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JP 2013-513548 A 2013.4.22 (57)【要約】 本発明はEimeria感染から
JP 2013-513548 A 2013.4.22 (57)【要約】 本発明はＥｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するための コクシジウム症ワクチンに関し、このワクチンは、膜へ の係留のための疎水性シグナル配列につながれるか、ま たは分泌を可能にするための疎水性分泌シグナルおよび 切断部位につながれた（異種）プロモーターと、ｒ５６ 、８２ｋＤａ、および／またはＴＦＰ２５０抗原に由来 するものなどのＥｉｍｅｒｉａ抗原ＯＲＦのインフレー ム挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリア デニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとをイ ンフレームで含む組み換えトリアデノウイルスベクター を含む。 (2) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【特許請求の範囲】 【請求項１】 Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記 ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、オープ ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入する ことを可能にするための、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリ アデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモータ ーを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。 【請求項２】 目的の前記ＯＲＦは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原、Ｅｉｍｅｒ 10 ｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原、およびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの 切断型８２ｋＤａ抗原からなる群より選択される抗原をコードする、請求項１に記載のコ クシジウム症ワクチン。 【請求項３】 前記マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２ ５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原と組み合 わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコードするＯＲＦを含む、 請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。 【請求項４】 前記トリアデノウイルスゲノムは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ 20 ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１ ２のゲノムからなる群より選択される、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。 【請求項５】 前記トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである、請求項１に記載のコクシジウ ム症ワクチン。 【請求項６】 前記組み換えトリアデノウイルスベクターは、目的の前記ＯＲＦの挿入のための前記ク ローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶 性産物を生成する、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。 【請求項７】 30 前記核酸は、 ａ）配列番号１３に示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０∼１０３５の配列を含 むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない、切断型Ｒ ５６； ｂ）配列番号２のアミノ酸２４∼３４５からなる切断型Ｒ５６フラグメント、または配 列番号２のアミノ酸２４∼３４５のフラグメントをコードする、切断型ｒ５６； ｃ）配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８∼７０８３ の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードして いない、切断型ＴＦＰ２５０；および ｄ）配列番号１６のヌクレオチド６４４８∼７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ 40 ２５０ からなる群より選択される抗原をコードする、請求項２に記載のコクシジウム症ワクチ ン。 【請求項８】 Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記 ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎 水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号２のアミノ酸２４∼３４５から なる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４∼３４５のフラグメントをコードする 核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結され たプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワク 50 (3) JP 2013-513548 A 2013.4.22 チン。 【請求項９】 Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記 ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎 水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８∼ ７０８３の核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シ グナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み 換えトリアデノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン。 【請求項１０】 Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンであって、前記 10 ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎 水性シグナル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型 ８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲ ノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクター を含む、コクシジウム症ワクチン。 【請求項１１】 多価コクシジウム症ワクチン調製物であって、前記調製物は： 請求項７に記載のコクシジウム症ワクチン、 膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナ ル配列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８∼７０８３の 20 核酸配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、 トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリア デノウイルスベクターを含む、コクシジウム症ワクチン；ならびに／または 膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナ ル配列とインフレームで挿入された、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ 抗原をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作 動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、コ クシジウム症ワクチン を含む、多価コクシジウム症ワクチン調製物。 【請求項１２】 30 マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支 炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウ イルス（ＩＢＤＶ）、トリインフルエンザ（ＡＩ）、レオウイルス、トリレトロウイルス 、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、およびＥ． ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含む、請求項１１に記載の多価コクシ ジウム症ワクチン調製物。 【請求項１３】 Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅ ｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感 40 染に対して被験体を免疫化する方法であって、請求項１に記載のワクチンを前記被験体に 投与するステップを含む、方法。 【請求項１４】 前記投与するステップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤ ａ抗原を含むＦＡＶベクターによって前記被験体が免疫化されたときにみられる免疫より も増強されたレベルの免疫を誘発する、請求項１３に記載の方法。 【請求項１５】 前記被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよび ハトからなる群より選択される鳥種である、請求項１３に記載の方法。 【請求項１６】 50 (4) JP 2013-513548 A 2013.4.22 前記鳥種はニワトリである、請求項１５に記載の方法。 【請求項１７】 前記ニワトリは成体のブロイラーニワトリである、請求項１６に記載の方法。 【請求項１８】 前記投与するステップは、前記被験体に前記ワクチンを噴霧するステップ、前記被験体 に食物中の前記ワクチンを給餌するステップ、および前記被験体の飲用供給物中に前記ワ クチンを提供するステップを含む、請求項１３に記載の方法。 【請求項１９】 ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、 Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅ 10 ｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎ ｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法であって、被験体に請求 項１に記載のワクチンを投与するステップと、前記ニワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録 商標）を投与するステップとを含む、併用ワクチン接種療法。 【請求項２０】 前記ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は種畜雌鳥に投与されることによって孵化の際にヒヨ コに免疫を与え、請求項１に記載のワクチンは孵化後の１日目およびそれより後に前記ヒ ヨコに投与され、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与される、請求項１９に記載の 併用ワクチン接種療法。 【請求項２１】 20 トリアデノウイルスゲノムを含む組み換えトリアデノウイルスベクターであって、異種 プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニング部位と、ポリアデ ニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配列はマルチプルクロ ーニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目的のＯＲＦを挿入す ることによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とインフレームで前記目 的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる、組み換えトリアデノウイルスベク ター。 【請求項２２】 前記疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発現された宿主細胞から 分泌されることを可能にするための切断部位を含む、請求項２１に記載の組み換えトリア 30 デノウイルスベクター。 【請求項２３】 前記シグナル配列は切断部位を含有しないことによって、前記宿主細胞の前記細胞表面 に係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる、請求項２１に記載 の組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項２４】 膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前 記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦ の挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノ ウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイ 40 ルスベクター。 【請求項２５】 前記目的のＯＲＦの前記挿入のための前記クローニング部位のすぐ上流に切断配列をさ らに含み、前記ベクターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する、請求項２４に記 載の組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項２６】 ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする 核酸を含むシグナル配列と、 ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、 ｃ）ポリアデニル化シグナルと、 50 (5) JP 2013-513548 A 2013.4.22 ｄ）トリアデノウイルスゲノムと に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項２７】 ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする 核酸を含むシグナル配列と、 ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸 と、 ｃ）ポリアデニル化シグナルと、 ｄ）トリアデノウイルスゲノムと に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。 10 【請求項２８】 ａ）疎水性分泌シグナル配列および切断部位、または膜アンカードメインをコードする 核酸を含むシグナル配列と、 ｂ）Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と 、 ｃ）ポリアデニル化シグナルと、 ｄ）トリアデノウイルスゲノムと に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項２９】 切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号１４に示される全長ｒ５６配列のヌク 20 レオチド７０∼１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される完全なｒ５６タンパク質 配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項３０】 切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号２のアミノ酸２４∼３４５からなる切 断型Ｒ５６フラグメントまたは配列番号２のアミノ酸２４∼３４５のフラグメントをコー ドする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルス。 【請求項３１】 切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５ ０配列のヌクレオチド６４４８∼７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全な ＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２６に記載の組み換えトリアデ 30 ノウイルスベクター。 【請求項３２】 切断型ｒ５６をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１５０∼２３６１から なる切断型ｒ５６フラグメントをコードする、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウ イルスベクター。 【請求項３３】 切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５ ０配列のヌクレオチド６４４４∼７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全な ＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない、請求項２７に記載の組み換えトリアデ ノウイルスベクター。 40 【請求項３４】 切断型ＴＦＰ２５０をコードする前記核酸は、配列番号４のアミノ酸２１４９∼２３６ １からなる切断型ＴＦＰ２５０フラグメントをコードする、請求項２７に記載の組み換え トリアデノウイルスベクター。 【請求項３５】 前記分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェ ロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグナル配列からなる群より選択される 、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項３６】 前記膜アンカーシグナル配列は、トリインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列から 50 (6) JP 2013-513548 A 2013.4.22 なる群より選択される、請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクター。 【請求項３７】 請求項２６に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、ワクチン。 【請求項３８】 トリ集団における免疫応答を誘発する方法であって、前記集団に請求項３８に記載のワ クチンを投与するステップを含む、方法。 【請求項３９】 コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する方法であって、請求項２４に記載 の組み換えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記 ワクチンの投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い 10 免疫応答を誘発する、方法。 【請求項４０】 請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターを含む、単離細胞。 【請求項４１】 請求項２４に記載の組み換えトリアデノウイルスベクターおよび適切な賦形剤を含む、 薬学的処方物。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 （関連出願） 20 本出願は、２００８年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２２，５９ ６号の優先権を主張する。上記米国仮特許出願の全容は、その全体が参照によって本明細 書に援用される。 【０００２】 本発明は、トリのワクチン接種のための方法および組成物に関する。 【背景技術】 【０００３】 コクシジウム症は、世界的に非常に重要なニワトリの疾患である。それはブロイラー産 業だけでも年間１０億ＵＳＤを超える推定損失をもたらす。コクシジウム症は、７種のア ピコンプレクサの寄生原虫Ｅｉｍｅｒｉａの感染によってもたらされる。これら７種のう 30 ちでも、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａおよびＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａが最も 問題であると考えられている。コクシジウム症の症状は、気力低下、貧血、水様下痢また は血性下痢（感染する種による）、体重減少および飼料効率比の低下を含む。 【０００４】 Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫の生育および伝播は特にニワトリに蔓延している。なぜならこれ らのトリは典型的に稠密な条件下で飼育されているために、衛生管理を維持することがき わめて困難だからである。これらの条件下で抗コクシジウム薬物を使用することは、抵抗 性が発達するため、かつ窮屈な給餌環境においてこうした薬物を持続的に投与することが 困難であるために効果がない。さらに、抗コクシジウム薬は抗菌効果も有しており、餌内 に抗生物質を使用することは望ましくないとされている。 40 【０００５】 米国農務省（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ：ＵＳＤＡ）は、家禽の餌に加えられてニワトリ腸内におけるＥｉ ｍｅｒｉａ段階の細胞内発達を防ぐ抗コクシジウム薬物の使用に、米国および世界的なブ ロイラー産業が大きく頼っていることを認識している。肉製品に薬物が残留することを防 ぐやり方として、ニワトリが市場に送られる約１週間前に薬物が餌から取除かれる。抗コ クシジウム薬物はトリコクシジウム症を防ぐための主要な手段であり続けているが、ＵＳ ＤＡは、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫がこうした薬物に耐性となり得るため、代替的な制御方策 の開発が必要だと述べている。 【０００６】 50 (7) JP 2013-513548 A 2013.4.22 コクシジウム症と戦うための代替的な解決策の１つは、有効なワクチンを開発すること であろう。低用量の病原性または弱毒化Ｅｉｍｅｒｉａ種接合子嚢の混合物の投与が検討 されてきたが、それはまだ実際に有効な介入として証明されていない。ニワトリはＥｉｍ ｅｒｉａに対する免疫を発達させるため、コクシジウム症に対する「サブユニット」ワク チンを開発するためにかなりの努力が費やされている。こうしたワクチンは、遺伝子操作 技術を用いて、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のタンパク質成分を生成するだろう。このアプロー チの背後にある根拠は、バクテリアの無害な実験株を用いて、胚内（卵の中）または孵化 時のニワトリを免疫化するために用いられ得る「組み換え」タンパク質を生成できるとい うことである。もし成功すれば、ニワトリは寄生虫の表面に通常存在するタンパク質によ って免疫化されるため、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染に耐性となる。しかしながら、ＵＳ 10 ＤＡによると、今日までの努力は実を結ぶには至っておらず、トリコクシジウム症を予防 するために利用可能な商業的サブユニットワクチンは未だに存在しない。 【０００７】 ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は当該産業において何らかの承認を得ているワクチンであ り、これは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの発生のマクロガメトサイト（雌性）段階か ら単離された３つの主要なアフィニティ精製された全長ネイティブ抗原（５６ｋＤａ、８ ２ｋＤａおよび２３０ｋＤａ）を用いて、産卵する雌鳥の産卵期が始まる直前に雌鳥にワ クチン接種することに基づいている。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕ ｌｉｎａ、ｍａｘｉｍａおよびｔｅｎｅｌｌａに対する免疫を含む、ブロイラーに感染す るコクシジウム種に対する交差免疫を誘発する。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は産卵時点 20 前の若雌鳥を免疫化するために用いられる。免疫種畜は卵黄を通じて特定の抗体をブロイ ラーに移し、孵化後の生育初期にそれらを遮蔽し、一方では農場で自然にコクシジウムに 晒される。この露出によって母性保護の際に免疫がもたらされ、それがブロイラーのライ フサイクルの初期段階でブロイラーに移される。保護的な移行抗体が卵黄を介して子供の ヒヨコに移され、ヒヨコは高力価の移行抗体を有して孵化する。これらの移行抗体は、ヒ ヨコの生育期間の最初の２∼３週間にわたり、接合子嚢脱落を低減させるように作用する 。これは次に、ピーク同腹仔接合子嚢カウント（ｐｅａｋ ｌｉｔｔｅｒ ｏｏｃｙｓｔ ｃｏｕｎｔｓ）を６０∼８０％低下させ、これは通常は３∼５週齢で起こる。 【０００８】 しかしながら、このワクチンは母子免疫をブロイラーに移すことができるものであり、 30 餌に抗コクシジウム薬を入れることなくブロイラーを飼育できるという事実にもかかわら ず、その免疫は、ブロイラーのライフサイクルの初期段階で母鳥からブロイラーに移され るという点において間接的な免疫である。ブロイラーがその免疫を保持することを確かめ るための仕組みはなく、孵化後のブロイラーまたはヒヨコに直接投与できるワクチンは現 在入手不可能である。このことから、母鳥から免疫を適切に受取らなかったブロイラー、 または免疫を失って追加免疫を必要とするより高齢のブロイラーの間でコクシジウム症が 広がる可能性が残っている。実際に、ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）の製造者は、ＣｏｘＡ ｂｉｃは種畜にワクチン接種するために用いられるものであって、その種畜のブロイラー ヒヨコのみを保護することを示している。ＥＬＩＳＡ法によって定めるとき、母子免疫は 約１４日間またはもう少し長く持続する。それらのトリがライフサイクルのもっと後の年 40 齢でさまざまな種のＥｉｍｅｒｉａに晒されれば、もはや母子免疫は存在しないため、よ り高齢のトリは保護されないままとなる。 【０００９】 ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）ワクチンには、それが種畜ニワトリへの注射によって投与 されるというさらなる欠点もある。ＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）のためのワクチン接種ス ケジュールにおいては、若雌鳥は飼育の間に２回のワクチン注射を受ける必要があり、そ の２回の注射の間を少なくとも４週間あける必要がある。第１の注射は１２週齢から１５ 週齢で行なわれてもよい；第２の注射は１８週齢から２１週齢で行なわれてもよい。よっ てこのワクチンの投与モードは、大集団のブロイラーニワトリへの直接投与に容易に適応 できない。 50 (8) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【００１０】 上述のとおり、ブロイラーニワトリの処置のためのワクチンを得ることには主要な商業 的誘因がある。ニワトリに注射する必要のあるワクチンは、大集団のニワトリへの投与に 対して実用的ではない。したがって、コクシジウム症の有害な影響に対する保護をもたら すためにブロイラーニワトリに容易に投与され得るワクチンが要求されている。 【発明の概要】 【課題を解決するための手段】 【００１１】 特定の局面において、本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシ ジウム症ワクチンを提供することによって、コクシジウム症ワクチンに対する要求に対処 10 するものであって、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性 シグナル配列と、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍ ｅ：ＯＲＦ）を前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするため の、ＯＲＦを挿入するためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと 、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリ アデノウイルスベクターを含む。 【００１２】 特定の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５ ６抗原をコードする。他の実施形態において、目的のＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉ ｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原をコードする。さらに付加的な実施形態において、目的の 20 ＯＲＦはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする。特定の他 の例示的な実施形態において、マルチプルクローニング部位は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘ ｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０抗原および／またはＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型 ８２ｋＤａ抗原と組み合わせた、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６抗原をコ ードするＯＲＦを含む。 【００１３】 コクシジウム症ワクチンは、あらゆるトリウイルスから調製されてもよい。好ましくは 、コクシジウム症ワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡＶ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、Ｆ ＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡＶ１０、ＦＡＶ１１およびＦＡＶ１２のゲ ノムからなる群より選択されるトリアデノウイルスゲノムを用いる。特定の実施形態にお 30 いて、トリアデノウイルスゲノムはＦＡＶ８ゲノムである。 【００１４】 組み換え組み換えトリアデノウイルスベクターはさらに、目的のＯＲＦの挿入のための クローニング部位のすぐ上流に切断配列を含んでもよく、前記ベクターからの発現産物は 可溶性産物を生成する。 【００１５】 例示的な実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に示され る全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０∼１０３５の配列を含むが、配列番号２に示される 完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。残基７０∼１０３５によってコードさ れるヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。配列番号１４には全長のＥｉｍｅｒｉａ 40 ｍａｘｉｍａ Ｒ５６をコードする配列も示されており、この配列は配列番号１の配列内 に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基１０３∼１０６に示されている。さらに 他の実施形態において、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４∼ ３４５からなる切断型ｒ５６フラグメント、または配列番号２のアミノ酸２４∼３４５の フラグメントをコードする。特定の代替的な実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコ ードする核酸は、配列番号１６に示される全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８ ∼７０８３の配列を含むが、配列番号４に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列は コードしていない。より特定的には、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号 １６のヌクレオチド６４４８∼７０８３の核酸配列からなる。残基６４４８∼７０８３に よってコードされるヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。配列番号１６には全長のＥ 50 (9) JP 2013-513548 A 2013.4.22 ｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ ＴＦＰ２５０をコードする配列も示されており、この配列 は配列番号３の配列内に含まれており、ここではａｔｇ開始部位が残基２３１∼２３３に 示されている。 【００１６】 Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチンの組成物および 使用方法も意図されており、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を含 む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入された、配列番 号２のアミノ酸２４∼３４５からなる切断型ｒ５６または配列番号２のアミノ酸２４∼３ ４５のフラグメントをコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイル スゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベク 10 ターを含む。 【００１７】 別の実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワクチ ンの調製および使用を教示し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードする核酸を 含む疎水性シグナル配列に作動可能に連結されたプロモーターと、前記疎水性シグナル配 列とインフレームで挿入された、配列番号１６のヌクレオチド６４４８∼７０８３の核酸 配列からなる切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリ アデノウイルスゲノムとを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。 【００１８】 さらなる実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染から家禽を保護するためのコクシジウム症ワ 20 クチンの組成物および使用方法に関し、前記ワクチンは、膜アンカードメインをコードす る核酸を含む疎水性シグナル配列と、前記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入され た、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａ抗原をコードする核酸と、ポリア デニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーター を含む組み換えトリアデノウイルスベクターを含む。 【００１９】 本発明は、上記コクシジウム症ワクチン組成物の組み合わせを含む多価コクシジウム症 ワクチン調製物も意図している。 【００２０】 加えて、多価コクシジウム症ワクチン調製物は、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ 30 Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔ ｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（Ｃｈ ｉｃｋｅｎ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイル ス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：ＩＢＤＶ）、 トリインフルエンザ（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＡＩ）、レオウイルス、トリレ トロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種 、およびＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される免疫原をさらに含んでもよい。 【００２１】 本発明の例示的な方法は、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘ 40 ｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、 Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉによる感染に対して被験体を免疫化することに関し、この方法は、本発 明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態において、投与するス テップは、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むＦＡ Ｖベクターによって前記被験体を免疫化したときにみられる免疫よりも増強されたレベル の免疫を誘発する。 【００２２】 好ましくは、この方法はニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズ ラおよびハトからなる群より選択される鳥種の処置のために使用される。好ましくは、そ 50 (10) JP 2013-513548 A 2013.4.22 の鳥種はニワトリである。特定の実施形態において、ニワトリは成体のブロイラーニワト リである。 【００２３】 投与は、たとえば前記被験体への前記ワクチンの噴霧、食物中の前記ワクチンの前記被 験体への給餌、および前記被験体の飲用供給物中への前記ワクチンの提供などを含むあら ゆる従来の投与経路によるものであってもよい。 【００２４】 本発明の別の方法は、ニワトリ集団に、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒ ｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃ ａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉ 10 ｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉに対する防御免疫を与えるための併用ワクチン接種療法を 含み、この方法は、被験体に本発明のいずれかのワクチンを投与するステップと、前記ニ ワトリ集団にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与するステップとを含む。 【００２５】 この併用療法は、種畜雌鳥にＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）を投与して孵化の際にヒヨコ に免疫を与え、本発明の前記ワクチンを孵化後のｄａｙ１およびそれより後にヒヨコに投 与し、かつ前記集団の成体ブロイラー雌鳥に投与するというものである。 【００２６】 本発明の他の局面は、トリアデノウイルスゲノムを含むトリアデノウイルスベクターを 記載し、これは異種プロモーターと、異種疎水性シグナル配列と、マルチプルクローニン 20 グ部位と、ポリアデニル化配列とを含み、前記プロモーターおよび前記疎水性シグナル配 列はマルチプルクローニング部位の上流に位置し、前記マルチプルクローニング部位に目 的のＯＲＦを挿入することによって、前記プロモーターの調節下で前記シグナル配列とイ ンフレームで前記目的のＯＲＦを発現できる発現ベクターがもたらされる。 【００２７】 特定の実施形態において、疎水性シグナル配列は、前記目的のＯＲＦの発現産物が、発 現された宿主細胞から分泌されることを可能にするための切断部位を含む。他の実施形態 においては、シグナル配列が切断部位を含有しないことによって、宿主細胞の細胞表面に 係留された前記目的のＯＲＦの融合発現産物の発現がもたらされる。 【００２８】 30 膜アンカードメインをコードする核酸を含む疎水性シグナル配列と、目的のＯＲＦを前 記疎水性シグナル配列とインフレームで挿入することを可能にするための、目的のＯＲＦ の挿入のためのマルチプルクローニング部位と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノ ウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイル スベクターも意図される。いくつかの実施形態において、ベクターは、目的のＯＲＦの挿 入のためのクローニング部位のすぐ上流に切断配列をさらに含んでいてもよく、前記ベク ターからの発現産物は可溶性ＯＲＦ産物を生成する。 【００２９】 疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲ 40 ノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクター も開示される。 【００３０】 別の実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘ ｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと 、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリ アデノウイルスベクターに関する。 【００３１】 さらなる実施形態は、疎水性分泌シグナル配列および切断部位と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍ ａｘｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナル 50 (11) JP 2013-513548 A 2013.4.22 と、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えト リアデノウイルスベクターに関する。 【００３２】 さらなる実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅ ｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ｒ５６タンパク質をコードする核酸と、ポリアデニ ル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含 む組み換えトリアデノウイルスベクターに関する。 【００３３】 さらに付加的な実施形態は、膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列 と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの切断型ＴＦＰ２５０タンパク質をコードする核酸と 10 、ポリアデニル化シグナルと、トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロ モーターを含む組み換えトリアデノウイルスベクターを記載する。 【００３４】 膜アンカードメインをコードする核酸を含むシグナル配列と、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘ ｉｍａの切断型８２ｋＤａタンパク質をコードする核酸と、ポリアデニル化シグナルと、 トリアデノウイルスゲノムとに作動可能に連結されたプロモーターを含む組み換えトリア デノウイルスベクターも意図される。 【００３５】 上記に概説したワクチンにおいて、切断型ｒ５６をコードする核酸は、配列番号１４に 示される全長ｒ５６配列のヌクレオチド７０∼１０３５の配列を含むが、配列番号２に示 20 される完全なｒ５６タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切断型ｒ５６ をコードする核酸は、配列番号１４のヌクレオチド７０∼１０３５の核酸配列、または配 列番号１４のヌクレオチド７０∼１０３５のフラグメントからなる。たとえば、切断型ｒ ５６をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸２４∼３４５または配列番号２のアミノ 酸２４∼３４５のフラグメントからなる切断型ｒ５６フラグメントをコードする。 【００３６】 他の実施形態において、切断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号３に示され る全長ＴＦＰ２５０配列のヌクレオチド６４４８∼７０８３の配列を含むが、配列番号４ に示される完全なＴＦＰ２５０タンパク質配列はコードしていない。より特定的には、切 断型ＴＦＰ２５０をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド６４４８∼７０８３ 30 の核酸配列からなる。 【００３７】 分泌を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる分泌シグナル配列を 含んでもよい。特定の実施形態において、分泌シグナル配列は、ニワトリガンマインター フェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエンザＨ１Ｎ２の分泌シグ ナル配列からなる群より選択される。 【００３８】 アンカー産物を生成する組み換えトリアデノウイルスベクターは、あらゆる膜アンカー シグナル配列を含んでもよい。特定の実施形態において、膜アンカーシグナル配列は、ト リインフルエンザＨＡ抗原の分泌シグナル配列からなる群より選択される。 40 【００３９】 記載されるいずれの発現ベクターも、本明細書に記載される方法における使用のために ワクチンに容易に配合され得る。 【００４０】 例示的な方法は、トリ集団における免疫応答を誘発する方法を含み、この方法は前記集 団にこうしたワクチンを投与するステップを含む。 【００４１】 コクシジウム症に対して家禽集団にワクチン接種する好ましい方法は、本発明の組み換 えトリアデノウイルスベクターを含むワクチンを投与するステップを含み、前記ワクチン の投与は、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０を含むワクチンの投与よりも高い免疫応答 50 (12) JP 2013-513548 A 2013.4.22 を誘発する。 【００４２】 本明細書に記載される組み換えトリアデノウイルスベクターを含む単離細胞も意図され る。 【００４３】 組み換えトリアデノウイルスベクターのいずれかを適切な賦形剤と有利に組み合わせて 、動物、特にトリの処置のための薬学的処方物を生成してもよい。 【図面の簡単な説明】 【００４４】 【図１】図１は、本発明のＦＡＶに基づくベクターの概略を示す図である。 10 【図２】図２は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのｒ５６タンパク質を 含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。 【図３】図３は、ネイティブ、膜アンカーまたは分泌形のいずれかのＴＦＰ２５０タンパ ク質を含むさまざまなＦＡＶ構築物のウエスタンブロット分析を示す図である。 【図４Ａ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（ １９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である 。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または 予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５∼ １２４である。 【図４Ｂ】図４は、Ｈｅｉｊｎｅ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３，１７−２１（ 20 １９８３）の図１より転載した、真核生物のシグナル配列のコレクションを示す図である 。これらの配列は、アスタリスク（＊）によって示されるそれらの公知の切断部位または 予想される切断部位に基づいて整列されている。ここに示される配列は、配列番号３５∼ １２４である。 【図５】図５は、発現カセットの化学合成のためのスキームを示す図である。 【図６】図６は、構築物を調製するためのＰＣＲ増幅のためのスキームを示す図である。 【図７】図７は、配列の挿入のためのマルチプルクローニング部位の使用のためのスキー ムを示す図である。 【図８】図８は、以前に添付物にて「ｐ１２３２＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマイン ターフェロンの分泌シグナルを有するＣＭＶＰ−ＴＦＰ２５０−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ 30 ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号１７として本明細書に示 される。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号１８によってコードされており 、これは配列番号１７のヌクレオチド５６２９．．５７１２に位置し、配列番号１９のタ ンパク質に翻訳される。切断型ＴＦＰ２５０挿入物は配列番号２０の配列によってコード されており、これは配列番号１７のヌクレオチド５７１３から６３４８に位置し、配列番 号２１の配列に翻訳される。このプラスミドは、位置４９６５．．．５６２３にＣＭＶプ ロモーター配列を有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８ 年１２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号 の添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援 用する。 40 【図９】図９は、以前に添付物にて「ｐ１２２３＿ｅｎｔｉｒｅ」と示した、ガンマイン ターフェロンの分泌シグナルを有するＭＬＰ−Ｒ５６−ｐＡ−ｐＡ／１０５４（ＦＡＶ ＲＨＥ）のプラスミド構造を示す図である。全配列は配列番号２２として本明細書に示さ れる。その配列において、分泌シグナル配列は配列番号２３によってコードされており、 これは配列番号２２のヌクレオチド５３８１．．５４６１に位置し、配列番号６のタンパ ク質に翻訳される。切断型Ｒ５６挿入物は配列番号２４の配列によってコードされており 、これは配列番号２２のヌクレオチド５４６２から６４３０に位置し、配列番号２５の配 列に翻訳される。このプラスミドは、ヌクレオチド５３８１...５４６１にＭＬＰ配列を 有する。この図面に示される情報および関連する配列情報は、２００８年１２月１５日に 提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前 50 (13) JP 2013-513548 A 2013.4.22 提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。 【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図であ る。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖） および配列番号２８（タンパク質配列）である。 【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図であ る。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖） および配列番号２８（タンパク質配列）である。 【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｅ．ｍａｘｉｍａの８２ｋＤａタンパク質の配列を示す図であ る。この図面に示される配列は、配列番号２６（上側の鎖）；配列番号２７（下側の鎖） および配列番号２８（タンパク質配列）である。 10 【図１１】図１１は、Ｅ．ｍａｘｉｍａのＲ５６配列（配列番号２）およびＥ．ｔｅｎｅ ｌｌａのＲ５６配列（配列番号２９）の比較を示す図である。シグナル配列を欠いた切断 型Ｒ５６の配列（配列番号３０）も示される。この図面の下側部分は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌ ａの切断型Ｒ５６（配列番号３１）とＥ．ｍａｘｉｍａの切断型Ｒ５６（配列番号３２） との配列比較を示す。この配列情報図は、２００８年１２月１５日に提出された優先権出 願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の添付物にて以前提供したものである （本明細書においてその全体にわたり引用により援用する。 【図１２】図１２は、Ｅ．ｍａｘｉｍａ（配列番号３３）およびＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（配 列番号３４）の短縮バージョンのＲ５６を示す図である。この配列情報図は、２００８年 １２月１５日に提出された優先権出願である米国仮特許出願第６１／１２２，５９６号の 20 添付物にて以前提供したものである（本明細書においてその全体にわたり引用により援用 する。 【発明を実施するための形態】 【００４５】 本発明は、ブロイラーニワトリの集団に、コクシジウム症に対するこうしたトリの防御 免疫のために投与できる組み換えウイルスワクチン組成物の調製方法および使用に関する 。このワクチンは孵化後のトリに投与でき、注射による投与は必要なく、代わりに経口、 食物供給、飲用供給物を通じて、またはエアロゾルスプレーとして投与されてもよい。本 発明のワクチン構築物の利点は、免疫原を内部発現させるのではなく、免疫原の発現が感 染細胞の細胞外部位に送達されるように指示することである。本明細書に記載されるワク 30 チンの場合、こうして免疫原が粘膜細胞（例、鼻腔、気道、胃腸管、腸粘膜などにおける 粘膜細胞）の外表面に送達されることによって、細胞内での送達免疫原の発現では免疫原 が適切な免疫応答機構に効率的に接触しないおそれがあるのに対し、免疫応答が迅速に開 始され得る部位に免疫原を提示する。 【００４６】 既存のワクチンは、いくつかの理由から有効なコクシジウム症ワクチンに対する当該技 術分野の長年にわたる要求を満たしていない。第１に、コクシジウム症を処置するために 現在利用可能なワクチンであるＣｏｘＡｂｉｃ（登録商標）は、母鳥にしか免疫を与えず 、その免疫が卵黄を通じてブロイラー集団に移ることに頼っている。母子免疫は、卵の孵 化後最初の約１４日間という比較的短期間しか持続しない。よって、これはブロイラーニ 40 ワトリにおいて特定的に長期の応答を誘発するために有効なワクチンではない。さらに、 このワクチンは注射を介して投与される。このことからも、このワクチンは高齢のトリの 大集団を処置するために有効でないものとなる。 【００４７】 コクシジウム症に対する既存の処置の問題点に対処するため、本発明者らはブロイラー に防御免疫を与えるための新たなワクチンを開発した。このワクチンは、サブユニットワ クチンにおけるＥｉｍｅｒｉａ抗原の発現をもたらすトリアデノウイルス発現系に基づく ものである。この抗原は疎水性シグナル配列とインフレームで発現され、ワクチンが投与 されたニワトリにおけるウイルス感染細胞の細胞表面に提示されるか、または代替的に、 発現ベクター中の疎水性シグナル配列が切断シグナルをも含む場合には、こうした感染ニ 50 (14) JP 2013-513548 A 2013.4.22 ワトリにおける細胞外ドメインに分泌される。これらの特徴、ならびに組み換えトリアデ ノウイルスコクシジウム症ワクチンを用いるための方法および組成を、本明細書の下記に おいてさらに詳しく説明する。 【００４８】 一般的に、本発明のワクチンは、トリアデノウイルスゲノムでできた、図１に示される とおりに構築された発現ベクターで構成される。トリまたは家禽アデノウイルス（ｆｏｗ ｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＦＡＶ）は当業者に周知であり、広範囲にわたって特徴付け られている。たとえば、家禽アデノウイルスタイプ１株ＣＥＬＯ（ヒヨコ胚致死孤児（ｃ ｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｌｅｔｈａｌ ｏｒｐｈａｎ）に対するもの）と呼ばれるトリ アデノウイルスが記載されている（Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２ 10 ９３９−４９（１９９６）；Ｌｉ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５（Ｐｔ １０ ）：１８１７−２５（１９８４）；Ｍａｙ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：４８ ３−９（１９７５）；Ｌｅｈｒｍａｎｎ，Ｈ．，Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：６５１７−２５（１９９９）；Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１： ３１６８−７７（１９９７））。遺伝子療法、ならびにヒトおよび動物、特にトリにおけ る感染性疾患に対するワクチンでの使用のために、ベクターを形成するためのＣＥＬＯの 使用および操作方法は、たとえば米国特許第６，３３５，０１６号などにも広範囲に記載 されている。ＣＥＬＯ（ＦＡＶ１またはＦＡＶ Ａ）の完全なゲノム配列は、Ｇｅｎｂａ ｎｋ受入番号Ｕ４６９３３；ＮＣ＿００１７２０およびＡＣ＿００００１４に見出される であろう。 20 【００４９】 特定の実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物において用いられる 家禽アデノウイルスベクターは、たとえば米国特許出願第０８／４４８，６１７号および 第０９／２７２，０３２号に記載されるものなどの家禽アデノウイルスベクター（ＦＡＶ ）であり、本明細書においてその内容は引用により援用される。特に好ましい実施形態に おいて、このベクターはＦＡＶ血清型８（以後「ＦＡＶ８」）の右側端部を含む。ＦＡＶ ８の全ヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号５として示される。ＦＡＶ８発現 ベクターの全ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１５５９１１にも含まれ ている。ＦＡＶ８の単離および生成のための方法は、米国特許第６，２９６，８５２号（ 本明細書においてその全体にわたり引用により援用する）に記載されている。 30 【００５０】 ＦＡＶ９（ＦＡＶ Ｄとも呼ばれる）はＣａｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９（Ｐ ｔ １０），２５０７−２５１６（１９９８）に記載されており、その完全なゲノムはＧ ｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８３９７５およびＮＣ＿０００８９９に示されている。 【００５１】 ＦＡＶの配列の教示が当業者に公知であるため、本発明のワクチンは、ＦＡＶ１、ＦＡ Ｖ２、ＦＡＶ３、ＦＡＶ４、ＦＡＶ５、ＦＡＶ６、ＦＡＶ７、ＦＡＶ８、ＦＡＶ９、ＦＡ Ｖ１０、ＦＡＶ１１、ＦＡＶ１２またはあらゆる後に単離される血清型の家禽アデノウイ ルスを用いて容易に調製され得る（ウイルスの分類についてはＭｏｎｒｅａｌ，Ｇ．Ａｄ ｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ 40 ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｖ．４，ｐ．１−２７（ １９９２）を参照）。米国特許第６，２９６，８５２号に記載されるとおり、ＦＡＶ Ｃ ＦＡ２０（ＦＡＶ血清型１０である）、ＣＦＡ１５（血清型１０）ならびにＣＦＡ４０お よびＣＦＡ４４（両方とも血清型８）ならびにＦＡＶ ＣＦＡ１５およびＣＦＡ１９（血 清型９）は、ワクチン生成のために特に有用であり得る。 【００５２】 本明細書で調製されるワクチンにおいて使用されるプロモーターは、ＦＡＶ構築物中の 目的の異種コード領域の発現を駆動できるあらゆるプロモーターであってもよい。こうし たプロモーターは、トリアデノウイルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ＭＬＰ）、ＣＭＶｐ、ＰＧＫ−、Ｅ１−、ＳＶ４０初期プロモーター 50 (15) JP 2013-513548 A 2013.4.22 （ＳＶＧ２）、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ−４０最初期プロモーター、Ｔ４後期プ ロモーター、およびＨＳＶ−Ｉ ＴＫ（ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｈ ｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝子プ ロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）） ＬＴＲ（長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ））およびＰＧＫ（ホ スホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ））遺伝 子プロモーターを含むがそれに限定されない。ＦＡＶ ＭＬＰのＤＮＡ配列は、米国特許 第６，２９６，８５２号の図５に示されている。多くの他の哺乳動物またはトリのプロモ ーターが当業者に公知であり、それらが用いられてもよい。 【００５３】 10 本明細書に記載されるワクチンに使用されるプロモーターは、目的のオープンリーディ ングフレームまたはコード領域の核酸配列とインフレームでつながれた疎水性シグナル配 列のインフレーム融合物の発現を駆動する。疎水性シグナル配列は、家禽アデノウイルス 発現ベクターに感染した宿主細胞の外膜を標的として、または特定的にそこに向けて目的 のペン（ｐｅｎ）リーディングフレームまたはコード領域の発現を行なわせるために用い られ得るあらゆる配列であってもよい。本発明において、このＦＡＶに基づく発現ベクタ ーはニワトリに感染させることが意図される。ＦＡＶは典型的に、たとえばニワトリの腸 管、気道または胃腸管などに見出され得る、ニワトリの粘膜細胞、肝細胞および上皮細胞 に感染する。よって疎水性シグナル配列は、目的のオープンリーディングフレームまたは コード領域の発現をこれらの粘膜細胞の細胞表面に輸送するものである。こうして目的の 20 オープンリーディングフレームまたはコード領域を動物の粘膜細胞の細胞表面に提示する ことによって、免疫応答の開始をそれほど効果的に促進できないおそれのある動物細胞内 での発現とは対照的に、本発明のワクチンは、免疫応答を効果的に開始できる内部部位に 抗原を最も効果的に送達できる。今説明しているワクチンの使用によるこの発現産物の細 胞外分泌によって、野生型免疫原によってワクチンを調製したときにみられるものよりも 大きい抗体免疫応答および抗体生成がもたらされる。 【００５４】 真核細胞において、分泌タンパク質は、疎水性シグナル配列によって小胞体膜を標的と する。本発明はこの性質を用いて、異種疎水性シグナル配列を利用してワクチンにおける 所与のタンパク質の発現を細胞表面に向ける。 30 【００５５】 本明細書で用いられるウイルスベクターは、ＯＲＦの発現産物が発現の際に切断型ＯＲ Ｆタンパク質の（感染細胞からの）分泌を可能にするように改変されたＯＲＦをコードす るか、または感染細胞の表面にタンパク質を直接発現させるような核酸を含むポリヌクレ オチド構築物を含む、組み換えベクターである。たとえば、目的のＯＲＦは、ニワトリガ ンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、またはインフルエンザウイルスの ＨＡタンパク質からのシグナル配列とインフレームで発現される。用いられ得る他のシグ ナル配列は、たとえば乳清リンタンパク質シグナル配列；α−１酸糖タンパク質；α−サ イロトロピン；メクラウナギからのインスリン；アンコウからのインスリン；ヒトインス リン；ラットインスリンＩまたはＩＩ；ヒツジβ−カゼイン；ヒツジχ−カゼイン；ヒツ 40 ジα−ラクトアルブミン；ヒツジβ−ラクトグロブリン；ヒツジα−ｓｌカゼイン、およ びヒツジα−ｓ２カゼイン；ＶＳウイルス糖タンパク質；雄鳥ＶＬＤＬ−１１；ミツバチ メリチン；ラットラクチン；ヒト胎盤ラクトゲン；ヒトβ−絨毛性ゴナドトロピン；ヒト α−絨毛性ゴナドトロピン；ウサギウテログロビン；ラット成長ホルモン；ヒト成長ホル モン、ヒト；ウシ成長ホルモン；ウシ副甲状腺ホルモン；ラットレラキシン；ラット血清 アルブミン；ヒト血清アルブミン；ラット肝臓アルブミン；ニワトリトロポエラスチンＢ ；ニワトリオボムコイド；ニワトリリゾチーム；ニワトリコンアルブミン；ヒトα−１ア ンチトリプシン；ラット前立腺結合タンパク質；ラット前立腺結合タンパク質ｃ２；ＡＤ ウイルス糖タンパク質；ラットアポリポタンパク質Ａｌ；狂犬病ウイルス糖タンパク質； ヒトインフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ赤血球凝集素；ヒトインフルエンザＪａｐ赤血球凝 50 (16) JP 2013-513548 A 2013.4.22 集素；トリインフルエンザＦＰＶ赤血球凝集素；ヒト白血球インターフェロン；ヒト免疫 インターフェロン；ヒト線維芽細胞インターフェロン；マウスχ−免疫グロブリン；マウ スλ−免疫グロブリン；マウスχ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；マウス 胚ＶＨ−免疫グロブリン；マウスＨ鎖免疫グロブリン；イヌトリプシノゲン１；イヌトリ プシノゲン２＋３；イヌキモトリプシノゲン２；イヌカルボキシペプチダーゼＡｌ；イヌ アミラーゼ；マウスアミラーゼ；ラットアミラーゼ；ウサギα−ラクトアルブミン；ブタ α−ラクトアルブミン；ラットカルボキシペプチダーゼＡ；ウシＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前 駆体；ブタＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ヒトＡＣＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体；ブタガスト リン；マウスレニン；トリパノソーマ糖タンパク質；ナマズソマトスタチン；アンコウソ マトスタチン；ラットカルシトニン；およびアンコウグルカゴンのシグナル配列などを含 10 む。これらのシグナル配列の各々は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ １３３ １７−２１（１９８３）の図１に示されており、本明細書における使用の ために容易に適応され得る。前述の参考文献の図１からのシグナル配列を本明細書の図４ に転載している。 【００５６】 所与のタンパク質に対するこれらおよびその他のシグナルペプチド部位は、当業者に公 知の方法を用いて容易に決定できる。たとえば、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０サーバ（Ｂｅｎ ｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．＆Ｂｒｕｎ ａｋ，Ｓ．（２００４）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３ 20 −７９５）を用いてシグナルペプチド部位を予測できる。加えて、シグナル配列の決定を 容易にするために利用可能なウェブサイトもあり、たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂ ｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／などを参照されたい。発現され た産物を細胞表面に輸送できる疎水性配列である限り、使用されるシグナル配列の正確な 同一性は重要ではない。 【００５７】 好ましい実施形態において、シグナル配列は、そのシグナル配列を切断して付加タンパ ク質をこうした細胞の細胞外スペースに分泌させることを可能にするための切断部位を含 む。特に好ましい実施形態においては、ニワトリガンマＩＦＮからのシグナル配列を用い て本発明のこの局面が示され、これは配列ＭＴＣＱＴＹＮＬＦＶＬＳＶＩＭＩＹＹＧＨＴ 30 ＡＳＳＬＮＬ（配列番号６）を含み、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＡＣＴ ＧＣＡ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＴＡ ＡＡＴ ＣＴＴ（配列番号７）によってコードされ、ブタガンマＩＦＮに対す る疎水性シグナル配列はＭＳＹＴＴＹＦＬＡＦＱＬＣＶＴＬＣＦＳＧＳＹＣ（配列番号８ ）であり、これはＤＮＡ配列ＡＴＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＣＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＴＡＣ ＴＧＣ（配列番号９）によってコードされ 、ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２に対する疎水性シグナル配列はＭＫＶＫＬＬＩＬ ＬＣＴＦＴＡＴＹＡＤＴＩ（配列番号１０）であり、これは配列ａｔｇ ａａａ ｇｔａ 40 ａａａ ｃｔａ ｃｔｇ ａｔｃ ｃｔｇ ｔｔａ ｔｇｔ ａｃａ ｔｔｔ ａｃａ ｇｃｔ ａｃａ ｔａｔ ｇｃａ ｇａｃ ａｃａ ａｔａ（配列番号１１）によって コードされる。これらの例示的な配列の各々も切断部位を含み、そこにシグナルペプチダ ーゼが作用して発現ＯＲＦの放出をもたらす。 【００５８】 プロモーターと、切断部位を含んでも含まなくてもよい疎水性シグナル配列とに加えて 、発現ベクターはポリアデニル化配列をさらに含む。ポリＡテールは、ｍＲＮＡ分子を細 胞質におけるエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、転写終結、ｍＲＮＡの核からの 排出、および翻訳を助ける。ほぼすべての真核生物ｍＲＮＡはポリアデニル化されている 。当業者は、タンパク質の組み換え発現のためにポリＡテール配列をルーチン的に付加す 50 (17) JP 2013-513548 A 2013.4.22 る。 【００５９】 本発明のベクターに挿入されるＯＲＦまたはその他の外来配列は、本明細書に記載され るＦＡＶベクターを使用して発現されることが望まれるあらゆるＯＲＦまたはその他の外 来配列であってもよい。これらその他の外来配列は、１つもしくはそれ以上のＯＲＦ、ま たは目的の発現産物、または遺伝子ではないが治療上の目的での他の機能を有するその他 のヌクレオチド配列からなっていてもよい。 【００６０】 しかしながら特定の実施形態において、本発明は、コクシジウム症に対してニワトリに ワクチン接種するためのサブユニットワクチンとして使用されるベクターを記載する。こ 10 の状況において、目的のＯＲＦはアピコンプレクサの原虫寄生体Ｅｉｍｅｒｉａの抗原を コードするものである。より特定的には、ＯＲＦは、米国特許第７，４２３，１３７号（ 本明細書において引用により援用される）に記載されるとおりの５６ｋＤａ、８２ｋＤａ および２３０ｋＤａの抗原からなる群より選択される。より特定的には、本発明者らは、 ５６ｋＤａ（本明細書では代替的にｒ５６と呼ばれる）または２３０ｋＤａ（本明細書で は代替的にＴＰＦ２５０と呼ばれる）抗原の全長配列をＦＡＶに組み込んでも有効なワク チンが生成されないことを見出した。しかし、切断型ｒ５６配列を用いると、ワクチンは 効果的に免疫応答を誘発する。ｒ５６の全長アミノ酸配列を配列番号２に示しており、こ のタンパク質配列は配列番号１の配列によってコードされ、ｒ５６をコードする全長遺伝 子も配列番号１４に示されている。加えて、５６ｋＤａ抗原をコードするプラスミドは、 20 ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号ＮＭ０１／２２４ ００の下で公的に入手可能である。５６ｋＤａ抗原によって形質転換されたバクテリア細 胞も、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２４０１の下で入手可能である。したがって 特定の実施形態において、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断型ｒ５６が用いら れる。ｒ５６の配列は配列番号２のアミノ酸２４∼３４５を含むものであり、これは配列 番号１４の配列７０∼１０３５によってコードされてもよい。本発明の好ましいコクシジ ウム症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は、切断型ｒ５６を感染細胞の細胞表面に 係留する疎水性シグナル配列とインフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム 症ワクチンにおいて、ｒ５６の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフ 30 レームであることによって、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ｒ５６は細胞の細胞外 スペースに放出される。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリイン フルエンザＨＡ抗原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症 ワクチンが提供される。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シ グナル配列が、ニワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、および ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチ ンが提供される。特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型 ｒ５６の細胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたｒ５６を細胞外スペースに放 出するワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。 【００６１】 40 さらに他の例示的な実施形態においては、コクシジウム症ワクチンの調製のために切断 型ＴＦＰ２５０が用いられる。ＴＦＰ２５０の全長配列は配列番号４に示されており、こ れは配列番号３または配列番号１６によってコードされる。２５０ｋＤａ抗原をコードす るプラスミドは、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受入番号 ＮＭ０１／２２３９６の下で公的に入手可能である。この抗原によって形質転換されたバ クテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９７の下で入手可能である。 本明細書における好ましいワクチンに用いられるＴＦＰ２５０の配列は、配列番号４のア ミノ酸２１４９∼２３６１またはアミノ酸２１５０∼２３６１を含むものであり、それは それぞれ配列番号１６の配列６４４４∼７０８３および２１４９∼２３６１によってコー 50 (18) JP 2013-513548 A 2013.4.22 ドされてもよい。本発明の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２５０の切 断型配列は、切断型ＴＦＰ２５０を感染細胞の細胞表面に係留する疎水性シグナル配列と インフレームである。本発明の別の好ましいコクシジウム症ワクチンにおいて、ＴＦＰ２ ５０の切断型配列は切断部位を含む疎水性シグナル配列とインフレームであることによっ て、膜の細胞外側への輸送の際に、切断型ＴＦＰ２５０は細胞の細胞外スペースに放出さ れる。特定の実施形態において、アンカーｒ５６タンパク質がトリインフルエンザＨＡ抗 原の疎水性シグナル配列によって細胞表面に係留されるコクシジウム症ワクチンが提供さ れる。さらに他の特定の実施形態においては、切断部位を含む疎水性シグナル配列が、ニ ワトリガンマインターフェロン、ブタガンマインターフェロン、およびヒトインフルエン ザウイルスＨ１Ｎ２からなる群より選択される、コクシジウム症ワクチンが提供される。 10 特定の実施形態においては、両方のタイプのワクチン、すなわち切断型ＴＦＰ２５０の細 胞表面発現を可能にするワクチンと、発現されたＴＦＰ２５０を細胞外スペースに放出す るワクチンとを含むコクシジウム症ワクチン組成物が調製されてもよい。 【００６２】 類似の態様で、Ｅｉｍｅｒｉａの８２ｋＤａ抗原を発現するワクチンと組み合わせてワ クチンを調製してもよいことが意図される。８２ｋＤａ（本明細書においてはｇａｍ８２ とも呼ばれる）抗原は、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｙｍｂｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから受 入番号ＮＭ０１／２２３９８の下で公的に入手可能であり、８２ｋＤａ抗原によって形質 転換されたバクテリア細胞は、同じ保管所から受入番号ＮＭ０１／２２３９９で入手可能 20 である（本明細書の添付物に示されている）。本発明のワクチンのいずれかが、既存のワ クチン投与プロトコルと組み合わせて使用されてもよい。たとえば、種畜、ヒヨコおよび 高齢のニワトリにおいて防御免疫を生成するために、本明細書に記載されるワクチンをＣ ｏｘＡｂｉｃ（登録商標）と組み合わせて使用してもよい。 【００６３】 本明細書に記載される実施例の多くがＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの抗原から調製さ れたワクチンに関するが、当業者は他のＥｉｍｅｒｉａ種からの相同配列を用いてこうし たワクチンを調製してもよいことが容易に明らかになるだろう。当業者は、従来の分子生 物学技術を用いてＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａからのオープンリーディングフレームの 上記配列に対する相同性を介して、こうした適切なＤＮＡ配列を容易に同定できる。よっ 30 て、他のＥｉｍｅｒｉａ種、たとえばＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａ ｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓまたはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉなどに 由来する、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａのｒ５６、ＴＦＰ２５および８２ｋＤａのＯＲ Ｆの相同体は、本明細書に記載されるコクシジウム症ワクチンの調製物に対して特定的に 意図される。これに関して、配列番号１２はＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａのｒ５６の 配列を提供する。Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａおよびＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ のｒ５６配列が有効であることが示されれば、当業者は本明細書に記載される方法および 組成物に用いるために他のＥｉｍｅｒｉａ種からのｒ５６の相同体を容易に同定できるだ ろう。 40 【００６４】 好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、 Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅｉｍｅｒｉ ａ ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓ もしくはＥｉｍｅｒｉａ ｂｒｕｎｅｔｔｉ、または免疫学的に交差反応性の抗原を発現 する微生物による感染に対して被験体を免疫化する方法を提供するために用いられ、この 方法は、本発明のワクチンを被験体に投与するステップを含む。特に好ましい実施形態に おいて、被験体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラおよ びハトからなる群より選択される鳥種を含むがそれに限定されない鳥種である。特に好ま しい実施形態において、その鳥種はニワトリであり、より特定的にはブロイラーニワトリ 50 (19) JP 2013-513548 A 2013.4.22 である。 【００６５】 このワクチンは、ワクチン接種に典型的に用いられるあらゆる経路によって投与されて もよく、その経路は、全身的（たとえば、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻腔 内、非経口的、腸管内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または頭蓋内など）、経口投与、エアロ ゾル化、または肺内注入によるものを含むがそれに限定されない。投与は単一用量で行な われてもよいし、特定の時間間隔後に１回またはそれ以上繰り返される用量で行なわれて もよい。適切な投与経路および投与量は状況（たとえば、処置される個体、処置される障 害、または目的のポリペプチドのＯＲＦもしくはフラグメントなど）によって変わるが、 当業者によって定められ得る。 10 【００６６】 このワクチンは従来の投与計画に従って投与されてもよく、たとえば投与量処方に適合 する態様の単一または繰り返し投与として、予防的に有効な量、すなわちトリ（特に家禽 ）において病原性のＥｉｍｅｒｉａ寄生虫による攻撃に対する免疫を誘導する前記抗原を 発現できる組み換え微生物または免疫化抗原の量にて投与されてもよい。免疫とは、ワク チン接種後のトリの集団において、ワクチン接種していないグループに比べて有意なレベ ルの防御が誘導されることとして定義される。特定の実施形態において、与えられる免疫 は増強された免疫であり、ここで本発明のワクチンは、ワクチン接種後のトリの集団にお いて、全長ｒ５６または全長ＴＦＰ２５０抗原または全長８２ｋＤａ抗原を含むサブユニ ットＦＡＶベクターによってトリがワクチン接種されるときにみられる防御よりも有効な 20 レベルの防御を誘導する。この、より効果的なワクチン接種が観察されるのは、このサブ ユニットワクチンが全長配列から調製されたサブユニットワクチンよりも高い安定性を有 するためである。 【００６７】 本発明のワクチンは、感染動物が脱落させる接合子嚢の数を減らすかもしれない。通常 、脱落した接合子嚢は群の他の動物に感染する。よって脱落した接合子嚢の数が減少する ことによって、その後感染される動物の数も減少し、さらに脱落した接合子嚢の数が減少 することによって、感染性負荷の減少がもたらされる。特定の実施形態において、本発明 のワクチンは、その後のＥｉｍｅｒｉａ感染によって攻撃されたときに、トリにおける盲 腸の病変の数を低減させる。 30 【００６８】 典型的に、生ウイルスベクターワクチンのニワトリ当りの用量率は１０２から１０１０ ｐｆｕの範囲であってもよい（ただし、たとえばＨＶＴに対しては＜１０００ｐｆｕでも 十分であり得る）。 【００６９】 本発明のワクチンは、同じおよび／もしくは他のＥｉｍｅｒｉａ種の他の抗原性成分、 ならびに／または家禽病原性ウイルスもしくは微生物に由来する付加的な免疫原および／ もしくはこれらの免疫原をコードする核酸配列と効果的に混合されてもよい。こうした混 合ワクチンは、トリの群における寄生虫負荷を減少でき、コクシジウム症に対する防御の レベルを増加でき、加えて他の家禽病原体に対する防御ができる。こうした他の免疫原は 40 、たとえばマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染 性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血剤（ＣＭ）、レオウイルス、トリレトロウ イルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、サルモネラ菌種、また はＥ．ｃｏｌｉからなる家禽病原性ウイルスまたは微生物の群から選択されてもよい。よ って本発明は多価ワクチンを意図している。特に好ましい多価ワクチンは、上述のｒ５６ 発現ベクターを、上述のＴＦＰ２５０を発現する家禽アデノウイルスベクターと組み合わ せるか、および／または上述の８２ｋＤａ抗原を発現する家禽アデノウイルスベクターと 組み合わせたもので構成される、本発明のコクシジウム症ワクチンである。 【００７０】 ＦＡＶに基づくサブユニットワクチン中で発現されるＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａの 50 (20) JP 2013-513548 A 2013.4.22 切断型抗原から調製される本発明のワクチンの特定の利点は、それらをエアロゾルスプレ ーもしくは点眼剤によって投与してもよいし、ブロイラートリの飲水、胚内もしくはトリ の餌に入れて投与するか、またはトリによって摂取されるゲルマトリックスとして配合し てもよいことから、これらのワクチンが典型的な過密条件下であってもブロイラートリの 大規模ワクチン接種に適用可能なことである。よって好ましくは、ワクチンはその投与を 達成するためにワクチンの噴霧を容易にする賦形剤とともに調製されてもよい。 【００７１】 本発明のこれらのワクチンは、新たに孵化したヒヨコに噴霧または給餌されてもよいし 、より高齢のトリに同様に噴霧および給餌されてもよい。 【００７２】 10 本発明のワクチンは、ｒ５６の全長配列またはＴＦＰ２５０の全長配列によって作製さ れた同様のワクチンよりも明白な免疫応答を生じてより良い免疫を与える態様で、Ｅｉｍ ｅｒｉａ感染の病原性の影響から家禽を保護することができる。 【００７３】 本発明に従うワクチンは、たとえば上述した家禽アデノウイルスベクターを医薬的に許 容できる担体と単に混合することによって作られてもよい。医薬的に許容できる担体とは 、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を与えない、少なくともその動物がワクチン接 種されないときの疾病によってみられる影響よりも過度の悪影響を与えない化合物と理解 される。医薬的に許容できる担体は、たとえば滅菌水または滅菌生理食塩水などであって もよい。より複雑な形では、担体はたとえば緩衝液などであってもよい。 20 【００７４】 代替的には、本発明のコクシジウム症ワクチンはアジュバントをも含有してもよい。一 般的にアジュバントは、非特異的態様で宿主の免疫応答を高める物質を含む。当該技術分 野において、いくつかの異なるアジュバントが公知である。アジュバントの例は、フロイ ントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ポリマーならびにポリア ミン、たとえばデキストラン硫酸、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびピランなど である。同じく非常に適切なのは、表面活性物質、たとえばＳｐａｎ、Ｔｗｅｅｎ、ヘキ サデシルアミン、リゾレシチン、メトキシヘキサデシルグリセロールなど、およびＱｕｉ ｌｌ Ａ（登録商標）などのサポニンである。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグ リシン、タフトシンなどのペプチドがしばしば用いられる。これらのアジュバントの次に 30 、免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ＩＳ ＣＯＭＳ）、ミネラルオイル、たとえばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登 録商標）など、植物油またはそのエマルション、およびＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏ ｒｔｅが有利に用いられてもよい。このワクチンは「媒体」をも含んでもよい。媒体とは 、ポリペプチドがそれに共有結合することなく付着するような化合物のことである。よく 用いられる媒体化合物は、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸化物、硫酸化物または酸 化物、シリカ、カオリンおよびベントナイトなどである。媒体中に抗原が部分的に埋込ま れるような、こうした媒体の特殊な形がいわゆるＩＳＣＯＭである（欧州特許第１０９． ９４２号、欧州特許第１８０．５６４号、欧州特許第２４２．３８０号）。 【００７５】 40 ワクチン組成物は、たとえば分解されやすいポリペプチドの分解を防ぐため、ワクチン の有効期間を増すため、または凍結乾燥効率を改善するための安定剤をさらに含んでもよ い。有用な安定剤は、スキムミルク、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物、たとえ ばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランま たはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミンまたはカゼインまたはその分解産 物など、および緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などを含む。 【００７６】 凍結乾燥材料は、何年間も保存して生存可能に保つことができる。凍結乾燥材料に対す る保存温度は、材料に有害になることなく零度より高くてもよい。特定の局面において、 ワクチンは凍結乾燥される。 50 (21) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【実施例】 【００７７】 以下の実施例は、本発明に従うワクチンの生成を示すものである。これらの実施例にお いては、家禽アデノウイルス血清型８（ｆｏｗｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙ ｐｅ ８：ＦＡＶ８）が用いられた。この送達系を用いることの主要な利点は、適切な標 的組織（この場合には腸粘膜）へのサブユニットワクチン送達のためのベクターとして弱 毒化ＦＡＶ８を利用できることにある。 【００７８】 実施例１ 構築物の調製および分析 10 本実施例においては、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫のマクロガメトサイト段階からの最も免疫 原性の高いタンパク質の１つである組み換えタンパク質ｒ５６をＦＡＶ８ベクターにクロ ーニングした。加えて、Ｅｉｍｅｒｉａ雄核発生段階からの別の免疫原性タンパク質であ る組み換えタンパク質ＴＦＰ２５０を別のＦＡＶ８ベクターに別個にクローニングした。 このＴＦＰ２５０のＯＲＦは、前の研究でやはりＥｉｍｅｒｉａによる攻撃感染に対する 部分的防御免疫を誘導することが示されたミクロネームタンパク質（寄生虫侵入に関与す る小器官）の部分をコードしている。 【００７９】 形成された発現構築物を以下の２つの表に示す。 【００８０】 【化１】 20 30 40 【００８１】 (22) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【化２】 10 20 このベクター系を用いてニワトリにおける免疫応答を最大限にするために、これら２つ のタンパク質をコードする各ＯＲＦを３つのＦＡＶ８発現構築物に別々にクローニングし て、ネイティブタンパク質、膜に係留されたバージョンのタンパク質、および分泌形の抗 原のいずれかを発現させた。後者の２つのＦＡＶ８構築物は、目的のＯＲＦの上流に適切 30 なシグナル配列を融合することによって得られた。送達ベクターとしてＦＡＶ８を用いた ことにより、ワクチンを安価に大規模に投与できるため、かなり大きなブロイラー市場に 導入される可能性を有する最終生成物が提供される。 【００８２】 驚くべきことに、全長ｒ５６がＦＡＶ８ベクターにクローニングされたとき、それはベ クター内で不安定であるために、サブユニットワクチンとして送達されたときにも適切な 防御免疫を提供できないことが見出された。しかし、切断型バージョンの抗原を用いたと きには、免疫が明確に示された。 【００８３】 ３つのバージョンのｒ５６および３つのバージョンのＴＦＰ２５０を生成した。バージ ョン１はＵＴＳから供給されたネイティブＯＲＦであり、そのコード領域をＦＡＶ発現カ セットに挿入した以外は変更していないものである。バージョン２は、シグナル配列を加 えることによってｒ５６またはＴＦＰ２５０が細胞から分泌されるようにしたものである 。バージョン３にもシグナル配列が付加されているが、これはｒ５６またはＴＦＰ２５０ を細胞膜に向けるためのものである。 【００８４】 下記の表は第１の研究の結果をまとめたものである： 【００８５】 40 (23) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【表１】 10 組み換えウイルスが得られたことを確認するために、従来の手段を用いてウイルスを単 離してプラーク精製した。加えてＰＣＲを用いて、組み換えＦＡＶのＤＮＡから単離され た、挿入されたｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡ全体、ならびに各セクシ ョン（プロモーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０およびポリＡ）の増幅を確認した。プロ モーター、ｒ５６またはＴＦＰ２５０ ＤＮＡおよびポリＡからなる挿入発現カセット全 体を含む、組み換えＦＡＶから単離したＤＮＡについても、両方向の配列決定を行なって 20 配列挿入物の忠実度を確認した。抗ｒ５６または抗ＴＦＰ２５０血清を用いてタンパク質 発現を確認した。 【００８６】 図２および図３は、さまざまな構築物からのｒ５６およびＴＦＰ２５０のタンパク質分 析を示す。異なるＦＡＶ８構築物をＬＭＨ細胞系統に感染させることによって、タンパク 質発現実験を行なった。これらの構築物は、すべてのタンパク質発現バージョン（ネイテ ィブ、分泌および膜アンカー）とともに、異なるプロモーター（ＭＬＰまたはＣＭＶｐ） の制御下で設計された。陰性対照として、未感染のＬＭＨ細胞およびＦＡＶ８ベクターの みを感染させた細胞を用いた。組み換え５６に対して産生されたポリクローナル抗血清を 用いてｒ５６抗原を検出し、組み換えペプチドに対するマウス抗血清を用いてＴＦＰ２５ 30 ０を検出した。タンパク質バンドは、クローニングされた部分遺伝子フラグメントから予 測されたペプチドの予想サイズに基づく適切な分子量のところに現れた。組み換えＴＦＰ ２５０（図３）に対するレーン３および４にみられるスメアは、ペプチドと宿主細胞材料 との凝集によるもののようであった。 【００８７】 この結果から、明確なバンドを示さなかったＴＦＰ２５０膜アンカー構築物を除くすべ ての構築物はよく発現されることが示された。明確なバンドを示さなかったのは、発現さ れたタンパク質が膜に係留して、膜からの抽出後に高次構造が変化したためかもしれない 。 【００８８】 40 当業者にとって、多くの異なる可能性が利用可能である。必要な構築物を作製するため に、３つの実施例を以下に示す。図５には、制限酵素部位、目的のＯＲＦ（たとえば切断 型ｒ５６、８２ｋＤａタンパク質またはＴＦＰ２５０など）とインフレームのシグナル配 列、および構築物をＦＡＶの右手端部発現カセットに挿入させるための第２の制限酵素部 位の化学合成のためのスキームが示されている。 【００８９】 代替的に、（図６）当業者は、適切なＲＥ部位およびインフレームのシグナル配列を有 するプライマーを用いて、目的のＯＲＦから所望の配列をＰＣＲ増幅してもよい。 【００９０】 他の実施例において、当業者はＦＡＶ ＲＨＥ発現カセットを構築して、プロモーター 50 (24) JP 2013-513548 A 2013.4.22 およびシグナル配列、次いでシグナル配列とインフレームで目的のＯＲＦを挿入するため のＭＣＳを含ませてもよい（図７）。 【００９１】 実施例２ 防御免疫応答の誘導 本実施例は、ＦＡＶ８−ｒ５６およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ベクターが、Ｅ．ｍａｘ ｉｍａの発生を妨げて寄生虫病変を防ぐような防御免疫応答を誘導する能力をテストする ものである。 【００９２】 【表２】 10 病変を生成するために必要な接合子嚢の数を評価するために予備試験が行なわれ、その 20 試験では３０羽のＳＰＦニワトリを可搬性の清潔なケージ内でコクシジウム症のない条件 下（清潔度、水および餌）で飼育する。ニワトリに毎週飲水を通じてアンプロリウムを投 与することによって、攻撃前にコクシジウム感染を防ぐための処置をする。ｄａｙ２８に ニワトリは経口で適切な数のＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ接合子嚢の攻撃を受ける（表 ２を参照）。ｄａｙ３４に病変スコア付け（投与量レベル当り少なくとも５羽のニワトリ ）を行なう。平均３∼４の最も一貫した病変スコアを有するグループを選択して、試験で 用いられる高攻撃投与量に供する。予備試験に用いられたのと同じバッチの接合子嚢を２ ％重クロム酸カリウム中で４℃にて保存し、試験に用いる。 【００９３】 次いで、Ａｒｍｉｄａｌｅ近郊の孵化場から得られた４００羽のＳＰＦニワトリ（最初 30 の３週間で最高１０％の死亡率を許容）、および胚内免疫化のための１８日インキュベー ションの１８０個の受精卵に対して予備試験を行なう。 【００９４】 以下のワクチンおよび対照が用いられる： 対照：ワクチン接種なし（陰性対照）；ＦＡＶ８ベクターのみ（陰性対照）；ｒ５６タ ンパク質のワクチン接種；およびＴＦＰ２５０タンパク質のワクチン接種。テストされる ワクチンは、以下のとおりのＦＡＶ８構築物に基づくワクチンである：ＦＡＶ８−ｒ５６ ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ｒ５６ Ｎ末端膜アンカー；ＦＡＶ８−ｒ５６分泌形 ；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ネイティブタンパク質；ＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０ Ｎ末端膜ア ンカー、およびＦＡＶ８−ＴＦＰ２５０分泌形。 40 【００９５】 ＦＡＶ８構築物の力価は用量当り１×１０８となる。以下に記載されるとおり、ワクチ ンは経口、胚内、または皮下ワクチン接種によって投与される。 【００９６】 経口ワクチン投与に対しては、２１ゲージのブラントチップ（ｂｌｕｎｔ−ｔｉｐ）針 に接続した１ｍｌシリンジを用いる。トリを垂直に保持し、そっと口を開かせて、後鼻孔 の割れ目の前部にブラントチップ針を挿入する。ワクチンをゆっくりと投与して、ワクチ ンが嚥下される前に後鼻孔の割れ目および中咽頭を浸すようにさせる。この態様で、ワク チンが投与される際に上咽頭のほとんど、および口腔のほぼ全体がワクチンに接触する。 【００９７】 50 (25) JP 2013-513548 A 2013.4.22 １８日インキュベーションにおける胚内ワクチン接種に対しては、１８０個の卵が尿膜 腔液中に、日齢ヒヨコに用いられるのと同じ用量レベルでウイルスの注射を受ける（グル ープ５、６、１７、１８、２３および２４の卵、各々以下の表３を参照）。 【００９８】 組み換え抗原を用いた皮下および筋肉内ワクチン接種に対しては、バクテリアを発酵濃 度の１０倍に濃縮して、下記の尿素緩衝液中での超音波処理によって溶解する：２５ｍＭ のＴｒｉｓ ｐＨ８．０、６Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ、さらに０．８μＭフィル タで濾過する。各２５ｍｌのＣＥサンプルならびに尿素緩衝液およびＰＢＳから１００ｍ ｌのエマルション（２５％水相）を調製する。この試験にはフロイントの完全アジュバン トが用いられ、エマルションは注射の直前に調製される。 【００９９】 各ニワトリは、最初にｄａｙ１に用量当り０．５ｍｌを皮下にワクチン接種され、次い でｄａｙ１４に用量当り０．５ｍｌを筋肉内に追加される。 【０１００】 下記の表はワクチン接種に対する実験設計をまとめたものである。 【０１０１】 10 (26) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【表３】 10 20 30 コクシジウム症の混入を避けるために、ｄａｙ７、１４および２１にニワトリの飲水中 のアンプロリウムでニワトリを毎週処置する。さらに、隔離飼育器、設備などを徹底的に 40 洗浄し、すべての作業者が入室の際に着替えることによってコクシジウムの感染を防ぐ。 ｄａｙ２６に糞便サンプルを取ってＥｉｍｅｒｉａ接合子嚢の存在をテストする。ｄａｙ ２８に、接合子嚢排出の測定に用いられるニワトリは、経口的に１００個のＥ．ｍａｘｉ ｍａ胞子形成接合子嚢の攻撃を受け、病変スコアに対するニワトリは、予備試験で決定さ れた顕著な病態をもたらす数の胞子形成接合子嚢を受取る（２０∼５０，０００）。 【０１０２】 上記の試験は以下のスケジュールに従う。 【０１０３】 卵インキュベーションのｄａｙ１８に、グループ３、９および１２の第１の胚内ワクチ ン接種。 50 (27) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【０１０４】 卵インキュベーションのｄａｙ２１に、胚内ワクチン接種グループからのヒヨコが３つ の別個の卵インキュベータ内で孵化。 【０１０５】 ｄａｙ１に、その他すべてのグループの第１のワクチン接種を行なう。 【０１０６】 ｄａｙ１４に、すべてのヒヨコ（グループ３、９および１２を含む）の第２のワクチン 接種を行なう。 【０１０７】 ｄａｙ２８に、血清学的テストのためにニワトリから採血してから、病変スコア付けに 10 対してはニワトリ当りに必要な正しい数の接合子嚢（予備試験の結果に基づく）によって 、接合子嚢カウントに対してはニワトリ当り１００個の接合子嚢によって、Ｅ．ｍａｘｉ ｍａによる攻撃を受けさせる。 【０１０８】 ｄａｙ３４に、大投与量の接合子嚢を受けたグループに対する病変スコア付けを行なう 。 【０１０９】 ｄａｙ３４∼ｄａｙ３７に、１００個の接合子嚢に感染されたヒヨコの各グループから の糞便を単一のプールに集め、ｄａｙ３７にすべてのサンプルに対して接合子嚢カウント を行なう。 20 【０１１０】 ｄａｙ４２（感染後１４日）に血清学的テストのためにトリから採血し、屠殺する。 【０１１１】 免疫応答の評価のためのインビトロテストを行ない、ここでは免疫化の４週間後（ｄａ ｙ２８）にＦＡＶ８被覆プレート（ＴｒｏｐＢｉｏ Ｌｔｄ．）上で血清学テストを行な って、ＦＡＶ８構築物の感染を確認する（すべての群に対して）。免疫化４週間後の血清 および攻撃後１４日の血清に対しても、ＡＰＧＡ、ｒ５６およびＴＦＰ２５０被覆プレー ト上でＥＬＩＳＡアッセイが行なわれる（すべてのグループに対して）。さらに、正の対 照血清として抗ｒ５６／ＡＰＧＡ／抗ＴＦＰ２５０／を、陰性対照として正常なニワトリ 血清を用いた、調製用ガメトサイトおよび組み換えＴＦＰ２５０含有ブロットによるウエ 30 スタンブロットを用いて、タンパク質分析を行なう。 【０１１２】 上に示すとおりに行なわれた最初の試験において、最高の防御を有したワクチン接種グ ループは、平均病変スコアがそれぞれ１．３１および１．３６のｒ５６分泌グループおよ びｒ５６ネイティブグループであることが見出され、ここでスコア１はブロイラーニワト リにおける良好な能力結果を得るために許容できると考えられる。対照グループにおける 平均病変スコア２．３７と、ワクチン接種グループにおける１．３１との差は、病気のニ ワトリと防御されたニワトリとの間の格差によるものと明確にいえる。 【０１１３】 病変スコア付けおよび接合子嚢カウントの両方に基づいて、ｒ５６分泌構築物を含むＦ 40 ＡＶ８ベクターは１日齢のヒヨコにおける防御の誘導に非常に良好に働くことが結論付け られた。胚内免疫化によってこの構築物によるワクチン接種を受けたグループは、こうし た高レベルの防御を示さなかった。この理由は、孵化が早かったためにヒヨコがウイルス に晒される時間が十分でなかったためだと考えられる。それにもかかわらず、胚内ワクチ ン接種はなおも将来のワクチン接種に対する実行可能で経済的なアプローチである。１日 齢のヒヨコの経口ワクチン接種は効果的であることが証明されたことから、こうしたトリ にワクチンを噴霧または給餌することが、ブロイラーに長期の免疫を与える有用な方法と なることが期待される。 【０１１４】 ｒ５６構築物によって良好な結果を提供したことに加え、病変スコア付けおよび接合子 50 (28) JP 2013-513548 A 2013.4.22 嚢カウントの両方によって、ＴＦＰ２５０分泌構築物も顕著な（２０∼３０％低いが）レ ベルの防御免疫を誘導することが見出された。 【図１】 【図４Ａ】 【図４Ｂ】 (29) 【図５】 【図７】 【図６】 【図８】 【図９】 JP 2013-513548 A 2013.4.22 (30) 【図１０Ａ】 【図１０Ｂ】 【図１０Ｃ】 【図１１】 JP 2013-513548 A 2013.4.22 (31) 【図１２】 JP 2013-513548 A 2013.4.22 (32) 【図２】 JP 2013-513548 A 2013.4.22 (33) 【図３】 【配列表】 2013513548000001.app JP 2013-513548 A 2013.4.22 (34) JP 2013-513548 A 2013.4.22 【国際調査報告】 10 20 30 40 (35) JP 2013-513548 A 2013.4.22 10 20 30 40 (36) JP 2013-513548 A 2013.4.22 10 20 30 40 (37) JP 2013-513548 A 2013.4.22 10 20 30 40 (38) JP 2013-513548 A 2013.4.22 10 20 30 40 (39) JP 2013-513548 A 2013.4.22 10 20 30 40 (40) JP 2013-513548 A 2013.4.22 フロントページの続き (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,S K,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR, BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,I S,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE ,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW (72)発明者 シェパード， マイケル ジー． オーストラリア国 ３０９５ ビクトリア， エルザム， ジ アイリー ９ Ｆターム(参考) 4B024 AA10 BA80 CA01 DA02 EA02 FA20 GA11 HA20 4B065 AA90X AA95Y AB01 AC20 BA02 CA45 4C085 AA03 AA04 BA05 CC07 CC08 DD62 EE01 EE03 GG08 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA14 ZC64 10