16MB - 地球環境産業技術研究機構

目
次
第Ⅰ編
概 要 ······························································ 1
第１章
目 的 ······························································ 1
第２章
２．１
２．１．１
２．１．２
２．１．３
全 体 計 画 ··························································
全 体 計 画 の 概 要 ···················································
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価 ·································
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価 ····························
海 洋 隔 離 技 術 の 動 向 調 査 ··········································
２．２
２．２．１
２．２．２
２．２．３
２．２．４
２．２．５
２．２．６
２．２．７
２．２．８
２．２．９
２．２．１０
２．２．１１
平 成 19 年 度 実 施 内 容 ············································· 3
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価 ································· 3
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価 ···························· 3
海 洋 隔 離 技 術 の 動 向 調 査 ·········································· 3
研 究 実 施 場 所 ····················································· 5
実 施 期 間 ·························································· 5
実 施 計 画 日 程 ····················································· 6
研 究 組 織 及 び 管 理 体 制 ············································ 7
研 究 者 氏 名 及 び 人 員 （ 役 職 、 研 究 項 目 別 担 当 ） ··················· 8
経 理 担 当 者 氏 名 及 び 業 務 管 理 者 氏 名 ······························ 10
他 か ら の 指 導 ･協 力 者 名 及 び 指 導 ・ 協 力 事 項 ······················ 10
そ の 他 ··························································· 11
第３章
３．１
３．１．１
３．１．２
３．１．３
平 成 19 年 度 事 業 の 成 果 概 要 ·····································
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価 ································
生 物 影 響 評 価 手 法 の 開 発 ·········································
実 海 域 生 物 影 響 デ ー タ の 収 集 ·····································
深 海 生 物 の CO 2 影 響 研 究 ········································
３．２
３．２．１
３．２．２
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価 ··························· 17
CO 2 挙 動 の 観 測 ・ 予 測 技 術 の 開 発 ································ 17
海 洋 隔 離 の 可 能 性 評 価 ··········································· 19
３．３
３．３．１
３．３．２
海 洋 隔 離 技 術 の 動 向 調 査 ········································· 22
国 際 ネ ッ ト ワ ー ク の 構 築 ········································· 22
理 解 促 進 基 盤 の 整 備 ·············································· 23
３．４
研 究 発 表 ・ 特 許 出 願 ·············································· 24
第４章
４．１
今 後 の 課 題 ······················································· 26
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価 に 関 す る 課 題 ·················· 26
４．２
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価 に 関 す る 課 題 ············· 27
４．３
海 洋 隔 離 技 術 の 動 向 調 査 に 関 す る 課 題 ··························· 28
i
2
2
2
2
2
12
12
12
12
14
第Ⅱ編
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価 ································ 31
第１章
１．１
１．２
１．２．１
１．２．２
１．２．３
研 究 課 題 と 目 標 ··················································
は じ め に ·························································
目 標 ·····························································
生 物 影 響 評 価 手 法 の 開 発 ·········································
実 海 域 生 物 影 響 デ ー タ の 収 集 ·····································
深 海 生 物 の CO 2 影 響 研 究 ········································
第２章
２．１
２．１．１
生 物 影 響 評 価 手 法 の 開 発 ········································· 35
生 態 系 モ デ ル の 開 発 ·············································· 35
生 態 系 モ デ ル の 高 精 度 化 ········································· 35
第３章
３．１
３．１．１
実 海 域 生 物 影 響 デ ー タ の 収 集 ····································· 58
生 物 影 響 海 洋 実 験 ················································ 58
ペ ラ ジ ッ ク チ ャ ン バ ー の 開 発 ····································· 58
３．２
３．２．１
海 洋 現 場 実 験 想 定 海 域 の 現 況 ····································· 71
海 洋 観 測 に よ る 現 況 調 査 ········································· 71
第４章
４．１
４．１．１
４．１．２
４．１．３
４．１．４
深 海 生 物 の CO 2 影 響 研 究 ········································ 90
深 海 生 態 系 の 研 究 ················································ 90
カ イ ア シ 類 の 捕 食 構 造 解 析 ······································· 90
生 物 パ ラ メ ー タ へ の 影 響 実 験 ···································· 104
沈 降 フ ラ ッ ク ス へ の 影 響 ········································ 118
分 子 微 生 物 学 的 手 法 に よ る 多 様 性 解 析 ·························· 136
４．２
４．２．１
４．２．２
CO 2 影 響 の 研 究 ················································· 183
模 擬 深 海 環 境 下 に お け る 深 海 生 物 の CO 2 影 響 実 験 ··············· 183
深 海 微 生 物 群 集 に 対 す る 脱 窒 関 連 遺 伝 子 検 出 技 術 の 適 用 性 ······ 197
第５章
ま と め と 考 察 ··················································· 212
第６章
今 後 の 課 題 ······················································ 214
第Ⅲ編
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価 ·························· 217
第１章
１．１
１．２
１．２．１
１．２．２
研 究 課 題 と 目 標 ················································· 217
は じ め に ························································ 217
目 標 ····························································· 218
CO 2 挙 動 の 観 測 ・ 予 測 技 術 の 開 発 ······························· 218
海 洋 隔 離 の 可 能 性 評 価 ·········································· 220
第２章
２．１
２．１．１
２．１．２
CO 2 挙 動 の 観 測 ・ 予 測 技 術 の 開 発 ·······························
海 洋 中 CO 2 挙 動 観 測 技 術 の 開 発 ·································
天 然 CO 2 発 生 海 域 の 観 測 ·······································
統 合 モ ニ タ リ ン グ シ ス テ ム の 設 計 ·······························
２．２
２．２．１
２．２．２
２．２．３
２．２．４
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 技 術 の 開 発 ································· 267
中 規 模 海 洋 モ デ ル 開 発 ·········································· 267
広 域 海 洋 モ デ ル 開 発 ············································· 276
CO 2 液 滴 群 の 溶 解 ・ 拡 散 挙 動 予 測 ······························· 286
CO 2 液 滴 の 溶 解 挙 動 予 測 技 術 の 開 発 ····························· 294
ii
31
31
31
31
32
32
222
222
222
241
第３章
３．１
３．１．１
３．１．２
海 洋 隔 離 の 可 能 性 評 価 ·········································· 315
海 洋 隔 離 の ケ ー ス ス タ デ ィ ······································ 315
海 洋 隔 離 ケ ー ス ス タ デ ィ ········································ 315
小 規 模 海 洋 隔 離 実 験 ············································· 340
３．２
３．２．１
３．２．２
３．２．３
全 球 モ デ ル に よ る 海 洋 隔 離 予 測 ·································
低 解 像 度 モ デ ル に よ る 海 洋 酸 性 化 に 対 す る 海 洋 隔 離 の 有 効 性 ····
評価
大 気 海 洋 全 球 モ デ ル に よ る CO 2 隔 離 予 測 計 算 ···················
全 球 BOX モ デ ル に よ る CO 2 隔 離 予 測 計 算 ······················
第４章
ま と め と 考 察 ··················································· 439
第５章
今 後 の 課 題 ······················································ 445
第Ⅳ編
海 洋 隔 離 技 術 の 動 向 調 査 ········································ 447
第１章
１．１
１．２
１．２．１
１．２．２
研 究 課 題 と 目 標 ················································· 447
は じ め に ························································ 447
目 標 ····························································· 447
国 際 ネ ッ ト ワ ー ク の 構 築 ········································ 447
理 解 促 進 基 盤 の 整 備 ············································· 448
第２章
２．１
２．１．１
２．１．２
２．１．３
国 際 ネ ッ ト ワ ー ク の 構 築 ········································ 449
国 際 連 携 検 討 ワ ー キ ン グ グ ル ー プ の 活 動 ························ 449
活 動 概 要 ························································ 449
ロ ン ド ン 条 約 対 応 ··············································· 455
国 際 ネ ッ ト ワ ー ク 構 築 と PO の 進 め 方 ··························· 465
２．２
２．２．１
２．２．２
２．２．３
２．２．４
２．２．５
国 際 法 ・ 国 内 法 の 動 向 ·········································· 470
概 要 ····························································· 470
OSPAR 条 約 ···················································· 471
ロ ン ド ン 条 約 ··················································· 489
海 洋 汚 染 防 止 法 ················································· 510
ロ ン ド ン 条 約 96 年 議 定 書 に お け る CO 2 海 洋 隔 離 実 験 の 実 現 ···· 514
可能性の考察
２．３
２．３．１
２．３．２
海 外 研 究 機 関 の 動 向 ············································· 530
概 要 ····························································· 530
海 外 研 究 機 関 の ヒ ア リ ン グ 結 果 ································· 530
第３章
３．１
３．１．１
３．１．２
理 解 促 進 基 盤 の 整 備 ············································· 535
海 洋 隔 離 プ ロ ジ ェ ク ト の 情 報 発 信 ······························· 535
海 洋 隔 離 プ ロ ジ ェ ク ト Web サ イ ト ······························ 535
Web フ ォ ー ラ ム の 基 盤 整 備 ····································· 538
第４章
ま と め と 考 察 ··················································· 542
第５章
今 後 の 課 題 ······················································ 544
iii
390
390
413
427
概要
１．CO 2 海洋隔離に伴う生物影響評価
生物影響評価手法の開発として、中深層生態系モデルの３次元化を行い、生物影響
評価については、パラメータ測定のためにカイアシ類の呼吸速度の影響実験を実施した。
また、実海域生物影響データ収集を目的にしたペラジックチャンバーシステムの開発
では、システムを設計し、制御部とチャンバーを製作し、テスト海域における海洋実
験では、ペラジックチャンバーの動作確認試験及び曝露予備実験を実施した。テスト
海域における海洋観測では、チャンバー実験海域のバックグラウンド環境を測定した。
また、深海生物の CO 2 影響研究として、捕食構造解析では沈降粒子を考慮した食物連
鎖構造の解析を、沈降フラックスの凝集性解析では沈降粒子の凝集性実験を行ったほ
か、生物多様性への CO 2 影響評価手法の開発では N 2 O や窒素循環に関わる DNA 解
析手法を開発した。さらに、外洋中深層海水中における窒素循環に関わる遺伝子群の
構造解析の研究では研究実施機関を公募し、CO 2 影響評価の新たな手法開発を行った。
２．海洋中 CO 2 挙動予測と隔離可能性評価
天然 CO 2 発生海域の観測として沖縄トラフ海域での観測機器試験、鹿児島湾内の天
然 CO 2 発生海域調査（pH 分布、潮流観測）を実施し、挙動予測モデルの開発を行っ
た。また、海洋隔離の実適用ケース及び海洋実験ケースについて各々の実現可能性を
評価したほか、海洋中 CO 2 安定化予測のため全球モデルの開発や酸性化予測計算を行
った。
３．海洋隔離技術の動向調査
海洋隔離に対する理解促進を図るため、HP による情報発信や Web フォーラムを
開催できるソフトを整備した。また、国際ネットワークの構築を目指して、ロンドン
条約会合等に係わる国内外の動向調査、海洋隔離に関するシンポジウムの提案、ロン
ドン条約科学会合サイエンスデー発表準備等を行った。
－1－
Abstracts
1. Studies on Biological Impact Assessment
In the development of biological impact assessment technology, the ecosystem model of
deep ocean was improved for calculation of three dimensional domain, and respiration rate
of copepods was measured to determine the impact of CO 2 exposure by laboratory
experiment. In the development of pelagic chamber (PC) system for the purpose of
collecting data on biological impact in the sea field, the system was designed and its
control unit and chamber unit were assembled. In the ocean experiment, the operation
capabilities of the PC system were adequately confirmed in the testing field and
preliminary exposure experiment was implemented. In the field observation, background
environment of the testing field was obtained during observation cruise.
In studies of CO 2 impact assessment on deep-sea organisms, various efforts were made
such as analysis of food-chain structure in consideration of settling particles in the sea
waters and cohesive analysis of settling particles in the sea waters. Meanwhile, in the
development of CO 2 impact assessment methodology on biodiversity, DNA analysis was
introduced to elucidate N 2 O and Nitrogen cycle. As another novel approach, studies on
gene structural analysis affected by circulation of Nitrogen in deep layer at open sea were
focused on and some implementing institution was publicly invited participation in this
project.
2. Prediction of CO 2 behavior in the ocean and feasibility study of CO2 Ocean
Sequestration
As part of studies under this project, observation survey of naturally CO 2 spouted sea area was
conducted and CO 2 behavior prediction model was improved in this fiscal year. A newly
developed observation equipment was tested in Okinawa trough waters and also observation
cruise in Kagoshima Bay was conducted to investigate distribution of pH range and to obtain
numerical data of tidal current. Furthermore, feasibility studies both on actual application case
and ocean experiment one were respectively carried out in parallel with development of global
model and calculation of acidification of ocean surface to predict CO 2 stabilization in the sea
waters.
3. Trend survey on CO2 Ocean Sequestration technology
With a view to foster a further social acceptance of CO 2 Ocean Sequestration, project activities
and relevant information were updated and released from project website. A new software for
－2－
web forum system was also introduced into this project. Substantial international network was
set up through the international and domestic survey on London Convention, suggestions for a
symposium on CO 2 Ocean Sequestration and preparation for reporting at Science Day of
Scientific Group Meeting of the London Convention.
－3－
第Ⅰ編
概要
第１章
目的
温室効果ガスである二酸化炭素（以下CO 2 ）の大気中濃度は、化石燃料消費の増大に伴
って増加を続けており、地球温暖化を抑制するためにはCO 2 の大気への排出抑制策の検討
が急務である。一方、安定的に一定の経済成長を維持していくためには、今後も化石燃料
の消費が避けられないものと考えられる。こうした中で、海洋の持つ膨大なCO 2 吸収能力
を有効に活用し、CO 2 を人為的に海洋中層に放出溶解させ、大気から隔離する海洋隔離技
術は、各種のCO 2 の隔離・固定技術の中でもCO 2 削減可能量等の面で有望な技術の一つで
ある。
海洋は、CO 2 の最大の吸収源としての機能を有しており、現在の地球上におけるCO 2 の
存在量は、大気中約750 Ｇ（Ｇ：ギガ＝10億）㌧、陸上約2,200 Ｇ㌧、海洋中約40,000 Ｇ
㌧と試算されている。大気中の CO 2 は数万年間の時間スケールで、概ねこのような比率で
大気、海洋、地上に配分され、安定化するものと考えられる。産業革命以降の約200年間
に大気中に放出された化石燃料消費に由来するCO 2 は、海洋等への移行が追いつかず、大
気中のCO 2 濃度のみが 急激に上昇してい るの が現状であり、産 業革 命前の大気中の CO 2
濃度が280 ppmであったのに対し、1990年の濃度は360 ppmとなっている。
本事業では、H14年度からH18年度に実施した事業成果を基に、CO 2 の海洋隔離技術に
ついて海洋環境への影響を評価する技術を開発し、国際的な場や学会等における科学的な
認知を高めることを目的とする。そのため、本事業では、①海洋隔離に伴うCO 2 による生
物影響の評価、②海洋中CO 2 の挙動予測等による海洋隔離の可能性評価、③海洋隔離の理
解促進や国際ネットワーク構築等へ向けた動向調査、等を進める。
1
第２章
２．１
全体計画
全体計画の概要
補 助 金 事 業「 二 酸 化 炭 素 固 定 化・有 効 利 用 技 術 等 対 策 事 業 費 補 助 金 」と し て 交 付 決
定 さ れ た 研 究 開 発 テ ー マ「 二 酸 化 炭 素 の 海 洋 隔 離 に 伴 う 環 境 影 響 予 測 技 術 開 発（ 継 続
フ ェ ー ズ ）に つ い て 、５ ヶ 年 の 研 究 開 発 を 進 め て い る が 、本 年 度 は そ の 初 年 度 で あ る 。
上記テーマにおける研究項目は以下のとおり。
（ １ ） CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価
（ ２ ） 海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価
（３）海洋隔離技術の動向調査
以下に、各研究項目の内容を示す。
２．１．１
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価
生 物 影 響 評 価 手 法 を 開 発 す る た め 、生 態 系 モ デ ル の 多 層 化・３ 次 元 化 の 改 良 、モ デ ル
の 高 精 度 化 、CO 2 影 響 解 析 、及 び 、実 適 用 ケ ー ス に お け る 隔 離 想 定 海 域 の 生 物 影 響 評 価
と長期影響予測等を目標に技術開発を行う。また、実海域生物影響データを収集するため、
生 物 影 響 海 洋 実 験 に 必 要 な ペ ラ ジ ッ ク チ ャ ン バ ー の 開 発 、CO 2 影 響 海 洋 実 験 、生 物 影 響
実 験 海 域 の 現 存 量 調 査 、実 験 想 定 海 域 の 観 測 等 を 目 標 に 技 術 開 発 を 行 う 。さ ら に 、深 海
生 物 の CO 2 影 響 を 研 究 す る た め 、深 海 生 態 系 研 究 と CO 2 影 響 研 究 等 を 目 標 に 技 術 開 発 を
行う。
２．１．２
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価
海 洋 中 CO 2 挙 動 観 測 技 術 と CO 2 挙 動 予 測 技 術 を 開 発 す る た め 、曳 航 式 観 測 シ ス テ ム の
開 発 と 天 然 CO 2 発 生 海 域 の 観 測 、及 び 、CO 2 挙 動 予 測 モ デ ル の 開 発 と 海 洋 隔 離 想 定 海 域
の 海 洋 観 測 等 を 目 標 に 技 術 開 発 を 行 う 。ま た 、海 洋 隔 離 の 可 能 性 評 価 を 行 う た め 、実 適
用 ケ ー ス の 検 討 、CO 2 希 釈 溶 解 技 術 の 研 究 、海 洋 実 験 の ケ ー ス ス タ デ ィ 、海 洋 中 CO 2 安
定化予測、海洋隔離サイトの評価等を目標に技術開発を行う。
２．１．３
海洋隔離技術の動向調査
海 洋 隔 離 に 対 す る 理 解 促 進 基 盤 の 整 備 と 国 際 ネ ッ ト ワ ー ク 構 築 の た め 、パ ブ リ ッ ク ア
ウ ト リ ー チ 実 施 、社 会 的 合 意 形 成 の 課 題 調 査 、国 際 的 情 報 交 換 、国 際 的 共 同 研 究 、国 際
的合意形成の課題調査等を目標に海洋隔離技術の動向調査を行う。
2
２．２
平成１９年度実施内容
２．２．１
CO 2 海 洋 隔 離 に 伴 う 生 物 影 響 評 価
（１）生物影響評価手法の開発
１ ） 生 態 系 モ デ ル の 開 発 ： 中 深 層 生 態 系 モ デ ル の 開 発 、 及 び CO 2 影 響 の 感 度 解
析の実施
（２）実海域生物影響データの収集
１）生物影響海洋実験：その場観察用ペラジックチャンバーシステムの開発と
海洋現場実験の実施
２）海洋現場実験想定海域の現況把握：テスト海域における現存量調査の実施
（ ３ ） 深 海 生 物 の CO 2 影 響 研 究
１）深海生態系の研究：カイアシ類の捕食構造解析、生物パラメーターへの影
響実験、沈降フラックス解析、生物多様性解析の実施
２ ）CO 2 影 響 の 研 究：模 擬 深 海 環 境 下 CO 2 影 響 実 験 、及 び 深 海 微 生 物 群 集 へ の
CO 2 影 響 評 価 手 法 の 開 発 の 実 施
２．２．２
海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能 性 評 価
（ １ ） CO 2 挙 動 の 観 測 ・ 予 測 技 術 の 開 発
１ ）海 洋 中 CO 2 挙 動 観 測 技 術 の 開 発：天 然 CO 2 発 生 海 域 の CO 2 分 布 観 測 、統 合 モ
ニタリングシステム設計の実施
２ ） 海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 技 術 の 開 発 ： 中 規 模 CO 2 挙 動 モ デ ル 開 発 、 大 規 模 CO 2
挙 動 モ デ ル 開 発 、CO 2 液 滴 群 の 溶 解・拡 散 挙 動 予 測 、CO 2 液 滴 の 溶 解 挙 動 予
測技術開発の実施
（２）海洋隔離の可能性評価
１ ） 海 洋 隔 離 の ケ ー ス ス タ デ ィ ： CO 2 放 流 量 を 変 え た 場 合 の 海 洋 隔 離 ケ ー ス ス
タディの実施
２）全球モデルによる海洋隔離予測：低解像度モデルによる海洋隔離の海洋酸
性 化 に 対 す る 有 効 性 評 価 、大 気 海 洋 全 球 モ デ ル に よ る CO 2 隔 離 予 測 計 算 、全
球 BOXモ デ ル に よ る CO 2 隔 離 予 測 計 算 の 実 施
２．２．３
海洋隔離技術の動向調査
（１）国際ネットワークの構築
１ ）国 際 連 携 検 討 ワ ー キ ン グ グ ル ー プ の 活 動：ロ ン ド ン 条 約 対 応 方 針 検 討 、PO
の進め方検討の実施
3
２ ）国 際 法・国 内 法 の 動 向：OSPAR条 約・ロ ン ド ン 条 約・海 洋 汚 染 防 止 法 検 討 、
CO 2 海 洋 実 験 の 実 現 可 能 性 検 討 の 実 施
３）海外研究機関の動向：海外研究機関へのヒアリングの実施
（２）理解促進基盤の整備
１ ） 海 洋 隔 離 プ ロ ジ ェ ク ト Webサ イ ト
２ ） Webフ ォ ー ラ ム の 基 盤 整 備
4
２．２．４
研究実施場所
研 究 実 施 場 所 を 表 2.2.4-1に 示 す 。
表 2.2.4-1
(1)
研究実施場所一覧
(3)
CO 2 海 洋 隔 離
プロジェクト
CO 2 貯 留 研 究
グループ
KANSO分 室
(4)
委託研究
京都府木津川市木津川台
9-2
京都府木津川市木津川台
9-2
大阪府大阪市中央区安土町
1-3-5
千 葉 県 柏 市 柏 の 葉 5-1-5
(5)
委託研究
東京都目黒区大岡山2-12-1
(6)
委託研究
札幌市北区北10条西5丁目
(7)
委託研究
長 崎 市 文 教 町 １ -14
(8)
委託研究
京都市左京区北白川追分町
(9)
委託研究
東 京 都 港 区 白 金 台 1-2-37
明治学院大学 法学部 消費情報
環境法学科
(10)
委託研究
茨 城 県 つ く ば 市 並 木 1-2-1
(11)
委託研究
(12)
委託研究
(13)
委託研究
千葉県我孫子市我孫子
1646
千葉県我孫子市我孫子
1646
長 崎 市 深 堀 町 5-717-1
（独）産業技術総合研究 所 エネル
ギー技術研究部門 エネ ルギー
社会システムグループ
（財 ）電 力 中 央 研 究 所 環 境 科 学
研究所 化学環境領域
（財 ）電 力 中 央 研 究 所 環 境 科 学
研究所 物理環境領域
三 菱 重 工 業 （株 ） 長 崎 研 究 所
(2)
２．２．５
実施期間
自
平成１９年４月
１日
至
平成２０年３月３１日
5
（財 ）地 球 環 境 産 業 技 術 研 究 機 構
地球環境産業技術研究所
（財 ）地 球 環 境 産 業 技 術 研 究 機 構
地球環境産業技術研究所
（株 ）環 境 総 合 テ ク ノ ス
東京大 学大 学院 新 領域 創成科 学
研究科 環境システム学専攻
東京工業大学 炭素循環エネル
ギー研究センター
北海道大学大学院 地球 環境科学
研究院 地球圏科学部門
長崎大学 環東シナ海海洋環境
資源研究センター
京都大学大学院 農学研究科
２．２．６
実施計画日程
実 施 計 画 日 程 を 表 2.2.6-1に 示 す 。
表 2.2.6-1
実施計画日程
平 成 19年
年月
項目
４
５
１ ．CO2 海洋隔離に伴う生物影響評価
（１）生物影響評価手法の開発
（ ２ ）実 海 域 生 物 影 響 デ ー タ の 収 集
（ ３ ） 深 海 生 物 の CO 2 影 響 研 究
２ ． 海 洋 中 CO 2 挙 動 予 測 と 隔 離 可 能
性評価
（ １ ） CO 2 挙 動 の 観 測 ・ 予 測 技 術
開発
（２）海洋隔離の可能性評価
３．海洋隔離技術の動向調査
（１）国際ネットワークの構築
（２）理解促進基盤の整備
6
６
７
８
平 成 20年
９ 10 11 12 １
２
３
２．２．７
研究組織及び管理体制
研究組織および管理体制を示す。
理事長
秋山 喜久
事務局長
総務グループ
経理チーム
日高 哲男
グループリーダ
日高 哲男（兼任）
チームリーダ
前田 浩
研究企画グループ
地球環境産業技術研究所
所長
茅 陽一
グループリーダ
岡村 繁寛
CO 2 貯 留 研 究 グ ル ー プ
グループリーダ
村井
重夫
CO 2 海 洋 隔 離 プ ロ ジ ェ ク ト
CO 2 貯 留 研 究 グ ル ー プ
グループリーダ
村井
プロジェクトリーダ
重夫
RITE
責任者
村井 重夫（兼任）
KANSO分 室
西堀 文康
CO 2 海 洋 隔 離 技 術 委 員 会
・生物影響評価分科会
・ CO 2 挙 動 予 測 等 分 科 会
・ 海 洋 隔 離 国 際 連 携 検 討 WG
7
２．２．８
研究者氏名及び人員（役職、研究項目別担当）
（１）(財)地球環境産業技術研究機構
氏名
大隅 多加志
間木 道政
戸高 栄二
三戸 彩絵子
辻
志織
所属
RITE CO2貯留研究ｸﾞﾙｰﾌﾟ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
役職（職名）
主席研究員
主任研究員
主任研究員
研究員
研究員
担当研究課題
プロジェクト全般
海洋隔離技術評価
プロジェクト全般
環境影響評価技術開発
プロジェクト全般
西堀 文康
渡辺 雄二
三郎丸 隆
小牧 博信
石田 洋
後藤 浩一
杉本 智哉
岸
靖之
古澤 一思
関戸 嘉郎
林 正敏
藤井 武史
前田 亘宏
山本 祐也
RITE KANSO分室
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
主任研究員
主任研究員
主任研究員
主任研究員
主任研究員
主任研究員
研究員
研究員
研究員
研究員
研究員
研究員
研究員
研究員
環境影響評価技術開発
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
茅
RITE研究所
所長
全体総括
岡村 繁寛
RITE研究企画グループ
上に同じ
村井 重夫
CO2海洋隔離プロジェクト
ｸﾞﾙｰﾌﾟﾘｰﾀﾞ
兼主席研究員
ﾌﾟﾛｼﾞｪｸﾄﾘｰﾀﾞ
兼主席研究員
主任研究員
研究員
陽一
久松 勝也
森影 有佳里
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
（２）東京大学
氏名
佐藤 徹
丁 世珉
平林 紳一郎
所属
大学院 新領域創成科学研
究科
大学院 工学系研究科
役職（職名）
担当研究課題
CO2海洋隔離に関する中規模海洋
教授
研究員
モデル開発およびロンドン条約対応
助教
（３）東京工業大学
氏名
平井 秀一郎
所属
炭素循環エネルギー研究
センター
役職（職名）
教授
8
担当研究課題
CO2液滴群の溶解・拡散挙動予測
（４）北海道大学
氏名
山中 康裕
増田 良帆
所属
大学院 地球環境科学研究院
上に同じ
役職（職名）
准教授
研究員
担当研究課題
高解像度オフラインモデルを用いた、
CO2海洋隔離の最適条件に関する研究
所属
環東シナ海海洋環境資源
研究センター
役職（職名）
教授
担当研究課題
高圧・低温環境下での魚類のCO2
影響実験
所属
大学院 農学研究科
役職（職名）
助教
担当研究課題
外洋中深層海水中における窒素循
環に関わる遺伝子群の構造解析
所属
役職（職名）
法学部 消費情報環境法学科 教授
担当研究課題
ロンドン条約96年議定書における
CO2海洋隔離実験の実現可能性の考察
（５）長崎大学
氏名
石松 惇
（６）京都大学
氏名
吉永 郁生
（７）明治学院大学
氏名
磯崎 博司
（８）(独)産業技術総合研究所
氏名
西尾 匡弘
所属
エネルギー技術研究部門
エネルギー社会システム
グループ
役職（職名）
ｸﾞﾙｰﾌﾟﾘｰﾀﾞ
担当研究課題
CO2 の海水中への溶解・拡散に関
する数値実験
（９）(財)電力中央研究所
氏名
下島 公紀
仲敷 憲和
所属
環境科学研究所 化学環境領域
環境科学研究所 物理環境領域
役職（職名）
上席研究員
上席研究員
担当研究課題
ナチュラルアナログによる海洋中
液体CO2挙動計測
仲敷 憲和
環境科学研究所 物理環境領域
上席研究員
海洋中CO2濃度の全球予測
役職（職名）
主席研究員
室長
主席研究員
主任研究員
主任研究員
研究員
主席研究員
主席研究員
担当研究課題
CO2海洋隔離のケーススタディおよ
び統合モニタリングシステム設計
（１０）三菱重工業（株）
氏名
南浦 純一
川北 千春
竹内 和久
太田 真
谷垣 信吉
川崎 佐年
井上 俊司
矢野 州芳
所属
長崎研究所
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
上に同じ
船舶・海洋事業本部
上に同じ
9
２．２．９
経理担当者
業務管理者
２．２．１０
経理担当者氏名及び業務管理者氏名
（財）地球環境産業技術研究機構 総務グループ経理チーム
前田 浩
リーダ
（財）地球環境産業技術研究機構 CO2海洋隔離プロジェクト 村井 重夫
リーダ
他からの指導・協力者名及び指導・協力事項
（１）指導・協力者名
なし
（２）指導・協力事項
なし
10
２．２．１１
その他
（１）技術委員会
委員長
委員
委員
委員
（独）産業技術総合研究所 エネルギー技術研究部門
東京大学大学院 新領域創成科学研究科 環境システム学専攻
東京工業大学 炭素循環エネルギー研究センター
京都大学 フィールド科学教育研究センター 海域ステー
ション 瀬戸臨海実験所
委員
東海大学 海洋学部 環境情報工学科
委員
（独）産業技術総合研究所 環境管理技術研究部門
委員
（独）産業技術総合研究所 エネルギー技術研究部門
委員
中央電力協議会
委員
（社）日本鉄鋼連盟
事務局 （財）地球環境産業技術研究機構 海洋隔離プロジェクト
事務局 （財）地球環境産業技術研究機構 海洋隔離プロジェクト
事務局 （財）地球環境産業技術研究機構 海洋隔離プロジェクト
主幹研究員
教授
教授
教授
所長
教授
研究部門長
主任研究員
事務局部長
常務理事
ﾌﾟﾛｼﾞｪｸﾄﾘｰﾀﾞ
主任研究員
研究員
赤井
佐藤
平井
白山
誠
徹
秀一郎
義久
中田
原田
西尾
福島
細川
村井
久松
森影
喜三郎
晃
匡弘
透
昌彦
重夫
勝也
有佳里
（２）生物影響評価分科会
主査
委員
委員
委員
委員
京都大学 フィールド科学教育研究センター 海域ステー
ション 瀬戸臨海実験所
長崎大学 水産学部
長崎大学 環東シナ海海洋環境資源研究センター
東海大学 海洋学部 環境情報工学科
（独）産業技術総合研究所 環境管理技術研究部門
教授
所長
教授
教授
教授
主任研究員
白山 義久
石坂
石松
中田
鈴村
丞二
惇
喜三郎
昌弘
教授
教授
ｸﾞﾙｰﾌﾟﾘｰﾀﾞ
上席研究員
佐藤
平井
西尾
下島
徹
秀一郎
匡弘
公紀
主幹研究員
教授
所長
教授
教授
研究部門長
主任研究員
主任研究員
主任研究員
主任研究員
代表取締役
取締役部門長
赤井 誠
白山 義久
（３）CO2挙動予測等分科会
主査
委員
委員
委員
東京大学大学院 新領域創成科学研究科 環境システム学専攻
東京工業大学 炭素循環エネルギー研究センター
（独）産業技術総合研究所 エネルギー技術研究部門
（財）電力中央研究所 環境科学研究所 化学環境領域
（４）海洋隔離国際連携検討WG
主査
委員
委員
委員
委員
委員
委員
委員
委員
委員
委員
（独）産業技術総合研究所 エネルギー技術研究部門
京都大学 フィールド科学教育研究センター 海域ステー
ション 瀬戸臨海実験所
東京大学大学院 新領域創成科学研究科 環境システム学専攻
明治学院大学 法学部 消費情報環境法学科
（独）産業技術総合研究所 環境管理技術研究部門
（独）産業技術総合研究所 エネルギー技術研究部門
（独）産業技術総合研究所 環境管理技術研究部門
（財）海洋生物環境研究所 実証実験場
みずほ情報総研（株） 環境・資源エネルギー部
（株）クインテッサジャパン
日本エヌ・ユー・エス（株） 環境コンサルティング部門
11
佐藤
磯崎
原田
西尾
鈴村
喜田
板岡
高瀬
岸本
徹
博司
晃
匡弘
昌弘
潤
健之
博康
幸雄
第３章
平成１９年度事業の成果概要
本プロジェクトの開発成果概要を以下に示す。
３．１
CO 2 海洋隔離に伴う生物影響評価
３．１．１
生物影響評価手法の開発
３．１．１－１
生態系モデルの開発
（１）生態系モデルの高精度化
今年度は、三次元かつ表層生態系を考慮した中深層生態系モデルを用いて現況再現
を行なった。その結果、表層の chlorophyll-a 分布、亜熱帯域と亜寒帯域の chlorophyll-a
と栄養塩（PO4-P,NO3-N）の鉛直分布は概ね再現できた。しかし、中深層の動物プラン
クトン現存量が観測値より大きく下回り、有機物沈降フラックスは過大評価となった。
また、動物プランクトンの再現性では摂食方法に応じた改善が必要と考えられた。
３．１．２
実海域生物影響データの収集
３．１．２－１
生物影響海洋実験
（１）ペラジックチャンバーの開発
１）動作および試料安定性
CO2 海洋隔離における海洋中層浮遊生物群集への影響を評価するために、複数の食
物栄養段階を含む浮遊生物群集を対象とした現場曝露実験装置（ペラジックチャンバ
ー）を開発するため、本年度は、ペラジックチャンバーの採水部の製作と制御部の試
作を行い、陸上および浅海域において基本動作の確認実験を実施した。
所定水深で作動させた装置を船内に揚収し蓋の作動状況を確認したところ、水漏れ
は生じておらず、採水が確実にできていることが確認できた。採水直後の水質は、3
つのチャンバー全てがほぼ同じ値を示しており、プログラムの通り所定水深で正常に
採水できていることが確認された。
２）高濃度 CO 2 海水による曝露状況
高濃度 CO 2 海水注入後は、いずれのチャンバーも約 15 分経過後に pH は約 7 まで
低下し、実験終了時までその値を維持していた。このことから、高濃度 CO 2 海水は、
注入後にチャンバーの一部に留まることなく、速やかにチャンバー全体に均一に拡散
することが確認された。
３）CO 2 曝露予備実験
3 つのチャンバーをコントロール、2000μatm 実験区および 5000μatm 実験区の条
件に設定した結果、pH はぞれぞれで約 8、約 7.4 および約 6.9 を維持していた。また、
溶存酸素 DO は、水温と対応した挙動を示した。
12
酸素消費速度は、前年度までに実施した低質曝露実験装置（ベンチックチャンバー）
の実験結果から CO 2 の影響を受けると示唆されるが、今回の DO センサーによって推
定することは精度上困難と考えられた。そこで、実験開始時と終了時に採水してウイ
ンクラー法で求めた DO の差から酸素消費速度を算出した。その結果、コントロール、
2000μatm 実 験 区 お よ び 5000μatm 実 験 区 で そ れ ぞ れ 、 89.2、 171.5 お よ び 22.8
O2 mg/m 3 /day となった。
一方、バクテリアがチャンバー内で優占しているため、検証としてバクテリアの現
存量から酸素消費速度の推定を試みた。バクテリアの現存量としては CO 2 曝露予備実
験終了時の全菌数を用い、酸素消費速度は Nagata らの式に当てはめて試算した。そ
の結果、バクテリア現存量から求めた呼吸速度はコントロール、2000μatm 実験区お
よび 5000μatm 実験区でそれぞれ、32、51 および 9 O 2 mg/m 3 /day と推定され、実測
値と同様に 2000μatm 実験区で酸素消費速度が最も高くなった。
2000μatm 実験区では菌数の増加も観察されていることから、2000μatm 実験区で
は CO 2 分圧の増加に伴う菌数の増加と活性を持つバクテリアや動物の呼吸昂進が生じ
ている可能性が考えられる。なお、さらに高い CO 2 分圧では麻酔作用を引き起こすこ
とが知られている。今回の予備実験の結果から約 3 日の実験であるが酸素消費速度の
実験区間での差異が検出でき、酸素消費速度がペラジックチャンバー実験における
CO 2 影響の指標として有効であることが分かった。
３．１．２－２
海洋現場実験想定海域の現況
（１）海洋観測による現況調査
ペラジックチャンバーの開発のために行なう係留実験海域のバックグラウンドを把
握するため、2007 年 11 月 7 日から 2007 年 11 月 16 日に北緯 38 度、東経 145 度の
亜寒帯に属する海域を観測した。CTD 測定及び採水、ORI ネットによる生物現存量調
査、深層流動場および沈降粒子束調査、表層沈降粒子束調査、現場海水ろ過調査を実
施した。その結果、溶存酸素（DO）は約 1000db の極小層において 51.3μmol/kg であ
り、亜熱帯の隔離想定海域よりも 8.5μmol/kg 低かった。栄養塩類は 1000db 付近で最
大値を示し、1000db 以深では 2006 年度亜熱帯海域の値と比較すると凡そ同程度の濃
度分布であった。pH、全アルカリ度そして全炭酸濃度の鉛直分布は、2006 年に得ら
れた亜熱帯海域の値と概ね良く一致した。生物現存量については、微小プランクトン
の鉛直分布を見るとバクテリアが最も多く、水深の増加に伴い有光層内で急速に現存
量 を 減 ら し た 。 水 深 1000m 以 深 で は 減 少 率 は 低 下 し 、 中 深 層 で は 約 10 10 cells/m 3
（10 4 cells/ml）であった。植物プランクトンは藍藻と微小鞭毛藻が優占し、有光層で
10 8 ～10 10 cells/m 3（10 2 ～10 5 cells/ml）存在し、中深層ではプレパラート試料中に認め
られル程度に非常にわずかではあった。また、微小原生動物では微小鞭毛虫類が最も
優占しており、水深が増すにつれて急激に減少した。ペラジックチャンバーの係留目
13
標である 1000m 付近では、バクテリア、微小鞭毛虫類、渦鞭毛虫類の現存量は、そ
れ ぞ れ 7×10 10 cells/m 3 、 4×10 6 cells/m 3 、 お よ び 1×10 6 cells/m 3 （ そ れ ぞ れ 、 7×
10 4 cells/ml、4 cells/ml、および 1 cells/ml）と少なかった。一方、炭素態に換算した
現存量を比較すると、1000m 水深ではバクテリアが 1.4mgC/m3 であるのに対して、
渦鞭毛虫と鞭毛虫がそれぞれ 0.12mgC/m3、0.04mgC/m3 であり、細胞数での差に比
べて分類群間の差が小さくなっている。
３．１．３
深海生物の CO 2 影響研究
３．１．３－１
深海生態系の研究
（１）カイアシ類の捕食構造解析
生態系モデルのコンパートメントの構築や深海生態系における CO 2 影響の伝播の
解明に成果を供することを最終目標とし、安定同位対比を用いた食物連鎖構造の解析
を行った。中深層における食物連鎖解析により、粒子状物質の表層由来の成分がカイ
アシ類の一次食資源となっていることが分かった。また、表層の生産力の高い亜寒帯
では、肉食性カイアシ類とヤムシ類が共存している可能性が見出された。雑食性のオ
ンケア属、カラヌス属、 Scolecithrix danae 、 Candacia bipinnata 、 Pleuromamma
abdominalis は表層から採取されたカイアシ類の安定同位対比を測定した同属および
同種と窒素同位対比が一致しており、この結果も中深層のカイアシ類と表層のカイア
シ類の一次食資源が同じである可能性を示唆した。
（２）生物パラメータへの影響実験
生態系モデル構築における生物パラメータの高精度化を目的として、カイアシ類を
用い、CO 2 を曝露した際の呼吸速度評価試験と呼吸代謝活性評価試験に関する評価・
検討を行った。
呼吸速度評価試験は、カイアシ類を透明アクリル製フローセル型培養容器に入れ、
このフローセルに任意の CO 2 分圧に調整した試験海水と試験個体を加え、フローセル
上部より蛍光式 DO センサーを挿入した。このセルを任意の温度条件に設定した恒温
培養槽内に静置し、1 分毎のフローセル内の溶存酸素濃度の変化を測定した。蛍光式
DO センサーにより得られた溶存酸素濃度から、試験個体あたりの呼吸速度（R a ）を
算出した。富山湾および大阪湾において採取された Metridia pacifica 、 Neocalanus
cristatus 、 Paracalanus parvus 、 Calanus sinicus を用いて、CO 2 濃度と呼吸速度の
関係を測定した結果、単位容積あたりの呼吸速度については、CO 2 分圧と呼吸速度の
間に大きな相関は見られず、 Calanus sinicus の場合で 380µatm の CO 2 分圧条件下
で最も高い呼吸速度 0.402µL-O 2 /hr/mm 3 を示した。
呼吸代謝活性評価試験は、CO 2 分圧条件下で 96 時間静置培養を行った M. pacifica
について呼吸酵素活性のポテンシャルを示す電子伝達系（ETS）活性とし、呼吸代謝
14
生成物質である ATP 量を測定した。ETS 活性測定は、M. pacifica を分取し、破砕後、
最終的にリン酸緩衝液を含む懸濁液とした。この懸濁液を遠心分離し、上清画分を分
取、ETS 測定用試料とした。次に、反応基質リン酸緩衝液と INT 溶液を分注した容
遠沈管に ETS 活性測定用試料を加え反応溶液とした。この反応溶液を 20 分間反応さ
せ、反応停止後、還元されたホルマザンを分光光度計を用いて 490nm と 750nm の波
長で測定した。得られた結果より ETS 活性を算出した。ETS 活性については、380µatm
の CO 2 分圧条件と比較して 5000µatm の CO 2 分圧条件では ETS 活性が約 2.38 倍と
なり、2500µatm の CO 2 分圧条件においても 380µatm 試験区の約 1.67 倍であった。
ATP 量の測定は、 M. pacifica のうち 7～10 個体を分取した。試験個体を破砕し、
最終的に Tris 緩衝液を含む懸濁液とした。この懸濁液を煮沸処理を行った後、氷温下
で急冷、その後遠心分離を行い、上清画分を分取し、ATP 測定用試料とした。ATP 測
定用試料をマイクロプレート上に分注した後、Tris 緩衝液を加え反応溶液とした。ATP
活性測定用発色試薬を添加し、Microplate Luminometer を用いて発光量（ALU）を
求め、ATP 量を算出した。ATP 量については、380µatm の CO 2 分圧条件において 1
個体あたりの ATP 量が 0.94pmol であったのに対して、2500µatm の CO 2 分圧条件で
は 1.45pmol、 5000µatm の CO 2 分 圧 条 件 で は 2.84pmol と な っ た 。 380µatm と
5000µatm の CO 2 分圧条件を比較した場合、5000µatm 試験区における 1 個体あたり
の ATP 量は、380µatm 試験区における 1 個体あたりの ATP 量の約 3.0 倍であった。
上記の結果から、呼吸速度評価試験においては、380～7500µatm の CO2 曝露条件
の間で試験に用いたカイアシ類 4 種の呼吸速度に大きな差は見られなかった。一方で
M. pacifica を 用いて行った呼吸代謝活性評価においては ETS 活性および ATP 量とも
に、CO 2 曝露分圧の上昇に従い、増加する傾向が示された。
（３）沈降フラックスへの影響
様々な懸濁粒子を用いて、CO 2 海洋隔離による懸濁物凝集作用への影響を研究した。
その結果、
１）高 CO 2 環境下では懸濁物凝集作用が抑制される、
２）凝集過程には粘性物質が関与している、
３）この粘性物質と TEP の関係は明白ではない、
４）高 CO 2 環境は有機物の分解過程に影響を与える、
ことが明らかになった。
（４）分子微生物学的手法による多様性解析
中深層における現場実験において脱窒活性への影響を評価するための特異的微生物
活性の解析手法の開発を最終目標として，今年度は、脱窒活性に関する N 2 O 産生にか
かわる遺伝子について DGGE 法を基にした解析手法の検討と実験海域での現況把握
15
を検討した結果，下記の結果を得た。
１）脱窒関連遺伝子として nirK，nirS を選択し，プローブを設計，ポジティブコント
ロールにおいてそれぞれの遺伝子が増幅できることを確認した。
２）nirK，nirS をターゲットとした DGGE を実施するための GC クランプをつけたプロー
ブを設計した。そのプローブを用いて増幅を確認したところ，ポジティブコントロー
ルにおいては一定の増幅が得られたが、野外試料については増幅が認められなかった。
３ ） 現 場 暴 露 海 域 の 遺 伝 子 の 微 生 物 鉛 直 分 布 を 把 握 す る た め に 16S-rDNA を 用 い た
DGGE を実施し，微生物群集構造を把握した。
４）N 2 O 関連遺伝子を持つ微生物の鉛直分布把握のために， nirK，nirS のプローブを
用いて PCR により現場の遺伝子の増幅を実施し，500m～1500m のサンプルにおい
て nirK 遺伝子が確認された。
また、海洋生態系に対する隔離 CO 2 の影響を評価する一環で、ペラジックチャンバ
ーの動作試験おいて得られた試料について、細菌の遺伝子の DGGE 法による多様性の
検討を実施し、以下の結果を得た。
１）ペラジックチャンバー浅海実験試料に対する微生物の多様性を検討し，３μｍで捕
捉される懸濁物付着型の細菌と３μｍフィルターを通過する単独浮遊型の細菌では
種組成が異なることを確認した。
２）ペラジックチャンバー浅海実験試料における脱窒関連遺伝子の検出を実施し，今回
のサンプルで nirK が検出されることを確認した。
３．１．３－２
CO 2 影響の研究
（１）模擬深海影響下における深海生物の CO 2 影響実験
CO2 海洋隔離に伴う高圧・低水温という深海環境条件下での深海生物への影響を評価
するため、模擬深海条件下での CO2 影響実験を行なった。その結果、下記の成果を得た。
１）ザラビクニンを用いた高圧 CO 2 曝露実験の圧力条件としては、6MPa が適当である
と判断された。
２）6MPa 条件下での CO 2 曝露実験の結果から、高水圧はザラビクニンの CO 2 耐性に
負の影響を及ぼす可能性があることが強く示唆された。
３）腐食鋳型標本を用いた血管系の観察によって、ザラビクニンのカニュレーション
部位としては尾動脈が適当であると判断された。
（２）深海微生物群集に対する脱窒関連遺伝子検出技術の適用性
ペラジックチャンバー実験においては、微生物機能への CO2 影響として研究例があ
る亜硝酸還元の nir 遺伝子に絞り検出技術の開発を行なっているが、この遺伝子は脱
窒過程全体の一部でしかない。そこで、脱窒機能を含め海洋中の窒素循環を構成する
機 能 に つ い て 広 範 な 遺 伝 子 検 出 技 術 の 開 発 を 別 途 実 施 し た 。そ の 結 果 、新 た に N 2 O
16
還元酵素遺伝子 nosZ を検出することができ、かつ 500m、1500ｍでは nosZ 遺伝子の
変異は少なく深層では多様性が単純であることがわかった。また、増幅が非常に困難
で検出できなかった nirS については増幅条件の開発に成功した。
３．２
海洋中CO 2 挙動予測と隔離可能性評価
３．２．１
CO 2 挙動の観測・予測技術の開発
３．２．１－１
海洋中 CO 2 挙動観測技術の開発
（１）天然 CO 2 発生海域の観測
高濃度の CO 2 を含む噴気ガスの自噴が確認されている鹿児島湾若尊カルデラ（たぎ
りサイト，ハオリムシサイト）において，有人潜水調査船を用いた海洋中での CO 2 挙
動観測を実施した。
１）有人潜水調査船に pH/p CO 2 センサーや CTD を取り付けて，たぎりサイトのガス噴
気ポイントを中心にした 400m 四方のエリアをグリッド状に航走し，6 層（195m，
175m，150m，125m，100m，75m）について，マッピング観測を行った。
２）たぎりサイトおよびハオリムシサイトについて，ガス噴気ポイントの探査を行い，
詳細なガス噴気ポイントマップを作成するとともに，ガス噴気状況の高解像度映像
を取得した。また，たぎりサイトのガス噴気地帯において採水を行い，pH，硫化水
素，ATP，微生物量，栄養塩類について測定した。
３）たぎりサイトのガス噴気地帯に音響ドップラー流速分布計（ADCP）を設置し，流
向・流速の計測を行った。カルデラ内（水深 200〜170m）では南北方向，カルデラ
中層（水深 150〜100m）では北東〜南東方向の流れが卓越していた。
４）噴出した噴気ガスの拡散状況の広範囲マッピング結果をもとに pH の水平分布図を
作成した。たぎりサイトでは，噴気ガス（高濃度の CO 2 を含む）由来の低 pH は，
温度躍層が発達する水深 120m 以深で顕著であり，南西側により pH の低い場所が
存在していた。
５）たぎりサイトの噴出する噴気ガスの高解像度映像から噴気ガスのフラックスの推定を
行った。
（２）統合モニタリングシステムの設計
今年度は海洋モニタリング技術の技術動向を調査し、海洋実験～事業化に至るまで
の CO 2 のモニタリングに AUV を援用することを検討した。なお、AUV についても、
電源・自律航行に関して、Backup を行う母船が必要であるが、放流サイト内・およ
び境界面のモニタリングに AUV を援用する場合、CO 2 放流船や輸送船にその役目を
与えることが可能であることを確認した。
17
３．２．１－２
海洋中 CO 2 挙動予測技術の開発
（１）中規模海洋モデル開発
深海中へ意図的に注入された CO 2 濃度の分散過程の数値計算のために、新しいメソ
スケール(10 2 km オーダー)の海洋モデルを開発した。CO 2 拡散シミュレーションの結
果は、固定点放流と比べて Moving Ship 法は環境影響を減少させることができること
を 示 し て お り 、 ま た 、 境 界 に お け る 粒 子 処 理 を 含 ん だ PLM （ Particle Laplacian
Method）が適切に機能したことが確認された。開発されたモデルは、「生物影響が最
小または僅かとなるように CO 2 海洋隔離システムを最適化するための概要を提供す
る」という最終目標のために、適用できることが期待できた。
（２）広域海洋モデル開発
前年度行ったケーススタディでは、年間 5000 万トンを 1 サイト（133ºE-134ºE,
19ºN-22ºN）に連続注入という統一条件を用いたが、本年度の広域モデル研究では複
数のシミュレーションを行い、この条件を最適化する研究を行った。
注入 CO 2 の鉛直配分に関して、2000m 以浅の CO 2 注入量を減らし、2000m 以深の
注入量を増やした実験を行った。その結果、深度 1700ｍ付近での最大濃度は PNEC
（予測無影響濃度）の 80%であった一方、他の深度では PNEC に対してかなり余裕
があった。鉛直配分を変更した結果、1700m 近辺の CO 2 濃度は減少しており、今回
行った鉛直配分の変化が CO2 濃度の PNEC に対する比を下げるのに有効であること
が分かった。
サイトの水平形状を変えた 4 つの実験を行った結果、東西 1 度×南北 3 度のサイト
が最も CO 2 濃度を低くする形状であった。これにより、南北方向に長いサイトの設定
が有効であると確認された。東西 1 度×南北３度の 1 サイトと東西１×南北 1 度のサイ
トを南北に 1 度離して 2 箇所設ける場合とでは、結果に有意な差が生じなかった。ま
た、東西 1 度×南北 2 度のサイトを設定した場合、PNEC を越えるぐらい濃度が高く
なる。これらの結果は昨年 1 度×1 度の結果の重ね合わせによる粗い見積もりと符合し
ており、重ね合わせによる見積もりは本質を外していなかったと言える。
注入場所の最適化に関しては、注入場所を変えて行ったオンライン実験の結果を利
用した。まず、最大濃度とサイト内の平均渦活動度のフィティングカーブを求めた。
これによって渦活動度から最大濃度を推定することが可能になるので、PNEC を越え
ずに注入可能な年間最大量の地図を作成できる。日本近海は隔離ポテンシャルが高く、
時に黒潮続流域では PNEC を越えずに 1 度×1 度、水深 1000m～2000m のサイトに
80Mton/year の CO 2 を注入できる海域がある。この海域は関東地方、東海地方といっ
た CO 2 大規模放出源からも近く、第 2 のサイトの候補地として最適な海域であると考
えられる。
18
（３）CO 2 液滴群の溶解・拡散挙動予測
小規模な海洋実験で CO 2 放出によ る生物影響 を検討する際に、そ の 濃度が、実際
に大規模に海洋隔離 を 実施したときの CO 2 濃 度と大きさが異なる よ うでは、小規模
な海洋実験の意味が希薄になるため、小規模な海洋実験で、どのような条件に設定
すれば実際の大規模なものについて検証したことになるのか、数値計算によりその
実験条件を検討した 。その結果、ノズル幅 を 2.5ｍと小さく し、放流 船の前進速度＝
1.0m/sec、放流流量 = 0.01 トン /sec、初期液 滴径目標値 = φ14mm、パイプ下端位
置の深度＝1200m、ノ ズルアレイ幅＝2.5m と すれば、小規模実証実 験ケースのノズ
ル直上５ｍの点での CO 2 の濃度分布は、大 規 模 ケ ー ス に 対 し て 、 そ の 濃 度 を 再 現 す
る ことが可能であることを明らかにした。すなわち、小規模実験を実施する場合は、
大規模実験の濃度上昇を再現する条件出しを実施することが必要である。
（４）CO 2 液滴の溶解挙動予測技術の開発
CO 2 放出の初期の段階では液相/気相の相変化を伴うので、ハイドレート膜に覆われ
ない個々のCO 2 液滴の行く末を予想する技術の開発を主目的とし、個々のCO 2 液滴の
物理的な特性と海水との相互作用について物理モデルを元に数値モデルを構築した。
その後、開発したモデルの予備的な適用により放出されたCO 2 液滴の行く末について
ケーススタディを行った。
その結果、下記の成果を得た。
１）CO 2 液滴/気泡 それぞれの静止した海水中における溶解速度および上昇速度につい
て表現できる数値モデルを開発し、CO 2 気泡と海水間の相互作用についてシミュレ
ーションを行った。モデルは、CO 2 -海水系の物理化学的な特性（密度, 海水中の CO 2
拡散係数, CO 2 溶解度; 有効物質移動係数および有効抗力係数）に関するサブモデル
により構成される。
２）想定海域の深度 550m から 100m に焦点を当ててケーススタディを行った。放出す
る深度として 800m, 550m, 350m, 200m および 100m を想定し、初期液滴/気泡径
を 40mm, 30mm, 20mm, 10mm, 5mm および 3mm とした場合の終端距離と時間
について計算した。その結果、CO 2 液滴/気泡が溶解を終了するまでの時間と上昇距
離の関係が分かった。また、CO 2 液滴/気泡の相変化時の膨張速度と溶解速度の関
係を求めることができた。
３．２．２
海洋隔離の可能性評価
３．２．２－１
海洋隔離のケーススタディ
（１）海洋隔離ケーススタディ
本年度は、事業化規模を想定した CO 2 の海上輸送・希釈放流システムについて、以
下の条件を対象に、CO 2 処理量 1 トン当たりのコスト及び追加的 CO 2 発生量の試算を
19
実施した。
・放流サイトまでの輸送距離を 1,500km とし、年間回収量を 2,500 万トン、1,000
万トン、500 万トンに変更した場合。
・年間輸送量 5,000 万トンで輸送距離を 1,000km、500km に変更した場合。
これらのケーススタディを実施した結果、次の成果が得られた。
１）放流エリアが同一サイズ(100km×333km)では、年間 CO 2 回収量が減るほどコスト
が増大する。
２）PNEC を越えないと予想される範囲で、年間 CO 2 回収量に応じて放流エリアを小さ
くし、輸送船・放流船の必要隻数・サイズを低減することにより、コストが削減され
る。500 万トンでは放流エリアを小さくすると、コストが若干低減する。これは、放
流エリア縮小が初期コスト及び償却コストの若干の低減に繋がったためと考えられ
る。一方、1,000 万トンではコストは変化しない。この場合、輸送・放流船の小型化
は、システム休止時の陸上 CO 2 ストック（タンク個数）を増加させる結果となり、
コスト増となる。
３）追加的 CO 2 発生量は年間 CO 2 回収量に対し、若干のばらつきは見られるが、おおむ
ね 5%前後になる。
４）輸送距離を短くすると輸送船隻数が削減し、コスト・追加的 CO 2 発生量は輸送距離
にほぼ比例して減少する。
（２）小規模海洋隔離実験
Moving ship 方式による CO 2 海洋隔離の要素技術を確認するために、曳航パイプ方
式の小規模海洋実験の条件について検討した。
１）既存の設備の流用を考えた場合は、実験条件は以下の程度が適当と思われる。
・放流深度：1,000m
・曳航速度：1 m/sec
・放流流量：1～10kg/sec
２）本実験システムとしては、バージ船から Coiled Tube を繰り出す方式が有望と考え
られる。既存の１～5 inch 径パイプで、上記実験条件に対応できる。ただし、本実
験条件では、VIV 発生の可能性があり、その影響・対策について検討しておく必要
がある。
３）本実験システムは、既存の技術で実施可能であると思われる。しかし、パイプレイ
システムについては海外メーカーからの調達を要する。また、装置の小型化の検討
も必要である。
４）CO 2 送り込みシステムについては、流量 1kg/sec については問題ないものと思われ
るが、10kg/sec については高圧・大流量ポンプの検討が必要である。
20
３．２．２－２
全球モデルによる海洋隔離予測
（１）低解像度モデルによる海洋酸性化に対する海洋隔離の有効性評価
今年度は、H18 年度の計算結果に数ケースの計算を追加し、全海洋の平均レベルで
の酸性化の予測について整理するとともに、６種類のシナリオに基づく評価を行った。
また、海域別の pH 変動についても検討した。その結果、下記の成果を得た。
１）評価シナリオ１：海洋隔離による大気中 CO 2 の削減効果を検討した結果、長期的に
は CO 2 濃度の安定化レベルを下げることはできないが、短期的には急激な CO 2 濃
度の上昇を抑制できる効果があると試算された。
２）評価シナリオ２：海洋隔離による海洋中の pH 変化の比較を行った結果、海洋隔離
は CO 2 が注入される海洋中深層の酸性化を促進させるが、表層の酸性化を抑制する
ことができると試算された。
３）評価シナリオ３：表層の酸性化防止と中層の酸性化抑制の両立性の検討を行った結
果、海洋隔離による海洋中深層の pH 低下の許容範囲を考慮する必要はあるが、CCS
による回収可能な CO2 が存在するため、それを大気に排出し続ける場合を想定すると、
海洋隔離を行うことによる表層酸性化を抑止する効果は極めて高まると試算された。
４）評価シナリオ４：海洋隔離量に対する表層と中層の酸性化の抑制効果の検討を行っ
た結果、大気中 CO 2 濃度 550ppm 安定化排出シナリオの超過 CO 2 排出量の内およ
そ 30％までを海洋隔離で削減するケースでは、海水中の pH 変動を低く抑えられる
可能性があると試算された。
５）評価シナリオ５：海洋隔離を追加的に利用する場合の酸性化抑止効果について検討
を行った結果、超過 CO 2 排出量の 10％を大気に放出しつづけた場合と、海洋隔離
の CO 2 を増量した場合との比較により、地球全体の平均レベルでの海洋酸性化の影
響はわずか（ΔpH=-0.01）であるが、大気中 CO 2 濃度のピーク値としては 20ppm
の低下につながると試算された。
６）評価シナリオ６：海洋隔離サイトについて検討した結果、大気中 CO 2 の吸収効果が
高い大西洋では pH 低下が他の海域よりも大きいこと、隔離総量を変えずに隔離海
域を太平洋とインド洋に限定すると短期的には大西洋の酸性化を抑制できるが長期
的（1000 年）には抑制効果はないと試算された。
（２）大気海洋全球モデルによる CO 2 隔離予測計算
大気海洋結合モデル CCSM3（Community Climate System Model Version 3）
に 海 洋 炭 素 循 環 モ デ ル OCMIP(Ocean-Carbon Cycle Model Intercomparison
Project)を組み込み、CO 2 海洋隔離を模擬した数値実験、および、同量の CO 2 が大
気中に滞留し大気中 CO 2 濃度が増加すると仮定した数値実験を行った。CTL ケー
ス（1990 年相当の現状気候条件下でのコントロール実験）ケースと、OCN ケース
（CTL 実験の 100 年目の計算結果を初期値として、海洋隔離の模擬実験）と、ATM
21
ケース（OCN 実験において海洋中に放出する CO 2 と同量の CO 2 が全て大気中に
滞留すると仮定した実験）を比較計算した。その結果、海洋表層の pH 分布は OCN
ケースと CTL ケースではほとんど差異が見られず、大気中 CO2 濃度が増加する
ATM ケースでは海洋全域において酸性化の進行が顕著である。一方、海洋深層(水
深 1875m)の pH 分布は、太平洋やインド洋では ATM ケースと CTL ケースの差は
ほとんど見られないが、大西洋、特に北大西洋北部と南大洋においては酸性化の進
行が見られる。また、OCN ケースにおける海洋深層の酸性化は著しく、その範囲
は、アラスカ・カナダの太平洋岸、インド洋、ドレイク海峡近辺にまで及んでいる
ことが分かった。なお、今回使用したモデルは、海洋中の炭素循環のみを考慮した
モデル構成であるため、大気中濃度の変化を評価することはできないが、近い将来
には、大気・海洋・陸域間の完結した炭素循環を取り扱うことのできる地球システ
ムモデルを、海洋隔離の効果の予測と環境影響の評価に応用することが可能になる
と期待される。
（３）全球 BOX モデルによる CO 2 隔離予測計算
海洋の CO 2 隔離能力の把握や CO 2 海洋隔離と海洋酸性化との関係など明らかに
するために、これまでは簡易 BOX モデルや低解像度モデルを用いた全球規模の炭
素循環計算を実施してきたが、本年度は、信頼性を高めるために高機能な高解像度
BOX モデルの開発を開始し、改良 BOX モデルの基本設計と計算に使用するデー
タ作成を実施した。主な基本仕様としては、下記の機能を含めることにした。
・BOX の種類は、陸域、大気、海洋、海底の 4 種類
・各領域の BOX 数は実用上合計 500 程度を想定
・海洋 BOX 毎に異なる物質循環モデル(生態系モデル)を選択可能
・海洋 BOX のコンパートメントは、全 BOX 共通コンパートメントと、BOX 毎に異
なる固有コンパートメント（物質循環モデルに依存）に大別
・陸域 BOX には、人為系排出源、自然系排出源、自然系吸収源を設定
・海洋 BOX の表層は大気 BOX との間で物質交換可能（粒子状物質、気体など）
・陸域 BOX とそれに接続する海洋 BOX との間で物質交換（主に陸域からの流入）
・海洋 BOX と海底 BOX の間で物質交換（沈降堆積、溶出、噴出など）
３．３
海洋隔離技術の動向調査
３．３．１
国際ネットワークの構築
（１）国際連携検討ワーキンググループ活動
CO2 海洋隔離技術を実適用できる環境整備の課題を検討するため国際連携検討
ワーキンググループを設置して、ロンドン条約締約国会議(LC/LP)における海洋隔
離実験実施承認へ向けての状況の把握、ロンドン条約対処方針案の作成、国への働
22
きかけ、理解促進活動等を実施した。とくに、ロンドン条約科学会合のサイエンス
デーの発表提案、海洋隔離に関わるセッションやシンポジウムの学会における企画、
ホームページ充実などの情報提供基盤整備等を推進した。
（２）国際法・国内法の動向
本年度は、国際法として OSPAR 条約とロンドン条約を、国内法としては海洋汚染
防止法を対象に動向を調査した。OSPAR 条約では 2007 年 6 月に海洋隔離禁止が決議
されたことから、ロンドン条約への波及が懸念された。そのため、2006 年から 2007
年にかけての OSPAR 条約およびロンドン条約の状況を整理し、ロンドン条約対応検
討会において海洋隔離禁止が波及した場合の対策案を作成した。今年度のロンドン条
約会合(LC30/LP2)では、想定される事態には至らなかった。なお、同会合(LC30/LP2)
では、CO2 の海底下地中貯留の CO 2 WAG が承認された。一方、鉄散布を含む海洋肥
沃化に関する海洋実験についての議論が注目され、2008 年 5 月の科学会合において
引き続き検討されることになった。この海洋実験に関する議論は、海洋隔離の実海域
実験や事業化に大きく影響するものと考えられるため、引き続き動向調査と対処方針
案作成を行なった。
これらの調査と平行して、ロンドン条約 96 年議定書における CO 2 海洋隔離実験の
実現可能性の考察について調査を行った。その結果、96 年議定書には海洋隔離禁止の
決議はないため、リストの追加改正とその科学技術的検討のための実験の可能性は残
っているが、96 年議定書は法的・社会的・経済的要素の考慮も定めているため、CO 2
海洋隔離実験に対する社会的受容性への要求レベルが高まっているとの指摘があった。
（３）海外研究機関の動向
海外研究機関の動向調査では、ロンドン条約関連会合や炭素隔離リーダーシップフ
ォーラム（CSLF）会合において、イギリス、フランス、ノルウェー、アメリカ、カ
ナダ、オーストラリア、サウジアラビア、韓国、中国の参加者より、海洋隔離に対す
る見解を調査した。その結果、ヨーロッパ諸国や北米など多くの国では、地中貯留で
対応可能なことから海洋隔離を対策オプションとして考えておらず、一部では削減効
果や環境影響から否定的であった。ただし、韓国は海洋隔離について好意的ではある
が、地中貯留が先行であるとの見解であった。
３．３．２
理解促進基盤の整備
（１）海洋隔離プロジェクト Web サイト
海洋隔離プロジェクトの概念や研究成果の情報発信を促進するため、海洋隔離ホー
ムページを全面的に更新した。今回の改良では、これまでの海洋隔離に関する解説や
プロジェクト成果の説明に加えて、海洋隔離に関連する国内外の学会やシンポジウム
23
の開催情報を提供した。
（２）Web フォーラムの基盤整備
海洋隔離の正しい理解の普及を図るとともに、国内外の研究者から本プロジェクトに
対する意見の受取りと研究成果に関する意見交換を行うため、Web フォーラム基盤シ
ステムとして Web フォーラムシステムと海洋データベースシステムの設計及び開発
を実施した。
３．４
研究発表・特許出願
研究発表 20 件（表 3.4-1）、特許 0 件（表 3.4-2）
表 3.4-1
タイトル
研究発表
年月日
発表形態
発表者
1 Moving Ship 方式による CO2 隔
離技術
2007/5/17
海洋理工学会
平成 19 年度春季大会
村井重夫
間木道政
2 隔離 CO 2 西部北太平洋にどのよ
うに広がるか
2007/5/17
海洋理工学会
平成 19 年度春季大会
増田良帆
山中康裕
3 CO2 海洋隔離による生物への影響
2007/5/17
海洋理工学会
平成 19 年度春季大会
石松 惇
吉川貴志
喜田 潤
薛 自求
渡辺雄二
4 Time Domain VIV Analysis of
Inclined Towed Pipe Based on
Lookup Table of VIV
Hydrodynamic Force
南浦純一
2007/12/12-15 Fifth Conference on
Bluff Body Wakes and 鈴木英之
尾崎雅彦
Vortex-Induced
Vibrations
5 CO 2 大量隔離
2007/7/4
東京大学海洋アライア
ンス
第 2 回シンポジウム
染矢
6 マリアナ海域北西栄福海山にお
ける液体 CO 2 挙動のナチュラル
アナログ
2007/9/20
2007 年度日本地球化
学会年会
下島公紀
7 CO 2 貯留のナチュラルアナログ
としての海底熱水活動
2007/9/26
2007 年度日本海洋学
会秋季大会
下島公紀
8 CO 2 が海洋生物におよぼす影響
2007/10
「海の豆知識」Vol.33 吉川貴志
（海生研ニュース付属）
9 A Numerical study with an
eddy-resolving model to
evaluate chronic impacts in
CO2 ocean sequestration
2007
International Journal
of greenhouse gas
control
24
聡
増田良帆
タイトル
年月日
発表形態
発表者
10 Emission of CO 2 from seafloor
hydrothermal systems at
Mariana Though
11 ナチュラルアナログによる海洋
中の液体 CO 2 の挙動観測
2007/12/10
2007 AGU Fall
Meeting
下島公紀
2007/10
電力中央研究所
研究年報 2007 年度版
下島公紀
12 CO 2 海洋隔離の環境モニタリン
グに係わる計測技術
2007/11/8
電力中央研究所
平成 19 年度
研究成果発表会-火力･
環境-
下島公紀
13 Hydrothermal systems as
natural analogue of CCS
2008/3/2
2008 Ocean Sciences
Meeting
下島公紀
14 二酸化炭素海洋隔離
－中層溶解技術－
2007/12/21
シンポジウム「気候変
動研究の最前線」
（ 主 催 :日 本 船 舶 海 洋
工学会関西支部）
佐藤
徹
15 CO 2 海洋隔離の技術開発の現状
2007/10
化学工学会誌
佐藤
徹
16 CO2 tolerance of juveniles of
three marine intertebrates,
2007
Plankton and
Benthos Research
渡辺雄二
喜田 潤
17 CO 2 海洋隔離技術の現状
2008/3/27
H20 年度資源･素材学会 佐藤
春季大会
Sepia lycidas, Sepioteuthis
lessoniana , and
Marsupenaeus japonicus
徹
18 Numerical Study on
2008/3/17
Multi-scale Diffusion CO2
Purposely Injected in the Deep
Ocean
二酸化炭素海洋貯留に
関するシンポジウム
Se-Min
Jeong
19 CO 2 海洋貯留の必要性と技術動
向、その将来
2008/3/17
二酸化炭素海洋貯留に
関するシンポジウム
佐藤
20 CO 2 隔離技術の最新動向
2008/3/1
配管技術
2008.3
表 3.4-2
発明の名称
Vol 50.No4
特許出願
発明者名
なし
25
特許出願
徹
大隅多加志
第４章
今後の課題
「二酸化炭素の海洋隔離に伴う環境影響予測技術開発」の継続フェーズは、平成１９年
度よりスタートした。本フェーズは、CO 2 海洋隔離技術による環境影響を把握するため
に必要な研究の第二段階として平成１４年度から実施されたフェーズ２の「二酸化炭素
の海洋隔離に伴う環境影響予測技術研究開発」を引継いだものである。
平成１９年度の実施内容は、CO 2 海洋隔離に伴う生物影響評価、海洋中 CO 2 挙動予測
と隔離可能性評価、海洋隔離技術の動向調査の３項目である。各項目の実施計画につい
ては第２章を、成果の概要については第３章を参照されたい。今後の課題については項
目ごとに各編の最終章でまとめているので、本章では、それらの概要について報告する。
４．１
CO 2 海洋隔離に伴う生物影響評価に関する課題
CO 2 の海洋隔離は海洋生態系の構造と機能を利用した技術であるため、環境影響評価
技術の開発を並行して進めることが求められる。このため、本研究開発では隔離想定海
域を設定して中深層生態系の構造と機能の推定を行なうとともに、CO 2 の増加が生物に
与える影響について各種の実験を実施してきた。過年度では短期的な影響を中心に生物
影響実験が進められ、これらの結果をリスク評価手法に基づいて海洋隔離における長期
的な影響の閾値として予測無影響濃度（PNEC）を推定した。しかし、PNEC は安全域
の閾値を示すものであり、長期的な生態系影響を推定する手法として、生態系モデルの
開発が必要である。今年度は生態系モデルの三次元化を進め、基本構造の構築ができた
が、中深層の動物プランクトン現存量や沈降フラックスの再現性向上が必要であり、生
物の過程式やパラメータ値について調整するため、今後の課題として下記のようなテー
マが挙げられる。
・ 中深層のパラメータの修正や動物の鉛直移動導入の是非、死亡速度など検討が必要で、
将来的には沈降フラックスに寄与するデトリタスのサイズ分割化などがあげられる。
・ 生態系モデルの予測に必要な各パラメータへの高濃度 CO 2 の影響度を推定するために、
呼吸速度への影響実験を開始したが、予備検討で実施した酸素消費速度、ATP、呼吸
に関連する電子伝達系（ETS）活性の測定を組み合わせて、さらに CO2 の影響データ
を蓄積することが必要である。
・ 安定同位体比による食物連鎖構造の解析では、表層沈降フラックスと中深層のカイア
シ類についての関係が把握できた。中深層に達した沈降物中における餌料として有効
な画分を定量評価するために、今年度回収できた中深層の沈降物の同位体比を測定し
て、比較検討することが必要である。
・ 沈降フラックスから中深層の生物群集への物質循環の流れを把握することが生態系モ
デルの検証として重要である。このような沈降物を形成する懸濁物は、高濃度 CO2 に
26
よる低 pH 下で凝集しにくくなることが明らかとなったが、さらにデトリタスの沈降速
度に対する高 CO 2 濃度の影響の評価が将来的に必要であろう。このためには、CO 2 濃
度と懸濁物凝集性の関係や各種沈降物のサイズと沈降速度に関する情報の収集が課題
となる。
・ 実海域における生物影響を検討するために深海現場実験装置（ペラジックチャンバー）
を開発しているが、今年度は採水部を製作して動作確認を行い、また CO2 曝露予備実
験を実施することができた。今後、CO 2 曝露の自動制御を行なうための制御部製作を
引き続き行なうことが必要である。また、曝露実験中の時系列データの取得方法や影
響評価のための項目の選択と測定方法などについて、検出器の探索、解析手法の開発
が課題となる。
・ ペラジックチャンバーの検出器や解析手法のひとつとして、分子生物学的な手法によ
る細菌の脱窒活性の検出技術が有効であることが示されたので、多様性解析のための
増幅条件など分析条件の検討をさらに進める必要がある。
・ CO 2 海洋隔離を行なう中深層については、生物群集構造や生活史など、いまだ基本的
な情報不足であることが現状である。この点については、引き続き文献や研究情報の入
手に努めると共に、CO 2 影響実験によるデータの蓄積を行なうことが求められる。
・ 現場での CO 2 影響実験が困難な大型生物である深海魚については、CO 2 の影響が圧力
で変化することが示唆されたことから、模擬深海環境下でのデータ蓄積が今後も求めら
れる。
４．２
海洋中 CO 2 挙動予測と隔離可能性評価に関する課題
・ CO 2 挙動観測技術の開発では天然 CO 2 発生海域を利用することで曳航式観測システム
等の実用性が確認されつつある。今後も天然 CO2 発生海域を利用して観測機器の測定
精度の向上を図るとともに、曳航式観測システム等の運用方法に関する知見を高めるこ
とが必要である。
・ CO 2 挙動モデルの検証に供する観測データの収集が引き続き必要である。事業化規模
モニタリングシステムについては、海洋隔離の順応的管理のために生物影響評価の要求
仕様を明確化し、海洋隔離のケーススタディとして全体システムのコストや CO 2 発生
量を再評価する必要がある。
・ CO 2 挙動の予測技術の開発では、天然 CO 2 発生海域や隔離想定海域の測定データを用
いてモデル検証を行い、予測精度の向上を図ることが必要である。また大規模モデルと
中規模以下のモデルの有機的結合に向けて開発をさらに推進する必要がある。
・ 海洋隔離の可能性評価では、海洋隔離の実適用および海洋実験のケーススタディにつ
いて海洋隔離実適用ケースの LCA 手法によるコストおよび CO 2 発生量評価が、社会的
合意を得るためにも必要である。
27
・ 海洋実験については、小規模と大規模の別なく、技術的実現可能性の評価が必要であ
る。
・ 海洋隔離の有効性評価については、引き続き複数モデルでの検証を目指し、より信頼
性の高い中解像度モデルや高解像度モデルの開発に努める必要がある。同様に、中解
像度モデルや高解像度モデルに使用する計算条件などの信頼性を高める必要がある。
以上の課題を整理すると、今後の研究テーマは次のようになる。
１）CO 2 挙動観測技術の開発
・天然 CO 2 発生海域を利用して曳航式観測システム等の観測機器の高精度化および
運用方法の確立
・CO 2 拡散のマッピング観測と広範囲な CO 2 プルーム観測による CO 2 拡散挙動解析
・海洋中での CO 2 挙動に関する観測データの蓄積と CO 2 拡散に伴う環境影響の観測
・事業化規模モニタリングシステムにおける生物影響評価の要求仕様の明確化
２）CO 2 挙動予測技術の開発
・想定海域のデータ取得とモデルの予測精度向上
・大規模・中規模・小規模・液滴スケールモデルの有機的結合
３）海洋隔離の可能性評価
①海洋隔離実適用および海洋実験のケーススタディ
・海洋隔離実適用ケースの LCA 手法によるコストおよび CO 2 発生量評価
・海洋実験(小規模～大規模)の技術的実現可能性の評価およびコスト評価
②海洋隔離の有効性評価
・BOX モデルによる排出シナリオおよび海洋隔離シナリオの設定
・中解像度全球モデルを用いた海洋の隔離量および隔離期間の再評価
・中解像度モデルから高解像度モデルへの展開
４．３
海洋隔離技術の動向調査に関する課題
・ CO 2 削減策としての海洋隔離技術は、OSPAR 条約で禁止決議され欧米の政策立案者を
中心に否定的な意見が主流になっている。また、ロンドン条約会合で CO 2 関係のテー
マとして議論されている鉄散布あるいは海洋施肥は、LP 附属書Ⅰに該当しない物質の
海洋投棄の規制の議論であること、実験の規模が論点となることなど、海洋隔離と同じ
論点を内在しており、今後の議論の成り行きを引き続き調査する必要がある。
・ OSPAR 条約決議について会議内での経緯はある程度把握されているが、海洋隔離の否
定につながった科学的根拠などの調査は十分でない。海洋隔離の認識を高めるためには、
反対者にとって、どのような情報が不足しているのかを正確に把握する必要がある。こ
れらの調査情報に基づき、海洋隔離の認知向上、ロンドン条約クリアに向けた戦略を再
28
構築することが必要である。これらの対応は、国際連携検討ワーキンググループを中心
に、今後も計画的に活動することが望まれる。
・ 海洋隔離プロジェクトの Web サイトは、閲覧者のアクセスを必要とするが、情報を常
時提供できる手法である。今後も、内容の充実を図るとともに、英語版のホームページ
作成を進める必要がある。
・ 本年度は Web フォーラムの基盤整備として、Web フォーラムシステムと海洋データベ
ースシステムの設計及び開発を実施した。このシステムにより、海洋隔離の正しい理解
の普及を図るとともに、国内外の研究者から本プロジェクトに対する見解と研究成果に
対する意見交換を行うことができる。今後は、海洋隔離のネットワークの構築を目的に、
システムの作動試験およびデータベースへの情報登録を進め、基盤システムの外部公開
に向けて作業を推進する必要がある。
29
30
第Ⅱ編
CO2 海洋隔離に伴う生物影響評価
第１章
研究課題と目標
１．１
はじめに
海洋中深層への CO 2 溶解希釈技術による CO 2 海洋隔離の事業化を検討する際には、CO 2
放出域における環境影響の予測・評価が必要となる。しかし、CO 2 海洋隔離事業は外洋域
において実施することが想定されており、従来の沿岸域における事業のように対象となる
海域を特定した環境影響の予測・評価手法はそのままでは適用できない。そこで、本プロ
ジェクトでは、CO 2 海洋隔離の環境影響評価技術の確立を目的として、新たな評価項目、
評価技術、評価基準等の検討を行うこととした。
CO 2 海洋隔離の事業化にあたっては、CO 2 の拡散を推定するための海洋物理・化学的な
評価技術、CO 2 濃度が増加することによる化学的影響の評価技術および CO 2 海洋隔離の影
響を受ける海域の生物影響の評価技術が挙げられる。こられのうち、生物影響評価技術に
関しては直接的な影響が懸念される生物、特に深海生物に関する情報の蓄積が重要と考え
られ、室内実験を中心として短期的な影響実験や深海底における現場曝露実験が実施され、
短期的な生物影響について比較的多くの情報を蓄積することができた。ケーススタディに
見られるように短期的な結果をもとにした長期影響の推定を実施しているが、長期影響デ
ータが不足しているために、推定の信頼性が低い。このため、長期影響評価技術としてこ
れまで進めてきた生態系モデルの高度化を図る。さらに、深海底生生物群集の現場実験に
より培った技術をもとに、実際に CO 2 が放出される対象水深に生息する浮遊生物群集に適
用した評価システムとしてペラジックチャンバーの開発を行うものである。
１．２
目標
１．２．１
生物影響評価手法の開発
隔離想定海域に放出された CO 2 の拡散および変化は、その海域の物理化学的環境に左右
される。拡散をうけた環境の変化が生物群集の、ひいては生態系の変化をもたらす。この
ため、CO 2 の生物影響評価としては、最終的に生態系への影響を評価することが必要とな
る。生態系への影響を考える時空間スケールは数年以上と長く、また数百 km 2 以上と非常
に大きくなるため、実実験を行なうことは不可能であり、モデルによるシミュレーション
が欠かせない。
生態系モデルについては中深層に特化して開発を行ない、中深層での特異性やモニタリ
31
ング項目の選択を検討した。本年からは、これらの成果をもとに CO 2 の拡散に伴う生態系
影響を予測するモデルへの展開として、3 次元化を進める。
１．２．２
実海域生物影響データの収集
本プロジェクトで検討されているムービングシップによる液体 CO 2 放出の結果、溶解拡
散した CO 2 は水深 1,000m から 2,500m の層に広がる。これらの水深に生息する生物に対
する影響実験は、カイアシ類に対する船上での急性致死影響実験が行なわれたのみである。
深海現場曝露実験も実施されているが、これは水深 2,000m の海底におけるベンチックチ
ャンバーを用いた実験であり、底生生物群集をもとに深海生物の特性を検討するものであ
った。群集の特性として、食物連鎖を通じた間接的な影響や、細菌群集における CO 2 環境
に適応した菌の増加などが類推されたが、このような特性が浮遊生物群集においても検証
することが必要となる。
このため、実際に CO 2 が放出される水深を対象として現場曝露実験を行う機器（ペラジ
ックチャンバー）を開発し、浮遊生物群集への影響実験を行なうことを目的とした。今年
度は、ペラジックチャンバーの採水部の開発を中心に行い、CO 2 曝露予備実験により、注
入部や制御部の検討を行なう。また、最終的な深海での実験を行なう海域のバックグラウ
ンドデータの取得を行なう。
１．２．３
深海生物の CO 2 影響研究
（１）深海生態系の研究
CO 2 海洋隔離における生物影響評価として生態系への影響が最終的な目標となるが、海
洋の生態系、特に深海生態系の構造と機能については十分な情報が蓄積されているわけで
はない。このため、生態系モデルの開発と並行して、深海生態系における研究をすすめる
ものである。
ここでは、生態系モデルの開発への寄与を優先的な目的とし、下記の項目を実施する。
①カイアシ類の食物連鎖構造の解析
生態系モデルの構造を検証するために、中深層の生態系において重要な優占分類群であ
るカイアシ類の食物起源を推定することが重要である。このため、カイアシ類に加えて、
懸濁物や表層からの沈降物の分画について安定同位体比を測定し、食物連鎖構造を推定す
る。
②生物パラメーターへの影響実験
生態系モデルによる CO 2 影響を推定するためには、基礎方程式中のパラメーターに対す
る CO 2 濃度の増加の影響として、ファクターを与える必要がある。現在のところ、致死影
32
響の閾値はあるが、亜致死としての影響が殆ど不明である。このため、基礎方程式のうち、
重要と考えられる呼吸速度に対する CO 2 濃度上昇の影響実験を行なった。
③沈降フラックスの解析
中深層生態系は表層からの沈降有機物に依存しており、沈降フラックスの定量的な情報
を得ることは重要である。また、海洋の懸濁物の凝集は海水の pH により影響を受けるこ
とが示唆されており、CO 2 濃度の増加による pH の低下は沈降フラックスの速度に影響を
与える可能性がある。このため、海洋から得られた懸濁物に対して凝集実験を行い、CO 2
による pH 低下の影響を検討する。
④微生物多様性の解析
中深層における現場曝露実験における検出技術として、生物密度が高い微生物を対象と
するためには、遺伝子工学的技術による検出技術が適している。CO 2 濃度が増加した場合、
その CO 2 環境に適応した群集構造への転換が生じることも予想される。通常の分解活性と
しては、ベンチックチャンバー実験で見られたように全体として補償される可能性もある
が、CO 2 海洋隔離が実施される水深上部は通常酸素極小層に近く、特異的な微生物活性が
存在する可能性がある。
今年度は、中深層における脱窒活性、特に N 2 O 産生に関る遺伝子の有無を検討し、検出
対象としての有効性を検討する。
（２）CO 2 影響の研究
海洋に生息する生物は、微生物から魚類に至るまで多様な種が生息している。また、そ
の機能も多岐にわたることから、一部の実験結果による影響予測から実施した CO 2 影響予
測に対して社会的な受容が得にくい主要因となっている。しかし、すべての生物種につい
て影響実験を行なうことは不可能である。そのため、このような影響評価は帰納的な推論
を実施することになる。ここでは、このような推定を行なうに必要な基本的な生物反応を
整理するために、CO 2 の生物研究を行なう。
今年度は、下記の 2 件について実施した。
①模擬深海環境化における深海生物の CO 2 影響実験
生物への CO 2 影響実験は、これまでカイアシ類と魚類について多くの結果を得ている。
しかし、深海は低温高圧のため、常圧での実験結果がそのまま外挿できるかどうかについ
ては、不明な点が多い。ここでは、生体が大きく生理的な情報を得ることが可能な魚類を
用いて、低温高圧の模擬深海環境下での CO 2 影響実験を行なう。
②深海微生物群集に対する脱窒関連遺伝子検出技術の適用性
微生物は生態系において単に有機物の分解を行なうだけでなく、さまざまな元素の物質
循環において重要な役割を担っている。そのような元素の中でも、窒素は海洋の一次生産
の制限要因となることが多く、さまざまな細菌種が関ることがわかっている。その中でも、
33
CO 2 海洋隔離を行なう水深は酸素極小層が近く、脱窒活性への影響が懸念される。深海現
場実験では、検出技術として有効な N 2 O 産生に焦点を絞って技術開発を行なっているが、
脱窒は独立に存在するのではなく窒素循環の一部を構成しているため、脱窒に関連する機
能と相互に影響を及ぼしあうと考えられる。このため、ここでは脱窒だけでなく関連する
遺伝子群を対象として、検出技術の有効性を検討する。
34
第２章 生物影響評価手法の開発
２．１ 生態系モデルの開発
CO2 の海洋隔離の環境影響評価では対象海域に生息する生物への影響を予め把握してお
くことが必要である。生物への影響に関しては、実験の容易さから個体に対する影響実験
が中心に行われてきたが、生物は個々の種で生活しているわけではなく、相互関係を考慮
した群集や生態系についての影響を把握する必要がある。この観点から底生生物群集を対
象としたベンチックチャンバー実験が実施されているが、実験期間が最長でも 2 週間程度
に限られている。深海の生態系は、表層生態系に比べて時間スケールが長く、生態系への
影響を検討するには、数年以上の時間スケールを考える必要がある。しかし、このような
影響を実験的に実施することは現実的に不可能であることから、生態系モデルによる予測
手法の必要性が生じる。
２．１．１
生態系モデルの高精度化
２．１．１－１ はじめに
昨年度まで開発を実施した生態系モデルは、1500m 以深を対象とした中深層限定の鉛直
一次元モデルであった。また、モデルで表現したコンパートメントは、動物プランクトン
（Carnivorous, Omnivorous, Micrograzer, HNF）
、デトリタス、溶存態有機物、バクテリ
アである。しかし、中深層生態系への基質供給は表層生態系が担っており、表層における
一次生産とこれを取り巻く栄養塩動態をあわせて検討することが必要となる。さらに、実
際の放出・拡散に合わせた長期的な予測を行なうためには、拡散領域をカバーできる三次
元モデルに拡張する必要がある。
２．１．１－２ 目的
本年度では、表層生態系を含めた 3 次元モデルの構築とそのモデルの再現性の確認を目
的とした。
２．１．１－３ 方法
①生態系モデルの構図
本年度用いた生態系モデルの構造および定式化は Nakata et al., (2004)1)に基づいている。
モデルの模式図を図 2.1.1-1、生物化学過程の定式化を表 2.1.1-1,2 に示す。本モデルはこれ
までの採食食物網（grazing food web）に、分解者（バクテリア）を加えた微生物食物網
（Microbial Food Web ;MFW）の構造を取り入れたモデルである。これにより、生物ポン
35
プに寄与すると思われる採食食物網と、一次生産には寄与するが生物ポンプに寄与しない
微生物食物網が卓越した海域を区別する事が可能となる。
モデルで扱う生物群のコンパートメントに関して、植物プランクトンは珪藻類（Diatoms）
、
渦鞭毛藻類（Dinoflagellates）、微小鞭毛藻類（Phytoflagellates）、ピコプランクトン
（Picophytoplankton）の 4 種類である。動物プランクトンは、ヤムシやカイアシ類
（Mesograzer）
、繊毛虫や放散虫類（Micrograzer）
、従属栄養性微小鞭毛虫類（Heterotrophic
nanoflagellates ; HNF）の 3 種類である。
植物プランクトンと動物プランクトンの食植関係は、図 2.1.1-1 で示したようにサイズに
基づいた関係となっている。また、バクテリアはデトリタスと溶存態有機物を摂取し、代
謝を通して炭素や窒素、リンを無機化している。
また、本モデルでは、植物プランクトンの栄養塩動態を詳述するために、Caperson and
Mayer(1972) 2)や Lehman et al., (1975) 3)らによって研究されたセルクォータをモデルに取
り入れている。これにより、植物プランクトンは周囲に栄養が無い状態でも、細胞内に貯
蓄した栄養塩により成長する事が可能となり、また、セルクォータのサイズにより植物プ
ランクトン現存量の空間的変化を加える事ができる。
図 2.1.1-1 生態系モデルの模式図（Nakata et al .,2004）
36
表 2.1.1-1 生態系モデルの生物化学過程の定式化①（Nakata et al .,2004）
37
表 2.1.1-2 生態系モデルの生物化学過程の定式化②（Nakata et al .,2004）
38
②座標系及び水深
モデルの計算領域は太平洋、インド洋、大西洋を含む、北緯 80 度から南緯 80 度までと
し、解像度は 2°×2°のグリッドシステムである。水深は最大 5500m で、水柱は 30 層に
分割した。層厚は生物の変化が大きい有光層域で 10m から 40m とし、中深層では 200m か
ら 500m である(表 2.1.1-3)。
表 2.1.1-3 モデルに与えた各層厚と各水深
layer
thickness
(m)
bottom
depth
layer
thickness
(m)
(m)
bottom
depth
layer
thickness
(m)
(m)
bottom
depth
(m)
1
10
10
11
60
300
21
300
1700
2
10
20
12
60
360
22
300
2000
3
15
35
13
70
430
23
300
2300
4
15
50
14
70
500
24
400
2700
5
20
70
15
100
600
25
400
3100
6
30
100
16
100
700
26
400
3500
7
30
130
17
150
850
27
500
4000
8
30
160
18
150
1000
28
500
4500
9
40
200
19
200
1200
29
500
5000
10
40
240
20
200
1400
30
500
5500
③物理場
生態系モデルに与えた物理場は、GFDL Modular Ocean Model Version2（MOM2;
Pacanowski,1996）4 )で求めた結果を使用した。海面表面における風応力は、Hellerman and
Rosenstein (1983) 5)による月平均値を与えた。水温、塩分の初期値に関しては、World Ocean
Atlas 1998 (WOA98; Levitus,1999) 6)の月平均実測値データを与えた。
物理モデルの計算期間は 1300 年、流動場の計算ステップは 1 時間、熱および塩分輸送に
関する計算ステップは、12 時間である。
④生態系モデルの初期条件分布
生態系モデルに与えた各コンパートメント初期値に関して、リン酸塩、硝酸塩、ケイ酸
塩の分布は WOA98 の年平均値を使用した。その他のコンパートメント（植物、動物プラ
ンクトン、デトリタス、DOC、アンモニア、亜硝酸塩、DO、全炭酸、アルカリ度、バクテ
リア、オパール）は、Northwest Pacific Carbon Cycle Study (NOPACCS)で、1990 年か
ら 1996 年に観測された東経 175 度線の鉛直方向のデータを全海域の分布として設定し、経
39
度方向に与えた。
⑤生態系モデルの計算条件およびパラメータ
今回、生態系モデルで使用したタイムステップは 3 時間、計算期間は 10 年の計算を実施
した。
植物プランクトンの成長に係わる、海洋表層における光強度のデータは、天測計算によ
る全球規模の日毎の太陽放射量と、日の出から日没までの空間的変化(Ikushima,1967) 7)、
雲量の月毎の実測値(the 1994 Atlas of Surface Marine Data ; da Silva et al., 1994) 8)を用
いて与えた。また、植物プランクトンの強光阻害は、Steel(1962) 9)の式を用いて表現して
いる。
今回、計算に使用した生物パラメータを表 2.1.1-4,5,6 に示した。用いたパラメータは、
Nakata et al., (2004)を基本としている。
40
表 2.1.1-4 植物プランクトンのパラメータ
Parameter
Selected Value
Unit
Phytoplankton
Maximum growth rate
Diatoms
Dinof
Phytofl
Picophyto
2.13
2.4
3.6
5.0
Baretta et al . (1997)
℃
20
20
20
20
nakata et al . (2004)
℃
T max=35
T min=－5
day
Thermal optima for growth
Hypothetical thermal
thresholds
Over which the growth activity
Maximum uptake rate
Reference
-1
T max=35
T min=－10
Calibrated
day-1
18
12
18
18
-1
12
12
12
12
μmol･l-1
1.0
1.5
0.05
0.025
for ammonium uptake
μmol･l
-1
1.5
2.0
0.1
0.1
for nitrate uptake
μmol･l-1
3.0
2.0
0.1
0.1
for silicate uptake
-1
0.3
－
－
－
Taylor et al . (1975)
-1
1.462
1.462
1.462
1.462
Wroblewski (1977)
－
－
for phosphorus
for nitrogen
day
Calibrated based on
Lehman et al . (1975)
Half saturation constants
for phosphate uptake
μmol･l
Ammonium inhibition factor
l･μmol
Maximum cell-quota capacity
P-quota 16, N-quota 8
－
2
Photosynthetic light optimum cal/cm /day
Physiological Q10 for metabolic activities
50
50
50
50
1.9
2.0
2.0
2.0
13.5% of the photosynthetic production
Extracellular release
Respiration rate at 0℃
day
3
-1
-1
Calibrated based on
Lehman et al . (1975)
Watt (1966)
0.03
0.03
0.03
0.03
Jorgensen et al . (1991)
Calibrated
0.0015
0.003
0.010
0.015
m/day
1.0
0.5
0.0
0.0
C/Chl-a ratio
by weight
50
50
50
50
Kawamiya et al . (2000)
C/P ratio (except P-quota)
by weight
161.3
161.3
35.0
35.0
C/N ratio (except N-quota)
by weight
15.9
15.9
4.5
4.5
Calibrated based on
Lehman et al . (1975)
C/Si ratio
by weight
4.5
－
－
－
O/C ratio
by weight
3.11
3.11
3.11
3.11
Natural mortality rate at 0℃ m /mgC /day
Sinking rate of living cells
Light extinction coefficient
m-1
0.03 + 0.0088・Chla + 0.054・(Chla)
41
2/3
Calibrated based on
Jorgensen et al . (1991)
Calibrated based on
Riley (1956)
表 2.1.1-5 動物プランクトンのパラメータ
Parameter
Selected Value
Unit
Zooplankton
Reference
Mesograzers
Micrograzers
HNF
day-1
0.65
1.20
2.00
Thermal optimum for feeding
℃
20
20
20
Hypothetical thermal threshold
℃
Maximal feeding rate
0.01
0.01
0.01
0.0
0.0
0.0
1.8
2.0
2.0
day
0.021
0.027
0.035
%
20
20
20
%
70
3
Feeding threshold
mgC/m
Physiological Q10 for metabolic activities
-1
Basal metabolic rate at 0℃
Fractional active metabolism
Assimilation efficiency
3
-1
Natural mortality rate at 0℃ m /mgC /day
Chemical compositions
Corresponds to b=1.94
Hypothetical setting
Kremer and Nixon
(1978)
T max=35, T min=－15
m3/mgC
Ivlev’s constant for feeding
Estimated refrring to
Taylor et al . (1993)
by weight
1.2×10
70
-3
70
-3
2.0×10
2.5×10
C/P=60, C/N=6.0, O/C=3.31
42
Ikeda (1970)
Marshall and Orr (1955)
-3
Calibrated
e.g .,
Parsons et al . (1984)
表 2.1.1-6 その他のパラメータ
Parameter
Selected Value
Unit
Reference
Bacteria
2.0
Physiological Q10
-1
Maximal up take rate at 0℃
Half saturation constants
for uptake
Oxygen limitation parameter
Detritus 0.3
DOM 0.5
mgC/m
Detritus 30
DOM 100
mgO2/l
Detritus 0.25
DOM 0.25
%
Detritus 70
DOM 70
day
3
Assimilation efficiency
Biodegradation of detritus
Analogy
with zooplankton
Assumed
10% of bacterial ingestion
－
3
Calibrated
-1
Natural mortality rate at 0℃ m /mgC /day
4.0×10-3
Calibrated
C/P ratio
by weight
45.4
C/N ratio
by weight
6.1
O/C ratio
by weight
3.42
Assumed chemical
composition at C 49%,
N 8% and P 1.1% drywt by referring to
Jorgensen et al. (1991)
day-1
0.05･exp(0.0693T)
Kamatani (1971)
Detritus and DOM
Dissolution rate of
particulate silica
C/P ratio
by weight
Detritus 47.6
DOM 123.5
C/N ratio
by weight
Detritus 13.3
DOM 30.3
O/C ratio
by weight
Detritus 3.01
DOM 2.82
Sinking rate of detritus
Applied typical values
in estuarine waters
m/day
10.0
Sarmiento et al. (1993)
day-1
0.02･exp(0.0693T)
-1
day
0.03･exp(0.0693T)
Calibrated referring to
Taguchi et al . (1988)
mgO2/l
2.5
Nutrients
Nitrification rate of ammonium
Nitrification rate of nitrite
Oxygen limit for nitrification
Sea surface aeration rate
Sea surface CO2 transfer
piston velocity
Atmospheric partial pressure
of CO2
-1
day
0.5
m/day
4.8
Liss and Merlivat (1986)
μatm
350
Taylor et al . (1991)
２．１．１－４ 現況再現計算結果
①既存パラメータ(Nakata et al., 2004)の結果
上述した条件を用いて、今回使用した生態系モデルの現況再現シミュレーションを実施し
た。計算値の結果を評価するために使用したデータは、次の通りである。
ａ．環境影響予測技術研究開発で得られた亜熱帯海域（北緯 22 度 30 分・東経 131 度
55 分；以後 St.A と呼ぶ）の 2003 年～2006 年の平均値。
ｂ．平成 9 年度から 13 年度にかけて実施された二酸化炭素の海洋隔離に伴う環境影響
予測技術研究開発－海洋調査及び CO2 の隔離能力評価技術の開発－で調査された
43
亜寒帯海域（北緯 44 度・東経 155 度；以後 St.B と呼ぶ）の 1998,1999 年の平均
値。
ｃ．World Ocean Atlas 2001 の Chlorophyll-a、NO3-N、PO4-P の平面分布。
既存パラメータで計算した結果、観測点 2 点（St.A, St.B）の計算値と観測値の鉛直分布
図（図 2.1.1-2）は、亜熱帯域（St.A）では Chlorophyll-a、PO4-P、NO3-N が、観測値の
鉛直分布とほぼ一致している。亜寒帯域（St.B）では、Chlorophyll-a は 20～50m 付近に
表れるピークが、観測値よりも高い結果となっているが傾向は捉えている。PO4-P、NO3-N
の計算値は、1000m 以深で観測値との整合性があるが、500m 付近に表れる濃度のピーク
が反映されていない。
次に、北緯 0 度～90 度、東経 120 度～西経 140 度までの太平洋の表層の水平分布図を図
2.1.1-3 に示す。ただし、モデルでは北極海は特異点（北極点）を含むため、考慮していな
い。計算値の Chlorophyll-a の分布は、オホーツク海からベーリング海にかけての濃度が高
い海域と亜熱帯のような濃度が低い海域を表現することができた。計算値の栄養塩（NO3-N、
PO4-P）の分布は、亜熱帯域の低濃度の海域は再現できたが、ベーリング海周辺に関しては、
高い濃度の分布を再現するに至っていない。この原因として、ベーリング海は北極海から
豊富な栄養を含んだ海水が流入することから、モデルが北極海を考慮していないためと考
えられる。
次に、中深層の動物プランクトン、バクテリア、デトリタスの現存量と有機物の沈降フラ
ックスを図 2.1.1-4 に示す。亜寒帯域のバクテリア、デトリタスの現存量に関して、計算値
は観測値と同程度のオーダーを示した。亜熱帯海域は、バクテリアの現存量は観測値と同
等のオーダーが得られたが、デトリタスの現存量が観測値よりも 1 オーダー低い結果とな
った。また、計算値のデトリタスの現存量は、亜熱帯と亜寒帯での海域の違いが見られな
かった。動物プランクトンに関して、亜熱帯、亜寒帯共に、計算値は現存量がほとんど皆
無であった。
有機物の沈降フラックスは、セジメントトラップで得られた観測結果とモデルの結果を比
較した。その結果、亜寒帯海域の 5000m で観測値と同等の値が得られたが、それ以外は計
算値が観測値よりも過大となった。
44
0
0.5
Chl-a (μg/l)
1
1.5
2
0
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
Depth (m)
Depth (m)
（a）
100
120
model
Observation
140
0.5
120
2
model
Observation
160
160
180
180
200
St.A
（b）
0
1
PO4-P (μmol/l)
2
St.B
3
4
0
0
0
1000
1000
2000
2000
Depth (m)
Depth (m)
1.5
100
140
200
3000
4000
1
4
model
Observation
6000
St.A
0
10
NO3-N (μmol/l)
20
30
St.B
40
50
0
0
1000
1000
2000
2000
Depth (m)
0
3000
4000
3
5000
6000
（c）
PO4-P (μmol/l)
2
3000
4000
model
Observation
5000
Depth (m)
Chl-a (μg/l)
1
model
Observation
NO3-N (μmol/l)
20
30
40
50
3000
4000
5000
10
model
Observation
5000
6000
6000
St.A
St.B
図 2.1.1-2 既存パラメータによる計算結果と観測値の鉛直分布図
（左：亜熱帯, 右：亜寒帯）
（a）Chlorophyll-a, （b）PO4-P, （c）NO3-N
45
Latitude
Longitude
Longitude
Latitude
Chl-a （μg/l）
Longitude
Longitude
Latitude
NO3-N （μmol/l）
Longitude
Longitude
PO4-P （μmol/l）
図 2.1.1-3 既存パラメータによる計算結果と観測値の表層水平分布図
（左：WOA01, 右：計算値）
作図海域：北緯 0 度～90 度, 東経 120 度～西経 140 度
46
（a）1.00E+01
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
Log Biomass (mgC/m3 )
1.00E+00
1.00E-01
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
Detritus
MesoG.
亜熱帯比較 (1500-2500m)
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
1.00E+01
Log Biomass (mgC/m3 )
1.00E+00
1.00E-01
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
MesoG.
Detritus
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
Log Biomass (mgC/m3 )
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
Detritus
MesoG.
2
（b）
0
flux (mgC/m /day)
10
20
30
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (2000-3000m)
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (3000-4000m)
2
40
0
flux (mgC/m /day)
20
40
60
1230
1000
Depth （m）
1940
2930
3740
2000
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
5000
4670
Organic Carbon flux 比較 （亜熱帯海域）
Organic Carbon flux 比較 （亜寒帯海域）
図 2.1.1-4 既存パラメータによる中深層の計算結果と観測値
（a）動物プランクトン、デトリタス、バクテリアの現存量
（b）有機物沈降フラックス
47
Detritus
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
亜熱帯比較 (3500-5500m)
Depth （m）
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E+00
1.00E-01
Detritus
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
亜熱帯比較 (2500-3500m)
1.00E+01
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (1500-2000m)
80
Detritus
②感度解析の結果
既存パラメータで計算した場合、表層の分布は概ね再現できているが、中深層の動物プラ
ンクトン現存量を全く再現できなかった。そこで、動物プランクトンの再現性を向上させ
るため、2 種類の感度解析を行なった（表 2.1.1-7）
。
表 2.1.1-7 感度解析で変更したパラメータ一覧
沈降速度(m/day)
動物プランクトン成長最適温度(℃)
既存パラメータ
10
20
CASE01
20
20
CASE02
10
5
1 つ目の解析は、現状のデトリタスの沈降速度を 10m/day から 20m/day に増加させ、動
物プランクトンの餌を増加させた場合である。結果は図 2.1.1-5 に示す。
亜寒帯海域の動物プランクトンの現存量は、HNF に関しては半オーダー増加したが、そ
れ以外は既存の結果と変わらなかった。亜熱帯海域に関しては、全く既存の結果と変わら
なかった。これは、元々表層の生産量が少ないので沈降速度を上げても、落ちてくるデト
リタスの量が少ないため、効果が低いと考えられる。また、デトリタスの沈降速度を上げ
たため、計算結果の有機物の沈降 flux がかなり大きくなり、観測値との差が開いてしまっ
た。
1 つ目の結果を踏まえ、2 つ目の解析では動物プランクトンの成長最適温度に着目した。
1000m 以深の水温は 5℃以下となっており低温である。既存のパラメータは表層の生態系
を対象としているため、動物プランクトンの最適温度は 20℃である。よって、2 つ目の解
析では最適温度を 5℃とし、低温度でも動物プランクトンの成長が大きくなるように設定し
た（図 2.1.1-6）
。結果は図 2.1.1-7 に示す。
亜熱帯域の HNF が 1500-2500m 層で既存の計算結果より 1 オーダー増加し、デトリタス
の沈降速度を上げた条件より増加した。亜寒帯域の 1500-2000m 層でも HNF が、既存の計
算結果よりも微増したが、それら以外は既存の結果と変わらなかった。今回の条件で亜寒
帯域よりも亜熱帯域で HNF が増加した理由としては、デトリタスの沈降速度が 10m/day
の場合、中深層での動物プランクトンの餌となる、デトリタスやバクテリアの現存量が、
亜寒帯域、亜熱帯域であまり変わらない事と、1500m 付近まで亜熱帯の水温が亜寒帯より
も成長最適温度に近いためではないかと考えられる（図 2.1.1-8）
。
48
（a）1.00E+01
1.00E+00
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
Log Biomass (mgC/m3 )
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
Detritus
MesoG.
亜熱帯比較 (1500-2500m)
2
（b）
Detritus
2
flux (mgC/m /day)
10
20
30
0
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (1500-2000m)
40
flux (mgC/m /day)
20
40
60
0
80
1230
1000
Depth （m）
Depth （m）
1940
2930
2000
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
3740
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
5000
4670
Organic Carbon flux 比較 （亜熱帯海域）
Organic Carbon flux 比較 （亜寒帯海域）
図 2.1.1-5 沈降速度 20m/day 時の中深層の計算結果と観測値
（a）動物プランクトン、デトリタス、バクテリアの現存量
（b）有機物沈降フラックス
4
4
3.5
Meso.G
Micro.G
3.5
HNF
3
growth rate （day-1）
growth rate （day-1）
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E-01
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
2.5
2
1.5
1
0.5
Meso.G
Micro.G
HNF
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
-10
-5
0
5
10
15
20
temp （℃）
25
30
35
40
-10
-5
0
5
10
15
20
temp （℃）
25
30
35
40
図 2.1.1-6 動物プランクトンの成長曲線（左：最適温度 20℃, 右：最適温度 5℃）
49
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
1.00E+01
Log Biomass (mgC/m3)
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
Detritus
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
MesoG.
亜熱帯比較 (1500-2500m)
観測値亜熱帯
計算値亜熱帯
1.00E+01
Log Biomass (mgC/m3)
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
MicroG.
HNF
Bacteria
1.00E+01
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
1.00E-11
MesoG.
Detritus
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (2000-3000m)
図 2.1.1-7 最適温度 5℃時の中深層の計算結果と観測値
0
Temperature（℃）
5
10
15
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
亜熱帯
亜寒帯
図 2.1.1-8 MOM2 で計算された亜熱帯・亜寒帯域の年平均の水温鉛直分布
50
Detritus
観測値亜寒帯
計算値亜寒帯
亜熱帯比較 (2500-3500m)
depth（m）
3
Log Biomass (mgC/m )
1.00E+00
1.00E-01
MicroG.
HNF
Bacteria
亜寒帯比較 (1500-2000m)
Detritus
③定常状態の確認
今回、本モデルで行なった計算期間は 10 年であった。表層生態系に関しては、この程度
の計算期間で定常に達するが、中深層に表層と同じ時間スケールで定常に達する点につい
ては疑問が残る。そこで、既存のパラメータを用いて 40 年間の計算を行ない、定常状態の
確認を行なった。
計算期間 40 年の動物プランクトン、デトリタス、バクテリアの時系列変化を図 2.1.1-9,10
に示す。中深層の動物プランクトンは計算開始から 2 年で現存量がなくなった。デトリタ
スは水深 1500m で、計算開始から 2 年程、5000m で 5 年程経過してから、バクテリアは
1500m で 3 年程、5000m で 8 年程経過してから急激な変化が収まっている。バクテリアや
デトリタスについては現存量が保存され、定常状態に達することができたが、動物プラン
クトンについては定常に達せず、パラメータの見直しが必要と考えられる。
51
3
Biomass（mgC/m ）
（a）1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
y00,d000
y05,d000
Mesograzer
y10,d000
y15,d000
Micrograzer
y20,d000
y25,d000
y30,d000
y35,d000
y40,d000
Heteroflagellate
（b）
3
POC Biomass（mgC/m ）
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y00,d000
y05,d000
y10,d000
y15,d000
y20,d000
POC
y25,d000
y30,d000
y35,d000
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y40,d000
Bacteria Biomass（mgC/m3）
1.40
Bacteria
3
Biomass（mgC/m ）
（c）
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
y00,d000
y05,d000
y10,d000
Mesograzer
y15,d000
y20,d000
Micrograzer
y25,d000
y30,d000
y35,d000
y40,d000
Heteroflagellate
（d）
3
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y00,d000
y05,d000
y10,d000
y15,d000
y20,d000
POC
y25,d000
y30,d000
y35,d000
Bacteria
図 2.1.1-9 計算期間 40 年における亜熱帯海域の時間変化
(a) 水深 1500m の動物プランクトン現存量
(b) 水深 1500m の Detritus と Bacteria 現存量
(c) 水深 5000m の動物プランクトン現存量
(d) 水深 5000m の Detritus と Bacteria 現存量
52
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y40,d000
Bacteria Biomass（mgC/m3 ）
POC Biomass（mgC/m ）
1.40
3
Biomass（mgC/m ）
（a）
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
y00,d000
y05,d000
y10,d000
Mesograzer
y15,d000
y20,d000
Micrograzer
y25,d000
y30,d000
y35,d000
y40,d000
Heteroflagellate
（b）
3
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y00,d000
y05,d000
y10,d000
y15,d000
y20,d000
POC
y25,d000
y30,d000
y35,d000
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y40,d000
Bacteria Biomass（mgC/m3 ）
POC Biomass（mgC/m ）
1.40
Bacteria
3
Biomass（mgC/m ）
（c）
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-06
1.00E-07
1.00E-08
1.00E-09
1.00E-10
y00,d000
y05,d000
y10,d000
y15,d000
Mesograzer
y20,d000
y25,d000
Micrograzer
y30,d000
y35,d000
y40,d000
Heteroflagellate
（d）
3
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y00,d000
y05,d000
y10,d000
y15,d000
y20,d000
POC
y25,d000
y30,d000
y35,d000
Bacteria
図 2.1.1-10 計算期間 40 年における亜寒帯海域の時間変化
(a) 水深 1500m の動物プランクトン現存量
(b) 水深 1500m の Detritus と Bacteria 現存量
(c) 水深 5000m の動物プランクトン現存量
(d) 水深 5000m の Detritus と Bacteria 現存量
53
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y40,d000
Bacteria Biomass（mgC/m3 ）
POC Biomass（mgC/m ）
1.40
④コンパートメントの改良
今年度は、今後展開するための生態系モデルの拡張として、動物プランクトンの食性別
構造への分割および炭酸カルシウム外骨格生物の導入（図 2.1.1-11）を行なった。今後、有
孔虫や円石藻などの炭酸カルシウムを持つプランクトンのフラックスやパラメータの情報
を収集し、方程式や組み込み方法を検討する。
図 2.1.1-11 今年度拡張したモデルの模式図
赤線で囲んだコンパートメントが、今回新しく追加したもの。
54
２．１．１－５ 考察
今回行なった解析に関して、表層のモデルの再現性は高いが、中深層の再現性、特に動
物プランクトンの現存量については再現性を得ることはできなかった。動物プランクトン
のモデルの現存量は図 2.1.1-9 を見る限り、初期段階で急激に減少し、感度解析で餌の量を
増やすためデトリタスの沈降速度を 10m/day から 20m/day に変更しても、
亜寒帯域の HNF
が微増した以外は変化が無かった。次に、デトリタスの沈降速度を既存に戻し、最適温度
を 5℃に設定し低温度でも成長しやすい状況での解析を行なった。この解析の結果では、亜
寒帯域の HNF が 1 オーダー増加した以外は、大きな変化は見られなかった。特に、ヤムシ
類やカイアシ類を含んだ Mesograzer に関しては、これらの感度解析においても結果がほと
んど変わっていない。現在の基礎方程式は、ろ過食性の動物プランクトンの式を利用して
おり、餌密度に依存する問題がある。表層の動物プランクトンの摂食方法として、ろ過食
性が多いため、このパラメータが適合しているが、中深層の動物プランクトンはろ過食性
のものが殆ど出現せず、中深層動物プランクトンの摂食方法を考慮した改善が必要である。
今回は、3 次元化に広域の再現パターンの確認を目的としたため、このパラメータについて
は修正していない。今後、中深層一次元モデルで試みた IVLEV 定数の変更など、層に応じ
たパラメータの適用が必要と考えられる。
また、Mesograzer に関してはマイグレーション（日周鉛直運動）による表層での捕食と
中層への持込も重要になってくるのではないかと考えられる。
有機物の沈降フラックスに関して、計算値は全体的に観測値を上回った。この原因とし
て、現モデルのデトリタスを 1 種類で与えていることが挙げられる。現在のモデルでは、
動物プランクトンの糞や植物・動物プランクトンの死骸は、全て 1 種類のデトリタスに組
み込まれ沈降していく。しかし、実際のプランクトンの死骸や糞は、種類によって大きさ
が違っており沈降速度が違う。デトリタスをサイズで分けたモデルは GOM（Green Ocean
Model; Quéré et al., 2005）10)がある。GOM ではデトリタスを 2 つのサイズ（large detritus,
small detritus）に定義し、プランクトンが排出する糞や死骸をプランクトンの種類によっ
て分けている。本モデルにおいてもデトリタスを分別して、別々の沈降速度を与えること
で、過大評価であった有機物沈降フラックスの精度を向上させることができると考えられ
る。
55
２．１．１－６ まとめ
今年度、三次元かつ表層生態系を考慮したモデルを用いて現況再現を行なった。その結
果、表層の chlorophyll-a 分布、観測点 A,B の chlorophyll-a・栄養塩（PO4-P,NO3-N）の
鉛直分布は概ね再現できた。しかし、中深層の動物プランクトン現存量が観測値より大き
く下回り、有機物沈降フラックスは過大評価となった。また、動物プランクトンの再現性
では摂食方法に応じた改善が必要と考えられた。
２．１．１－７ 今後の課題
今回、既存で用いた生物の過程式および生物パラメータは、表層生態系において実績を
残してきたものである。よって、表層のモデルの再現性は高いが、中深層に関しては再現
性がかなり悪い。今後の課題としては、
① 中深層の動物プランクトンの再現性向上
② 有機物の沈降フラックスの再現性向上
が挙げられる。①に関しては最適温度のみを変更しても効果が低かったため、中深層鉛直
１次元モデルでおこなった Ivlev 定数の修正やマイグレーション、死亡速度など変更し感度
解析を行なう必要がある。②に関しては、デトリタスのサイズによる分割化を行うことが
重要である。
拡張したモデルの計算実施は、現行のモデルの再現性が向上することと、新しく追加し
たコンパートメントの生態を文献などから情報を集めてから行なう予定である。
56
引用文献
1) Nakata, K., T. Doi, K. Taguchi and S. Aoki (2004) Characterization of Ocean
Productivity Using a New Physical-Biological Coupled Ocean Model. Global
Environmental Change in the Ocean and on Land, 1-44
2) Caperon, J. and J. Meyer (1972) Nitrogen-limited growth of marine phytoplankton, I.
Changes in population characteristics with steady-state growth rate, Deep-Sea Res.,
19A, 601-618.
3) Lehman, J.T., D.B. Botokin and G. E. Likens (1975) The assumptions and rationales
of a computer model of phytoplankton population dynamics, Limnol. Oceanorg., 20,
343-364.
4) Pacanowski, R. C. (1996) MOM2 Version 2.0 (Beta) Documentation, user’s guide and
reference manual, GFDL Ocean Teck. rep. 3.2, Geophys. Fluid Dyn. Lab. Princeton,
N.J., 329pp.
5) Hellerman, S. and M. Rosenstein (1983) Normal monthly wind stress over the world
ocean with error estimates, J. Phys. Oceanogr., 13, 1093-1104.
6) Levitus, S. (1999) World Ocean Atlas 1998, version 1.1, U.S. National Oceanographic
Data Center.
7) Ikushima, I. (1967) Ecological studies on the productivity of aquatic plant
communities, Bot. Mag., Tokyo, 80, 57-67.
8) da Silva, A., A.C.Young and S. Levitus (1994) Atlas of Surface Marine Data 1994,
Volume 1 : Algorithms and Procedures. NOAA Atlas NESDIS 6, U.S. Department of
Commerce, Washington, D.C.
9) Steel, J.H. (1962) Environmental control of phytosynthesis in the sea, Linmol.
Oceanogr., 7, 137-150.
10)Corinne Le Quéré, Sandy P. Harrison, I. Colin Prentice, Erik T. Buitenhuis, Olivier
Aumont, Laurent Bopp, Hervé Claustre, Leticia Cotrim Da Cunha, Richard Geider,
Xavier Giraud, Christine Klaas, Karen E. Kohfeld, Louis Legendre, Manfredi
Manizza, Trevor Platt, Richard B. Rivkin, Shubha Sathyendranath, Julia Uitz, Andy
J. Watson and Dieter Wolf-Gladrow (2005) Ecosystem dynamics based on plankton
functional types for global ocean biogeochemistry models, Global Change Biology, 11,
2016-2040.
57
第３章
３．１
実海域生物影響データの収集
生物影響海洋実験
二酸化炭素(CO 2 )の生物影響に関する研究は、これまで、単一種を対象として個体ある
いは個体群を用いた室内実験が行われている。また、群集に対する CO2 影響実験として、
浅海の生態系を単純化した陸上メソコズム実験やベンチックチャンバーを利用した深海底
ベントス群集に対する現場実験が実施され、いくつか知見が得られている。しかし、単一
種のみを扱った実験では CO 2 放出水深に生息する現場の生物を使った実験が極めて僅か
である。また、群集実験のメソコズム実験は、浅海での群集に対する影響であり、得られ
た結果を用いて深海の生態系への影響を評価するには外挿性に問題がある。過年度の研究
から深海底生生物群集の現場曝露実験により深海生物の特性は把握できたが、最終的には
CO2 放出水深の浮遊生態系への曝露実験を行なうことが社会的受容性を得るためにも必要
と考えられる。
海洋中への放出実験については、CO 2 液滴の挙動を追跡するためにこれまで計画は行な
われてきたものの、社会的な状況から実施には至っていない。また、放出された CO 2 の生
物影響をそのような開放系での実験で検出するための手段は確立されていない。このよう
な状況においては、海洋中深層の浮遊生態系に対する CO 2 影響評価として海洋中深層の水
塊を囲い込むチャンバー実験を行うことが研究方法として有効と考えられる。そこで、今
年度より海洋中深層現場囲い込み実験装置（ペラジックチャンバー）の開発を行うことと
した。また、この実験を通じて CO 2 影響の検出技術についても検討する。
３．１．１
ペラジックチャンバーの開発
３．１．１－１
はじめに
CO2 海洋隔離における海洋中層浮遊生物群集への影響を評価するために、複数の食物栄
養段階を含む浮遊生物群集を対象としたペラジックチャンバーを開発することが課題であ
る。また、曝露実験装置開発と並行して、下記に示すような検出機能を検討することも大
きな課題である。これらの成果は、今後 CO 2 海洋隔離の開放系実験や事業化における生物
影響評価技術やモニタリング技術として活用することを目指している。
①経時的観察・観測機能の開発：チャンバー内の計測項目として水温、圧力、DO、pH
などの物理化学項目を測定する機能、および視覚的な観察方法を検討する。
②曝露後の生物現存量や組成の評価技術の開発：曝露による生物量や組成の変化を把握
するための計測方法を検討する。
③微生物機能および微生物多様性の評価技術の開発：中深層の微生物機能として重要と
58
みなされる機能（例えば脱窒、メタン生成など）の特異的 DNA 配列を用いた分子生
物学的手法による検出技術について検討する。
本年度は、ペラジックチャンバーの採水部の製作と制御部の試作を行い、陸上および浅
海域において基本動作の確認実験を実施した。
３．１．１－２
装置および実験概要
チャンバー実験では、複数のチャンバーを備え、１つは対照区、残りは影響評価したい
物質等（ここでは CO2 ）を曝露する実験区として設定して、影響を検討する。これまで実
施してきたベンチックチャンバー実験を踏まえて、ペラジックチャンバーは対照区と２つ
の曝露区を有する装置として開発を進めることとした。CO 2 影響の検出技術もベンチック
チャンバー実験で実施した手法を参考にし、実験終了時における生物量と生物活力および
実験中の酸素濃度の経時的モニタリングから見積もられる酸素消費量などを採用する予定
である。
ペラジックチャンバー開発にあたっては、装置のサイズ、水塊囲い込み方法が大きな課
題である。沿岸浅海域や陸上において実施されているメソコズム実験などの囲い込み実験
は、大気開放の実験系であり、評価対象の生物の密度に適した容積を有する設備の施工や
生物を濃縮して収容するなど、種々のアレンジが可能である。しかし、海洋中深層におけ
る囲い込み実験は、中深層で密閉した状態を保たなければならないことと、船舶で運搬、
設置および回収作業を実施しなければならないことから、装置の形状や大きさには制限が
ある。本事業では、調査船舶で運搬でき、深海における設置・回収作業が比較的簡易にで
きること、比較的短期間での開発が可能なことおよび CO 2 影響が検出できる最小限の生物
量が確保できることに主眼をおいて開発を行うこととした。開発期間とコストの観点から、
チャンバーには東京大学海洋研究所が開発した容積 250L の大型採水器を利用することが
適していると考えられ、この装置を参考にして開発を進めることとした。
ところで、CO 2 海洋隔離において放出想定海域としている場所は、北太平洋亜熱帯循環
域にあたり、水深約 5500m の中深層（1000m～2500m）である。同海域は、「海の砂漠」
とも呼ばれ、生物量が非常に少ない海域であることが知られている。同海域のこれまでの
海洋調査からも、同水深帯における生物量は、亜寒帯海域や移行域と比べて極めて低いこ
とが明らかとなっている。
ところで、開発機器の性能を評価・判断するためには、このような生物量が希薄な海域
ではなく、確実に検出可能な生物量を有している海域を利用するほうが適していると考え
られる。また、隔離想定海域は亜熱帯海域とかなり遠方になり、回航までの日数がかかる
ことや荒天による実施の不確実性が大きく、機器の動作試験サイトとしては適していない。
そのため、ペラジックチャンバー実験は、西部北太平洋の亜寒帯海域と亜熱帯海域の移行
域で、生物量が多いことが予測される宮城県塩釜沖で実施することを計画した。
59
３．１．１－３
装置仕様
本装置は、任意の水深に係留し、現場海水をチャンバー内に密閉して、任意の時刻また
はインターバルでチャンバー内に CO 2 海水を注入し、チャンバー内の水質を測定できるこ
とを目標とする。
CO2 海水の注入時刻、注入量、水質の測定間隔の設定や記録データはメモリーにより保
存し、その読み出しはコンピューターにて行う。
①
製作内容
本年度は、以下に示すシステムの基本性能を確認できる装置の開発を行う。
（ａ）250L の海水が採水できるチャンバーを搭載できる
（ｂ）海中にて採水筒の蓋を閉め海水を囲い込むことができる
（ｃ）装置回収後、船上にて採水したサンプルが漏れ出さない
（ｄ）採水筒内に CO 2 海水の注入ができる
（ｅ）採水筒内からサンプルの抽出ができる
②
構成
図 3.1.1-1 に外観図を示す。
本装置は、同一のユニットを 3 ユニット搭載し、各ユニットは制御ユニット、バッテリ
ユニット、採水筒、CO 2 注入ポンプ、循環ポンプ、CO 2 バッグから構成される。さらに、
各ユニットを搭載できるフレームと各採水筒の蓋開閉機構より構成される。
本年度は、フレーム、蓋開閉機構、採水筒、制御ユニット、バッテリユニットを開発し
た。
③
仕様
（ａ）概要
最大使用水深 3,000m
寸法
φ1550×H2380mm
質量
未定（可能な限り軽量）
水中重量
材質
未定（
〃
）
（耐圧容器）アルミニウム、ポリアセタール
（フレーム）ステンレス
（採水筒）硬質塩化ビニル
（チューブ）バイトン
最大搭載ユニット数
3 ユニット
最大採水容量 250ℓ×3 ユニット
60
最大設置期間 2 週間
動作間隔
1 分以上で任意に設定可能（動作条件により変動）
動作環境
0℃～+40℃
（ｂ）制御ユニット
耐圧容器材質 アルミニウム
プロセッサ
TMPZ84C015BF-8
システムクロック
８ビット CPU
6.144MHz
タイマー
リアルタイムクロック (±10ppm 以下)
消費電流
最大 150mA（各ポンプの消費電流は含みません）
設定方法
RS232C 通信（Windows 版専用通信ソフト付属）
通信条件
速度 9600bps,ﾃﾞｰﾀﾋﾞｯﾄ 8,ﾊﾟﾘﾃｨﾁｪｯｸなし,ｽﾄｯﾌﾟﾋﾞｯﾄ 1
電源
DC12V
モータ制御数 6 台（CO 2 注入ポンプ、注入口切替バルブ、循環ポンプ、採水ポンプ、
採水口切替バルブ、採水筒蓋開閉機構）
（ｃ）バッテリユニット
耐圧容器材質 アルミニウム
使用コネクタ VSG-4-BCL（Brantner 製）
内蔵電池
充電式二次電池
定格容量
DC12V、20Ah
充電方式
定電圧充電（充電電圧：13.8V）
（ｄ）チャンバー
容器材質
硬質塩化ビニル
採水容量
250L
CO 2 注入口
鉛直方向に 5 箇所
採水口
鉛直方向に 5 箇所
※CO 2 注入口と採水口はできるだけ離して設ける
61
３．１．１－４
動作試験方法と結果
ペラジックチャンバーを写真 3.1.1-1 に示す。チャンバー内部の上方には、チャンバー内
海水を攪拌するためにスターラを取り付けた（写真 3.1.1-2）。
ペラジックチャンバーの実海域動作試験は、平成 20 年 3 月 15 日から 3 月 22 日にかけ
て 第 5 海 工 丸 を 傭 船 し て 実 施 し た 。 実 施 場 所 は 、 塩 釜 沖 の 海 底 水 深 350m 地 点
（38-12N,141-50E）である。この地点において水深 300m の海水を採水し、海水囲い込み
動作の確認および CO 2 曝露検討実験を船上および陸上において実施した。
①
②
日程：
3 月 15 日（土）
塩釜機器搬入、艤装、出港
3 月 15 日（土）～18 日（火）
金華山沖（38-12N,141-50E）
3 月 18 日（火）
塩釜帰港
3 月 18 日（火）～20 日（木）
陸上実験
方法概要：
実験は 3 回実施した。１回目の実験は機器動作確認およびチャンバー間における試料の
安定性を検討することを目的とした。チャンバー実験は実験終了時に対照区と曝露区とを
比較して影響を検出することから、チャンバー間の実験初期値の安定性の評価が重要であ
る。機器動作確認試験は、3 月 16 日 11：18 に水深 300m において実施した。動作状況の
確認は、装置を船内に揚収した後に蓋が作動しており、採水が確実になされているかどう
か、水漏れが生じていないかどうかを観察することで行った。また、実験初期データとし
てチャンバーから以下の試料を採取した。
（ａ）生物量：バクテリア、単細胞生物、多細胞生物、POC
（ｂ）生物活性：呼吸酵素活性、ATP
（ｃ）バクテリア組成
（ｄ）水質：pH、T- CO2 、DO、栄養塩、アルカリ度
2 回目の実験は、CO 2 の注入量、拡散状況の確認を行った。3 月 16 日 14：20 に、1 回
目の実験同様、水深 300m から採水し、船上で 3 つのチャンバーに、それぞれ同じ高濃度
CO 2 海水を約 4Ｌずつ注入し、写真 3.1.1-3 に示すように pH センサー（TOA
DKK 製、
HM-30R）を取り付け、pH の変化から CO 2 の拡散状況を観察した。pH センサーによるデ
ータ取得の間隔は、チャンバーごとで変え、10 秒間、1 分間および 5 分間とした。3 月 17
日 9：00 頃に実験を終了し、上記同様の試料を採取した。
3 回目の実験は、CO 2 曝露予備試験を行った。3 月 17 日 13：40 に、水深 300ｍから採
水し、船上および陸上における約 3 日間の曝露実験を実施した。船上で生物試料採取後、
3 本のチャンバーに、それぞれ異なった濃度の CO 2 海水を所定量注入し、チャンバー内の
62
CO 2 濃度が約 2000μatm と約 5000μatm になる曝露区とコントロールを設定した。実験終
了時に、上記同様の試料を採取した。写真 3.1.1-3 に示すように pH センサーおよび DO
センサー（Automatic System Research 社製 Model FO-960；蛍光式）を取り付けた。そ
れぞれのセンサーによるデータ取得の間隔は５分間とした。曝露の期間は 3 月 17 日 17：
00 から 3 月 20 日 16：00（71 時間）とした。
添加する海水には、近畿大学富山試験場で汲み上げられた水深約 100m の海水(0.45μm
ろ過済み）をベース海水とし、純 CO 2 ガスと N 2 ガスをそれぞれ 100ml/min で、5 時間曝
気して調製した酸素フリーのそれぞれの飽和海水を用いた。飽和海水は 1L 容のアルミニ
ウムバッグに収納し、使用するまで冷暗所に保存した。CO 2 ガス飽和海水は 5000μatm 用、
N 2 ガス飽和海水はコントロール用、両者を１：１で混合した海水を 2000μatm 用とし、そ
れぞれ約 4L 容（全容量の 1.6％）をチャンバーに注入した。注入はペリスタポンプを用い、
内径 8mm のホースを介して約 5ml／秒の速度でチャンバー上部から行った。注入量は、
CO2SYS プログラムを用い、アルカリ度 2256µeq/l（ベース海水の報告値
1 ））
、塩分
34‰、
水温 5 とし、計算される CO 2 濃度が約 5000μatm となる pH を求め、あらかじめ試験管
レベルで求めた CO 2 ガス飽和海水添加量と pH の間にある以下に示す関係式から試算して
決定した。なお、試験管レベルで行った検討試験に用いたベース海水は、上述した近畿大
学富山試験場の海水であり、pH は 8.04 であった。
CO 2 ガス飽和海水添加％ = 444080EXP(－1.7912pH)
③
（R＝0.99975）
結果
（ａ）動作および試料安定性
所定水深で作動させた装置を船内に揚収し蓋の作動状況を確認したところ、全ての試験
で蓋は正常に作動しており、採水が確実にできていることが確認できた。また水漏れは生
じていなかった。表 3.1.1-1 に水質分析結果を示す。採水直後の水質は、3 つのチャンバー
全てがほぼ同じ値を示しており、プログラムの通り所定水深で正常に作動し、採水できて
いることが確認された。
（ｂ）高濃度 CO 2 海水による曝露状況
図 3.1.1-2 に 2 回目に実施した実験の pH 観測結果を示す。高濃度 CO 2 海水注入後は、
pH は、いずれのチャンバーも約 15 分経過後に約 7 まで低下し、実験終了時までその値を
維持していた。このことから、高濃度 CO 2 海水は、注入後にチャンバーの一部に留まるこ
となく、速やかにチャンバー全体に均一に拡散することが確認された。
（ｃ）CO 2 曝露予備実験
図 3.1.1-3 に 3 回目に実施した実験の pH、DO および水温の観測結果を示す。pH は、
63
コントロール、2000μatm 実験区および 5000μatm 実験区が、ぞれぞれ約 8、約 7.4 およ
び約 6.9 を維持していた。DO は、水温と対応した挙動を示した。これは、DO センサーが
蛍光検出法を採用しているために、水温による蛍光強度の変動によるものと考えられ、セ
ンサーの水温補正機能が不十分なためと考えられた。補正機能が不十分である点は、実験
初期の DO がチャンバー間で差が認められることからも示唆され、今後、水温による補正
ファクターを整備、補正機能の改善を行わせる必要がある。酸素消費速度は、これまで実
施したベンチックチャンバー実験において CO2 の影響を受けることが示唆されているが、
今回の結果からチャンバー間の酸素消費速度を今回の DO センサーから推定することは困
難と考えられた。
そこで、実験開始時と終了時に採水してウインクラー法で求めた DO の差から酸素消費
速度を算出した。その結果、コントロール、2000μatm 実験区および 5000μatm 実験区で
それぞれ、89.2、171.5 および 22.8 O2 mg/m 3 /day となり、コントロールに対して 2000μatm
実験区では酸素消費速度が昂進し、5000μatm 実験区では抑制される結果となった。チャ
ンバー内にはバクテリア以外に原生動物など他の動物も存在するが、バクテリアがチャン
バー内で優占しているため、検証としてバクテリアの現存量から酸素消費速度の推定を試
みた。バクテリアの現存量は CO 2 曝露予備実験終了時の全菌数（コントロール、2000μatm
実験区および 5000μatm 実験区でそれぞれ 5.5×10 5 、6.6×10 5 および 3.3×10 5 cells/ml）
を用いた。酸素消費速度は、Nagata ら(2000) 2) の式（以下）に当てはめて試算した。
BR＝（1－BGE）／BGE・BP
BR は、バクテリアの呼吸速度（mgC/m 3 /day）
BGE は、バクテリア成長効率で、ここでは 0.2 2) を与えた。
BP はバクテリアの生産速度
mgC/m3 /day
をそれぞれ示す。また、
BP は、（バクテリア現存量－1.4）／0.4 3 ） として試算した。
バクテリア現存量は、0.02pgC/cell 4) で試算した。
BR は、計算後、単位を mgC/m 3 /day から mgO 2 /m 3 /day に変換した。
その結果、バクテリア現存量から求めた呼吸速度はコントロール、2000μatm 実験区お
よび 5000μatm 実験区でそれぞれ、32、51 および 9 O 2 mg/m 3 /day と推定され、実測値と
同様に 2000μatm 実験区で酸素消費速度が最も高くなった。なお、菌数から推定した酸素
消費速度は実測値より若干低かった。これは Nagata ら（2000）の式が深海まで含めた野
外条件下での酸素消費速度を推定するためのものであり、今回の実験条件（表層水を用い
た。水温が深海よりも高い。容器に隔離されている。）に対しては過小評価となると考えら
れること、また実測の酸素消費速度はバクテリア以外の生物の呼吸速度も含まれることに
よると考えられる。
64
酸素消費速度は、2000μatm 実験区＞コントロール＞5000μatm 実験区の順で大きかっ
たが、一般的に、CO 2 分圧の増加に対しては呼吸速度の昂進が生じ
5) 、さらに高い
CO 2 分
圧では麻酔作用を引き起こすことが知られている。また、2000μatm 実験区では菌数の増
加も観察されていることから、2000μatm 実験区では CO 2 分圧の増加に伴う菌数の増加と
活性を持つバクテリアや動物の呼吸昂進が生じている可能性が考えられる。ただし、今回
の結果は予備実験であり、上記のことを踏まえて評価できる実験プロトコルにより、さら
に検討を行なうことが必要である。今回の予備実験の結果からは約 3 日の実験で酸素消費
速度の実験区間での差異が検出でき、酸素消費速度がペラジックチャンバー実験における
CO 2 影響の指標として有効であると考えられる。
参考文献
1) 平成 13 年度エネルギー使用合理化海洋資源活用システム開発事業
産業技術総合開発機構共同研究業務
発－基盤研究－
成果報告書 II
新エネルギー・
エネルギー使用合理化海洋資源活用システム開
2002
社団法人
日本海洋開発産業協会.
2) Nagata, T. et al. (2000) Bacterioplankton distribution and production in deep
Pacific waters: Large-scale geographic variations and possible coupling with
sinking particle flux. Limnol. Oceanogr., 45(2), 426-435.
3) Dufour, PH. and Torreton, J. –P. (1996) Bottom-up and top-down control of
bacterioplankton from eutrophic to oligotrophic sites in the tropical northeastern
Atlantic Ocean. Deep-Sea Research I, 43, 1305-1320.
4) Lee, S and Fuhrman, J. A. (1987) Relationshio between biovolume and biomass of
natural derived marine bacterioplankton. Applied Environmental Microbiology , 53,
1298-1303.
5) Randall,D. W. et al. (1997) Animal physiology, W.H. Freeman and Company, New
York
65
図 3.1.1-1
ペラジックチャンバー外観図
写真 3.1.1-1
ペラジックチャンバー写真
66
写真 3.1.1-2
ペラジックチャンバー攪拌装置
DO センサー
ｐH センサー
写真 3.1.1-3
曝露予備実験状況
67
表 3.1.1-1
1
2
3
ｐH
∑CO2 (µmol/l)
Alkalinity (µeq/l)
initial
initial
DO (ml/l)
pCO2(μatm)
Chamber
Bottle
Temp(℃)
initial
1
6.2
7.936
2083
2257
6.29
428
2
6.2
7.938
2087
2265
6.36
417
3
6.3
7.940
2086
2260
6.41
429
1
5.4
7.871
6.910
2115
2457
2263
2267
6.00
6.17
504
4864
2
5.5
7.870
6.902
2114
2493
2261
2264
6.23
6.07
508
5667
3
5.5
7.870
6.902
2116
2497
2264
2270
6.34
5.94
506
5626
1
6.3
7.962
7.996
2089
2091
2263
2265
6.72
6.54
429
430
2
6.3
7.966
7.445
2084
2279
2258
2265
6.69
6.33
426
1711
3
6.3
7.965
6.999
2086
2478
2260
2264
6.32
6.27
427
5369
end
end
end
initial
end
8.0
Chamber A (5分間隔）
Chamber B (1分間隔）
Chamber C (10秒間隔）
7.8
7.6
pH pH
実験
水質分析結果
7.4
7.2
7.0
6.8
3/16/08
17:00:00
3/16/08
21:00:00
3/17/08
1:00:00
3/17/08
5:00:00
時間
図 3.1.1-2
2 回目実験 pＨ変動
68
3/17/08
9:00:00
initial
end
8.2
8.0
コントロール
2000ppm
5000ppm
7.8
pHpH
7.6
7.4
7.2
7.0
6.8
3/17/08
12:00:00
3/18/08
0:00:00
3/18/08
12:00:00
図 3.1.1-3
3/19/08 3/19/08
0:00:00 12:00:00
時間
3/20/08
0:00:00
3/20/08
12:00:00
3/21/08
0:00:00
3 回目実験 pＨ変動
8.8
8.6
DO (ppm)
pH
8.4
コントロール
2000ppm
5000ppm
8.2
8.0
7.8
3/17/08
12:00:00
3/18/08
0:00:00
3/18/08 3/19/08
3/19/08
12:00:00 0:00:00
12:00:00
時間
図 3.1.1-4
3/20/08
0:00:00
3 回目実験 DO 変動
69
3/20/08
12:00:00
3/21/08
0:00:00
10
水温(℃)
水温（℃）
8
6
コントロール
2000ppm
5000ppm
4
2
3/17/08
12:00:00
3/18/08
0:00:00
3/18/08
12:00:00
3/19/08 3/19/08
0:00:00 12:00:00
時間
図 3.1.1-5
表 3.1.1-2
2
3
1
2
3
バクテリア、微小鞭毛虫分析結果
5
5
5.2x10
5
4.1x10
4.1x105
3/20/08 3/21/08
12:00:00 0:00:00
3 回目水温変動
バクテリア
cells/ml
実験 Chamber
実験終了時
実験初期時
Average
SD
5
4
1
4.3x10
1.7x10
5
4
1
2
4.4x10
3.0x10
5
3
3.9x10
1.7x104
1
2
3
3/20/08
0:00:00
4
3.6x10
5
4.4x10
3.9x105
1.7x10
4
2.3x10
3.5x104
5
1.1x10
4
2.6x10
1.5x104
5.5x10
5
6.6x10
3.3x105
微小鞭毛虫類
cells/ml
実験終了時
実験初期時
Average
SD
4
2.2x10
2.0x10
0.7x10
70
実験終了時の
pCO2(μatm)
426
417
429
2.1x10
2.7x10
0.4x10
1.2x10
3.4x10
0.9x10
2.1x10
2.5x10
0.8x10
0.7x10
4.0x10
2.3x10
5,667
5,667
5,626
2.0x10
2.3x10
1.5x10
0.4x10
0.7x10
0.7x10
430
1,711
5,369
３．２
海洋現場実験想定海域の現況
３．２．１海洋観測による現況調査
３．２．１－１
はじめに
二酸化炭素を海洋中層に隔離するうえで、二酸化炭素の海洋中層生態系への影響を明ら
かにしなければならないが、問題点が 2 点ある。
1、実際に海洋中層へ二酸化炭素を放出する開放型の実放流実験を行うことが現時点では
社会的な受容を得にくい
2、海洋中深層の環境、特に群集や生態系を実験室に再現することは非常に困難であること
この 2 点を解消するために、閉鎖型の深海現場実験が提案され、実施されてきた。ただ
し、これまで実施してきたものは、生物密度が高い海底底生生物群集を対象としたベンチ
ックチャンバーを用いた実験であった。しかし、海洋中深層への CO 2 隔離技術の影響評価
を考えるためには、中深層の浮遊生物群集を対象とした現場実験を避けて通ることはでき
ない。このため、次の段階として、前項で報告された現場係留型―閉鎖系実験装置ペラジ
ックチャンバーの開発を進めている。
このペラジックチャンバーは、中深層の現場海域に係留して、現場水塊を囲い込むこと
で、チャンバー内の温度、塩分、圧力などの物理環境、生物群集組成等の生物環境および
化学環境を現場と同様にするものである。そして、このチャンバー内に CO 2 を導入して海
洋への CO 2 隔離の状態を再現して現場生物への影響を把握しようとするものである。
この装置を開発する上で、問題となるのが生物密度である。海洋では、エネルギーの多
くを太陽光に依存しているため、生物は有光層内に最も多く存在する。CO 2 隔離が想定さ
れる中深層は、表層に比べて生物現存量が少なく、大きな容量のチャンバーを必要とする。
今回開発するチャンバーはベンチックチャンバーに比べて、容量を 250L と大型化して、
バクテリア、原生動物などを中心とした複数段階の食物連鎖を検討できるサイズを目指し
ている。このペラジックチャンバーの開発に際しては、水塊隔離機構、注入・採水機構、
検出機構などいくつかの要素実験を経て、CO 2 曝露実験に進める必要があるが、このよう
な要素実験段階では、陸上から近い海域で実験を行なうことが望ましい。また、このよう
な要素実験においては、生物密度の高いほうが有利である。平面的には、冬季鉛直混合層
の深さから高緯度海域に生物が多いことが分かっている
1) 。
そこで、開発初期段階では、1、
生物量が多い、2、海底面が平坦である（沈降粒子束把握のため、セジメントトラップを
中心とした係留系を設置する、またチャンバー実験では係留式を想定しているため）、3、
水深 1000m 以上（隔離想定深度が 1000m 以深であるから）の海域を選定条件として、係
留実験海域を選択することとした。以上 3 点を満たす海域として亜寒帯海域と亜熱帯海域
の境界海域の三陸沖約 200 海里の点を選定した。
71
３．２．１－２
目的
ペラジックチャンバーの開発のために行なう係留実験海域のバックグラウンドを把握
することを目的とする。
３．２．１－３
方法
観測点は生物量、海底面および水深から、亜寒帯海域と亜熱帯海域の境界海域である三
陸沖の北緯 38 度、東経 145 度とした（図 3.2.1-1）。調査は (株)オフショアオペレーショ
ン所属の第 12 海工丸を傭船し、2007 年 11 月 7 日から 2007 年 11 月 16 日まで行った。
航海途中に現場海域の天候が悪化し、11 月 10 日から 11 月 13 日には一時調査を中断し宮
城県塩釜港に寄港した。航海時の作業記録を表 3.2.1-1 に示す。
72
135 ٛ
45 ٛ
140 ٛ
145 ٛ
150 ٛ
45 ٛ
調査地点
北緯 38 度
40 ٛ
40 ٛ
35 ٛ
35 ٛ
30 ٛ
135 ٛ
東経 145
140 ٛ
145 ٛ
図 3.2.1-1 調査地点図
73
30 ٛ
150 ٛ
74
2007/11/09 (Fri)
2007/11/10 (Sat)
2007/11/11 (Sun)
2007/11/12 (Mon)
2007/11/13 (Tue)
2007/11/14 (Wed)
6
7
8
9
10
11
2007/11/16 (Fri)
2007/11/08 (Thu)
5
13
2007/11/07 (Wed)
4
2007/11/15 (Thu)
2007/11/06 (Tue)
3
12
2007/11/05 (Mon)
2
日付
2007/11/04 (Sun)
1
0時
1時
2時
3時
4時
5時
7時
DST回収
CTD-D
6時
9時
13時
ORI(2500～1500m)
ORI(200～0m)
38N 141-30E
塩釜入港、艤装解除
STM
38N 145E
DST投入 ORI(1500～500m)
CHLT
荒天待機（現場濾過器調整・データ整理等）
荒天待機（データ整理等）
荒天待機（ATP活性測定・データ整理等）
14時
艤装（機器搭載）
塩釜港出港
12時
38N 145E
地形調査
11時
38-03N 144-50E
トラップ用採水 ろ水計ﾃｽﾄ
10時
航海時調査実績表
38N 141-30E
塩釜入港 荒天待機（サンプルろ過・データ整理等）
艤装
艤装
艤装（機器搭載）
8時
表 3.2.1-1
17時
BUC CHLT CTD-S
16時
現場ろ過
塩釜港出港
15時
20時
21時
セジメントトラップ設置確認
19時
マリンスノーカメラ・水中顕微鏡
マリンスノーカメラ・水中顕微鏡
18時
22時
23時
備考
CTD 測定及び採水
Sea-Bird 社 の CTD(SBE-9 plus) 、 Sea-Bird 社 の SBE-17plus お よ び カ ル ー セ ル
（SBE-32）に 12ＬのＸニスキン採水器を装着して、海表面から 5300m まで、水温、塩分、
溶存酸素の連続測定を行い、所定の水深で海水試料を採取した。
採水した海水について、塩分、溶存酸素（DO）、栄養塩類（硝酸、亜硝酸、アンモニア、
リン、ケイ酸）、全炭酸、pH、全アルカリ度、ATP、クロロフィル a および粒子状有機炭
素の試料の分取を行い、船上あるいは実験室に持ち帰って分析に供した。生物現存量分析
用としては、バクテリア、ピコプランクトン、ミクロプランクトンおよびハプト藻用試料
を分取した。また、食物連鎖解析用試料と微生物の DNA 解析用試料をあわせて分取した。
ORI ネットによる生物現存量調査
ネットプランクトンの層別採集を行うために、ORI ネットによる層別鉛直引きを実施し
た。ただし、荒天のために鉛直引きの層は 2500-1500m の 1 層に限られた。
深層流動場および沈降粒子束調査
調査地点の沈降粒子量把握、食物連鎖解析用試料および凝集実験用試料の採取のため、
係留型時間分画式セジメントトラップ（日油技研工業社製
SMD21-6000）を 1500m、
2500m、3500m の 3 層（図 3.2.1-2）に設置した。沈降粒子の捕集間隔を 20 日と設定した
（表 3.2.1-2）。また、観測点における隔離予定深度の流動場を把握するため、セジメント
トラップの係留系にはアンデラー流速計（RCM-8）を深度 2000m に設置した。流速計測
は 1 時間間隔で行なった。
表層沈降粒子束調査
ドリフティングセジメントトラップを用いて、表層沈降粒子の捕集を行った。ドリフテ
ィングセジメントトラップの軌跡は、GPS ブイを用いて追跡した（図 3.2.1-3）。荒天のた
め、試料の捕集期間は約 1 日間に留まった。
現場ろ過調査
日油技研工業製の現場型大量ろ過装置を深度 1450m、1500m、1550m の 3 層に係留し、
試料を採取した。現場型大量ろ過装置には、孔径 5μm のニトロセルロースフィルターを
ベースとし、その上に孔径 1.2μm ポリカーボネートフィルターを重ねて装着した。現場ろ
過器は所定の水深において 1 時間作動させた。ろ過した海水量は約 1400L である。現場ろ
過器から回収したフィルターは実験室に持ち帰り、懸濁物の凝集実験に使用した。
75
図 3.2.1-2
観測点近傍に投入したセジメントトラップおよび流速計の係留系図
76
表 3.2.1-2
2007 年 11 月係留セジメントトラップタイムスケジュール
Sample Cup NO.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Start
2007/11/11
2007/12/1
2007/12/21
2008/1/10
2008/1/30
2008/2/19
2008/3/10
2008/3/30
2008/4/19
2008/5/9
2008/5/29
2008/6/18
2008/7/8
2008/7/28
2008/8/17
2008/9/6
2008/9/26
2008/10/16
2008/11/5
2008/11/25
2008/12/15
77
end
2007/12/1
2007/12/21
2008/1/10
2008/1/30
2008/2/19
2008/3/10
2008/3/30
2008/4/19
2008/5/9
2008/5/29
2008/6/18
2008/7/8
2008/7/28
2008/8/17
2008/9/6
2008/9/26
2008/10/16
2008/11/5
2008/11/25
2008/12/15
2009/1/4
Duration
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
図 3.2.1-3
ドリフティングセジメントトラップ係留系図
78
３．２．１－４
①
結果
化学成分
塩分の鉛直分布をみると約 300db に極小層が存在し、33.767psu であった。300db 以深
では深度ともに増加した。また、溶存酸素（DO）は約 1000db に極小層がみとめられ、
51.3μmol/kg であった。2006 年度の本調査で得られた亜熱帯海域（北緯 23 度 30 分、東
経 131 度 55 分）でも今回と同じ水深の 1000db に酸素極小が認められている。ただし、
今年度の調査点のほうが、亜熱帯の隔離想定海域よりも 8.5μmol/kg 低い（図 3.2.1-4）。
79
DO(μmol/kg)
0.0
100.0
200.0
300.0
0
Depth(db)
1000
06RITE
2000
07RITE
3000
4000
5000
6000
7000
図 3.2.1-4
昨年度得られた亜熱帯海域における溶存酸素
濃度（06RITE）と本年度得られた溶存酸素濃度（07RITE）
の鉛直分布図
80
栄養塩類濃度の鉛直分布を図 3.2.1-5 に示す。栄養塩類は表層で低く、1000db 付近で最
大値を示す太平洋の典型的な鉛直分布を示した。今回、1500db と 2500db の栄養塩の値が
欠損しているものの、2006 年度亜熱帯海域の値と比較すると、1000db 以深では凡そ同程
度の濃度であった。
NO2 (μmol/kg)
NO3+NO2(μmol/kg)
20
40
0.00
60
0
0
1000
1000
2000
06RITE
3000
07RITE
Depth(db)
Depth(db)
0
4000
5000
3000
7000
SiO2(μmol/kg)
07RITE
PO4 (μmol/kg)
200
0.00
1.00
0
0
1000
1000
2000
2000
06RITE
3000
07RITE
Depth(db)
Depth(db)
150
3000
4000
5000
06RITE
07RITE
2.00
3.00
4000
5000
6000
6000
7000
7000
図 3.2.1-5
0.20
5000
7000
100
0.15
06RITE
4000
6000
50
0.10
2000
6000
0
0.05
昨年度得られた亜熱帯海域における栄養塩類濃度（06RITE）と本年度
得られた栄養塩類濃度（07RITE）の鉛直分布図
81
pH、全アルカリ度そして全炭酸濃度の鉛直分布を図 3.2.1-6 に示す。pH は表層 10db で
最大値 8.071 を観測し、深度 1000db まで深さと共に減少し、最小値 7.416 を記録した。
1000db 以深は深さとともに増加した。全アルカリ度は表層で低く深度と共に増加した。
全炭酸濃度は、pH と同様に表層で低く、1000db で最大値 2429.3μmol/kg を観測した。こ
れら炭酸系 3 成分を 2006 年に得られた亜熱帯海域の値と比較すると、微細な違いは存在
するものの、概ね良く一致した。
Total Alkalinity(μeq/kg)
pH(SWS)
7.500
8.000
2200 2250 2300 2350 2400 2450
8.500
0
0
1000
1000
2000
06RITE
3000
07RITE
Depth(db)
Depth(db)
7.000
4000
5000
2000
3000
06RITE
4000
07RITE
5000
6000
6000
7000
7000
TCO2(μmol/kg)
1900
2100
2300
2500
0
Depth(db)
1000
2000
3000
06RITE
07RITE
4000
5000
6000
7000
図 3.2.1-6
昨年度得られた亜熱帯海域と（06RITE）と本年度得られた pH、全アル
カリ度、全炭酸濃度（07RITE）の鉛直分布図
82
②
生物現存量
採水法で得られる微小プランクトンの鉛直分布を見ると、バクテリアが最も多く、表面
で 1.3×10 12 cells/m 3 （1.3×10 6 cells/ml）となった。水深の増加に伴い、有光層内で急速に
現存量を減らした（図 3.2.1-7）。水深 1000m 以深では、減少率は低下し、中深層では約
10 10 cells/m 3（10 4 cells/ml）であった（図 3.2.1-8）。光合成を行う植物プランクトンは、藍
藻と微小鞭毛藻が優占し、有光層で 10 8 ～10 10 cells/m 3 （10 2 ～10 5 cells/ml）存在した。中
深層では減少数が、非常にわずかではあるが、プレパラート試料中に認められたため、現
存量として算出されるが、中深層では光が届かないため、生産者としての機能はない（図
3.2-8）。
ま た 、 微 小 原 生 動 物 で は 微 小 鞭 毛 虫 類 が 最 も 優 占 し て お り 、 表 面 で 10 8 cells/m 3
（10 2 cells/ml）と最大となり、水深が増すにつれて、急激に減少した(図 3.2.1-9)。
ペラジックチャンバーの係留目標である 1000m 付近では、バクテリア、微小鞭毛虫
類、渦鞭毛虫類の現存量は、それぞれ 7×10 10 cells/m 3 、4×10 6 cells/m 3 、および 1×10 6 cells/m 3
（それぞれ、7×10 4 cells/ml、4 cells/ml、および 1 cells/ml）と少ない。
一方、炭素態に換算した現存量を比較すると、1000m 水深ではバクテリアが 1.4mgC/m 3
であるのに対して、渦鞭毛虫と鞭毛虫がそれぞれ 0.12mgC/m 3 、0.04mgC/m 3 と、細胞数
での差に比べて、それぞれの分類群間の差が小さくなっている（図 3.2.1-10）。特に、個体
数では渦鞭毛虫は鞭毛虫より少ないが、１細胞が大きく、バクテリアへの捕食圧が相対的
に大きいと考えられる。
83
細胞密度（細胞数/m3）
0 10
0
0
5 10
11
1 10
12
1.5 10
2 10
12
ﾊﾞｸﾃﾘｱ
藍藻
微小鞭毛藻
珪藻
渦鞭毛藻
鞭毛虫
渦鞭毛虫
繊毛虫
1000
2000
水深 (m)
12
3000
4000
5000
6000
図 3.2.1-7
ペラジックチャンバー実験実施想定海域の微小プランクトン現存量の鉛直分布
84
全菌数（細胞数/m3）
10
0
10
10
11
10
12
13
10
1000
水深 (m)
2000
3000
4000
5000
6000
微小藻類（細胞数/m3）
10
0
4
10
5
10
6
7
10
10
8
9
10
10 10
10
11
1000
水深 (m)
2000
3000
4000
藍藻
微小鞭毛藻
珪藻
渦鞭毛藻
5000
6000
図 3.2.1-8
バクテリアと微小藻類の現存量の鉛直分布
85
微小原生動物（細胞数/m3）
3
10
0
4
10
5
10
10
6
10
7
8
10
9
10
1000
鞭毛虫
渦鞭毛虫
繊毛虫
水深 (m)
2000
3000
4000
5000
6000
図 3.2.1-9
微小原生動物の鉛直分布
86
炭素態現存量（mgC/m3）
10
0
-2
10
-1
0
10
10
1
10
2
水深　（ｍ）
1000
ﾊﾞｸﾃﾘｱ
藍藻
微小鞭毛藻
珪藻
渦鞭毛藻
鞭毛虫
渦鞭毛虫
繊毛虫
2000
3000
4000
5000
6000
図 3.2.1-10
ペラジックチャンバー実験実施想定海域の炭素態生物現存量の鉛直分布
87
３．２．１－５
考察
海洋では、有機物の分解に伴い周辺の酸素が消費される。利用できる酸素が減少すると、
酸素以外の物質が有機物から電子を奪って酸化させる。海洋水中においては、量的に重要
でない成分（例えば鉄）を除けば、硝酸、硫酸、炭酸の順番で電子受容体となり還元が起
こる。硝酸の還元は微少酸素状態で生じるため、DO の極小層が存在する 1000db は脱窒
細菌の活性が高いことが予想される（図 3.2.1-4）。硫酸還元は、かなり還元的にならない
と生じないため、黒海のような無酸素状態が形成されないと生じることはなく、通常の海
水中では認められない。
硝酸濃度は有機物の分解生成の影響および横方向からの移流拡散の影響を受ける。その
ため、硝酸濃度のみでは、脱窒量は計算することが出来ない。そこで、窒素とリンの化学
量論比から脱窒量および窒素固定量を推察する N*が提案されている
2),3) 。海洋での有機物
の生成・分解は一定の比で行なわれる。また、リンは、熱力学的には、天然環境で気体と
して存在し得ない。このため、N*の変化は生産、分解に依存しない窒素量の変化、すなわ
ち窒素固定量と脱窒量を示すこととなる。
そこで海洋調査実施点での脱窒能を推定するために、N*を下式
3) で計算した。
N* = [NO 2 +NO 3 ] ― R N/P [PO 4 ]+2.9
（但し R N/P は 16 とする）
この N*は脱窒量の多い水塊で小さい値を示し、窒素固定量が多い水塊で大きな値を示す。
計算の結果、N*は表層で 1.8 以上と高い値を記録し、1000db まで深度と共に減少し、
1000db で-3.4 と本観測点で最低の値を記録した。1000db 以深では深度共に増加した。こ
のことからも、1000db 深に脱窒を経た水が存在することが分かる。1000db 深は CO 2 海洋
隔離影響深度であり、物質循環を考える上で隔離 CO 2 の脱窒細菌への影響を明らかにする
必要があると考えられる。
88
参考文献
1) Behrenfeld, M.J. and Falkowski. P.G. (1997) Photosynthetic Rates Derived from
Satellite-Based Chlorophyll Concentration. Limnology and Oceanography, 42, 1-20.
2) Gruber, N. and Sarmiento, J.L. (1997) Global patterns of marine nitrogen fixation
and denitrification. Global Biogeochemical Cycles, Volume 11, Issue 2, p. 235-266.
3) Deutsch, C. et al. (2001) Denit rification and N2 fixation in the Pacific Ocean.
Global Biogeochem Cycles, 15, 483–506.
89
深海生物の CO2 影響研究
第４章
４．１
深海生態系の研究
４．１．１
カイアシ類の捕食構造解析
４．１．１－１
はじめに
CO 2 海洋隔離に伴う生物影響評価手法を確立するために、生態系モデルの開発、深海生
態系の研究、CO 2 影響の研究が実施されている。本研究では、生態系モデルのコンパート
メントの構築や深海生態系における CO 2 影響の伝播の解明に成果を供することを最終目
標とし、安定同位対比を用いた食物連鎖構造の解析を行う。
食物連鎖の研究手法には、胃内容物の観察、摂餌行動の観察、安定同位体比の分析など
が挙げられる
1) 。胃内容物の観察は、実際に捕食者が食べた餌を確認できるが、体内に栄
養として取り込まない未消化のものを観察している可能性が指摘されている。摂餌行動の
観察により、餌の摂取様式が明らかになるものの、生物の生活史全体を通した餌の履歴を
把握しがたい。そもそも海洋中深層では生物密度の低さから現場での摂餌行動の観察は困
難である。さらに海域が貧栄養である場合、消化管に内容物が残留している生物が採取さ
れることは希である。一方、安定同位体比の研究は、捕食者が長期にわたって体内に同化
した餌の情報を得て、捕食－被食関係を間接的に観察する手法である。生物体組織の同位
体組成が主として餌の同位体組成に依存し、食物連鎖が高次に進むに従って重い同位体が
一定の割合で生物体組織に濃縮するという特徴を利用している
2) 。ある消費者の安定同位
体比をδs、一次生産者の安定同位体比をδp とし、捕食－被食関係によって生じる同位体の
濃縮係数をεとすると、栄養段階（TL）は次式によって求められる。
TL ＝ (δs－δp）／ε
（ア）
栄養段階が 1 段増えるごとに炭素同位対比（δ 13 C）は-1‰から+2‰、窒素同位対比（δ 15 N）
は+2‰から+4‰増加すると一般に言われている
3) 。安定同位体比を用いた亜熱帯域の中深
層生態系の研究より、カイアシ類の栄養段階は食性によって異なることが示唆され、中深
層で採取される粒子状物質よりも表層の粒子状物質に近い成分が中深層性のカイアシ類の
餌として重要との手がかりを得た。
本年度は、カイアシ類の食資源を探索するために、亜熱帯域よりも表層の基礎生産力の
高い亜寒帯域においてカイアシ類と粒子状物質の安定同位対比を測定し、捕食構造の解析
を行った。さらに肉食性カイアシ類と餌の共同関係にあるとみられるヤムシ類についても
検討を行った。
90
４．１．１－２
方法
① 試料採取
K1207 調査航海によって、塩釜沖から生物試料と粒子状物質の採取を行った。生物試料
は、ORI ネットを用いて 1500～2500m（中深層）と水深 0～200m（表層）の 2 層から得
た。カイアシ類は海水とともにビニールパックに密閉し、-20℃で凍結保存した。ヤムシ類
は個体ごとにプラスチック容器に並べて凍結保存した。粒子状物質は海水をガラス繊維フ
ィルターでろ過して回収する「懸濁粒子」とドリフティングセジメントトラップ（DST）
によって海水から回収される「沈降粒子」の 2 種類の採取を行った。懸濁粒子は、水深 0、
500、1000、1500m の 4 層からニスキン採水器によって海水を採取し、水深 0m では 4L、
他の水深では 8L の海水を直径 25mm の Whatman GF/F フィルターでろ過して回収し、
凍結保存した。フィルターは有機物による汚染を防ぐために、予め 450℃で 4 時間加熱処
理を施した。沈降粒子は 4 つまたは 8 つのカップを持つ DST を水深 65、155、185、215、
305m に設置し、約 1 日間海水中に放流したのちに揚収した。水深 65、155、305m の試
料は 1 カップ分をろ過してフィルター上に回収し、凍結保存した。185m と 215m の試料
は各 3 カップ分を海水中に懸濁させたまま凍結保存した。
② 安定同位体比の測定
凍結した生物試料は研究室に移送し、解凍後、氷温下でできる限り詳細に種類の同定を
行った。写真撮影を行った後、個体を純水ですばやく洗浄し、乾燥重量が安定するまで 60℃
で乾燥した。ただし、ヤムシ類は加熱すると体液が容器に付着して個体全体を回収するこ
とが困難になるので、凍結乾燥を行った。生物試料は、脱脂試料と未処理試料を作成した。
脱脂はクロロホルム：メタノール（2:1）混合溶液に生物試料を一晩以上浸漬させ、60℃
で乾燥させた。炭素同位体比と窒素同位体比の測定には、元素分析計－安定同位比体質量
分析装置(Elemental Analyser－Isotope Ratio Mass Spectrometor; EA－IRMS)を用いた。
フィルター試料として持ち帰った粒子状物質は解凍後、顕微鏡下で観察しながら写真を
撮影した。フィルター上に捕捉されたプランクトン類（主にカイアシ類）を取り除いた後
に 60℃で乾燥させた。沈降粒子試料の一部は、塩酸により炭酸塩を除去した試料も用意し
た。海水中に懸濁させた沈降粒子試料は、水深 185m から得たものが 3 カップと 215m か
ら得たものが 3 カップ、合計 6 カップである。これらの試料は水深の区別をつけず、水深
200m から得た試料とした。1 カップ分はフィルターでろ過し、他の沈降試料と同様の処
理を行った。残りの 5 カップ分はソーティングを行い、フィーカルペレットなど成分ごと
に凍結乾燥や脱炭酸塩処理を行った。
４．１．１－３
結果と考察
① 生物試料の同定結果と試料の特徴
91
K1207 航海によって採取された生物試料の同定結果を表 4.1.1-1 に示す。カイアシ類は
表層と中深層あわせて 35 種類同定された。カンダシア科、ユーキータ科、ヘテロラブド
ゥス科、フェンネ科、ポンテラ科のカイアシ類は肉食性、カラヌス属とリンカラヌス属は
植食性、その他は雑食性として知られる
4) 。その他ヤムシ類、クリオネ類、オキアミ類が
得られた。
平成 14 年度から平成 18 年度までに実施された海洋隔離プロジェクトフェーズ II では、
主に亜熱帯域の中深層を中心に生物試料を採取した。当該海域は貧栄養であり生物生産量
も少ないことから採取された生物の消化管には内容物がほとんど認められなかった。一方、
今回採取されたカイアシ類の一部にはオリーブグリーンの胃内容物を含むものが認められ
たり、特にヤムシ類には消化管に内容物を含む個体が多く認められた（図 4.1.1-1）。表層
から得られたヤムシ類には、オンケアやミクロセテラなどのカイアシ類、有孔虫など、原
型を留めているものが含まれていた。一方、中深層から得られたヤムシ類の消化管には赤
みがかった不定形の物質が主に占めており、赤い油球も含まれていた。胃内容物によって
ヤムシの安定同位対比に誤差を与えることが予測されるので、胃内容物を含まない試料を
安定同位対比の測定に用いることとした。
② 中深層から得たカイアシ類とヤムシ類の安定同位体比
水深 1500～2500m における生物試料の安定同位対比マップを図 4.1.1-2 に示す。カイア
シ類の窒素同位対比は 5.0～13.3‰の範囲に分布していた。最も値の低かったものはオン
ケア属であり、高かったものはパラユーキータ属であった。栄養段階の 1 ステップに相当
する同位対比効果を 3.4‰程度
2) と仮定すると、これら最低値と最高値の差は栄養段階の
2
ス テ ッ プ 以 上 に 相 当 す る 。 炭 素 同 位 対 比 の 値 幅 は -23.1 ～ -19.0‰ で あ り 、 Rhincalanus
cornutus 、Eucalanus attenuatus 、Neocalanus cristatus の 3 種のカイアシ類が他のカイ
アシ類よりも 約 2‰ 高い値をとっ ているこ とが特徴的で あった。 試料量の多か った
Neocalanus cristatus について脂質を溶媒抽出した後に同位対比を測定したところ、炭素
同位対比はほとんど変化せず、脂質をほとんど含んでいないことがわかった。Rhincalanus
cornutus と Eucalanus attenuatus の属するユーカラヌス科のカイアシ類や Neocalanus
cristatus の属するカラヌス科のカイアシ類は成長に伴い中深層へ移動するが、摂餌は表層
でのみ行うことが知られている
5, 6) 。そのため、これらのカイアシ類が中深層に存在する
ときには体内に蓄積した脂質をほとんど消費しきっていると推測される。以上のことから、
中深層におけるカイアシ類の安定同位対比は食性や生活史の違いを反映していると考えら
れる。
ヤムシ類の窒素同位対 比は 11.3‰と高く肉食 性カイアシ類であるパ ラユーキータ属の
窒素同位対比 9.5～13.3‰と同程度であった。亜熱帯域における従来の観測結果では、肉
食性であるヤムシ類が存在するときには肉食性カイアシ類の現存量が少なく、ヤムシ類が
92
餌の競合に打ち勝っていることが示唆されていた。しかし、今回の観測ではヤムシ類と肉
食性カイアシ類が共存しているように見える。亜寒帯では亜熱帯に比べ表層の基礎生産力
が高く、餌が豊富に存在することに由来しているかもしれない。今後、現存量調査の結果
や再現性の確認を行う予定である。
③ カイアシ類の食資源の探索と中深層における食物連鎖
粒子状物質の顕微鏡観察結果を図 4.1.1-3 に示す。観察結果から明らかなように、海水
ろ過試料である懸濁粒子には視認可能な粒子がほとんど含まれていなかった。一方、セジ
メントトラップを利用して捕集した沈降粒子のそのほとんどが視認可能な粒子であった。
主にはフィーカルペレットとその分解途中の破片が捕集された。その他、オタマボヤとそ
のハウス、放散虫、有孔虫が認められた。一部、ごくわずかにカイアシ類やヤムシ類も観
察されたが、粒子状物質がカイアシ類の食資源となりうるかを検討することが本研究の目
的であるので、これら生物を取り除いて安定同位対比の分析に供した。
次に、粒子状物質の安定同位対比の鉛直分布を図 4.1.1-4 に示す。窒素同位対比につい
ては、水深 500m 以浅の沈降粒子と懸濁粒子の値は 4‰程度であり、これらに比べて水深
1000m の懸濁粒子の値は若干高かった。炭素同位対比の鉛直分布を見ると水深が深くなる
に つ れ 脱 炭 酸 塩 処 理 し て い な い 沈 降 粒 子 の 値 が 高 く な っ た 。 炭 酸 塩 の 炭 素 同 位 対 比 は約
0‰と高いことが知られている（例えば
7) 。水深の増加に伴い沈降粒子中に含まれる有機物
の割合が減少し、有孔虫などの炭酸塩の割合が全体に対して大きくなるために炭素同位対
比が変化したと考えられる。一方、脱炭酸塩処理を施した沈降粒子は懸濁粒子の値とほぼ
一致した。食物連鎖を考える場合、沈降粒子の炭酸塩を除去することは重要といえる。
さらに、沈降粒子についてはその成分ごとにも安定同位対比を測定した。安定同位対比
の測定に利用できるほど分類できた成分は、フィーカルペレット、オタマボヤとそのハウ
ス、放散虫であった。フィーカルペレットは長径 1mm 以上のものをフィーカルペレット
（大）、長さが短く不定形のものをフィーカルペレット（小）と区分した。残りの成分から
カイアシ類など形状の分かる生物片を除いたものを残渣とした。水深 200m から得た成分
の測定結果を図 4.1.1-5 に示すように安定同位対比マップ上に表した。生物試料の分析と
同様に脱炭酸塩処理を施さなかった場合、フィーカルペレットと残渣の炭素同位対比はカ
イアシ類で最も値の高かった 19‰よりも高い値を示した。これらの成分には炭酸塩骨格を
有する有孔虫が含まれているため、炭素同位対比が高くなったと考えられる。そこで、フ
ィーカルペレットに脱炭酸塩処理を施したところ、炭素同位対比は-17.7‰から-25.0‰へ
と 7.3‰も減少した。他に炭素同位対比が 19‰より低い値を示した成分は、オタマボヤと
そのハウス、放散虫であった。放散虫と脱炭酸塩処理を施したフィーカルペレットの炭素
同位対比の差を考慮すると、沈降粒子全体の有機物の炭素同位対比は誤差として約 10%の
幅を持つ成分の加重平均値であることが分かった。一方、炭素同位対比に比べ窒素同位対
93
比は値の変化がわずかであった。沈降粒子を構成する成分の本来の同位対比に加え、炭素
源としては炭水化物、脂質、タンパク質、炭酸カルシウムなど炭素同位対比の異なる様々
な成分があるのに対し、窒素源は主にタンパク質に限られているためかもしれない。安定
同位対比マップを利用して食物連鎖を考察するに当たり、沈降粒子全体を分析した値には
特に炭素同位対比に関して大きな幅があることを認識する必要があることが明らかになっ
た。
粒子状物質とカイアシ類をあわせて安定同位対比マップに示すと図 4.1.1-6 のようにな
った。水深 500m 以深の粒子状物質はカイアシ類の炭素窒素同位対比の最低値と同等かよ
り低い値を示した。このことは中深層から採取されたカイアシ類の食資源として表層由来
の物質が考えられること示唆した。
④ 表層における食物連鎖
水深 200m 以浅から得られた粒子状物質、カイアシ類、ヤムシ類の安定同位対比マップ
を図 4.1.1-7 に示す。表層では、粒子状物質、カイアシ類、ヤムシ類の順に窒素同位対比
が高くなった。カイアシ類の窒素同位対比は 4.9～8.2‰であり、肉食性のカイアシ類が採
取されているにもかかわらず（表 4.1.1-1）、中深層とは異なり高い値を示すものが採取さ
れなかった。また、食性が同じであってもカイアシ類の窒素同位対比は種によって異なっ
ている。種ごとの現存量を調査し、ヤムシ類との餌の捕食競争について検討することが重
要と考えられる。
次に、中深層と表層の両方で採取されたカイアシ類の窒素同位対比を比較した（図
4.1.1-8）。ルシクチア属の窒素同位対比には差があるが、種が異なる可能性もある。オン
ケ ア 属 、 カ ラ ヌ ス 属 、 Scolecithrix danae 、 Candacia bipinnata 、 Pleuromamma
abdominalis について値が一致した。窒素同位対比の一致は食資源としている成分の組成
が一致している可能性を示す。親潮域では、オンケア属やプレウロマンマ属など、表層で
摂餌し中深層へ移動する鉛直移動性のカイアシ類の存在が報告されている
8, 9) 。粒子状物
質による表層から中深層への食物連鎖の流れだけでなく、カイアシ類の移動による表層か
ら中深層への食物連鎖の流れが存在する可能性が示唆された。今後、これらカイアシ類の
鉛直方向への移動や摂餌場所を研究することも重要と考えられる。
４．１．１－４
まとめと今後の課題
中深層における安定同位対比を用いた食物連鎖解析により、粒子状物質の表層由来の成
分がカイアシ類の一次食資源となっていると考えられた。表層の生産力の高い亜寒帯では、
肉食性カイアシ類とヤムシ類が共存している可能性が見出された。雑食性のオンケア属、
カラヌス属、 Scolecithrix danae 、 Candacia bipinnata 、 Pleuromamma abdominalis は
表層から採取されたカイアシ類の安定同位対比を測定した同属および同種と窒素同位対比
94
が一致しており、この結果も中深層のカイアシ類と表層のカイアシ類の一次食資源が同じ
である可能性を示唆した。
今後、カイアシ類の鉛直方向への移動や摂餌場所の研究や現存量を考慮した肉食性カイ
アシ類とヤムシ類の関係の解析が重要と考えられる。
95
表 4.1.1-1
K12-06 調査航海で得た生物試料の同定結果とカイアシ類の食性
採取深度
0-200m
1500-2500m
試料名
カイアシ類
Chiridius gracilis
Gaetanus minor
カラヌス属
Neocalanus cristatus
Candacia bipinnata
Candacia columbiae
Candacia longimana
Paracandacia truncata
セントロパジェス属
Centropages furcatus
Rhincalanus cornutus
Eucalanus attenuatus
ユウキータ科
パラユウキータ属
Paraeuchaeta elongata
Paraeuchaeta spinosa
ヘテロラブドゥス属
ルシクチア属
Lucicutia curta
Lucicutia longispina
メトリディア属
Pleuromamma gracilis
Pleuromamma abdominalis
Pleuromamma quadrungulata
Pleuromamma scutullata
Pleuromamma xiphias
Cephalophanes refulgens
ラビドケラ属
Lophothrix frontalis
Scolecithrix danae
Scottocalanus securifrons
Temora discaudata
Temora turbinata
コリケウス属
オンケア属
ヤムシ類
クリオネ類
オキアミ類
（カイアシ類の食性）*
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
肉食性
肉食性
肉食性
肉食性
雑食性
雑食性
植食性
植食性
肉食性
肉食性
肉食性
肉食性
肉食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
肉食性
肉食性
肉食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
雑食性
* Mauchlin (1998)
96
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
図 4.1.1-1
ヤムシと胃内容物の顕微鏡観察結果
左：0～200m から採取。胃内容物としてオンケアやミクロセテラなどのカイアシ類、有孔
虫などが認められた。
右：1500～2500m から採取。胃内容物は不定形で赤い油球を多く含んでいた。
16
8
15
δ N (‰)
12
4
0
-24
-20
-16
13
δ C (‰)
図 4.1.1-2
●
水深 1500-2500m における生物試料の安定同位体比マップ
カイアシ類、▲
ヤムシ類、△
97
ヤムシ類の胃内容
0m
65 m
フィーカルペレット（大と小）
500 m
155 m
オタマボヤ（左）とそのハウス（右）
1000 m
200 m
放散虫
1500 m
有孔虫
305 m
図 4.1.1-3
粒子状物質の顕微鏡観察結果
1 列目：懸濁粒子（0、500、1000、1500m から採取）
2 列目：沈降粒子（65、155、200、305m から採取）
囲み枠内：水深 200m から得た沈降粒子の各成分（スケールは 1mm）
98
15
13
δ N (‰)
0
8
δ C (‰)
16
-24
-20
-16
0
Depth (m)
500
1000
1500
図 4.1.1-4
粒子状物質の安定同位体比の鉛直分布
懸濁粒子：◆
脱炭酸塩処理なし
沈降粒子：□
脱炭酸塩処理あり、■
脱炭酸塩処理なし
16
8
全体
放散虫
残渣
15
δ N (‰)
12
4
オタマボヤと
そのハウス
0
フィーカル
ペレット(小)
フィーカルペレット(大)
-24
-20
-16
13
δ C (‰)
図 4.1.1-5
水深 200m から得られた沈降粒子とその成分の安定同位体比マップ
全体：○
脱炭酸塩処理あり
成分：□
脱炭酸塩処理あり、■
99
脱炭酸塩処理なし
16
8
15
δ N (‰)
12
4
0
-24
-20
-16
13
δ C (‰)
図 4.1.1-6
水深 1500-2500m におけるカイアシ類と粒子状物質の安定同位体比マップ
●
カイアシ類、▼
懸濁粒子、▽
100
沈降粒子
16
δ N (‰)
12
15
8
4
0
-24
-20
-16
13
δ C (‰)
図 4.1.1-7
●
水深 0-200m における試料の安定同位体比マップ
カイアシ類、▲
ヤムシ類、▼
101
懸濁粒子、▽
沈降粒子
16
中深層
12
8
ルシクチア属
Pleuromamma abdominalis
Scolecithrix danae
Candacia bipinnata
オンケア属
カラヌス属
4
0
0
4
8
12
16
表層
図 4.1.1-8
表層と中深層の両方で採取されたカイアシ類の窒素同位対比の比較
（見易さのため 1：1 の値を波線で示した）
102
引用文献
1)
Hirota, M. (1997) サンゴ礁生態系の同位体組成の特徴，月刊海洋. 29, 413-418
2)
Minagawa, M.,Wada, E. (1984) Stepwise enrichment of δ 15 N along food chains:
Further evidence and the relation between δ 15 N and animal age，Geochimica et
Cosmochimica Acta. 48, 1135-1140
3)
Yoshioka, T. (1997) TL＝1 の同位体比，月刊海洋. 29, 408-412
4)
Mauchline, J. (1998) The biology of calanoid copepods. Blaxter, J. H. S. ,
Southward, A. J.
and
Tyler, P. A. (eds), in "Advances in marine biology", London,
UK, Elsevier Academic Press
5)
Mackas, D. L., Sefton, H., Miller, C. B.,Raich, A. (1993) Vertical habitat
partitioning by large calanoid copepods in the oceanic subarctic Pacific during
spling，Progress in Oceanography. 32, 259-294
6)
Yamaguchi, A., Ikeda, T., Watanabe, Y.,Ishizaka, J. (2004) Vertical distribution
patterns of pelagic copepods as viewed from the predation pressure hypothesis，
Zoological Studies. 43, 475-485
7)
酒井均,松久幸敬 (1996) 炭素の同位体地球化学. 「安定同位対地球化学」,
東京大学
出版会, pp 143-222,
8)
Nishibe, Y.,Ikeda, T. (2007) Vertical distribution, population structure and life
cycles of four oncaeid copepods in the Oyashio region, western subarctic Pacific，
Marine Biology. 150, 609-625
9)
Yamaguchi, A.,Ikeda, T. (2000) Vertical distribution, life cycle, and body allometry
of two oceanic calanoid copepods (Pleuromamma scutullata and Heterorhabdus
tanneri ) in the Oyashio region, western North Pacific Ocean，Journal of Plankton
Research. 22, 29-46
参考文献
財団法人 地球環境産業技術研究機構 (2007) 平成 18 年度 二酸化炭素固定化・有効利用
技術等対策事業「二酸化炭素の海洋隔離に伴う環境影響予測技術開発」成果報告書, 64-84
103
４．１．２
生物パラメータへの影響実験
４．１．２－１ 目的
本検討では、生態系モデル構築における生物パラメータの高精度化を目的として、二酸
化炭素放出想定海域において、比較的大きな生物現存量を示し、また二酸化炭素に対して
も高い感受性を有するカイアシ類を用い、二酸化炭素曝露した際の呼吸速度および及びそ
れに伴う呼吸代謝活性に関する評価・検討を行った。
４．１．２－２ 方法
①呼吸速度評価試験
ａ．試験個体の採取
呼吸速度評価試験には、富山湾および大阪湾において採取された Metridia pacifica 、
Neocalanus cristatus、Paracalanus parvus、Calanus sinicus を用いた。
このうち M. pacifica、N. cristatus については、2008 年 1 月 29 日に富山湾水深 600m
地点（36°、50′N、137°、08′E）において、NGG54 プランクトンネットを水深 400m
から表層まで鉛直方向に曳くことにより採取した。
P. parvus、C. sinicus については、2008 年 2 月 7 日に大阪湾 4.9m 地点（34°、39′N、
135°、08′E）において、NGG54 プランクトンネットを鉛直方向に曳くことにより採取
した。
採取されたカイアシ類 4 種は、ネットによる採取後直ちに実体顕微鏡下でソーティング
することにより単離して実験に供した。
ｂ．実験海水の調整
近畿大学富山試験場において海面下 100m より取水されている海水を、0.45μm アイソ
ポアフィルターでろ過し、ベース海水とした。このベース海水 20L に対して、
( a ) Control ガス：CO2 = 380ppm、O2 = 21％、N2 = base
( b ) 高濃度 CO2 ガス：CO2 = 10000ppm、O2 = 21％、N2 = base
を、100ml/min で 6 時間以上曝気した。
Control ガスを 6 時間以上曝気した海水を Control 海水、高濃度 CO2 ガスを 6 時間以上
曝気し pH が約 6.85 となった海水を高濃度 CO2 海水とした。次に炭酸系計算プログラム
算出された pH と CO2
CO2SYS により、
任意の CO2 分圧における海水中の pH を算出した。
分圧の関係をもとに、Control 海水と高濃度 CO2 海水を任意の pH に合わせて混合し、目的
とする CO2 分圧の試験海水を調製した。なお CO2SYS を用いた計算を行うに当たって、平
成 12～13 年度にかけて実施された「NEDO エネルギー使用合理化海洋資源活用システム
開発」1)で得られた、近畿大学富山試験場 100m 海水のアルカリ度に関する通年観測結果を
参考とし、本計算におけるベース海水中のアルカリ度を 2256μmol/kg と仮定した。
104
ｃ．呼吸速度の測定
表 4.1.2-1 に本試験における条件設定を示す。ソーティングされた試験個体のうち、M.
pacifica、N. cristatus は、それぞれ試験条件と同一条件下で、12 時間以上前培養した後、
呼吸速度評価試験に供した。一方 P. parvus、C. sinicus については、前培養を実施しなか
った。
カイアシ類の培養容器には透明アクリルにより作成した 2 種のフローセル(Automatic
System Research 社製：容量 11ml、5.5ml)を用いた。このフローセルに任意の CO2 分圧に
調整した試験海水と試験個体を加え、フローセル上部より蛍光式 DO センサー（Automatic
System Research 社製）を挿入した。蛍光式 DO センサーを挿入したフローセルを任意の
温度条件に設定した恒温培養槽内に静置し、1 分毎のフローセル内の溶存酸素濃度の変化を
測定した（図 4.1.2-1）
。
蛍光式 DO センサーにより得られた任意の時間における溶存酸素濃度から、下記の式( 1 )
を用いて、試験個体あたりの呼吸速度（Ra）を算出した。
Ra = ( O1-O2 ) / ( T1 – T2 ) / N ・・・・・( 1 )
Ra：個体あたりの呼吸速度（µL-O2 / hr / animal ）
T1、T2：時間（ hr ）
O1、O2：T1 および T2 時間後のフローセル中の酸素量（µL）
各試験に用いた個体は、1%ホルマリンで固定した後、Nikon 社製万能投影機 Profile
Projector V-12 を用いて個体の体長および体幅を測定した（図 4.1.2-2）
。弘田らはカイアシ
類の体長と乾燥重量の関係を下記の式( 2 )で近似するとともに、湿重量と乾燥重量の重量比
を 10:1、個体 1mm3 あたりの湿重量を 1mg と仮定することが可能であると報告している 2)。
体長 Lx より式( 2 )-( 4 )を用いて試験個体の容積 Vx を算出した。算出された試験個体の容積
Vx より、各試験区における試験個体の平均容積 Vn を求め、式( 1 )から求められた個体あた
各試験区における単位容積あたりの呼吸速度 R
りの呼吸速度 Ra を Vn で除することにより、
を算出した。
logDWx= -9.59+3.41logLx
DWx = 10(-9.59+3.41logLx)・・・・・( 2 )
WWx = ( DWx×10 ) / 1000・・・・・( 3 )
WWx = Vx・・・・・( 4 )
Vn= (V1+V2+V3+・・・+Vn ) / N ・・・・( 5 )
R = Ra / Vn ・・・・( 6 )
DWx：個体あたりの乾燥重量（µg）
WWx：個体あたりの湿重量（mg）
105
Lx：体長（µm）
Vx：試験個体の容積（mm3）
Vn：各試験区での試験個体の平均容積（mm3）
N ：試験個体数
Ra：個体あたりの呼吸速度（µL-O2 / hr / animal ）
R ： カイアシ類 1mm3 あたりの呼吸速度（µL-O2 / hr / mm3 ）
②呼吸代謝活性評価試験
本検討では、M. pacifica について呼吸代謝系の重要な反応系のひとつである電子伝達系
（ETS）活性 5)を測定し、呼吸酵素活性のポテンシャル評価を行うとともに、呼吸代謝生成
物質のひとつである ATP 量を測定した。
ａ．試験個体の採取
呼吸代謝活性評価試験には 2008 年 1 月 29 日に富山湾水深 600m 地点（36°、50′N、
137°、08′E）において採取された M. pacifica を用いた。
ｂ．試験個体の調整
M. pacifica を、（a）CO2 =380µatm、O2 飽和、(b) CO2=2500µatm、O2 飽和、( c )
CO2=5000µatm、O2 飽和に調整された 3 通りの試験海水を分注した 500ml 容マヨネーズ瓶
に、それぞれ 22 個体ずつ添加し、96 時間、2℃条件で静置培養を行った後、呼吸代謝活性
測定に供した。
ｃ．試験海水の調整
試験海水の調整は、呼吸速度評価試験と同様の手法により行った。
ｄ．呼吸代謝活性の測定
( a ) ETS 活性
各 CO2 分圧条件下で 96 時間静置培養を行った M. pacifica のうち 10 個体ずつを 1.5ml
容エッペンドルフチューブに湿潤状態で分取した。ここに 100µL のホモジナイズ用リン酸
緩衝液を加え、ホモジナイザーペッセルを用いて試験個体を破砕した。ホモジナイズに用
いたホモジナイザーペッセルおよびエッペンドルフチューブ壁面に付着した残渣をリン酸
緩衝液で洗い流し、最終的に 500µL のリン酸緩衝液を含む懸濁液とした。この懸濁液を
1,000g、2℃条件下で 10 分間遠心分離を行い、上清画分 300µL を分取し、ETS 測定用試料
とした。
次に、NADH 4.8mg、NADPH 0.63mg を含む反応基質リン酸緩衝液 3ml と 1ml INT 溶
液（4mM テトラゾリウム塩：2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium
106
Chloride）を分注した 15ml 容遠沈管に、100μL の ETS 活性測定用試料を加え反応溶液と
した。
この反応溶液を 6℃、暗環境下で、20 分間反応させた。その後 1ml の反応停止薬（36％
ホルマリン溶液と 1M、pH2.5 のリン酸を等量ずつ混合）により ETS 反応を停止し、ETS
活性により還元されたホルマザンを、分光光度計を用いて 490nm と 750nm の波長で測定
した。
ここで得られた結果より、下記の式( 7 )、( 8 )を用いて ETS 活性を算出した。なお本検
討内では、標準ファクターである INT を 1 と仮定した。
ETS = 60×H×AS×COD / ( INT×T×L×f ）・・・・( 7 )
COD＝[( AOD×AS ) – ( BOD×BS ) – ( FOD×FS )] / AS・・・・( 8 )
ETS：電子伝達系活性量(µL-O2 / h )
H：懸濁液容量( ml )
AS：測定試料量( ml )
BS :反応基質リン酸緩衝液ブランク量( ml )
FS：INT 溶液ブランク量( ml )
AOD：測定試料における 490nm と 750nm での値の差
BOD：反応基質リン酸緩衝液における 490nm と 750nm での値の差
COD：INT 溶液における 490nm と 750nm での値の差
T：反応時間
L：測定に用いたセルに光透過距離（cm）
f ：試料添加量
INT：標準ファクター（本検討では 1 と仮定した。
）
( b ) ATP 量
各 CO2 分圧条件下で 96 時間静置培養を行った M. pacifica のうち 7～10 個体を 1.5ml
容エッペンドルフチューブに湿潤状態で分取した。ここに 100µL の Tris 緩衝液を加え、ホ
モジナイザーペッセルを用いて試験個体を破砕した。その後、破砕に用いたホモジナイザ
ーペッセルおよびエッペンドルフチューブ壁面に付着した残渣を Tris 緩衝液で洗い流し、
最終的に 500µL の Tris 緩衝液を含む懸濁液とした。この懸濁液を、98℃、5 分間煮沸処理
を行った後、氷温下で急冷した。その後、15,000rpm、4℃条件下で 5 分間遠心分離を行い、
上清画分 400µL を分取し、ATP 測定用試料とした。
この ATP 測定用試料のうち 10μL を 96 穴白色マイクロプレート上に分注した後、90µL
の Tris 緩衝液を加え反応溶液とした。ここに東洋インキ社菌次郎 ATP 活性測定用キット
LL-1001 発色試薬 100µL を添加し、Anthos 社製 Lucy2 Microplate Luminometer を用い
て発光量（ALU）を求めた。
107
得られた発光量から、予め求められた既知濃度の ATP と発光量の関係を示す下記の検量
線（図 4-1-2-3）を用いて ATP 量の算出を行った。
４．１．２－３ 結果
①呼吸速度評価試験
図 4.1.2-4 に、フローセル内における溶存酸素濃度変化を示す。各試験区において時間経
過とともに溶存酸素濃度の減少が確認された。なお P. parvus を用いた試験では、繰り返し
試験を行った同一 CO2 分圧試験区間で溶存酸素濃度の変化に差が見られた。これは P.
parvus を用いた試験では、2 回の繰り返し試験で用いたフローセルの容積が異なったため、
投入した試験個体についても相違が生じ、このためフローセル内の酸素消費濃度の変化に
不整合が見られたためである。
表 4.1.2-2、図 4.1.2-5、6 に各試験区において得られたカイアシ類 4 種の個体及び単位容
積あたりの呼吸速度を示す。呼吸速度の算出は、測定開始 1 時間から 1 時間経過する間の
短期的な呼吸速度と、測定開始 1 時間後から 6 時間経過する間の長期的な呼吸速度の 2 通
りについて行った。なお N. cristatus を用いた試験については、培養時間が 3 時間程度で
あったため、短期的な呼吸速度のみを求めた。また M. pacifica を用いた試験では、各 CO2
分圧で 2 回以上の繰り返し試験を行ったうち、7 時間以上の培養については、各試験区とも
に 1 回のみであったため、長期的な呼吸速度は 1 回の試験結果のみから算出した。求めら
れた短期的な呼吸速度と長期的な呼吸速度では、長期的な呼吸速度において繰り返し試験
間の誤差が小さくなる傾向が確認された。
M. pacifica を用いた試験で得られた呼吸速度の最大値は、試験個体あたりの呼吸速度に
おいて 2500µatmCO2 分圧条件下で 0.150µL-O2/hr/animal を示した。また単位容積あたり
の呼吸速度では 5000µatmCO2 分圧条件下において 0.266µL-O2/hr/mm3 を示した。一方最
低 呼 吸 速 度 は 試 験 個 体 あ た り の 呼 吸 速 度 で は 380µatmCO2 分 圧 条 件 下 に お い て
0.081µL-O2/hr/animal、単位容積あたりの呼吸速度では 380µatm の CO2 分圧条件下におい
て 0.148µL-O2/hr/mm3 となった。
N. cristatus を用いた試験で得られた呼吸速度の最大値は、試験個体あたりの呼吸速度に
おいて 1500µatmCO2 分圧条件下で 1.260µL-O2/hr/animal を示した。また単位容積あたり
の呼吸速度では 750μatmCO2 分圧条件下において 0.031µL-O2/hr/mm3 を示した。一方最
低呼吸速度は試験個体あたりの呼吸速度では 3500µatm の CO2 分圧条件下において
0.795µL-O2/hr/animal、単位容積あたりの呼吸速度では 380µatm の CO2 分圧条件下におい
て 0.016µL-O2/hr/mm3 となった。
P. parvus を用いた試験で得られた呼吸速度の最大値は、試験個体あたりの呼吸速度にお
いて 5000µatmCO2 分圧条件下で 0.033µL-O2/hr/animal を示した。また単位容積あたりの
呼吸速度では 380µatm の CO2 分圧条件下において、1.663µL-O2/hr/mm3 となった。一方
最低呼吸速度は試験個体あたりの呼吸速度では 2500µatm の CO2 分圧条件下において
108
0.017µL-O2/hr/animal、単位容積あたりの呼吸速度では 2500µatm の CO2 分圧条件下にお
いて 1.085µL-O2/hr/mm3 となった。
C.sinicus を用いた試験においては、一個体当たりの呼吸速度で評価を行った場合、CO2
暴露分圧の上昇に伴って呼吸速度も上昇する傾向が示され、5000µatm の CO2 分圧条件下
における呼吸速度は 0.146µL-O2/hr/animal となった。しかし単位容積あたりの呼吸速度に
ついて評価を行った場合、CO2 分圧と呼吸速度の間に、大きな相関は見られず、380µatm
の CO2 分圧条件下で、最も高い呼吸速度 0.402µL-O2/hr/mm3 を示した。
②呼吸代謝活性評価試験
（図
ETS 活性および ATP 量ともに、
CO2 曝露分圧の上昇に伴い増加する傾向が確認された
4.1.2-7）
。ETS 活性については、380µatm の CO2 分圧条件と比較して 5000µatm の CO2
分圧条件では ETS 活性が約 2.38 倍となり、2500µatm の CO2 分圧条件においても 380µatm
試験区の約 1.67 倍であった。
ATP 量については、
380µatm の CO2 分圧条件において 1 個体あたりの ATP 量が 0.94pmol
であったのに対して、2500µatm の CO2 分圧条件では 1.45pmol、5000µatm の CO2 分圧条
件では 2.84pmol となった。380µatm と 5000µatm の CO2 分圧条件を比較した場合、
5000µatm 試験区における 1 個体あたりの ATP 量は、380µatm 試験区における 1 個体あた
りの ATP 量の約 3.0 倍であった。
４．１．２－４ 考察
①実験系の構築
カイアシ類における呼吸速度については、池田らにより数多くの知見が取り纏められて
おり、その中で Calanus cristatus の呼吸速度を 1.02～1.08µL-O2/hr/mg-drywt（5.5～6.5℃
Metridia pacifica の呼吸速度を 1.69µL-O2/hr/mg-drywt（4.5～5.5℃条件）、P. parvus
条件）
、
では 6.74～9.92µL-O2/hr/mg-drywt（11.7～14.5℃条件）と報告している 3)。弘田らは、カ
イアシ類における湿重量と乾燥重量の重量比を 10:1、個体 1mm3 あたりの湿重量を 1mg と
仮定することが可能であると報告している
2)。池田らにより報告された
C.cristatus、M.
pacifica の呼吸速度について、弘田らの仮定に従い単位容積あたりの呼吸速度に換算した場
合 、 C. cristatus で は 0.102 ～ 0.108µL-O2/hr/mm3 、 M. pacifica で は 0.169 ～
0.308µL-O2/hr/mm3、P. parvus では 0.674～0.992µL-O2/hr/mm3 となる。本試験において
得られた N. cristatus の呼吸速度は、2℃で任意の CO2 分圧条件において、0.016～
0.031µL-O2/hr/mm3 となり、池田らの報告と比較して若干低い値となった。一方 M. pacifica
については、2℃で任意の CO2 分圧条件における呼吸速度は 0.148～0.266µL-O2/hr/mm3 で
あり、池田らの報告に近似した値となった。また P. parvus では 10℃で任意の CO2 分圧条
件における呼吸速度が 1.085～1.743µL-O2/hr/mm3 となり、池田らの報告と比較して若干高
い値となった。これらの呼吸速度の違いは、各試験での培養温度の違いや用いた個体の状
109
態に起因するものと考えられる。
また池田らは、カイアシ類と呼吸速度と個体の乾燥重量の関係を下記の式で近似してい
る 4)。
R=10(02538T-0.1259)×DW(-0.01089T+0.8918)・・・・（９）
R：個体あたりの呼吸速度（µL-O2 /hr/animal ）
DW：個体乾燥重量（mg）
T：水温（℃）
上記の式を用いて、本試験で用いた M. pacifica、N. cristatus、P. parvus、C. sinicus の
乾燥重量と培養試験時の温度条件から呼吸速度を求めた。その結果、M. pacifica で 0.120
N. cristatus では 0.067～0.071µL-O2/hr/mm3、P. parvus では 0.519
～0.127µL-O2/hr/mm3、
～0.549µL-O2/hr/mm3、C. sinicus で 0.257～0.304µL-O2/hr/mm3 となった。この値を、今
回得られた呼吸速度と比較すると、N. cristatus、P. parvus においては、若干の差が見られ
たが、M. pacifica、C. sinicus においては近似した値となった。
今回構築された実験系において得られた呼吸速度は、既存報告値等と比較して概ね近似
した値が得られており、本試験系の妥当性が示された。
②CO2 曝露によるカイアシ類への呼吸代謝への影響
本検討で得られた結果のうち、呼吸速度評価試験においては、380～7500µatm の CO2
曝露条件の間で、試験に用いたカイアシ類 4 種の呼吸速度に大きな差は見られなかった。
一方で M. pacifica を用いて行った呼吸代謝活性評価においては ETS 活性および ATP 量と
もに、CO2 曝露分圧の上昇に従い、増加する傾向が示された。しかし本試験で得られた呼
吸速度と呼吸代謝活性の間には CO2 曝露時間には差がある。呼吸速度代謝試験では、前培
養を含め最大 24 時間程度の CO2 曝露環境下での呼吸速度を評価したのに対して、呼吸代謝
活性評価においては 96 時間の CO2 曝露を行った後、ETS 活性および ATP 量を測定した。
このことから CO2 曝露後 24 時間程度ではカイアシ類の呼吸速度は CO2 による影響を受け
CO2 分圧に対応したある一定の呼吸更新が行われ、
ないが、
96 時間の CO2 曝露においては、
これに伴い ETS 活性および ATP 量等の呼吸代謝活性が上昇した可能性が示された。
４．１．２－５ 今後の課題
今回の検討では最大 96 時間の CO2 曝露におけるカイアシ類の呼吸への影響を評価した。
今後は、より長期的な CO2 曝露環境下での呼吸速度および呼吸代謝活性の双方についての
詳細な検討を行うことにより、本検討で示された可能性を発展的に評価し、生物パラメー
タ取得に係わる数値データの取得を行う必要がある。
110
引用文献
1) 沿岸環境調査マニュアル[底質・生物篇] 1986 恒星社厚生閣
2) 平成 13 年度エネルギー使用合理化海洋資源活用システム開発事業 新エネルギー・産
業技術総合開発機構共同研究業務
エネルギー使用合理化海洋資源活用システム開発－基
盤研究－ 成果報告書 II 2002 社団法人 日本海洋開発産業協会
3) T. Ikeda, 1974, Nutritional Ecology of Marine Zooplankton, Memoirs of the facult of
fisheries Hokkaido univ.
4) 池田
勉, 1978, 1978 年岡田賞受賞記念講演 海産動物プランクトンの代謝活性に関す
る研究－とくに体サイズとの関係について－, Journal of the Oceanographical Society of
Japan, Vol.33, pp.173-180
5) Zooplankton Methodology Manual, 2000, Academic Press
111
表 4.1.2-1 呼吸速度評価試験における実験条件
M. pacifica
N. cristatus
P. parvus
C. sinicus
10
2
25（試験1）
5（試験2）
3
培養温度（℃）
2
2
2
2
培養規模（ｍｌ）
11
11
380
380
750
1500
2500
3500
5000
7500
個体数
（個体数/試験区）
CO2分圧（μatm）
1500
2500
3500
5000
11（試験１）
5.5（試験2）
380
380
2500
2500
5000
5000
5.5
前培養
12時間以上実施
12時間以上実施
実施せず
実施せず
繰り返し試験数
各試験区2回以上
各試験区2回以上
試験1、試験2を1回
ずつ実施
各試験区2回
図 4.1.2-1 蛍光式 DO センサーとフローセルを用いた呼吸速度評価試験の様子
112
N.cristatus
3.0
0.8
2.5
体幅(mm)
体幅(mm)
M.pacifica
1.0
0.6
380μatm
1500μatm
2500μatm
3500μatm
5000μatm
0.4
0.2
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
380μatm
750μatm
1500μatm
2500μatm
3500μatm
5000μatm
7500μatm
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
2.0
0.0
3.0
0.0
2.0
4.0
体長（mm)
1.0
0.4
0.8
体幅(mm)
0.3
0.2
380μatm
2500μatm
5000μatm
0.1
0.2
10.0
12.0
0.4
0.6
体長(mm)
0.8
0.6
0.4
380μatm
2500μatm
5000μatm
0.2
0.0
0.0
8.0
C. sinicus
0.5
0.0
1.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
体長(mm)
図 4.1.2-2 試験に用いたカイアシ類の体長と体幅の関係
1.2
1.0
ATP量（pmol)
体幅(mm)
P. parvus
6.0
体長(mm)
0.8
0.6
0.4
y = 0.0009x
R2 = 1
0.2
0.0
0
200
400
600
800
1000
AUL
図 4.1.2-3 ATP 量と AUL の関係
113
1200
2.5
3.0
M.pacifica
N.cristatus
11.0
9.0
380ppm
750ppm
1500ppm
2500ppm
3500ppm
5000ppm
7500ppm
10.5
DO（mg/L)
10.0
DO（mg/L）
11.0
380μatm
1500μatm
2500μatm
3500μatm
5000μatm
8.0
7.0
10.0
9.5
9.0
8.5
6.0
8.0
0
200
400
時間（min）
600
800
0
50
P. parvus
11.0
C. sinicus
380ppm
2500ppm
5000ppm
10.0
DO（mg /L）
DO（mg/L）
9.0
150
11.0
380μatm（試験1）
2500μatm（試験1）
5000μatm（試験1）
380μatm（試験2）
2500μatm（試験2）
5000μatm（試験2）
10.0
100
時間（min)
8.0
7.0
9.0
8.0
7.0
6.0
0
200
400
時間（min）
600
800
6.0
0
100
200
300
時間（min）
図 4.1.2-4 各試験区におけるフローセル内の溶存酸素濃度の変化
114
400
500
表 4.1.2-2 各試験区におけるカイアシ類の呼吸速度
CO2分圧（μatm)
380
M. pacifica
N. cristatus
P. parvus
C. sinicus
開始1時間後から1時
個体当たりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/animal
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
容積あたりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/mm3
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
個体当たりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/animal
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
容積あたりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/mm3
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
個体当たりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/animal
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
容積あたりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/mm3
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
個体当たりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/animal
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
開始1時間後から1時
容積あたりの呼吸速度 間での呼吸速度
μL-O2/hr/mm3
開始1時間後から6時
間での呼吸速度
750
1500
2500
3500
5000
0.109
0.115
0.150
0.120
0.129
0.081
0.099
0.107
0.097
0.096
0.208
0.197
0.263
0.251
0.266
0.148
0.195
0.213
0.175
0.174
7500
0.814
1.241
1.260
0.824
0.795
0.879
1.086
0.016
0.031
0.029
0.018
0.018
0.018
0.022
0.027
0.017
0.033
0.028
0.019
0.024
1.579
1.085
1.743
1.663
1.194
1.297
0.120
0.126
0.146
0.105
0.120
0.146
0.402
0.298
0.365
0.316
0.273
0.370
115
2.0
0.20
呼吸速度
（μL-O2/hr/animal)
呼吸速度
（μL-O2/hr/animal)
N.cristatus
M.pacifica
0.25
0.15
0.10
0.05
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
0.00
61-120min(1hr)
1.5
1.0
0.5
0.0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0
2000
4000
CO2濃度（μatm）
CO2濃度（μatm）
P. parvus
8000
C. sinicus
0.05
0.20
0.04
呼吸速度
（μL-O2/hr/animal)
呼吸速度
（μL-O2/hr/animal)
6000
0.03
0.02
0.01
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
0.00
0.15
0.10
0.05
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
0.00
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0
1000
2000
CO2濃度(μatm)
3000
4000
5000
6000
CO2濃度（μatm）
図 4.1.2-5 任意の CO2 分圧におけるカイアシ類の個体あたりの呼吸速度
M.pacifica
N.cristatus
0.50
0.05
0.40
0.04
呼吸速度
（μL-O2/hr/mm3)
呼吸速度
（μL-O2/ hr/mm3)
61-120min(1hr)
0.30
0.20
0.10
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
0.00
0.03
0.02
0.01
0.00
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0
2000
CO2濃度（μatm）
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
呼吸速度
（μL-O2/hr/mm3)
呼吸速度
（μL-O2/hr/mm3)
1.00
2000
3000
4000
5000
0.60
0.40
0.20
61-120min(1hr)
61-420min(6hr)
0.00
0.00
1000
8000
0.80
2.00
0
6000
C. sinicus
P. parvus
3.00
4000
CO2濃度（μatm）
0
6000
1000
2000
3000
4000
5000
CO2濃度（μatm）
CO2濃度(μatm)
図 4.1.2-6 任意の CO2 分圧におけるカイアシ類の単位容積あたりの呼吸速度
116
6000
3.0
0.05
2.5
個体あたりのATP量
（pmol-ATP/animal）
ETS活性
( 1 ) ETS
0.06
0.04
0.03
0.02
0.01
( 2 ) ATP
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.00
380
2500
CO2濃度(μatm)
380
5000
2500
CO2濃度（μatm）
5000
図 4.1.2-7 任意の CO2 分圧における M.pacifica の ETS 活性および ATP 量
117
４．１．３
沈降フラックスへの影響
４．１．３－１
はじめに
中深層生態系には熱水・冷水噴出サイトなどに生息する化学合成生物を除くと有機物を
生成する生産者は知られておらず、中深層生態系は表層生態系から沈降してくる有機物粒
子に依存している。このような沈降粒子は、植物プランクトンそのもののほか、動物プラ
ンクトンの糞粒、植物プランクトンの珪藻や円石藻などの殻、動植物の生物遺骸、ホヤの
脱いだハウスなどさまざまなものから構成されている
1),2) 。これらの構成粒子はその粒径
の大きさから、単体では沈降せず、凝集して沈降する。例えば、Aldridge ら（1989）3) は、
珪藻からなる凝集フロックの観察を行っており、フロックの成長に伴って沈降速度が増加
することを報告している。フロックの沈降速度が上昇することは、ある層に存在する時間
が短くなることを意味しており、その層に生息する生物にとってはこれらの粒子を利用で
きる機会が減少し、結果として生物量の減少に繋がる可能性が考えられる。
また、マリンスノーの間隙中の有機物濃度は周囲の海水に比べて高いことがわかってい
る
4 ）。このような環境は微生物にとって好適な条件であり、マリンスノー中には細菌、微
小べん毛虫やせん毛虫などが生息すること、かつ粒子径が大きいほど生息数が多いとされ
ている
5) 。沈降粒子中の粒子状有機物は、生息する付着型の細菌類の働きにより溶存態有
機物に分解され、粒子の沈降に伴い、粒子後方に溶存態有機物のプリュームが形成される。
こうして拡散した溶存態有機物は周辺海中に生息する自由生活タイプの細菌類に消費され
ると言われている
6) 。このような物質の流れを考えると、沈降するフロックの形成状況が
変化することは、粒子中における微生物群集の組成や量に影響を与え、中深層生態系への
有機物供給の量のみならず、有機物の分解や供給経路についても影響を与えると考えられ
る。
一般に、懸濁粒子は負に帯電しており、表面荷電が中和されることにより微小粒子が形
成されるといわれている
7) 。この中和過程は、周囲の
pH により影響を受けるため、環境
中の pH 環境の変動は重要な要因と考えられる。例えば、Chin ら
8) は溶存有機物からコロ
イドの有機物粒子の生成に関して、pH が７以下となると生成する粒子のサイズが小さく
なると報告している。
CO 2 が海洋中に放出されると、溶解と解離に伴い pH の低下が生じるため、上記に述べ
た凝集作用への影響について検討をおこなうことが必要である。凝集フロックの大きさの
変化により、沈降速度、中深層生態系への基質の供給形態、微小生物のマイクロハビタッ
トの減少が生じた場合、長期的には海洋中の物質代謝へも波及する可能性もあり、重要な
問題と考えられる。
このような観点から、昨年度は、外洋中深層から採取された懸濁物を用いて、CO 2 の懸
濁物凝集への影響を研究した。その結果、粘着性物質が凝集に寄与している可能性があっ
118
た
9 ）。現在、海洋においては粒子の凝集に対しての酸性多糖類（Transparent
particle 以後 TEP と称す）の関与が指摘されている
10),11) 。
TEP
exopolymer
は粘性があるため、12),13) 、
周辺粒子の凝集を促進することから、海洋表層からの沈降除去に大きな影響を与えている
と考えられる
14) 。この
TEP 生成量は pCO 2 と共に増加することが知られており
海洋隔離時には、影響を受ける可能性が高い。また、TEP の C/N 比が高い
10) 、CO 2
11) ことからも、
CO2 海洋隔離に伴い TEP 生成量が変化した場合、物質循環に多大な影響を与える可能性
がある。しかしながら、CO 2 海洋隔離に伴う粒子凝集性や TEP 生成に係る知見は少ない。
４．１．３－２
目的
本研究では、CO 2 の海洋中層への隔離が、粒子凝集性つまり物質循環に与える影響を明
らかにすることを目的とする。
119
４．１．３－３
方法
外洋の懸濁物は、平成 19 年 11 月 14 日に、三陸沖の北緯 38 度・東経 145 度の地点か
ら採取した。採取深度は 1500m と 0m である。1500ｍの懸濁物は、現場濾過装置（日油
技 研 工 業 製 、 FP-6100 ） 内 の 孔 径 1.2 μ m の ポ リ カ ー ボ ネ ー ト メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー
（ISOPORE
RTTP14250,ミリポア製）で濾過することによって捕集した。0ｍの懸濁物
は、バケツで海水を採水し、ISOPORE
RTTP14250 で濾過することにより捕集した。ろ
過量はそれぞれ 874L と 73L であった。
沿岸の懸濁物は、平成 19 年 12 月 13 日～14 日にかけて、近畿大学水産研究所富山実験
場（北緯 36 度 47 分、東経 137 度 07 分）で採水している水深 100m からの汲みあげ海水
より採集した。100μm 以上の大きな粒子は、汲みあげ海水にプランクトンネット（NXX13）
を約 24 時間設置して捕集した。1.2μm 以上の小さな粒子は、汲み上げ海水をポリエチレ
ンコンテナーに採水し、ISOPORE
RTTP14250 で濾過することにより捕集した。
濾過したフィルターは実験室まで冷凍状態で持ち帰った。持ち帰ったフィルターはろ過
海水に浸漬し、30 分間超音波処理をおこなってフィルターから懸濁物を剥離させ、最終的
に約 1000ml の高濃度懸濁物海水を調製した。この高濃度懸濁物海水 400ml にたいして、
ろ過海水に CO 2 標準ガスを 12 時間以上曝気して調製した高 CO 2 海水と未曝気のろ過海水
を加えて、pH が凡そ 5.3 に成るように調整した（高 CO 2 区）。また、対照として、高濃度
懸濁物海水と未曝気ろ過海水だけで調整した懸濁水を調整した（自然 CO 2 区）。ここで用
いたろ過海水は、それぞれ、粒子を捕集した現場のろ過海水である。これらの懸濁水をカ
ルスターフラスコ（500ml、東京硝子器械製）に、なるべく気相部分がなくなるように満
たし（約 1.5L となる）、密栓状態とした後、スターラーを用いて 30rpm で攪拌をおこな
った（この作業を今後曝露と呼ぶ）。懸濁物の凝集には、バクテリア等の関与が考えられる
ため、曝露は４℃、暗条件で 24 時間行い、随時懸濁物の状況を観察した（図 4.1.3-1）。
凝集フロックの形成には、pH 条件が重要と考えられたため、曝露攪拌中は pH メーター
（TOA
DKK 製、HM-30R）によりフラスコ内の pH を経時的に計測した。
pH の変化に伴う、海水中 TEP 発生量の変化を明らかにするため TEP の測定を行った。
TEP 濃度は分光光度計を用いてキサンタンガムベースで比色定量した
15 ）。測定の繰り返
し精度は約 10％であった。また、懸濁物の有機炭素（POC）・窒素含有量（PON）は塩酸
蒸気中で炭酸塩を除去した後、CHN 元素分析計（PerkinElmer 2400）で測定した。
120
図 4.1.3-1
懸濁物曝露実験装置図
121
４．１．３－４
結果
外洋性懸濁物曝露実験時の pH と温度を図 4.1.3-2 に、沿岸性懸濁物曝露実験時の pH と
温度を図 4.1.3-3 に示す。全ての実験において、凡そ 3 時間で、目的温度 4℃に到達した。
目視観察ではこの間、粒子の凝集状態に大きな変化は見られなかった。このため、初期 3
時間の高い温度は粒子の凝集に影響を与えなかったと考えられる。凝集作用に影響が大き
いと考えられる pH は、曝露実験期間中に大きく変動することは無く、暴露実験終了時（24
時間後）においてもほぼ初期状態を保つことが出来た。
122
6.00
20
5.80
7.60
15
7.40
10
7.20
5
7.00
0:00
6:00
12:00
0
24:00
18:00
25
B)
20
5.60
15
5.40
10
5.20
5
5.00
0
0:00
6:00
Exposure time
C)
pH
7.80
6.00
20
5.80
7.60
15
7.40
10
7.20
5
7.00
0
0:00
6:00
12:00
18:00
24:00
Exposure time
25
Temp(℃)
pH
8.00
12:00
18:00
25
D)
20
5.60
15
5.40
10
5.20
5
5.00
24:00
Temp(℃)
pH
7.80
25
Temp(℃)
A)
Temp(℃)
pH
8.00
0
0:00
6:00
Exposure time
12:00
18:00
24:00
Exposure time
図 4.1.3-2
外洋性懸濁物曝露実験時の pH と温度
A) 1500m 自然 CO 2 区；B) 1500m 高 CO 2 区；C) 0m
自然 CO 2 区；D) 0m 高 CO 2 区を示す。
15
7.90
10
7.70
5
7.50
0:00
6:00
12:00
18:00
0
24:00
5.80
25
B)
20
5.60
15
5.40
10
5.20
5
5.00
0
0:00
6:00
Exposure time
25
6.00
20
5.80
8.10
15
7.90
10
7.70
5
7.50
Temp(℃)
pH
pH
C)
0
0:00
6:00
12:00
12:00
18:00
24:00
Exposure time
8.50
8.30
Temp(℃)
20
8.10
6.00
18:00
25
D)
20
5.60
15
5.40
10
5.20
5
5.00
24:00
0
0:00
6:00
Exposure time
図 4.1.3-3
Exposure time
沿岸性懸濁物曝露実験時の pH と温度
A) 100μm＜自然 CO 2 区；B) 100μm＜
C) 1.2μm＜
12:00
自然 CO 2 区；D) 1.2μm＜
を示す。
123
高 CO 2 区；
高 CO 2 区
18:00
24:00
Temp(℃)
pH
8.30
25
A)
Temp(℃)
pH
8.50
外洋性懸濁物の曝露直後は、1500m、0m の懸濁物両方で、肉眼で確認できる大きなフ
ロックは存在しなかった。しかしながら、24 時間曝露後は、1500m 懸濁物と 0m 懸濁物
の両 CO2 条件で大きなフロックが確認され、特に、自然 CO 2 区では、細い糸状の物質が
発生していた（図 4.1.3-4 と図 4.1.3-5）。また、溶液内を均一にするために攪拌した際、
自然 CO 2 区では、凝集フロックに粘性が認められた。
図 4.1.3-4
外洋性懸濁物（1500m）24 時間曝露後の状態
A)は自然 CO 2 区、B)は高 CO 2 区を示す。
124
図 4.1.3-5
外洋性懸濁物（0m）24 時間曝露後の状態
A)は自然 CO 2 区、B)は高 CO 2 区を示す。
125
曝露 24 時間後、バクテリアの活性を止めるためホルマリンを加え、1 週間静置し、フロ
ックを沈降させ、凝集状態を観察した（図 4.1.3-6）。その結果、1500m の懸濁物と 0m の
懸濁物ともに、自然 CO 2 区で膜状の物質が発生していた。
図 4.1.3-6
外洋性懸濁物曝露実験後、懸濁溶液に中性ホルマリン
を加え、2％に調整し、1 週間静置した状態
A) は 1500m 自然 CO 2 区、B) は 1500m 高 CO 2 区、C) は 0m 自然 CO 2 区
そして D)は 0m 高 CO 2 区を示す。
126
100μm 以上の沿岸性懸濁物は、砂質を多く含んでおり、外洋性懸濁物、沿岸性懸濁物の
1.2μm 以上の懸 濁物と は組成が大き く異なっ ていた。沿岸 性懸濁物 の海水曝露直 後は、
100μm 以上、1.2μm 以上の懸濁物両方で、肉眼で確認できる大きなフロックは存在しなか
った。しかし、24 時間曝露後は全ての実験区で大きなフロックが確認された（図 4.1.3-7）。
ただし、外洋性懸濁物の曝露実験で観察された糸状の物質は観察されなかった。1 週間静
置後は、外洋性懸濁物と同様に自然 CO 2 区で膜状の物質が観察された（図 4.1.3-8）。
図 4.1.3-7
沿岸性懸濁物曝露後の状態
A)は 100μm＜の自然 CO 2 区、B)は 100μm＜の高 CO 2 区、C)は
1.2μm＜の自然 CO 2 区そして D)は 1.2μm＜の高 CO 2 区を示す。
127
図 4.1.3-8
沿岸性懸濁物曝露実験後、懸濁溶液に中性ホルマ
リンを加え、2％に調整し、1 週間静置した状態
A)は 100μm＜の自然 CO 2 区、B)は 100μm＜の高 CO 2 区、C)は 1.2μm
＜の自然 CO 2 区そして D)は 1.2μm＜の高 CO 2 区を示す。
128
測定された TEP 含有量を図 4.1.3-9 に示す。外洋性懸濁物（0m）の曝露前の TEP 含有
量は、曝露後の TEP 含有量の約 3 倍、凡そ 170 μg/mg と大きい値であった。TEP 含有量
は
15) の方法に従って測定したが、この方法ではろ紙上の粒子をろ過しながら染色するため
に、フィルターが目詰まりすると測定値が高くなることが知られている
15) 。外洋性懸濁物
（0m）については、曝露前の TEP 含有量測定に供した粒子量が多かったことから、TEP
量が過大見積りされた可能性がある。外洋性懸濁物の TEP 含有量は約 50 μg/mg ～170
μg/mg と、沿岸性懸濁物の TEP 含有量（2 μg/mg ~ 11 μg/mg）より高い値であった。こ
のことは、沿岸性懸濁物が多くの砂質を含んでいることを示している。曝露後の TEP 含
有量について自然 CO 2 区と高 CO 2 区では一定の傾向が認められず、TEP 含有量に明白な
違いは認められなかった。
200
A)
TEP Conc.(μg/mg)
TEP Conc.(μg/mg)
120
90
60
30
0
100
50
25.0
C)
TEP Conc.(μg/mg)
TEP Conc.(μg/mg)
150
0
5.0
4.0
B)
3.0
2.0
1.0
0.0
20.0
D)
15.0
10.0
5.0
0.0
図 4.1.3-9
懸濁物曝露実験時の TEP 含有量
A)、B)、C)および D)はそれぞれ外洋性懸濁物（1500m）、外洋性懸濁物（0m）、
沿岸性懸濁物（100μm＜）と沿岸性懸濁物（1.2μm＜）を示す。棒は左側からそ
れぞれ曝露前、自然 CO 2 区と高 CO 2 区のキサンタンガムベースの TEP 含有量を示
す。エラーバーそれぞれ 2 回の測定値を示す。
129
４．１．３－５
考察
一昨年と昨年の研究では、粒径分布の測定結果等から、高 CO 2 環境が「沿岸性懸濁物の
凝集を抑制」「外洋性懸濁物の凝集を促進」したと結論付けている。そこで CO 2 の凝集へ
の影響が試料によって異なる原因を明らかにするため、本年度は、様々な物質を用いて同
様の懸濁物曝露実験を行った。その結果、外洋性懸濁物のみならず、砂分が多かった沿岸
性懸濁物でも、自然 CO 2 区で膜状物質の発生を確認した（図 4.1.3-4、図 4.1.3-5、図 4.1.3-6
と図 4.1.3-8）。これらのことから、高 CO 2 環境が懸濁物の凝集を抑制することが推察さ
れた。Chin ら
8) は溶存有機物からのコロイド有機物粒子の生成に関して、pH
が７以下と
なると生成する粒子のサイズが小さくなると報告しており、今回の実験結果と傾向が一致
した。一昨年と昨年の研究のように、沿岸性懸濁物と外洋性懸濁物で CO 2 に対して正反対
の挙動を示すことは考え難く、本年度得られた「高 CO 2 環境が、全ての懸濁物の凝集を抑
制した」という結果は簡潔であり、適切な結果であると考えられる。昨年度は、外洋性懸
濁物試料採取の際の時空間的制約から、懸濁粒子を少量しか採取できなかった。粒子が凝
集するためには、粒子同士が衝突する必要があり、粒子量が不十分であった昨年度は、本
年度より衝突確立が低かったはずである。また、昨年度の外洋性懸濁物では粒子の測定は、
粒径分布を 40μm 以下で評価しており、昨年度の沿岸性懸濁物や今年度の懸濁物と評価す
るサイズが異なっている。このため、本年度のように肉眼で観察される状況とは異なって
いるのかもしれない。これらのことが、昨年度の結果と本年度の結果が異なる原因だろう。
曝露後の自然 CO 2 区では、膜状物質および糸状物質が観察された。また、自然 CO 2 区
で、凝集フロックに粘性が認められた。現在海洋において、繊維状かつ粘性を持つ物質と
して TEP の存在が知られている
16),17) 。TEP
含有量を測定した結果、CO 2 濃度と TEP 含
有量の間に一定の関係を見つけることが出来なかった（図 4.1.3-9）。このことから、今回
観測された粘性物質は TEP と無関係であると考えられる。しかしながら、沿岸性懸濁物
（1.2μm＜）の高 CO 2 区で 2 回の測定値が大幅に異なっていることは（図 4.1.3-9）、その
他の TEP 含有量もエラーバーよりも大きな誤差を含んでいる可能性を示唆しており、TEP
と CO 2 濃度が無関係であると結論付けることは早計である。
ところで、TEP は POC/PON 比が高いことが報告されている
11) 。POC/PON
比と TEP
含有量の関係を図 4.1.3-10 に示す。TEP 含有量と POC/PON 比の間には相関関係が無か
った。また、POC/PON 比と CO 2 環境にも一貫した関係は発見できなかった。これに加え
て、曝露前に比べて曝露後の POC 量が減少している。特に、外洋性懸濁物で差が大きか
った（図 4.1.3-11）。このことは、実験時に懸濁物中の有機物が分解していたことを示す。
すなわち POC/PON 比の変化が示すものは、TEP の生成分解だけでなく、その他有機物中
の炭素と窒素の分解も生じていることを示している。特に、POC/PON 比が高 CO 2 区と自
然 CO 2 区で異なっていた（図 4.1.3-10）ことから、高 CO 2 環境は、有機物の分解過程に
影響を与えることを示している。このような影響はこれまでの深海底現場実験（ベンチッ
130
クチャンバー実験）でも細菌数や ATP の変化として知られており、浮遊生物系や沈降物質
でのマイクロハビタットを検討する際にも重要であると考えられる。
海洋深層生態系はおもに、表層から供給される粒子によって維持されている。海洋表層
から供給される粒子のフラックスは、粒子の密度と粒径に依存する。このため、CO 2 海洋
隔離に伴い、粒子の凝集性がどのように変化するかを明らかにすることは重要な課題であ
る。今回の研究で、CO 2 海洋隔離が粒子の凝集性に影響を与えることが明らかになった。
ただし、今回の結果は懸濁物を濃縮した状態でおこなっており、実験で見られた反応が懸
濁物の非常に希薄な外洋現場で生じているかどうかについては、慎重に判断すべきである。
しかしながら、凝集作用については pH の違いにより何らかの影響が生じることが明らか
であり、中深層へ沈降する物質の組成の解明と、より現場に即した実験方法の開発が必要
である。
131
100.0
35.0
A)
30.0
25.0
80.0
20.0
TEP Content (μg/mg)
60.0
0.0
4.0
4.0
5.0
2.0
0.0
0.0
19.5
19.0
18.5
3.0
2.5
0.0
Shiogama 0m I
25.0
20.0
3.5
8.0
40.0
20.0
20.5
C)
10.0
6.0
Shiogama 1500m IShiogama 1500mNShiogama 1500mH
4.5
12.0
B)
80.0
60.0
10.0
20.0
180.0
160.0
140.0
120.0
100.0
15.0
40.0
200.0
Shiogama 0mN
Shiogama 0mH
25.0
D)
20.0
20.0
15.0
15.0
17.5
10.0
10.0
17.0
16.5
5.0
5.0
16.0
15.5
0.0
18.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Toyama 100µm I
Toyama 100µmN
図 4.1.3-10
Toyama 100µmH
0.0
Toyama 1.2µm I
Toyama 1.2µmN
Toyama 1.2µmH
懸濁物曝露実験時の TEP 含有量と POC/PON 比の関係
A)、B)、C)および D)はそれぞれ外洋性懸濁物（1500m）、外洋性懸濁
物（0m）、沿岸性懸濁物（100μm＜）と沿岸性懸濁物（1.2μm＜）を
示す。棒と点は、左側からそれぞれ曝露前、自然 CO 2 区と高 CO 2 区の
6
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PON content (μg/mg)
POC content (μg/mg)
キサンタンガムベースの TEP 含有量と POC/PON 比を示す。
5
4
3
2
1
0
図 4.1.3-11
外洋性懸濁物（1500m）
外洋性懸濁物（0m）
沿岸性懸濁物（100μm＜）
沿岸性懸濁物（1.2μm＜）
n.d
懸濁物曝露実験時の POC と PON 含有量
棒の一群は左からそれぞれ、曝露前、自然 CO 2 区そして高 CO 2 区を示す。
132
POC/PON ratio (mol/mol)
120.0
４．１．３－６
まとめ
様々な懸濁粒子を用いて、CO 2 海洋隔離による懸濁物凝集作用への影響を研究した。
その結果、
1、高 CO 2 環境下では懸濁物凝集作用が抑制される
2、凝集過程には粘性物質が関与している
3、この粘性物質と TEP の関係は明白ではない
4、高 CO 2 環境は有機物の分解過程に影響を与える
ことが明らかになった。
４．１．３－７
今後の課題
現在の知見では、凝集に関連している粘性物質は TEP である可能性が高い。しかしな
がら、今回は TEP と粘性物質の関係は明白ではなかった。この原因の一つとして、TEP
測定上の問題があり、TEP 測定精度の向上を図らなければならない。さらに、TEP の生
成・分解は主に微生物の作用と考えられ、CO 2 の微生物への影響を考慮する研究を行なう
必要があるだろう。
また、今回は、TEP に着目して研究を行なったが、昨年度の報告書でも指摘しているよ
うに、pH の影響を受けて粒子の表面荷電が変化することも考えられ、表面荷電の測定な
ど新規の研究も必要であろう。
今回の研究では、隔離 CO 2 が粒子の凝集に影響を与えることが明らかになったが、隔離
CO 2 が深海生物群集に与える影響を明らかにするためには、CO 2 変化と下層へのフラック
ス変化の関係を定量化する必要があると考えられる。
133
引用文献
1)
Robison, B.H. et al. (2005) Giant larvacean houses: rapid carbon transport to the
deep sea floor. Science, 308, 1609-1611.
2)
Hansen, J.L.S. et al. (1996) Marine snow derived from abandoned larvacean
houses: sinking rates, particle content and mechanisms of aggregater formation.
Marine Ecology Progress Series, 141, 205-215.
3)
Alldredge, A.L. and Gotschalk C.C. (1989) Direct observations of the mass
flocculation of diatom blooms: characteristics, settling velocities and formation of
diatom aggregates. Deep-Sea Research, 36, 159-171.
4)
梶 原 昌 弘 (1989) マ リ ン ス ノ ー の 形 成 機 構 . Proceedings of Advanced Marine
Technology Conference, 1, 17–24.
5)
Kiørboe, T. (2003) Marine snow microbial communities: scaling of abundances with
aggregate size. Aquatic Microbial Ecology, 33, 67-75.
6)
Kiørboe, T. and Jackson G.A. (2001) Marine snow organic solute plumes, and
optimal chemosensory behavior of bacteria. Limnology and Oceanography, 46,
1309-1318.
7)
用水廃水便覧編集委員会 (1986）用水廃水便覧, 丸善.
8)
Chin, W.C. et al. (1998) Spontaneous assembly of marine dissolved organic matter
into polymer gels. Nature, 391, 568-572.
9) （財）地球環境産業技術研究機構 (2007), 平成 18 年度二酸化炭素固定化・有効利用技
術等対策事業
二酸化炭素の海洋隔離に伴う環境影響評価技術開発成果報告書
10) Engel, A. and Passow, U. (2001) Carbon and nitrogen content of transparent
exopolymer particles (TEP) in relation to their Alcian Blue adsorption. Marine
Ecological Progress Series, 219, 1-10.
11) Engel, A. (2002) Direct relationship between CO 2 uptake and transparent
exopolymer particles production in natural phytoplankton. Journal of Plankton
Research, 24, 49-53.
12) Dam, H.G. and Drapeau, D.T. (1995) Coagulation efficiency, organic matter glues
and the dynamics of particles during a phytoplankton bloom in mesocosm study.
Deep-Sea Research, 42, 111-123.
13) Logan, B.E. et al. (1995) Rapid formation and sedimentation of large aggregation is
predictable from coagulation rates (half-lives) of transparent exopolymer particles
(TEP). Deep-Sea Research, 42, 203-214.
134
14) Alldredge, A.L. et al. (1993) The abundance and significance of a class of large,
transparent organic particles in the ocean. Deep-Sea Research, 40, 1131-1140.
15)
Passow,
U.
and
Alldredge,
A.L.
(1995)
A
dye-binding
assay
for
the
spectrophotometric measurement of transparent exopolymer particles (TEP).
Limnology and Oceanography, 40, 1326-1335.
16) Passow, U. (2000) Formation of transparent exopolymer particles, TEP, from
dissolved precursor material. Marine Ecological Progress Series, 192, 1-11.
17) Passow, U. (2002) Production of transparent exopolymer particles (TEP) by phytoand bacterioplankton. Marine Ecological Progress Series, 236, 1-12.
135
４．１．４
分子微生物学的手法による多様性解析
４．１．４－１
目的
CO2 の海洋隔離が想定される水深近傍では、酸素極小層が存在し脱窒活性が高いことが想
定される。放出水深における微生物影響について、有機物分解に関してはさまざまな分類群
により分解活性自体が補償されることが期待されるが、脱窒活性のような特異的な機能につ
いては他の微生物による補償が難しいと考えられる。
このため、中深層における現場実験において脱窒活性への影響を評価することを目的として、
特異的微生物活性の解析手法の開発を目指すものである。
今年度は、脱窒活性に関する N2O 産生にかかわる遺伝子について DGGE 法を基にした解
析手法の検討と実験海域での現況把握を目的とする。
４．１．４－２
はじめに
環境中における脱窒過程にからむ遺伝子を用いた研究例を収集し、海洋における脱窒遺
伝子の検出方法を検討した。表 4.1.4-1 に、検索により収集した文献一覧を示す。文献検
索からは、関連するものとして 12 件の文献を抽出した。海洋を対象とした文献は４件で
あった。このように、窒素関連遺伝子を利用した環境中の脱窒菌の動態/多様性解析に関
する文献はあまり多くない。また、報告者は、日，米，英，独，カナダ，スウェーデン，
台湾等、全世界に渡るが、突出している国、報告者はいなかった。
これらの文献をみると、脱窒菌動態/多様性解析に使用する遺伝子は、nirS，nirK が使
用されるケースが多い。脱窒菌の多様性は、塩濃度、有機物濃度等による影響をうけて変
化することが報告されている。さらに、排水処理系に関する報告では、多様性の減少が、
排水処理性能（脱窒性能）の不安定性に関与することが報告されている。
今年度は、CO2 放出拡散が想定される 1000m 付近は酸素極小となるため、脱窒が生じ
ている可能性がある。このため、今年度は脱窒遺伝子の当該海域での有無を確認し、脱窒
遺伝子の検出技術への適用性を検討する。
136
137
03A0767978
04A0327393
③
03A0160202
1
②
整理番号
No.
竹内準一 (英国エセックス
大)
吉永郁生, 城戸優英, 内田
有こう (京大 大学院)
海水中で優勢な脱窒細
菌 Marinobacter spp.の
亜硝酸還元酵素遺伝子
(nirS)および N2O 還元
酵素遺伝子(nosZ)
日本水産
学会大会
講演要旨
集
月刊海洋
Appl
Environ
Microbiol
TARONCHEROLDENBURG G, GRINER E
M, FRANCIS C A, WARD B
B (Princeton Univ., New
Jersey)
環境中の窒素循環にお
ける機能的遺伝子多様
性の解析のためのオリ
ゴヌクレオチドマイクロ
アレイ
海洋微生物-II-基礎,応
用研究とその利用-2 章
生態研究 河口域堆積
物中における硝酸塩還
元細菌群集の生態
資料名
著者名
Vol.2004,
Page.166
(2004.03.31)
号外 35,
Page.99-105
(2003.11.01)
Vol.69, No.2,
Page.11591171
(2003.02)
巻号ページ
(発行年月日)
抄録なし
水系の微生物生態と生物地球化学を解明する
ために微生物の動的多様性を調べた。機能的
遺伝子を定量するためにオリゴヌクレオチドマイ
クロアレイを開発し応用した。米国メリーランド
州の水系 2 地点を対象にして脱窒素遺伝子
nirS を解析した。遺伝子間および遺伝子内分離
能を調べたこと,窒素循環の遺伝子
amoA,nifH,nirK,nirS を比較しシグナル分離を達
成したこと,アンモニア酸化菌株,脱窒素性ハロ
安息香酸分解菌株の nirK 変異株を単離したこ
と,マイクロアレイによる遺伝子内分離限界を調
べたこと,マイクロアレイ当たり標的 DNA10pg が
最小検出限界であること,調査 2 地点間のハイ
ブリダイゼーションパターンは相違すること,水系
の塩分,無機態窒素,溶解有機炭素の相違によ
り脱窒素菌株群集構成は相違することを報告し
た。
硝酸塩は嫌気的条件下では脱窒されるものと
思われてきた。しかし,海洋の生物地球化学的
な研究からアンモニアへと戻される経路のある
ことが判明した。その経路を担う微生物学的な
研究は,主に英国で進められた。今,分子生態学
的手法により錯綜する窒素循環経路に関与す
る機能遺伝子に新たなメスが入ろうとしている。
抄録
環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
題名
表 4.1.4-1
海
水
海
洋
河
口
域
水
系
対
象
nirS
norZ
不明
nirS
脱窒
遺伝
子
138
05A0400241
04A0430639
4
5
整理番号
No.
SHARMA
Shilpi,
ANEJA
Manish
Kumar,
MUNCH
Charles,
穀 実 用 マ メ 科 Jean
作 物 の 根 圏 に SCHLOTER Michael
お け る 亜 硝 酸 (GSF-National Res. Appl
レダクターゼ遺 Center
for Environ
伝子(nirK およ Environment
and Microbiol
び nirS)の転写 Health, Neuherberg,
DEU),
MAYER
多様性
Jochen
(Univ.
Kassel,
Witzenhausen, DEU)
Vol.71,
No.4,
Page.20012007
(2005.04)
Vol.70,
No.5,
Page.31523157
(2004.05)
YOSHIE
S,
TSUNEDA
S,
HIRATA A (Waseda
Tokyo),
排 水 処 理 シ ス Univ.,
テムにおける脱 NODA N (National
Advanced Appl
窒 細 菌 に 関 し Inst.
て亜硝酸レダク Industrial Sci. and Environ
タ ー ゼ 遺 伝 子 Technol., Ibaraki), Microbiol
の 多 様 性 を 塩 INAMORI
Y
分が減少する
(National
Inst.
Environmental
Studies,
Ibaraki,
JPN)
著者名
巻号ページ
(発行年月
日)
題名
資料名
異化作用性細菌亜硝酸レダクターゼをコードする nirK および nirS
遺伝子の転写を,経済的に重要な 3 穀実用マメ科作物,Vicia
faba,Lupinus albus,および Pisum sativum の成熟期根圏サンプルか
ら分離した mRNA の逆転写 PCR(RT-PCR)によって解析した。nirK
遺伝子と転写物は全ての根圏サンプルから検出された。nirK RTPCR 産物からの変性剤濃度勾配ゲル電気泳動像の比較により,サ
ンプリング変動を解析した。複製物間には高い類似性があり,作物毎
のこれら産物はクローン化したものであった。制限酵素 Mspl を用い
た制限断片長多形性によって,正しい挿入サイズを持つクローンをス
クリーニングした。クローンは 12 の型に分かれた。Lupinus ライブラ
リーは 12 の型全てを持っており,3 作物中で最も多様性があった。そ
れぞれの型のクローンの配列を解析した。同じグループにまとめた
型は全てクラスタに違いがあり,データベースに最初に記録されてい
る nirK から分かれたものであった。試験結果から,マメ科作物根圏
における脱窒素の新規多様性が分かった。根圏が遺伝子転写に影
響を及ぼすことが分かった。
冶金工業排水処理システム MWTS における亜硝酸還元細菌の実
態を調べた。嫌気性充填層の MWTS(I)および嫌気性流動層の
MWTS(I)を対象にして比較した。MWTS の嫌気性リアクター内の
nirK および nirS の多様性を調べた。遺伝子クローニング法,配列決
定法,系統解析法で脱窒細菌群集を解析した。I および II の nirK お
よび nirS の多様性を比較して,排水の流動性が脱窒細菌群集に与
える影響を調べた。塩分が存在すると細菌の多様性が減少するこ
と,nirS クローンは海洋細菌に類似すること,nirK クローンは
Alcaligenes 属に類似することを報告した。
抄録
表 4.1.4-1（つづき） 環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
耕
作
地
排
水
対
象
nirS
nirK
脱窒
遺伝
子
nirS
nirK
139
06A0240020
05A0966220
6
⑦
整理番号
No.
資料名
巻号ページ
(発行年月
日)
Appl
Environ
Microbiol
Vol.72,
No.3,
Page.21022109
(2006.03)
Vol.27,
YOU Sheng-Jie
No.19,
(Chung
Yuan Biotechnol
Page.1477Christian Univ., Lett
1482
Chungli, TWN)
(2005.10)
著者名
SANTORO
Alyson
E.,
海岸帯水層にお
BOEHM
いて硝酸塩およ
Alexandria
B.,
び塩分勾配に影
FRANCIS
響される脱窒細
Christopher
A.
菌集落組成
(Stanford Univ.,
California)
亜硝酸レダクター
ゼ遺 伝子を 用い
ることによる活性
スラッジシステム
での脱窒細菌多
様性の同定
題名
都市下水処理プラントの活性スラッジにおける脱窒菌の多様性を
亜硝酸レダクターゼコード化遺伝子 2 種類,nirS 及び nirK で検討し
た。チトクローム cd1 含有(nirS)または銅含有(nirK)の亜硝酸レダク
ターゼを有する脱窒菌の培養コロニーは nirS 及び nirK に対する
PCR プライマーで増幅して調べた。培養コロニーの 22.5%及び
12.5%は各々nirS 及び nirK のプライマーで増幅でき,各々それらの
遺伝子を有することから,両者をあわせた 35%のコロニーが脱窒菌
とみなせることを示した。更に,両亜硝酸レダクターゼ含有コロニー
は RFLP 及び変性勾配ゲル電気泳動分析により 5 種類の異なるタ
イプの細菌に分類できた。系統発生分析の結果から,5 タイプの脱
窒菌は系統発生的に多様であり,また獲得できた唯一の nirS 遺伝
子と他の公表されている nirS 遺伝子との配列相同性が多様である
ことを確認した。
脱窒作用すなわち硝酸塩および亜硝酸塩のガス状物質(NO,N,O,お
よび N)への亜酸素状態での微生物異化還元は,長い間エコシステ
ムからの固定化窒素の生物学的消失だと考えられてきた。ここで
は,高硝酸塩含有地下水が存在するカリフォルニアのハンチントン
海岸における,海岸帯水層での脱窒性集落を調べた。海岸帯水層
の堆積物から抽出した DNAs から,nirK 脱窒作用経路で重要な役
割を果たす亜硝酸レダクターゼをコードする遺伝子断片(nirK およ
び nirS)を PCR 増幅し,クローニングし,配列を解析した。nirK クロー
ンは 85%以上,nirS クローンは 92%以上が脱窒細菌として培養でき,
データベースで他の環境中クローンに対してアミノ酸レベルで同定
できた。互いに 40m 以内に位置している場所でも独自の集落であ
ると識別できたことから,脱窒細菌多様性および集落組成変化は小
さいと考えた。モンテカルロ法による nir 配列の統計解析で,ある種
の集落は完全に識別できたが,完全に高度に多様化した脱窒作用
集落の特性を明らかにするには,さらに配列を解析する必要がある
と考えた。
抄録
表 4.1.4-1（つづき） 環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
海
岸
帯
水
層
活
性
汚
泥
対
象
nirSn
irK
脱窒
遺伝
子
nirS
nirK
140
07A0098477
06A0869532
8
⑨
整理番号
No.
著者名
DNA マイクロアレ
イ を 用 い る
PUGET SOUND
の堆積物からの
生物地球化学的
循環遺伝子の多
様性
日本生態
学会大会
講演要旨
集
資料名
TIQUIA
S.M.,
GURCZYNSKI S.,
ZHOLI A. (Univ.
Michigan,
MI, Environ
USA), DEVOL A. Technol
(Univ.
Washington, WA,
USA)
湿地生態系にお
ける脱窒菌およ
LEE Seung-Hoon,
びメタン生成菌の
KIM Seon-Young,
コミュニ テ ィ構成
KANG Hojeong
に及ぼす CO2 上
昇の影響
題名
Vol.27,
No.12,
Page.13771389
(2006.12)
Vol.53rd,
Page.442
(2006.03.24
)
巻号ページ
(発行年月
日)
オリゴヌクレオチド基部の DNA マイクロアレイとして 50mer プロー
ブを用いて PUGET SOUND 堆積物中の多数の異なる機能をもつ
遺伝子の構成とポピュレーションダイナミクスをモニタリングした。ア
レイは 763 プローブを含み,具体的には硝化(amoA),メタン酸化
(pmoA),脱窒(nirS,nirK),窒素固定(nifH およ及び硫酸塩還元(dsrAB)
領域に関与する。763 含むこれらの遺伝子コードは上記生態系プロ
セスでの鍵酵素(かぎこうそ)となる。PUGET SOUND で深さの異な
る沈積物から試料を取り,オリゴチップを用い前述の遺伝子分布を
特徴づけた。より浅部堆積物から得られた遺伝子組成と分布はよく
似ていたが,深部堆積物は異なる生物群構造を示し,生物多様性も
著しく少なかった。明らかな雑種形成の兆候を分析すると,試料全体
に共通の遺伝子の存在が分る。さらに最も有力な機能をもつ個体
群(ギルド)は窒素循環群に含まれていることを示した。
抄録なし
抄録
表 4.1.4-1（つづき） 環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
湾
内
堆
積
物
湿
地
対
象
nirS
nirK
不明
脱窒
遺伝
子
141
07A0715416
07A0159867
10
11
整理番号
No.
資料名
GENTILE
M.E.
(ARCADIS, California),
JESSUP C.M., CRIDDLE Appl
C.S. (Stanford Univ., Environ
California), NYMAN J.L. Microbiol
(Malcom Pirnie, Inc.,
California)
著者名
DANDIE C. E., MILLER
M. N., ZEBARTH B. J.,
土 壌 中 の GOYER C. (Potato Res.
脱 窒 菌 叢 Centre, Agriculture and
の 一 酸 化 Agri-Food Canada, New
Appl
窒 素 レ ダ Brunswick,
CAN),
Environ
M.
N.,
ク タ ー ゼ MILLER
Microbiol
標 的 リ ア TREVORS J. T. (Univ.
ル タ イ ム Guelph, Ontario, CAN),
PCR 定量 BURTON D. L. (Nova
Scotia Agricultural Coll.,
Nova Scotia, CAN)
脱窒素分
散増殖反
応器にお
ける機能
不安定性
と群落動
態との相
関関係
題名
生物学的水処理システムは機能的に安定であり,しかも長期にわたっ
て複雑な微生物集落活性を維持して汚染質を処理する必要がある。
ここでは,2 種類の分散増殖脱窒素反応器を用いて,機能的に安定な
時期と不安定な時期における集落動態を比較した。集落構造は 16S
rRNA 遺伝子を用いて検討した。集落動態は T-RFLP を用いて検討し
た。機能的に不安定な時期には集落構造が大きく変化し,集落動態は
排水化学と有意な相関性を示した。試験結果から,集落動態と機能的
不安定性の間には明かな関係があり,脱窒素集落内の硝酸還元菌類
中の多様性が重要であることが分かった。
抄録
土壌微生物の培養で脱窒菌数を定量し,炭素源添加処理による脱窒
菌叢密度変化を調べた。そのため,脱窒菌数の定量にはチトクローム
c を電子供与体とする一酸化窒素レダクターゼ cnorB 遺伝子のリア
ルタイム PCR 定量をした。全菌数は 16S rRNA 遺伝子リアルタイム
Vol.73,
PCR により測定した。まず,土壌微小生態系にグルコース炭素
No.13,
500mg/kg 土壌を毎日,7 日間添加した場合の土着土壌微生物で 16S
Page.4250rRNA のコピー数が微生物バイオマス炭素と正相関することを認め
4258
た。次に,グルコース炭素量を 0-500mg/kg 土壌の範囲で変動して与
(2007.07)
えたときの微生物叢の動態を調べ,Pseudomonas 由来の cnorB が添
加グルコース量に応じて増加したが,Bosea 由来の cnorB は変化しな
かった。このとき土壌微小生態系において脱窒速度,呼吸,cnorBp 密
度はグルコース添加速度に応じて増加した。
Vol.73,
No.3,
Page.680690
(2007.02)
巻号ペー
ジ
(発行年月
日)
表 4.1.4-1（つづき） 環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
16Sr
RNA
16Sr
RNA
排
水
土
壌
脱窒
遺伝
子
対
象
142
整理番号
07A1142384
No.
12
著者名
資料名
KJELLIN Johan,
WOERMAN
Anders (Dep. of
Land and Water
Resources
水文 学と 脱 窒素
Engineering,
群集構造によっ
Royal Inst. of
Water
て説明される湿
Technol.,
Res
地堆積物での脱
Stockholm, SWE),
窒素活性の空間
HALLIN
Sara
変化
(Dep.
of
Microbiology,
Agricultural Univ.
of
Sweden,
Uppsala, SWE)
題名
抄録
スウェーデンの処理用湿地の堆積物における脱窒素活性と生物化学
的および水文学プロセスコントロールの空間変化を定量した。2D 深さ
平均化流れモデルを用いて水滞留時間を含む水文学プロセスを分析
し,酸化二窒素レダクターゼをコード化する nosZ 遺伝子の勾配ゲル電
気泳動(DGGE)の変成を用いて脱窒菌群集構造を分析した。さらに,硝
酸塩制限条件で有用な脱窒素速度の評価への理論的基準を提示し
Vol.41,
た。結果は,脱窒素速度がサンプリング場所間で大きく異なる
No.20,
Page.4710- (CV=0.34)ことを示した。変化は堆積物での窒素濃度と水滞留時間に
4720
よって最も良く記述された。DGGE 分析は,いくつかの重要な集団が支
(2007.12)
配し,群集多様性が栄養塩類レベルの減少と水滞留時間の増加と共
に増加することを示した。さらに,硝酸塩制限試験で測定した生成物生
成に対する脱窒素と他の窒素変換プロセスを比較する数学式の適合
によって,Menten および一次速度に関する脱窒素速度を推算できるこ
とを示した
巻号ペー
ジ
(発行年月
日)
表 4.1.4-1（つづき） 環境中における脱窒遺伝子の研究例と検出方法に関する検討結果
（No.欄の丸数字は海洋を対象とした文献）
湿
地
対
象
nosZ
脱窒
遺伝
子
４．１．４－３
脱窒過程と遺伝子の選択
窒素循環に関わる分子生物学の専門家にヒアリングを行い，解析手法の選択および特異的
プローブの提供の可能性について調査を実施した。
脱窒性能を有する微生物は分類学上の多くの種類にまたがるため，特定の菌をターゲット
とする 16SrRNA ではなく，脱窒関連酵素（図 4.1.4-1）をコードする遺伝子が用いられる。
文献調査からも、脱窒過程の評価には nir 遺伝子を用いていることが多く、本研究において
も技術的な実現性を考え、nir 遺伝子を対象とする。
図 4.1.4-1
窒素循環とそれに関わる酵素
（出典：長岡技術大学
水環境工学研究室）
nir 遺伝子は，脱窒菌に固有の亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子であり，それぞれ nirS，
nirK でコードされる，機能は同じで構造の異なる２種類の亜硝酸還元酵素が存在する。脱窒
菌はどちらかの遺伝子を持っているが、１つの種（species）には１種類の酵素だけが存在す
る。但し，同じ nirS でも菌種ごとに若干の配列の違いはある。京都大学では nirK と nirS の
ポジティブコントロール（ポジコン）を調整可能であることがわかった。
nirK および nirS をターゲットとするプライマは下記の通りである。
nirK：
nirK1F 526-542 GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA
143
nirK5R 1023-1040 GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGG
nirS：
nirS1F 763-780 CCTA(C/T)TGGCCGCC(A/G)CA(A/G)T
nirS6R 1638-1653 CGTTGAACTT(A/G)CCGGT
Braker, G. et al (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64:3769-3775
また、京都大学の PCR プロトコルは下記の通り
95℃
4min
95℃
0.5min
56℃
0.5min
72℃
1min
72℃
7min
4℃
hold
４．１．４－４
×30
ＤＮＡ試料の抽出と精製
① 試料
海洋調査 K12-07 において採水され、0.2μm ポリカーボネートメンブレンフィルターによ
りろ過した凍結試料を用いた。サンプルは下記の通りである。
・N2O
0m
2007.11.9：フィルター7 枚（うち 4 枚を分析）
・N2O
500m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
・N2O
1000m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
・N2O
1500m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
144
② DNA 抽出
フ ィ ル タ ー を 細 か く 切 り ， 500 µl マ イ ク ロ チ ュ ー ブ へ 入 れ ， 試 薬 Lyse-N-GoTMPCR
Reagent（PIERCE 製）500 µl を加え，試薬がフィルター全体に行き渡るように撹拌を実施
した。サーマルサイクラー（PROGENE，Techne 製）を用い，下記条件にて抽出を行った。
65℃
30sec
8℃
30sec
65℃
90sec
97℃
180sec
8℃
60sec
65℃
180sec
97℃
60sec
65℃
60sec
80℃
hold
抽出したサンプルは-80 ℃で冷凍保存した。
精製は以下の方法で実施した。マイクロピペットを用いて抽出液を可能な限り 1.5 ml マイ
クロチューブへ移し，遠心分離（3000 rpm，5 min，4 ℃）を行った。別の 1.5 ml マイクロ
チューブへ上澄み液を可能な限り移し，抽出試薬の 2.5 倍量（約 1 ml）の凍結エタノールを
加え，マイクロチューブを上下に転倒させ，よく混合した。混合した-20 ℃で 2 時間以上放置
後，遠心分離（12000 rpm，15 min，4 ℃）を行ない，上澄み液を捨て，70 %凍結エタノー
ルを 400 µl 加えた。遠心分離（13000 rpm，5 min，室温）を行ない，上澄み液を完全に捨
て，55 ℃で瞬間的にエタノールを揮散させた。TE buffer を全量 100 µl となるように加え溶
解し，55 ℃で 1 時間静置しマイクロチューブにまとめた。
４．１．４－５
N2O 産生に関わる DNA プローブを用いた DGGE 法による微生物評価手法検討
N2O 産生に関わる遺伝子群のうち，二種類について，DGGE 法による検出手法の検討を実
施した。
① DNA 増幅の検討
以下に述べる検討には，京都大学より提供頂いたポジティブコントロール（以下，ポジコ
ン）を用い，ポジコンでの DNA 増幅の有無をもって条件の良否判断を行なった。
a.
nirS の増幅に関する検討
方法
プライマーは京都大学
吉永先生のプロトコルおよび文献（ 表 4.1.4-1
145
No.1） を参考に
作製した。配列は下記の通りである。
nirS1F (763-780)
：CCTA(C/T)TGGCCGCC(A/G)CA(A/G)T
nirS6R (1638-1653)
：CGTTGAACTT(A/G)CCGGT
PCR の際のサンプル量を決定するため，ポジコン添加量を変化させて PCR 増幅を確認し
た。試薬組成は文献（表 4.1.4-1
No.1）に従った。
200 µl マイクロチューブへ下記試薬および DNA 鋳型となるサンプルを入れる。サンプル
はポジコン（40ng/µl）とし，添加量を 0.25，1，2.5 µl（0.2，0.8，2 ng/µl）とする。
10×Buffer
5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
nirS1F プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
nirS6R プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
サンプル
0.25，1，2.5 µl（10，40，100 ng）
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
（1.0 U）
サーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，下記条件（京大プロトコール）にて
PCR を実施した。
95℃
4min
95℃
0.5min
56℃
0.5min
72℃
1min
72℃
7min
4℃
hold
×30
この試料の一部について、2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確
認した。
結果
図 4.1.4-2 に PCR 産物の電気泳動写真を示す。サンプル添加量 0.25，1 µl（0.2，0.8
ng/µl）では DNA 増幅が見られたが，添加量 2.5 µl（2 ng/µl）では増幅は確認されなかった。
146
なお，NirS 遺伝子は 900bp 付近に検出される。
サンプル 0.2ng/µl
サンプル 0.8ng/µl
サンプル 2ng/µl
マーカー（100bp）
1000
図 4.1.2-2
PCR 産物の電気泳動写真
147
500
100bp
ｂ．nirK の増幅に関する検討
方法
プライマーは京都大学
吉永先生のプロトコルおよび文献（ 表 4.1.4-1
No.1） を参考に
作製した。配列は下記の通りである。
nirK1F (526-542)
：GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA
nirK5R (1023-1040)
：GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGG
200 µl マイクロチューブへ下記試薬および DNA 鋳型となるサンプルを入れ，サンプルは
ポジコン（40ng/µl）とし，添加量を 0.25，1，2.5 µl（0.2，0.8，2 ng/µl）とし，試薬組成は
文献（表 4.1.4-1
No.1）に従った。
10×Buffer
5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
nirK1F プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
nirK5R プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
サンプル
0.25，1，2.5 µl（10，40，100 ng）
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
（1.0 U）
PCR 条件１としてサーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，下記条件（京大プ
ロトコール）にて PCR を実施した。
95℃
4min
95℃
0.5min
61-56℃ 0.5min（0.5℃/cycle）
72℃
1min
95℃
0.5min
56℃
0.5min
72℃
1min
72℃
7min
4℃
hold
×10
×20
148
PCR 条件２としてサーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，文献（ 表 4.1.4-1
No.1）の下記条件にて PCR を実施した。
95℃
5min
95℃
30sec
45-40℃ 40sec（0.5℃/cycle）
72℃
40sec
95℃
30sec
43℃
40sec
72℃
40sec
72℃
7min
4℃
hold
×10
×20
PCR 増幅産物を 2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確認した。
結果
PCR 条件１においてはいずれの濃度においてもサンプルの増幅は確認されなかった。図
4.1.4-3 に PCR 条件２における PCR 産物の電気泳動写真を示す。PCR 条件２においてはポ
ジコンにて増幅が確認された。なお，NirK 遺伝子は 500bp 付近に検出された。（図 4.1.4-3）
サンプル
マーカー（100bp）
1000
図 4.1.4-3
PCR 産物の電気泳動写真
149
500
100bp
② GC clamp 付きプライマーによる DNA 増幅
本項では DGGE を行なうための GC clamp 付きプライマーでの DNA 増幅に関する検討を
実施した。ポジティブコントロールとして過去に DNA 抽出したサンプルの中から，nirK の
増幅を確認したものをポジコン K として用いた。
プライマーは前節に示すプライマーペアのうち，フォワードプライマーの 5’側に GC clamp
と呼ばれる 40bp 程度の G-C が豊富な配列を設計したものを作製した。GC clamp 配列は，
従来より 16SrRNA 領域増幅のために使用しているプライマーと同じ GC clamp 配列を付加
した nirK1F-GC と，文献（ 表 4.1.4-1
No.2） を参考にした nirK1F-GC-Jbac の 2 種類を作
製し，検討に用いた。配列は下記の通りである。
nirK1F-GC
：
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG
GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA
nirK1F-GC-Jbac
：
CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG
GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA
nirK5R
：GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGG
a．検討１
方法
200 µl マイクロチューブへ下記試薬および DNA 鋳型となるサンプルを入れた。但し，プ
ライマーペアは nirK1F と nirK5R，nirK1F-GC と nirK5R，あるいは nirK1F-GC-Jbac と
nirK5R とし，サンプルはポジコン K（0.4～0.5 ng/µl）とした。
10×Buffer
5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
F プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
R プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
サンプル
0.4～0.5 ng/µl
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
（1.0 U）
150
サーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，文献（表 4.1.4-1
No.1）の下記条件
にて PCR を行なった。
95℃
5min
95℃
30sec
45-40℃ 40sec（0.5℃/cycle）
72℃
40sec
95℃
30sec
43℃
40sec
72℃
40sec
72℃
7min
4℃
hold
×10
×20
2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確認した。
結果
PCR 産物の電気泳動写真を図 4.1.4-4 に示す。プライマーnirK1F を用いたものは増幅する
が，GC clamp を付けた nirK1F-GC と nirK1F-GC-Jbac を用いたものはいずれも増幅が見ら
れなかった。また，nirK1F で増幅した PCR 産物は，約 500bp の目的バンド以外にも複数の
サイズのエキストラバンドが見られた。
マーカー
nirK1F
nirK1F
nirK1F-GC
nirK1F-GC
nirK1F-GC-Jbac
nirK1F-GC-Jbac
図 4.1.4-4
PCR 産物の電気泳動写真
151
ｂ．検討 2
方法
検討１のエキストラバンド検出を受け，参考文献
1) の『プライマーの最終濃度は通常
0.5
µM にする。混合プライマーのように各プライマー分子の濃度が低くなる場合にはもっと濃度
を高くしてもよいが，ほとんどの場合 0.5 µM より高いプライマー濃度は非特異的増幅を増す
だけなので避けたほうがよい。まず 0.5 µM を試してみて，それでも非特異的増幅が見られる
ようなら，0.2 µM 程度まで濃度を下げてみるのも手である。』との記載を参考にして，プラ
イマー濃度を変化させて PCR 増幅を確認した。各プライマー濃度を 0.7，0.5，0.4，0.3，0.2
µM とし，検討１と同様に操作した。
結果
プライマーnirK1F では 0.7，0.5 µM およびとても薄いが 0.4 µM にて増幅が確認された。
一方 GC clamp 付きの nirK1F-GC，nirK1F-GC-Jbac ではいずれのプライマー濃度でも増幅
は見られなかった。
ｃ．検討 3
方法
検討１のエキストラバンド検出を受け，参考書籍 3)の『鋳型 DNA とオリゴヌクレオチドが
2 本鎖を形成してプライミング反応*4 が起こるためには，アニーリングの温度をオリゴヌク
レオチドの Tm*5 以下にしなければならない。しかし一方で，アニーリング温度を下げすぎ
るとプライマーの非特異的なアニーリングが起こりやすくなり，目的とする DNA 断片の増幅
を非特異産物が阻害する。したがって，アニーリング温度は可能な限り高いことが望まし
い。』との記載を参考にし，アニーリング温度を高く設定して PCR を試みた。
200 µl マイクロチューブへ検討１と同様に試薬およびポジコンを入れ，各プライマー濃度
は検討２と同じく 0.7，0.5，0.4，0.3，0.2 µM とした。サーマルサイクラー（PC802，
ASTEC 製）を用い，文献（表 4.1.4-1
95℃
10min
94℃
1min
56℃
1min
72℃
1min
72℃
10min
4℃
hold
No.4） の下記条件にて PCR を行なった。
×30
2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確認した。
152
結果
いずれにサンプルも増幅は確認されなかった。
ｄ．実サンプルでの DNA 増幅
方法
200 µl マイクロチューブへ下記試薬，実サンプルの DNA 抽出液およびポジコン K を入れ
た。プライマーペアは，nirK1F と nirK5R とする。なおプライマー濃度は，検討２の結果か
ら 0.5 µM とした。
10×Buffer5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
nirK1F プライマー
2.5 µl
（25 pmol，0.5 µM）
nirK5R プライマー
2.5 µl
（25 pmol，0.5 µM）
サンプル
0.4～0.5 ng/µl
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
（1.0 U）
サーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，下記条件にて PCR を実施した。
95℃
10min
94℃
1min
56℃
1min
72℃
1min
72℃
10min
4℃
hold
×30
200 µl マイクロチューブへ下記試薬およびサンプルを調整した。プライマーはこれまでの
検討結果から nirK-GC-Jbac とし，サンプルは上記の PCR 産物とした。
153
10×Buffer
10 µl
dNTP
10 µl
（200 µM）
nirK1F-GC-Jbac プライマー 5 µl
（50 pmol，0.5 µM）
nirK5R プライマー
5 µl
（50 pmol，0.5 µM）
サンプル
1 µl
Taq polymerase（5 U）
0.5 µl
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
（2.5 U）
nirK1F の条件と同様に PCR を実施した。2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR
増幅の有無を確認した。
結果
図 4.1.4-5 に PCR 産物の電気泳動写真を示す。ポジコン K のみ目的バンドが薄く検出さ
れた。また，ポジコン K にもエキストラバンドが見られるが，実サンプルでは約 150bp と
350bp 付近にエキストラバンドが鮮明に検出された。
マーカー
ポジコン
1500m
1000m
500m
0m
図 4.1.4-5
PCR 産物の電気泳動写真
③ DGGE 分析
文献（表 4.1.4-1
No.4）を参考に nir 検出を目的とした DGGE 分析を実施した。前項の
②の d.ではポジコン K 以外の実サンプルではうまく増幅できなかったが，参考として②の d.
で得られた PCR 産物を本項にて DGGE 分析に供した。
方法
50-60 %変性剤を含む 6 %ポリアクリルアミドゲルを作製した。なお，7 M 尿素と 40 %ホ
ルムアミドの混合溶液を 100 %変性剤とする。今回使用するゲル組成は次の通り。
154
0 %／6 %
50 %／6 %
60 %／6 %
7.5 ml
7.5 ml
7.5 ml
1 ml
1 ml
1 ml
ホルムアミド
10 ml
12 ml
尿素
10.5 g
12.6 g
α*6
α
α
50 ml
50 ml
50 ml
変性剤／アクリルアミド
40% Acrylamide/Bis (37:1)
50×TAE buffer
蒸留水
Total
泳動タンクにゲルをセット後，ヒーターを取り付け，温度を 60℃に設定，温度が安定後
50V，17h で電気泳動を実施した。電気泳動後のゲルは SYBR Green で染色後， UV 照
射・ゲル観察装置（ATTO 製）にて UV（254 nm）100%照射を行ない，ディスプレイで電
気泳動の結果を確認した。
結果
得られた DGGE 画像を図 4.1.4-6 に示す。実サンプルについては②の d.にて目的バンド
（約 500bp）の増幅が確認されなかったことから，脱窒細菌以外のバクテリアが多く検出さ
れていると思われる。一方，ポジコン K では脱窒遺伝子 nirK を持つ脱窒細菌が検出されて
いると思われ，今後の参考とする。今回の結果より nir をターゲットとした PCR におけるサ
ンプル濃度は 0.2-0.8 ng/µl，プライマー濃度は 0.5 µM が適当であると考えられたが，アニー
リング温度と時間についてはさらに詳細な検討が必要である。
155
マ ーカー
マ ーカー
0
図 4.1.4-6
500
1000
1500m
ポジコン K
nirK 検出を目的とした DGGE 分析画像
156
４．１．４－６
現場曝露実験海域の N2O 関連遺伝子を持つ微生物鉛直分布
二種類のプローブを用いて検討した評価手法を今回得られた海洋試料について適用し，各
層における N2O 関連遺伝子の有無を検討する。
① 試料
4.1.4-4 と同様，海洋調査において採水した海水を 0.2μm ポリカーボネートメンブレンフィ
ルターによりろ過した凍結試料を用いた。サンプルは下記の通りである。
・N2O
0m
2007.11.9：フィルター7 枚（うち 4 枚を分析）
・N2O
500m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
・N2O
1000m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
・N2O
1500m
2007.11.9：フィルター3 枚（うち 3 枚を分析）
② 方法
現場暴露海域の遺伝子の微生物鉛直分布を把握するために 16S-rDNA を用いた DGGE を実
施し，微生物群集構造を把握するとともに，代表的なバンドについてはシーケンスにより配
列 を 決 定 し ， ホ モ ロ ジ ー 検 索 （ 塩 基 配 列 デ ー タ ベ ー ス 検 索 サ イ ト DNA Data Bank of
Japan：http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html の BLAST）により相同性の高い菌を検索
した。検索条件は下記の通りである。
・プログラム
：blastn（DNA 配列×DNA 配列 DB）
検索対象データベース
塩基配列データベース：DDBJ 全データ
検索対象 DIVISION
：ヒト，霊長類，齧歯類，哺乳類，脊椎動物，無脊椎動物，
植物，バクテリア，ウィルス，ファージ
N2O 関連遺伝子を持つ微生物の鉛直分布の把握のためには 4.1.4-5 で検討した，nirK，
nirS のプローブを用いて PCR により現場の遺伝子の増幅を実施した。
157
③ 結果
16S-rDNA を用いて得られた DGGE 画像を図 4.1.4-7 に示す。参考のため平成 15 年度と
平成 16 年度に実施した海洋中層サンプルの DGGE 分析結果も図 4.1.4-7 に併せて報告する。
各水深のバンドパターンおよび優占種を比較すると，水深 500-1500 m は非常によく似てお
り，水深 0 m のみ異なるバンドパターンおよび優占種を示した。特徴的な 10 バンドとして下
記を切り出した。選択バンドを図 4.1.4-8 に示す。
Band①
水深 0 m の優占種
Band②
水深 500-1500 m では検出されるが，水深 0 m では検出されない
Band③
水深 500-1500 m にて強く検出
Band④
水深 500-1500 m にて強く検出
Band⑤
いずれの水深でも検出されるが水深 0 m では弱い
Band⑥
水深 500-1500 m にて強く検出
Band⑦
水深 500-1500 m では検出されるが，水深 0 m では検出されない
Band⑧
検出強度は 500＜1000＜1500 m で，水深 0 m では検出されない
Band⑨
水深 500-1500 m にて強く検出
Band⑩
水深 500-1500 m では検出されるが，水深 0 m では検出されない
切り出したバンドのシーケンス結果は添付資料 4.1.4-1 に示す。このシーケンス結果をもと
にホモロジー検索の結果，それぞれのバンドは下記の遺伝子と相同性が高かった。これらの
菌で特に脱窒活性が高いと報告がある菌はなかった。
Band①：Cyanobacteria グループの Synechococcus sp. ECS-18 の 16S rRNA 遺伝
子の一部と 98 %の相同性。
本バクテリア種は東シナ海の表層水より単離され，光合成を行なう。
Band②：Bacterium HTCC0812 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 99 %の相同性。
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
Band③：HTCC8052 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 94 %の相同性。
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
Band④：Bacterium HTCC0812 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 99 %の相同性。
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
Band⑤：Alpha proteobacteria グループの Candidatus Pelagibacter ubique の
遺伝子の一部と 95 %の相同性。
本バクテリア種は従属栄養性海洋細菌である。
Band⑥：Bacterium HTCC8041 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 100 %の相同性。
158
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
Band⑦：Actinobacteria グループの Acicimicrobidae bacterium Ellin7143 の
16S rRNA 遺伝子の一部と 94 %の相同性。
本バクテリア種は土から単離された放線菌である。
Band⑧：Gamma proteobacteria グループの Gamma proteobacterium BAL235 の 16S
rRNA 遺伝子の一部と 99 %の相同性。
本バクテリア種はバルト海水深 3 m より単離された。
Band⑨：Bacterium HTCC8041 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 94 %の相同性。
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
Band⑩：Bacterium HTCC8041 の 16S rRNA 遺伝子の一部と 100 %の相同性。
本バクテリア種は Oregon coast 水深 10 m より単離された。
159
0
平成 16 年度
500 1000 1500
0
平成 15 年度
500 1000 1500 0
マ ーカー
マ ーカー
平成 19 年度
500 1000 1500m
泳動 方 向
図 4.1.4-7
16S-rDNA を用いて得られた DGGE 画像
160
0
平成 16 年度
500 1000 1500
0
⑧
⑬
②
⑭
⑯
500 1000 1500m
⑳
④
⑫
⑱
⑪
①
500 1000 1500 0
泳動 方 向
⑮
平成 15 年度
⑲
③
⑰
マ ーカー
マ ーカー
平成 19 年度
⑤
⑥
⑨
⑩
⑦
図 4.1.4-8
シーケンス用切り出しサンプル
161
現場暴露海域の nirK 遺伝子および nirS 遺伝子の増幅産物の鉛直分布を図 4.1.4-9，4.1.410 に示す。500m～1500m のサンプルにおいて nirK 遺伝子が検出され，0m では検出されな
かった。16S-rDNA で得られた鉛直方向の微生物群集構造も 0m と 500m～1500m のサンプ
ルで大きく違っており，この群集構造の違いが nirK 遺伝子の鉛直分布の差になっている可能
性がある。nirS 遺伝子に関しては全ての水深で検出されなかった。ポジコンが明確に増幅で
きていることから，nirS は存在しないあるいは非常に少ないと考えられる。
ポジコン
1500m
1000m
500m
0m
マーカー
図 4.1.4-9
現場暴露海域の nirK 遺伝子増幅産物の鉛直分布
ポジコン
1500m
1000m
500m
0m
マーカー
図 4.1.4-10
現場暴露海域の nirS 遺伝子増幅産物の鉛直分布
162
４．１．４－７
ペラジックチャンバー動作試験試料における脱窒関連遺伝子の検出
ペラジックチャンバーの動作試験において得られたろ過試料について、ユニバーサルプ
ローブによる多様性の解析と脱窒関連遺伝子の検出を試みた。
① 試料
実験で得られた試料の一覧を表 4.1.4-2 に示す。
表 4.1.4-2
サンプル一覧
試験番号 チャンバー
C1
EX1
C2
C3
C1
EX2
C2
C3
C1
EX3
C2
C3
C1
EX3
C2
C3
ろ過量
（L)
CO2置換海水
添加後のチャ
ンバー内のpH
サンプル
フィルター
（μm）
DGGE
3
9 採水直後
添加せず
DGGE
0.22
9 採水直後
添加せず
DGGE
3
9 採水直後
添加せず
DGGE
0.22
9 採水直後
添加せず
DGGE
3
9 採水直後
添加せず
DGGE
0.22
9 採水直後
添加せず
DGGE
3
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
0.22
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
3
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
0.22
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
3
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
0.22
END
9 CO2添加後約15時間後
約6.9
DGGE
3
initial
5 採水直後
約6.9
DGGE
0.22
initial
5 採水直後
約6.9
DGGE
3
initial
5 採水直後
約7.44
DGGE
0.22
initial
5 採水直後
約7.44
DGGE
3
initial
5 採水直後
約8.01
DGGE
0.22
initial
5 採水直後
約8.01
DGGE
3
END
9 CO2添加後約72時間後
約6.9
DGGE
0.22
END
9 CO2添加後約72時間後
約6.9
DGGE
3
END
9 CO2添加後約72時間後
約7.44
DGGE
0.22
END
9 CO2添加後約72時間後
約7.44
DGGE
3
END
9 N2添加後約72時間後
約8.01
DGGE
0.22
END
9 N2添加後約72時間後
約8.01
163
サンプリング時期
② DNA 増幅反応（PCR）
②で抽出・精製した DNA 溶液を使用し，プライマーペアとして，まず，338F と 515R
（E. coli numbering）の組み合わせで 1 回目 PCR を行い，次に PCR 産物 1μL（1/50 量）
を 338F with GC clamp と 515R のプライマーペアの組み合わせで 2 回目 PCR を行ったも
のを DGGE のサンプルとした。1 回目の PCR は，Template DNA 量は 5 ng，DNA 増幅
反応を 25 サイクルとした。DNA 濃度測定は，260 nm の吸光度計測で行った。338F，
515R プライマー及び GC clamp の配列，並びに PCR サイクルを以下に示す。
・プライマー及び GC clamp の配列
358F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'
518R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
GC clamp ： 5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG3'
・PCR プログラム
プレヒート 95 ℃・9 分
サイクル反応 (95 ℃・1 分→60 ℃・1 分→伸長反応 72 ℃・1 分)×20 ｻｲｸﾙ
最終反応 72 ℃・6 分
③ DGGE 法によるユニバーサルプローブによる多様性の検討
DGGE は DCode システム（Bio-Rad 社）を用いて行った。変性剤濃度は，100 %変性剤
を 7M 尿素，40 %ホルムアミドとして，60 %（9 % アクリルアミドゲル）と 40 %（7 %ア
ク リ ル ア ミ ド ゲ ル ） とし ， 電 気 泳 動 は ， 90 V で 15 時 間 行 っ た 。 染 色 は SYBR Green
（Molecular Probes）により 30 分間行い，検出，及びデジタル化はプリントグラフ（ア
トー）により行った。
結果
ユニバーサルプローブによる DGGE 法の結果について、0.22 µm フィルターにて捕集した
バクテリアの DGGE パターンを図 4.1.4-11，3 µm フィルターにて捕集したバクテリアの
DGGE パターンを図 4.1.4-12 に示す。ペラジックチャンバー動作実験３（EX3）の初期
（initial）と曝露終了時（end）でパターンが変化することが確認された。また CO2 を添加し
た区で特にパターンの変化が大きいことが確認された。実験２（EX2）では大きな違いが無
いことから、曝露時間 15 時間では種組成への明らかな影響は生じず、72 時間程度の曝露で
影響が生じることがわかった。
164
EX2
EX3
initial
C1
C2
C3
C1
C2
マ ーカ ー
マ ーカ ー
EX1
C3
C1
C2
end
C3
C1
C2
C3
泳動 方 向
図 4.1.4-11
ユニバーサルプローブによる DGGE 法（0.22 µm フィルター）
165
EX2
EX3
initial
C1
C2
C3
C1
C2
マ ーカ ー
マ ーカ ー
EX1
C3
C1
C2
end
C3
C1
C2
C3
泳動 方 向
図 4.1.4-12
ユニバーサルプローブによる DGGE 法（3 µm フィルター）
166
④ NIR 遺伝子の検出－PCR および電気泳動
ペラジックチャンバー浅海実験で得られた微生物試料について、nir 遺伝子が検出されるか
否かを検討した。
nirS
プライマーは京都大学
吉永先生のプロトコルおよび文献（ 表 4.1.4-1
No.1） を参考に
作製した。配列は下記の通りである。
nirS1F (763-780)
：CCTA(C/T)TGGCCGCC(A/G)CA(A/G)T
nirS6R (1638-1653)
：CGTTGAACTT(A/G)CCGGT
200 µl マイクロチューブへ下記試薬および DNA 鋳型となるサンプルを入れる。
10×Buffer
5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
nirS1F プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
nirS6R プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
サンプル
3.5 µl
（35 ng）
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
（1.0 U）
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
サーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，下記条件（京大プロトコール）にて
PCR を実施した。
95℃
4min
95℃
0.5min
56℃
0.5min
72℃
1min
72℃
7min
4℃
hold
×30
2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確認した。
nirK
プライマーは京都大学
吉永先生のプロトコルおよび文献（ 表 4.1.4-1
167
No.1） を参考に
作製した。配列は下記の通りである。
nirK1F (526-542)
：GG(A/C)ATGGT(G/T)CC(C/G)TGGCA
nirK5R (1023-1040)
：GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGG
200 µl マイクロチューブへ下記試薬および DNA 鋳型となるサンプルを入れる。
10×Buffer
5 µl
dNTP
5 µl
（200 µM）
nirK1F プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
nirK5R プライマー
3.5 µl
（35 pmol）
サンプル
35 µl
（35 ng）
Taq polymerase（5 U）
0.2 µl
（1.0 U）
滅菌蒸留水
適量
Total
50 µl
サーマルサイクラー（PC802，ASTEC 製）を用い，文献 （表 4.1.4-1
No.1）の下記条
件にて PCR を実施した。
95℃
5min
95℃
30sec
45-40℃ 40sec（0.5℃/cycle）
72℃
40sec
95℃
30sec
43℃
40sec
72℃
40sec
72℃
7min
4℃
hold
×10
×20
PCR 増幅産物を 2 %アガロースゲルで電気泳動を行ない，PCR 増幅の有無を確認した。
168
結果
図 4.1.4-13 に 0.22 µm フィルターサンプル，図 4.1.4-14 に 3 µm フィルターサンプルの
nirS 遺伝子に関する PCR 産物の電気泳動写真を示す。なお，nirS 遺伝子は 900bp 付近に検
出される。ポジティブコントロールについては、nisS は検出されたが、実験試料からはいず
れのサンプルからも検出されなかった。
C1
EX1
C2
C3
C1
EX2
C2
C3
C1
initial
C2
C3
EX3
C1
end
C2
C3
ポジティブコントロール
マーカー（100bp）
1000
図 4.1.4-13
500
100bp
nirS 遺伝子を用いた PCR 産物の電気泳動写真（0.22 µm）
169
C1
EX1
C2
C3
C1
EX2
C2
C3
C1
initial
C2
C3
EX3
C1
end
C2
C3
ポジティブコントロール
マーカー（100bp）
1000
図 4.1.4-14
500
100bp
nirS 遺伝子を用いた PCR 産物の電気泳動写真（3 µm）
170
図 4.1-4-15 に 0.22 µm フィルターサンプル，図 4.1-4-16 に 3 µm フィルターサンプルの
nirK 遺伝子に関する PCR 産物の電気泳動写真を示す。0.22 µm フィルターサンプルでは，
検出強度に差はあるものの，いずれのサンプルにおいても増幅が確認された。一方，3 µm
フィルターサンプルでは，いずれのサンプルでも増幅は確認されなかった。なお，nirK 遺伝
子は 500bp 付近に検出される。
C1
EX1
C2
C3
C1
EX2
C2
C3
C1
initial
C2
C3
EX3
C1
end
C2
C3
ポジティブコントロール
マーカー（100bp）
1000
図 4.1-4-15
500
100bp
nirK 遺伝子を用いた PCR 産物の電気泳動写真（0.22 µm）
171
C1
EX1
C2
C3
C1
EX2
C2
C3
C1
initial
C2
C3
EX3
C1
end
C2
C3
ポジティブコントロール
マーカー（100bp）
1000
図 4.1-4-16
500
100bp
nirK 遺伝子を用いた PCR 産物の電気泳動写真（3 µm）
172
４．１．４－８
まとめ
中深層における現場実験において脱窒活性への影響を評価することを目的として、特異的
微生物活性の解析手法の開発を最終目標として，今年度は、脱窒活性に関する N2O 産生にか
かわる遺伝子について DGGE 法を基にした解析手法の検討と実験海域での現況把握を検討し
た結果，下記の結果を得た。
・脱窒関連遺伝子として nirK，nirS を選択し，プローブを設計，ポジティブコントロール
においてそれぞれの遺伝子が増幅できることを確認した。
・nirK，nirS をターゲットとした DGGE を実施するための GC クランプをつけたプロー
ブを設計した。そのプローブを用いて増幅を確認したところ，ポジティブコントロール
においては一定の増幅が得られたが、野外試料については増幅が認められなかった。
・現場曝露海域の遺伝子の微生物鉛直分布を把握するために 16S-rDNA を用いた DGGE
を実施し，微生物群集構造を把握した。
・N2O 関連遺伝子を持つ微生物の鉛直分布の把握のために， nirK，nirS のプローブを用
いて PCR により現場の遺伝子の増幅を実施し，500m～1500m のサンプルにおいて
nirK 遺伝子が確認された。
また、海洋生態系に対する隔離 CO2 の影響を評価する一環で、ペラジックチャンバーの動作
試験おいて得られた試料について、細菌の遺伝子の DGGE 法による多様性の検討を実施し以
下の結果を得た。
・ペラジックチャンバー浅海実験試料に対する微生物の多様性を検討し，3μm で捕捉され
る懸濁物付着型の細菌と 3μm フィルターを通過する単独浮遊型の細菌では種組成が異な
ることを確認した。
・ペラジックチャンバー浅海実験試料における脱窒関連遺伝子の検出を実施し，今回のサ
ンプルで nirK が検出されることを確認した。
４．１．４－９
今後の課題
・今回は 500m～1500m のサンプルにおいてのみ nirK 遺伝子が確認されたが、他のサンプ
ルについてもサンプル量を増やす、条件を最適化することにより，検出できる可能性が
残され、京大で実施されている他の関連酵素を含めた解析結果により判断することが必
要である。
・GC クランプをつけた状態での増幅はアニーリング温度・時間を最適化する必要がある。
・nirK 遺伝子の存在が確認できているため，今後はリアルタイム PCR など定量手法の検
討も必要である。
173
参考文献
1) 中山広樹、新版
バイオ実験イラストレイテッド第 3 巻
1996
174
本当にふえる PCR、秀潤社,
添付資料 4.1.4-1 シークエンス解析結果
Band ①
GGGGGATCCT GGCGAGCCTG ACGGAGCACG CCGCGTGAGG GATGAAGGCC TCTGGGCTGT
AAACCTCTTT TATCAAGGAA GAAGATCTGA CGGTACTTGA TGAATAAGCC ACGGCTAATT
CCGTGCCAGC AGCCGCGGTA AT
Band ②
GCGGTACTGA GGGCACCCTG ATCAGCATAC CGCGTGTGTG AAGAAGGCCT GAGGGTTGTA
AAGCACTTTC AATTGTGAAG AAAAGTTAAC GGTTAATAAC CGTTAGCCTT GACGTTAACT
TTAGAAGAAG CACCGGCTAA CTCCGTGCCA GCAGCCGCGG TAATTA
Band ③
GAAATCGGGC TATCTGGGGT ACGTCATCTC TTCCCCATAA AAGAGCTTTA CGACCCAAGG
GGCTTCTTCA CTCACGCGAC ATTGCTGCAT CAGAGTTTCC TCCATTGTGC AATATTCCCC
ACTGCTGCCT CCCGTAGGG
Band ④
GTGCGACGGC TCTCTAGTTA CGTCAGGTCA ACGGTTATTA ACCGTTAACT TTTCTTCACA
ATTGAAAGTG CTTTACAACC CTCAGGCCTT CTTCACACAC GCGGTATTGC TGGATCAGGG
TTGCCCCCAT TGTCCAATAT TCCCCACTGC TGCCTCCCGT AGGA
Band ⑤
AGGAAACGGG GCTTTTCTTT GGGGTACGTC ATCATCTTCC CCCATAAAAG AGCTTTACGA
CCCAAGGGCC TTCTTCACTC ACGCGACATT GCTGCATCAG AGTTGCCTCC ATTGTGCAAT
ATTCCCCACT GCTGCCTCCC GTAGGA
Band ⑥
GGGGGGTAGA TGGCGAGCTG ACGCAGCCAC GCCGCGTGAG GGATGAAGGC TTTCGGGTTG
TAAACCTCTT TCAGCAGGGA CGAAAATGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCTC CGGCCAACTA
CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TTATA
Band ⑦
TAGTACTGGG GGCACCCTGA TCTAGCCATG CCGCGTGAGT GATAGAAGGC CTTAGGGTCG
TAAAGCTCTT TCGCCTGTGA AGATAATGAC GGTAGCAGGT AAAGAAACCC CGGCTAACTC
CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TA
Band ⑧
GCGACGGGTC TCTGTTAGAT TACGTCAAGG CTTGAAAGTA TTAATTTCAA GCTTTTCTTC
TCTATTGAAA GTGCTTTACA ACCCTAGAGC CTTCTTCACA CACGCGGCAT TGCTGCATCA
GGCTTGCGCC CATTGTGCAA TATTCCCCAC TGCTGCCTCC CGTAGG
Band ⑨
GGGGGCTACA TGGCGAGCTG ATGCAGCGAT GTCGCGTGAG TGATGAAGGC CTTTGGGTTG
TAAACCTCTT TCCCCGGGAA GAGGATGGAT GGTCCCTTGT GAATAAGCCC CGGTTAATTC
CTGGCCACCA CCCCCGGAAT TA
Band ⑩
GGGGGTTCTG GGGAACCTGA TGCAGCGATG CCGCGTGAGT GAAGAAGGCC TTTGGGTTGT
AAAGCTCTTT CGTCGGGGAA GAAAATGACT GTACCCGAAT AAGAAGGTCC GGCTAACTTC
GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT AACT
175
添付資料 4.1.4-2 バクテリアデータ（Band①）
DQ023295|DQ023295.1 Synechococcus sp. ECS-18 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence.
Length = 822
Score = 244 bits (123), Expect = 7e-62
Identities = 129/131 (98%)
Strand = Plus / Plus
-------------------------------------------------------------------------------LOCUS
DQ023295
822 bp
DNA
linear
BCT 22-MAY-2005
DEFINITION Synechococcus sp. ECS-18 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.
ACCESSION
DQ023295
VERSION
DQ023295.1
KEYWORDS
.
SOURCE
Synechococcus sp. ECS-18
ORGANISM Synechococcus sp. ECS-18
Bacteria; Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus.
REFERENCE
1 (bases 1 to 822)
AUTHORS
Noh,J.H. and Choi,D.H.
TITLE
Synechococcus sp. ECS-18, isolated from the East China Sea
JOURNAL
Unpublished
REFERENCE
2 (bases 1 to 822)
AUTHORS
Noh,J.H. and Choi,D.H.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (02-MAY-2005) Marine Living Resources Research Division,
Korea Ocean Research and Development Institute, Ansan, PO Box 29,
Kyeonggi-Do, Ansan, Republic of Korea
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..822
/organism="Synechococcus sp. ECS-18"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="ECS-18"
/isolation_source="surface water of the East China Sea"
/db_xref="taxon:329268"
rRNA
<1..>822
/product="16S ribosomal RNA"
176
添付資料 4.1.4-3 バクテリアデータ（Band②④）
EF616595|EF616595.1 Bacterium HTCC8012 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence.
Length = 673
Score = 266 bits (134), Expect = 2e-68
Identities = 137/138 (99%)
Strand = Plus / Plus
-----------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
EF616595
673 bp
DNA
linear
BCT 10-DEC-2007
Bacterium HTCC8012 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.
EF616595
EF616595.1
.
bacterium HTCC8012
bacterium HTCC8012
Bacteria.
REFERENCE
1 (bases 1 to 673)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Improvements of high-throughput culturing yielded novel SAR11
strains and other abundant marine bacteria from the Oregon coast
and the Bermuda Atlantic Time Series study site
JOURNAL
ISME J 1 (4), 361-371 (2007)
PUBMED
18043647
REFERENCE
2 (bases 1 to 673)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (17-MAY-2007) Department of Microbiology, Oregon State
University, 220 Nash Hall, Corvallis, OR 97331, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..673
/organism="bacterium HTCC8012"
/mol_type="genomic DNA"
/isolation_source="Oregon coast station NH-5, 10 m depth"
/db_xref="taxon:466016"
rRNA
<1..>673
/product="16S ribosomal RNA"
177
添付資料 4.1.4-4 バクテリアデータ（Band③）
EF616618|EF616618.1 Bacterium HTCC8052 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence.
Length = 920
Score = 157 bits (79), Expect = 1e-35
Identities = 94/99 (94%)
Strand = Plus / Minus
-----------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
EF616618
920 bp
DNA
linear
BCT 10-DEC-2007
Bacterium HTCC8052 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.
EF616618
EF616618.1
.
bacterium HTCC8052
bacterium HTCC8052
Bacteria.
REFERENCE
1 (bases 1 to 920)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Improvements of high-throughput culturing yielded novel SAR11
strains and other abundant marine bacteria from the Oregon coast
and the Bermuda Atlantic Time Series study site
JOURNAL
ISME J 1 (4), 361-371 (2007)
PUBMED
18043647
REFERENCE
2 (bases 1 to 920)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (17-MAY-2007) Department of Microbiology, Oregon State
University, 220 Nash Hall, Corvallis, OR 97331, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..920
/organism="bacterium HTCC8052"
/mol_type="genomic DNA"
/isolation_source="Oregon coast station NH-5, 10 m depth"
/db_xref="taxon:466039"
rRNA
<1..>920
/product="16S ribosomal RNA"
178
添付資料 4.1.4-5 バクテリアデータ（Band⑤）
EU410957|EU410957.1 Candidatus Pelagibacter ubique clone fosmid
01-003783, complete sequence.
Length = 32086
Score = 159 bits (80), Expect = 3e-36
Identities = 95/100 (95%)
Strand = Plus / Plus
-----------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
JOURNAL
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
JOURNAL
EU410957
32086 bp
DNA
linear
BCT 25-FEB-2008
Candidatus Pelagibacter ubique clone fosmid 01-003783, complete
sequence.
EU410957
EU410957.1
.
Candidatus Pelagibacter ubique
Candidatus Pelagibacter ubique
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; SAR11
cluster; Candidatus Pelagibacter.
1 (bases 1 to 32086)
Gilbert,J.A., Muhling,M. and Joint,I.
Description of a SAR11 16S rDNA containing fosmid clone
highlighting a region of variable replacement within the genome
Unpublished
2 (bases 1 to 32086)
Gilbert,J.A., Muhling,M. and Joint,I.
Direct Submission
Submitted (17-JAN-2008) Plymouth Marine Laboratory, Prospect Place,
Plymouth, Devon PL1 3DH, UK
179
添付資料 4.1.4-6 バクテリアデータ（Band⑥⑨⑩）
EF616608|EF616608.1 Bacterium HTCC8041 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence.
Length = 890
Score = 252 bits (127), Expect = 3e-64
Identities = 127/127 (100%)
Strand = Plus / Plus
-----------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
EF616608
890 bp
DNA
linear
BCT 10-DEC-2007
Bacterium HTCC8041 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.
EF616608
EF616608.1
.
bacterium HTCC8041
bacterium HTCC8041
Bacteria.
REFERENCE
1 (bases 1 to 890)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Improvements of high-throughput culturing yielded novel SAR11
strains and other abundant marine bacteria from the Oregon coast
and the Bermuda Atlantic Time Series study site
JOURNAL
ISME J 1 (4), 361-371 (2007)
PUBMED
18043647
REFERENCE
2 (bases 1 to 890)
AUTHORS
Stingl,U., Tripp,H.J. and Giovannoni,S.J.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (17-MAY-2007) Department of Microbiology, Oregon State
University, 220 Nash Hall, Corvallis, OR 97331, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..890
/organism="bacterium HTCC8041"
/mol_type="genomic DNA"
/isolation_source="Oregon coast station NH-5, 10 m depth"
/db_xref="taxon:466029"
rRNA
<1..>890
/product="16S ribosomal RNA"
180
添付資料 4.1.4-7 バクテリアデータ（Band⑦）
AY673309|AY673309.1 Acidimicrobidae bacterium Ellin7143 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence.
Length = 1382
Score = 190 bits (96), Expect = 9e-46
Identities = 117/124 (94%)
Strand = Plus / Plus
------------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
AY673309
1382 bp
DNA
linear
BCT 20-MAY-2005
Acidimicrobidae bacterium Ellin7143 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence.
ACCESSION
AY673309
VERSION
AY673309.1
KEYWORDS
.
SOURCE
Acidimicrobidae bacterium Ellin7143
ORGANISM Acidimicrobidae bacterium Ellin7143
Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobidae.
REFERENCE
1 (bases 1 to 1382)
AUTHORS
Davis,K.E., Joseph,S.J. and Janssen,P.H.
TITLE
Effects of growth medium, inoculum size, and incubation time on
culturability and isolation of soil bacteria
JOURNAL
Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 826-834 (2005)
PUBMED
15691937
REFERENCE
2 (bases 1 to 1382)
AUTHORS
Davis,K.E.R., Joseph,S.J. and Janssen,P.H.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (02-JUL-2004) Department of Microbiology and Immunology,
University of Melbourne, Grattan Street, Parkville, Victoria 3010,
Australia
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..1382
/organism="Acidimicrobidae bacterium Ellin7143"
/mol_type="genomic DNA"
/isolate="Ellin7143"
/isolation_source="soil"
/db_xref="taxon:305070"
rRNA
<1..>1382
/product="16S ribosomal RNA"
181
添付資料 4.1.4-8 バクテリアデータ（Band⑧）
DQ063171|DQ063171.1 Gamma proteobacterium BAL235 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence.
Length = 448
Score = 192 bits (97), Expect = 3e-46
Identities = 100/101 (99%)
Strand = Plus / Minus
------------------------------------------------------------------------LOCUS
DEFINITION
DQ063171
448 bp
DNA
linear
BCT 11-JAN-2008
Gamma proteobacterium BAL235 16S ribosomal RNA gene, partial
sequence.
ACCESSION
DQ063171
VERSION
DQ063171.1
KEYWORDS
.
SOURCE
gamma proteobacterium BAL235
ORGANISM gamma proteobacterium BAL235
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria.
REFERENCE
1 (bases 1 to 448)
AUTHORS
Riemann,L., Leitet,C., Pommier,T., Simu,K., Holmfeldt,K.,
Larsson,U. and Hagstrom,A.
TITLE
The native bacterioplankton community in the central baltic sea is
influenced by freshwater bacterial species
JOURNAL
Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 503-515 (2008)
PUBMED
18039821
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..448
/organism="gamma proteobacterium BAL235"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="BAL235"
/isolation_source="Baltic Sea, 3m depth, Landsort deep St.
BY31, Zobell/R2A media"
/db_xref="taxon:331904"
/country="Sweden"
/lat_lon="58.6083 N 18.2392 E"
/collection_date="17-May-2004"
rRNA
<1..>448
/product="16S ribosomal RNA"
182
４．２
CO 2 影響の研究
４．２．１
模擬深海環境下における深海生物の CO 2 影響実験
４．２．１－１
はじめに
CO 2 海洋隔離に伴う生物影響を評価するためには、高圧・低水温という深海環境条件下
で深海生物を用いた実験を行なう必要がある。CO2 海洋隔離計画が想定している水深は約
2000m の中心層であることから、これらの水深帯に生息する遊泳性の深海生物を用いて実
験を行なうことが理想的である。米国の Monterey Bay Aquarium Research Institute の
研究者らは潜水艇を用いて、底生性深海魚を現場で採集して高圧チェンバーに入れたまま
実験室に持ち帰って CO 2 曝露実験を行なう試みを続けているが、その進行は遅々としてお
り、実施の困難さが大きいことが伺われる（石松、私信）。次善の策として、われわれは
水深数百メートル程度からの深海生物の入手を検討していたが、平成 18 年度に深層水取
水施設の一箇所（富山県入善海洋深層水活用施設、取水深度 386m）から底生性の深海生
物（魚類、甲殻類、頭足類）が良好な状態で入手できることを見出した。さらに平成 18
年度には、水深 2000m 相当までの水圧と水温 0-2℃で実験を行える高圧実験装置を開発し
た。平成 18 年度に深海魚の一種ザラビクニン Careproctus trachysoma を用いて、模擬深
海環境下における CO 2 曝露予備実験を行なったが、一部の対照区の個体が実験終了後尾部
に組織の壊死が見られるなど、実験条件について十分な検討を行なうに至らなかった。
高圧条件下では、供試個体から得られる情報が電気的信号として取得できる心電図・筋
電図に限られる（この点についても、平成 18 年度に予備的検討を行なった）。しかし、
これらの情報のみでは、CO 2 曝露時の生理状態の変化を把握するには不十分である。血液
は体内の生理状態を把握する情報源として適しており、適当な動脈に採血のためのカニュ
ーラを装着することによって反復採血が可能となる。高圧条件下ではこの技術は適用でき
ないが、常圧条件下の CO 2 曝露実験において生理応答を把握する有用な技術として期待さ
れる。今年度は反復採血を行なうための予備調査として、ザラビクニンの血管系の構造に
ついて、鋳型標本を作製して詳細な検討を行なう。
４．２．１－２
目的
ザラビクニンを用いた模擬深海環境下における CO 2 影響実験方法を確立するため、適正
な圧力条件を確立することを第 1 の目的とする。
上記の検討によって得られた適正な圧力条件を用いてザラビクニンの CO 2 曝露実験を
行い、平成 18 年度までに得られている常圧における CO 2 曝露実験の結果と比較し、圧力
が CO 2 耐性に及ぼす影響について検討することを第 2 の目的とする。
採血のためのカニュレーションに適当な血管を探索すること、および血管系の構造を正
183
確に把握するため、腐食鋳型標本法によってザラビクニン血管系の三次元構造を解明する
ことを第 3 の目的とする。
４．２．１－３
方法
①ザラビクニンを用いた CO 2 影響実験適正圧力条件の検討
平成 18 年度に 開発し た高圧実 験装置 （石松
2007） を用い て、供 試魚ザラ ビクニ ン
（ Careproctus trachysoma ）が健全に生存可能な水圧を調査した。実験中は毎分 1 リッタ
ーの流速で海水を循環させた。実験水温は 2℃とした。
供試魚は、富山県入善海洋深層水活用施設で水深 384m より捕獲されたザラビクニンを
用いた。入手後、実験開始までは少なくとも 5 日間飼育水槽（水温 2℃）で無給餌で飼育
した。また実験で用いた海水も富山県入善海洋深層水活用施設で水深 384m より採水され
た深層水を用いた。
実験方法は、まず供試魚 1 個体をチェンバーに入れて一晩馴致したのち、毎時 1MPa で
昇圧した。 絶対圧 10MPa まで昇圧後、一晩馴致したのち最大 144 時間まで供試魚の状態
を観察した。観察項目は生存の有無、姿勢、遊泳の有無、呼吸頻度、および組織壊死の有
無とした。ただし供試魚が死亡した時点で実験を終了した。10MPa における実験結果に基
づき、次に供試魚 2 個体を同時にチェンバーに入れて 8MPa で同様の実験を行った。この
場合 2 個体中 1 個体が死亡した時点で実験を終了した。8MPa における実験結果に基づき、
供試魚 2 個体を同時にチェンバーに入れて 7MPa で同様の実験を行った。最後に 7MPa の
結果に基づき、供試魚 1 個体をチェンバーに入れて 6MPa で同様の実験を行った。
実験後の供試魚は解剖し、性別、体重、体長、生殖腺重量を記録した。また実験中に記
録した観測項目の姿勢および遊泳の有無について点数化し、健康状態を示す指標とした。
点数は、倒立または上向きで遊泳があるとき 100 点、倒立または上向きで遊泳がないとき
50 点、横臥で遊泳があるとき 25 点、そして横臥で遊泳がない時を 0 点とした。
②水圧 6MPa におけるザラビクニンの CO 2 耐性
実験 1 より定めた適当水圧 6MPa 下において、ザラビクニンを各濃度に調整した CO 2
曝気海水に曝露し、その耐性を調査した。供試魚は、富山県入善海洋深層水活用施設で水
深 384m より捕獲されたザラビクニンを用いた。また実験で用いた海水も富山県入善海洋
深層水活用施設で水深 384m より採水された深層水を用いた。
実験方法は、まず供試魚 2 個体をチェンバーに入れて一晩馴致したのち、毎時 1MPa で
昇圧した。 絶対圧 6MPa まで昇圧後、一晩馴致したのち、各濃度に調整した CO 2 混合気
体を高圧実験装置の曝気筒に送気し、曝露を開始、最大 144 時間まで供試魚の状態を観察
した。ただし供試魚が死亡した時点で実験を終了した。CO 2 濃度は 2％及び 1％とし、対
照実験として大気による曝露を行った。今年度の実験では対照実験を 1 回（N=2）、CO 2 -2％
184
を 1 回（N=2）、および CO 2 -1％を 1 回（N=2）おこなった。また観察項目は供試魚の生
存の有無、姿勢、遊泳の有無、呼吸頻度、および組織壊死の有無とした。
また実験後の供試魚は解剖し、性別、体重、体長、生殖腺重量を記録した。
③腐食鋳型標本法によるザラビクニンの血管系の観察
腐食鋳型標本の作製は、Gonzales et al (2008)に準じて行なった。以下に簡潔に作成方
法を記す。ザラビクニンは、2-phenoxyethanol（1 ml/l）で浸漬麻酔を行なった。鰓蓋運
動の停止を確認後、鰓を同濃度の phenoxyethanol 溶液で灌流しながら、囲心腔を切開し、
心室から動脈球へポリエチレンカニューラを挿入した。その後、0.9%NaCl 溶液で血管系
を還流し、脱血を行なった。鋳型標本作成用樹脂（Mercox、大日本インキ）を硬化剤と混
合して直ちに血管内に注入した。樹脂が硬化するのを待って、濃塩酸に魚を浸漬し、組織
を全て溶かした。その後、流水で残留した組織片を取り除き、走査電子顕微鏡用資料を定
法に従って作成した。
４．２．１－４
結果
①ザラビクニンを用いた CO 2 影響実験適正圧力条件の検討
各圧力条件下によるザラビクニンの生存状況を図 4.2.1-1 に示す。10MPa では、供試魚
（１個体）は 72～96 時間の間に死亡した。8MPa では、72～96 時間の間に２個体中１個
体が死亡した。7MPa では実験終了の 144 時間まで死亡は認められなかった（N=2）。6MPa
でも死亡は認められなかった（N=1）。図 4.2.1-2 に示すように、７MPa 条件では 96 時
間以降、供試魚の姿勢制御に異常が見られた。また呼吸頻度も 7MPa 条件下では、曝露時
間の延長とともに低下した。6MPa では、実験終了の 144 時間まで観察した全ての項目（生
残状況、遊泳姿勢、呼吸頻度）に変化は認められなかった（図 4.2.1-3）。表 4.2.1-1 に実
験に使用した個体の体重・全長・生殖腺重量および性別を示す。
②水圧 6MPa におけるザラビクニンの CO 2 耐性
2%CO 2 条件下では、24～48 時間の間に 2 個体とも死亡した。1％CO 2 条件下では、72
～96 時間の間に１個体が死亡した（図 4.2.1-4）。表 4.2.1-2 に使用した個体の体重・全長・
生殖腺重量および性別を示す。対照実験（6MPa,空気曝気）では 144 時間の実験終了時ま
で供試個体に異常（遊泳姿勢・呼吸頻度）は認められなかった。
③腐食鋳型標本法によるザラビクニンの血管系の観察
ザラビクニンの頭部および胴体部前半の鋳型樹脂標本を図 4.2.1-5 に示す。ザラビクニ
ンは他のほとんどの硬骨魚類同様、4 対の鰓弓をもっていた（図 4.2.1-6）。しかし、第 1
～第 3 鰓弓までが 2 列の鰓弁をもつ全鰓（holobranch）であったのに対して、第 4 鰓弓は
185
鰓弁を 1 列しか有さない半鰓（hemibranch）であった（図 4.2.1-7）。心臓から拍出され
た血液は 4 対の鰓に腹大動脈（ventral aorta, VA）によって導かれ、鰓を通った後、出鰓
動脈(efferent branchial arteries, EBAs)によって背大動脈(dorsal aorta, DA)に送られる。
出鰓動脈の集合部直後から内臓へ血液を送る、腹腔動脈(coeliac artery,CA)が発している。
二次鰓弁は比較的大型で、柱状細胞（pillar cell）が散在する典型的な硬骨魚のパターンを
示した（図 4.2.1-8）。ザラビクニンでは、二次循環系が非常によく発達しており、出鰓動
脈を初めとして多くの箇所に特徴的は強く湾曲した小動脈が多数存在し、一次循環系（血
管系）と二次循環系の接点になっていた（図 4.2.1-9）。
図としては示していないものの、尾動脈は他の硬骨魚類と同様脊椎直下を尾部に向って
直進しており、皮膚の切開によって比較的容易に到達可能であった。
４．２．１－５
考察
①ザラビクニンを用いた CO 2 影響実験適正圧力条件の検討
平成 18 年度に行なった研究では、10MPa で曝露実験を行なった。対照個体は 72 時間
まで正常に生存した。対照個体の心拍数および呼吸頻度は実験期間中ほぼ安定していた。
曝露実験終了後、飼育水槽へ戻し、その後の生存状況を観察したところ、一時的衰弱（姿
勢制御不可）傾向が見られたものの、徐々に回復し 7 日間以上の生存が確認された。ただ
し、数日後尾部の組織が壊死し始めるのが確認された。実験個体は CO 2 曝露開始後 13 時
間までに斃死が確認された。
今年度も当初は 10MPa での CO 2 曝露実験を予定していたものの、図 4.2.1-1 に示すよ
うに、対照個体が 72～96 時間の間に死亡する事態が起こった。この理由は明らかではな
い。実験に使用したザラビクニンは水深 400m から採集されること、文献によるとザラビ
クニンの生息深度は 147～785m とされていること（波戸岡・中坊 1993）から、1000m
に相当する圧力が過大であった可能性が考えられる。また実験時期が平成 18 年度（12 月
～翌１月）と 19 年度（６月～７月）で異なったことから、成熟などによるザラビクニン
の生理状態の相違も考えられるが、明らかにすることはできなかった。
6MPa では 144 時間の実験終了まで全ての観察項目に以上は見られず、さらに尾部の壊
死も認められなかったことから、以降の CO 2 曝露実験は 6MPa 条件下で実施することが適
当であると判断した。
平成 18 年度は 72 時間の高圧曝露後、飼育水槽に戻してその後の生残状況を観察した。
しかし、実験終了時の減圧プロセスが魚の生死に影響する可能性が考えられたため、今年
度は高圧での対照実験を 144 時間までと延長し、高圧チェンバー内での生存状況をより長
期間観察することによって対照魚の状態を把握することとし、実験終了後の飼育水槽にお
ける観察は実施しなかった。
186
②水圧 6MPa 条件下と大気圧条件下でのザラビクニンの CO 2 耐性の比較
平成 18 年度までの検討によって、ザラビクニンはこれまで研究に使用してきた深海魚
の中でも比較的 CO 2 耐性が低いことが明らかになっている（表 4.2.1-3）。また昨年度の
高圧 CO 2 曝露実験では、10MPa で 2%CO 2 に曝露した１個体は 13 時間で死亡した。これ
は高圧がザラビクニンの CO 2 耐性に負の影響を及ぼした結果と考えたが、今年度はより詳
細な検討を行なうこととした。
まず昨年度の実験では心電図記録用の電極を装着したザラビクニンを実験に用いたが、
電極装着の影響を評価を含めて、より慎重に検討を進めるため、今年度は intact な個体を
用いて実験を行なった。その結果が図 4.2.1-4 であるが、6MPa の圧力条件でも CO 2 耐性
が低下すること可能性が強く示唆された（6MPa では 24～48 時間に 2 個体とも死亡した
のに対して、常圧では 48～72 時間の間に 6 個体中 1 個体が死亡）。
Pane and Barry (2007)は、深海性のカニ Chionoecetes tanneri と浅海性のカニ Cancer
magester を用いて CO 2 曝露実験を大気圧下で行い、 Ch. tanneri は Ca. magester に比べ
て酸塩基平衡調節の能力が低いこと、また低酸素条件下では Ch. tanneri の酸塩基調節能
力がさらに低下することを報告している。本研究では、海水の溶存酸素濃度は常に空気平
衡レベルの 80-90％に保たれていたが、一般に深海では水深 1000m 程度を中心に酸素極小
層が発達しており(Thurman and Trujillo 1999)、CO 2 曝露実験もその条件を考慮して行う
ことが望ましい。
③ザラビクニンの血管系
ザラビクニンの血管系は、典型的な硬骨魚の基本構造を示した。鰓は呼吸器循環と非呼
吸器循環の 2 系よりなっており、二次循環系が非常によく発達していた。二次鰓弁は比較
的大型（0.13 ± 0.06 mm 2 ）で二次鰓弁密度は 13 ± 1.8 mm -1 であった（石松ら、未発
表）。カニュレーションの部位としては、尾動脈が適当と判断した。
４．２．１－６
まとめ
①ザラビクニンを用いた高圧 CO 2 曝露実験の圧力条件として、6MPa が適当であると
判断した。
②6MPa 条件下での CO 2 曝露実験の結果から、高水圧はザラビクニンの CO 2 耐性に
負の影響を及ぼす可能性があることが強く示唆された。
③腐食鋳型標本を用いた血管系の観察によって、ザラビクニンのカニュレーション部
位としては、尾動脈が適当であると判断した。
４．２．１－７
今後の課題
①ザラビクニンについては、6MPa が適正な CO2 曝露時の圧力条件であるとしたが、
187
海洋隔離が行なわれる水深を考慮すると、より深海性の魚種を用いて、10～20MPa
の条件で実験を行なうことが望ましい。しかし、通常海洋深層水は 400m 以浅から
採取されている場合が多く、この課題をどのように克服できるかは現在のところ不
明である。韓国東海岸には水深 1000ｍから取水している施設があるとの情報があ
り、当該施設での深海生物採取の可能性について検討する必要がある。
②ザラビクニンの CO 2 耐性に対する高水圧の影響について、さらに実験例を増やす必
要が緊急の課題である。平成 20 年度には対照実験も含めて、1％と 2%CO 2 条件に
絞って、検討を重ねる。まず intact な個体を用いて実験を行なうことが肝要である。
③高水圧の効果が確定した後に、心電図・筋電図を用いた高圧下 CO 2 曝露実験、およ
び常圧下における CO 2 曝露期間中の血液性状の解析を行なう必要がある。
④魚類以外の深海生物を用いた CO 2 曝露実験を行なう必要がある。現在ザラビクニン
を入手している入善の施設では、甲殻類や頭足類も生きた状態で入手可能であり、
これらを用いた実験が考えられる。
⑤近年、海洋酸性化が浅海生物に及ぼす影響が明らかになりつつある。これまでの研
究 で 特に 炭 酸 カ ル シ ウ ム の 外骨 格 を も つ 生 物 の 初 期発 生 が 大 き な 影 響 を 受け るこ
とが明らかにされている(Kurihara et al., 2004, 2007)。魚類は一般的に無脊椎動物
よりも CO 2 耐性が高いが(Ishimatsu et al. 2008)、初期発生段階では成体よりも
CO 2 耐性が低いことが知られており(Ishimatsu et al 2005)、深海で初期発生を行な
う種（魚類・無脊椎動物）についての検討が必要である。
188
引用文献
1) Gonzales, T. T., M. Katoh and A. Ishimatsu (2008) Respiratory vasculatures of the
intertidal
air-breathing
eel
goby,
Odontamblyopus
lacepedii
(Gobiidae:
Amblyopinae). Env. Biol. Fish. DOI 10.1007/s10641-007-9295-5
2) 波戸岡清峰・中坊徹次 (1993) 日本産魚類検索、中坊徹次編、東海大学出版会、東京、
pp. 568, 586, 909.
3) 石松
惇 (2007) 平成 18 年度二酸化炭素固定化・有効利用技術等対策事業二酸化炭素
の海洋隔離に伴う環境影響評価予測技術開発成果報告書第Ⅱ編 3 章 3 編「生理実験」、
（財）地球環境産業技術研究機構。
4) Ishimatsu, A., M. Hayashi, K. S. Lee, T. Kikkawa and J. Kita (2005) Physiological
effects on fishes in a high-CO 2 world. J. Geophys. Res. – Oceans 110, C09S09,
doi:10.1029/2004JC002564.
5) Ishimatsu, A., M. Hayashi and T. Kikkawa (2008) Fishes in high-CO 2 , acidified
oceans. Mar. Ecol. Prog. Ser. (in press).
6) Kurihara, H. and Y. Shirayama (2004) Effects of increased atmospheric CO 2 on sea
urchin early development. Mar. Eco. Prog. Ser., 274, 161-169.
7) Kurihara, H., S. Kato and A. Ishimatsu (2007) Effects of increased seawater pCO 2 on
early development of the oyster, Crassostrea gigas . Aquat. Biol., 1, 91-98.
8) Pane, E. F. and J. P. Barry (2007) Extracellular acid-base regulation during
short-term hypercapnia is effective in a shallow-water crab, but ineffective in a
deep-sea crab. Mar. Eco. Prog. Ser., 334, 1-9.
9) Thurman, H. V. and A. P. Trujillo (1999) Essentials of Oceanography (6 th ed).
Prentice-Hall, New Jersey, 527 pp.
189
0%
0%
50%
100%
（時間）
図 4.2.1-1
6～10MPa 条 件 下 に お け る ザラ ビ ク ニ ン の 生 残 状況 。 供 試 個 体 数：
1(10MPa), 2(8MPa), 2(7MPa), 1(6MPa)。実験前日に高圧チェンバーに入れて馴致
を行なった後、毎時 1MPa で所定のレベルまで昇圧した。
（点数）
倒立or上向き＆遊泳あり＝100点
倒立or上向き＆遊泳なし＝50点
横臥＆遊泳あり＝25点
横臥＆遊泳なし＝0点
6MPa
7MPa
8MPa
10MPa
（時間）
図 4.2.1-2
6～10MPa 条件下におけるザラビクニンの高圧チェンバー内での姿勢・
遊泳状況の観察。
190
(BPM)
6MPa
7MPa
8MPa
10MPa
（時間）
図 4.2.1-3
6～10MPa 条件下におけるザラビクニンの呼吸頻度の経時変化。呼吸頻
度は 1 分毎の回数（BPM）で示した。
0%
大気圧
50%
0%
大気圧
75%
100%
（時間）
図 4.2.1-4
大気圧および高圧条件下でのザラビクニンの CO2 耐性の比較。大気圧
条件では 144 時間まで曝露実験を継続した。
191
VA
4cm
図 4.2.1-5
EBA
CA
DA
ザラビクニンの血管鋳型標本。CA: 腹腔動脈、DA:背大動脈、EBA:出鰓
動脈、VA:腹大動脈
I
II
III
IV
5 mm
図 4.2.1-6
ザラビクニンの鰓弓。ローマ数字はそれぞれ第 1～第 4 鰓弓を示す。
192
第3鰓弓
図 4.2.1-7
第4鰓弓
ザラビクニンの第 3 鰓弓と第 4 鰓弓の横断面（走査電顕像）。第 3 鰓弓は
一次鰓弁を 2 列もつ全鰓であるのに対し、第 4 鰓弓は 1 列しかもたない半鰓である。
図 4.2.1-8
ザラビクニンの二次鰓弁。比較的大型で、柱状細胞が散在する（二次鰓弁
の小孔と柱状細胞があった部分）。
193
図 4.2.1-9
出鰓動脈を取り囲む二次循環系連絡血管。出鰓弁動脈基部にも二次循
環系連絡血管が多数認められる。
194
表 1-1
CO 2 影響実験適正圧力条件の検討に用いたザラビクニンの体重、全長、生殖腺重量
及び性別
圧力 (MPa)
表 4.2.1-2
体重 (g)
全長 (cm)
生殖腺重量 (g)
性別
10
220
25.0
No data
♂
8
160
24.1
No data
♂
8
193
24.7
No data
♂
7
185
24.5
5.19
♂
7
185
24.8
2.55
♂
6
193
23.8
5.39
♂
水圧 6MPaCO2 耐性実験に用いたザラビクニンの体重、全長、生殖腺重量及び性別
体重 (g)
体長 (cm)
生殖腺重量 (g)
性別
Control
219
26.5
3.66
♂
Control
186
23.5
1.81
♂
2% CO 2
197
23.5
7.16
♂
2% CO 2
178
24.0
3.47
♂
1% CO 2
181
23.5
3.21
♂
1% CO 2
227
25.0
5.39
♀
実験区
195
表 4.2.1-3
ミナミコブシカジカ、ザラビクニン、ノロゲンゲおよびアゴゲンゲの CO 2
曝露時の斃死率（％）
Species
ミナミコブシ
カジカ
ザラビクニン
ノロゲンゲ
アゴゲンゲ
Temp
（℃）
2
2
2
2
%CO 2
N
3
経過時間（hr）
0
0.5
1
3
8
24
48
72
3
0
0
0
0
0
0
0
0
5
3
0
0
0
0
0
0
33
33
7
6
0
0
0
0
0
83
83
83
1
4
0
0
0
0
0
0
0
0
2
6
0
0
0
0
0
0
0
17
3
4
0
0
0
0
0
25
100
5
4
0
0
0
0
25
100
3
3
0
0
0
0
0
0
33
33
5
2
0
0
0
0
0
0
50
100
3
2
0
0
0
0
0
0
0
0
196
４．２．２
深海微生物群集に対する脱窒関連遺伝子検出技術の適用性
４．２．２－１
はじめに
海洋細菌群集に対する高濃度 CO 2 の影響を評価する場合、個々の海洋細菌（種）の挙動
を追跡するよりも、個々の細菌（種）が物質の転換（Materials conversion）に果たす影
響を推定する方がより妥当であろう。その観点から考えると、海洋中深層の細菌群集が果
たしている重要と思われる機能は、
１．有機物の無機化（従属栄養活性）
２．アンモニウムの硝化
３．脱窒
４．その他（メタン酸化、硫黄酸化・還元、鉄酸化・還元）
と考えられる。なぜならば一般的な外洋環境では、CO 2 隔離予定深度が有光層下の酸素最
小域（Oxygen Minimum Zone, OMZ）に相当するからである。この水域の従属栄養細菌
にとっての炭素源は表層から沈降する懸濁粒子として供給される有機物（Particulated
Organic Carbon, POC）か、あるいは周囲の海水中に溶存する有機物（Dissolved Organic
Carbon, DOC）と考えられ、独立栄養細菌にとってはそれらに加えて炭酸ガス及び炭酸
イオン（CO 2 , CO 3 2 - ）となる。同様に、エネルギー源としては POC と DOC に加えて、
有機物の無機化過程で一時的に供給されるであろう還元型の分子、例えば NH 4 , H 2 S ある
いは CH 4 ということになる。ただし、エネルギー供給可能な新たな分子（原子）は今後も
増える可能性があり、例えば還元型のマンガンや鉄などはある種の細菌にとっては充分な
エネルギー源となるかもしれない。
とはいえ、１）地球環境への影響の大きさ、２）これまでの海洋学的な知見、から考え
ると、海洋中深層で細菌群集が関与する最も重要な物質転換過程は「有機物の無機化（ア
ンモニア化）→硝化→脱窒」に至る窒素転換過程であろう。なぜならば、もともと貧栄養
で酸素が少ない OMZ では、表層から供給される POM から無機化されたアンモニウムイ
オンを硝化するエネルギー獲得系が有意義である他、脱窒による有機物利用も細菌の生残
のうえで有利だからである。実際、海域における窒素ガス生産、つまり脱窒が、浅海域堆
積物を除けば外洋の OMZ で行われているという考えは、（あまり実証例はないものの）
広く受け入れられている。硝化に関しても表層で充分な量の有機物生産（一次生産）が行
われた場合は、中深層で無視できない硝化が行われていることが最近示唆されつつある。
実際に CO 2 注入予定域である海洋中深層の窒素循環と周辺の環境を模式化すると図 4.2.2-1
のようになる。
さて、この水域で起こっている窒素循環過程と生態系および地球環境との関係を考える
と、負の影響ということで最も重要なのは亜酸化窒素、つまり N 2 O の生産である。N 2 O
は CO 2 と並ぶ地球温暖化ガスであり、またオゾン層破壊ガスでもある。近年、CO 2 と同様
197
に大気中で増加傾向にあり、またその生産源として海域が注目されている。N 2 O は硝化と
脱窒の両過程で中間代謝物および副産物として生成されるため、実際の海洋環境における
硝化細菌（アンモニア酸化細菌）と脱窒細菌群集に与える高濃度の CO 2 の影響を調べるこ
とが重要である。しかし、海洋のこれらの細菌群集の生理生態に関する情報はきわめて少
なく、また両活性を正確に見積もる手段は今のところ存在しない。さらに、脱窒細菌に関
しては、この活性が分類学的に多様な細菌種に分布していることから、16S rRNA 遺伝子
情報を用いてその群集生態を見積もることは困難である。硝化細菌についても近年、海水
中の古細菌（AOA, Ammonium Oxidizing Archaea）がこの活性を持っているとの報告
がなされ、海域の硝化とそれに関与する細菌（古細菌）群集の動態について再考が求めら
れている。
さて、硝化、脱窒のいずれの場合も、これらの過程に関わる高濃度の CO 2 の影響を調べ
るならば、本来ならばそれぞれの細菌を対象海域から分離し、その群集動態や種組成を調
べるべきである。しかし、外洋中深層水の多くの細菌が培養困難細菌であることを考慮す
ると、それぞれの過程の中で N 2 O 生産に関わる機能遺伝子を標的とした分子生態学的解
析（非培養法）を試みるのが良いと考えられる。その場合は、硝化（アンモニア酸化）過
程におけるヒドロキシルアミン酸化還元酵素（HAO）と脱窒過程における一連の酵素、特
に亜硝酸還元酵素（NO 2 reductase, NIR）、一酸化窒素還元酵素（NO reductase, NOR）、
および亜酸化窒素還元酵素（N 2 O reductase, NOS）が標的となる。そこで今回は、海洋
中深層海水から抽出した環境由来 DNA を鋳型としてこれら４つの遺伝子を選択的に PCR
増幅し、ライブラリー作成後、複数のクローンの塩基配列からそれぞれの遺伝子の種組成
を解析することで（クローンライブラリー法）、CO 2 隔離予定海域である海洋中深層の
N 2 O 生産に関わる細菌群集の種組成を予測することとした。
４．２．２―２
材料と方法
（１）試料の採取および DNA 抽出
微生物機能遺伝子の解析に用いた DNA 試料は、平成 19 年 11 月 7 日から 11 月 16 日
にかけて実施した「海洋現場実験想定海域の現況把握」海洋調査において採取した。北緯
38 度 00 分 00 秒、東経 145 度 00 分 10 秒の定点から CTD に併設したニスキン採水器を
用い、0m、500m、1000m、および 1500m の各層から採水した。採水した海水は各水深
層別に 47mm 0.2μm ヌルレポアフィルターを用いてろ過し、細菌を含む粒子を捕集した
後、-20℃で保存した。後日、粒子画分から DNA を常法によって抽出し、遺伝子解析に供
した。ろ過量は 20L であった。各フィルターには 2ml の NET buffer（400 mM NaCl, 20
mM EDTA, 50 mM Tris, pH8.0）を加え、終濃度が 1%および 100µg/ml となるように
10%SDS 溶液および 20mg/ml proteinase K（TAKARA）を添加した後、50℃で 1 時間
加温して溶菌した。溶菌液に等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール
198
（25:24:1）混液を加えて穏やかに 10 分間攪拌した後 4,000×g で 10 分間遠心分離した。
水層を回収し、等量のクロロホルム:イソアミルアルコール（24:1）混液を加え、穏やかに
10 分間攪拌した後 4,000×g で 10 分間遠心分離し、水層を回収した。この水層に等量の
2-プロパノールを静かに重層し、その後室温でゆっくり攪拌した後、15,000×g で 20 分間
遠心分離し 2-プロパノール層を除去した。このペレットに-冷 70%エタノールを 1ml 加え、
指でたたいてペレットを拡散させ、-20℃のまま一晩静置した。その後 15,000×g で 20 分
間遠心し、上清を捨てた後、遠心乾燥機で乾燥し、50ul の TE buffer に溶解し-30℃で保
存した。
（２）機能遺伝子の PCR 増幅
nos Z 遺伝子増幅用プライマー 2 )
Nos661F
CGCCTGGGGGCTGACCAA
Nos1527F
CGCTGTTCHTCGACAGYCA
Nos1527R
CTGRCTGTCGADGAACAG
Nos1773R
ATRTCGATCARCTGBTCGTT
Nos2230R
TTCCATGTGCAGCGCATGG
nos Z 遺伝子増幅の PCR 条件（TAKARA EX Taq polymerase を使用）
95℃
4分
｜
95℃
1分
56℃
30 秒
72℃
1分
30 サイクル）
（以上
｜
72℃
7分
但し、PCR 条件の検討に際しては、アニーリング温度やサイクルシークエンスのプログ
ラムを微調整した。
nir S 遺伝子増幅用プライマー 3 )
nirS1F
CCTAYTGGCCGCCRCART
nirS2F
TACCACCCSGARCCGCGCGT
nirS3F
TTCCTBCAYGACGGCGGC
nirS4F
TTCRTCAAGACSCAYCCGAA
199
nirS3R
GCCGCCGTCRTGVAGGAA
nirS5R
CTTGTTGWACTCGSSCTGCAC
nirS6R
CGTTGAACTTRCCGGT
nir S 遺伝子増幅の PCR 条件（TAKARA EX Taq polymerase を使用）
1 段階目
95℃
4分
｜
95℃
1分
56℃
30 秒
72℃
1分
（以上
20 サイクル）
｜
72℃
7分
増幅産物を 100 倍希釈し、2 段階目の PCR 反応の鋳型とした。
2 段階目
95℃
4分
｜
95℃
1分
56℃
30 秒
72℃
1分
（以上
30 サイクル）
｜
72℃
7分
但し、PCR 条件の検討に際しては、アニーリング温度やサイクルシークエンスのプログ
ラムを微調整した。
（３）クローンライブラリーの作成、塩基配列決定および遺伝子解析
得られた PCR 産物は 1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、予想される長さ
の PCR 産物を滅菌したナイフで切り出した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System (Promega)を用いて付属のマニュアルに従い精製した。精製した PCR 産物は
pGEM-T-Easy vector system（Promega）を用いて pGEM-T-Easy ベクターに導入
した。同ベクターを用いて E. coli INVαF’株（Invitrogen）の形質転換を行うことに
200
より、クローンライブラリーを構築した。PCR 産物のインサートを有するコロニーの選
抜は 20 mg/ml X-Gal（5-Bromo-4-Chloro-3 -Indolyl-β-D-Galactoside, タカラバイ
オ株式会社）を発色基質として用いた blue-white selection により行った。
各クローンライブラリーから、ベクター中にインサートを含む白コロニーを無作為に
30 クローン以上選び、インサートの塩基配列を決定した。シーケンシング作業はタカラ
バイオ株式会社
ドラゴンジェノミクスセンターに発注し、キャピラリー型 DNA シー
ケンサ（3730xl, Applied Biosystems）および付属のベースコーラを用いて行った。
塩基配列を決定したクローンのうち、PCR 反応に用いたプライマー配列を持たないクロ
ーンは以後の解析から除いた。また、得られた塩基配列を DDBJ の提供する BLAST プ
ログラム（NCBI-BLAST 2.2.12）に供して相同性検索を行い、対象の遺伝子データベ
ースの 配列 と明 らかに 異なる 塩基 配列 も除い た。こ の後 遺伝 子解析 ソフト の BioEdit
(Version 7. 0. 9.)および GENETYX-MAC ver.14.0（ゼネティックス）を用いて得ら
れた遺伝子塩基配列を編集し、アミノ酸配列に変換した。この際、これまでに脱窒細菌
分離株から得られたすべての nosZ および nirS のアミノ酸配列に保存されており、これ
らの酵素の活性中心の構造に重要とされる一群のアミノ酸配列を持たないクローンに
関しても以降の解析から除いた。
その他に、 nor B ( qnor B および cnor B)に関してもプライマーをデザインし、PCR 増幅を試み
たが、今のところ成功していないので省略する。
４．２．２－３
結果及び考察
今回の研究では、最終的に 0m 層、500m 層および 1500m 層から nos Z（N 2 O 還元酵素
遺伝子）の増幅に、nir S（Cytocrome C 型の NO 2 還元酵素遺伝子）は 0m 層、500m 層、
1000m 層および 1500m 層の全層から増幅産物を得ることができた（図 4.2.2-2 および図
4.2.2-3）。現在知られている nir 遺伝子のうち、 nir K（銅を含む型の NO 2 還元酵素遺伝
子）は、今回検出されなかった。一般に nir K 型 NO 2 還元酵素を持つ脱窒細菌は海域に少
ないと考えられていることから
4 ) 、今回の結果は妥当であると考えられる。ただし、今回
調製した DNA 試料がきわめて微量であり、かつ精製度においてもあまり条件が良くなか
った可能性を考えれば、この判断にはより多くの追試が必要であると考えられる。
まず nos Z について見てみると、用いたプライマーの組み合わせのうち、nosZ1557F と
nosZ1773R の組み合わせで予想される塩基長（250bp）の DNA 断片がほぼ 1 本のバン
ドとして増幅できた。ただし、1000m の試料からは増幅産物が得られなかった。後述のよ
うに nirS の断片はこの層の試料から得られていることから、単純に 1000m 層の海水には
脱窒細菌がいないとは判断できず、DNA 試料の質・量の問題が関係しているのかもしれ
ない。ほかのプライマーの組み合わせでは、いくつかの条件を検討してみても目的とする
塩基長の PCR 増幅断片は得られず、今のところ再現性良く PCR 増幅可能なプライマーは
201
この一組だけである。瀬戸内海や伊勢湾の試料についても同様の結果であることから、今
後はこのプライマーの組み合わせで解析を進めることとする。
一方、 nir S の PCR 増幅結果は、nirS1F と nirS6R を用いた時に予想される塩基長（約
900bp）の長さの DNA 断片が検出された。しかし他にいくつかの DNA 断片が存在した
ため、図 4.2-2 の a, b, c, d の 4 つの DNA 断片をそれぞれ大腸菌にクローニングし、得
られたライブラリーからそれぞれいくつかのクローンの塩基配列を決定して確認した。得
られた塩基配列を既存の nir S データベースのそれと比較したところ、 nir S と考えられた
のは、b の断片だけであった。そこで、増幅量が少なかった 0m 層の試料も含めてこの b
の増幅断片を大腸菌にクローニングしたライブラリーから、より多くのクローンを選択し
て現在塩基配列を解析中である。
0m、500m、および 1500m の各深度の海水試料から得られた DNA を鋳型として PCR
増幅した nos Z 部分塩基配列のクローンライブラリー（それぞれ 30〜40 クローン）につ
いて、既知の nos Z データベースの該当部位の塩基配列とともに系統樹を作成し、それぞ
れのクローンの系統学的位置とそれぞれのクラスターに属するクローン数を調べた。その
結果、得られた nos Z の大部分は新規な配列で、かつデータベースに登録されている nos Z
のうち海洋堆積物ないし瀬戸内海の海水から得られたクローンを含むクレードに属した。
0m 層の海水から得られた nos Z 遺伝子は大きく４つのクラスターに分かれた（図 4.2.2-4）。
最も多くのクローンを含むクラスター（0m cluster-1）には 18 クローンが含まれ、これ
は全体の 44%に相当する。この値を優占度とすると、0m cluster-2、0m cluster-3、0m
cluster-4 の優占度はそれぞれ、29%（12/41）、15%（6/41）、12%（5/41）となった。
それぞれのクラスター内では若干の多様性が見られるものの、アミノ酸配列を基にした系
統樹で比較するとそれほどの多様性は無くなることから、この塩基配列レベルの多様性は
非同義置換レベルの多様性、つまりコドンの縮重によるものと考えることができる。
つぎに 500m 層の海水試料について nos Z の多様性を調べてみると（図 4.2.2-5）、解
析したクローン全体の 69%（25/36）は、高い相同性のもとで一つのクラスター（500m
cluster-1）を構成した。0m 層の海水試料中の nos Z の多様性と比較すると、多様度は低
い と 考 え ら れ る 。 さ ら に こ の 層 の nos Z で 二 番 目 に 多 い 配 列 （ 500m cluster-2 ） は 、
Pseudomonas 属の nos Z と比較的近縁な遺伝子であった。0m 層の nos Z が、すべて非培
養法による海底堆積物由来の遺伝子クローンと比較的近縁であったことを考えると、海洋
の中層水（500m）に、 Pseudomonas 属（γ-proteobacteria）と近縁な脱窒細菌が存在
している可能性が示唆されたことは興味深い。
今回用いた海水試料のうちで最も深い 1500m 層の海水中の nos Z 遺伝子も大きく二つ
のクラスターに分かれた（図 4.2.2-6）。そのうち「1500m cluster-1」は実に 77%（24/31）
を占め、今回調べた 3 層の中でもっとも多様度が低かった。第二のクラスターである
「1500m cluster-2」は、森林や畑の土壌から得られる Bradyrhyzobium 属などと最も
202
近縁で、これまで海洋環境から得られることが少ない nos Z であった。なぜ今回この遺伝
子が 1500m の深層の海水から得られたかは興味深いが、更なる追試が必要であると考え
られる。
さて、今回は、nor B（NO 還元酵素遺伝子）についても新たなプライマーをデザインし、
PCR 増幅を試みたが、今のところ成功していない。一方で nir S に関しても非常に条件の
設定が困難であったが、複数回の PCR を行うことでライブラリーの構築に成功した。現
在、塩基配列は解析中であるが、得られた少数の遺伝子断片（900bp）を既存のデータベ
ースと比較すると（図 4.2.2-7）、0m 層から得られたクローン名 0m-nirS-04 の DNA 断
片 が 、 塩 基 配 列 と し て は 似 て い な い も の の ア ミ ノ 酸 配 列 と し て は Roseobacter
denitrificans（ α-proteobateria）と近縁な遺伝子であった（図 4.2.2-8）。それ以外は
アミノ酸レベルでも塩基配列レベルでも新規な遺伝子であると考えられる。いずれの遺伝
子も、nirS（チトクローム型 NO 2 還元酵素）の活性中心である Fe 結合部位に保存された
アミノ酸残基を持つことから、機能している遺伝子である可能性が高いが、未知の遺伝子
が海水から得られたことは興味深い。
今回の実験ではまだ脱窒関連遺伝子の中で N 2 O（亜酸化窒素）を N 2 （窒素分子）にま
で還元する、最終段階の酵素である nos Z の解析までしかできていない。しかしこの解析
だけでも、中深層の脱窒細菌群集が表層のそれと比較して多様度が低い、特徴的な脱窒細
菌種から構成されている可能性が示唆された。今回得られた nos Z を一つの系統樹にまと
めてみると、少なくとも 500m 層と 1500m 層ではそれぞれの深度で優勢な cluster-1 と
cluster-2 が 今 後 の 環 境 モ ニ タ リ ン グ の 指 標 と し て 有 望 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た （ 図
4.2.2-9）。しかし、今回は一回の調査（2007 年 11 月）で得られた一種類の海水試料に
ついてのみ解析した結果に過ぎず、これらの遺伝子が通年、この海域で優勢であるかどう
かはわからない。実験上のバイアスに関しては、それぞれの深度の海水試料について 2 つ
の nos Z クローンライブラリーを作成した上で、それぞれの遺伝子の組成を解析した場合
もその間で有意な違いが見られておらず、無視できるものと考えられる。
４．２．２－４
今後の課題
現在も本研究は進捗中であり、 nor および hao に関しては PCR 条件を検討中である。
これらの遺伝子を未だに PCR 増幅できない理由としては、今回用いた DNA 試料の質お
よび量があまり良好ではなかったことも考えられるため、2006 年度に採取した伊勢湾の
海水試料に由来する DNA を鋳型として PCR 条件の最適化を進めることとする。また、
硝化細菌の群集解析に関しては、 hao のデータベースがいまだ充分ではないため、既知の
AOA および AOB（Ammonium Oxidizing Bacteria）の 16S rDNA や amo 遺伝子（ア
ンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子）を標的とした PCR 増幅を試み、その増幅産物の種
組成解析を試みるつもりである。nir S については今のところ群集組成解析に充分な数のシ
203
ークエンスを得られていないため、さらにクローンを回収し、現在配列決定を行っている。
nos Z については、今回海洋中深層には表層とは異なる遺伝子が優占していることが明ら
かになったが、あらためて現在利用可能なデータベースを検索してみると、従来の nos Z
とは遺伝的に異なるクラスターが nos Z と定義されてデータベースに加わっている。これ
らの多くは古細菌に由来するものだが、今後この新たに加わった遺伝子も含めて増幅でき
る新規な PCR プライマーをデザインするつもりである。いずれにせよ、CO 2 隔離予定の
現場海域の遺伝子群集組成を把握し、かつ長期のモニタリングに応用するためには、安定
的な細菌粒子の捕集方法や PCR 増幅方法を含めた検出手法を開発する必要がある。幸い、
nos Z に関しては今回の研究で各水深における優占遺伝子種が特定できており、今後この
遺伝子種を第一の標的遺伝子とすることができよう。
参考文献
1) Ward, B. B. (2000) Nitrification and the marine nitrogen cycle. In D. L.
Kirchman Ed. Microbial Ecology of the Ocean.
Wiley-Liss, New York,
pp.427-453
2) Scala, D. J. and Kerkhof, L. J. (1998) Nitrous oxide reductase ( nos Z)
gene-specific PCR primers for detection of denitrifiers and three nosZ genes
from marine sediments. FEMS Microbiol Ecol. 162:61-68.
3) Braker, G., Fesefeldt, A., and Witzel, K.-P.(1998) Development of PCR primer
system for amplificatio of nitrite reductase genes ( nir S and nir K) to detect
denitrifying bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol.
64:3769-3775.
4) Braker, G., Ayala-del-Rio, H. L., Devol, A. H., Fesefeldt, A, and Tiedje, J. M.
(2001) Community structure of denitrifiers, Bacteria , and Archaea along
redox
gradients
in
Pacific
northwest
marine
sediments
by
terminal
restriction fragment length polymorphism analysis of amplified nitrite
reductase
( nir S)
and
16S
rRNA
67:1893-1901.
204
genes.
Appl.
Environ.
Microbiol.
0
NH 4 + ⇄ R-NH 2
NH 4 + → N 2 O → NO 2 - → NO 3 -
DO
100
CH 4 → CO 2
200
水
深
NO 3 - → NO 2 - → N 2 O → N 2
m
300
NO 2 -
400
NH 4 + → N 2 O → NO 2 - → NO 3 -
OMZ
500
図 4.2.2-1 ペルー沖の酸素極小層（oxygen minimum zone; OMZ）周辺の
窒素変換過程の分布モデル。
参考文献 １ ） を改変。
205
1. 100bp ladder marker
123456
2. 0 m
3. 500m
4. 1000m
a
b
c
5. 1500m
d
6. Positive control
図4.2.2- 2 nir S PC R増 幅産物 . プライ マーは n i rS 1F とn i rS 6 Rを 使用 し、
予想される増幅産物の長さは約900bp。アルファベットは塩基配列を決定した
バンド
1. 100bp ladder marker
123456
2. 0 m
3. 500m
4. 1000m
5. 1500m
a
6. Positive control
図4.2.2-3 nosZ PCR増幅産物. プライマーはnosZ1527FとnosZ1773Rを使
用し、予想される増幅産物の長さは約250bp。アルファベットは塩基配列を
決定したバンド
206
Ralstonia solanacearum
R. eutropha
Azobacter largimobile
Azo.irakense
1000
0m cluster-1
1000
658
1000
862
957
622
705
527
0m cluster-2
956
1000
993
650
680
939
957
976
587
0m cluster-3
577
998
0m cluster-4
990
635
842
724
875
595
743
997
888
647
628
676
1000
661
696
1000
578
851
1000
0.02
図4.2.2-4
Azo.lipoferum
Rhizobium meliloti
Bradyrhizobium japonicum
Azo.halopraeferens
Azo. brasilense Sp7
Achromo. xylosoxidans
Rhodobacter sphaeroides
Paracoccus denitrifcans
Achromo. cycloclastes
999
Pseudomonas sp.
P. fluorescens
801
P. stutzeri
883
P. aeruginosa
543
P. denitrificans
P. aeruginosa PAO1
596
HB7
HS9
HS7
1000
0m層海水由来の nosZ 部分塩基配列（約250bp）を含む近隣結合系統樹。
参考の塩基配列として分離細菌株の他、環境由来のクローン（uncultured）も含む。
●：海洋堆積物由来、○：瀬戸内海海水由来。
207
Ralstonia solanacearum
R. eutropha
Azobacter largimobile
Azo.irakense
1000
1000
615
529
690
1000
967
773
505
909
594
981
981
910
626
500m cluster-1
1000
634
656
895
840
749
999
818
742
852
Azo.lipoferum
601
Rhizobium meliloti
787
Azo.halopraeferens
Azo.brasilense Sp7
1000
599
Achromo.xylosoxidans
Rhodobacter sphaeroides
Paracoccus denitrifcans
Achromo. cycloclastes
Pseudomonas stutzeri
Pseu.aeruginosa
Pseudomonas .
998
580
649
1000
500m cluster-2
895
929
0.02
505
547
1000
819
P.fluorescens
P.denitrificans
P.aeruginosa
Marinobacter sp. HB7
Marinobacter sp. HS9
1000Marinobacter sp. HS7
図4.2.2-5 500m層海水由来の nosZ 部分塩基配列（約250bp）を含む近隣結合系統樹。
参考の塩基配列として分離細菌株の他、環境由来のクローン（uncultured）も含む。
●：海洋堆積物由来、○：瀬戸内海海水由来。
208
Ralstonia solanacearum
R. eutropha
Azo largimobile
Azo irakense
1000
609
1500m
cluster-1
1000
926
974
703
1000
957
930
947
1000
655
660
1000
919
563
663
680
951
577
758
985
672
842
1000
Azo. lipoferum
Azo. halopraeferens
Azo.brasilense Sp7
Achromo. xylosoxidans
Rhizobium meliloti
957
1500m
cluster-2
1000
827
607
1000
595
820
0.02
図4.2.2-6
640
790
Rhodobacter sphaeroides
Paracoccus denitrifcans
Achromo. cycloclastes
Pseudomonas sp.
P.stutzeri
P. aeruginosa
P. fluorescens
P. denitrificans
P.aeruginosa PAO1
Marinobacter sp. HB7
1000
Marinobacter sp. HS9
Marinobacter sp. HS7
665
1500m層海水由来の nosZ 部分塩基配列（約250bp）を含む近隣結合系統
樹。参考の塩基配列として分離細菌株の他、環境由来のクローン（uncultured）も含
む。●：海洋堆積物由来、○：瀬戸内海海水由来。
209
Pseudomonas stutzeri (M80653)
Pseu. Stutzeri (X53676)
Alcaligenes faecalis (AJ224913)
Unidentified bacteria denitrifying isolate (AJ224910)
Azospirillum brasilense Sp7 (AJ224912)
Pseu. aeruginosa (X16452)
Roseobacter denitrificans (AJ224911)
Paracoccus denitrificans (U75413)
Para. denitrificans (U05002)
0m-nirS-04
500m-nirS-03
1000m-nirS-01
0m-nirS-03
0m-nirS-02
0m-nirS-01
999
1000
1000
1000
527
1000
1000 1000
997
676
0.2
Nucleotides
図4.2.2-7
外洋海水由来の nir S 部分塩基配列（約900bp）を含む近隣結合系統樹。
カッコ内は参考の塩基配列のアクセッション番号。
1000
1000
1000
751
942
855
Azospirillum brasilense Sp7 (AJ224912)
0.1
Pseudomonas stutzeri (M80653)
941
1000
Pseu. Stutzeri (X53676)
Unidentified bacteria denitrifying isolate (AJ224910)
1000 Alcaligenes faecalis (AJ224913)
1000 Paracoccus denitrificans (U75413)
Para. denitrificans (U05002)
Roseobacter denitrificans (AJ224911)
1000
0m-nirS-04
Pseu. aeruginosa (X16452)
1000m-nirS-01
500m-nirS-03
0m-nirS-02
1000
0m-nirS-03
0m-nirS-01
Amino acids
図4.2.2-8 外洋海水由来の nir S 部分塩基配列（約900bp）から演繹したアミノ酸配
列をもとにして作成した近隣結合系統樹。カッコ内は参考の塩基配列のアクセッショ
ン番号。
210
Ralstonia eutropha (AY305378)
ProE (AF119923)
696F (AF119928)
B803 (AB089827)
0m cluster-1
ProH (AF119929)
ProT (AF119932)
ProO (AF119933)
ProD (AF119922)
0m cluster-3
696L|AF119927
0m cluster-4
0m cluster-2
696E (AF119949)
500m cluster-1
696I (AF119918)
B902 (AB089829)
ProV (AF119938)
ProP (AF119935)
696A (AF119954)
ProQ (AF119936)
696B (AF119952)
696Q (AF119942)
B905 (AB089831)
696C (AF119951)
1500m cluster-1
Rhizobium meliloti (U47133)
Azo. Lipoferum (AF361793)
Azo.halopraeferens (AF361794)
Achromo. Xylosoxidans (AY072227)
1500m cluster-2
Bradyrhizobium japonicum (AP005936)
Rhodobacter sphaeroides (AF125260))
Paracoccus denitrifcans (X74792)
P. stutzeri (M22628)
500m cluster-2
Pseudomonas
. (AF083948)
P. fluorescens (AF197468)
P. denitrificans (AF016059)
0.02
P. aeruginosa
Marinobacter sp. HB7 (AB088344)
Marinobacter sp. HS9 (AB088346)
Marinobacter sp. HS7 (AB088345)
図4.2.2-9 外洋海水由来の nosZ 部分塩基配列（約250bp）の系統学的位置関係のま
とめ。カッコ内は参考の塩基配列のアクセッション番号。矢印は各水深で優勢であっ
た遺伝子クラスターを示す。
211
第５章
まとめと考察
長期の生物影響評価手法として、生態系モデルの高度化を図り、表層生態系を考慮した
三次元モデルの開発を始めた。現時点では、過年度の中深層モデル開発におけるパラメー
タなどの導入等は行なっていないが、導入した三次元の基本モデルでは表層のクロロフィ
ル a 分布やこれまで観測した測点のクロロフィル a・栄養塩（PO 4 -P、NO 3 -N）の鉛直分
布は概ね再現できたと考えられる。しかし、中深層の動物プランクトン現存量が観測値よ
り大きく下回り、有機物沈降フラックスは過大評価となった。これらは中深層動物プラン
クトンのパラメータ調整をまだ実施していないことに起因するものであり、中深層生態系
モデル開発で検討したファクターの導入が必要である。
長期影響の予測手法として生態系モデルの利用は不可欠ではあるが、検証をモデル全体
として実施することは困難である。この点については、生態系モデルの個別要素を現場デ
ータや実験結果により検証すればよいと考えられる。これらの検証のひとつとして、中深
層浮遊生物群集への現場曝露実験を行なうことは社会の認知を得る上で有効であろう。
この目的のために、深海底現場曝露実験（ベンチックチャンバー）での成果をもとに、
水深 1,000-2,500m での深海現場曝露実験装置（ペラジックチャンバー）を開発すること
とした。今年度は、ペラジックチャンバーの基本構造を製作し、基本動作の確認を実施し
た。さらに、採水後陸上での曝露予備実験を通じて、検出技術の検討として、酸素消費速
度や微生物遺伝子解析技術が適用できることを確認した。また、現場実験候補海域のバッ
クグラウンド調査を実施した。
深海生態系の生物現存量と群集構造の決定には、沈降フラックスの大きさが重要である
ことがわかってきた。この影響は食物連鎖を通じて大型の生物に伝わることから、安定同
位体比による食物連鎖構造の解析を実施した。その結果、中深層のカイアシ類の安定同位
体比は表層の動物とほぼ一致し、さらに一次餌料として中深層に沈降してくる沈降物全体
が有用なのではなく、むしろ表層直下で捕捉された新鮮な沈降物が有効であることが示唆
された。
生態系モデルを用いた CO 2 の影響予測のためには、基礎方程式に含まれるパラメータへ
の影響を把握することが必要である。そこで、生物活動にとって基本的な呼吸活動に対す
る CO 2 影響実験について沿岸性あるいは冷水性カイアシ類を用いて開始した。予備実験結
果から呼吸酵素活性の亢進や ATP 産生量の増加を示唆する結果が得られ、呼吸速度あるい
は活性への CO 2 の影響を検出可能であることが示唆された。
沈降フラックスを形成する粒子には、さまざまな有機物・無機物が凝集したものが知ら
れているが、この凝集性は海水の pH により変化する可能性がある。そこで、海域から採
集したいくつかの懸濁物を用いて凝集性に対する高濃度 CO 2 環境（酸性化）の影響を検討
した。その結果、CO 2 濃度が高いと懸濁物の凝集性が抑制されることが明らかとなった。
212
こ の よ う な 凝 集 作 用 に は 粘 性 物 質 が 関 与 し て い る こ と が 提 案 さ れ て い る が 、 TEP
（Transparent Exopolymer Particles）との関係は明確にはならなかった。
ペ ラ ジ ッ ク チ ャ ン バー 実 験 に お い て 浮 遊 生物 群 集 の 主 体 と な る 微生 物 へ の 影 響 を 検出
する技術開発が重要である。過年度のベンチックチャンバー実験では、有機物の無機化と
いう機能について検討したが、CO 2 が高濃度になったとしても、その濃度に適応した細菌
群集により有機物無機化作用についてはその CO 2 濃度に適応した細菌により補償される
ことが示唆された。一方、CO 2 隔離が想定される放出水深付近には酸素極小層があり、微
生物の特異機能として脱窒機能への影響が重要な機能であると考えられる。このような特
定機能の検出には分子生物学的な手法を用いることが有効と考えられ、亜硝酸還元を担う
nir 遺伝子の検出技術開発を始めた。その結果、水深 500m 以深で nirK 遺伝子の存在を確
認した。
深海生物に対する CO 2 影響は表層生物とは異なることが魚類を用いた実験で明らかに
なっている。しかし、魚類のような大型生物について深海現場での実験は困難なことから、
低温かつ高圧を保持できる模擬深海環境下での実験を進めてきた。その結果、深海魚のザ
ラビクニンでは高圧化で高 CO 2 に対する耐性が減少することが明らかとなった。
ペラジックチャンバー実験への微生物の機能への影響として研究例がある亜硝酸還元の
nir 遺伝子に絞り検出技術の開発を行なっているが、この遺伝子は脱窒過程全体の一部で
しかない。そこで、脱窒機能を含め海洋中の窒素循環を構成する機能について広範な遺伝
子検出技術の開発を別途実施した。この結果、新たに N 2 O 還元酵素遺伝子 nosZ を検出す
ることができ、かつ 500m、1500ｍでは nosZ 遺伝子の変異は少なく深層では多様性が単
純であることがわかった。また、増幅が非常に困難で検出できなかった nirS について増幅
条件の開発に成功した。
213
第６章
今後の課題
CO 2 の 海 洋 隔 離 は 海 洋 生 態 系 の 構 造 と 機 能 を 利 用 し た 技 術 で あ る た め 、 環 境 影 響 評
価技術の開発を並行して進めることが求められる。このため、本研究開発では隔離想
定 海 域 を 設 定 し て 中 深 層 生 態 系 の 構 造 と 機 能 の 推 定 を 行 な う と と も に 、 CO 2 の 増 加 が
生物に与える影響について各種の実験を実施してきた。
過年度では短期的な影響を中心に生物影響実験が進められ、これらの結果をリスク
評価手法に基づいて海洋隔離における長期的な影響の閾値として予測無影響濃度
（ PNEC） を 推 定 し た 。 し か し 、 PNEC は 安 全 域 の 閾 値 を 示 す も の で あ り 、 長 期 的 な
生態系影響を推定する手法として、生態系モデルの開発が必要である。
今年度は生態系モデルの三次元化を進め、基本構造の構築ができたが、中深層の動
物プランクトン現存量や沈降フラックスの再現性向上が必要であり、生物の過程式や
パラメータ値について調整が課題として挙げられる。特に、中深層のパラメータの修
正や動物の鉛直移動導入の是非、死亡速度など検討が必要で、将来的には沈降フラッ
クスに寄与するデトリタスのサイズ分割化などがあげられる。
ま た 、生 態 系 モ デ ル の 予 測 に 必 要 な 各 パ ラ メ ー タ へ の 高 濃 度 CO 2 の 影 響 度 を 推 定 す
る た め に 、呼 吸 速 度 へ の 影 響 実 験 を 開 始 し た 。予 備 検 討 で 実 施 し た 酸 素 消 費 速 度 、ATP、
呼 吸 に 関 連 す る 電 子 伝 達 系 （ ETS） 活 性 の 測 定 を 組 み 合 わ せ て 、 さ ら に 影 響 デ ー タ を
蓄積することが必要である。
沈降フラックスから中深層の生物群集への物質循環の流れを把握することが生態系
モデルの検証として重要である。安定同位体比による食物連鎖構造の解析では、表層
沈降フラックスと中深層のカイアシ類についての関係が把握できた。中深層に達した
沈降物中における餌料として有効な画分を定量評価するために、今年度回収できた中
深層の沈降物の同位体比を測定して、比較検討することが必要である。また、このよ
う な 沈 降 物 を 形 成 す る 懸 濁 物 は 、高 濃 度 CO 2 に よ る 低 pH 下 で 凝 集 し に く く な る こ と
が 明 ら か と な り 、デ ト リ タ ス の 沈 降 速 度 に 対 す る 高 CO 2 濃 度 の 影 響 の 評 価 が 将 来 的 に
必 要 で あ ろ う 。 こ の た め に は 、 CO 2 濃 度 と 懸 濁 物 凝 集 性 の 関 係 や 各 種 沈 降 物 の サ イ ズ
と沈降速度に関する情報の収集が課題となる。
実海域における生物影響を検討するために深海現場実験装置（ペラジックチャンバ
ー ）を 開 発 し て い る が 、今 年 度 は 採 水 部 を 製 作 し て 動 作 確 認 を 行 い 、ま た CO 2 曝 露 予
備 実 験 を 実 施 す る こ と が で き た 。 今 後 、 CO 2 曝 露 の 自 動 制 御 を 行 な う た め の 制 御 部 製
作を引き続き行なうことが必要である。また、曝露実験中の時系列データの取得方法
や影響評価のための項目の選択と測定方法などについて、検出器の探索、解析手法の
開発が課題となる。このひとつとして、分子生物学的な手法による細菌の脱窒活性の
検出技術が有効であることが示された。ただし、多様性解析のための増幅条件など分
析条件の検討がさらに必要である。
CO 2 海 洋 隔 離 を 行 な う 中 深 層 に つ い て は 、 生 物 群 集 構 造 や 生 活 史 な ど い ま だ 基 本 的
214
な情報は不足していることが現状である。この点については、引き続き文献や研究情
報 の 入 手 に 努 め る と 共 に 、 CO 2 影 響 実 験 に よ る デ ー タ の 蓄 積 を 行 な う こ と が 求 め ら れ
る 。特 に 、現 場 で の 実 験 が 困 難 な 大 型 生 物 で あ る 深 海 魚 で CO 2 の 影 響 が 圧 力 で 変 化 す
ることが示唆されたことから、模擬深海環境下でのデータ蓄積が今後も求められる。
215
216