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貝殻中に含まれる不溶性蛋白質のアミノ酸組成について

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貝殻中に含まれる不溶性蛋白質のアミノ酸組成について
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貝殻中に含まれる不溶性蛋白質のアミノ酸組成について
川原, 鳳策; 米田, 義昭
北海道大學水産學部研究彙報 = BULLETIN OF THE
FACULTY OF FISHERIES HOKKAIDO UNIVERSITY,
19(1): 52-61
1968-05
DOI
Doc URL
http://hdl.handle.net/2115/23347
Right
Type
bulletin
Additional
Information
File
Information
19(1)_P52-61.pdf
Instructions for use
Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
貝殻中に含まれる不溶性蛋白質のアミ/酸組成について
川原 鳳策事・米田
義昭市
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句の異なる 2種類の結晶構造が知られおり,
貝殻を構成する炭酸カルシウムにはCa
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著者は貝殻の形成機構を明らかにする端緒としていろいろの貝殻中の有機成分を検索して,種によ
る特異性,結晶形の異なる種の不溶性蛋白質であるコンキオリン構成アミノ酸の組成上の変化および
貝殻の寸国体での変化(貝殻の内層,外層,腹縁部分,関殻筋痕および弾帯など)を明らかにしよう
と試みた。
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貝殻形成には有機基質のコンキオ事ンがある種の役割を持ワと言われている!),~>,
すなわち外套被
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別に存在している炭酸イオンと結合する。有機基質は炭酸カルシウムに先行して構造単位を決め,乙
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をもっ貝殻とでは異な勺ている ζ とが推測される。
ζ のような観点より有機基貨の構造や化学的性質
に関して研究が行われ,以下に述べるように多くの成果が報告ぎれている。 R
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コンキオリンのアミノ酸を定量し,結晶構造の変化を構成ア Eノ酸と関連きぜて検討を加えた。
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>,のちは真珠に関する一連の生化学的研究の中で,コンキオリンを酢酸などの化学処理によっ
て分劃して各分劃区分の末端アミノ酸を検討し, きちに真珠および真珠貝のコンキオリン構成アミノ
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入れるという i
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殻中の有機基質の進化と貝の分類学上の適用を目的とした比較生化学的研究を行った d Wa
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1::関する一連の研究を行い,数種の貝殻の鉱物化組織と非鉱物組織中の蛋白
質のアミノ酸組成をしらぺた。
本報はホタテガイ, ウバガイおよびクロアワピ(エゾアワピ)三種貝殻より得たヨンキオンのアミ
ノ酸組成,全窒素およびアミノ糖の定量を試み若干の知見を得たのでその結果を報告する e
材料および方法
本研究に用いた試料はホタテガイ P
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ワピは函館市山背泊沖にで採取した。
信料の翻桜一貝殻を流水中で十分水洗して附着している軟組織. 角質層およびぞの他の異質部分を
完全に除去した後風乾する。試料はハンドクラッシャー, 季L
鉢などを用いてそれぞれ Table1 1
1
:
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す部分11:分けた。
コンキオリンー磁製乳鉢で粉砕した貝殻および弾帯の一定量をとり,苛性ソーダで pH5.2~5.3 ζ
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調節した 0.25MEDT
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2Naを加えて脱灰した。脱灰中 1
1::有機基質の変質を防ぐためトルエンを少
量加えた。脱灰中は時々撹伴して泡の発生が無くなると,逐次 EDTA溶液を加えて脱灰を完全に行
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) して不溶性残査を分荷量し,水で 3回繰り返して
わせた。脱灰終了後遠心分離 (
水洗して酸を除きシリカゲル入りデシケーター中で乾燥した。以後の実験にはこの乾燥粉末を用いた。
X 線回折京料一分離した試料を磁製乳鉢, メノウ乳鉢で粉砕し, 1
0
0メッシュの飾を通過したもの
(
.少量の水に懸濁させて塗布し,乾燥後 X 線回折を
を集めた。 乙の粉末 20mgをスライドガラス板 1
行った。
分析方法
アミノ厳組員覧ーコンキオリン lOmg を精秤してアンプルに入れ, 6N塩酸 1ml を加えた後封管レ,
1
1
00C の電気恒温器中で 24時間加熱して加水分解を行った。分解終了後不溶性残溢を遠心分離して
除乞上澄を硫酸デシケ{ター中で減庄乾闘した.乾間後水 1~2 滴を加えて溶かし,ふたたびデシケ
ーター中で乾燥する。
ζ の操作を
3回繰り返して塩酸を可及的除去した。分析に際レては pH2
.
2の
0.2Mークエン酸緩衡液に溶かして 10ml とし.この内の 1~2血l をアミノ酸分析に供した e 分新はア
ミノ酸自動分析装置(日立製作所K.K. KLA-IIおよび KLA-III型)を用い匂i
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法 12) を用いた。
金量自民一貝殻,弾帯中のコンキオリンの全窒素量はミクロケルダー Jレ法に従って定量した。
アミノ槍ーコンキオリン 20mg を 4N塩酸で 1
100C, 9時間加水分解した。分解条件については
いろいろ検討した結果この条件下で加水分解を行うのが最適で, その後減圧乾固い次いで一定量の
水に溶かして稀釈し Elson-Morg
佃 1
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) によって比色定量した。
結 果
1
. X 績回折による員般結晶構造
貝殻および弾帯の X線による結晶構造の回折結果は Fig.l I
r.示す通りである。ホタテガイの腹縁
部は C
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eのみより成るが,閉殻筋痕および前・后耳には A
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eの最強ピークを示す反射角である乙とにより判定し
た。弾帯は貝殻部分 I
r.比べると鉱物化が顕著でなく,結晶構造の同定がむずかしかったので,次亜塩
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e を示した
素酸ナトリウムによって有機物を分解した後 X 線回折を行った。結晶構造は Arag
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)。ウバガイについては貝殻の各部分や弾帯のいづれも A
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イの弾帯部分もホタテガイのそれと同様に次亜塩素酸ナトリウム処理を行った。エゾアワピは A
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40 の C
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にのみ検出された。
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i
n
.
。
- 5
5-
[XIX,1
,北大水産業報
2
. 貝般および弾帯部分のコンキオリンのアミノ厳組成
T
r
y
. と Ammonia を除く)を 1000 とし,各アミノ酸
塩酸加水分解物の構成アミノ酸の全残基数 (
の残基の g数をもって示した。
ホタテガイーホタテガイ貝殻コンキオリンのアミノ酸組成の大きな特徴としては, As
p
.が多量に含
まれていて全体の約 3096 以上を占めている。次いでSer. は 18~2396 , G
l
y
.が 20-2596 を占め,
ζ れら
3種のアミノ酸で全残基数の約 7096 を占めている。弾帯部分は貝殻のアミノ酸組成と比較す
ると大きな差異が認められる。貝殻コンキオリンの主成分である A
s
p
.とS
e
r
. がわずか 5 696 を
可
y
. が約 5096 に増加し,
占めるに過ぎなドのに対しGl
さらに貝殻では痕跡程度しか含まれていない
Me
t
.
と CySOsHの 2種のいわゆる硫黄含有アミノ酸が著しく増加している。一方塩基性ア Eノ酸
区分では貝殻,弾帯共に L
y
s
. が主成分であるが,量的にみると弾帯の方が少量であった。
s
p
. であり,全体の 43、4696 を占
ウバガイー貝殻コンキオリンの主成分はホタテガイと同様 K A
r
.とG
l
y
. は比較的少ない傾向であるが P
r
o
.,
めていて量的にはホタテガイよりむしろ多い。一方Se
L
e
u
.,l
1
e
u
.,T
y
r
. および P
h
e
. がホタテガイよりも多い。特に芳香族アミノ酸の T
y
r
. とPh
e
. が多
量に含まれているのが特徴で,両アミノ酸の合計はホタテガイの約 3倍 K も達した。
弾帯部分は G
l
y
.(
約4
8
9
6
),M
e
t
.(
約 2396) が著るしく多く含まれている事, Cy
SusH(約 1596) も
多量にあり硫黄含有アミノ酸が多い傾向である事,
さらに塩基性アミノ酸区分が減少している点はホ
タテガイ弾帯部分の持っている特徴とよく一致している。
ヱゾアワビー乙の貝殻は二枚貝のように形態的な特徴から分割できなかったので,本実験では生長
T晶,b
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6
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2.5
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1
3
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+
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3.9
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3
.
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.
2
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4
.
3
)
2.3
4
4
.
9
- 56ー
十
1
9
6
8
]
川原・米田: 貝殻中の不溶性蛋白質
端辺,中央部の 2つの部分に分けてみた。
約 2
5
9
6
) であり,次いて G
l
y
.,A
l
a
.,S
e
r
. および Arg.
構成アミノ酸をみると,主成分が Asp. (
が多量であった。ホタテガイおよびウパガイと比較すると Gly.,A
l
a
.,Va
,
.
l Leu.および 1
1
釦.のい
わゆる中性アミノ酸が多量に含まれており,酸性アミノ酸のAs
p
. が減少している
ζ と,塩基性アミ
ノ酸区分の Lys. が少なし Arg. が増加している乙とが特徴である。
アミノ種,全竃察および灰分
貝殻部分と二枚尽の弾帯のアミノ糖,全窒素量および灰分をしらぺ f
こ。貝殻は一個体全体を試料と
してコンキオリンを調製した。弾帯は 20~30 個体より得た試料よりコンキオリンそ調製した。結果
を Table3Ir.示した。アミノ糖定量の際,試料の酸加水分解条件をアワピコンキオリンを用いて検討
した。塩酸濃度を 6規定と 4規定とし,試料 20mg Ir.対してそれぞれ 2ml 争加え, 1
l0oCで 3,
6,
9,
12および 15時間封管中で加水分解したものの 50倍稀釈液を Elson-Morgan法 1
とより比色定量し
た (
F
i
g
.2
)。
コシキオリン中のアミノ!糖含有量は全蜜棄に対するグルコザ Eン態窒棄の割合でもって示した。全
窒素量はコンキオリン 10mgをケルダールフラスコ中で硫酸分解したのち常法適り行った。分析は繰
り返し 3回行い,その平均値をとった。二枚貝の貝殻試料の全窒素量が弾帯とアワピ貝殻に比しでか
なり低い値を示した。灰分は試料 1伺 mg について重量分析した結果を示したが,二枚貝の貝殻部分
)。
ではいちじるしく多量に認められた (Table3
約 四c
t
u
r
a
lu
n
i
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s of色hrees
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阻
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-57 -
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・
考 察
貝殻の中に存在する有機基質が殻の鉱物化にある役割を持っと考えられているが, ζ れが結晶の同
質異像,配向,さらに貝殻の形態を左右するか否か, もしとれがその一因子であると考えるならばそ
れが有機基質のどのような構造の差異に基くものか, ζ れらの点について明らかにする必要がある。
現段階では無機質の鉱物化がいかなる有機基質の構造に依存しているか明確でないので,貝殻の同質
異像を調節する生物学的因子をコンキオリンの構成アミノ酸の差異より其の手懸りを見出すととは必
ずしも容易な ζ とではない。 しかし有機基質コンキオリンのアミノ酸組成の検索は技術的に比較的容
易に行いうるので,乙の方向より上述の重要な問題 1
1:一歩接近する手段として有効であろうと恩われ
l
y
. とT
y
r
. の二種類のアミノ酸がCalc
i
t
eとAragoni.
t
eの閣で相違のある
る
。 Rocheらめによれば G
一時一
1
9
6
8
]
川原・米田: 貝殻中の不溶性蛋白質
ことを報告しており, T
a
r
叫切ら吟の真珠貝の研究においてもPhe.と P
r
o
. が真珠層に少く, A
1
a
.が
多量Ii::存在する
ζ とを述ぺ,両結晶構造において構成アミノ酸に顕著な相違の存在することを示唆し
ている。アミノ酸をグループ別にまとめて比較すると (
F
i
g
.3
),Ca1
c
i
t
eより成るホタテ貝殻と Arag
o
n
It
eよる成るエゾアワピとウバガイ貝殻コンキオリンの組成上の変化は,
オキシアミノ酸が顕著に多
く含まれ (2~4 倍),芳香族アミノ酸が後者 f r.多くまれている (4~5 倍)。貝の種属相互聞の変化はアミ
ノ酸全般に亘って認められるが,特にエゾアワピにおいて中性アミノ酸と塩基性アミノ酸のAr
g・がい
ちじく多い。ウバガイは芳香族アミノ酸,硫黄含有アミノ酸が多く含まれ,中性アミノ酸とオキシアミ
ノ酸が少ない@ホタテガイはオキシアミノ酸が多く,芳香族アミノ酸,塩基性アミノ酸,硫黄含有アミノ
n!'>は構成アミノ酸の中で酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の含有比に着
酸が少ない傾向であった。 Ha
目して,
ζ の比が結晶構造の肉質異像と何らかの関係がある乙とを示唆した。
F
i
g
.
3K見られるように
乙の比は結晶構造によって必ずしも特異的な値を示さなった。たとえば二枚貝の二種類では,ホタテ
.
6
8,ウバガイが 6
.
4
7であるが,ウパガイと同じくAra
g
∞i
t
eより成るエゾアワピが 2
.
5
8とい
ガイが 5
う低い値を示した。 乙の酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の比は結晶形の同質異像を説明する典型的な
値を示すものではなく, むしろ種属聞の蛋白基質の特異性を示す上 f
r.重要な意味をもっ可能性がある。
弾帯部分の X線回折による結晶形の同定には次亜塩素酸ナトリウム処理により有機質を除去したも
a
g
∞
,i
t
eを示した。 S
t
e
n
z
e
P
O
)はカキ貝
のについて行いホタテガイおよびウパガイ共に結晶構造はAr
r
a
g
o
n
i
t
e より出来ている
の弾帯部分が A
X線回折により明らかにし, Hareは M
y
t
i
1
u
sの靭
a
g
ぽl
i
t
eであることを報告したが, ここでも二種類の二枚貝の弾帯が Arag
∞i
t
e
帯の結晶が同じくAr
∞
6
w
w
ζ とを
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600
600
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400
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I
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-59:、ー
[XIX,1
北大水産業報
結晶を有する ζ とを明らかにした。アミノ酸組成は貝殻部分と比較すると全般的 1
<
:
:大きな相違を示し
As
p
.,S
e
r
.
,G
l
y
. の変化が大きい ζ と
, M
e
t
. などの硫黄含有アミノ酸の著るしい増加が貝殻コンキオ
相違であった。弾帯の蛋白基質の殻のそれとは全く異質の性質を有するものと推測さ
リンとの大きとt
れる。特 1
<
:
:硫黄含有アミノ酸の CySOsHがいちじるしく滑加している ζ とは蛋白質の立体構造 K何
らかの変化があるものと考えれる。
全窒素量,アミノ!糖および灰分量の測定結果では殻と弾帯,種属商,結晶形の違いによる変動が認
5
9
6 のほぼ一致した値を示したが,二枚貝の値はとれ
められる。全蜜棄は弾帯とエゾアワピ貝般で 1
より若干低い値であり, 6
.
2
5を乗じた蛋白質の概算健はコンキオリンの約 9
4-9696 に対して,二枚
貝の殻では 66~7896 を占めるに過ぎない。一方灰分量は二枚貝の殻が大きな値を示し (11~1896) ,
弾帯とエゾアワピ貝殻は 0
.
5
2
.
5
9
6 の範囲であった。灰分量の変化が蛋白基質と結合した無機イオ
ンの存在を示すものなのか否かは,灰分の化学分析を行っていないので明白に述べる乙とができない。
<
:
:対する割合は二枚貝よりも巻貝の方が高い値を示し, Arag
∞iteより成る殻中
アミノ糖の全窒素量 1
のアミノ糖はCa
l
c
i
t
eのものよりも多量に含まれている。アミノ糖の同定はアワピコンキオリンにつ
∞∞m
阿 保 5 OX
8,2 4
いて,イオン交換クロマトグラフィー (D
ーパークロマトグラフィーで定性分析した結果,
匂
h,H 型)を行い,溶出区分をペ
イオン交換による溶出位置,ペーパークロマトグラ
ム上の Rf値よりグルコサミンを確認した。他の溶出区分より 3ケの小さいピークを認めたが,乙れ
らについてはさらに詳しく検討を加えてから報告したい。アワピコンキオリン中のアミノ糖中のグル
コザミンの含有比は概算で約 8
0
9
6 を占めて居り,グルコサミンがアミノ糠の主成分である。
要 約
三種類の貝殻(ホタテガイ[IJ
,ウバガイ口I],およびエゾアワピ [
I
I
I
J
) の結晶構造および有機
基質コンキオリンの化学成分を検討し次の結果を得た。
(
1
) X 線廻折 l
とより貝殻結晶構造をしらべ, (1)はCal
c
i
t
e
,(II)および (
I
H
) はAr
a
g
o
n
i
t
e結晶
r
a
g
o
n
i
t
e結晶形を示した。
形を示した。二種の二枚貝(I)および(II)の弾帯は A
(
2
) 貝殻コンキオリンの構成アミノ酸は貝殻の結晶形の差異による変動がオキシアミノ酸と芳香
族アミノ酸 K認められる。すなわち C
a
l
c
i
t
e型の貝般は A
r
a
g
o
n
i
t
e型のものに比較してオキシアミノ
酸 (
S
e
r
.,Thr.) が 2~4 倍量多く含くまれてるいるが,芳香族アミノ酸 (Tyr. , Phe) は 1/4~1I5 程
度であった。
(
3
) 種属関の差異は(I)がオキシアミノ酸を多量に含み,芳香族アミノ酸が少量である。(II)は芳
香族アミノ酸,イミノ酸.酸性アミノ酸を比較的多量 K含み,中性ア占ノ酸が少量である。(I1I)は中
性アミノ酸と塩基性アミノ酸の A
rg. が多い傾向であった。
(
4
) 弾帯のアミノ酸組成は貝殻のそれとは全般的にいちじるしい差異がある。特に G
l
y
.とM
e
t
.
の含有量がいちじるしく多く,一方貝殻部分の主成分である A
s
p
. が減少している。
(
5
) 塩基性アミノ酸に対する酸性アミノ酸の比は結晶の同質異像との関速において意味を有する
値を示きず,種属聞で大きな変動を示した。
(
6
) アミノ糖の含有量は A
r
a
g
o
n
i
t
eの貝殻に多く含まれている傾向を示し,特に (
I
I
I
)においてそ
の含有量が顕著であった。
' 射 辞
本研究遂究行にあたりアミノ酸自動分析装置使用の便宜を与えてぐだされた農学部農産物利用学研
究室,小幡弥太郎教授ならびに当学節水産食品化学第二研究室,村田喜一教授,分析装置使用に際し
どいた大石圭一博士ならびに奥村彩子助手に対し厚く感謝の意を表する。尚研究費の一部は
助言いた T
著者の一人(川原) 1
<
:
:与えられた昭和 4
1年度科学研究費補助金によった。
-00-
J
1
9
6
8
j
川原・米田: 貝般中の不溶性蛋白質
文 献
1
) ジョセフ・ストルコウスキー (
1
9
6
0
)
. カルシウムと生命(松岡,八島訳),白水社
2
) Glimcher
,M.J.(
1
9
6
0
)
. Calcmcation i
nB
i
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l
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g
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l Systems,Ame
l
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.,421-487,e
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.
.,Ranson,G
.,andE
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n,M.(
1
9
5
1
)
. C抑 J
t
t
.r
e
n
d
.S
o
c
.b
i
o
l
.,145,
3
) Roche,J
1
4
7
4
.
.,Hatano,H.,andSuzue,G
.(
1
9
6
0
)
. ]
.B
i
o
c
h
e
m
.,47,1
1
7
.
4
) Tanaka,S
.,Hatano,H.,回d I
t
a随 ka,O
.(
1
9
6
0
)
. B
u
l
l
. Chem. S
o
c
. ]at,33,5
4
3
.
5
) Tanaka,S
6
) Watabe,N.,andWilbur,K.M.(
1
9
6
0
)
. Nature,188,3
3
4
.
7
) Hare,P
.E.(
1
9
6
3
)
. S
c
i
e
n
c
e,1
3
9,No.3
5
5
1,2
1
6
.
.T
.,andLove,S
.(
1
9
6
5
)
. Nature,205,8
7
6
.
8
) Degens,E
1
9
6
6
)
. Bull.]
a
t
.S
o
c
.S
c
i
.F
i
s
h
.,32,2
9
5
.
9
) Wada,K.(
1
0
) Wada
,K.(1966). i
b
i
d
. 32,3
0
4
.
1
1
) Spackman
,D.H.,S
t
e
i
n,W.H.,andMoore,S
.(
1
9
5
8
)
. A
n
a
l
. Che
例
.
, 30,1
1
9
0
.
1
9
6
4
)
. アミノ酸自動分析法,化学問人
1
2
) 波多野博行 (
1
3
) Elson,L
.A.,阻d Morgan
,W.T
.J
.(
1
9
3
3
)
. B
i
o
c
h
e
m
.]
.
, 27
,1
8
2
4
.
1
4
) 泉辺彦 (
1
鮒0
)
. 蛋白質・核酸・酵素, 5
,4
3
.
1
5
) S
t
e
n
z
e
l
,H.B
.(
1
9
6
3
)
. S
c
i
e
錦c
e,142,No.3589,2
3
2
.
- 6
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