比 べ 消 化 性 に優 れ 栄 養 価 値 の 高 い
気泳動 に よ り比 較 検討を行 った のでそ の結果 を報告す
る。
食 品 で あ る 。納 豆 に使 用 す る 大 豆 に は 中 粒 と小 粒 が あ
り,一 般 に は小 粒 大 豆 を 使 用 した納 豆 が好 ま れ て い る
が,そ
そ こで,大 豆 の 形 態 の 違 い が 発 酵 過 程 中 の 成 分 の 変
化 や 製 品 の 出来 上 り時 聞 な ど に影 響 を 与 え る ので は な
い か と考 え,粉
末 大 豆 で 納 豆 を 製 造 し,短 時 間 で 栄 養
価 値 の 高 い食 品 と して 利 用 出 来 るか ど うか を 知 る た め
前 報1)に お い て 旨味,香
ア ミノ態 窒 素,ア
り,栄 養 的価 値 に関 連 の 深 い
ン モ ニ ァ 態 窒 素,糖,ビ
タ ミ ンBz
の各 成 分 につ い て 丸 大 豆 使 用 納 豆 との 比 較 検 討 を 行 っ
た 。 そ の結 果,形
え,丸
II
実 験 方 法
の 理 由 は 明 らか で は な い 。
態 の 違 い が 納 豆 菌 の繁 殖 に影 響 を 与
大 豆 よ り表 面 積 の 大 き い粉 末 大 豆 にお いて は 短
時 間 で 納 豆 化 が 行 わ れ る とい う結 論 を 得 た 。
ま た,納 豆 菌 が 生 産 す る 加 水 分 解 酵 素 の う ち最 も納
1.試
料の調 製
納 豆 菌:宮 城 野 納 豆 製 造 所(仙
れ たBacillus
台 市)で 純 粋 培 養 さ
nattoを 使 用 した 。
原 料:丸 大 豆 は ア メ リカ産 の もの を 使 用 し,粉 末 大
豆 はそれ を
一196。Cで
瞬 間 凍 結 粉 砕 した もの を 使 用
した 。
納 豆 の 製 造:前
で2時
2実
報D同
様 に行 い 発 酵0か
ら20時 間 ま
間 ご とに と り出 し,こ れ を 試 料 と した 。
験方 法
各 試 料 を 乳 鉢 で 充 分 す りつ ぶ した の ち一 定 量 を 秤 取
し,約6倍
の4M尿
素 を 含 む0.1MNaClに
懸濁 し
豆 の発 酵 過 程 に 関 与 す る 酵 素 は タ ンパ ク質 分 解 酵 素 で
1時 間 室 温 で 撹 伴 抽 出 を 行 い,8,000×gで20分
あ り,こ の 酵 素 に よ って タ ンパ ク質 は ペ プ チ ドや ア ミ
心 分 離 後 そ の 清 澄 液 を と り,こ
ノ 酸 に ま で 分 解 さ れ2・9)納 豆 の 旨味や 消 化 性 に影 響 を
で1時 間 遠 心 分 離 し,こ の 清 澄 液 を 水 溶 性 タ ンパ ク質
与 え て い る と云 わ れ て い る。
抽 出 液 と した 。
そ こで 今 回 は こ の タ ンパ ク質 分解 酵 素 に よ る発 酵 中
の 水 溶 性 タ ンパ ク質 の水 解 過 程 を,形 態 の異 な る 丸 大
*京 都女子大学 食物 学科 調理学第1研 究 室
**日 本生活 医学研究 所
1)Sephadexに
Sephadex
れ を さ らに56,000×9
よ るゲ ル ロ過
G-50を
水 に よ く分散 させ24時 間 室 温 に
懸 濁 放 置 して 完 全 に 膨 潤 さ せ た の ち4M尿
0.1MNaC1溶
間遠
液 で3回
素を含む
洗 浄 した も の を直 径1.5cm,
- 28-
食物学会誌・第4
0号
I
I
I 結果と考察
生大立
1
8
1
.6
ρhu
i
1
.2
1
.0
0
.
8
2
4
ρ
り
ハU
日
ロ
{
)
父
町
一
ヨ
パ
﹁
︿ VEll---
1
.4
1
2
0.
4
一言、¥切ミ)ど一﹂川Tt
馬断畑、ソヘ入、11111
1
.8
0
.
2
。
o
KA
V
e
p
h
a
d
e
xG-50による水溶性タンパク
図1 S
1
) S
e
p
h
a
d
e
xによるゲノレロ過
S
e
p
h
a
d
e
x G-50 による水溶性タンパク質のクロマ
トグラムを図 1
および図2
に示した。吸光度 280nm の
測定では,生大立,蒸煮大豆については丸大豆,粉末
,0
.
8および1.0
付近に 3つのピーク
大豆ともに KAV0
がみられ,発酵 6時間では KAVO のピークが減少し
KAV0
.
6の位置に新しいピークが現われ, KAV0
.
8の
1
0
時聞になると丸大豆では
ピークは増加する。発酵後
KAVO のピークはわずかとなり 0
.
7
付近に新しいピー
クが現われ, KAV0
.
8および1.0のピークは増加する。
発酵2
0時間では 280nmの吸収のほとんどが KA
.
9
VO
および1.0のピークの位置に観察される。
Lowry法によるタンパク質の測定では,生大豆では
KA
.8および1.0の位置にはごくわずかしか検出さ
VO
.
8および1.0
れず,また蒸煮大豆においても KA
V0
の位置のタンパク質量は少ない。とのことより生大豆,
質のゲ jレロ過
蒸煮大豆における 0
.
8および1.0のピークは紫外部
吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸であると推察
長さ 45cmのカラムに均一に流し込み, 4M尿素を含
される。ゲ Jレロ過でみるかぎり丸大豆と粉末大豆の違
む 0
.
1M NaCl 溶液で充分平衡化を行ったのち生大
いは明確でなく,両者ともに発酵時間の経過ととも
0,2
0
時間の各抽出液につい
豆,蒸煮大豆,発酵 6, 1
に高分子のタンパク質は納立菌により加水分解され
てゲルロ過を行った。
まず,抽出液 0
.2mlをカラムに吸着させ, 4M尿
素を含む 0
.
1M NaClで溶出 (
1
0m
l
j
h
r
) し,フラク
KAVO
.
8付近のタンパク質量は増加する。発酵2
0時聞
.8のピークのタンパク質量は減少す
になると KAVO
るが 280nmの吸収はほとんど変化しないととろから,
ションコレクターで1.5m
lずつ秤取して分画を行い,
さらに分解されて低分子のペプチドやアミノ酸にまで
各画分の 280nm の吸光度を測定した。
分解が進んだものと推察される。
あわせて
Lowry 法 l
とよりタンパク質の定量を行い, 各ピーク
曲線の総面積からこれらピークのタンパク質が全体に
占める割合を算出した。
2
) ディスク電気泳動
8M尿素を含む 1
5
9
彰ポリアクリ jレアミドゲル電気泳
動による結果を図 3
および図 4
に示した。図3
にみられ
るように生大豆,蒸煮大豆,発酵 2時間および 4時間
2
) ディスク電気泳動
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は D
a
v
i
s
1
0
)
方法 l
とより 8M尿素を含む 1
5
9
6ゲ
、 jレを用い,
らの
後の丸大豆および粉末大豆ともにゲノレの上部に 6本の
トリスー
鮮明なバンドを示し,その他数本の不鮮明なバンドが
みられる。生大豆ではゲ、ノレの上端部および中央部に特
グリシン緩衝液中で行った。
3
) 分子量の測定
に濃い鮮明なバンドが 2本認められるが蒸煮大豆では
b
e
r,Osb
o
r
n10)らの SDSポリア
分子量の測定は We
とのバンドは消失する。これは高分子のタンパク質が
クリルアミドゲ、ル電気泳動法に従い, 0
.
1
9
6SDSを含
加熱 i
とより水解または変性凝固したためと考えられる。
む1
2
.
5
9
6ゲノレを用い O.lM リン酸塩緩衝液 (
0
.
1形
蒸煮大豆と発酵 2時間および 4時間後の試料では大き
SDSを含む, pH7
.2
)中で行った。
な変化は認められないが発酵 6時聞になると急速に水
SDS測定用には各抽出液の最終濃度が 1
9
6SDS,1
9
6
2
-メ jレカプトエタノーノレ, O.OlM リン酸塩緩衝液
(pH7
.0
)になるように調製したのち 6
0C3
0
分間還元
0
させたものを使用した。
"
"
'
'
5
解が進み泳動バンドは中央より先端部に移動し, 4
本の成分が認められる。粉末大豆は発酵 6時間後にか
なり低分子化した泳動ノインドを与え,丸大豆よりも加
水分解速度が速い乙とを示している。図 4の発酵 1
0
"
"
'
'
2
0時間の各泳動図にみられるように発酵時間の経過と
ともにバンドの数は減少し,粉末大豆では 1
4
時間で先
昭和 6
0
年1
1月(19
8
5年)
~
h大 ,
i
.
29-
1
りふん ,
i
.
I
I
!1~主主、 K1J.
3
6
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1
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1
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1
j
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1
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1
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1
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1
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1
1
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2
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5
自
民
1
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吉野叫)逗刊一一将官、ご入以 11111
2
1
1
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I
伴G
I
I
.
'
i
:
1
1
1
1
。 。
KAV
、
0
.
5
KAV
副
1
.0
。
e
p
h
a
d
e
xG-50による水溶性タンパク質のゲソレロ過
図2 S
端部に 1本の鮮明なバンドの他にいくつかの不鮮明な
る
。
バンドがみられるが,発酵 20時間では先端部の 1本の
3
) 分子量の推定
みとなる口丸大豆ではバンドの消失は徐々に進行し,
SDS ポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準
発酵 20時間で中央部と先端部に 2本のバンドがみられ
タンパク質の分子量と泳動速度の関係を図 5に示した口
る
。
この関係に基づいて泳動距離を分子量に変換し,発酵
この結果より,プロテアーゼによって粉末大豆では
過程における分子量の経時的変化を示すデンシトメト
約1
4時間でタンパク質の大部分が低分子のペプチドや
リーによるパターン(図 6および図 7
)を作成した。図
アミノ酸にまで分解されるが,丸大豆が同程度まで分
6
'とみられるように生大豆では分子量分布は 100,0
0
0
"
'
'
解されるためには発酵 20時間が必要であると推察され
000の広範囲にわたっており,分子量 100,
000近く
1
0,
円
ο
n
u
食物学会誌・第 4
0号
九大豆
粉末大 I
A
l
4A
・
J今
1
i
{酔
2
1
1
寺1
1
1
1
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大以
品川上手
j
l
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1
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大U
1
i
{
時
G
l
h
f
'
l
l
1
l
図 3 製造過程中の水溶性タンパク質の変化
(8M 尿素
1
5
9
6ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動)
泥酔
8
1
1年IIIJ
- 31-
昭和60
年1
1月(1985年)
九大豆
粉末大tJ.
発酔
1
0
1
1
年
!
日l
?
C骨
子
発酵
発酵
1
2
1
1
.
'
i
=
1
I1
1
4
1
1
キ
│
間
1
6
1
1年1
1
1
1
発
両
手
1
8
1
1キ1
1
1
1
図 4 製造過程中の水溶性タンパク質の変化
(8M尿素 15%ポリアクリノレアミドゲルによる電気泳動)
発酵
2
0
1
1
年1
1
1
1
食物学会誌・第40号
- 3
2-
l ホスホリラーゼ
(MW:9Ax1
(1)
4 一2 アルブミン
(MW:G.7x1(1)
骨一一・ 1 オボアルブミン
(MW>
1
.3
:x1
(1)
骨
一
一 lカーボニックアンヒド、ラーゼ
(MW::3.0XI01)
.
.
5 トリプシンインヒビター
(MW:2.01X1
(1)
埠 一 一 Gα ラクトアルブミン
(MW:1
.
4
4X1
(1)
+一一
4
.
7
P
4
.
G
(切。︻)
4
.
5
耐
廿
4.
4
,
'
、
,
'
"
4
.
3
4
.
2
4.
1
4
.
0
0
.
2
0
.
5
υ
に
0
.
1
ハ
υ
。
0
.
7
0
.
8
0
.
9
1
.0
村I
~.J 移 動 l
i
図 5 SDS ポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準タンパク質の移動度
ク質の熱変牲が著しいためと考えられる。しかし発
に大きなピークがある。蒸煮大豆では加熱 l
とより水解
ノf
されて分子量 1
0
0,
0
0
0近くのタンパク質は減少し,
酵 6時間になると急速にプロテアーゼによる加水分解
60,
000.
.
_
,4
0,
000のタンパク質が増加する。発酵 2時間
0,
000以上のものは減少し 30,
000.
.
_
,
が進み,分子量 4
および 4時間では蒸煮大豆に比べ著しい差はみられな
1
5,
000のものが増加する D 発酵 8.
.
_
,1
2時間では徐々に
0,
0
0
0
以上のものは
いが,発酵 6時間になると分子量 4
0,000のポリペプチドは減少し
加水分解が進み分子量 3
0,
0
0
0.
.
_
,1
8,
000の範囲に多く分布し,
著しく減少して 3
20,
000
前後のものが増加する。発酵 1
4時間になるとほ
発酵 4時間まで存在していた分子量 1
5,
0
0
0
"
"
'
_
_
'
1
0,
000の
0,
0
0
0.
.
_
,1
0,
0
0
0の聞に分布し,丸大豆の 20時
とんどが 2
ものは減少している。これらのタンパク質は納豆菌の
間発酵のものとほぼ同程度の分布状態であった。その
フ。ロテアーゼによって色素と結合できない程度に低分
0,
000
近くのポリペプ
後も徐々に分解は進み,分子量 2
子化されたものと考えられる。その後発酵 8.
.
_
,2
0時間
チドはさらに減少し, 1
0,000に近いものが増加する。
では時間経過に伴って徐々に分子量3
0,
000
前後のもの
丸大豆,粉末大豆ともに発酵過程中にみられる分子
0,
000.
.
_
,1
0,
000のポリペプチドが増加する。
が減少し, 2
0,
0
0
0.
.
_
,1
0,
000のポリペプチドの増加は高分子のタ
量2
図 7に示すように粉末大豆は丸大豆とほぼ同様な傾
ンパク質の減少度より小さいが,これはこれらのタン
0
0,
000近くのタンパ
向を示すが,蒸煮大豆の分子量 1
パク質のほとんどがさらに低分子のペプチドやアミノ
ク質の減少は丸大立ほど顕著ではない。これは粉末大
酸にまで分解されたためと考えられる。
豆の方が表面積が大きいため加熱の影響が大きくタン
e
p
h
a
d
e
x G-10を用い 6M 塩酸グアニジ
そこで S
- 33-
昭和6
0
年1
1月(1
9
8
5年)
生大医
発酵1
4時間
発酵6時間
発酵 8時間
発 酵 16時間
発酵 211,~:mj
発酵 1
0時間
発酵1
8時間
発酵4
1
時間
発酵 1
2時間
発 酵2
0
時
!
日j
来系:大 '
J
.
出制町一主宰
噌(︺同×一[
噌()︻× N
噌(︺同×噌
噌()-[×。
噌()同×∞
畦{)同×。-[
N
噌()円×円
噌{)同×
守(}︻×噌
噌{)同×。
噌()同×。同
噌()︻×∞
日(}円×戸
千()同× N
ザ()-[×噌
噌()同×匂
申()同×∞
申()同×。同
1
1
分
量
図 6 SDS ポリアクリルアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図〈丸大豆)
波長:AEx 5
5
3nm; スリット: o
.2X3mm; モード:透過リニアスキャンニング法;
スキャンニング速度: 50mm/min; チャート速度: 50mm/min
- 34ー
食物学会誌・第4
0号
発酵6時間
発酵 1
4時 n
I
J
蒸煮大豆
時間
発酵8
発酵1
6時 間
発酵 1
0時間l
発酵 1
8
1
1
王
子
!
日j
発酵 1
2時
!
日i
時間
発 酵2
0
1
出鰐友田特
生大豆
発酵2時間
発酵 4
1
1
寺
陪j
守()-×円
申()-× N
申{)-×噌
噌()同×。
×円
守()同×∞
{)H
噌()︻×。一[
守
守()円× N
×∞
-マ()円×噌
Y ( )︻
司
噌(}同×。
守()同×。-[
N
守()︻×円
司()同×
︻×市
Y()
司
噌()同×。
申()同×∞
噌()︻×。︻
子
分
量
図 7 SDS ポリアクリ Jレアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図(粉末大立)
波長 :λEx 553nm;スリット :0.2X3mm; モード:透過リニアスキャンニング法;ス
キャンニング速度: 50mmjmin; チャート速度: 50mmjmin
昭和 60
年1
1月(1
9
8
5
年)
- 35ー
4
.
0
3
.
8
[
。 3.6
1:ミオグロビン (MW:17,
2
0
1
)
切
~."
2:ミオグロビン I十 I
I(MW:14,
6
3
2
)
:~
:ミオグロビン 1(MW:8,
2
3
5
)
、-『
、
.
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ご
ヘ
3
.
4
1:ミオグロビン I
I(MW:6,
3
8
3
)
5
:ミオグロビン I
I
I(MW:2,
5
5
6
)
(
i
:ミオグロビン 1
-}11(MW:1,
6
9
5
)
3
.
2
3
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0
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0
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2
0
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4
0
.
6
0
.
8
1
.0
K
<
¥
v
図 8 Sephadex G-lO による 6M 塩酸グアニジン存在下でのポリペプチドの標準曲線
ンを溶媒とし,生大豆および丸大豆の蒸煮大豆,発酵
(
2
)および (
3
)のピークが増加し,分子量 3,
600のピーク
6時間, 20時間の各抽出液を塩酸グアニジン 6 M お
(
5
)が新たに溶出される。発酵20
時聞になると著しく水
よび2
-メ Jレカプトエタノール 1労の濃度になるよう調
解が進み, (
1
)(
2
)のピークは減少し,
(
3
)のピークは著
製したのち 60C,30分間で還元させた溶液についてゲ
5
)のピークは著しく増加し,新たに分子
しく減少, (
ルロ過を行い,ポリペプチドの標準曲線により分子量
量3,100(
6
),3,
000(
7
),2,
300(
8
),1
,600(
9
)のピークが
の測定を行い,その結果を図 8および図 9に示した。
とみられるように発酵 20時間に
溶出される。この結果 l
図 9にみられるように生大立では分子量 17,
000(
1
)
,
なると大部分のタンパク質が分子量 4,
000以下のペプ
8, 100(2~ 5,
3
0
0
(
3
)の 3つのピークが溶出されるが,蒸
チドにまで分解されているととが裏付けられる。
0
煮大豆では加熱によってピーク (
1
)のタンパク質および
以上の結果より大豆中の水溶性タンパク質の発酵中
ピーク (
2
)のペプチドが減少するがピーク (
3
)が増加し,
のフ。ロテアーゼによる水解は発酵 4時間以後急速に進
新たに分子量 4,
200のピーク (
4
)が溶出される。発酵 6
み,納豆になると一部のタンパク質は残存するが大部
時聞になるとプロテアーゼによってタンパク質やペプ
分のものは分子量 20,
0
0
0
1
0,
000のポリペプチドおよ
チドは水解されて,さらに(1)のピークは減少し代りに
び低分子のペプチドやアミノ酸にまで水解される。ま
。
円
。
円
食物学会誌・第4
0
号
I
'
t
併G
I
I
S
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6
1
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図9 S
e
p
h
a
d
e
xG-10による 6M塩酸グアニジン存在下でのゲ、 jレロ過
:1
.7X1
04; 2
:8
.
1X1
03; 3
:5
.
3X1
03; 4
:4
.
2X1
03; 5
:3
.
6X1
03;
分子量: 1
3
6
: 3.1X103; 7
:3
.OX103; 8
:2
.3X103; 9
:1
.6X10
た分子量推定やディスク電気泳動により丸大豆の発酵
方が各成分の変化が速く,今回の水溶性タンパク質の
2
0時間のものと粉末大豆の発酵 1
4時間のものの水解程
水解過程と一致した。さらに今後旨味と関係するアミ
度はほぼ同じであると考えられる。
ノ酸組成の変化についての検討が必要である。
前報においてもほとんどの成分は発酵 4時間までの
変化は少く,またエネルギー源である糖を添加して納
I
V要
約
豆製造を行った場合にも粘質物の生成は発酵 4時間ま
納豆製造過程中の水溶性タンパク質の水解過程をゲ
でほとんどおこらないと乙ろから,納豆菌の発芽や増
Jレロ過法,ポリアクリノレアミド電気泳動法を用いて明
殖のためには温度 4
0C,湿度8
0形で最低 4時間が必要
らかにし,また大豆の形態の違いがタンパク質の水解
であると推察される。
過程にどのような影響を与えるかを知るため丸大豆と
0
また前報でのアミノ態窒素,アンモニア態窒素,
粉末大豆を使用して検討を行った結果は次のとうりで
pH,ビタミン B2,糖の各成分の増減は丸大豆の発酵
ある。
2
0
時間と粉末大豆の発酵 1
4時間の植がほぼ等しく,形
(
1
)
態の違いにより丸大豆より表面積の大きい粉末大豆の
経過とともに KAVOに溶出されたタンパク質の大部分
S
e
p
h
a
d
e
x G-50 によるゲルロ過では発酵時間の
- 37ー
昭和 60
年1
1月(1
985
年)
は水解され, KAVO.8付近に溶出されたタンパク質が
増加する。また一部のタンパク質は 280nmの紫外部
吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解さ
れた。しかしゲルロ過では丸大豆と粉末大豆の違いを
明らかにする乙とは出来なかった。
(
2
)
蒸煮大豆,発酵 2および 4時間の水溶性タンパク
質は分子量 100,
0
0
0
'
"
'
'
1
0,
0
0
0の広い範囲に分布し,発
0
0
0
'
"
'
'
1
0,
000の範囲に分布する。発酵
酵 6時間では 40,
0
0
0
近くのものは減少し,
時間の経過とともに分子量40,
20,
0
0
0
'
"
'
'
1
0,
000の範囲のポリペプチドが増加した。ま
た丸大豆の発酵20時間と粉末大豆の発酵 1
4
時間のポリ
ペプチドの分子量分布はほぼ同じであった。
以上の結果より,大立の形態の違いが納豆菌の繁殖
に影響を与え,表面積の大きい粉末大豆においてフ。ロ
テアーゼ、の活性も盛んとなってタンパク質の水解が速
くすすみ,発酵 14時間で納豆になることが明らかとな
っf
こ
。
終りに試料大豆を御提供いただいた大阪ガス株式会
社に深く感謝致します。
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