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JP 2012-511329 A 2012.5.24 (57)【要約】
JP 2012-511329 A 2012.5.24 (57)【要約】 本願は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、同をコードする核酸、その 治療的組成物、およびＴ細胞機能を増強し、細胞媒介性 免疫応答をアップレギュレーションするためおよびＴ細 胞機能障害性障害（感染（例、急性および慢性）および 腫瘍免疫を含む）の処置のためのその使用に関する。 (2) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配列を含む単離された重鎖可変領域 ポリペプチドであって、それにおいて： （ａ）ＨＶＲ−Ｈ１配列がＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号１）であり； （ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列がＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）で あり； （ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列がＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）であり； さらにそれにおいて：Ｘ１がＤまたはＧであり；Ｘ２がＳまたはＬであり；Ｘ３がＴまた はＳである、重鎖可変領域ポリペプチド。 10 【請求項２】 Ｘ１がＤであり；Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＴである、請求項１記載のポリペプチド。 【請求項３】 式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）の、ＨＶＲの間に並置された重鎖 可変領域フレームワーク配列をさらに含む、請求項１記載のポリペプチド。 【請求項４】 フレームワーク配列が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項３記 載のポリペプチド。 【請求項５】 20 フレームワーク配列が、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークである、 請求項４記載のポリペプチド。 【請求項６】 フレームワーク配列の１つまたは複数が、以下： ＨＣ−ＦＲ１がＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４）で あり； ＨＣ−ＦＲ２がＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５）であり； ＨＣ−ＦＲ３がＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６）であり； ＨＣ−ＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７）である 30 である、請求項５記載のポリペプチド。 【請求項７】 ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域と組み合わせた 請求項１記載の単離された重鎖ポリペプチドであって、ここで （ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列がＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号８）であり； （ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列がＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号９）であり； （ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列がＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１０）で あり；さらに、それにおいて：Ｘ４がＤまたはＶであり；Ｘ５がＶまたはＩであり；Ｘ６ がＳまたはＮであり；Ｘ７がＡまたはＦであり；Ｘ８がＶまたはＬであり；Ｘ９がＦまた はＴであり；Ｘ１０がＹまたはＡであり；Ｘ１１がＹ、Ｇ、Ｆ、またはＳであり；Ｘ１２ 40 がＬ、Ｙ、ＦまたはＷであり；Ｘ１３がＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＦまたはＩであり；Ｘ１４ がＨ、Ｖ、Ｐ、ＴまたはＩであり；Ｘ１５がＡ、Ｗ、Ｒ、ＰまたはＴである、重鎖ポリペ プチド。 【請求項８】 Ｘ４がＤであり；Ｘ５がＶであり；Ｘ６がＳであり；Ｘ７がＡであり；Ｘ８がＶであり ；Ｘ９がＦであり；Ｘ１０がＹであり；Ｘ１１がＹであり；Ｘ１２がＬであり；Ｘ１３が Ｙであり；Ｘ１４がＨであり；Ｘ１５がＡである、請求項７記載のポリペプチド。 【請求項９】 さらに、以下の式：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶ Ｒ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）の、ＨＶＲの間に 50 (3) JP 2012-511329 A 2012.5.24 並置された軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む、請求項７記載のポリペプチド。 【請求項１０】 フレームワーク配列が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項９記 載のポリペプチド。 【請求項１１】 フレームワーク配列が、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである、請求項１０ 記載のポリペプチド。 【請求項１２】 フレームワーク配列の１つまたは複数が、以下： ＬＣ−ＦＲ１がＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１）であ 10 り； ＬＣ−ＦＲ２がＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）であり； ＬＣ−ＦＲ３がＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３）であり； ＬＣ−ＦＲ４がＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４）である である、請求項１１記載のポリペプチド。 【請求項１３】 重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラ グメントであって、それにおいて： （ａ）重鎖がＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３を含み、それにおいて、 20 さらに： （ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列がＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号１）であり； （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列がＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２） であり； （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列がＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）であり；そして （ｂ）軽鎖がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３を含み、それにおいて、 さらに： （ｉｖ）ＨＶＲ−Ｌ１配列がＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号８）であり； （ｖ）ＨＶＲ−Ｌ２配列がＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号９）であり；および （ｖｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列がＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１０） 30 であり、 それにおいて：Ｘ１がＤまたはＧであり；Ｘ２がＳまたはＬであり；Ｘ３がＴまたはＳで あり；Ｘ４がＤまたはＶであってもよく；Ｘ５がＶまたはＩであってもよく；Ｘ６がＳま たはＮであってもよく；Ｘ７がＡまたはＦであってもよく；Ｘ８がＶまたはＬであっても よく；Ｘ９がＦまたはＴであってもよく；Ｘ１０がＹまたはＡであってもよく；Ｘ１１が Ｙ、Ｇ、Ｆ、またはＳであってもよく；Ｘ１２がＬ、Ｙ、ＦまたはＷであってもよく；Ｘ １３がＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＦまたはＩであってもよく；Ｘ１４がＨ、Ｖ、Ｐ、Ｔまたは Ｉであってもよく；Ｘ１５がＡ、Ｗ、Ｒ、ＰまたはＴであってもよい である、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメント。 【請求項１４】 40 Ｘ１がＤであり；Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＴである、請求項１３記載の抗体または抗体 フラグメント。 【請求項１５】 Ｘ４＝Ｄ、Ｘ５＝Ｖ、Ｘ６＝Ｓ、Ｘ７＝ＡおよびＸ８＝Ｖ、Ｘ９＝Ｆ、およびＸ１０＝ Ｙ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｘ１２＝Ｌ、Ｘ１３＝Ｙ、Ｘ１４＝ＨおよびＸ１５＝Ａである、請求項 １３記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項１６】 Ｘ１＝Ｄ、Ｘ２＝ＳおよびＸ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｄ、Ｘ５＝Ｖ、Ｘ６＝Ｓ、Ｘ７＝Ａおよび Ｘ８＝Ｖ、Ｘ９＝Ｆ、およびＸ１０＝Ｙ、Ｘ１１＝Ｙ、Ｘ１２＝Ｌ、Ｘ１３＝Ｙ、Ｘ１４ ＝ＨおよびＸ１５＝Ａである、請求項１３記載の抗体または抗体フラグメント。 50 (4) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【請求項１７】 （ａ）式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２ ）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）の、ＨＶＲの間に並置され た重鎖可変領域フレームワーク配列、および （ｂ）式：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２） −（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のＨＶＲの間に並置された軽 鎖可変領域フレームワーク配列 をさらに含む、請求項１３∼１６いずれか１項記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項１８】 フレームワーク配列が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する、請求項１７ 10 記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項１９】 重鎖可変領域フレームワーク配列が、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワ ークである、請求項１８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２０】 フレームワーク配列の１つまたは複数が、以下： ＨＣ−ＦＲ１がＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４）で あり； ＨＣ−ＦＲ２がＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５）であり； ＨＣ−ＦＲ３がＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 20 配列番号６）であり； ＨＣ−ＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７）である である、請求項１９記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２１】 軽鎖可変領域フレームワーク配列が、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである 、請求項１８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２２】 フレームワーク配列の１つまたは複数が、以下： ＬＣ−ＦＲ１がＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１）であ り； 30 ＬＣ−ＦＲ２がＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）であり； ＬＣ−ＦＲ３がＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３）であり；そして ＬＣ−ＦＲ４がＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４）である である、請求項２１記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２３】 （ａ）可変重鎖フレームワーク配列が以下： （ｉ）ＨＣ−ＦＲ１がＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号 ４）であり； （ｉｉ）ＨＣ−ＦＲ２がＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５）であり； 40 （ｉｉｉ）ＨＣ−ＦＲ３がＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹ ＹＣＡＲ（配列番号６）であり； （ｉｖ）ＨＣ−ＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７）であり；そして （ｂ）可変軽鎖フレームワーク配列が以下： （ｉ）ＬＣ−ＦＲ１がＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１ ）であり； （ｉｉ）ＬＣ−ＦＲ２がＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）であり； （ｉｉｉ）ＬＣ−ＦＲ３がＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡ ＴＹＹＣ（配列番号１３）であり； （ｉｖ）ＬＣ−ＦＲ４がＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４）である 50 (5) JP 2012-511329 A 2012.5.24 である、請求項１８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２４】 ヒト定常領域をさらに含む、請求項２３記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２５】 定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択され る、請求項２４記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２６】 定常領域が、ＩｇＧ１である、請求項２５記載の抗体フラグメントの抗体。 【請求項２７】 マウス定常領域をさらに含む、請求項２３記載の抗体または抗体フラグメント。 10 【請求項２８】 定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、およびＩｇＧ３からなる群より選択 される、請求項２７記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項２９】 定常領域が、ＩｇＧ２Ａである、請求項２８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項３０】 低下したまたは最小のエフェクター機能を有する、請求項２５または２８記載の抗体ま たは抗体フラグメント。 【請求項３１】 最小のエフェクター機能が、エフェクターなしＦｃ突然変異に起因する、請求項３０記 20 載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項３２】 エフェクターなしＦｃ突然変異が、Ｎ２９７Ａである、請求項３１記載の抗体または抗 体フラグメント。 【請求項３３】 エフェクターなしＦｃ突然変異が、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである、請求項３１記載の 抗体または抗体フラグメント。 【請求項３４】 最小のエフェクター機能が、非糖鎖化に起因する、請求項３０記載の抗体または抗体フ ラグメント。 30 【請求項３５】 重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体または抗原結合性フラグメントであって、それ において： （ａ）重鎖が、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤ ＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）と少なくとも８５ %の全配列同一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配 列を含み、そして （ｂ）軽鎖が、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１ ８）、およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）と少なくとも８５%の全配列同一性を それぞれ有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む 40 抗体または抗原結合性フラグメント。 【請求項３６】 配列同一性が少なくとも９０%である、請求項３５記載の抗体または抗体フラグメント 。 【請求項３７】 （ａ）式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２ ）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のＨＶＲの間に並置された 重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワーク配列、および （ｂ）式：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２） −（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のＨＶＲの間に並置された軽 50 (6) JP 2012-511329 A 2012.5.24 鎖可変領域（ＶＬ）フレームワーク配列 をさらに含む、請求項３６記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項３８】 ヒトコンセンサス配列に由来するＶＨおよびＶＬフレームワーク領域をさらに含む、請 求項３７記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項３９】 ＶＨフレームワーク配列が、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由 来する、請求項３８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項４０】 ＶＨフレームワーク配列が、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワー 10 ク配列である、請求項３９記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項４１】 ＶＨフレームワーク配列が、以下： ＨＣ−ＦＲ１がＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４）で あり； ＨＣ−ＦＲ２がＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５）であり； ＨＣ−ＦＲ３がＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６）であり； ＨＣ−ＦＲ４がＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７）である である、請求項４０記載の抗体または抗体フラグメント。 20 【請求項４２】 ＶＬフレームワーク配列が、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶサブグル ープ配列に由来する、請求項３８記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項４３】 ＶＬフレームワーク配列が、ＫａｂａｔカッパＩコンセンサスフレームワーク配列であ る、請求項４２記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項４４】 ＶＬフレームワーク配列が以下： ＬＣ−ＦＲ１がＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１）であ り； 30 ＬＣ−ＦＲ２がＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）であり； ＬＣ−ＦＲ３がＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３）であり； ＬＣ−ＦＲ４がＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４）である である、請求項４３記載の抗体または抗体フラグメント。 【請求項４５】 重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラ グメントであって、それにおいて： （ａ）重鎖が、以下： ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡ 40 ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配 列番号２０）の重鎖配列と少なくとも８５%の配列同一性を有し、そして （ｂ）軽鎖が、以下： ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）の軽鎖配 列と少なくとも８５%の配列同一性を有する 抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメント。 【請求項４６】 50 (7) JP 2012-511329 A 2012.5.24 配列同一性が少なくとも９０%である、請求項４５記載の抗体または抗原結合性フラグ メント。 【請求項４７】 重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラ グメントであって、それにおいて： （ａ）重鎖が以下： ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配 列番号２０）の配列を含み、そして 10 （ｂ）軽鎖が以下： ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）の配列を 含む 抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメント。 【請求項４８】 請求項１３∼４７のいずれか１項記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメン トおよび少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む組成物。 【請求項４９】 20 請求項１∼１１のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする単離核酸。 【請求項５０】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメントの軽鎖または重鎖可変配列をコードす る単離された核酸であって、それにおいて： （ａ）重鎖が、さらに、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）と少なく とも８５%の配列同一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ− Ｈ３配列を含み、または （ｂ）軽鎖が、さらに、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配 列番号１８）、およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）と少なくとも８５%の配列同 30 一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む、単 離された核酸。 【請求項５１】 配列同一性が９０%である、請求項５０記載の核酸。 【請求項５２】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、さらに、ヒトコンセンサス配列に由来するＶＬおよびＶＨフレー ムワーク領域を含む、請求項５０記載の核酸。 【請求項５３】 ＶＨ配列が、ＫａｂａｔサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する、請求項 ５２記載の核酸。 40 【請求項５４】 ＶＬ配列が、ＫａｂａｔカッパＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶサブグループ配列に由来 する、請求項５２記載の核酸。 【請求項５５】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、マウス抗体に由来する定常領域を含む、請求項５０記載の核酸。 【請求項５６】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体がヒト抗体に由来する定常領域を含む、請求項５０記載の核酸。 【請求項５７】 定常領域が、ＩｇＧ１である、請求項５６記載の核酸。 【請求項５８】 50 (8) JP 2012-511329 A 2012.5.24 低下したまたは最小のエフェクター機能を有する、請求項５７記載の核酸。 【請求項５９】 最小のエフェクター機能が、エフェクターなしＦｃ突然変異に起因する、請求項５８記 載の核酸。 【請求項６０】 エフェクターなしＦｃ突然変異が、Ｎ２９７Ａである、請求項５９記載の核酸。 【請求項６１】 請求項４９∼６０のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。 【請求項６２】 請求項６１記載のベクターを含む宿主細胞。 10 【請求項６３】 真核生物である請求項６２記載の宿主細胞。 【請求項６４】 哺乳動物である請求項６３記載の宿主細胞。 【請求項６５】 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項６４記載の宿主細胞。 【請求項６６】 原核生物である請求項６２記載の宿主細胞。 【請求項６７】 Ｅ．ｃｏｌｉである請求項６６記載の宿主細胞。 20 【請求項６８】 請求項６２∼６７のいずれか１項記載の宿主細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合 性フラグメントをコードするベクターの発現のために適した条件下で培養すること、およ びその抗体またはフラグメントを回収することを含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を作製するため のプロセス。 【請求項６９】 請求項４８記載の組成物および少なくとも１つのＢＮＣＡ分子を含む、製造品。 【請求項７０】 請求項４８記載の組成物および少なくとも１つの化学療法剤を含む、製造品。 【請求項７１】 30 化学療法剤が、ゲムシタビンである、請求項７０記載の製造品。 【請求項７２】 請求項４８記載の組成物およびポジティブな同時刺激分子に対する少なくとも１つのア ゴニストを含む、製造品。 【請求項７３】 ＢＮＣＡアンタゴニストをさらに含む、請求項７２記載の製造品。 【請求項７４】 請求項４８記載の組成物および少なくとも１つの抗生物質を含む、製造品。 【請求項７５】 抗生物質が、抗ウイルス薬剤である、請求項７４記載の製造品。 40 【請求項７６】 抗ウイルス薬剤が、逆転写酵素阻害剤である、請求項７５記載の製造品。 【請求項７７】 逆転写酵素阻害剤が、ポリメラーゼ阻害剤である、請求項７６記載の製造品。 【請求項７８】 抗ウイルス薬剤が、プロテアーゼ阻害剤である、請求項７５記載の製造品。 【請求項７９】 請求項４８記載の組成物および少なくとも１つのワクチンを含む、製造品。 【請求項８０】 機能障害性Ｔ細胞に対する有効量の請求項４８記載の組成物の投与を含む、Ｔ細胞機能 50 (9) JP 2012-511329 A 2012.5.24 を増強する方法。 【請求項８１】 Ｔ細胞機能障害性障害に苦しむ患者に対して治療的有効量の請求項４８記載の組成物を 投与することを含む、Ｔ細胞機能障害性障害を処置する方法。 【請求項８２】 Ｔ細胞機能障害性障害が、感染である、請求項８１記載の方法。 【請求項８３】 感染が、慢性的である、請求項８２記載の方法。 【請求項８４】 Ｔ細胞機能障害性障害が、腫瘍免疫である、請求項８１記載の方法。 10 【請求項８５】 慢性感染が、持続的である、請求項８３記載の方法。 【請求項８６】 慢性感染が、潜在的である、請求項８３記載の方法。 【請求項８７】 慢性感染が、緩徐である、請求項８３記載の方法。 【請求項８８】 感染が、細菌、ウイルス、真菌、および原虫からなる群より選択される病原体に起因す る、請求項８２記載の方法。 【請求項８９】 20 病原体が、細菌であり、方法が、さらに抗菌薬剤の投与を含む、請求項８８記載の方法 。 【請求項９０】 病原体が、ウイルスであり、方法が、さらに抗ウイルス薬剤の投与を含む、請求項８８ 記載の方法。 【請求項９１】 病原体が、真菌であり、方法が、さらに抗真菌薬剤の投与を含む、請求項８８記載の方 法。 【請求項９２】 病原体が、原虫であり、方法が、さらに抗原虫薬剤の投与を含む、請求項８８記載の方 30 法。 【請求項９３】 ワクチンの投与をさらに含む、請求項８８記載の方法。 【請求項９４】 方法が、放射線治療、化学療法、標的治療、免疫療法、ホルモン治療、血管新生阻害、 および緩和ケアからなる群より選択される処置計画の適用をさらに含む、請求項８４記載 の方法。 【請求項９５】 腫瘍免疫が、乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液、胃、神経膠 腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頚部の癌、胃癌、および膵臓癌からなる群より選択される癌 40 に起因する、請求項８４記載の方法。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 関連出願 本願は、２００８年１２月９日に出願された米国仮出願第６１／１２１０９２号の３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）の下で優先権の利益を主張し、その開示が参照によりその全体が 本明細書に組み入れられる。 【０００２】 発明の属する技術分野 50 (10) JP 2012-511329 A 2012.5.24 本発明は、一般的に、免疫機能およびＴ細胞機能を増強すること（細胞媒介性免疫応答 のアップレギュレーションを含む）およびＴ細胞機能障害性障害の処置に関する。 【０００３】 発明の背景 Ｔ細胞に対する同時刺激または２つの別々のシグナルの提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ ）による休止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の広く受け入れられたモデルである。Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)。このモデルは、さらに、 非自己から自己の識別および免疫寛容を提供する。Bretscher et al., Science 169: 104 2-1049 (1970); Bretscher, P. A., P. N. A. S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)。一次シグナル、または抗原特異的シグナルが 10 、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関連して提示される外来抗原ペプチドの認識に続いて Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じて伝達される。二次または同時刺激シグナルが、抗原提示 細胞（ＡＰＣ）上で発現される同時刺激分子によりＴ細胞に送達され、Ｔ細胞のクローン 増殖、サイトカイン分泌物、およびエフェクター機能の促進を誘導する。Lenschow et al ., Ann. Rev. Immunol. 14: 233 (1996)。同時刺激の非存在において、Ｔ細胞は抗原刺激 に抵抗性になりうる、効果的な免疫応答を開始しない、さらに外来抗原に対する消耗また は寛容を招きうる。 【０００４】 簡単な２シグナルモデルは過度の単純化でありうる。なぜなら、ＴＣＲシグナルの強度 は、実際に、Ｔ細胞の活性化および分化に対して量的な影響を与えるからである。Viola 20 et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993) 。さらに、Ｔ細胞活性化が、ＴＣＲシグナル強度が高い場合、同時刺激シグナルの非存在 においてでさえ生じうる。より重要なことには、Ｔ細胞が、ポジティブおよびネガティブ の両方の二次同時刺激シグナルを受ける。そのようなポジティブおよびネガティブのシグ ナルの調節は、免疫寛容を保持し、自己免疫を予防しながら、宿主の保護免疫応答を最大 限にするために決定的である。 ネガティブの二次シグナルがＴ細胞寛容の誘導のために必要と思われ、一方ではポジテ ィブのシグナルがＴ細胞活性化を促進する。簡単な２シグナルモデルが依然としてナイー ブリンパ球についての妥当な説明を提供する一方で、宿主の免疫応答は動的なプロセスで あり、同時刺激シグナルは抗原に暴露されたＴ細胞に対しても提供されうる。 30 【０００５】 同時刺激の機構は、治療上の興味である。なぜなら、同時刺激シグナルの操作が、細胞 ベースの免疫応答を増強または終結させるための手段を提供することが示されているから である。最近、Ｔ細胞機能障害またはアネルギーが、阻害的受容体、プログラム死１ポリ ペプチド（ＰＤ−１）の発現誘導および持続と同時に生じることが発見されている。結果 として、ＰＤ−１およびＰＤ−１との相互作用を通じてシグナル伝達する他の分子、例え ばプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２） などを治療的に標的化することが、強い興味の分野である。ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の阻 害は、癌（例、腫瘍免疫）および感染（急性および慢性（例、持続的）感染を含む）の処 置のためにＴ細胞免疫を増強するための手段として提案されている。しかし、この経路に 40 おける標的に対する最適な治療法が、まだ商業化されていないため、有意なまだ対処され ていない医療ニーズが、存在する。 【０００６】 発明の概要 本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（そのような抗体をコードする核酸およびそのような抗体 を含む組成物を含む）、および細胞媒介性免疫応答をアップレギュレーションするために Ｔ細胞機能を増強させるためのそれらの使用およびＴ細胞機能障害性障害（感染（例、急 性および慢性）および腫瘍免疫を含む）の処置を提供する。 【０００７】 一実施態様において、本発明は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３配 50 (11) JP 2012-511329 A 2012.5.24 列を含む単離された重鎖可変領域ポリペプチドを提供し、それにおいて： （ａ）ＨＶＲ−Ｈ１配列がＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号１）であり； （ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列がＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）で あり； （ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列がＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）であり； さらに、それにおいて：Ｘ１がＤまたはＧであり；Ｘ２がＳまたはＬであり；Ｘ３がＴま たはＳである。１つの特定の局面において、Ｘ１がＤであり；Ｘ２がＳであり、およびＸ ３がＴである。別の局面において、ポリペプチドは、さらに、以下の式のＨＶＲの間に並 置された重鎖可変領域フレームワーク配列：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（Ｈ Ｃ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ 10 ４）を含む。さらに別の局面において、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレー ムワーク配列に由来する。さらなる局面において、フレームワーク配列は、ＶＨサブグル ープＩＩＩコンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、フレームワーク 配列の少なくとも１つは以下： ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４）で あり； ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５）であり； ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６）であり； ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７） 20 である。 さらなる局面において、重鎖ポリペプチドは、さらに、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、 およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域と組み合わされ、それにおいて： （ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号８）であり； （ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号９）であり； （ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１０）で あり； さらに、それにおいて：Ｘ４はＤまたはＶであり；Ｘ５はＶまたはＩであり；Ｘ６はＳま たはＮであり；Ｘ７はＡまたはＦであり；Ｘ８はＶまたはＬであり；Ｘ９はＦまたはＴで あり；Ｘ１０はＹまたはＡであり；Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ，またはＳであり；Ｘ１２はＬ、 30 Ｙ、ＦまたはＷであり；Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＦまたはＩであり；Ｘ１４はＨ、 Ｖ、Ｐ、ＴまたはＩであり；Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、ＰまたはＴである。 さらなる局面において、Ｘ４はＤであり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり；Ｘ７はＡ であり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦであり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであり；Ｘ１ ２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＨであり；Ｘ１５はＡである。さらなる局面 において、軽鎖は、さらに、以下の式のＨＶＲの間に並置された軽鎖可変領域フレームワ ーク配列：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２） −（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）を含む。さらなる局面におい て、フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる 局面において、フレームワーク配列は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである 40 。さらなる局面において、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下： ＬＣ−ＦＲ１はＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１）であ り； ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２）であり； ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３）であり； ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４） である。 【０００８】 別の実施態様において、本発明は、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離された抗Ｐ 50 (12) JP 2012-511329 A 2012.5.24 Ｄ−Ｌ１抗体または抗原結合性フラグメントを提供し、それにおいて： （ａ）重鎖は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ−Ｈ３を含み、それにおいて 、さらに： （ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列はＧＦＴＦＳＸ１ＳＷＩＨ（配列番号１）であり； （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＡＷＩＸ２ＰＹＧＧＳＸ３ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２） であり； （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）であり；そして （ｂ）軽鎖はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３を含み、それにおいて、 さらに： （ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＲＡＳＱＸ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７Ｘ８Ａ（配列番号８）であり； 10 （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＳＡＳＸ９ＬＸ１０Ｓ（配列番号９）であり；および （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＱＱＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＰＸ１５Ｔ（配列番号１０ ）である。 【０００９】 さらに、それにおいて：Ｘ１はＤまたはＧであり；Ｘ２はＳまたはＬであり；Ｘ３はＴ またはＳであり；Ｘ４はＤまたはＶであり；Ｘ５はＶまたはＩであり；Ｘ６はＳまたはＮ であり；Ｘ７はＡまたはＦであり；Ｘ８はＶまたはＬであり；Ｘ９はＦまたはＴであり； Ｘ１０はＹまたはＡであり；Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｆ，またはＳであり；Ｘ１２はＬ、Ｙ、Ｆ またはＷであり；Ｘ１３はＹ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＦまたはＩであり；Ｘ１４はＨ、Ｖ、Ｐ 、ＴまたはＩであり；Ｘ１５はＡ、Ｗ、Ｒ、ＰまたはＴである。特定の局面において、Ｘ 20 １はＤであり；Ｘ２はＳであり；およびＸ３はＴである。別の局面において、Ｘ４はＤで あり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり；Ｘ７はＡであり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦで あり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであり；Ｘ１２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ １４はＨであり；Ｘ１５はＡである。さらに別の局面において、Ｘ１はＤであり；Ｘ２は Ｓであり；およびＸ３はＴであり；Ｘ４はＤであり；Ｘ５はＶであり；Ｘ６はＳであり； Ｘ７はＡであり；Ｘ８はＶであり；Ｘ９はＦであり；Ｘ１０はＹであり；Ｘ１１はＹであ り；Ｘ１２はＬであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＨであり；およびＸ１５はＡである 。 【００１０】 さらなる局面において、重鎖可変領域は、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複 30 数のフレームワーク配列：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、そし て軽鎖可変領域は、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレームワーク配列 ：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ −ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）を含む。さらなる局面において、フレ ームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる局面にお いて、重鎖フレームワーク配列は、KabatサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由 来する。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコ ンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列の１ つまたは複数は以下： 40 ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４） ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５） ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６） ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７） である。 【００１１】 さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列は、KabatカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、ま たはＩＶサブグループ配列に由来する。さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列 は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、軽鎖フレ 50 (13) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ームワーク配列の１つまたは複数は、以下： ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１） ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２） ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３） ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４） である。 【００１２】 さらなる特定の局面において、抗体はさらに、ヒトまたはマウス定常領域を含む。さら なる局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ 10 ４からなる群より選択される。さらなる特定の局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１ である。さらなる局面において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ 、ＩｇＧ３からなる群より選択される。さらなる局面において、マウス定常領域は、Ｉｇ Ｇ２Ａである。さらなる特定の局面において、抗体は、低下したまたは最小のエフェクタ ー機能を有する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は、「エフェク ターなし（effector-less）Ｆｃ突然変異」または非糖鎖化（aglycosylation）に起因す る。さらなる実施態様において、エフェクターなしＦｃ突然変異は、定常領域中のＮ２９ ７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換である。 【００１３】 さらに別の実施態様において、本発明は、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ− 20 Ｌ１抗体を提供し、それにおいて： （ａ）重鎖は、さらに、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）と少なく とも８５%の配列同一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ− Ｈ３配列を含み、または （ｂ）軽鎖は、さらに、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配 列番号１８）、およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）と少なくとも８５%の配列同 一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。 【００１４】 特定の局面において、配列同一性は、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９ 30 ２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、または１００%である。別の 局面において、重鎖可変領域は、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレー ムワーク配列：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、そして軽鎖可変 領域は、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレームワーク配列：（ＬＣ− ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３） −（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）を含む。さらに別の局面において、フレームワー ク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる局面において、重 鎖フレームワーク配列は、KabatサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。 さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサ 40 スフレームワークである。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列の１つまたは 複数は、以下： ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４） ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５） ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６） ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７） である。 【００１５】 さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列は、KabatカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、ま 50 (14) JP 2012-511329 A 2012.5.24 たはＩＶサブグループ配列に由来する。さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列 は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、軽鎖フレ ームワーク配列の１つまたは複数は、以下： ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１） ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２） ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３） ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４） である。 【００１６】 10 さらなる特定の局面において、抗体はさらに、ヒトまたはマウス定常領域を含む。さら なる局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ ４からなる群より選択される。さらなる特定の局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１ である。さらなる局面において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ 、ＩｇＧ３からなる群より選択される。さらなる局面において、マウス定常領域は、Ｉｇ Ｇ２Ａである。さらなる特定の局面において、抗体は、低下したまたは最小のエフェクタ ー機能を有する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は「エフェクタ ーなしＦｃ突然変異」または非糖鎖化に起因する。さらなる実施態様において、エフェク ターなしＦｃ突然変異は、定常領域中のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換で ある。 20 【００１７】 さらなる実施態様において、本発明は、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離された 抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、それにおいて： （ａ）重鎖は、以下： ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配 列番号２０）の重鎖配列と少なくとも８５%の配列同一性を有し、または （ｂ）軽鎖は、以下： ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰ 30 ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１） の軽鎖配列と少なくとも８５%の配列同一性を有する。 【００１８】 特定の局面において、配列同一性は、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９ ２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、または１００%である。別の 局面において、重鎖可変領域は、、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレ ームワーク配列：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ− Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、そして軽鎖可 変領域は、、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレームワーク配列：（Ｌ 40 Ｃ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）を含む。さらに別の局面において、フレーム ワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる局面において 、重鎖フレームワーク配列は、KabatサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来す る。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセ ンサスフレームワークである。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列の１つま たは複数は以下： ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４） ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５） ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 50 (15) JP 2012-511329 A 2012.5.24 配列番号６） ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７） である。 【００１９】 さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列は、KabatカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、ま たはＩＶサブグループ配列に由来する。さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列 は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、軽鎖フレ ームワーク配列の１つまたは複数は、以下： ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１） ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２） 10 ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３） ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４） である。 【００２０】 さらなる特定の局面において、抗体はさらに、ヒトまたはマウス定常領域を含む。さら なる局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ ４からなる群より選択される。さらなる特定の局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１ である。さらなる局面において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ 、ＩｇＧ３からなる群より選択される。さらなる局面において、マウス定常領域は、Ｉｇ 20 Ｇ２Ａである。さらなる特定の局面において、抗体は、低下したまたは最小のエフェクタ ー機能を有する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は、原核細胞に おける産生に起因する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は、「エ フェクターなしＦｃ突然変異」または非糖鎖化に起因する。さらなる実施態様において、 エフェクターなしＦｃ突然変異は定常領域中のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ 置換である。 【００２１】 さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体との 組み合わせで上に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含む組成物を提供する。 【００２２】 30 さらなる実施態様において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖または重鎖可変領域配 列をコードする単離核酸を提供し、それにおいて： （ａ）重鎖は、さらに、ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１５）、ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６）、およびＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号３）と少なく とも８５%の配列同一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、およびＨＶＲ− Ｈ３配列を含み、そして （ｂ）軽鎖は、さらに、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１７）、ＳＡＳＦＬＹＳ（配 列番号１８）、およびＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１９）と少なくとも８５%の配列同 一性をそれぞれ有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。 【００２３】 40 特定の局面において、配列同一性は、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９ ２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、または１００%である。局面 において、重鎖可変領域は、、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレーム ワーク配列：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２ ）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、そして軽鎖可変領 域は、、以下のＨＶＲの間に並置された１つまたは複数のフレームワーク配列：（ＬＣ− ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３） −（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）を含む。さらに別の局面において、フレームワー ク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来する。さらなる局面において、重 鎖フレームワーク配列は、KabatサブグループＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ配列に由来する。 50 (16) JP 2012-511329 A 2012.5.24 さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサ スフレームワークである。さらなる局面において、重鎖フレームワーク配列の１つまたは 複数は、以下： ＨＣ−ＦＲ１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号４） ＨＣ−ＦＲ２ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号５） ＨＣ−ＦＲ３ ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ 配列番号６） ＨＣ−ＦＲ４ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７） である。 【００２４】 10 さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列は、KabatカッパＩ、ＩＩ、ＩＩ、ま たはＩＶサブグループ配列に由来する。さらなる局面において、軽鎖フレームワーク配列 は、ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワークである。さらなる局面において、軽鎖フレ ームワーク配列の１つまたは複数は以下： ＬＣ−ＦＲ１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１１） ＬＣ−ＦＲ２ ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１２） ＬＣ−ＦＲ３ ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ 配列番号１３） ＬＣ−ＦＲ４ ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４） である。 20 【００２５】 さらなる特定の局面において、抗体はさらに、ヒトまたはマウス定常領域を含む。さら なる局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ ４からなる群より選択される。さらなる特定の局面において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１ である。さらなる局面において、マウス定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ 、ＩｇＧ３からなる群より選択される。さらなる局面において、マウス定常領域は、Ｉｇ Ｇ２Ａである。さらなる特定の局面において、抗体は、低下したまたは最小のエフェクタ ー機能を有する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は、原核細胞に おける産生に起因する。さらなる特定の局面において、最小のエフェクター機能は、「エ フェクターなしＦｃ突然変異」または非糖鎖化に起因する。さらなる局面において、エフ 30 ェクターなしＦｃ突然変異は定常領域中のＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換 である。 【００２６】 さらなる局面において、核酸は、さらに、以前に記載した抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれか をコードする核酸の発現のために適したベクターを含む。さらなる特定の局面において、 ベクターは、さらに、核酸の発現のために適した宿主細胞を含む。さらなる特定の局面に おいて、宿主細胞は、真核細胞または原核細胞である。さらなる特定の局面において、真 核細胞は、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）などである。 【００２７】 さらなる実施態様において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性フラグ 40 メントを作製するプロセスを提供し、以前に記載した抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかまたは 抗原結合性フラグメントをコードする核酸を発現のために適した形態で含む宿主細胞を、 そのような抗体またはフラグメントを産生するために適した条件下で培養すること、およ び抗体またはフラグメントを回収することを含む。 【００２８】 さらなる実施態様において、本発明は、本明細書で提供する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはそ の抗原結合性フラグメントおよび少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体を含む組成物 を提供する。 【００２９】 さらなる実施態様において、本発明は、本明細書で開示する治療的有効量の組成物を同 50 (17) JP 2012-511329 A 2012.5.24 封した容器およびＴ細胞機能障害性障害の処置のための使用を示す添付文書を含む、製造 品を提供する。 【００３０】 さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも１つのＢＮＣＡ分子との組み合わせ で上に記載する抗ＰＤ−Ｌ１組成物のいずれかを含む、製造品を提供する。一局面におい て、ＢＮＣＡ分子は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、ＢＮＣＡオリゴペプチド、ＢＮ ＣＡ ＲＮＡｉ、またはＢＮＣＡ小分子である。別の局面において、Ｂ７ネガティブ同時 刺激分子を、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７．１、Ｂ７−Ｈ３ 、およびＢ７−Ｈ４からなる群より選択する。 【００３１】 10 さらなる実施態様において、製造品は、化学療法剤との組み合わせで上に記載する抗Ｐ Ｄ−Ｌ１組成物のいずれかを含む。一局面において、化学療法剤は、ゲムシタビンである 。 【００３２】 さらなる実施態様において、本発明は、ポジティブ同時刺激分子の１つまたは複数のア ゴニストとの組み合わせで上に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含む、製造品を提 供する。一局面において、ポジティブ同時刺激分子は、Ｂ７ファミリー同時刺激分子であ る。別の局面において、ポジティブ同時刺激分子は、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ ＣＯＳ／ＩＣＯＳＬからなる群より選択される。さらに別の局面において、ポジティブ同 時刺激分子は、ＴＮＦＲファミリー同時刺激分子である。さらなる局面において、ＴＮＦ 20 Ｒ同時刺激分子は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７／ＣＤ ２７Ｌ、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ、およびＨＶＥＭ／ＬＩＧＨＴ、ならびにその可溶性フラ グメント、構築物、およびアゴニスト抗体からなる群より選択される。 【００３３】 さらなる実施態様において、本発明は、１つまたは複数の抗生物質との組み合わせで上 に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含む、製造品を提供する。一局面において、抗 生物質は、抗ウイルス薬剤、抗菌薬剤、抗真菌薬剤、抗原虫薬剤からなる群より選択され る。 【００３４】 別の局面において、抗ウイルス薬剤は、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、イン 30 テグラーゼ阻害剤、侵入または融合阻害剤、成熟阻害剤、ウイルス放出阻害剤、免疫応答 エンハンサー、抗ウイルス相乗エンハンサー、ワクチン、肝臓アゴニスト、および生薬か らなる群より選択される。さらに別の局面において、組み合わせは、抗ウイルス薬剤の１ つまたは複数のカテゴリーを含む。 【００３５】 さらなる実施態様において、本発明は、１つまたは複数のワクチンとの組み合わせで上 に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含む、製造品を提供する。 【００３６】 さらなる実施態様において、本発明は、上に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体または組成物の いずれかの有効量を投与することを含む、Ｔ細胞機能を増強する方法を提供する。一局面 40 において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または組成物は、機能障害性Ｔ細胞を非機能障害性にする。 【００３７】 さらなる実施態様において、本発明は、上に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体または組成物の いずれかの治療的有効量を投与することを含む、Ｔ細胞機能障害性障害を処置する方法を 提供する。１つの特定の局面において、Ｔ細胞機能障害性障害は、感染または腫瘍免疫で ある。別の局面において、感染は急性または慢性である。別の局面において、慢性感染は 、持続的、潜在的、または緩徐である。さらに別の局面において、慢性感染は、細菌、ウ イルス、真菌、および原虫からなる群より選択される病原体に起因する。さらなる局面に おいて、宿主における病原体レベルは、低下される。さらなる局面において、方法はさら に、ワクチンを用いた処置を含む。さらなる局面において、方法はさらに、抗生物質を用 50 (18) JP 2012-511329 A 2012.5.24 いた処置を含む。さらなる局面において、病原体は、細菌であり、方法はさらに、抗菌薬 剤の投与を含む。さらなる局面において、細菌は、マイコバクテリウム属、サルモネラ属 、リステリア属、ストレプトコッカス属、ヘモフィルス属、ナイセリア属、クレブシエラ 属、ボレリア属、バクテロイデスフラジリス（Bacterioides fragillis）、トレポネーマ 属、およびヘリコバクターピロリ（Helicobacer pylori）からなる群より選択される。さ らなる局面において、病原体は、ウイルスであり、方法はさらに、抗ウイルス薬剤の投与 を含む。さらなる局面において、ウイルスは、Ｂ型、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルスＩ 、ＩＩ、ヒト免疫不全症ウイルスＩ、ＩＩ、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ、ＩＩ、水痘帯状疱疹か らなる群より選択される。さらなる局面において、病原体は、真菌であり、方法はさらに 10 、抗真菌薬剤の投与を含む。さらなる局面において、障害は、アスペルギルス症、ブラス トミセス症、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、パラコ クシジオイデス症、微胞子虫症からなる群より選択される。さらなる局面において、病原 体は、原虫であり、方法はさらに、抗原虫薬剤の投与を含む。さらなる局面において、障 害は、リーシュマニア症、プラスモディウム症（即ち、マラリア）、クリプトスポリジウ ム症、トキソプラズマ症、トリパノゾーマ症、および蠕虫感染（吸虫（例、住血吸虫症） 、条虫（例、エキノコックス症）、および線虫（例、旋毛虫症、回虫症、フィラリア症、 および糞線虫症）に起因するものを含む）からなる群より選択される。 【００３８】 さらなる局面において、Ｔ細胞機能障害性障害は、腫瘍免疫である。さらなる局面にお 20 いて、ＰＤ−Ｌ１抗体または組成物を、放射線治療、化学療法、標的治療、免疫療法、ホ ルモン治療、血管新生阻害、および緩和ケアからなる群より選択される従来の治療をさら に含む処置計画と組み合わせる。さらなる特定の局面において、化学療法の処置は、ゲム シタビン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンからな る群より選択される。さらなる特定の局面において、腫瘍免疫は、乳房、肺、結腸、卵巣 、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頚部の 癌、胃癌、および膵臓癌からなる群より選択される癌に起因する。 【図面の簡単な説明】 【００３９】 【図１】図１は、細胞表面分子のＢ７ファミリーによるＴ細胞の同時刺激を描く図示的な 30 例示である。 【図２】図２は、ＰＭＥＬ／Ｂ１６ Ｔ細胞刺激アッセイの実験デザインを示す概略図で ある。 【図３】図３は、メラニン細胞ペプチドｇｐ１００に応答したＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞 における増強したＩＦＮ−γ産生を通じた抗原特異的Ｔ細胞機能に対する抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの効果を示す棒グラフである。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージおよ びＩＦＮ−γ産生のそれらのレベルの両方が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在における刺激の間 に増加された。 【図４】図４は、ＯｖａパルスＡ２０ Ｂ細胞／ｍＰＤ−Ｌ１ ＡＰＣを用いた二次刺激 における抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ ＹＷ２４３．５５．Ｓ１によるＯｖａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細 40 胞の増殖における増強を通じた抗原特異的Ｔ細胞機能に対する抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの効果 を示す棒グラフである。 【図５】図５は、混合リンパ球反応における抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ１によ るヒトＣＤ８Ｔ細胞の増殖における増強を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ＣＦＳＥ の強度において希釈により測定された増殖性細胞のパーセントも報告されている。 【図６】図６は、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ ＹＷ２４３．５５Ｓ７０のキメラ形態を用いた慢 性ＬＣＭＶの処置の実験デザインの概略図である。矢印は、２×１０６pfuクローン１３ ＬＣＭＶを用いた感染後１４日目に開始された６用量の抗ＰＤ−Ｌ１のタイミングを示す 。 【図７】図７Ａおよび７Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０による慢 50 (19) JP 2012-511329 A 2012.5.24 性ＬＣＭＶ感染のｉｎ ｖｉｖｏでの処置に続くｅｘ ｖｉｖｏでの細胞における増強さ れたＣＤ８エフェクター機能を示すグラフである。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０によるＰＤ −Ｌ１の遮断が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱果粒を増加させ（表面ＣＤ１０７Ａの増加により測 定される）（図７Ａ）、ＬＣＭＶペプチドｇｐ３３に応答して%ＩＦＮ−ガンマ産生細胞 を増加させた（図７Ｂ）。ｇｐ３３特異的細胞の頻度を、Ｈ２−Ｄｂ ｇｐ３３ペンタマ ーを用いた染色により明らかにした。 【図８】図８Ａおよび８Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの処置に続く 慢性ＬＣＭＶ感染における血液および組織ＬＣＭＶ力価における低下を示す。図８Ａにお いて、種々の示された組織からのウイルス力価を、それぞれＡｂ処置後の２１日目および ２８日目、１週間目および２週間目に分析した。図８Ｂにおいて、血清ウイルス力価を０ 10 、７、１４、２１、および２８日目に分析し、ＬＣＭＶ接種が０日目に生じて、処置が１ ４日目に始まる。 【図９】図９Ａは、樹立された腫瘍の治療的処置（腫瘍が２５０mm３である１４日目に開 始された処置）に続く抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適用の結果として、ＭＣ３８．Ｏｖａ結腸癌腫 瘍増殖における有意な低下を示す。図９Ｂは、フローサイトメトリーにより測定された組 織培養におけるＭＣ３８．Ｏｖａ細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現の表面レベルを示すヒスト グラムである。ＰＤ−Ｌ２は、ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞により発現されない。 【図１０】図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍の増殖に対す るＰＤ−Ｌ１遮断処置単独および抗ＶＥＧＦまたはゲムシタビンとの組み合わせの効果を 示すグラフである。 20 【図１１Ａ】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ−Ｌ １抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を伴う ＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ｂ】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ−Ｌ １抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を伴う ＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【００４０】 好ましい実施態様の詳細な説明 本明細書で言及した全ての参考文献が、参照により具体的に組み入れられる。 【００４１】 30 一般的な技術 本発明の実行は、特記なき場合、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え 技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そ のような技術は文献において十分に説明される。例えば、Molecular Cloning: A Laborat ory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M .J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reac tion, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)。 40 【００４２】 Ｉ．宿主免疫 Ａ．リンパ球の発生および活性化 ヒトにおける２つの主な型のリンパ球はＴ（胸腺由来）およびＢ（骨髄由来）である。 これらの細胞は、リンパ系発生経路にコミットした骨髄および胎児肝臓中の造血幹細胞に 由来する。これらの幹細胞の子孫は、ＢまたはＴリンパ球中に成熟する多岐にわたる経路 に従う。ヒトＢリンパ球の発生は、完全に骨髄内で起こる。Ｔ細胞は、他方で、骨髄を離 れ、血流を通じて胸腺まで移動する未成熟な前駆体から発生し、そこで、それらは、増殖 し、成熟Ｔリンパ球に分化する。 【００４３】 50 (20) JP 2012-511329 A 2012.5.24 胸腺または骨髄から出現する成熟リンパ球は静止、または「休止」状態にあり、即ち、 それらは有糸分裂的に不活性である。血流中に分散した場合、これらの「ナイーブ」また は「処女」リンパ球は、種々の二次または末梢のリンパ系器官（例えば脾臓、リンパ節、 または扁桃腺など）中に移動する。大半の処女リンパ球が固有の短い寿命を有し、骨髄ま たは胸腺を離れた後、数日以内に死ぬ。しかし、そのような細胞が抗原の存在を示すシグ ナルを受ける場合、それらは活性化し、連続ラウンドの細胞分裂を起こす。結果として得 られる子孫細胞の一部が、次に、休止状態に戻り、刺激アレルゲンとの次の遭遇のために 本質的に初回刺激された記憶リンパ球 − ＢおよびＴ細胞になる。活性化された処女リ ンパ球の他の子孫は、エフェクター細胞であり、数日間だけ生き残るが、しかし、特定の 防御活性を行う。 10 【００４４】 リンパ球の活性化は、休止リンパ球が刺激されて、分裂し、子孫（その一部がエフェク ター細胞になる）を産生する際に通過する順序付けられた連続事象を指す。完全応答は、 細胞増殖の誘発（有糸分裂誘発）および免疫学的機能の発現の両方を含む。リンパ球は、 特定のリガンドがそれらの表面上の受容体に結合する際に活性化される。リガンドは、Ｔ 細胞およびＢ細胞について異なるが、しかし、結果として得られる細胞内生理学的機構は 類似している。 【００４５】 一部の外来抗原自体がリンパ球の活性化、特に、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンを架橋 する大きなポリマー抗原、またはＴ細胞上の他の糖タンパク質を誘導することができる。 20 しかし、大半の抗原は、ポリマーでなく、大多数のＢ細胞への直接的な結合でさえ、活性 化をもたらさない。これらのより共通の抗原は、それらが近くの活性化ヘルパーＴリンパ 球と共に同時刺激された際にＢ細胞を活性化する。そのような刺激は、Ｔ細胞により分泌 されるリンホカインから生じうるが、しかし、Ｂ細胞と、特定のＢ細胞表面受容体と相互 作用し、二次シグナルを生成するＴ細胞表面タンパク質との直接的な接触により最も効率 的に伝達される。 【００４６】 Ｂ．Ｔ細胞 Ｔリンパ球は免疫グロブリンを発現せず、しかし、代わりに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ） と呼ばれる表面タンパク質により外来物質の存在を検出する。これらの受容体は、直接的 30 な接触によりまたは他の免疫細胞の活性に影響を与えることを通じて抗原を認識する。マ クロファージと一緒に、Ｔ細胞は細胞媒介性免疫に関与する一次細胞型である。 【００４７】 Ｂ細胞とは異なり、Ｔ細胞は、特定の状況においてだけ外来物質を検出することができ る。特に、Ｔリンパ球は、外来タンパク質を、それが最初に小さなペプチドに切断された 場合にだけ認識し、それらは次に抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる二次宿主細胞の表面 上に提示される。多くの型の宿主細胞が一部の条件下で抗原を提示することができるが、 しかし、特定の型は、この目的のために、より特異的に適応され、Ｔ細胞活性（マクロフ ァージおよび他のＢ細胞を含む）を制御する際に特に重要である。抗原提示は、提示細胞 の表面上での、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質と呼ばれる特定のタンパク質に 40 部分的に依存する。このように、細胞媒介性免疫を刺激するために、外来ペプチドがＭＨ Ｃペプチドとの組み合わせでＴ細胞に提示されなくてはならず、この組み合わせがＴ細胞 受容体により認識されなくてはならない。 【００４８】 ２つの有意なＴ細胞サブセットがある：細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ ）およびヘルパーＴ細胞（ＴＨ）細胞、それらはマーカーＣＤ８およびＣＤ４の細胞表面 発現に基づき大まかに同定されうる。Ｔｃ細胞はウイルス防御において重要であり、特定 の細胞表面発現ウィルスペプチドを認識することにより直接的にウイルスを殺すことがで きる。ＴＨ細胞は、他の細胞型の増殖、成熟、および免疫学的機能（例、Ｂ細胞、マクロ ファージ、および細胞傷害性Ｔ細胞の活性を制御するためのリンホカイン分泌）を促進す 50 (21) JP 2012-511329 A 2012.5.24 る。処女Ｔリンパ球および記憶Ｔリンパ球の両方が、通常は静止状態のままであり、この 状態において、それらは有意なヘルパー活性または細胞傷害活性を示さない。活性化され た場合、これらの細胞は数ラウンドの有糸分裂を起こし、娘細胞を産生する。これらの娘 細胞の一部が記憶細胞として静止状態に戻るが、しかし、他はヘルパー活性または細胞傷 害活性を活発に発現するエフェクター細胞になる。これらの娘細胞はそれらの親に似てい る：ＣＤ４＋細胞はＣＤ４＋子孫だけを産生することができ、ＣＤ８＋細胞はＣＤ８＋子 孫だけを産出する。エフェクターＴ細胞は、休止Ｔ細胞上では発現されない細胞表面マー カー（例えばＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４０Ｌ、トランスフェリン受容体、お よびクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質など）を発現する。活性化刺激が取り除かれた場合、 細胞傷害活性またはヘルパー活性は、エフェクター細胞が死ぬかまたは静止状態に戻るに 10 つれて、数日間の期間にわたり徐々に鎮静する。 【００４９】 Ｂ細胞活性化に類似し、大半の抗原に対するＴリンパ球応答も２つの型の同時刺激を必 要とする。最初は抗原であり、それは、抗原提供細胞上のＭＨＣタンパク質により適切に 提示された場合、Ｔ細胞受容体により認識および結合されることができる。この抗原−Ｍ ＨＣ複合体は細胞内部にシグナルを送り、それは、通常、Ｔ細胞活性化をもたらすために は不十分である。完全活性化（例えばヘルパーＴ細胞を用いて生じる）は、抗原提示細胞 の表面上に発現される同時刺激因子と呼ばれる他の特定のリガンドを用いた同時刺激を必 要とする。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、他方で、一般的に、ＩＬ−２（活性化ヘルパー Ｔ細胞により分泌されるサイトカイン）を必要とする。 20 【００５０】 Ｃ．免疫応答 他の身体の防御から区別される哺乳動物の免疫系の３つの一次機能特性は、以下：（１ ）特異性 − 大多数の標的分子の間で個別に認識するおよび応答するまたは応答しない 能力、（２）識別 − 非自己から自己を決定するための能力（全ての無数のタンパク質 および他の有機物質と穏やかに共存し、依然として身体に導入される外来物質に対してウ イルス学的に応答するようにする）、および（３）記憶 − 経験により形成される能力 （特定の外来病原体との後の遭遇が、最初の遭遇で生じたよりも迅速で活発な応答を惹起 する）を含む。これらの機能の１つまたは複数が失敗している場合、病理学的状態がもた らされる。 30 【００５１】 処女リンパ球が一次リンパ系器官から末梢中へ持続的に放出され、各々が抗原結合を可 能にする表面受容体を運ぶ。Ｂ細胞における抗原結合が表面結合免疫グロブリンを通じて 媒介されるのに対し、Ｔ細胞において、それはＴ細胞受容体により媒介される。処女リン パ球が活性化される場合、それらは増殖し、活性化および増殖のさらなるサイクルを次に 起こしうる娘細胞を産出する。所与の抗原に対する応答のスピードおよび強度は、大部分 がクローン選択により決定される：特定の抗原に特異的な娘細胞またはクローンの集団が 大きいほど、免疫応答を認識し、それに関与することができる細胞の数はより大きい。す べての免疫応答が、複雑で入り組んで調節される一連の事象であり、いくつかの細胞型を 含む。それは、免疫原が身体に入り、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる特殊化クラスの 40 細胞に遭遇した際に誘発される。これらのＡＰＣは微量の免疫原を捕捉し、抗原特異的ヘ ルパーＴリンパ球が認識することができる形態でそれを提示する。ヘルパーＴ細胞が次に 活性化され、その次に、他のクラスのリンパ球（例えばＢ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞な ど）の活性化を促進する。活性化リンパ球は次に増殖し、それらの特定のエフェクター機 能を行う。このプロセスの各段階で、リンパ球およびＡＰＣが、直接的な接触を通じてま たは調節性サイトカインを分泌することにより互いに連絡を取る。 【００５２】 ＡＰＣにより捕捉される外因性抗原は、抗原プロセシングと呼ばれる一連の変化を受け る。特にタンパク質性免疫原のそのようなプロセシングは、変性および部分的なタンパク 質分解消化を含み、免疫原は短いペプチドに切断される。結果として得られるペプチドの 50 (22) JP 2012-511329 A 2012.5.24 限られた数が、次に、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質と非共有結合的に会合し、ＡＰＣ表 面に輸送される（抗原提示として公知のプロセス）。ＡＰＣと直接接触するＣＤ４＋ヘル パーＴリンパ球が活性化されうるが、しかし、それは、ＡＰＣにより提示される特定のペ プチド−ＭＨＣ複合体を認識し、結合することができるＴ細胞受容体タンパク質を発現し た場合にだけ活性化される。 【００５３】 ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞は免疫応答の主要なオーケストレイターである。なぜなら、そ れらは、２つの他のリンパ系エフェクター細胞：細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞および抗体分 泌形質細胞の活性化のために必要とされるからである。ＴＨ活性化が免疫応答において早 期に生じ、少なくとも２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルが、ＡＰＣ表面上で 10 の抗原性ペプチド−ＭＨＣ複合体へのＴ細胞抗原受容体の結合により提供され、ＣＤ３タ ンパク質複合体を通じて伝達され、その一方で第２の、ＡＰＣを通じた同時刺激シグナル が、Ｔ細胞表面上の別々のシグナル伝達タンパク質の、ＡＰＣ上の特定のリガンドとの結 合に起因すると考えられる。１つの公知のそのような相互作用は、Ｔ細胞タンパク質ＣＤ ２８およびＢ７として公知のＡＰＣ表面タンパク質のファミリーである。他の表面タンパ ク質のペアも同時刺激を媒介しうる。同時刺激のプロセスを続いてより詳細に記載する。 本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１を通じたシグナル伝達により提供されるネガテ ィブな同時刺激シグナルの拮抗作用を通じて同時刺激を増強すると考えられる。 【００５４】 一緒に、２つのシグナルはヘルパーＴ細胞を誘導し、サイトカインインターロイキン２ 20 （ＩＬ−２）の分泌を開始させ、また、その表面上で特異的で高い親和性のＩＬ−２受容 体の発現を開始させる。ＩＬ−２は、Ｔリンパ球のための高度に強力な分裂促進因子であ り、活性化Ｔ細胞の増殖性応答に必須である。それが分泌される細胞に対するＩＬ−２の 効果 − オートクライン効果として公知の現象。Ｔ細胞が両方のシグナルを受けている 場合でさえ、それは、それ自体の表面ＩＬ−２受容体が遮断されている場合には増殖しな いであろうことがさらに示されている。ＩＬ−２は周辺の細胞に作用することもできる（ いわゆるパラクリン効果）。この効果は、Ｔｃ細胞を活性化するために特に重要であり、 それらは、一般的に、それら自体の増殖を刺激するために十分なＩＬ−２を産生しない。 ＩＬ−２に加えて、活性化ＴＨ細胞は他のサイトカインを分泌し、Ｂ細胞、マクロファー ジ、および他の細胞型の増殖、分化、および機能を促進する。 30 【００５５】 ＡＰＣと抗原特異的ＴＨ細胞の間での接触は、ＡＰＣに対する効果も有する − その 最も重要なものの１つはＩＬ−１の放出である。このサイトカインはオートクライン様式 で作用し、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質および種々の接着分子の表面発現を増加させ、 それによりＴＨ細胞の結合が強化され、抗原提示が増強されると考えられる。同時に、Ｉ Ｌ−１がＴＨ細胞に対してパラクリン様式に機能し、ＩＬ−２分泌およびＩＬ−２受容体 発現を促進する。 【００５６】 以前に記載された様式でのＴＨ細胞の活性化の間に、一部のＢ細胞が、それらが後に分 泌するであろう膜結合形態の抗体である、それらの抗原受容体を通じて免疫原を会合した 40 可能性もある。Ｔ細胞とは異なり、Ｂ細胞は、遊離の非プロセシング形態の免疫原を認識 する。特異的抗原結合は、Ｂ細胞活性化に導くことができるシグナルの１つの型を提供す る。第２の型が、活性化ＴＨ細胞により提供され、それらは、その表面上で非免疫グロブ リン受容体に結合することによりＢ細胞を活性化するのを助けるタンパク質を発現する。 これらのＴＨ由来シグナルは、その抗原特異性にかかわらず任意のＢ細胞に作用し、ヘル パー因子として公知である。これらのヘルパー因子はＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ− ６を含む。しかし、助けは細胞−細胞接触を通じてより効率的に達成され、それによって Ｔ細胞表面上のタンパク質がＢ細胞上のタンパク質と直接的に接触することが可能になる 。接触媒介性の助けの最も効果的な形態は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と呼ばれる タンパク質（それらが活性化された後にだけＴＨ細胞上で発現される）がＢ細胞上のＣＤ 50 (23) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ４０と呼ばれるタンパク質に結合する際に生じる。バイスタンダー活性化として公知のプ ロセスにおいて、活性化Ｂ細胞との接触は、その表面免疫グロブリンが抗原において会合 していなくても、休止Ｂ細胞を活性化するのに十分でありうる。 【００５７】 Ｔｃリンパ球が機能して、それらの表面上で外来抗原を発現する細胞（例えば、ウイル ス感染宿主細胞など）を絶滅させる。大半のＴｃ細胞がＣＤ４よりむしろＣＤ８を発現し 、故にクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質よりむしろクラスＩに関連する抗原を認識する。体 細胞がウイルスにより感染される場合、一部の免疫原性ウイルスタンパク質が細胞内でプ ロセシングを受けうるが、結果として得られるペプチドは次にクラスＩ ＭＨＣ分子との 表面複合体として現れうる。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は次に抗原特異的クローン 10 のＴ細胞受容体により認識され、Ｔｃ細胞活性化のために必要な２つのシグナルの１つを 提供しうる。この第１のシグナルは単独で、Ｔｃ細胞上に高親和性ＩＬ−２受容体を誘導 する。第２のシグナルは、近くの活性化ＴＨリンパ球から分泌されたＩＬ−２により供給 される。両方のシグナルを受けると、活性化Ｔｃ細胞は細胞傷害活性を得て、それが、そ れが結合した細胞、ならびに同じペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を持つ任意の他の細胞 を殺すことが可能になる。一部の場合において、死滅が生じる。なぜなら、Ｔｃが標的細 胞に特定の毒素を放出するためであり；他において、Ｔｃは標的細胞にアポトーシスによ る自殺を誘導する。活性化Ｔｃ細胞も増殖し、同じ抗原特異性を伴う追加のＴｃ細胞を与 える。 【００５８】 20 Ｄ．免疫グロブリンスーパーファミリーによる同時刺激： １．Ｂ７．１／Ｂ７．２ − ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ 恐らく、最も良く特徴付けられているＴ細胞同時刺激経路は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）／ Ｂ７．２（ＣＤ８６） − ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）を通じてシグナル伝 達する経路である。このシグナル伝達経路はＴ細胞の活性化および寛容に決定的である。 Karandikar et al., J. Neuroimmunol. 89: 10-18 (1998); Oosterwegal et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 294-300 (1999); Salomon et al., Annu. Rev. Immunol. 19: 225-2 52 (2001); Sansom, D. M., Immunol. 101: 169-177 (2000); Chambers et al., Annu. R ev. Immunol. 19: 565-592 (2001)。 【００５９】 30 Ｂ７．１［Freeman et al., J. Exp. Med. 174: 625-631 (1991); Freedman et al., J . Immunol. 137: 3260-3267 (1987); Yokochi et al., J. Immunol. 128: 823-827 (1982 )]およびB7.2[Freeman et al., Science 262: 909-911 (1993); Freeman et al., J. Exp . Med. 178: 2185-2192 (1993); Azuma et al., Nature 366: 76-79 (1993)］は、２つの 刺激受容体ＣＤ−２８およびＣＴＬＡ−４について二重特異性を有する。Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987); Gross et al., J. Immunol. 144: 3201-3210 (1990).ＣＤ２８がＴ細胞の表面上で恒常的に発現され［Gross et al., J. I mmunol. 149: 380-388 (1992)］、一方でＣＴＬＡ−４（より高い親和性の受容体）は、 Ｔ細胞活性化に続き迅速にアップレギュレーションされる発現を有する。Peach et al., J. Exp. Med. 180: 2049-2058 (1994); Linsley et al., J. Exp. Med. 176: 1595-1604 40 (1992); Kinsley et al., Immunity 1: 793-801 (1994); Linsley et al., Immunity 4: 535-543 (1996)。大半のＡＰＣ集団がＢ７．２を恒常的に低レベルで発現し、それは迅速 にアップレギュレーションされ、Ｂ７．１は、活性化後、後に誘導的に発現される。Free man et al., Science 262: 909-911 (1993); Hathcock et al., J. Exp. Med. 180: 631640 (1994)。Ｂ７．２の先行する発現およびマウスノックアウトデータは、Ｂ７．２が免 疫応答を開始するためのより重要な同時刺激分子であることを示唆するが、しかし、他の 点では２つの分子は大部分でオーバーラップする機能を有する。McAdam et al., Immuno. Rev. 165: 631-640 (1994)。 【００６０】 ＣＤ２８がＢ７．１およびＢ７．２と相互作用し、ＴＣＲシグナルと共同するシグナル 50 (24) JP 2012-511329 A 2012.5.24 を伝達し、Ｔ細胞活性化を促進する。Lenschow et al., Annu. Rev. Immunol. 165: 233258 (1996); Lanzavecchia et al., Cell 96: 1-4 (1999)。ＴＣＲシグナルの非存在にお いて、ＣＤ２８シグナル伝達は生理学的な有意性を有さない。ＣＤ２８シグナル伝達はＴ 細胞活性化についての閾値を調節し、Ｔ細胞活性化のために必要とされるＴＣＲ会合の数 を有意に減少させる。Viola et al., Science 273: 104-106 (1996)。ＣＤ２８活性化は Ｔ細胞生存を促進することによりＴ細胞応答を持続し、それによりサイトカインがＴ細胞 クローン増殖および分化を開始することが可能になる。Thompson et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 86: 1333-1337 (1989); Lucas et al., J. Immunol. 154: 5757-5768 (19 95); Shahinian et al., Science 261: 609-612 (1993); Sperling et al., J. Immunol. 157: 3909-3917 (1996); Boise et al., Immunity 3: 87-98 (1995)。ＣＤ２８は、また 10 、以前に活性化されたＴ細胞の応答を最適化し、インターロイキン２（ＩＬ−２）産生お よびＴ細胞生存を促進する。一部の応答はＣＤ２８非依存的であるが、これが強い抗原刺 激に起因する同時刺激の非依存性であるのか、または、他の、未知の同時刺激経路への依 存性の結果であるのかははまだ明らかではない。 【００６１】 ＣＴＬＡ−４活性化はネガティブシグナルを起こし、それはＴＣＲおよびＣＤ−２８媒 介性のシグナル伝達を阻害する。ＣＴＬＡ−４会合は、ＩＬ−２合成および細胞周期を通 じた進行の阻害ならびにＴ細胞応答の終結をもたらす。Walunas et al., Immunity 1: 40 5-413 (1994); Walunas et al., J. Exp. Med. 183: 2541-2550 (1996); Krummel et al. , J. Exp. Med. 182: 459-466 (1995); Brunner et al., J. Immunol. 162: 5813-5820 ( 20 1999); Greenwald et al., Immunity 14: 145-155 (2001)。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞応答 （末梢Ｔ細胞寛容を含む）を調節する際に重要な役割を果たす。シグナル伝達がＣＴＬＡ −４およびＣＤ２８を通じてどのように協調されるかは明らかではないが、一部の可能性 は、免疫抑制サイトカインの誘導、ＣＤ２８シグナル伝達および／またはＴＣＲ媒介性シ グナル伝達の直接的な拮抗作用により、Ｂ７への結合についてＣＤ２８に勝ることを含む 。 【００６２】 結果として、ＣＴＬＡ−４（例、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ抗体）の拮抗作用およびま たはＢ７．１／Ｂ７．２／ＣＤ２８に拮抗することが、感染（例、急性および慢性）およ び腫瘍免疫の処置において免疫応答を増強するために有用でありうる。 30 【００６３】 ２．ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬシグナル伝達： ＡＰＣとＴ細胞の間での相互作用の別の経路は、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）およびＩＣＯ ＳＬ（Ｂ７−Ｈ２、ＣＤ２７５）を通じて生じる。ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬシグナル伝達は 、Ｔヘルパー細胞分化およびエフェクター機能を促進し、特にインターロイキン１０（Ｉ Ｌ−１０）産生のために重要であるが、しかし、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２産生（調節性 Ｔ細胞を含む）、Ｔ細胞寛容、および自己免疫を調節する際により適度な役割を果たす。 【００６４】 ＣＤ２８とは対照的に、ＩＣＯＳは、ナイーブＴ細胞上で恒常的に発現されず、しかし 、Ｔ細胞上でＴＣＲ会合後に迅速に誘導される。Hutloff et al., Nature 397: 263-266 40 (1999); Yoshinaga et al., Nature 402: 827-832 (1999); Beier et al., Eur. J. Immu nol. 30: 3707-3717 (2000); Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000); Mages et al ., Eur. J. Immunol. 30: 1040-1047 (2000); McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5 040 (2000)。これは、ＩＣＯＳが活性化Ｔ細胞に同時刺激シグナルを提供することを示唆 する。ＣＤ２８による同時刺激がＩＣＯＳ発現を増強し、ＩＣＯＳ発現はＢ７．１および Ｂ７．２の非存在において低下され、ＩＣＯＳはＣＤ２８シグナルに完全には依存的では ない。McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5040 (2000); Aicher et al., J. Immuno l. 164: 4689-4696 (2000); Kopf et al., J. Exp. Med. 192: 53-61 (2000)。ＩＣＯＳ が、Ｔヘルパー１および２型（ＴＨ１およびＴＨ２）細胞の両方で、分化の初期段階の間 にアップレギュレーションされるが、しかし、レベルはＴＨ２細胞で高いままであり、Ｔ 50 (25) JP 2012-511329 A 2012.5.24 Ｈ１細胞では減少する。胚中心におけるＴ細胞でのＩＣＯＳの発現パターンBeier et al. , Eur. J. Immunol. 30: 3707-3717 (2000); Mages et al., Eur. J. Immunol. 30: 1040 -1047 (2000)は、Ｂ細胞のためのＴ細胞ヘルプにおけるＩＣＯＳについての役割を示す。 機能試験によってこれが確認されており、ＩＣＯＳの発現さえもラットＢ細胞で確認され ているが、他の種では確認されていない。Tezuka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm un. 276: 335-345 (2000: McAdam et al., Nature 409: 102-105 (2001); Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001); Dong et al., J. Immunol. 166: 3659-3662 (2001); Tafur i et al., Nature 409: 105-109 (2001)。 【００６５】 ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬシグナル伝達についての１つの役割は、活性化されたばかりのＴ 10 細胞ならびにエフェクターＴ細胞によるサイトカイン産生（例、ＩＬ−４、ＩＬ−１３） を調節するためであると思われる。Hutloff et al., Nature 397: 263-266 (1999); Coyl e et al., Immunity 13: 95-105 (2000); Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001)。ア レルギー性気道疾患の試験において、ＴＨ２エフェクター機能（ＴＨ２分化ではない）が ＩＣＯＳ遮断により提供されている。Tesciuba et al., J. Immunol. 167: 1996-2003 (2 001)。ＩＣＯＳはＴＨ１エフェクター機能も調節することができることが示されているた め、ＴＨ１およびＴＨ２サイトカインの両方の産生を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再活性化時 にＩＣＯＳ−Ｉｇ融合タンパク質により抑制することができる。Kopf et al., J. Exp. M ed. 192: 53-61 (2000)。 【００６６】 20 ＩＣＯＳについての別の潜在的な役割は、ＴＨ１応答を持続することに関する。多発性 硬化症についての自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の実験モデルにおいて、ミエリン特異的 ＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介されるＴＨ１疾患で、ＩＣＯＳ遮断の転帰が、同時刺激がＴ細 胞初回刺激の間に、次にＥＡＥのエフェクター段階の間に遮断される場合に別々でありう ることが示されている。Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001); Rottman et al., Na ture Immunol. 2: 605-611 (2001); Sporici et al., Clin. Immunol. 100: 277-288 (20 01)。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）により誘導されるＥＡＥが 、ＩＣＯＳ−／−ノックアウトマウスにおいて大幅に悪化され、ＩＦＮ−γの産生が野生 型と比較して増加する。同様に、ＥＡＥ誘導の間でのＩＣＯＳ遮断が疾患を悪化させ、ま た、増加したＩＦＮ−γ産生をもたらした。従って、初回刺激の間でのＩＣＯＳ遮断は、 30 応答のＴＨ１極性化に導く。興味深いことに、ＩＣＯＳ−Ｉｇの存在におけるｉｎ ｖｉ ｔｒｏでのミエリン特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の初回刺激が、ＥＡＥを誘導 するためのそれらの能力を阻害した。ｉｎ ｖｉｖｏで観察されたＩＣＯＳ−Ｉｇ遮断で の結果と著しく対照的である。Sporici et al., supra。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの対立する転帰についての差はまだ明らかではないが、しかし、ＩＬ−１０産 生調節性Ｔ細胞、ならびにエフェクターＴ細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＩＣＯＳ遮断 の間でのＩＣＯＳについての役割を反映しうる。ＩＬ−１０を通じた同時刺激はＩＬ−１ ０産生の増強で非常に効果的であり、ＣＤ２８を通じた同時刺激よりも効果的である。Hu tloff et al., supra.ＩＬ−１０、ＩＬ−１２調節ループがＥＡＥを調節する際に決定的 である。なぜなら、ＩＬ−１０ −／−マウス（しかし、ＩＬ４ −／−マウスではない 40 ）が悪化したＥＡＥを発生するからである。Segal et al., J. Exp. Med. 187: 537-546 (1998)。 【００６７】 ＩＣＯＳについてのさらに別の潜在的な役割が、Ｔ細胞依存的なＢ細胞液性応答の増強 にある。ＩＣＯＳ−／−およびＩＣＯＳＬ−／−マウスで、ＩＣＯＳがＴ細胞依存的なＢ 細胞応答のために必要とされることが示されている。Hutloff et al., Nature 397: 26366 (1999); Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001); Coyle et al., Immuni ty 13: 95-105 (2000); McAdam et al., Nature 409: 102-5 (2001); Tafuri et al., Na ture 409: 105-9 (2001); Suh et al., Nat. Immunol. 4: 899-906 (2003)。ＩＣＯＳ− ／− マウスは、また、一次免疫化に応答した低下した胚中心、二次攻撃に応答した胚中心 50 (26) JP 2012-511329 A 2012.5.24 形成における深刻な欠損、およびＩｇＧクラススイッチにおける欠損を示す。Ｔ：Ｂ細胞 相互作用におけるＩＣＯＳの役割が、さらに、成人発症の共通する可変性の免疫不全症を 伴う患者におけるＴ細胞中でのＩＣＯＳのホモ接合性喪失の同定により検証された。Grim bacher et al., Nat. Immunol. 4: 261-68 (2003)。 【００６８】 結果として、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ（例、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、可溶性ＩＣＯＳ ／ＩＣＯＳＬリガンド）のアゴニズムは、感染（例、急性および慢性）および／または腫 瘍免疫の処置における免疫応答を増強するために有用でありうる。 【００６９】 ３．ＰＤ−１経路： 10 Ｔ細胞活性化を調節する重要なネガティブ同時刺激シグナルが、プログラム死１受容体 （ＰＤ−１）（ＣＤ２７９）、ならびにそのリガンド結合パートナーＰＤ−Ｌ１（Ｂ７− Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）により提供さる。ＰＤ −１のネガティブな調節的役割が、ＰＤ−１ノックアウト（Ｐｄｃｄ１−／−）により明 らかにされ、それは自己免疫の傾向がある。Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1 999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)。ＰＤ−１はＣＤ２８およびＣＴ ＬＡ−４に関連するが、しかし、ホモ二量体化を可能にする膜近位システインを欠く。Ｐ Ｄ−１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含む。ＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２だけに結合する。Fr eeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-136 20 9 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. E xp. Med. 193: 839-846 (2001)。 【００７０】 ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化単球、および樹状細胞 （ＤＣ）で発現されうる。ＰＤ−１は、活性化された（しかし、未刺激ではない）ヒトＣ Ｄ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞により発現される。これは、ＣＤ ２８およびＣＴＬＡ−４のより限定された発現と対照的である。Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)。活性 化ヒトＴ細胞からクローン化されたＰＤ−１の少なくとも４つのバリアントがある：（ｉ ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２および３または（ｉｖ）エク 30 ソン２∼４を欠く転写物を含む。Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005) 。ＰＤ−１Δｅｘ３を例外として、全てのバリアントが、全長ＰＤ−１と同様のレベルで 休止中の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）において発現される。全てのバリアントの発現が 、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いたヒトＴ細胞の活性化時に有意に誘導される。ＰＤ− １Δｅｘ３バリアントは膜貫通ドメインを欠き、可溶性ＣＴＬＡ−４に似ており、自己免 疫において重要な役割を果たす。Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)。このバリア ントは、関節リウマチを伴う患者の滑液および血清中に濃縮される。Wan et al., J. Imm unol. 177: 8844-50 (2006)。 【００７１】 ２つのＰＤ−１リガンドは、それらの発現パターンにおいて異なる。ＰＤ−Ｌ１は、マ 40 ウスＴおよびＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞、および骨髄由来肥満細胞で 恒常的に発現される。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)。ＰＤ−Ｌ１ が広い範囲の非造血系細胞（例、角膜、肺、脈管上皮、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、 膵島、胎盤合胞体栄養細胞、ケラチノサイトなど）で発現され［Keir et al., Annu. Rev . Immunol. 26: 677-704 (2008)］、活性化後に多くの細胞型でアップレギュレーション される。Ｉ型およびＩＩ型の両方のインターフェロンＩＦＮがＰＤ−Ｌ１をアップレギュ レーションする。Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner e t al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)。細胞株におけるＰＤ−Ｌ１発現は、Ｍｙ Ｄ８８、ＴＲＡＦ６、およびＭＥＫが阻害される場合に減少する。Liu et al., Blood 11 0: 296-304 (2007)。ＪＡＫ２もＰＤ−Ｌ１誘導に結び付けられてきた。Lee et al., FEB 50 (27) JP 2012-511329 A 2012.5.24 S Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ホスファター ゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐ Ｉ３Ｋ）およびＡｋｔシグナル伝達を修飾した細胞ホスファターゼ）の喪失または阻害が 、癌において転写後のＰＤ−Ｌ１発現を増加させた。Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-8 8 (2007)。 【００７２】 ＰＤ−Ｌ２発現はＰＤ−Ｌ１よりも限定されている。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ、マクロファ ージ、および骨髄由来肥満細胞で誘導的に発現される。ＰＤ−Ｌ２は、また、休止中の腹 膜Ｂ１細胞（しかし、従来のＢ２ Ｂ細胞ではない）の約半分から３分の２で発現される 。Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)。ＰＤ−Ｌ２＋ Ｂ１細胞はホ 10 スファチジルコリンに結合し、細菌性抗原に対する先天性免疫応答のために重要でありう る。ＩＦＮ−γによるＰＤ−Ｌ２の誘導は、ＮＦ−κＢに部分的に依存している。Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)。ＰＤ−Ｌ２は、また、ＧＭ−ＣＦ、Ｉ Ｌ−４、およびＩＦＮ−γにより単球およびマクロファージで誘導することができる。Ya mazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100: 5336-41 ( 2003)。 【００７３】 ＰＤ−１シグナル伝達は、典型的に、細胞増殖に対するよりもサイトカイン産生に対し てより大きな効果を有し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２産生に対する有意な 効果を伴う。ＰＤ−１媒介性阻害シグナル伝達は、また、ＴＣＲシグナル伝達の強度に依 20 存し、低レベルのＴＣＲ刺激でより大きな阻害を送達する。この低下は、ＣＤ２８を通じ た同時刺激により［Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)］またはＩＬ− ２の存在により［Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)］克服すること ができる。 【００７４】 ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を通じたシグナル伝達が、双方向性でありうるという証拠 が増えている。すなわち、ＴＣＲまたはＢＣＲシグナル伝達を修飾することに加えて、シ グナル伝達は、また、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現する細胞に戻って送達されうる 。ワルデンストレームマクログロブリン血症を伴う患者から単離された天然ヒト抗ＰＤ− Ｌ２抗体を用いた樹状細胞の処理が、ＭＨＣ ＩＩまたはＢ７同時刺激分子をアップレギ 30 ュレーションすることは見出されず、そのような細胞が、より多量の炎症性サイトカイン （特にＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）を産生し、Ｔ細胞増殖を刺激した。Nguyen et al., J . Exp. Med. 196: 1393-98 (2002).この抗体を用いたマウスの処置が、また、（１）移植 されたｂ１６メラノーマに対する耐性を増強し、腫瘍特異的ＣＴＬを迅速に誘導した。Ra dhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cance r Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)； （２）アレルギー喘息のマウスモデルにおいて気道炎症疾患の発生を遮断した。Radhakri shnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)。 【００７５】 40 樹状細胞（「ＤＣ」）中への逆シグナル伝達のさらなる証拠が、可溶性ＰＤ−１（Ｉｇ 定常領域に融合されたＰＤ−１ ＥＣドメイン − 「ｓ−ＰＤ−１」）を用いて培養さ れた骨髄由来ＤＣの試験に起因する。Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 ( 2006)。このｓＰＤ−１は、抗ＰＤ−１の投与を通じて可逆的な様式で、ＤＣ活性化を阻 害し、ＩＬ−１０産生を増加させた。 【００７６】 加えて、いくつかの試験が、ＰＤ−１に非依存的であるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に ついての受容体を示す。Ｂ７．１は、既に、ＰＤ−Ｌ１についての結合パートナーとして 同定されている。Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)。化学架橋試験は、ＰＤ− Ｌ１およびＢ７．１がそれらのＩｇＶ様ドメインを通じて相互作用することができること 50 (28) JP 2012-511329 A 2012.5.24 を示唆する。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞中への阻害シグナルを誘導するこ とができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＢ７．１によるＰＤ−Ｌ１の連結またはＣＤ４＋Ｔ細 胞上でのＰＤ−Ｌ１によるＢ７．１の連結が、阻害シグナルを送達する。ＣＤ２８および ＣＴＬＡ−４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３プラスＢ７．１コートビーズにより刺激された場 合に、減少した増殖およびサイトカイン産生を示す。Ｂ７．１についての全ての受容体（ 即ち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＰＤ−Ｌ１）を欠くＴ細胞において、Ｔ細胞増殖 およびサイトカイン産生は、抗ＣＤ３プラスＢ７．１コートビーズによりもはや阻害され なかった。これは、Ｂ７．１がＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の非存在においてＰＤ−Ｌ１ を通じてＴ細胞で特異的に作用することを示す。同様に、ＰＤ−１を欠くＴ細胞は、抗Ｃ Ｄ３プラスＰＤ−Ｌ１コートビーズの存在において刺激された場合に減少した増殖および 10 サイトカイン産生を示し、Ｔ細胞に対するＢ７．１上でのＰＤ−Ｌ１連結の阻害効果が実 証された。Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１についての全ての公知の受容体を欠く場合（即ち、ＰＤ− １およびＢ７．１なし）、Ｔ細胞増殖は抗ＣＤ３プラスＰＤ−Ｌ１コートビーズによりも はや損なわれなかった。このように、ＰＤ−Ｌ１が、Ｂ７．１またはＰＤ−１のいずれか を通じてＴ細胞に対して阻害効果を発揮することができる。 【００７７】 Ｂ７．１とＰＤ−Ｌ１の間での直接的な相互作用は、同時刺激の現在の理解が不完全で あることを示唆し、Ｔ細胞上でのこれらの分子の発現に対する有意性を強調する。ＰＤ− Ｌ１−／−Ｔ細胞の試験は、Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１がＴ細胞サイトカイン産生をダウンレ ギュレーションすることができることを示す。Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci 20 . USA 101: 10691-96 (2004)。ＰＤ−Ｌ１およびＢ７．１の両方がＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ 、およびマクロファージ上で発現されるため、これらの細胞型上でのＢ７．１とＰＤ−Ｌ １の間に方向性の相互作用についての可能性がある。加えて、非造血系細胞上のＰＤ−Ｌ １が、Ｔ細胞上のＢ７．１ならびにＰＤ−１と相互作用しうるが、ＰＤ−Ｌ１がそれらの 調節に関与しているか否かの問題を提起する。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果 についての１つの可能な説明は、Ｔ細胞ＰＤ−Ｌ１がＣＤ２８との相互作用からＡＰＣ Ｂ７．１を捕捉しうるまたはそれから分離しうることである。 【００７８】 結果として、ＰＤ−Ｌ１を通じたシグナル伝達の拮抗作用（ＰＤ−１、Ｂ７．１のいず れか、または両方との相互作用からＰＤ−Ｌ１を遮断することと、それによりＰＤ−Ｌ１ 30 がＴ細胞および他の抗原提示細胞に対してネガティブな同時刺激シグナルを送ることを予 防することとを含む）は、感染（例、急性または慢性）および腫瘍免疫に応答した免疫を 増強する可能性が高い。また、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグ ナル伝達の他の成分のアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１および抗ＰＤ −Ｌ２抗体と組み合わせてもよい。 【００７９】 ４．Ｂ７−Ｈ３ 同時刺激シグナルは、また、Ｂ７−Ｈ３（Ｂ７ＲＰ−２、ＣＤ２７６、ＰＲＯ３５２） を通じて提供され、それは広くリンパ系および非リンパ系組織において発現される。Chap oval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001)。ヒトにおいて、Ｂ７−Ｈ３は４Ｉｇお 40 よび２Ｉｇバリアントの両方を有し、４Ｉｇ形態が優勢であり、２Ｉｇバリアントがマウ スにおいて優勢である。Sun et al., J. Immunol. 168: 6294-97 (2002); Steinberger e t al., J. Immunol. 172: 2352-59 (2004); Ling et al., Genomics 82: 365-77 (2003) 。 【００８０】 最近の試験では、Ｂ７−Ｈ３がＴ細胞応答の刺激剤および阻害剤の両方であることが示 されている。刺激的活性化の証拠が以下により提供される：（１）抗ＣＤ３との組み合わ せで、Ｂ７−Ｈ３／Ｉｇ融合物がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を同時刺激し、ＩＦ Ｎ−γおよびＣＤ８溶解活性を刺激した。Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 ( 2001)；および（２）ＥＬ−４リンパ腫モデルの腫瘍中へのＢ７−Ｈ３発現プラスミドの 50 (29) JP 2012-511329 A 2012.5.24 注射は、腫瘍の５０%の完全退縮をもたらし、それはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞に依 存的であった。しかし、いくつかの最近の試験では、この分子についての阻害的な役割が 示されている。Ｂ７−Ｈ３−／−ＡＰＣノックアウトが、ＭＬＲ応答におけるアロ反応性 Ｔ細胞増殖における２倍の増加を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８によるＣＤ４ Ｔ細胞 の活性化は、いずれかの形態のＢ７−Ｈ３を用いてトランスフェクションされたＨＬＡ− ＤＲ２において阻害された。Ling et al., Genomics 82: 365-77 (2003)。結果は、低下 した増殖およびＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、およびＧＭ−ＣＳＦの産生であっ た。これらの試験の和解は、対立する機能を伴うＢ７−Ｈ３についての２つの受容体の存 在にありうる（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４がＢ７．１およびＢ７．２を介してどのよう にシグナル伝達を調節するかに類似する）。 10 【００８１】 結果として、Ｂ７−Ｈ３シグナル伝達の遮断は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わ せた場合に、感染および腫瘍免疫に対する免疫応答の増強に寄与しうる。 【００８２】 ５．Ｂ７−Ｈ４ Ｂ７ファミリーへの最も最近の追加はＢ７−Ｈ４（Ｂ７ｘ、Ｂ７−Ｓ１、Ｂ７−Ｈ．５ 、ＶＴＣＮ１、ＰＲＯ１２９１）であり、それはＴ細胞応答のネガティブレギュレーター である。Zang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (18), 10388-10392 (2003); Watanabe et al., Nat. Immunol. 4 (7), 670-679 (2003); Prasad, et al., Immunity 18(6), 863-873 (2003); Sica et al., Immunity 18 (6), 849-861 (2003)。ヒトおよび 20 マウスの両方のＢ７−Ｈ４が、リンパ系器官（脾臓および胸腺）および非リンパ系器官（ 肺、肝臓、精巣、卵巣、胎盤、骨格筋、膵臓、および小腸を含む）において広く発現され る。Ｂ７−Ｈ４は、正常ヒト組織において、ＩＨＣまたはＢ７−Ｈ４の翻訳レベルでの調 節により検出されない。ＩＨＣでは、Ｂ７−Ｈ４が肺および卵巣の腫瘍において高度に発 現されることが示され、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析では、マウス Ｂ７−Ｈ４が前立腺、肺、および結腸の癌細胞株においても高度に発現されることが示さ れる。Ｂ７−Ｈ４は、活性化Ｔ細胞（しかし、ナイーブＴ細胞ではない）上の未知の受容 体に結合し、それはＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、およびＢ７−Ｈ３についての受 容体とは別々である。ＢＴＬＡがＢ７−Ｈ４についてのリガンドであると最初に報告され たが、野生型細胞（しかし、ＢＴＬＡ−／−細胞ではない）へのＢ７−Ｈ４／Ｉｇ融合物 30 の報告された結合によって、ＨＶＥＭ（ＢＴＬＡではない）がＢ７−Ｈ４についての固有 のリガンドであるという結論に説得力がある。Sedy et al., Nat. Immunol. 6: 90-98 (2 004)。 【００８３】 Ｂ７−Ｈ４トランスフェクタントおよび固定化されたＢ７−Ｈ４／Ｉｇ融合物を用いた 試験では、Ｂ７−Ｈ４がＴＣＲ媒介性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、Ｇ０／Ｇ１ 期における細胞周期進行、およびＩＬ−２産生を阻害するシグナルを送達することが実証 される。Sica et al., Immunity 18: 849-61 (2003); Zang et al., PNAS 100: 10388-92 (2003); Prasad et al., Immunity 18: 863-73 (2003)。Ｂ７．１同時刺激は、Ｂ７−Ｈ ４／Ｉｇ誘導性阻害を克服することができない。抗Ｂ７−Ｈ４抗体を遮断することによっ 40 て、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生が増加した。完全フロイントアジ ュバント（ＣＦＡ）中でのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の投与に相応す る抗Ｂ７−Ｈ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの投与が、ＫＬＨを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの 再刺激時に抗ＫＬＨ抗体ＩｇＭ産生における適度な増加ならびにＴ細胞増殖およびＩＬ− ２産生における２∼３倍の増加に導き、抗Ｂ７−Ｈ４の存在におけるｉｎ ｖｉｖｏでの より大きなＴ細胞初回刺激を示唆する。抗Ｂ７−Ｈ４遮断抗体は、ＥＡＥの発症および重 症度を顕著に加速させ、抗Ｂ７−Ｈ４処置された自己免疫マウスモデルの脳においてＣＤ ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＣＤ１１ｂ＋マクロファージを増加させた。Ｂ７−Ｈ ４に関して利用可能な組み合わせ実験データは、それが末梢組織における免疫応答をダウ ンレギュレーションし、Ｔ細胞寛容の調節において役割を果たしうることを示唆する。Ｂ 50 (30) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ７−Ｈ４の発現は、また、腫瘍免疫における宿主免疫応答の回避において役割を果たしう る。Choi et al., J. Immunol. 171: 4650-54 (2003)。結果として、Ｂ７−Ｈ４の拮抗作 用は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた場合、感染および腫瘍免疫に対する免疫 応答を増強するために有用でありうる。 【００８４】 ６．ＢＴＬＡ： Ｂ７ファミリーメンバーＢＴＬＡ（ＣＤ２７２、ＢＴＬＡ−１）は、ＰＤ−１およびＣ ＴＬＡと機能的に類似している。Ｔｈ１細胞用の選択マーカーとして最初に同定され、Ｂ ＴＬＡはリンパ球だけで発現される。ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＰＤ−１と同様に 、ＢＴＬＡは活性化の間にＴ細胞上で誘導される。しかし、ＩＣＯＳ（Ｔｈ２細胞では上 10 昇したままであるが、しかし、Ｔｈ１細胞ではダウンレギュレーションされる）とは対照 的に、ＢＴＬＡはＴｈ１細胞（しかし、Ｔｈ２細胞ではない）では発現されたままである 。ＰＤ−１と同様に、ＢＴＬＡは、Ｂ細胞上でも発現される。Gavrieli et al., Biochem . Biophys. Res. Commun. 312: 1236-43 (2003)。しかし、ＢＴＬＡは休止中のＢ細胞お よび活性化Ｂ細胞の両方で発現されるのに対し、ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞でアップレギュ レーションされる。ＢＴＬＡは２つのＩＴＩＭモチーフを有する。 【００８５】 ＢＴＬＡは、ＢおよびＴリンパ球の両方に対して阻害効果を発揮する。Watanabe et al ., Nat. Immunol. 4: 670-79 (2003)。ＢＬＴＡ−／−Ｂ細胞は、抗ＩｇＭに対する適度 な応答（しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＣＤ３に対する増加した応答）を示す。極性化 20 −／− ＢＴＬＡ Ｔｈ１細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗原暴露に応答して増殖における２ 倍の増加を示す。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＢＴＬＡ−／−マウスは、ハプテン特異的抗体応答 における３倍の増加およびＥＡＥ対する増強された感受性を示す。ＢＴＬＡ−／−マウス の表現型は、ＰＤ−１−／−マウスの表現型に似ており、自己免疫に対する増加した感受 性、しかし、ＣＴＬＡ−４−／−マウスよりも軽微な表現型を示す。しかし、ネガティブ レギュレーターとしてのその役割を考えると、ＢＴＬＡの遮断は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ 抗体と組み合わせた場合、感染および抗腫瘍免疫において免疫応答を増強するために有用 であることが判明しうる。 【００８６】 興味深いことに、ＩｇスーパーファミリーメンバーＢＴＬＡは、また、ＴＮＦＲファミ 30 リーメンバーＨＶＥＭと相互作用することが最近示されている。Sedy et al., Nat. Immu nol. 6: 90-98 (2005); Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1116-1121 (2005)。ＨＶＥＭは、ＴＮＦＲファミリー同時刺激因子の下で、下に概説される。 【００８７】 Ｅ．ＴＮＦＲファミリー同時刺激因子 １．ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４） ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＸＰＧ１Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ４）およびＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３ ４Ｌ、ＣＤ２５２、ＧＰ３４、ＴＮＦＳＦ４、ＴＸＧＰ１）欠損マウスは、ウイルス抗原 および一般的なタンパク質抗原の両方に対しておよび接触過敏反応において低下した一次 ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有する。Chen et al., Immunity 11: 689-698 (1999); Kopf et al 40 ., Immunity 11: 699-708 (1999); Murata et al., J. Exp. Med. 191: 365-374 (2000); Gramaglia et al., J. Immunol. 165: 3043-3050 (2000)。より低い頻度の抗原特異的エ フェクターＴ細胞が、一次応答における後期に生成され、より少ない記憶Ｔ細胞が発生す る。Gramaglia et al., supra。ＣＤ２７を欠損したＴ細胞とは対照的に、初期増殖は、 ＯＸ４０を欠損したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞集団において損なわれていない。しかし、低 下した増殖および顕著なアポトーシス細胞死が活性化後４−５日目に生じ、結果としてわ ずかなＴ細胞しか長期間生存しない。Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001)。Ｏ Ｘ４０欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、最初の細胞分裂は影響されず、しかし、一次エフェ クター細胞の蓄積が抗原との遭遇後３−６日目に顕著に低下する。Croft et al., Nat. I mmunol. 3: 609-620 (2003)。 50 (31) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【００８８】 樹状細胞またはＴ細胞によるＯＸ４０Ｌのトランスジェニック発現が、抗原応答性ＣＤ ４＋Ｔ細胞の数を増加させ、異常なＴ細胞活性化に関連する自己免疫様症状を産生する。 Brocker et al., Eur. J. Immunol. 29: 1610-1616 (1999); Murata et al., J. Immunol . 169: 4628-4636 (2002)。免疫化後、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体の注射が、一次応答の ピーク時に、大多数の抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積、および生成される記憶Ｔ細胞の 数における同時増強をもたらす。Gramaglia et al., supra., Bansai-Pakala et al., Na ture Med. 7: 907-912 (2001), Maxwell et al., J. Immunol. 164: 107-112 (2000); We atherill et al., Cell. Immunol. 209: 63-75 (2001)。一次エフェクターＣＴＬの増強 された蓄積が、抗原で初回刺激されたマウスがＯＸ４０に特異的なアゴニスト抗体を用い 10 て処置される場合に生じる。De Smedt et al., J. Immunol. 168: 661-670 (2002)。 【００８９】 ＯＸ４０は、一次免疫応答のピークで、新たに生成されたエフェクター細胞の生存を可 能にする後期作用シグナルを提供すると考えられる。ＯＸ４０がＣＤ２８から下流で機能 するという良い証拠もある − ＣＤ２８シグナルにより媒介されるＯＸ４０の増加発現 に加えて、ＣＤ２８欠損対ＯＸ４０欠損の機能分析によって、早期の一次Ｔ細胞応答がＣ Ｄ２８シグナルの非存在において顕著に損なわれるが、しかし、後期応答だけがＯＸ４０ シグナルの非存在において損なわれることが示されている。Rogers et al., Immunity 15 : 445-455 (2001); Bertram et al., J. Immunol. 168: 3777-3785 (2002)。 【００９０】 20 結果として、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの活性化（例えばアゴニスト抗体の適用を通じて） が、Ｔ細胞機能障害性障害を処置するために本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた場 合に有用でありうる可能性が高い。 【００９１】 ２．４−１ＢＢ （ＣＤ１３７）／４−１ＢＢＬ、 ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌと同様に、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）および４ −１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）を欠くＴ細胞では、より少ない抗原反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が 、４−１ＢＢＬが存在しない場合に一次応答において蓄積し、より少ない記憶Ｔ細胞が発 生することが示される。DeBenedette et al., J. Immunol. 163: 4833-4841 (1999); Tan et al., J. Immunol. 163: 4859-4868 (1999); Tan et al., J. Immunol. 164: 2320-23 30 25 (2000)。また、４−１ＢＢＬを遮断することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の増殖 性応答は変化しないが、しかし、数回に分割された細胞のアポトーシスのため、３−６日 後の一次応答のピークでエフェクターＣＴＬの蓄積が抑制される。Cooper et al., Eur. J. Immunol. 32: 521-529 (2002)。アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体および抗４−１ＢＢＬ− トランスフェクトＡＰＣも同様の結果を産生している：ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔ細胞応答 がｉｎ ｖｉｖｏで顕著に増加される。Melero et al., Nature Med. 3: 682-685 (1997) ; Melero et al., Eur. J. Immunol. 28: 1116-1121 (1998); Takahashi et al., J. Imm unol. 162: 5037-5040 (1999); Guinn et al., J. Immunol. 162: 5003-5010 (1999); Ha lstead et al., Nature Immunol. 3: 536-541 (2002); Takahashi et al., Immunol. Let t. 76: 183-191 (2001); Bansal-Pakala et al., J. Immunol. 169: 5005-5009 (2002)。 40 ４−１ＢＢ−特異的抗体は最初の増殖性応答を変化させず、４−１ＢＢＬ遮断実験からの 結論を支持し、細胞−生存シグナルを供給する際での４−１ＢＢの後期活性を指し示す。 【００９２】 ＯＸ４０と同様に、４−１ＢＢは、一次免疫応答のピークで、新たに生成されたエフェ クター細胞の生存を可能にする後期作用シグナルを提供すると考えられる。４−１ＢＢが ＣＤ２８より後期に機能するという良い証拠もある − ＣＤ２８シグナルにより媒介さ れるＯＸ４０および４−１ＢＢの増加発現に加えて、ＣＤ２８欠損対４−１ＢＢ欠損の機 能分析によって、早期の一次Ｔ細胞応答がＣＤ２８シグナルの非存在において顕著に損な われるが、しかし、後期応答だけがＯＸ４０シグナルの非存在において損なわれることが 示されている。Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001); Bertram et al., J. Imm 50 (32) JP 2012-511329 A 2012.5.24 unol.168: 3777-3785 (2002)。 【００９３】 アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体が、ＣＤ８＋ＣＴＬが中心的な役割を果たす癌において腫 瘍退縮を誘導することができる。Melero et al., Nat. Med. 3: 682-5 (1997); Hirano e t al., Cancer Res. 65(3): 1089-96 (2005)。ＰＤ−Ｌ１の恒常的な誘導性発現は、その ような腫瘍において耐性を与え、それはＰＤ−Ｌ１の遮断時に可逆的である。Hirano et al。 【００９４】 結果として、４−１ＢＢ／４−ＢＢＬの活性化（例えばアゴニスト抗体の適用を通じて ）が、特にＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト（例、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）との組み合わせで、Ｔ細 10 胞機能障害性障害を処置するために有用でありうる可能性が高い。 【００９５】 ３．ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０） Ｔ細胞応答の最初の段階におけるＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７、Ｓ１５２）およびＣＤ２ ７Ｌ（ＣＤ７０、ＴＮＦＳＦ７）シグナル伝達の重要性がｉｎ ｖｉｔｒｏでの遮断試験 において実証されており、それにおいてＣＤ２７／ＣＤ７０相互作用が破壊された。Oshi ma et al., Int. Immunol. 10: 517-526 (1998); Agematsu et al., J. Immunol. 153: 1 421-1429 (1994); Hintzen et al., J. Immunol. 154: 2612-2623 (1995)。ＣＤ２７を欠 くＴ細胞は最初は正常に分裂するが、しかし、次に、活性化後３日目またはそれ以降に不 良に増殖する。Hendriks et al., Nature Immunol. 1: 433-440 (2000)。これは、ＣＤ２ 20 ７が、Ｔ細胞死の早期抑制によりまたは細胞周期に作用することにより、ナイーブＴ細胞 集団の最初の増殖の促進に関与し、活性化後２∼３日間持続的な分裂を可能にすることを 示す。これはＣＤ２７欠損マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ試験により裏付けられ、それにおい て、より低い数の抗原特異的応答（４∼８日目）およびより少ない記憶Ｔ細胞が３週間ま たはそれ以上にわたり発生する。Hendriks et al., supra。ＣＤ２７の発現は、Ｔ細胞活 性化後、早期にアップレギュレーションされ、それが、エフェクター応答のピーク前に、 早期増殖を保持するシグナルを主に送達することを示唆する。 【００９６】 結果として、ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌの活性化（アゴニスト抗体の適用を通じることを含 む）が、特に本明細書に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで、Ｔ細胞機能障害性 30 障害を処置するために有用でありうる可能性が高い。 【００９７】 ４．ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３） ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｋｉ−１）およびＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３、ＴＮＦＳＦ８ ）シグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのいくつかのＴ細胞機能について同時刺激的であ る。Del Prete et al., J. Exp. Med. 182: 1655-1661 (1995), Bowen et al., J. Immun ol. 156: 442-449 (1995)。ＣＤ３０Ｌに対する遮断試薬は、Ｔｈ２細胞の発生を抑制し 、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｈ１細胞の発生を増強した。この活性は、ＣＤ３０がＴｈ２細胞 および２型細胞傷害性Ｔｃ２細胞により優先的に発現されることを示すデータと一致する 。Del Prete et al., supra, Nakamura et al., J. Immunol. 158: 2090-2098 (1996)。 40 ＣＤ３０は、非極性化された一次応答においてナイーブＴ細胞の活性化後３∼４日目に発 現される。Nakamura et al., supra（その役割が２型サイトカイン支配的応答に制限され ないことを示す）。 【００９８】 ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌシグナル伝達の正確な機構は不明であるが、それがＯＸ４０およ び４−１ＢＢに類似しうることが示唆されている。養子性に転移された抗原特異的ＣＤ８ ＋Ｔ細胞が、ＣＤ３０Ｌ欠損マウス中に転移される場合、それらは一次応答のピーク時に 多数蓄積せず、より少ない記憶Ｔ細胞が発生する。結果として、ＣＤ３０が、また、増殖 および／または生存シグナルを提供し、一次応答のピーク時に多数の抗原特異的Ｔ細胞の 生成を可能にする。 50 (33) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【００９９】 結果として、ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌの活性化（アゴニスト抗体の適用を通じることを含 む）が、特に本明細書に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで、Ｔ細胞機能障害性 障害を処置するために有用でありうる可能性が高い。 【０１００】 ５．ＨＶＥＭ／ＬＩＧＨＴ Ｔ細胞同時刺激に対するＨＶＥＭ（ＨＶＥＡ、ＡＴＡＲ、ＬＩＧＨＴＲ、ＴＮＦＲＳＦ １４、ＰＲＯ５０９）およびＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８、ＨＶＥＭＬ、ＴＲ２、ＴＮＦＳＦ １４、ＰＲＯ７２６）の効果は、１）ＬＩＧＨＴがリンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ） にも結合する能力および２）ＨＶＥＭが可溶性ＬＴα３に結合する能力により複雑化され 10 る。このように、ＨＶＥＭ／ＬＩＧＨＴの効果の任意の試験では、また、このシグナル伝 達系についての他の結合パートナーの効果を考慮に入れるべきである。ＬＩＧＨＴの遮断 によって、同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において早期Ｔ細胞増殖およびサイトカイン 分泌を阻害することができる。Tamada et al., J. Immunol. 164: 4105-4110 (2000), Kw on et al., J. Biol. Chem. 272: 14272-14276 (1997); Harrop et al., J. Immunol. 16 1: 1786-1794 (1998); Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (2000)。炎症性サイト カインの産生は、ＬＩＧＨＴがＭＨＣ不適合心臓同種移植片において遮断される場合に抑 制される。Ye et al., J. Exp. Med. 195: 795-800 (2002)。さらに、同種皮膚移植片が 、ＬＩＧＨＴおよびＣＤ２８の両方を欠損するレシピエントにおいて遅延した動態で拒絶 される。Scheu et al., J. Exp. Med. 195: 1613-1624 (2002)。遅延された移植片拒絶が 20 Ｔ細胞クローン増殖またはサイトカイン産生の早期抑制を示しうるとの示唆。この結論は 、（ｉ）同種抗原に応答するＬＩＧＨＴ欠損脾細胞が、ＴＨ１およびＴＨ２の両方のサイ トカインの低下した産生ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球活性（ＣＴＬ）活性の弱い生成を 有することを示すｉｎ ｖｉｔｒｏ試験［Sheu et al., supra.］ならびに（ｉｉ）ＬＩ ＧＨＴの遮断がアロ反応性ＣＴＬの生成を低下させることを示すｉｎ ｖｉｖｏ試験によ り裏付けられる。Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (2000)。 【０１０１】 結果として、ＨＶＥＭ／ＬＩＧＨＴ（例えばアゴニスト抗体の適用を通じて）が、特に 本明細書に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで、Ｔ細胞機能障害性障害を処置す るために有用でありうる可能性が高い。 30 【０１０２】 ＩＩ．定義 「アレルゲン」または「免疫原」は、免疫応答を誘発することができる任意の分子であ る。本明細書で使用する通り、この用語は、抗原分子自体、またはその供給源（例えば花 粉粒、動物のフケ、昆虫毒、または食物産物など）のいずれかを対象とする。これは抗原 という、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体により特異的に認識されることができる分子 を指す用語と対比される。免疫応答を誘導することが可能である任意の外来物質が、潜在 的なアレルゲンである。天然および合成由来の多くの異なる化学物質が、アレルゲン性で あることが公知である。複雑な天然有機化学物質、特にタンパク質が、抗体媒介性アレル ギーを起こす可能性が高いのに対し、単純な有機化合物、無機化学物質、および金属はＴ 40 細胞媒介性アレルギーをより優先的に起こす。一部の場合において、同じアレルゲンは１ を上回る型のアレルギーに関与しうる。アレルゲンへの暴露は、吸入、注射、注射、また は皮膚接触を通じうる。 【０１０３】 免疫機能障害に関連する「機能障害」は、抗原刺激に対する免疫の低下した応答性の状 態を指す。この用語は消耗および／またはアネルギーの両方の共通エレメントを含み、そ れにおいて抗原認識が生じうるが、しかし、後に続く免疫応答は感染または腫瘍増殖を制 御するのには無効である。 【０１０４】 「寛容」または「免疫学的寛容」は、免疫系が特定の抗原に対して防御的な免疫応答を 50 (34) JP 2012-511329 A 2012.5.24 増さないことである。寛容は天然または自己でありうるが、それにおいて身体はそれ自体 のタンパク質および抗原を攻撃せず、またはそれが免疫系の操作に起因して誘導されうる 。中枢性寛容がリンパ球発生の間に生じ、胸腺および骨髄において作動する。このプロセ スの間に、自己抗原を認識するＴおよびＢリンパ球が、それらが完全な免疫担当細胞に発 生する前に除去される。このプロセスは胎児発生の間に最も活性であるが、しかし、未成 熟リンパ球が生成されるため生涯を通じて持続する。末梢Ｔ細胞寛容は、末梢組織に存在 する自己抗原に対する機能的な無応答性を指し、ＴおよびＢ細胞が成熟し、末梢に入った 後に生じる。これらのプロセスは、「調節性」Ｔ細胞による自己反応性細胞の抑制および 炎症に伴う同時刺激シグナルの非存在において抗原に遭遇するリンパ球における低応答性 （アネルギー）の生成を含む。「獲得」または「誘導寛容」は外部抗原に対する免疫系の 10 適応を指し、他の状況において細胞媒介性または体液性免疫を誘導する可能性が高いであ ろう所与の抗原に対するリンパ系組織の特定の非反応性により特徴付けられる。成人にお いて、寛容は、非常に大用量の抗原、または免疫応答の刺激のために要求される閾値を下 回る小用量の反復投与（例えば可溶性抗原の静脈内または舌下投与を介してなど）により 臨床的に誘導されうる。免疫抑制は、また、寛容の誘導を促進する。自己寛容の破綻は自 己免疫を導きうる。 【０１０５】 「Ｔ細胞機能を増強する」は、Ｔ細胞が持続するまたは増幅された生物学的機能を有す るように、または消耗したもしくは不活性なＴ細胞を再生もしくは再活性化するように誘 導する、起こす、または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例は以下：ＣＤ 20 ８＋Ｔ細胞からのγ−インターフェロンの増加した分泌、増加した増殖、増加した抗原応 答性（例、ウイルスまたは病原体クリアランス）（介入前でのそのようなレベルと比較し て）を含む。一実施態様において、増強のレベルは、少なくとも５０%、あるいは６０%、 ７０%、８０%、９０%、１００%、１２０%、１５０%、２００%である。この増強を測定す る様式は、当業者に公知である。 【０１０６】 「Ｔ細胞機能障害性障害」は、抗原刺激に対する減少した応答性により特徴付けられる Ｔ細胞の障害または状態である。特定の実施態様において、Ｔ細胞機能障害性障害は、Ｐ Ｄ−１を通じた不適当な増加したシグナル伝達に特異的に関連する障害である。別の実施 態様において、Ｔ細胞機能障害性障害は、アネルギー性である、またはサイトカインを分 30 泌する、増殖する、もしくは細胞溶解活性を実行する減少した活性を有するものである。 特定の局面において、減少した応答性は、免疫原を発現する病原体または腫瘍の無効な制 御をもたらす。Ｔ細胞機能障害により特徴付けられるＴ細胞機能障害性障害の例は、未消 散の急性感染、慢性感染、および腫瘍免疫を含む。 【０１０７】 「慢性感染」は、感染性物質（例、病原体、例えばウイルス、細菌、原虫寄生虫、真菌 など）が、感染宿主において免疫応答を誘導しているが、しかし、急性感染の間にその宿 主から一掃または除去されていない感染を指す。慢性感染は、持続的、潜在的、または緩 徐でありうる。急性感染は、典型的には、数日間または数週間以内に免疫系により消散さ れ（例、インフルエンザ）、持続感染は比較的低いレベルで数ヶ月、数年、数十年、また 40 は生涯にわたり持続しうる（例、Ｂ型肝炎）。対照的に、潜伏感染は、迅速に増加する高 悪性度の感染および上昇した病原体レベル（例、単純ヘルペス）の期間により中断された 長期間の無症状の活性により特徴付けられる。最後に、遅発性感染症は、疾患症状におけ る緩やかで持続的な増加（例えば長期間の潜伏、それに続く臨床症状の発症後に開始する 長引く進行性の臨床経過など）により特徴付けられるものである。潜在的で持続的な感染 とは異なり、遅発性感染症は、急性期のウイルス増殖を伴って開始しないことがある（例 えば、ピコルナウイルス感染、ビスナウイルス（visnavirus）、スクレイピー、クロイツ フェルト・ヤコブ疾患）。慢性感染を誘導することが可能である例示的な感染性物質は、 ウイルス（例、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス 、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ｉ型およびＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス、 50 (35) JP 2012-511329 A 2012.5.24 １型および２型ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、１型および２型 、水痘帯状疱疹ウイルスなど）、細菌（例、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（My cobacterium tuberculosis）、リステリア属（Listeria spp.）、クレブシエラ・ニュー モニエ（Klebsiella pneumoniae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ボレリア（ Borrelia）属、ヘリコバクターピロリなど）、原虫寄生虫（例、リーシュマニア（Leishm ania）属、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、シストソーマ （Schistosoma）属、トキソプラズマ（Toxoplasma）属、トリパノソーマ（Trypanosoma） 属、テニア・クラシセプス（Taenia carssiceps）など）、および真菌（例、アスペルギ ルス（Aspergillus）属、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、コクシジオイ 10 デス・イミチス（Coccidioides immitis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histopla sma capsulatum）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）など）を含む。 追加の感染性物質は、脳または神経の構造に、これらの組織においてタンパク質ミスフォ ールディングをさらに伝播し、細胞死、組織損傷、および最終的な死を起こすアミロイド プラークの形成を招くことにより影響を与えるプリオンまたはミスフォールドされたタン パク質を含む。プリオン感染に起因する疾患の例は以下：クロイツフェルト・ヤコブ疾患 およびその変種、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致 死性家族性不眠症（ｓＦＩ）、クールー、スクレイピー、牛における牛海綿状脳症（ＢＳ Ｅ）（別名「狂牛」疾患）、種々の他の動物形態の脳症［例、伝播性ミンク脳症（ＴＭＥ ）、慢性消耗病（ＣＷＤ）（オジロジカ、ヘラ鹿、およびミュールジカ）、ネコ海綿状脳 20 症、外来性有蹄類脳症（ＥＵＥ）（ニアラ、オリックス、およびより大きなクーズー）、 ダチョウの海綿状脳症］を含む。 【０１０８】 「腫瘍免疫」は、腫瘍が免疫認識およびクリアランスを回避するプロセスを指す。この ように、治療の概念として、腫瘍免疫は、そのような回避が減弱され、腫瘍が免疫系によ り認識され、攻撃される場合、「処置」される。腫瘍認識の例は、腫瘍結合、腫瘍縮小、 および腫瘍クリアランスを含む。 【０１０９】 「Ｂ７ネガティブ同時刺激アンタゴニスト」（「ＢＮＣＡ」）は、Ｂ７ファミリーのメ ンバーにより媒介されるＴリンパ球上で発現された細胞表面タンパク質により媒介される 30 またはそれを通じたネガティブ同時刺激シグナルを減少、遮断、阻害、抑止し、それに干 渉する薬剤である。一局面において、ＢＮＣＡは単独で、または本発明の抗ＰＤ−１抗体 との組み合わせで、機能障害性Ｔ細胞を非機能障害性にしうる。別の局面において、ＢＮ ＣＡは、Ｂ７ネガティブ同時刺激分子の核酸もしくはタンパク質の合成、発現、シグナル 伝達、および／または発現後プロセシングを阻害する薬剤でありうる。さらに別の局面に おいて、ＢＮＣＡは、Ｂ７ネガティブ同時刺激分子によるシグナル伝達を減少、遮断、阻 害、抑止し、またはそれに干渉する抗体、抗原結合抗体フラグメント、ＢＮＣＡオリゴペ プチド、ＢＮＣＡ ＲＮＡｉ、またはＢＮＣＡ小分子である。例示的なＢ７ネガティブ同 時刺激分子は以下：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、Ｂ７．１（Ｔ細胞上で発現） 、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４を含む。 40 【０１１０】 ポジティブ同時刺激アゴニストは、Ｔリンパ球上で発現された細胞表面タンパク質によ り媒介されるまたはそれを通じた同時刺激シグナルを増加、増強、増大、または促進させ る分子である。一局面において、ポジティブ同時刺激分子は、ポジティブ同時刺激経路を 活性化する細胞外ドメイン、可溶性構築物、またはアゴニスト抗体でありうる。例示的な ポジティブ同時刺激分子は、Ｂ７スーパーファミリー分子（例、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｃ Ｄ２８、およびＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ）を含む。追加の例は、ＴＮＦＲファミリー同時刺 激分子（例、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、４１−ＢＢ／４１−ＢＢＬ、ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌ 、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ、およびＨＶＥＭ／ＬＩＧＨＴ）を含む。 【０１１１】 50 (36) JP 2012-511329 A 2012.5.24 「小分子」または「小有機分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有するものであ る。 【０１１２】 「干渉ＲＮＡ」「ＲＮＡｉ」は、標的遺伝子の発現を低下させる１０∼５０ヌクレオチ ド長のＲＮＡであり、それにおいて鎖の部分は十分に相補的である（例、標的遺伝子と少 なくとも８０%の同一性を有する）。ＲＮＡ干渉の方法は、転写後レベル（例、翻訳）で 生じる遺伝子発現の標的特異的抑制（即ち、「遺伝子サイレンシング」）を指し、遺伝子 発現のＲＮＡ媒介性阻害の全ての転写後機構および転写機構、例えばP. D. Zamore, Scie nce 296: 1265 (2002)およびHannan and Rossi, Nature 431: 371-378 (2004)に記載され るものなどを含む。本明細書で使用する通り、ＲＮＡｉは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ 10 ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ ）の形態でありうる。そのようなＲＮＡｉ分子は、しばしば、別々の相補的なまたは部分 的に相補的なＲＮＡ鎖の形態で発現されうる二本鎖ＲＮＡ複合体である。二本鎖ＲＮＡ複 合体を設計するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、適したｓｈＲＮ ＡおよびｓｉＲＮＡの設計および合成は、Sandy et al., BioTechniques 39: 215-224 (2 005)において見出されうる。 【０１１３】 「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、標的遺伝子の発現を低下させる１０∼ ５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖であり、それにおいて第１鎖の 部分は十分に相補的である（例、標的遺伝子と少なくとも８０%の同一性を有する）。 20 ｓｉＲＮＡは、上昇したインターフェロン合成、非特異的タンパク質合成阻害、および ＲＮＡ分解（哺乳動物細胞においてＲＮＡｉの使用に関連する細胞の自殺または死をしば しばもたらす）により特徴付けられる抗ウイルス応答を特異的に回避するよう設計される 。Paddison et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1443-8.(2002)。 【０１１４】 「ヘアピン」という用語は、７∼２０ヌクレオチドのループＲＮＡ構造を指す。「ショ ートヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、標的遺伝子の発現を低下させるヘアピン ターンにより特徴付けられる一本鎖ＲＮＡ（１０∼５０ヌクレオチド長）であり、それに おいてＲＮＡ鎖の部分は十分に相補的である（例、標的遺伝子と少なくとも８０%の同一 性を有する）。「ステム−ループ」という用語は、短い不対ループ（ロリポップ形状構造 30 を与える）で終わる二重らせんを形成する同じ分子塩基対の２つの領域間での対合を指す 。 【０１１５】 「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」（以前にｓｔＲＮＡとして公知）は、「ステ ム−ループ」構造により特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして最初に転写される約１０∼ ７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡであり、それは、続いて成熟ｍｉＲＮＡにプロセシン グされ、その後ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を通じたさらなるプロセ シングを受け、る。 【０１１６】 「ＢＮＣＡ干渉ＲＮＡ」または「ＢＮＣＡ ＲＮＡｉ」は、好ましくは特異的に、ＢＮ 40 ＣＡ核酸に結合し、その発現を低下させる。これは、Ｂ７ネガティブ同時刺激分子の発現 が、存在するＢＮＣＡ ＲＮＡｉを用いて、ＢＮＣＡ ＲＮＡｉが存在しないコントロー ルにおけるＢ７ネガティブ同時刺激分子の発現と比較し、より低いことを意味する。ＢＮ ＣＡ ＲＮＡｉは、公知の方法を使用して同定および合成してもよい（Shi Y., Trends i n Genetics 19(1): 9-12 (2003)， WO2003056012, WO2003064621, WO2001/075164, WO200 2/044321）。 【０１１７】 「ＢＮＣＡオリゴペプチド」は、好ましくは特異的に、本明細書で記載するＢ７ネガテ ィブ同時刺激ポリペプチド（受容体、リガンド、またはシグナル伝達成分を含む）にそれ ぞれ結合するオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドは、公知のオリゴペプチ 50 (37) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ド合成方法論を使用して化学的に合成してもよく、または組換え技術を使用して調製およ び精製してもよい。そのようなオリゴペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸長、あ るいは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１ ７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ 、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、 ４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５ ７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０ 、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、 ８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９ ７、９８、９９、または１００アミノ酸長またはそれ以上である。そのようなオリゴペプ 10 チドは、過度の実験なく、周知の技術を使用して同定されうる。これに関して、ポリペプ チド標的に特異的に結合することが可能であるオリゴペプチドについてオリゴペプチドラ イブラリーをスクリーニングするための技術が、当技術分野において周知であることに注 目される（例、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、第４，７０ ８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８ ４号、第５，５７１，６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公報ＷＯ８４／０３５ ０６およびＷＯ８４／０３５６４; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 : 3998 4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178 182 (1 985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen e t al., J. Immunol. MeTH102: 259 274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 61 20 1 616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); L owman, H. B. et al. Biochemistry, 30: 10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Kang, A. S . et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363 (1991)、およびSmith, G. P., Curren t Opin. Biotechnol., 2: 668 (1991)を参照のこと）。 【０１１８】 「ＢＮＣＡ小分子アンタゴニスト」または「ＢＮＣＡ小分子」は、好ましくは特異的に 、Ｂ７ネガティブ同時刺激ポリペプチドを阻害する、本明細書で定義するオリゴペプチド または抗体以外の有機分子である。そのようなＢ７ネガティブ同時刺激シグナル伝達阻害 は、好ましくは、抗原刺激に応答性の機能障害Ｔ細胞を与える。例示的なＢＮＣＡ小分子 30 は、公知の方法論を使用して、同定および化学的に合成してもよい（例、ＰＣＴ公報ＷＯ ２０００／００８２３およびＷＯ２０００／３９５８５を参照のこと）。そのようなＢＮ ＣＡ小分子は、通常、約２０００ダルトン未満のサイズ、あるいは、約１５００、７５０ 、５００、２５０、または２００ダルトン未満のサイズであり、好ましくは特異的に、本 明細書に記載するＢ７ネガティブ刺激性ポリペプチドに結合することが可能であり、過度 の実験なく周知の技術を使用して同定されうる。これ関して、ポリペプチド標的に結合す ることが可能である分子について有機分子ライブラリーをスクリーニングするための技術 が、当技術分野において周知であることが注目される（例、ＰＣＴ公報ＷＯ００／００８ ２３およびＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。 【０１１９】 40 「抗生物質」という用語は、微生物（例えばウイルス、細菌、真菌、または原虫など） の増殖を特異的に阻害または無効にするが、しかし、投与される濃度および投与間隔で宿 主に対して非致死的である任意の分子を含む。本明細書で使用する通り、抗生物質という 用語は、抗菌薬剤、抗ウイルス薬剤、抗真菌薬剤、および抗原虫薬剤を含む。特定の局面 において、抗生物質は、投与濃度および投与間隔で宿主に対して非毒性である。抗菌性の 抗生物質または抗菌剤は、殺菌性（即ち、直接的に殺す）または静菌性（即ち、分裂を予 防する）として広く分類することができる。抗殺菌性の抗生物質は、狭スペクトル（即ち 、細菌（例えばグラム陰性など）の小クラスのサブセットにだけ影響を与える）または広 域スペクトル（即ち、広いクラスに影響を与える）としてさらに亜分類することができる 。抗生物質の例は以下：（ｉ）アミノグリコシド、例、アミカシン、ゲンタマイシン、カ 50 (38) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パ ロマイシン、（ｉｉ）アンサマイシン、例、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、（ｉｉ ｉ）カルバセフェム、例、ロラカルベフ、（ｉｖ）、カルバペネム、例、エルタペネム、 ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、（ｖ）セファロスポリン（cephao lsporins）（第一世代）、例、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファ レキシン、（ｖｉ）セファロスポリン（第二世代）、例、セファクロル（ceflaclor）、 セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、（ｖｉ）セファロス ポリン（第三世代）、例、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、 セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフ トリアキソン、（ｖｉｉ）セファロスポリン（第四世代）、例、セフェピム、（ｖｉｉｉ 10 ）、セファロスポリン（第五世代）、例、セフトビプロール、（ｉｘ）グリコペプチド、 例、テイコプラニン、バンコマイシン、（ｘ）マクロライド、例、アジスロマイシン、ク ラリスロマイシン、ジリトロマイシン（dirithromycine）、エリスロマイシン、ロキシス ロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、（ｘｉ） モノバクタム、例、アズトレオナム（axtreonam）、（ｘｉｉ）ペニシリン（penicilins ）、例、アモキシシリン、アンピシリン、axlocillin、カルベニシリン、クロキサシリン 、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン（meticillin）、 ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン（peperacillin）、チカルシリン 、（ｘｉｉｉ）抗生物質ポリペプチド、例、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ 、（ｘｉｖ）キノロン、例、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レ 20 ボフロキサシン、レメフロキサシン（lemefloxacin）、モキシフロキサシン、ノルフロキ サシン、オフロキサシン（orfloxacin）、トロバフロキサシン、（ｘｖ）スルホンアミド 、例、マフェナイド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファ ニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリ ム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、（ｘｖｉ）テトラサイクリン、例、デ メクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テト ラサイクリンおよび（ｘｖｉｉ）その他、例えばarspenamine、クロラムフェニコール、 クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フ ラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラン トイン、プラテシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファ 30 ンピン／リファンピシン、またはチニダゾールなどを含む。 【０１２０】 「抗ウイルス薬剤」という用語は、ウイルスの増殖、罹患、および／または生存を阻害 または無効にする任意の分子を含む。これは抗ウイルス薬物、例えば、（１）逆転写酵素 阻害剤、例えば：（ａ）ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）（例、アシ クロビル／アシクロビル（ZOVIRAX（登録商標）、ZOVIR（登録商標））、シドフォビル、 アジドチミジン／ジドブジン（ＡＺＴ、RETROVIR（登録商標））、ジダノシン（ｄｄＩ、 VIDEX（登録商標）；ザルシタビン（ｄｄＣ、HIVID（登録商標））；スタブジン（ｄ４Ｔ 、ZERIT（登録商標）；ラミブジン（３ＴＣ、EPIVIR（登録商標））；アバカビル（ZIAGE N（登録商標））；エムトリシタビン（EMTRIVA（登録商標））；ブリブジン（HELPIN（登 40 録商標））；エンテカビル（BARACLUDE（登録商標））；イドクスウリジン；ビラミジン （viramidine）（Valeant Pharmacueticalsによるタリバビリン（taribavirin））、シチ ジンヌクレオシドアナログポリメラーゼ阻害剤ＰＣＩ−６１３０、およびPharmasset/Roc heによりプロドラッグバリアント（例、Ｒ７１２８）；Merck/Isis Pharmaceuticalsによ るヌクレオシドアナログ阻害剤−ＭＫ−０６０８、（ｂ）ヌクレオチドアナログ逆転写酵 素阻害剤（ＮｔＲＴＩｓ）（例、テノホビル（VIREAD（登録商標））；アデフォビル（PR EVEON（登録商標）、HEPSERA（登録商標））；ホミビルセン（VITRAVENE（登録商標）） ；（ｃ）非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、（ＮＮＲＴＩｓ）、エファビレンツ（SUSTIV A（登録商標）、STOCRIN（登録商標））；ネビラピン（VIRAMUNE（登録商標））、デラビ ルジン（RESCRIPTOR（登録商標））、エトラビリン（INTELENCE（登録商標））、ロビリ 50 (39) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ド；ViroChem PharmaによるＨＣＶ ＲＮＡ依存的ＲＮＡ合成酵素の非ヌクレオシド阻害 剤−ＶＣＨ−７５９、PfizerによるＨＣＶポリメラーゼ阻害剤の非ヌクレオシド阻害剤− ＰＦ−８６８５５４；ならびに（ｄ）ポリメラーゼ阻害剤、Boehringer Ingelheimによる Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ−ＢＩＬＢ−１９４１、RocheによるＲＮＡポリ メラーゼ阻害剤−Ｒ１６２６；ＡＣＨ−０１３７１７１レプリカーゼ阻害剤（Achillion Pharmaceuticals）、Ｒ７１２８（Roche/Pharmassetによるポリメラーゼ阻害剤）、ＡＢ Ｔ−３３３およびＡＢＴ−０７２（Abbottによるポリメラーゼ阻害剤）、ＢＩ ２０７１ ２７（Boehringer Ingelheimによるポリメラーゼ阻害剤）、ＰＳＩ−７８５１（Pharmass etによるポリメラーゼ阻害剤）、ＡＮＡ５９８（Anadys Pharmaceuticalsによるポリメラ ーゼ阻害剤）、ＭＫ−３２８１（Merckによるポリメラーゼ阻害剤）、ＩＤＸ１８４（Ide 10 nixによるポリメラーゼ阻害剤）、ＧＳＫ ６２５４３３（Glaxo Smith Klineによるポリ メラーゼ阻害剤）、ＩＮＸ−１８９（Inhibitexによるポリメラーゼ阻害剤）、ＮＭ２８ ３（Idenixによるポリメラーゼ阻害剤）、ＨＣＶ７９６（Wyethによりポリメラーゼ阻害 剤）、ＧＬ６０６６７およびＧＳ９１９０（Gileadによるポリメラーゼ阻害剤）、Pfizer によるＰＦ−００８６８５５４ ０ポリメラーゼ阻害剤、ＶＣＨ７５９、ＶＣＨ９１６、 ＶＸ２２２、およびＶＸ７５９（Virochemによるポリメラーゼ阻害剤）、ＩＤＸ１８４お よびＩＤＸ３７５（Idenixによるポリメラーゼ阻害剤）、ＢＭＳ６５００３２（Bristol Myers Squibbによるポリメラーゼ阻害剤）；（２）プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナ ビル（FOROVASE（登録商標）／INVIRASE（登録商標））、リトナビル（NORVIR（登録商標 ））、インジナビル（CRIXIVAN（登録商標））、ネルフィナビル（VIRACEPT（登録商標） 20 ）、アンプレナビル（AGENERASE（登録商標））、ロピナビル（KALETRA（登録商標））、 アタザナビル（REYATAZ（登録商標））、ホスアンプレナビル（LEXIVA（登録商標））、 チプラナビル（APTIVUS（登録商標））、ダルナビル（PREZISTA（登録商標））、telapra vir（ＶＸ−９５０）；Vertex Pharmaceuticalsによる第二世代ＨＣＶプロテアーゼ阻害 剤、ＶＸ−５００およびＶＸ−８１３；Intermune/RocheによるＮＳ３／４Ａプロテアー ゼ阻害剤、ＩＴＭＮ−１９１／Ｒ−７２２７、ボセプレビル、Schering-Ploughによるプ ロテアーゼ阻害剤、ＳＣＨ ５０３０３４、Medivir/TibotecによるＨＣＶ ＮＳ３／４ Ａプロテアーゼ阻害剤、ＴＭＣ４３５／ＴＭＣ４３５３５０、Achillion Pharmaceutical sによるＡＣＨ−１６２５プロテアーゼ阻害剤、ＡＣＨ−８０６、Achillion/Gileadによ るプロテアーゼ阻害剤、ＢＩ２０１３３５およびＢＩＬＮ ２０６１、Boehringer Ingel 30 heimによるプロテアーゼ阻害剤、ＳＣＨ ９００５１８／ＳＰ９００５１８（ｎａｒｌａ ｐｒｅｖｉｒ）、Schering-Ploughによるプロテアーゼ阻害剤、ＭＫ−７００９、Merckに よるプロテアーゼ阻害剤、ＢＭＳ−６５００３２、ＢＭＳ−７９００５２、およびＢＭＳ −７９１３２５、Bristol Myeres Squibbによるプロテアーゼ阻害剤、Ｒ７２２７、Roche によるプロテアーゼ阻害剤、ＰＨＸ１７６６、Phenomixによるプロテアーゼ阻害剤、ＡＶ Ｌ−１８１、Avila Therapeuticsによるプロテアーゼ阻害剤、ビリベルジン、ＣＴＳ−１ ０２７、Roche Biosciencesによるプロテアーゼ阻害剤、ＶＸ９８５、Vertexによるプロ テアーゼ阻害剤、ＶＣＨ−７５９およびＶＣＨ−９１７、Virochem/Vertexによるプロテ アーゼ阻害剤、ＩＤＸ−１３６および３１６、Idenixによるプロテアーゼ阻害剤、ＡＢＴ −４５０、Abbottによるプロテアーゼ阻害剤、ＶＢＹ ３７６、Virobayによるプロテア 40 ーゼ阻害剤；（３）インテグラーゼ阻害剤、例えば、ラルテグラビル（ISENTRESS（登録 商標））、エルビテグラビル；（４）ヌクレオシドアナログ／ヌクレオチドアナログ阻害 剤の組み合わせ治療、アトリプラ（テノホビル＋エンブリシタビン（embricitabine）＋ エファビレンツ）、コンビビル（ラミブジン（lamivudein）＋ジドブジン）、（５）侵入 または融合阻害剤、例えば、マラビロク、エンフビルチド、ドコサノール、抗ＣＤ４抗体 、抗ｇｐ１２０抗体、抗ＣＣＲ５抗体、ＨＣＶ ＮＳ５ａアンタゴニスト：（ａ）Arrow TherapeuticsによるＡ−８３１、Ａ−６８９、およびＡＺＤ２８３６、（ｂ）Bristol My ers SquibbによるＢＭＳ−７９００５２およびＢＭＳ−８２４３９３、（ｃ）Glaxo Smit h KlineによるＧＳＫ−６２５４３３、（ｄ）ＮＳ４ａアンタゴニストＡＣＨ−１０９５ ；（５）成熟阻害剤、例えば：ベビリマットおよびバイブコン；（６）ウイルス放出阻害 50 (40) JP 2012-511329 A 2012.5.24 剤、例えば、ザナミビル（RELENZA（登録商標））、オセルタミビル（TAMIFLU（登録商標 ））、アルビドール；（７）免疫応答エンハンサー、例えば以下：インターフェロン−α （例、Biolex TherapeuticsによるＢＬＸ−８８３およびＢＬＸ ８８３ ＣＲ、Nautilu s Biotechによるベレロフォン（belerofon）、LG Life Sciencesによる長時間作用型ＩＦ Ｎ−α、ＩＦＮ−α ＳＲ、Flamel Technologiesによる長時間作用型ＩＦＮ−α２ｂ ＣＲおよびＩＦＮ−α２ｂ ＸＬ、ペグ化ＩＦＮ−α（例、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ａ， ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）；ＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ｂ，PEGINTRON（登録商標））） 、ＩＦＮ−ａ２ｂ−ヒト血清アルブミン融合タンパク質（ALBUFERON（登録商標））；イ ンターフェロン−β、ＩＦＮ−β−１ｂ（BETASERON（登録商標））、インターフェロン −γ、インターフェロン−γ、ペグ化インターフェロン−γ（例、ZymoGenetics/Novo No 10 rdiskによるＰＥＧ−ｒＩＬ−２９）、インターフェロン−ω／白血球ＩＩインターフェ ロン（例、Intarcia Therapeutics）、Ｔｏｌｌ様受容体７アゴニスト、イミキモッド、 イサトリビン、およびAnadys Pharmaceuticalsによるそのプロドラッグバリアント（例、 ＡＮＡ−９７５およびＡＮＡ−９７１）を含む、オグルファニド（oglufanide）（ＩＭ８ ６２、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ−ＯＨ）およびImplicit Bioscienceによるその脂質また はグリコシル抱合型バリアント、ＮＯＶ−２０５（例、Molixan（登録商標） − Novel os Therapeutics, Inc.によるペプチド抗ウイルス剤）、Enzo Biochemによる抗ウイルス 剤ＥＨＣ１８、ガンマ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（例、ＳＣＶ−０７、SciC lone Pharmaceuticals/Verta）、ａｌｏｆｅｒｏｎ（例、ａｌｏｆｅｒｏｎ−１−ＨＧＶ ＳＧＨＧＱＨＧＶＨＧ、ａｌｏｆｅｒｏｎ−２−ＧＶＳＧＨＧＱＨＧＶＨＧ）、ＣＰＧ 20 １０１０１、Coley Pharmaceuticals/ActilonによるＴＬＲ−９アゴニスト；（８）抗ウ イルスの相乗的エンハンサー（即ち、単独ではほとんど抗ウイルス特性がないが、しかし 、他の抗ウイルス剤の効果を増強する） − 例えば、クロロキン（choroquine）、グレ ープフルーツジュース、ヒドロキシ尿素、レフルノミド、ミコフェノール酸、レスベラト ロル、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉ）；ならびに他の抗ウイルス薬物、例えばアマンタ ジン、エドクスジン、ファムシクロビル（FAMVIR（登録商標））、ペンシクロビル、ホス カルネット（ｆａｓｃａｒｎｅｔ）、ホスホネット、ガンシクロビル（CYTOVENE（登録商 標）、CYMEVENE（登録商標）、VITRASERT（登録商標））、ガーダシル、イバシタビン、 イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、モロキシジン、ｎｅｘａｖｉｒ、ペラミビル、プレコ ナリル、ポドフィロトキシン、リバビリン、リマンタジン、トリフルリジン、トリジビル 30 、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、およ びインターフェロンエンハンサー、例えばTransition TherapeuticsによるＥＭＺ７０２ 、ヒスタミン二塩酸（例、Ceplene（登録商標）＋ＩＦＮ−α）；ならびに（９）雑多な または未分類の抗ウイルス剤、例えば：Kemin PharmaceuticalsによりＫＰＥ−０２００ ３００２（Artenimol）、ミトキノン、Antipodean Pharmaceuticalsによる補酵素Ｑ１０ 抗酸化剤アゴニスト、アルファ−グルコシダーゼＩ阻害剤（例、Ｍｘ−３２５３、Migeni x Pharmaceuticalsによるセルゴシビル（ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ）、カスタノスペルミン 、グルココルチコイドアンタゴニスト（例、ＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害剤、ミフェプリストー ン、VGX PharmaceuticalsによるＶＧＸ−４１０Ｃ）、肝臓アゴニスト（例、Phynova Pha rmaceuticalsによるＰＹＮ１７）、従来の薬草治療に由来する抗ウイルス薬剤、例、Phyn 40 ova PharmaceuticalsによるＰＹＮ１８、カスパーゼ阻害剤（例、ＬＢ−８４４５１、LG Life Sciencesによる、emricasan、PfizerによるＰＦ−０３４９１３９０／ＩＤＮ−６５ ５６）、サイクロフィリンＡへの結合を予防することによりウイルス複製を阻害するシク ロスポリンアナログ（例、NovartisによるＳＤＺ ＮＩＭ ９１１、DebiopharmによるＤ ｅｂｉｏ−０２５）を含む。 【０１２１】 「抗真菌薬剤」という用語は、真菌の増殖、罹患、および／または生存を阻害または無 効にする任意の分子を含む。これは例えば以下：（１）ポリエン抗真菌剤、例えばナタマ イシン（natamyin）、リモシジン、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、カン ジシンなど；（２）イミダゾール、例えばミコナゾール、ケトコナゾール（LOTRIMIN（登 50 (41) JP 2012-511329 A 2012.5.24 録商標））、エコナゾール、ビフォナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イ ソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール（ERTACZO（登録商標））、スルコ ナゾール、チオコナゾールなど、（３）トリアゾール、例えばフルコナゾール、イトラコ ナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テル コナゾールなど；（４）アリルアミン、例えばテルビナフィン（LAMISIL（登録商標）） 、アモロルフィン、ナフチフィン（Naftin（登録商標））、ブテナフィン（LOTRIMIN ULT RA（登録商標））など；（５）エキノキャンディン、例えばアニデュラフンジン、カスポ ファンギン、ミカファンギンなど、および抗真菌特性を伴う他の物質、例えば安息香酸、 ｃｉｃｃｌｏｐｉｘ、フルシトシン、グリセオフルビン、ゲンチアナバイオレット、ハロ プロジン、トルナフテート（TINACTIN（登録商標）、DESENEX（登録商標）、AFTATE（登 10 録商標））、ウンデシレン酸、ティーツリー油 − ＩＳＯ ４７３０（メラレウカの油 、テルピネン− ４−オール型）シトロネラ油、レモングラス、オレンジ油、パルマロー ザ油、パチョリ、レモンマートル、ニーム種子油、ヤシ油を含む。 【０１２２】 「抗原虫薬剤（anti-protozoan agent）」または「抗原虫薬剤（anti-protozoal agent ）」という用語は、原虫生物の増殖、罹患、および／生存を阻害または無効にする任意の 分子を含む。例示的な抗原虫薬剤は以下：（１）抗マラリア薬剤、例えば、キニン、キニ マックス、キニジン、キニマックス、クロロキン（ARALEN（登録商標））、ヒドロキシク ロロキン（Hydroxycloroquine）（PLAQUENIL（登録商標））、アモジアキン、ピリメタミ ン（DARAPRIM（登録商標））、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン（LARIAM（ 20 登録商標））、ハロファントリン、プリマキン、アルテミシニンおよびその誘導体（例、 アルテメテル、アーテスネート（artensunate）、ジハイドロアルテミシニン、アルテテ ル）、クリンダマイシン、ならびにその組み合わせ；（２）プロテアーゼ阻害剤、および 薬物、benznidaole、ブパルバクオン、カルバルソン、クリオキノール、ジスルフィラム 、エフロルニチン、エメチン、フラゾリドン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロー ル、メトロニダゾール（FLAGYL（登録商標））、ミルテホシン、ニフルチモクス、ニタゾ キサニド、オルニダゾール、硫酸パロモマイシン、ペンタミジン、ピリメタミン（DARAPR IM（登録商標））、セクニダゾール、チニダゾールを含む。 【０１２３】 「ワクチン」という用語は、本明細書で使用する通り、宿主中に接種された場合、特定 30 の病原体に対して防御免疫を誘導する任意の非病原性免疫原を含む。ワクチンは多くの形 態を取ることができる。ワクチンは病原体と重要な抗原を共有するが、しかし、それ自体 は病原性がない全生物でありうる（例、牛痘）。ワクチンは、また、死滅（例、ソークポ リオワクチン）または減弱（疾患を産生する能力を失っている、例、セービンポリオワク チン）から調製することができる。ワクチンは、また、病原生物から単離された精製高分 子から調製することができる。例えば、不活性形態の可溶性細菌毒素を含むトキソイドワ クチン（例、破傷風およびジフテリア）で、抗毒素抗体の産生をもたらすが、しかし、イ ンタクトな細菌に対する免疫をもたらさない。サブユニットワクチン（例、Ｂ型肝炎）は 、目的の病原体から単離された単一の免疫原性タンパク質だけを含む。ハプテンコンジュ ゲートワクチンは、特定の炭水化物または目的の病原体から単離されたポリペプチドエピ 40 トープを免疫原性担体（例えば破傷風トキソイドなど）に付着させる。これらの戦略では 、本質的に、エピトープをハプテンとして使用して抗体産生を誘導し、それは次に天然病 原体中の同じエピトープを認識する。しかし、最大限に効果的であるために、そのような ワクチンはＢおよびＴ細胞の両方の細胞エピトープを取り込まなくてはならず、Ｔ細胞エ ピトープは、それらが宿主個人の免疫系により認識、提示、および応答されることができ ることを確実にするように選ばなくてはならない。 【０１２４】 ＤＮＡワクチンは、筋肉内に注射された病原性タンパク質をコードするＤＮＡを取り込 み、発現する宿主細胞の能力を利用する。 【０１２５】 50 (42) JP 2012-511329 A 2012.5.24 本明細書に記載する方法のために抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで使用することがで きる抗ウイルスワクチンの例は、以下：Pevion BiotechによるＨＣＶワクチン（ｖｉｒａ ｓｏｍｅ）、ＴＧ４０４０（ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５Ｂに対する細胞（細胞傷害性 Ｔリンパ球ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）免疫応答を増強するように設計されたバイロンであ るTransgeneによるＭＶＡ−ＨＣＶ、CHRONVAC（登録商標）、Inovio Biomedicalによるコ ドン最適化ＮＳ３／４ａ ＤＮＡワクチン、NovartisによるＨＣＶ／ＣｐＧワクチン、Ｇ Ｉ−５００５−GlobeimmuneによるＨＣＶワクチン、ＩＣ４１、Intercellによるポリ−Ｌ −アルギニンとの組み合わせでＨＣＶ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔエピトープを有する合成 ペプチドの混合物を含む。 【０１２６】 10 免疫原に対する宿主応答は、アジュバントとの混合物として投与された場合に増強する ことができる。免疫アジュバントは、以下：（１）免疫原の保持を延長すること、（２） 免疫原の効果的サイズを増加すること（故に、食作用およびマクロファージへの提示を促 進すること）、（３）注射部位へのマクロファージまたは他の免疫細胞の流入を刺激する こと、または（４）局所的なサイトカイン産生および他の免疫学的活性を促進することを 含む。例示的なアジュバントは以下：完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、アルミニ ウム塩、およびムラミルジまたはトリペプチドといったマイコバクテリア由来タンパク質 を含む。 【０１２７】 「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗 20 体を含む）、ポリエピトープ特異性を伴う抗体組成物、多特異性抗体（例、二重特異性抗 体、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体フラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａ ｂ’）２、およびＦｖ））。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書におい て「抗体」と互換的に使用される。 【０１２８】 基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構 成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペ プチドと共に、５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、１０の抗原結合部位を含み、 ＩｇＡ抗体は、重合化し、Ｊ鎖との組み合わせで多価集合体を形成することができる２∼ ５の基本的な４鎖単位からなる。ＩｇＧの場合において、４鎖単位は一般的に約１５０， 30 ０００ダルトンである。各Ｌ鎖が１つの共有結合的ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結さ れ、２つのＨ鎖が、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つまたは複数のジスルフィド結合に より互いに連結される。各々のＨおよびＬ鎖が、また、規則的に間隔が空いた鎖内ジスル フィド架橋を有する。各Ｈ鎖がＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、αとγ鎖の各々に ついての３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμおよびεアイソタイプについての４つの ＣＨドメインが続く。各Ｌ鎖がＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ド メインが続く。ＶＬがＶＨと整列され、ＣＬが重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整 列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考え られる。ＶＨおよびＶＬの対合は、一緒に、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラ スの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th E 40 dition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994，７１頁および第６章を参照のこと。任意の脊椎動物種からの Ｌ鎖を、２つの明らかに別々の型（それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ およびラムダと呼ばれる）の１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイ ン（ＣＨ）のアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプ に割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、 ＩｇＧ、およびＩｇＭ（α、δ、ε、γ、およびμと命名される重鎖をそれぞれ有する） がある。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さな差に基づきサブ クラスにさらに分けられる。例えば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、 ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。 50 (43) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０１２９】 「単離」抗体は、その産生環境の成分（例、天然または組換え）から同定、分離、およ び／または回収されていたものである。好ましくは、単離ポリペプチドは、その産生環境 からの全ての他の成分との会合がない。その産生環境の混入成分（例えば組換えトランス フェクションされた細胞に起因するものなど）は、抗体についての研究、診断、または治 療的使用に典型的に干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク 質性または非タンパク質性溶質を含みうる。好ましい実施態様において、ポリペプチドを ：（１）例えばローリー方法により決定される９５重量%超の抗体まで、一部の実施態様 において、９９重量%超まで；（１）スピニングカップシークエネーターの使用によるＮ 末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または 10 （３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件 下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一まで精製する。単離抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕの組換え 細胞内の抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないで あろうからである。通常、しかし、単離ポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精 製工程により調製されるであろう。 【０１３０】 抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ド メインを指す。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と言 ってもよい。これらのドメインは、一般的に、（同じクラスの他の抗体と比べ）抗体の最 も可変的な部分であり、抗原結合部位を含む。 20 【０１３１】 「可変」という用語は、可変ドメインの特定のセグメントが抗体の間で広範囲に配列に おいて異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原につい ての特定の抗体の特異性を定義する。しかし、可変性は、可変ドメインの全長にわたり均 等に分布しない。代わりに、それは、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領 域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントにおいて集中する。可変ドメインのより高度に 保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可 変ドメインは４つのＦＴ領域を各々が含み、大部分がベータ・シート配置を採用しており 、３つのＨＶＲにより連結され、それらはベータ・シート構造を連結する、および一部の 場合においてその部分を形成するループを形成する。各鎖中のＨＶＲは一緒に近接してＦ 30 Ｒ領域により、および他の鎖からのＨＶＲとまとめられ、抗体の抗原結合部位の形成に寄 与する（Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, Nation al Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原 への抗体の結合に直接的に関与しないが、しかし、種々のエフェクター機能（例えば抗体 依存性の細胞毒性における抗体の関与など）を示す。 【０１３２】 「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する通り、実質的に均質な抗体 の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在しうる 起こりうる天然の突然変異および／または翻訳後修飾（例、異性化、アミド化）を除き同 一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられ 40 る。異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を典型的に含むポリクローナル 抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。そ れらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンにより混入 されていないハイブリドーマ培養により合成されるという点で有利である。「モノクロー ナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から入手されるとして抗体の特徴を示 し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求していると解釈されないはずである。例え ば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、種々の技術により作製してもよく 、例えば以下：ハイブリドーマ方法（例、Kohler and Milstein., Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodi es: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Ham 50 (44) JP 2012-511329 A 2012.5.24 merling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevie r, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ方法（例、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこ と）、ファージ・技術（例、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299 -310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免 疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分または全部を有する動物におけるヒトまたは ヒト様抗体を産生するための技術（例、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４ ０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Jakobovits et al., P 10 roc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-25 8 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５ ，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６ 号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；Marks et al., Bio/Tech nology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (19 96); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Int ern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照のこと）を含む。 【０１３３】 「ネイキッド抗体」という用語は、細胞傷害成分または放射標識に抱合されていない抗 20 体を指す。 【０１３４】 「全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「抗体全体」という用語を互換的に使用 し、抗体フラグメントとは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。具体 的には、抗体全体はＦｃ領域を含む重鎖および軽鎖を伴うものを含む。定常ドメインは、 ネイティブ配列の定常ドメイン（例、ヒトネイティブ配列の定常ドメイン）またはそのア ミノ酸配列バリアントでありうる。一部の場合において、インタクトな抗体は１つまたは 複数のエフェクター機能を有しうる。 【０１３５】 「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくはインタクトな抗体の抗 30 原結合および／または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ （ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体（米国特許第５，６ ４１，８７０号、実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を 参照のこと）；一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を 含む。抗体のパパイン消化は、２つの同一の抗原結合性フラグメント（「Ｆａｂ」フラグ メントと呼ぶ）、および残存「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化する能力を反映する命 名）を産生した。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、および１つ の重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と共にＬ鎖の全体からなる。各Ｆａｂフラグメン トは抗原結合に関して一価であり、即ち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペ プシン処理によって、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂフラグ 40 メントに大まかに対応し、抗原を架橋することが依然として可能である単一の大きなＦ（ ａｂ’）２フラグメントが産出される。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの １つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端で少数の追加残基を 有することによりＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨはＦａｂ’についての 本明細書の命名であり、それにおいて定常ドメインのシステイン残基は遊離チオール基を 持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来は、その間にヒンジシステインを有する Ｆａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学共役も公知で ある。 【０１３６】 Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドにより一緒にまとめられた両方のＨ鎖のカルボキシ 50 (45) JP 2012-511329 A 2012.5.24 末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域（特定の細胞型で見い出されるＦ ｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域）中の配列により決定される。 【０１３７】 「Ｆｖ」は、完全な抗原の認識部位および結合部位を含む最小限の抗体フラグメントで ある。このフラグメントは、堅固な非共有結合的会合における１つの重鎖および１つの軽 鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングか ら、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可 変ループ（各々、Ｈ鎖およびＬ鎖からの３つのループ）が放射する。しかし、単一の可変 ドメイン（または抗原について特異的なわずか３つのＨＶＲを含むＦｖの半分）でさえ抗 原を認識し、結合する能力を有する（結合部位の全体より低い親和性であるが）。 10 【０１３８】 「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一ポリペプチド 鎖中に連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましく は、ｓＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさ らに含み、それはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓ Ｆｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vo l. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を 参照のこと。 【０１３９】 本発明の抗体の「機能的フラグメント」はインタクトな抗体の部分を含み、一般的に、 20 インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域または修飾されたＦｃＲ結合能を保持 するまたは有する抗体のＦｃ領域を含む。抗体フラグメントの例は、直鎖抗体、一本鎖抗 体分子、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含む。 【０１４０】 「ダイアボディ」という用語は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカー（約 ５∼１０残基）を伴うｓＦｖフラグメント（前のパラグラフを参照のこと）を構築するこ とにより調製される小さな抗体フラグメントを指し、Ｖドメインの分子間鎖（しかし、鎖 内対合ではない）が達成され、それにより二価フラグメント（即ち、２つの抗原結合部位 を有するフラグメント）をもたらす。二特異性ダイアボディは２つの「クロスオーバー」 ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体であり、それにおいて２つの抗体のＶＨおよびＶＬド 30 メインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)にお いてより詳細に記載される。 【０１４１】 本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリ ン）を含み、それにおいて重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するまたは 特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるま たは相同であり、鎖の残りは、それらが所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来す るまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体のフ ラグメントにおける対応する配列と同一であるまたは相同である（米国特許第４，８１６ 40 ，５６７号； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984) ）。本明細書における目的のキメラ抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含み 、それにおいて抗体の抗原結合領域は、、例えば、マカクザルを目的の抗原を用いて免疫 化することにより産生される抗体に由来する。本明細書で使用する通り、「ヒト化抗体」 は「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。 【０１４２】 非ヒト（例、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小 配列を含むキメラ抗体である。一実施態様において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（ レシピエント抗体）であり、それにおいてレシピエントのＨＶＲ（以下に定義する）から の残基が、非ヒト種、例えば所望の特異性、親和性、および／または能力を有するマウス 50 (46) JP 2012-511329 A 2012.5.24 、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類など（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基により置 換される。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は 、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にお いてまたはドナー抗体において見い出されない残基を含みうる。これらの改変を、抗体性 能（例えば結合親和性など）をさらに洗練させるために作製してもよい。一般的に、ヒト 化抗体は、実質的に全てまたは少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインを 含み、それにおいて超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそ れに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのそれであるが、 ＦＲ領域は、、抗体性能（例えば結合親和性、異性化、免疫原性など）を改善する１つま たは複数の個々のＦＲ残基の置換を含みうる。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は 10 、典型的には、Ｈ鎖におけるわずか６つ、およびＬ鎖におけるわずか３つである。ヒト化 抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にはヒ ト免疫グロブリンのそれも含む。さらなる詳細については、例えば、Jones et al., Natu re 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988);およびPrest a, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994)；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０ ９号を参照のこと。 【０１４３】 20 「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸性配列に対応するアミノ酸性配 列を保有し、および／または、本明細書で開示するヒト抗体を作製するための技術のいず れかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義では、具体的には、非ヒト抗 原結合残基を含むヒト化抗体が除外される。ヒト抗体を、当技術分野において公知の種々 の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用して産生することができる。 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio l., 222: 581 (1991).また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能な方法が、 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985 ); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)に記載される。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)を参照のこと。ヒト抗 30 体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、しかし、 その内因性遺伝子座が無能になっているトランスジェニック動物（例、免疫化ゼノマウス ）に対して抗原を投与することにより調製することができる（例えば、XENOMOUSE（商標 ）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照の こと）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、 例えば、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006)を参照のこと 。 【０１４４】 「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場 合、配列において超可変であり、および／または、構造的に定義されたループを形成する 40 抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含む；ＶＨ中の３つ（ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体において、Ｈ３ およびＬ３は６つのＨＶＲの最も大きい多様性を提示し、特にＨ３は、抗体に微細な特異 性を付与する際に固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25(Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照のこと。実際に、重鎖だけからなる天然ラクダ 抗体は、軽鎖の非存在において機能的かつ安定的である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996)を参照のこと。 【０１４５】 50 (47) JP 2012-511329 A 2012.5.24 多くのＨＶＲ描写が本明細書において使用され、包含される。Kabatの相補性決定領域 （ＣＤＲ）は配列可変性に基づき、最も共通して使用される（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National I nstitutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）。Chothiaは、代わりに、構造的ループの 位置を指す（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶ Ｒは、KabatのＨＶＲとChothiaの構造的ループの間での妥協を表わし、Oxford Molecular 's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複 雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下に指摘する。 ループ Kabat AbM Chothia 接触 ---- ----- --- ------- ------- 10 L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabatナンバリング) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothiaナンバリング) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 【０１４６】 20 ＨＶＲは以下の通りの「伸長ＨＶＲ」：ＶＬ中２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、 ４６−５６または５０−５６（Ｌ２）および８９−９７または８９−９６（Ｌ３）ならび にＶＨ中２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または４９−６５（Ｈ２）および９３−１０２ 、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）を含みうる。可変ドメイン残基を、Kabat et al., supraに従って、これらの定義の各々について番号付けする。 【０１４７】 「Kabatにおける可変ドメイン残基ナンバリング」または「Kabatにおけるアミノ酸位置 ナンバリング」という表現、ならびにそのバリエーションは、Kabat et al., supraにお いて抗体の編集での重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用されるナンバ リングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用し、実際の直鎖アミノ酸配列は 30 、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮、またはその中への挿入に対応するより少ない または追加のアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の 単一アミノ酸インサート（Kabatに従った残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿 入残基（例、Kabatに従った残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含みうる。残基 のKabatナンバリングは、「標準的な」Kabatナンバリング配列を伴う抗体の配列の相同性 の領域でのアラインメントにより所与の抗体について決定することができる。 【０１４８】 「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義するＨＶＲ残基以外のそれ らの可変ドメイン残基である。 【０１４９】 40 「ヒトコンセンサスフレームワーク」または「アクセプターヒトフレームワーク」は、 ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も共通して生じ るアミノ酸残基を表わすフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまた はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサ ブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に おけるサブグループである。例は、ＶＬについて、サブグループは、Kabat et al., supr aにおけるサブグループカッパＩ、カッパＩＩ、カッパＩＩＩ、またはカッパＩＶであり うる。加えて、ＶＨについて、サブグループは、Kabat et al., supraにおけるサブグル ープＩ、サブグループＩＩ、サブグループＩＩＩでありうる。あるいは、ヒトコンセンサ 50 (48) JP 2012-511329 A 2012.5.24 スフレームワークは上に由来しうるが、それにおいて特定の残基、例えば、ヒトフレーム ワーク残基が、ドナーフレームワーク配列を種々のヒトフレームワーク配列のコレクショ ンと整列化することにより、ドナーフレームワークとのその相同性に基づいて選択される 場合などである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワ ークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含みう る、またはそれは既存のアミノ酸配列変化を含みうる。一部の実施態様において、既存の アミノ酸変化の数は、１０またはそれ以下、９またはそれ以下、８またはそれ以下、７ま たはそれ以下、６またはそれ以下、５またはそれ以下、４またはそれ以下、３またはそれ 以下、あるいは２またはそれ以下である。 【０１５０】 10 「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et al., supraの 可変重鎖サブグループＩＩＩ中のアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一 実施態様において、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は 、以下の配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（ＨＣ−ＦＲ１） （配列番号４）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（ＨＣ−ＦＲ２）、（配列番号５）、ＲＦ ＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＨＣ−ＦＲ３、配列 番号６）、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＨＣ−ＦＲ４）、（配列番号７）の各々の少なくと も部分または全てを含む。 【０１５１】 「ＶＬカッパＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat et al., supraの可変軽鎖カ 20 ッパサブグループＩ中のアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様 において、ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列 ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＬＣ−ＦＲ１）（配列番号１１） 、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＬＣ−ＦＲ２）（配列番号１２）、ＧＶＰＳＲＦＳ ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＬＣ−ＦＲ３）（配列番号１３ ）、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（ＬＣ−ＦＲ４）（配列番号１４）の各々の少なくとも部分 または全てを含む。 【０１５２】 特定の位置での（例、Ｆｃ領域の）「アミノ酸改変」は、特定の残基の置換または欠失 、あるいは特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残 30 基に「隣接する」挿入は、その１から２つの残基内の挿入を意味する。挿入は、特定の残 基に対するＮ末端またはＣ末端でありうる。本明細書における好ましいアミノ酸改変は置 換である。 【０１５３】 「親和性成熟」抗体は、それらの変化を保有しない親抗体と比較し、抗原についての抗 体の親和性において改善をもたらすその１つまたは複数のＨＶＲにおける１つまたは複数 の変化である。一実施態様において、親和性成熟抗体は、標的抗原についてナノモル濃度 またはさらにピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟抗体は当技術分野において公知 の手順により産生される。例えば、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)に は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載される。ＨＶＲおよ 40 び／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、以下により記載され る：Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. G ene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackso n et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995)；およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)。 【０１５４】 本明細書で使用する通り、「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は 、測定可能で再現性のある相互作用（例えば標的と抗体の間での結合など）を指し、それ は生物学的分子を含む分子の異種集団の存在において標的の存在を決定可能である。例え ば、標的（エピトープでありうる）に特異的に結合する抗体は、より大きな親和性、結合 50 (49) JP 2012-511329 A 2012.5.24 力を伴い、より容易に、および／またはそれが他の標的に結合するよりも大きな持続時間 を伴いこの標的に結合する抗体である。一実施態様において、無関係な標的への抗体の結 合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、標的への 抗体の結合の約１０%未満である。特定の実施態様において、標的に特異的に結合する抗 体は、解離定数（Ｋｄ）≦１μM、≦１００nM、≦１０nM、≦１nM、または≦０．１nMを 有する。特定の実施態様において、抗体は、異なる種からのタンパク質間で保存されてい るタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施態様において、特異的結合は 、排他的な結合を含みうるが、しかし、それを要求しない。 【０１５５】 「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を 10 阻害または低下させるものである。一部の実施態様において、遮断抗体またはアンタゴニ スト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。本発明の抗ＰＤ−Ｌ １抗体はＰＤ−１を通じてシグナル伝達を遮断し、抗原刺激に対する機能障害状態からＴ 細胞による機能的応答を回復させる。 【０１５６】 「アゴニスト」または活性化抗体は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強ま たは開始するものである。一部の実施態様において、アゴニスト抗体は、天然リガンドの 存在なしにシグナル伝達を起こすまたは活性化する。 【０１５７】 「固相」という用語は、本発明の抗体が付着することができる非水性マトリクスを記載 20 する。本明細書に包含される固相の例は、ガラス（例、制御された細孔ガラス）、ポリサ ッカリド（例、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコー ル、およびシリコーンから部分的にまたは完全に形成されるものを含む。特定の実施態様 において、状況に依存して、固相はアッセイプレートのウェルを含みうる；他において、 それは精製カラム（例、親和性クロマトグラフィーカラム）である。この用語は、また、 別々の粒子の非連続的固相（例えば米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるものな ど）を含む。 【０１５８】 「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ 酸配列バリアントＦｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプ 30 に伴い変動する。抗体エフェクター機能の例は以下：Ｃ１ｑ結合および補体依存的細胞傷 害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受 容体（例、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化を含む。「低 下または最小化」抗体エフェクター機能は、野生型または非改変抗体から少なくとも５０ %（あるいは６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７% 、９８%、９９%）だけ低下されるものを意味する。抗体エフェクターエフェクター機能の 決定は、当業者により容易に決定可能かつ測定可能である。好ましい実施態様において、 補体結合の抗体エフェクター機能、補体依存的細胞傷害、および抗体依存的細胞傷害が影 響を受ける。本発明の一部の実施態様において、エフェクター機能は、グルコシル化を除 去する定常領域中の突然変異（例、「エフェクターなし突然変異」）を通じて除去される 40 。一局面において、エフェクターなし突然変異は、ＣＨ２領域中のＮ２９７ＡまたはＤＡ ＮＡ突然変異（Ｄ２６５Ａ ＋ Ｎ２９７Ａ）である。Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001).あるいは、低下または除去されたエフェクター機能をもた らす追加の突然変異はＫ３２２ＡおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を含む。あ るいは、エフェクター機能は、産生技術、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例、Ｅ ．ｃｏｌｉ）またはそれにおいてエフェクター機能を促進する際に無効または効果が低い 変化したグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞における発現などを通じて低下または 除去することができる（例、Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (200 3)）。 【０１５９】 50 (50) JP 2012-511329 A 2012.5.24 「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害」またはＡＤＣＣは、細胞傷害の形態を指し、それに おいて特定の細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマク ロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇによって、これら の細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持つ標的に特異的に結合し、続いて細胞毒素を用 いて標的細胞を殺すことが可能になる。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」し、この機構に よる標的細胞の死滅のために必要とされる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための一次細 胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およ びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現が、Ravetch and Kinet, Annu. R ev. Immunol. 9: 457-92 (1991)の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡ ＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイ（例えば米国特許第５ 10 ，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるものなど）を実施しても よい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢ ＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、または加えて、目的の分 子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで（例、動物モデル、例えばClynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998)に開示されるものなど）評価してもよい。 【０１６０】 本明細書において別記なき場合、免疫グロブリン重鎖中の残基のナンバリングは、Kaba t et al., supraにおけるＥＵインデックスのものである。「KabatにおけるＥＵインデッ クス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。 【０１６１】 20 本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（ネイ ティブ配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む）を定義するために使用される。免 疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、、通常 、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端 まで伸展すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる 残基４４７）を、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸の 組換え操作により除去してもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４ ４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４ ４７残基を伴うおよび伴わない抗体の混合物を有する抗体集団を含みうる。本発明の抗体 における使用のための適したネイティブ配列Ｆｃ領域は、、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（Ｉ 30 ｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。 【０１６２】 「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好 ましいＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗 体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブク ラス（これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシング形態を含む） を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩ Ｂ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主に細胞質ドメインにおいて異なる、類似のア ミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫 受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢ 40 は、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフを含む（M. D aeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)を参照のこと）。ＦｃＲｓは以下にお いて概説される：Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel e t al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 1 26: 330-41 (1995)。他のＦｃＲ（今後、同定されるであろうものを含む）が、本明細書 における「ＦｃＲ」という用語により包含される。 【０１６３】 「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、また、新生児受容体ＦｃＲｎを含み、それは胎児 への母親のＩｇＧの転移に関与する。Guyer et al., J. Immunol.117: 587 (1976) and K im et al., J. Immunol.24: 249 (1994).ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が公知である 50 (51) JP 2012-511329 A 2012.5.24 （例、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nat ure Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004)； WO 2004/92219（Hinton et al.）を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｖｏでの ＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期を、例え ば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスフェクションされ たヒト細胞株において、またはバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊 長類においてアッセイすることができる。WO 2004/42072（Presta）には、ＦｃＲへの結 合を改善または減弱させた抗体バリアントが記載される。また、Shields et al., J. Bio l. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。 【０１６４】 10 「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施 する白血球である。一局面において、エフェクター細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発 現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末 梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞 、および好中球を含む。エフェクター細胞は、天然の供給源（例、血液）から単離しても よい。エフェクター細胞は、一般的に、エフェクター段階と関連するリンパ球であり、サ イトカインを産生するために機能し（ヘルパーＴ細胞）、病原体と感染した細胞を殺し（ 細胞傷害性Ｔ細胞）、または抗体を分泌する（分化Ｂ細胞）。 【０１６５】 「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在における標的細胞の溶解を指 20 す。古典的補体経路の活性化は、その同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体へ の補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、 ＣＤＣアッセイ（例、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) に記載される）を実施してもよい。変化したＦｃ領域アミノ酸配列および増加または減少 したＣ１ｑ結合能を伴う抗体バリアントが、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号および ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。それらの特許公報の内容は、具体的に、参照に より本明細書に組み入れられる。また、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 ( 2000)を参照のこと。 【０１６６】 ＩｇＧ中のＮグリコシル化部位は、ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７である。本発明は 30 、また、エフェクター機能が低下したまたは無いＦｃ領域を有する抗原結合ヒト化抗体の 組成物を提供する。これを達成することができる１つの様式はＡ２９７Ｎ置換であり、そ れは抗ＣＤ２０抗体において補体結合およびエフェクター機能（「エフェクターなしＦｃ 突然変異体」）を無効にすることが以前に示されている。Idusgie et al., supra.この突 然変異の結果として、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯなど）におけるこのＦｃ突然変異を含 む本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の産生は、任意のグリコシル化を有さず、それは、その次に 、低下したまたは最小限のエフェクター機能をもたらす。あるいは、抗体エフェクター機 能は、非哺乳動物細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉなど）における発現により、ＣＨ２置換なし に除去されうる。 【０１６７】 40 「結合親和性」は、一般的に、分子（例、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー （例、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別記なき場合、本明 細書で使用される通り、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例、抗体および抗原）の 間での１：１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子Ｘのそのパートナー Ｙについての親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）により表わすことができる。親和性 は、当技術分野において公知の一般的な方法（本明細書に記載するものを含む）により測 定することができる。低親和性抗体は、一般的に、緩徐に抗原に結合し、容易に解離する 傾向があるのに対し、高親和性抗体は、一般的に、迅速に抗原に結合し、より長く結合し たままになる傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が、当技術分野において公知 であり、そのいずれかを本発明の目的のために使用することができる。結合親和性を測定 50 (52) JP 2012-511329 A 2012.5.24 するための特定の説明的および例示的な実施態様が、以下に記載される。 【０１６８】 本発明の「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、一実施態様において、Ｆａｂを最小濃度の（１ ２５ Ｉ）標識抗原と滴定系列の非標識抗原の存在において平衡化し、次に結合抗原を抗Ｆ ａｂ抗体コートプレートを用いて捕捉することにより、抗原についてのＦａｂの溶液結合 親和性を測定する以下のアッセイにより、記載される通りに、Ｆａｂバージョンの抗体と 抗原分子を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定する（Chen , et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881）。アッセイのための条件を確立するため に、マイクロタイタ―プレート（Dynex）を一晩５０mMの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６） 中の５ｕg/mlの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を用いてコートし、続いて、ＰＢＳ中 10 の２%（w/v）ウシ血清アルブミンを用いて２∼５時間にわたり室温（約２３℃）でブロッ クする。非吸着プレート（Nunc ＃２６９６２０）において、１００pMまたは２６pM［１ ２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の 評価と一致する。Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599）。目的のＦａｂ を次に一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションをより長期間（例、６５時 間）にわたり持続し、平衡に達することを確実にしてもよい。その後、混合物を、室温で の１時間にわたるインキュベーションのために捕捉プレートに移す。溶液を次に除去し、 プレートをＰＢＳ中の０．１% Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて８回洗浄する。プレートを乾 燥させた場合、１５０ｕl/ウェルのシンチラント（MicroScint-20; Packard）を加え、プ レートをTopcountガンマカウンター（Packard）で１０分間にわたりカウントする。２０% 20 未満またはそれに等しい最高結合を与える各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける 使用のために選ぶ。 【０１６９】 別の実施態様において、Ｋｄを、BIACORE（登録商標）2000またはBIACORE（登録商標） 3000機器（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを 使用することにより、２５℃で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて∼１０応答単位（ＲＵ） で測定する。簡単に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ （ＣＭ５，BIAcore Inc.）を、供給業者の指示に従い、Ｎ−エチル−ｎ’−（３−ジメチ ルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、流速５μL/分での注射前に１０mM酢酸ナト 30 リウム（ｐＨ４．８）を用いて５μg/ml（∼０．２μM）まで希釈し、約１０応答単位（ ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注射に続き、１Mエタノールアミンを注射し 、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８nM∼５０ ０nM）を、ＰＢＳ中で、０．０５% ＴＷＥＥＮ ２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ） を用いて、２５℃で、流速約２５μL/分で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度 （ｋｏｆｆ）を、簡単な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（BIAcore（登録商標）Eva luation Softwareバージョン3.2）を使用して、会合および解離センサーグラムを同時に 適合させることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算 出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)を参照のこと。オン 速度が上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６M-1S-1を超える場合、次に、オン速 40 度を、２５℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光 強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmバンドパス）における増加または減少を 測定する蛍光クエンチング技術を、分光計（例えばストップフロー装備分光光度計（Aviv Instruments）または8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic） など）において、撹拌キュベットを用いて測定される増加濃度の抗原の存在において、使 用することにより決定することができる。 【０１７０】 本発明の「オン速度」、「会合の速度」、「会合速度」、または「ｋｏｎ」は、また、 上に記載の通りに、BIACORE（登録商標）2000またはBIACORE（登録商標）3000システム（ BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して、２５℃で、固定化抗原ＣＭ５チップを用 50 (53) JP 2012-511329 A 2012.5.24 いて約１０応答単位（RU）で決定することができる。簡単に説明すると、カルボキシメチ ル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，BIAcore Inc.）を、供給業者の指示に 従い、Ｎ−エチル−ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（Ｅ ＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、流 速５ｍL/分での注射前に１０mM酢酸ナトリウム（ｐｈ４．８）を用いて５mg/ml（≒０． ２mM）まで希釈し、約１０応答単位（RU）の共役タンパク質を達成する。抗原の注射に続 き、１Ｍエタノールアミンを加えて、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの ２倍連続希釈物（０．７８nM∼５００nM）を、ＰＢＳ中で、０．０５% ＴＷＥＥＮ ２ ０（ＰＢＳＴ）を用いて、２５℃で、流速約２５μL/分で注射する。会合速度（ｋｏｎ） および解離速度（ｋｏｆｆ）を、簡単な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（BIAcore 10 Evaluation Softwareバージョン3.2）を使用して、会合および解離センサーグラムを同時 に適合させることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして 算出する。例えば、Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881を参照のこと 。しかし、オン速度が上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６M-1S-1を超える場合 、次に、オン速度を、２５℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ形 態）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０nm、１６nmバンドパス）における 増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術を、分光計（例えばストップフロー装備 分光光度計（Aviv Instruments）または8000シリーズSLM-AMINCO分光光度計（ThermoSpec tronic）など）において、撹拌キュベットを用いて測定される増加濃度の抗原の存在にお いて、使用することにより決定することができる。 20 【０１７１】 「実質的に低下した」または「実質的に異なる」という表現は、本明細書で使用する通 り、２つの数値（一般的に、１つは分子に関連し、他は参照／比較分子に関連する）の間 での十分に高い程度の差を示し、当業者が、２つの値の間での差が、前記値（例、Ｋｄ値 ）により測定される生物学的特徴の関連内で統計的な有意性であると考えうる。前記の２ つの値の間での差は、参照／比較分子についての値の機能として、例えば、約１０%超、 約２０%超、約３０%超、約４０%超、および／または約５０%超である。 【０１７２】 「実質的に類似の」または「実質的に同じ」という用語は、本明細書で使用する通り、 ２つの数値（例えば、１つは本発明の抗体に関連し、他は参照／比較抗体に関連する）の 30 間の十分に高い程度の類似性を示し、当業者が、２つの値の間での差が、前記値（例、Ｋ ｄ値）により測定される生物学的特徴の関連内で生物学的および／または統計的な有意性 がほとんどないと考えうる。前記の２つの値の間での差は、参照／比較値の機能として、 例えば、約５０%未満、約４０%未満、約３０%未満、約２０%未満、および／または約１０ %未満である。 【０１７３】 ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント（%）アミノ酸配列同 一性」および「相同性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パ ーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の部分として考えず） 、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中 40 のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決 定する目的のためのアラインメントは、当技術分野内にある種々の方法で、例えば、公的 に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMEGAL IGN（商標）（DNASTAR）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、 アラインメントを測定するための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわた る最高アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定 することができる。本明細書における目的のために、%アミノ酸配列同一性の値を、配列 比較コンピュータープログラムALIGN-2（作成者Genentech, Inc.）を使用して生成する。 ALIGN-2のソースコードが、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559においてユ ーザー文書と共にファイルされており、そこでは、それはU.S. Copyright Registration 50 (54) JP 2012-511329 A 2012.5.24 No.TXU510087下で登録される。ALIGN-2プログラムが、Genentech, Inc., South San Fran cisco, Californiaを通じて公的に利用可能である。ALIGN-2プログラムを、UNIX操作シス テム、好ましくはデジタルUNIX V4.0D上での使用のために編集すべきである。全ての配列 比較パラメーターがALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。 【０１７４】 ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ａ の所与のアミノ酸配列Ｂに、それと、またはそれに対する%アミノ酸配列同一性（あるい は、所与のアミノ酸配列Ｂに、それと、またはそれに対する特定の%アミノ酸配列同一性 を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現することができる）を以下： １００×分数Ｘ／Ｙ 10 （式中、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメン トプログラムＡＬＩＧＮ−２による同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数 であり、式中、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）の通りに算出する。アミノ酸 配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくない場合、ＡのＢに対する%アミノ酸配 列同一性は、ＢのＡに対する%アミノ酸配列同一性とは等しくないと理解されるであろう 。 【０１７５】 別に特記なき場合、本明細書で使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値は、直前のパ ラグラフにおいて記載される通りに、ALIGN-2コンピュータープログラムを使用して得ら れる。 20 【０１７６】 本明細書における抗体をコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境におい て通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離される核酸分子で ある。好ましくは、単離核酸は、産生環境に関連する全ての成分との会合がない。本明細 書におけるポリペプチドおよび抗体をコードする単離核酸分子は、それが天然で見出され る形態または設定以外の形態である。単離核酸分子は、従って、細胞中に天然に存在する 本明細書におけるポリペプチドおよび抗体をコードする核酸から区別される。 【０１７７】 「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において機能的に連結されたコー ド配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物のために適したコントロール配 30 列は、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部 位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを 利用することが公知である。 【０１７８】 核酸は、それが、別の核酸配列と機能的な関係におかれた場合に「機能的に連結されて いる」。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡを、それが、ポリペプチドの分 泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチド用のＤＮＡに機能的に 連結し；プロモーターまたはエンハンサーを、それが配列の転写に影響を与える場合、コ ード配列に機能的に連結し；または、リボソーム結合部位を、それが翻訳を促進するよう に位置付けられる場合、コード配列に機能的に連結する。一般的に、「機能的に連結され 40 た」は、連結されたＤＮＡ配列が近接しており、および、分泌リーダーの場合では、近接 し、リーディング段階にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接する必要はな い。連結は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場 合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実行に従って使用する。 【０１７９】 「エピトープタグ付き」という用語は、本明細書で使用する場合、「タグポリペプチド 」に融合された本明細書に記載されるポリペプチドまたは抗体を含むキメラポリペプチド を指す。タグポリペプチドは、抗体を作製することができるエピトープを提供するための 十分な残基を有し、しかし、それは、それが融合されるポリペプチドの活性に干渉しない ように十分に短い。タグポリペプチドは、好ましくは、また、抗体が他のエピトープと実 50 (55) JP 2012-511329 A 2012.5.24 質的に交差反応しないようにかなり固有である。適したタグポリペプチドは、一般的に、 少なくとも６つのアミノ酸残基および通常は約８∼５０のアミノ酸残基（好ましくは、約 １０∼２０アミノ酸残基）を有する。 【０１８０】 本明細書で使用する通り、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質の結合 特異性（「付着性」）を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる 抗体様分子を命名する。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部 位以外の（即ち、「異種」である）所望の結合特異性を伴うアミノ酸配列と、免疫グロブ リン定常ドメイン配列の融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型 的に、受容体またはリガンドの少なくとも結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イム 10 ノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩ ｇＧ−１、ＩｇＧ−２（ＩｇＧ２ＡおよびＩｇＧ２Ｂを含む）、ＩｇＧ−３、またはＩｇ Ｇ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ま たはＩｇＭなどから得てもよい。Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１ つの可変領域の場所に、本明細書に記載するポリペプチドまたは抗体のドメインの置換を 含む。特定の好ましい実施態様において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒン ジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む。免 疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６ 月２７日公開）も参照のこと。例えば、本明細書における組み合わせ治療のために有用で ある第２の医薬として有用なイムノアドヘシンは、免疫グロブリン配列の定常ドメインに 20 融合された、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の細胞外もしくはＰＤ−１結合部分（あるい はその逆）を含むポリペプチドを含む。 【０１８１】 「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合的に一緒に連結された２ つの部分を有するポリペプチドを指し、部分の各々は異なる特性を有するポリペプチドで ある。特性は生物学的特性、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの活性など でありうる。特性は、また、簡単な化学的または物理的特性、例えば標的分子に対する結 合、反応の触媒などでありうる。２つの部分を、単一ペプチド結合によりまたはペプチド リンカーを通じて、互いにリーディングフレームで直接的に連結してもよい。 【０１８２】 30 「安定的な」製剤は、その中のタンパク質が保存時にその物理的および化学的な安定性 ならびに完全性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための種 々の分析技術が、当技術分野において利用可能であり、Peptide and Protein Drug Deliv ery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs.(19 91)およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)において概説される。 安定性は、選択された温度で、選択された時間にわたり測定することができる。迅速スク リーニングのために、製剤を４０℃で２週間から１ヶ月間にわたり保つことができ、その 時間で安定性を測定する。製剤を２∼８℃で保存する場合、一般的に、製剤は３０℃また は４０℃で少なくとも１ヶ月にわたり安定であるおよび／または２∼８℃で少なくとも２ 年間にわたり安定であるべきである。製剤を３０℃で保存する場合、一般的に、製剤は少 40 なくとも２年間にわたり３０℃で安定であるおよび／または４０℃で少なくとも６ヶ月に わたり安定であるべきである。例えば、保存の間での凝集の程度を、タンパク質安定性の 指標として使用することができる。このように、「安定な」製剤は、タンパク質の約１０ %未満および好ましくは約５%未満が製剤中の凝集体として存在するものでありうる。他の 実施態様において、製剤の保存の間での凝集体形成における任意の増加を決定することが できる。 【０１８３】 「再構成」製剤は、凍結乾燥タンパク質または抗体製剤を希釈剤中に、タンパク質が全 体に分散するように溶解することにより調製されたものである。再構成製剤は、目的のタ ンパク質を用いて処置される患者に対する投与（例、皮下投与）のために適しており、本 50 (56) JP 2012-511329 A 2012.5.24 発明の特定の実施態様において、非経口または静脈内投与のために適したものでありうる 。 【０１８４】 「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、一 般的に、約２５０∼３５０mOsmの浸透圧を有する。「低張」という用語は、ヒト血液のも のを下回る浸透圧を伴う製剤を記載する。対応して、「高張」という用語を使用して、ヒ ト血液のものを上回る浸透圧を伴う製剤を記載する。等張性を、例えば、蒸気圧または製 氷型浸透圧計を使用して測定することができる。本発明の製剤は、塩および／または緩衝 剤の添加の結果として高張である。 【０１８５】 10 「担体」は、本明細書で使用する通り、用いた投与量および濃度でそれに暴露された細 胞または哺乳動物に対して非毒性である医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤 を含む。しばしば、生理学的に許容可能な担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に 許容可能な担体の例は、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、および他の有機酸など；抗酸 化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質 、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポ リビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アル ギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース 、またはデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖アルコール、例え ばマンニトールまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；およ 20 び／または非イオン界面活性剤、例えばTWEEN（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）、およびPLURONICS（商標）である。 【０１８６】 「添付文書」は、適応、使用法、投与量、投与法、禁忌、パッケージされた産物と組み 合わせる他の医薬、および／またはそのような医薬の使用に関する警告などに関する情報 を含む、医薬の市販パッケージに通例含まれる適応に関する情報を含む、医薬の市販パッ ケージに通例含まれる使用説明書を指す。 【０１８７】 「医薬的に許容可能な酸」は、それらが製剤化される濃度および様式で非毒性である無 機酸および有機酸を含む。例えば、適した無機酸は、塩酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ 30 化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸など を含む。適した有機酸は、適した有機酸は、直鎖および分枝鎖アルキル、芳香族酸、環状 酸、脂環式酸、アリール脂肪酸、複素環式酸、飽和、不飽和、モノ、ジ、およびトリカル ボン酸、例えば、ギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、 トリメチル酢、ｔブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロピオン 酸、２−オキソプロパン酸、プロパン酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタン プロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタンジオイン酸（butandioic） 、安息香酸、３−（４ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、ア スコルビン酸、肉桂酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸 、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳 40 酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グリコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキ サル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモ酸（palmoic） 、パルメイン酸（palmeic）、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１ ，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルフホン酸、ベンゼンスルホン酸、 ４−コロベンゼンスルホン酸（chorobenzenesulfonic）、ナフタレン−２−スルホン酸、 ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルバイシクロ［２．２．２］ −オクト−２−エン−１−カルボキシル酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス −３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボキシル酸）、ヒドロキシナフトイン酸（hydr oxynapthoic）を含む。 【０１８８】 50 (57) JP 2012-511329 A 2012.5.24 「医薬的に許容可能な塩基」は、それらが製剤化される濃度および様式で非毒性である 無機および有機塩基を含む。例えば、適した塩基は、金属を形成する無機塩基から形成さ れるもの、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモ ニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルフォリン 、ピペリジンなどおよび有機非毒性塩基、１級、２級、および３級アミン、置換アミン、 環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、［例、Ｎ（Ｒ’）４＋（式中、Ｒ’は非依存的 にＨまたはＣ１−４アルキルである。例、アンモニウム、Ｔｒｉｓ）］、例えば、イソプ ロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルア ミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン（trimethamine ）、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイ 10 ン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカ ミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリア ミン樹脂などを含む。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルア ミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフ ェインである。本発明と共に使用可能な追加の医薬的に許容可能な酸および塩基は、アミ ノ酸に由来するもの、例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン 酸、グルタミン酸、リジン、およびアスパラギンを含む。 【０１８９】 「医薬的に許容可能な」緩衝剤および塩は、上に示された酸および塩基の酸性および塩 基性の両方の添加塩に由来するものを含む。特定の緩衝剤および／または塩は、ヒスチジ 20 ン、コハク酸、および酢酸を含む。 【０１９０】 「医薬的に許容可能な糖」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、保存時にタンパ ク質の化学的および／または物理的な不安定性を有意に予防または低下する分子である。 製剤を凍結乾燥し、次に再構成することを意図する場合、「医薬的に許容可能な糖」は「 リオプロテクタント（lyoprotectant）」としても公知でありうる。例示的な糖およびそ れらの対応する糖アルコールは以下：アミノ酸、例えばグルタミン酸一ナトリウムまたは ヒスチジンなど；メチルアミン、例えばベタインなど；離液系列塩、例えば硫酸マグネシ ウムなど；ポリオール、例えば三価アルコールまたはより高分子量の糖アルコール、例、 グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトー 30 ル、ソルビトール、およびマンニトールなど；プロピレングリコール；ポリエチレングリ コール；PLURONICS（登録商標）；およびそれらの組み合わせ。追加の例示的なリオプロ テクタントは、グリセリンおよびゼラチン、ならびに糖、メリビオース（mellibiose）、 メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、およびスタキオースを含む。還元糖の 例は、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソ−マルツロース、およ びラクツロースを含む。非還元糖の例は、糖アルコールおよび他の直鎖多価アルコールか ら選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドを含む。好ましい糖アルコールは 、モノグリコシド、特に二糖類、例えばラクトース、マルトース、ラクツロース、および マルツロースなどの還元により得られる化合物である。グリコシド側基はグルコシドまた はガラクトシドのいずれかでありうる。糖アルコールの追加の例は、グルシトール、マル 40 チトール、ラクチトール、およびイソ−マルツロースである。好ましい医薬的に許容可能 な糖は、非還元糖、トレハロースまたはスクロースである。医薬的に許容可能な糖を「保 護量」で製剤に加え（例、凍結乾燥前）、それは、タンパク質が保存の間（例、再構成お よび保存後）にその物理的および化学的な安定性および完全性を本質的に保持することを 意味する。 【０１９１】 本明細書における目的の「希釈剤」は、医薬的に許容可能であり（ヒトへの投与につい て安全で非毒性であり）、液体製剤（例えば凍結乾燥後に再構成される製剤など）の調製 のために有用であるものである。例示的な希釈剤は、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ ）、ｐＨ緩衝溶液（例、リン酸緩衝食塩水）、無菌生理食塩液、リンゲル液、またはデキ 50 (58) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ストロース溶液を含む。代わりの実施態様において、希釈剤は塩および／または緩衝剤の 水溶液を含むことができる。 【０１９２】 「保存剤」は、細菌の活性を低下するために本明細書の製剤に加えられることができる 化合物である。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数用量）製剤の産生を容易にし うる。潜在的な保存剤の例は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、 ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキル基が長鎖化合物で あるアルキルベンジルメチルアンモニウムクロライドの混合物）、およびベンゼトニウム クロライドを含む。保存剤の他の型は、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル、 およびベンジルアルコールなど、アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベ 10 ン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ− クレゾールを含む。本明細書における最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである 。 【０１９３】 「処置」は、処置されている個人または細胞の自然経過を変化させるように設計された 臨床介入であり、予防のためまたは臨床病理の経過の間に実施することができる。処置の 所望の効果は、疾患の発生または再発を予防すること、転移を予防すること、疾患進行の 速度を減少させること、疾患状態を寛解または緩和させること、および寛解または改善さ れた予後を含む。一部の実施態様において、本発明の抗体を使用し、疾患または障害の発 生を遅延させる。被験者は、例えば、本発明のアポトーシス抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して 20 Ｔ細胞機能障害性障害に関連する１つまたは複数の症状が軽減される場合、成功裏に「処 置される」。 【０１９４】 「有効量」は、少なくとも、所望のまたは示された効果（治療的または予防的な結果を 含む）を達成するために必要な投与量でおよび期間にわたり効果的な量を指す。例えば、 本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の有効量は、少なくとも、Ｔ細胞上のＰＤ−１または他のＡＰ Ｃもしくは両方の上のＢ７．１を通じたＰＤ−Ｌ１からのシグナル伝達の阻害をもたらす 最小濃度である。 【０１９５】 「治療的有効量」は、少なくとも、特定の障害の測定可能な改善または予防に効果を及 30 ぼすために要求される最小濃度である。本明細書における治療的有効量は、因子、例えば 患者の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体が個人において所望の応答を誘 発する能力などに従って変動しうる。治療的有効量は、また、抗体の任意の毒性または有 害効果よりも治療的に有益な効果が勝るものである。例えば、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体 の治療的有効量は、少なくとも、Ｔ細胞機能障害性障害の少なくとも１つの症状の阻害を もたらす最小濃度である。 【０１９６】 「予防的有効量」は、所望の予防的な結果を達成するために必要な投与量でおよび期間 にわたり効果的な量を指す。例えば、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の予防的有効量は、少な くとも、Ｔ細胞機能障害性障害の少なくとも１つの症状の発生を予防または減弱させる最 40 小濃度である。 【０１９７】 「慢性」投与は、延長した期間にわたり最初の治療効果（活性）を維持するような、急 性とは反対の持続的な様式での医薬の投与を指す。「間欠」投与は、中断なしに連続的に 行われないが、しかし、むしろ本来は周期的である処置である。 【０１９８】 処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物（ヒト、家庭動物および農場動物、なら びに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物（例えばイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、 ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなど）を含む）と して分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。 50 (59) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０１９９】 「医薬的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的になることを許すよう な形態であり、および製剤が投与されうる被験者に対して非許容可能に有毒である追加成 分を含まない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。 【０２００】 「無菌」製剤は無菌であり、全ての生きた微生物およびそれらの胞子を含まない。 【０２０１】 「約」という用語は、本明細書で使用する通り、当業者に周知であるそれぞれの値につ いての通常の誤差範囲を指す。 10 【０２０２】 「自己免疫障害」は、個人自身の組織または臓器から生じるおよびそれに対する疾患ま たは障害あるいはその同時分離または発現あるいはそれに起因する状態である。自己免疫 疾患は、臓器特異的疾患（即ち、免疫応答は、具体的には、臓器系、例えば内分泌系、造 血系、皮膚、心肺系、胃腸および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、筋神経系、中枢神経系な どに向けられる）または複数の臓器系に影響を及ぼしうる全身疾患（例えば、全身性エリ テマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性筋炎など）でありうる。好まし いそのような疾患は、自己免疫性リウマチ学的障害（例えば、ＲＡ、シェーグレン症候群 、強皮症、ループス、例えばＳＬＥおよびループス腎炎など、多発性筋炎−皮膚筋炎、ク リオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、および乾癬性関節炎など）、自己免疫性胃 腸および肝臓障害（例えば、炎症性腸疾患（例、潰瘍性結腸炎およびクローン病）、自己 20 免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管 炎、およびセリアック病など）、血管炎（例えば、ＡＮＣＡネガティブ血管炎およびＡＮ ＣＡ関連血管炎、チャーグ・ストラウス血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、および顕微鏡的多 発血管炎などを含む）、自己免疫性神経性障害（例えば、多発性硬化症、眼球クローヌス 筋クローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー疾 患、および自己免疫性多発ニューロパシーなど）、腎臓障害（例えば、糸球体腎炎、グッ ドパスチャー症候群、およびベルジェ病など）、自己免疫性皮膚科学的障害（例えば、乾 癬、蕁麻疹、発疹、尋常天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および皮膚エリテマトーデスなど）、 血液学的障害（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑、 および自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性 30 聴覚疾患（例えば、内耳疾患および聴力喪失など）、ベーチェット病、レイノー症候群、 臓器移植、および自己免疫性内分泌障害（例えば、糖尿病関連の自己免疫疾患、例えばイ ンスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、アジソン病、および自己免疫性甲状腺疾患（例、グ レーブス疾患および甲状腺炎）など）を含む。より好ましいそのような疾患は、例えば、 ＲＡ、潰瘍性結腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候 群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、および糸球体腎炎を含む。 【０２０３】 「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用する通り、細胞の機能を阻害もしく は予防するおよび／または細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は放射性同位元素（ 例、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、 ２１２ Ｂｉ 40 ３２ 、Ｐ およびＬｕの放射性同位元素）、および毒素（例えば細菌、真菌、植 物、または動物由来の小分子毒素または酵素的に活性な毒素、あるいはそのフラグメント など）を含む。 【０２０４】 「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例は、 アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））など ；アルキルスルホン酸、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファ ンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドー パなど；エチレンイミンおよびメチルメラミン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン 、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロー 50 (60) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ロメラミンを含む；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９− テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ−ラパ コン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン （HYCAMTIN（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、 アセチルカンプトテシン、スコポレチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブ リオスタチン；ペメトレキセド；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カ ルゼルシン、およびビセレシン合成的類似物を含めて）；ポドフィロトキシン；ポドフィ リン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシ ン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ １−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；ＴＬＫ−２８６；ＣＤＰ３ 10 ２３、経口アルファ４インテグリン阻害剤；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイト ロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（Ch olophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミ ンオキシド塩酸、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニマスチン、 トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosureas）、例えばカル ムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチ ン（ranimnustine）など；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例、カリケアマイシン 、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例、Nicolaou e t al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照のこと）；ダイネミシ ン、ダイネミシンＡを含む；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団およ 20 び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノ マイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビ シン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウ ノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン （ADRIAMYCIN（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソ ルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（DOXI L（登録商標））およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン 、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、ミ コフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシ ン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾ 30 シン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメ トトレキサート、ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））、テガフール（UFTORAL（登録商 標））、カペシタビン（XELODA（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシ ル（５−ＦＵ）など；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプ テリン、トリメトレキセートなど；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６−メルカプ トプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン 、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、 ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、およびイマチニブ（２−フェニル アミノピリミジン誘導体）、ならびに他のｃ−Ｋｉｔ阻害剤など；抗副腎剤、例えばアミ ノグルテチミド、マイトテイン、トリロスタンなど；葉酸補液、例えばフロリン酸など； 40 アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；ア ムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメ コルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガ リウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えばメイタン シンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニト ラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチ ルヒドラジド（ethylhydrazide）；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖体複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲ ルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルア ミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジ 50 (61) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ン）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカル バジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシ ン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例、パクリタキセル（TA XOL（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ABRAXANE（商標） ）、およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン ；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチンおよび カルボプラチンなど；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商 標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））； ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート 10 ；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）； レチノイド、例えばレチノイン酸など；上のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、また は誘導体；ならびに上の２つまたはそれ以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ（シクロホス ファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの組み合わせ治療の 略語）、およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラ チン（ELOXATIN（商標））を用いた処置計画の略語）である。 特に腫瘍免疫の処置において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで有用な特に 好ましい化学療法剤は、ゲムシタビンである。 【０２０５】 また、この定義には、癌の増殖を促進することができるホルモンの効果を調節、低下、 20 遮断、または阻害するように作用する抗ホルモン薬剤が含まれ、しばしば、全身または体 全体の処置の形態である。それらはホルモン自体でありうる。例は、抗エストロゲンおよ び選択的エストロジェン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（EVISTA（登録商標）） 、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェ ン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON（登録商標）） を含む；抗プロゲステロン；エストロジェン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；エ ストロジェン受容体アンタゴニスト、例えばフルベストラント（FASLODEX（登録商標）） など；卵巣を抑制またはシャットダウンするよう機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモ ン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば酢酸ロイプロリド（LUPRON（登録商標） 30 およびELIGARD（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプテレリ ンなど；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、およびビカルタミドなど；お よび酵素アロマターゼ（副腎においてエストロゲン産生を調節する）を阻害するアロマタ ーゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロー ル（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（AROMASIN（登録商標））、フォルメ スタニー、ファドロゾール、ボロゾール（RIVISOR（登録商標））、レトロゾール（FEMAR A（登録商標））、およびアナストロゾール（ARIMIDEX（登録商標））を含む。また、化 学療法剤のそのような定義は、ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えば、BONE FOS（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（DIDROCAL（登録商 標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ZOMETA（登録商標））、ア 40 レンドロネート（FOSAMAX（登録商標））、パミドロネート（AREDIA（登録商標））、チ ルドロネート（SKELID（登録商標））、またはリセドロネート（ACTONEL（登録商標）） ；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）； アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路におけ る遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、およ び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えばTHERATOPE（登録商標）ワクチ ンおよび遺伝子治療ワクチン、例えば、ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（ 登録商標）ワクチン、およびVAXID（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（ 例、LURTOTECAN（登録商標））；抗エストロゲン剤、例えばフルベストラントなど；Ｋｉ ｔ阻害剤、例えばイマチニブまたはＥＸＥＬ−０８６２など（チロシンキナーゼ阻害剤） 50 (62) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ；ＥＧＦＲ阻害剤、例えばエルロチニブまたはセツキシマブなど；抗ＶＥＧＦ阻害剤、例 えばベバシズマブなど；アリノテカン（arinotecan）；ｒｍＲＨ（例、ABARELIX（登録商 標））；ラパチニブおよびラパチニブトシル酸（ＧＷ５７２０１６としても公知のＥｒｂ Ｂ−２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；１７ＡＡＧ（熱ショック タンパク質（Ｈｓｐ）９０毒物であるゲルダナマイシン誘導体）、および上のいずれかの 医薬的に許容可能な塩、酸、または誘導体を含む。 【０２０６】 「増殖阻害剤」は、細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指し、その増殖はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかの受容体活性化に依存する。このように、 増殖阻害剤は、Ｓ期中の受容体依存性細胞のパーセンテージを有意に低下するものを含む 10 。増殖阻害剤の例は、（Ｓ期以外の場所において）細胞周期進行を遮断する薬剤、例えば Ｇ１期停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などを含む。古典的なＭ期遮断剤は、ビンカお よびビンカアルカロイド（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、およびト ポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エ トポシド、およびブレオマイシンなどを含む。Ｇ１停止させるそれらの薬剤は、Ｓ期停止 中にも及ぶ（例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカ ルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、 およびａｒａＣなど）。さらなる情報が、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1、表題"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineop lastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)(特にp. 13)に 20 おいて見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方と もがイチイ木に由来する抗癌薬物である。ドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、RhonePoulenc Rorer）は、ヨーロッパイチイに由来し、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、 Bristol-Myers Squibb）の半合成アナログである。 【０２０７】 「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして別の細胞に対して作用す る１つの細胞集団により放出されるタンパク質についての属名である。そのようなサイト カインの例は、リンホカイン、モノカイン；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１ 、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ− ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５．．．ＩＬ−３５、PR 30 OLEUKIN（登録商標）ｒＩＬ−２を含む；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ −βなど；および他のポリペプチド因子、ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む。 「インターロイキン」という用語は、現在、本質的にサイトカインの同義語になっている 。本明細書で使用する通り、サイトカインという用語は、天然供給源からまたは組換え細 胞培養およびネイティブ配列サイトカインの生物学的に活性な等価物（合成的に産生され た小分子実体ならびに医薬的に許容可能なその誘導体および塩を含む）からのタンパク質 を含む。サイトカインは意図される標的の近位部位に分類することができ、それにおいて オートクラインは、それが分泌される同じ細胞上での作用を指し、パラクラインは、サイ トカインが分泌される直ぐ近傍に限定される作用を指し、エンドクラインは、身体の遠い 領域での作用を指す。免疫サイトカインは、それらが細胞免疫を支持するＩ型応答（例、 40 ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−βなど）または抗体もしくは液性免疫を支持するＩＩ型応答（ＩＬ −４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）のどちらを増強するかにより分類することもできる 。免疫サイトカインは、種々の免疫細胞の同時刺激、成熟、増殖、活性化、炎症、増殖、 分化、サイトカイン産生および分泌、生存において役割を果たす。 【０２０８】 「ホルモン」という用語はポリペプチドホルモンを指し、それは一般的に導管を伴う腺 器官により分泌される。ホルモンには、例えば、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン 、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロ キシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；エストラジオール；ホルモン置換療 法；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタ 50 (63) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ノール、メピチオスタン、またはテストラクトンなど；プロレラキシン；糖タンパク質ホ ルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体 ホルモン（ＬＨ）など；プロラクチン、胎盤ラクトゲン、マウスゴナドトロピン関連ペプ チド、ゴナドトロピン放出ホルモン；インヒビン；アクチビン；ミュラー阻害物質；およ びトロンボポエチンが含まれる。本明細書で使用する通り、ホルモンという用語は、天然 供給源からまたは組換え細胞培養およびネイティブ配列ホルモンの生物学的に活性な等価 物（合成的に産生された小分子実体ならびに医薬的に許容可能なその誘導体および塩を含 む）からのタンパク質を含む。 【０２０９】 ＩＩＩ．本発明を行うための様式 10 Ａ．ファージディスプレイを使用したヒト化 本明細書に記載する超可変領域を移植したバリアントは、各超可変領域について別々の オリゴヌクレオチドを使用して、ヒト受容体配列をコードする核酸のKunkel突然変異誘発 により生成した。Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987).適切な変化を 、通常の技術を使用してフレームワークおよび／または超可変領域中に導入し、適した超 可変領域−抗原相互作用を補正および再確立することができる。 【０２１０】 ファージ（ミド）ディスプレイ（本明細書でファージディスプレイともいう）を、配列 ランダム化により生成されたライブラリーにおいて多くの異なる潜在的なバリアント抗体 を生成およびスクリーニングするための便利で速い方法として使用することができる。し 20 かし、変化した抗体を作製およびスクリーニングするための他の方法が、当業者には利用 可能である。 【０２１１】 ファージ（ミド）ディスプレイ（一部の状況においてファージディスプレイともいう） を、配列ランダム化により生成されたライブラリーにおいて多くの異なる潜在的なバリア ント抗体を生成およびスクリーニングするための便利で速い方法として使用することがで きる。しかし、変化した抗体を作製およびスクリーニングするための他の方法が、当業者 には利用可能である。 【０２１２】 ファージ（ミド）ディスプレイ技術は、リガンド（例えば抗原など）に結合する新規タ 30 ンパク質を生成および選択するための強力なツールを提供してきた。ファージ（ミド）デ ィスプレイの技術を使用することによって、タンパク質バリアントの大ライブラリーの生 成が可能になり、それは高親和性を伴う標的分子に結合するそれらの配列について迅速に 選別することができる。バリアントポリペプチドをコードする核酸は、一般的に、ウイル スコートタンパク質（例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質な ど）をコードする核酸配列に融合される。タンパク質またはポリペプチドをコードする核 酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の部分をコードする核酸配列に融合された一価ファージ ミドディスプレイシステムが開発されている（Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Low man and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)）。 一価ファージミドディスプレイシステムにおいて、遺伝子融合体が低レベルで発現され、 40 野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現され、粒子の感染性が保持される。ペプチドライブ ラリーを生成し、それらのライブラリーをスクリーニングするための方法が、多くの特許 において開示されている（例、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２ ，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、およ び米国特許第５，４９８，５３０号）。 【０２１３】 抗体または抗原結合ポリペプチドのライブラリーが、多くの方法（ランダムＤＮＡ配列 を挿入することにより単一遺伝子を変化させることによるまたは関連遺伝子のファミリー をクローニングすることによる、を含む）で調製されている。ファージ（ミド）ディスプ レイを使用して抗体または抗原結合性フラグメントを提示するための方法が、米国特許第 50 (64) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ５，７５０，３７３号、第５，７３３，７４３号、第５，８３７，２４２号、第５，９６ ９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，５８０，７１７号、および第５，６５８ ，７２７号に記載されている。ライブラリーを、次に、所望の特徴を伴う抗体または抗原 結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。 【０２１４】 鋳型核酸中に選択したアミノ酸を置換する方法が、当技術分野において十分に確立され ており、その一部が本明細書に記載される。例えば、超可変領域残基を、Kunkel方法を使 用して置換することができる。例えば、Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987)を参照のこと。 【０２１５】 10 オリゴヌクレオチドの配列は、変化させる超可変領域残基についての設計コドン組の１ つまたは複数を含む。コドン組は、所望のバリアントアミノ酸をコードするために使用さ れる異なるヌクレオチドトリプレット配列の組ある。コドン組を、特定のヌクレオチドま たはヌクレオチドの等モル混合物を命名するための記号を使用して、以下に示す通りに、 ＩＵＢコードに従って表わすことができる。 【０２１６】 【表１】 20 30 【０２１７】 オリゴヌクレオチドまたはプライマー組を標準的な方法を使用して合成することができ る。オリゴヌクレオチドの組を、例えば、固相合成により合成することができ、コドン組 により提供されるヌクレオチドトリプレットの全ての可能な組み合わせを表し、アミノ酸 40 の所望の群をコードする配列を含む。特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮重」を 伴うオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野において周知である。特定のコドン組を有 するヌクレオチドのそのような組を、市販の核酸シンセサイザー（例えば、Applied Bios ystems, Foster City, CAから利用可能）を使用して合成することができる、または商業 的に得ることができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。従って、特 定のコドン組を有する合成されたオリゴヌクレオチドの組は、典型的には、異なる配列を 伴う複数のオリゴヌクレオチドを含み、差は全体的な配列内のコドン組により確立される 。オリゴヌクレオチドは、本発明に従って使用される通り、可変ドメイン核酸鋳型へのハ イブリダイゼーションを可能にし、また、クローニング目的のための制限酵素部位を含む ことができる。 50 (65) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０２１８】 １つの方法において、バリアントアミノ酸をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチ ド媒介性の突然変異誘発により作製することができる。この技術は、当技術分野において 周知であり、Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987)により記載され る。簡単に説明すると、バリアントアミノ酸をコードする核酸配列は、所望のコドン組を コードするオリゴヌクレオチド組をＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることにより作製さ れ、そこで鋳型は可変領域核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖形態である。ハイブリ ダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、このようにオリゴヌクレオチドプラ イマーを取り込むであろう、およびオリゴヌクレオチド組により提供されるコドン組を含 むであろう鋳型の第２相補鎖全体を合成する。 10 【０２１９】 一般的に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオ リゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側で鋳型に完全に 相補的である１２∼１５ヌクレオチドを有するであろう。これによって、オリゴヌクレオ チドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズすることが確実となる。オリゴヌク レオチドは、当技術分野において公知の技術、例えばCrea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978)により記載されるものなどを使用して容易に合成される。 【０２２０】 ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（商業的に利用可能なＭ１３ｍｐ１ ８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適する）に由来するベクター、または、Viera et al. 20 , Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)により記載される一本鎖ファージ複製起点を含むベク ターにより生成される。このように、突然変異されるＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するた めに、これらのベクターの１つに挿入することができる。一本鎖鋳型の産生は、Sambrook et al.（上記）のセクション４．２１−４．４１に記載される。 【０２２１】 ネイティブなＤＮＡ配列を変化させるために、オリゴヌクレオチドを、適したハイブリ ダイゼーション条件下で一本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。ＤＮＡ重合酵素、通常Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを次に加え 、合成用のプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して鋳型の相補鎖を合成する。ヘ テロ二本鎖分子をこのように形成させ、ＤＮＡの１つの鎖が遺伝子１の突然変異形態をコ 30 ードし、他の鎖（本来の鋳型）が遺伝子１の天然の不変配列をコードする。このヘテロ二 本鎖分子を、次に、適した宿主細胞、通常原核生物（例えばＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１な ど）中に形質転換する。細胞を増殖後、それらをアガロースプレート上にプレーティング し、３２リン酸を用いて放射標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリ ーニングし、突然変異ＤＮＡを含む細菌コロニーを同定する。 【０２２２】 直ぐ上に記載する方法を改変してもよく、ホモ二本鎖分子が作製され、それにおいてプ ラスミドの両鎖が突然変異を含む。改変は以下の通りである：一本鎖オリゴヌクレオチド を、上に記載する通りに、一本鎖鋳型にアニーリングする。３つのデオキシリボヌクレオ チド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、お 40 よびデオキシリボチミン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾チオ デオキシリボシトシン（Amershamから入手することができる）と組み合わせる。この混合 物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物へのＤＮＡポリメラーゼの添 加時、突然変異塩基を除いて鋳型と同一であるＤＮＡの鎖が生成される。また、ＤＮＡの この新たな鎖は、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、それを制限エンドヌク レアーゼ消化から保護するのに役立つ。二本鎖のヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適切な制限酵素 を用いてニックを入れた後、鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは別の適切なヌクレ アーゼを用いて消化し、突然変異させる部位を含む領域以外で切断することができる。反 応を次に停止させ、部分的にだけ一本鎖である分子を残す。完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本 鎖を、次に、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、全ての４つのデオキシリボヌクレオチド三 50 (66) JP 2012-511329 A 2012.5.24 リン酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在において形成する。このホモ二本鎖分子を 次に適した宿主細胞中に形質転換することができる。 【０２２３】 以前に示した通り、オリゴヌクレオチド組の配列は、鋳型核酸にハイブリダイズするた めに十分な長さがあり、また、制限部位を含みうるが、しかし、必ずしも含まない。ＤＮ Ａ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、または、Viera et a l., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)により記載される一本鎖ファージ複製起点を含むベ クターにより生成することができる。このように、突然変異されるＤＮＡは、一本鎖鋳型 を生成するために、これらのベクターの１つに挿入しなければならない。一本鎖鋳型の産 生は、Sambrook et al., supraのセクション４．２１−４．４１に記載される。 10 【０２２４】 別の方法に従い、ライブラリーを、上流および下流のオリゴヌクレオチド組を提供する ことにより生成することができ、各組が異なる配列を伴う複数のオリゴヌクレオチドを有 し、異なる配列がオリゴヌクレオチドの配列内に提供されるコドン組により確立される。 上流および下流のオリゴヌクレオチド組は、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ポリメラ ーゼ連鎖反応において使用され、ＰＣＲ産物の「ライブラリー」を生成することができる 。ＰＣＲ産物を「核酸カセット」ということができる。なぜなら、それらは、他の関連す るまたは関連しない核酸配列、例えば、ウイルスコートタンパク質および二量体化ドメイ ンと、確立された分子生物学的技術を使用して融合することができる。 【０２２５】 20 ＰＣＲプライマーの配列は、超可変領域中の溶媒が接近可能で高度に多様な位置につい ての１つまたは複数の設計されたコドン組を含む。上に記載する通り、コドン組は、所望 のバリアントアミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチドトリプレット配 列の組である。所望の基準を満たす抗体選択剤は、適切なスクリーニング／選択工程を通 じて選択される通り、標準的な組換え技術を使用して単離およびクローン化することがで きる。 【０２２６】 Ｂ．組換え調製物 本発明は、また、抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする単離核酸、そのような核酸を含むベク ターおよび宿主細胞、ならびに抗体の産生のための組換え技術を提供する。 30 【０２２７】 抗体の組換え産生のために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ ＤＮＡの増幅）用または発現用の複製可能なベクター中に挿入する。モノクローナル抗体 をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離および配列決定される（例、抗 体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌク レオチドプローブを使用することによる）。多くのベクターを利用可能である。ベクター の選択は、部分的に、使用される宿主細胞に依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、 原核生物または真核生物（一般的に哺乳動物）のいずれか由来である。 【０２２８】 １．原核細胞における抗体産生 40 ａ）ベクター構築 本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列を、標準的な組換 え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を、抗体産生細胞（例 えばハイブリドーマ細胞など）から単離し、配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレ オチドをヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる 。一旦得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌ クレオチドを複製および発現することが可能な組換えベクター中に挿入する。当技術分野 において利用可能で公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができ る。適切なベクターの選択は、ベクター中に挿入される核酸のサイズおよびそのベクター を用いて形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機 50 (67) JP 2012-511329 A 2012.5.24 能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方）およびそれが存在する特定 の宿主細胞とのその適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、 限定はされないが、以下：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結 合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列を含む。 【０２２９】 一般的に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン配列および制御配列を含むプラ スミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、通常、複製部位、な らびに形質転換細胞において表現型選択を提供することが可能である標識配列を持つ。例 えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的に、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミド ）を使用して形質転換する。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイ 10 クリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含み、このように形質転換細胞を同定するた めの簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その派生物、または他の微生物プラスミドも しくはバクテリオファージは、また、内因性タンパク質の発現のために微生物により使用 されることができるプロモーターを含んでもよい、または含むように改変してもよい。特 定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２派生物の例が、Carter et al.、米国特 許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。 【０２３０】 また、宿主微生物と適合するレプリコン配列および制御配列を含むファージベクターを 、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バク テリオファージ（例えばＧＥＭ．ＴＭ．−１１など）を、感受性宿主細胞（例えばＥ．ｃ 20 ｏｌｉ ＬＥ３９２など）を形質転換するために使用することができる組換えベクターを 作製する際に利用してもよい。 【０２３１】 本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つまたはそれ以上の プロモーター−シストロン対を含みうる。プロモーターは、その発現を調節するシストロ ンの上流（５’）に位置付けられる非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典 型的に、２つのクラス（誘導的およびと恒常的）に分類される。誘導的プロモーターは、 培養条件における変化（例、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化）に応 答したその制御下での増加レベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。 【０２３２】 30 種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、周知である。選択さ れたプロモーターを、制限酵素消化を介した供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単 離したプロモーター配列を本発明のベクター中に挿入することにより、軽鎖または重鎖を コードするシストロンＤＮＡに機能的に連結することができる。天然プロモーター配列お よび多くの異種プロモーターの両方を使用し、標的遺伝子の増幅および／または発現に向 けてもよい。一部の実施態様において、異種プロモーターを利用する。なぜなら、それら は、一般的に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較し、発現された標的遺伝子のよ り大きな転写およびより高い産出を許すからである。 【０２３３】 原核生物宿主との使用のために適したプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、ガラク 40 タマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ ーシステムおよびハイブリッドプロモーター（例えばｔａｃまたはｔｒｃプロモーターな ど）を含む。しかし、細菌において機能的である他のプロモーター（例えば他の公知の細 菌またはファージのプロモーターなど）も適している。それらのヌクレオチド配列が発表 されており、それにより当業者が、それらを、標的軽鎖および重鎖をコードするシストロ ン（Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269）に、任意の要求される制限部位を供給す るためのリンカーまたはアダプターを使用して機能的に連結することが可能になる。 【０２３４】 一局面において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を 横断する直接的な転位に向ける分泌シグナル配列成分を含む。一般的に、シグナル配列は 50 (68) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ベクターの成分でありうる、または、それは、ベクター中に挿入される標的ポリペプチド ＤＮＡの一部でありうる。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞に より認識され、プロセシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）も のでなければならない。異種ポリペプチドに対して天然であるシグナル配列を認識し、プ ロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列が、例えば、アルカリホスフ ァターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リ ーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群より選択さ れる原核生物シグナル配列により置換される。本発明の一実施態様において、発現システ ムの両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその バリアントである。 10 【０２３５】 別の局面において、本発明の免疫グロブリンの産生は宿主細胞の細胞質中で起こりうる が、従って、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は要求されない。この点において 、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖が発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内 に機能的な免疫グロブリンが形成される。特定の宿主株（例、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ− 株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を提供し、それにより発現されたタ ンパク質サブユニットの適切な折り畳みおよび組み立てを許す。Proba and Pluckthun Ge ne, 159: 203 (1995)。 【０２３６】 本発明は、発現されるポリペプチド成分の定量的比率を、分泌されて適切に組み立てら 20 れる本発明の抗体の産出を最大限にするために調節することができる発現システムを提供 する。そのような調節は、少なくとも部分的に、ポリペプチド成分についての翻訳強度を 同時に調節することにより達成される。翻訳強度を調節するための１つの技術が、Simmon s et al.、米国特許第５，８４０，５２３号に開示される。それはシストロン内の翻訳開 始領域（ＴＩＲ）のバリアントを利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸また は核酸配列バリアントを、翻訳強度の範囲を用いて作製することができ、それにより特定 の鎖の所望の発現レベルについてこの因子を調整するための便利な手段を提供する。ＴＩ Ｒバリアントを、アミノ酸配列を変化させることができるコドン変化をもたらす従来の突 然変異誘発技術により生成することができるが、ヌクレオチド配列におけるサイレントな 変化が好ましい。ＴＩＲにおける変化は、例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の 30 数または間隔における変化を、シグナル配列における変化と共に含むことができる。突然 変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化さ せない（即ち、変化がサイレントである）コード配列の開始での「コドンバンク」の生成 である。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変化させることにより達成する ことができる；加えて、一部のアミノ酸、例えばロイシン、セリン、およびアルギニンな どは、バンクを作製する際に複雑度を加えることができる複数の１番目および２番目の位 置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4: 151-158に詳細に記載される。 【０２３７】 好ましくは、ベクターの組は、その中の各シストロンについてのＴＩＲ強度の範囲を用 40 いて生成する。この限定された組は、各鎖の発現レベルの比較ならびに種々のＴＩＲ強度 の組み合わせ下の所望の抗体産物の産出を提供する。ＴＩＲ強度を、Simmons et al.、米 国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるレポーター遺伝子の発現レベルを定量 化することにより決定することができる。翻訳強度比較に基づき、所望の個々のＴＩＲを 選択し、本発明の発現ベクターコンストラクトにおいて組み合わせる。 【０２３８】 ｂ）原核生物宿主細胞 本発明の抗体を発現させるために適した原核生物宿主細胞は、古細菌と真正細菌、例え ばグラム陰性またはグラム陽性生物などを含む。有用な細菌の例は、エシェリキア属（例 、Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属（例、B. subtilis）、腸内細菌、シュードモナス属（例 50 (69) JP 2012-511329 A 2012.5.24 、P. aeruginosa）、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア ・マルセッセンス（Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属 、根粒菌、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属を含む。一実施態様において、グラム 陰性細胞を使用する。一実施態様において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を本発明のための宿主とし て使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｗ３１１０株（Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp .1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325)およびその派生体を含み、遺伝子型Ｗ３１１０ ｙｆｈｕＡ （ｙｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ｙｏｍｐＴｙ（ｎ ｍｐｃ−ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有 する３３Ｄ３株を含む。他の株およびその派生体、例えばＥ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣ 10 Ｃ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５ ３７）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）なども適する。これ らの例は、限定的よりも、むしろ説明的である。定義された遺伝子型を有する上記の最近 のいずれかの派生体を構築するための方法が、当技術分野において公知であり、例えば、 Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載される。一般的に、細菌の細胞におけ るレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、 Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア属、またはサルモネラ属が、周知のプラスミド（例えばｐＢＲ３ ２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など）を、レプリコンを供 給するために使用する場合、宿主として使用するのに適しうる。 【０２３９】 20 典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプ ロテアーゼ阻害剤が望ましくは細胞培養に取り込まれうる。 【０２４０】 ｃ）抗体産生 宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換 体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来 の栄養培地中で培養する。形質転換はＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色 体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意 味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的 な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリ 30 アを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法ではポリエチ レングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーシ ョンである。 【０２４１】 本発明の抗体を産生するために使用される原核細胞は、当技術分野において公知の、選 択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。適した培地の例はＬｕｒｉａ培地 （ＬＢ）＋必要な栄養分補給を含む。一部の実施態様において、培地は、また、発現ベク ターの構築に基づき選択された選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択 的に許す。例えば、アンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用の 培地に加える。 40 【０２４２】 任意の必要な補給剤（炭素、窒素、および無機リン酸供給源の他）も、単独でまたは別 の補給剤を伴う混合物もしくは培地（例えば複雑な窒素供給源など）として導入された適 切な濃度で含んでもよい。場合により、培養液は、グルタチオン、システイン、シスタミ ン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、およびジチオスレイトールからなる群よ り選択される１つまたは複数の還元剤を含んでもよい。 【０２４３】 原核生物宿主細胞を適した温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖について、例えば、好ま しい温度は、約２０℃∼約３９℃、より好ましくは２５℃∼約３７℃の範囲、さらにより 好ましくは３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に依存して、約５∼約９の範囲の 50 (70) JP 2012-511329 A 2012.5.24 任意のｐＨでありうる。Ｅ．ｃｏｌｉについて、ｐＨは、好ましくは約６．８∼約７．４ 、より好ましくは約７．０である。 【０２４４】 誘導性プロモーターを本発明の発現ベクター中で使用する場合、タンパク質発現を、プ ロモーターの活性化のために適した条件下で誘導する。本発明の一局面において、Ｐｈｏ Ａプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換 された宿主細胞を、誘導用のリン酸制限培地中で培養する。好ましくは、リン酸制限培地 はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例、Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147を参照のこと）。種々の他の誘導因子を、用いられるベクターコンストラクトに 応じて、当技術分野において公知の通りに使用してもよい。 10 【０２４５】 本発明の発現された抗体タンパク質は、宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、そこか ら回収される。タンパク質の回収は、典型的には、微生物の破壊（一般的に、浸透圧ショ ック、超音波処理、または溶解などの手段による）を含む。一旦、細胞が破壊されると、 細胞片または全細胞を遠心分離またはろ過により除去してもよい。タンパク質を、さらに 、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、タンパク質 を培養液中に輸送し、その中で単離することができる。細胞を培養物から除去してもよく 、培養上清を、産生されたタンパク質のさらなる精製のためにろ過および濃縮する。発現 されたポリペプチドを、さらに、一般的に公知の方法（例えばポリアクリルアミドゲル電 気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットアッセイなど）を使用して単離および同定 20 することができる。 【０２４６】 あるいは、抗体産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。種々の大規模流加発酵手 順を、組換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０ ００リットルの能力、好ましくは約１，０００∼１００，０００リットルの能力を有する 。これらの発酵槽ではアジテーターインペラを使用し、酸素および栄養分、特にグルコー ス（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分布させる。小規模発酵は、一般的に、わずか 約１００リットルの容積である、約１リットル∼約１００リットルの範囲でありうる発酵 槽中での発酵を指す。 【０２４７】 30 発酵プロセスの間に、タンパク質発現の誘導は、典型的に、細胞が適した条件下で所望 の密度（ＯＤ５５０が約１８０∼２２０）まで増殖させた後に開始され、その段階で細胞 は初期の静止期にある。種々の誘導因子を、用いられるベクターコンストラクトに応じて 、当技術分野において公知であり、上に記載する通りに使用してもよい。細胞を、誘導前 に短い期間にわたり増殖させてもよい。細胞を、通常、約１２∼５０時間にわたり誘導す るが、より長いまたはより短い誘導時間を使用してもよい。 【０２４８】 本発明の抗体の産出および質を改善するために、種々の発酵プロセスを改変することが できる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な組み立ておよび折り畳みを改善す るために、シャペロンタンパク質、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、Ｄｓ 40 ｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴うペプ チジルプロリルシス、トランスイソメラーゼ）などを過剰発現する追加のベクターを使用 して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿 主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳みおよび溶解性を促進すること が実証されている。Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al .、米国特許第６，０８３，７１５号；Georgiou et al.、米国特許第６，０２７，８８８ 号；Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluc kthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210。 【０２４９】 50 (71) JP 2012-511329 A 2012.5.24 発現された異種タンパク質（特にタンパク分解に感受性であるもの）のタンパク質分解 を最小限にするために、タンパク質分解酵素が欠損した特定の宿主株を本発明のために使 用することができる。例えば、宿主細胞株を改変し、公知の細菌プロテアーゼ（例えばプ ロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、 プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびその組み合わせなど）をコードする遺伝子に おける遺伝的突然変異に効果を及ぼしてもよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株 を利用可能であり、例えば、Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al.、米国特許第 ５，２６４，３６５号；Georgiou et al.、米国特許第５，５０８，１９２号；Hara et a l., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)に記載される。 【０２５０】 10 タンパク質分解酵素が欠損し、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現する プラスミドを用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の抗体をコードする発現系 において宿主細胞として使用してもよい。 【０２５１】 ｄ）抗体精製 本明細書において産生される抗体タンパク質をさらに精製し、さらなるアッセイおよび 使用のための実質的に均質である調製物を得る。当技術分野において公知の標準的なタン パク質精製方法を用いることができる。以下の手順：免疫親和性カラムまたはイオン交換 カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上または陽イオン交換樹脂（ 例えばＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−Ｐ 20 ＡＧＥ、硫安塩析、およびゲルろ過（例えば、Sephadex G-75を使用）は、適した精製手 順の例示である。 【０２５２】 一局面において、固相に固定化されるプロテインＡは、本発明の全長抗体産物の免疫親 和性精製のために使用される。プロテインＡは黄色ブドウ球菌からの４１kD細胞壁タンパ ク質であり、高親和性を伴い抗体のＦｃ領域に結合する。Lindmark et al (1983) J. Imm unol. Meth. 62: 1-13。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたは シリカ表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラ ムである。一部の適用において、カラムを、混入物の非特異的付着を予防するために、試 薬（例えばグリセロールなど）を用いてコートしている。固相を次に洗浄し、固相に非特 30 異的に結合した混入物を除去する。最後に、目的の抗体を、溶出により固相から回収する 。 【０２５３】 ２．真核細胞における抗体産生 真核生物での発現のために、ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：シ グナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、ならびにエンハンサーエレメ ント、プロモーター、および転写終結配列の１つまたは複数を含む。 【０２５４】 ａ）シグナル配列成分 真核生物宿主における使用のためのベクターは、また、成熟タンパク質またはポリペプ 40 チドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードす るインサートを含んでもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され 、プロセシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺 乳動物細胞での発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例 えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを利用可能である。 【０２５５】 そのような前駆体領域のためのＤＮＡを、リーディングフレーム中で、本発明の抗体を コードするＤＮＡに連結する。 【０２５６】 ｂ）複製起点 50 (72) JP 2012-511329 A 2012.5.24 一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要とされない（ＳＶ４０ 起点を典型的に使用してもよい。なぜなら、ただ、それは初期プロモーターを含むからで ある）。 【０２５７】 ｃ）選択遺伝子成分 発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択可能マーカーとも呼ば れる）を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（アンピ シリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対して耐性を付 与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複雑な培地から利用可能ではな い決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例、バシラス属についてのＤアラ 10 ニンラセマーゼをコードする遺伝子）。 【０２５８】 選択計画の１例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子 を用いて成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生 し、このように選択計画中に生存する。そのような優性選択の例では、薬物（ネオマイシ ン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシン）を使用する。 【０２５９】 哺乳動物細胞のための適した選択マーカーの別の例は、本発明の抗体をコードする核酸 を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲ、チミジン キナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子 20 、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）。 【０２６０】 例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞は、最初に、メトトレキサー ト（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養液中で形質転換体の全てを 培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合での適切な宿主細胞は、Ｄ ＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例、ＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ−９０９６）である。 【０２６１】 あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、および別の選択 マーカー、例えばアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などを用い 30 て形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主 ）を、選択マーカー用の選択薬剤（例えばアミノグリコシド抗生物質、例、カナマイシン 、ネオマイシン、またはＧ４１８など）を含む培地中での細胞増殖により選択することが できる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。 【０２６２】 ｄ）プロモーター成分 発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望の 抗体配列をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。事実上、全ての真 核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５∼３０塩基上流に位置付けられるＡＴ リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０∼８０塩基上流に見出される別 40 の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこでＮは任意のヌクレオチドでありうる。大半の 真核生物の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、それはコード配列の３’末端へのポリ Ａテールの付加のためのシグナルでありうる。これらの配列の全てを、真核生物発現ベク ター中に挿入してもよい。 【０２６３】 原核生物宿主との使用のために適した他のプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ラ クタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼプロモータ ー、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、およびハイブリッドプロモーター （例えばｔａｃプロモーターなど）を含む。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適す る。細菌システムにおける使用のためのプロモーターは、また、抗体ポリペプチドをコー 50 (73) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ドするＤＮＡに機能的に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含 みうる。 【０２６４】 哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、以下のウ イルスのゲノムから得られるプロモーターにより制御される：例えばポリオーマウイルス 、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２など）、ウシパピローマウイ ルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、 および最も好ましくははサルウイルス４０（ＳＶ４０）、異種哺乳動物プロモーターから 、例、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモータ ーから（そのようなプロモーターが宿主細胞系に適合するという条件で）。 10 【０２６５】 ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含む ＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プ ロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる。ウシパピロ ーマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための システムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変が 、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、マウス細胞における単純ヘ ルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのヒトインターフェロン ｃＤＮＡの発現に関するReyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)を参照のこと。ある いは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。 20 【０２６６】 ｅ）エンハンサーエレメント成分 より高い真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクタ ー中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、 現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ トプロテイン、およびインスリン）。典型的に、しかし、真核細胞ウイルスからのエンハ ンサーが使用されうる。例は、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １０ ０−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期 側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生 物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関するYaniv, Nature 297: 17-18 (19 30 82)を参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列に対する位置５’または３’でベク ター中にスプライシングされうるが、しかし、好ましくはプロモーターから部位５’に位 置付けられる。 【０２６７】 ｆ）転写終結成分 真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物から の有核細胞）において使用される発現ベクターは、また、転写の終結のためにおよびｍＲ ＮＡを安定化させるために必要な配列を含みうる。そのような配列は、一般に、真核生物 またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、時には３’の非翻訳領域から利用 可能である。これらの領域は、、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリア 40 デニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転 写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およ びその中で開示される発現ベクターを参照のこと。 【０２６８】 ｇ）宿主細胞の選択および形質転換 本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローン化または発現するための適した宿主細 胞は、本明細書に記載するより高い真核細胞（脊椎動物宿主細胞を含む）を含む。培養（ 組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿 主細胞株の例は、以下：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（293細胞または浮遊培養中での増殖の 50 (74) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ためにサブクローン化された２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ）；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスタ ー卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４， Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 ( 1980) ）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎 臓細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬ Ａ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４） ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺 細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８ ０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞 10 （Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。 【０２６９】 宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転 換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝 子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。有用な哺乳動物宿主細 胞株の例は、 【０２７０】 ｈ）宿主細胞の培養。 本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養してもよい 20 。商業的に利用可能な培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Sigma）、最小必須培地（（MEM ）、（Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ ＤＭＥＭ）、Sigma）などが、宿主細胞を培養するために適する。また、Ham et al., Met h. Enz. 58: 44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)、米国特許第 ４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６ ０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００ １９５；またはＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｒｅ．３０，９８５に記載される培地のいずれ かを宿主細胞用の培養液として使用してもよい。これらの培地のいずれかに、必要に応じ て、以下を補給してもよい：ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、 トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム 30 、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド （例えばアデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（例えばGENTAMYCIN（商標）薬物な ど）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される） 、およびグルコースまたは等価のエネルギー供給源。任意の他の必要な補給剤を、また、 当業者に公知でありうる適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは 、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らか であろう。 【０２７１】 ｉ）抗体の精製 組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内に、ペリプラズム間隙中に産生されうる、 40 または培地中に直接的に分泌されうる。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程とし て、微粒子細片、宿主細胞または溶解フラグメントを、例えば、遠心分離または限外ろ過 により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、Ｅ．ｃｏｌ ｉのペリプラズム間隙に分泌される単離抗体のための手順が記載される。簡単に説明する と、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチル スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在において約３０分にわたり溶解させる。細胞片 を遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発 現系からの上清を、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、 AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテア ーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦなどを、先の工程のいずれかに含め、タンパク質分解を阻害 50 (75) JP 2012-511329 A 2012.5.24 してもよく、抗生物質を含め、外来性混入菌の増殖を予防してもよい。 【０２７２】 細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ ー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することがで き、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとし てのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種 類およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用し、１、２、または４の重鎖を含 むヒト免疫グロブリンに基づく抗体を精製することができる（Lindmark et al., J. Immu nol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプについておよ びヒト３について推奨される（Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)）。親和性リ 10 ガンドが付着するマトリクスは、最もしばしばアガロースであるが、しかし、他のマトリ クスを利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば制御された細孔ガラスまたは ポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンによって、アガロースを用いて達成することができ るよりも速い流速および短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、 Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製のために有用であ る。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール 沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹 脂（例えばポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンSEPHAROSE（商標）クロマト グラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、お よび硫安塩析も、回収される抗体に依存して利用可能である。 20 【０２７３】 任意の予備精製工程に続き、目的の抗体および混入物を含む混合物を、ｐＨが約２．５ −４．５の溶出バッファーを使用し、好ましくは低塩濃度（例、約０−０．２５M塩）で 実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。 【０２７４】 Ｃ．抗体調製 １）ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体は、一般的に、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生される。関連抗原を、免疫化される 種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ 30 ＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官 能性薬剤または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエス テル（システイン残基を通じた抱合）、Ｎヒドロキシスクシンイミド（リジン（ｌｙｓｉ ｅｎ）残基を通じて）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は非依存的により低いアルキル基である）を使用して抱 合することが有用でありうる。用いてもよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュ バントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジ コリノミコラート）を含む。免疫化プロトコールは、過度の実験なしに当業者により選択 されうる。 【０２７５】 40 動物を、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して、例えば１００μgま たは５μgのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウス用）を３容 積のフロイント完全アジュバントと組み合わせることにより、および、溶液を複数部位に 皮内注射することにより免疫化する。１ヶ月後、動物に、フロイント完全アジュバント中 のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５∼１／１０を用いて、複数部位での 皮下注射により追加免役する。７∼１４日後、動物を出血させ、血清を抗体価についてア ッセイする。動物に、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートも、タ ンパク質融合体として組換え細胞培養において作製することができる。また、凝集剤（例 えばミョウバンなど）が免疫応答を増強するために適する。 【０２７６】 50 (76) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ２）モノクローナル抗体 モノクローナル抗体を実質的に均質な抗体の集団から得る。即ち、その集団を含む個々 の抗体は、少量で存在しうる、起こりうる天然突然変異および／または翻訳後修飾（例、 異性化、アミド化）を除いて同一である。このように、修飾語「モノクローナル」は、別 々の抗体の混合物ではないとして抗体の特徴を示す。 【０２７７】 例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)により最初 に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよく、または組換えＤＮＡ方法に より作製してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。 【０２７８】 10 ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えばハムスターな ど）を本明細書で上に記載する通りに免疫化し、免疫化のために使用されるタンパク質に 特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することが可能であるリンパ球を誘 発する。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。リンパ球を、次に 、ミエローマ細胞と、適した融合剤（例えばポリエチレングリコールなど）を使用して融 合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles an d Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。 【０２７９】 免疫化薬剤は、典型的に、抗原性タンパク質またはその融合バリアントを含みうる。一 般的に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト由来細胞が所望である場合に使用され、 20 または、脾細胞またはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物の供給源が所望である場合に使用 される。リンパ球を、次に、不死化細胞株と、適した融合剤（例えばポリエチレングリコ ールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成するGoding, Monoclonal Antib odies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp.59-103。 【０２８０】 不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ、およびヒト 由来のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株を用いる。こ のように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親ミエローマ細胞の増殖ま たは生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適した培養液中に播種し、増殖させた。 例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ 30 ーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養液は、典型的に 、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）（ＨＧＰＲＴ欠損細 胞の増殖を予防する物質である）を含みうる。 【０２８１】 好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗 体の安定した高レベル産生を支持し、培地（例えばＨＡＴ培地など）に感受性であるもの である。これらの内、マウスミエローマ株、例えばSalk Institute Cell Distribution C enter, San Diego, California USAから利用可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マ ウス腫瘍に由来するもの、およびAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virgin ia USAから利用可能なＳＰ−２細胞（およびその派生体、例、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３） 40 などが好ましい。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノ クローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984 ); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p p.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。 【０２８２】 ハイブリドーマ細胞が増殖している培養液を、抗原に対して向けられたモノクローナル 抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモ ノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ （例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ ）など）により決定する。 50 (77) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０２８３】 ハイブリドーマ細胞が培養される培養液を、所望の抗原に対して向けられたモノクロー ナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の 結合親和性および特異性を、免疫沈降によりまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例え ばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など ）により決定することができる。そのような技術およびアッセイは、当技術分野において 公知である。例えば、結合親和性を、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980) のスキャチャード解析により決定してもよい。 【０２８４】 所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同 10 定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローン化し、標準的な方法（Goding, supra）により増殖してもよい。この目的のための適した培養液は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において 腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖しうる。 【０２８５】 サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培養液、腹水、または血清から 、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA-Sepharose、ヒドロキシルアパ タイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなど により適切に分離される。 【０２８６】 20 モノクローナル抗体は、また、組換えＤＮＡ方法（例えば米国特許第４，８１６，５６ ７号に記載されるものなど）により、および上に記載する通りに作製してもよい。モノク ローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離および配列決定さ れる（例、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可 能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。ハイブリドーマ細胞は、 そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。一旦、単離されると、ＤＮＡ を発現ベクター中に置いてもよく、それを次に、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産 生しない宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などにトランスフェクションする（そのよう な組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために）。抗体をコードするＤ 30 ＮＡの細菌における組換え発現に関する概説文献は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992)を 含む。 【０２８７】 さらなる実施態様において、抗体を、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (199 0)に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することが できる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)には、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウスお よびヒトの抗体の単離が記載されている。続く刊行物には、鎖シャッフリングによる高親 和性（nM幅）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)）、 40 ならびに組み合わせ感染および非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略 としてのｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)）が記載されている。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離 のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である 。 【０２８８】 ＤＮＡを、また、例えば、相同マウス配列の場所でヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに ついてのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison , et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンコー ド配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部を共有 50 (78) JP 2012-511329 A 2012.5.24 結合的に連結させることにより改変してもよい。典型的に、そのような非免疫グロブリン ポリペプチドを、抗体の定常ドメインについて置換し、または、それらを、抗体の抗原組 み合わせ部位の可変ドメインについて置換し、抗原についての特異性を有する１つの抗原 組み合わせ部位および異なる抗原についての特異性を有する別の抗原組み合わせ部位を含 むキメラ二価抗体を作製する。 【０２８９】 本明細書に記載するモノクローナル抗体は一価でありうるが、その調製は当技術分野に おいて周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変重鎖の組換え 発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を予防するように、Ｆｃ領域中の任意の点で一般的に切 断される。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を予防するために、別のアミノ酸 10 残基と置換してもよく、または欠失させる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法が、また、一価抗 体を調製するために適している。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生する ための抗体の消化を、当技術分野において公知の通常の技術を使用して達成することがで きる。 【０２９０】 キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、また、合成タンパク質化学において公知の方法 （架橋剤を含むものを含む）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製してもよい。例えば、免 疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することによ り構築してもよい。この目的のための適した試薬の例は、イミノチオラート（iminothiol ate）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。 20 【０２９１】 ３）ヒト化抗体 本発明の抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含みうる。非ヒト（例、マウス ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小に含む、キメラ免疫 グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ヒト化抗体はヒ ト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、それにおいてレシピエントの相補性決定 領域（ＣＤＲ）（本明細書で使用されるＨＶＲ）からの残基が、非ヒト種（例えば所望の 特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなど）（ドナー抗体 ）のＣＤＲからの残基により置換される。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ 30 フレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、また、レ シピエント抗体においてまたは移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列において見出 されない残基を含みうる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの 可変ドメインの実質的に全てを含みうるが、それにおいてＣＤＲ領域の全てまたは実質的 に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒ ト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適にはまた、免疫グ ロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含 む。Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323329 (1988)およびPresta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)。 【０２９２】 40 非ヒト抗体をヒト化するための方法が、当技術分野において周知である。一般的に、ヒ ト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基 を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と呼ばれ、それは典 型的に「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化を、本質的に、Winterおよび共同研究 者、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)の方法に従い、または ヒト抗体の対応する配列についての齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換を通じて実施す ることができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４， ８１６，５６７号）であり、それにおいて実質的にインタクトに満たないヒト可変ドメイ ンが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典 50 (79) JP 2012-511329 A 2012.5.24 型的には、一部のＣＤＲ残基および恐らくは一部のＦＲ残基が齧歯類抗体中の類似部位か らの残基により置換されるヒト抗体である。 【０２９３】 ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選 択が、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に 従い、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー 全体に対してスクリーニングされる。齧歯類のそれに最も近いヒト配列が、次に、ヒト化 抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる。Sims et al., J. Immu nol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987).別の方法 では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来 10 する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト 化抗体のために使用してもよい。Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 428 5 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)。 【０２９４】 抗体を、その抗原についての高い親和性および他の好ましい生物学的特性の保持を伴い ヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、 ヒト化抗体を、親のヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念的なヒ ト化産物の分析のプロセスにより調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用 可能であり、当業者によく知られている。コンピュータープログラムを利用可能であり、 それは選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造を例示し、提示 20 する。これらのディスプレイの検証は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可 能性の高い役割の分析、即ち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与 える残基の分析を許す。この方法において、ＦＲ残基がレシピエントから選択され、組み 合わせることができ、所望の抗体特徴（例えば標的抗原についての増加した親和性など） が達成される。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与える際に、直接的におよび 最も実質的に関与する。 【０２９５】 ヒト化抗体の種々の形態が検討される。例えば、ヒト化抗体は、抗体フラグメント（例 えばＦａｂなど）でありうるが、それは、場合により、イムノコンジュゲートを生成する ために、１つまたは複数の細胞傷害性薬剤に抱合される。あるいは、ヒト化抗体は、イン 30 タクトな抗体（例えばインタクトなＩｇＧ１抗体など）でありうる。 【０２９６】 ４）ヒト抗体 ヒト化に対する代替物として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化時に 、内因性の免疫グロブリン産生の非存在においてヒト抗体の完全レパートリーを産生する ことが可能であるトランスジェニック動物（例、マウス）を産生することが現在可能であ る。例えば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ Ｈ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載さ れている。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝 子アレイの移入は、抗原攻撃時でのヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits et 40 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362 : 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)；米国特許第 ５，５９１，６６９号およびＷＯ９７／１７８５２を参照のこと。 【０２９７】 あるいは、ファージディスプレイ技術を使用し、ヒト抗体および抗体フラグメントをｉ ｎ ｖｉｔｒｏで、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパ ートリーから産生することができる。McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)。この技術に従い、抗体Ｖド メイン遺伝子を、糸状バクテリオファージの大または小コートタンパク質遺伝子（例えば Ｍ１３またはｆｄなど）中にインフレームでクローン化し、ファージ粒子の表面上で機能 50 (80) JP 2012-511329 A 2012.5.24 的な抗体フラグメントとして提示する。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピー を含むため、抗体の機能特性に基づく選択は、また、それらの特性を示す抗体をコードす る遺伝子の選択をもたらす。このように、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。 ファージディスプレイは種々のフォーマットで実施することができ、例えば、Johnson, K evin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3: 564-571 (1993)に概説 される。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために使用す ることができる。Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)では、免疫化マウスの 脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾ ロン抗体の多様なアレイが単離された。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリ ーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、Mark 10 s et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12: 72 5-734 (1993)により記載される技術に本質的に従って単離することができる。また、米国 特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号を参照のこと。 【０２９８】 Cole et al.およびBoerner et al.の技術は、また、ヒトモノクローナル抗体の調製の ために利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Ala n R. Liss, p. 77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)） 。同様に、ヒト抗体を、トランスジェニック動物（例、内因性免疫グロブリン遺伝子が部 分的または完全に不活化されたマウス）中へヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入すること により作製することができる。攻撃時、ヒト抗体産生が観察され、それは全ての点（遺伝 20 子再配列、組み立て、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて見られるものと酷 似している。このアプローチは、例えば、以下に記載されている：米国特許第５，５４５ ，８０７号；第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６ 号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号および以下の科学的な刊行物：Ma rks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-8 59 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechn ology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)およびLon berg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)。 【０２９９】 最後に、ヒト抗体が、また、活性化Ｂ細胞によりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されうる（米 30 国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照のこと）。 【０３００】 ５）抗体フラグメント 特定の状況において、抗体全体よりむしろ抗体フラグメントを使用することに利点があ る。より小さなフラグメントサイズは迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍に対する 改善されたアクセスに導きうる。 【０３０１】 種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために開発されている。従来、これらのフラ グメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（例、Morimoto e t al., J Biochem Biophys. Method. 24: 107-117 (1992);およびBrennan et al., Scien 40 ce 229: 81 (1985)を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組換え宿 主細胞により直接的に産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ抗体フラグメント は全てＥ．ｃｏｌｉにおいて発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌されることができ、このよ うに、多量のこれらのフラグメントの簡易産生が可能になる。抗体フラグメントは、上で 考察する抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−Ｓ ＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的に共役し、Ｆ（ａｂ’）２フ ラグメントを形成することができる（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (199 2)）。別のアプローチに従い、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養から直 接的に単離することができる。増加したｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を伴うＦａｂおよびＦ （ａｂ’）２が米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施態様におい 50 (81) JP 2012-511329 A 2012.5.24 て、選択される抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８ ５；米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこ と。抗体フラグメントは、また、「線形抗体」でありうる（例、米国特許第５，６４１， ８７０号に記載される）。そのような線形抗体フラグメントは、一特異性または二特異性 でありうる。 【０３０２】 ６）抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ） 本発明の抗体を、また、ＡＤＥＰＴにおいて、プロドラッグ（例、ペプチジル化学療法 剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性 化酵素に抗体を抱合させることにより使用してもよい。例えば、ＷＯ８８／０７３７８お 10 よび米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。 【０３０３】 ＡＤＥＰＴのために有用であるイムノコンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活 性な細胞傷害形態に変換するような方法で、プロドラッグに作用することが可能な任意の 酵素を含む。 【０３０４】 本発明の方法において有用である酵素は、限定はされないが、以下の含む：グリコシダ ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒトリゾチーム、ヒトグルクロニダーゼ、アルカリホス ファターゼ（リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用）；アリルスルフ ァターゼ（硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用）；シトシンデアミナ 20 ーゼ（非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物５−フルオロウラシルに変換するために有 用）；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カル ボキシペプチダーゼ（例、カルボキシペプチダーゼＧ２およびカルボキシペプチダーゼＡ ）、カテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬなど）（ペプチド含有プロドラッグを遊離 薬物に変換するために有用）；Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ（Ｄアミノ酸置換基 含有プロドラッグに変換するために有用）；炭水化物切断酵素、例えばβ−ガラクトシダ ーゼおよびノイラミニダーゼ（グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有 用）など；βラクタマーゼ（βラクタムを用いて誘導体化された薬物を遊離薬物に変換す るために有用）；ならびにペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンVamidaseまたはペニ シリンＧアミダーゼなど（それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基を用い 30 てそれらのアミン窒素で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用）。あるい は、酵素活性を伴う抗体（当技術分野において「アブザイム」としても公知）を使用して 、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例、Massey, Nature 3 28: 457-458 (1987)を参照のこと）。抗体−アブザイムコンジュゲートを、腫瘍細胞集団 へのアブザイムの送達のために、本明細書に記載する通りに調製することができる。 【０３０５】 上の酵素を、当技術分野において周知の技術、例えば上で考察するヘテロ二官能性架橋 薬剤の使用などにより、本明細書に記載するポリペプチドまたは抗体に共有結合的に結合 させることができる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結さ れた本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野におい 40 て周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例、Neuberger et al., Na ture 312: 604-608 (1984)を参照のこと）。 【０３０６】 ７）二特異性および多特異性抗体 二特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、少なくとも２つの異なるエピトープ（同じまたは別のタ ンパク質上のものを含む）について結合特異性を有する抗体である。あるいは、１つのア ームは標的抗原に結合することができ、別のアームは、白血球上の誘発分子、例えばＴ細 胞受容体分子（例、ＣＤ３）、またはＩｇＧについてのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば ＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６ ）などに結合するアームと組み合わせることができ、細胞防御機構を標的の抗原発現細胞 50 (82) JP 2012-511329 A 2012.5.24 に集中させ、局在化する。そのような抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例、Ｆ （ａｂ’）２二特異性抗体）に由来しうる。 【０３０７】 二特異性抗体は、また、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化するために 使用してもよい。そのような抗体は、所望の抗原に結合する１つのアームおよび細胞毒傷 害性薬剤（例、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、 メトトレキセート、またはラジオアイソトープハプテン）に結合する別のアームを保有す る。公知の二特異性抗体の例は、抗ＥｒｂＢ２／抗体ＦｃｇＲＩＩＩ（ＷＯ９６／１６６ ７３）、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．５，８３７，２３４）、抗ＥｒｂＢ ２／抗ＣＤ３（Ｕ．Ｓ．Ｐ．５，８２１，３３７）を含む。 10 【０３０８】 二特異性抗体を作製するための方法が、当技術分野において公知である。全長の二特異 性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、そこで は２つの鎖が異なる特異性を有する。Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983) 。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ （クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、その内のわずか１ つが正しい二特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、親和性クロマトグラフィ ー工程により行われ、かなり扱いにくく、産物収量は低い。類似の手順が、ＷＯ９３／０ ８８２９においておよびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示され ている。 20 【０３０９】 異なるアプローチに従い、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を伴う抗体可変ド メインを、免疫グロブリン定常ドメインの配列に融合させる。融合体は、好ましくは、免 疫グロブリン重鎖定常ドメインを伴い、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも 部分を含む。融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合のために必要な部位を含む第 １の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および 、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し 、適した宿主生物中に同時トランスフェクションする。これは、構築において使用される ３つのポリペプチド鎖の不等率が最適な収量を提供する場合の実施態様において３つのポ リペプチドフラグメントの相互割合を調節する際に大きな柔軟性を提供する。しかし、等 30 率の少なくとも２のポリペプチドの発現が高収量をもたらす場合または比率が特に有意で はない場合、２つまたは全て３つのポリペプチド鎖についてのコード配列を１つの発現ベ クター中に挿入することが可能である。 【０３１０】 このアプローチの好ましい実施態様において、二特異性抗体は、１つのアームにおける 第１の結合特異性を伴うハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他のアームにおけるハイ ブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）で構成される。こ の非対称構造は、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二特異性化合物の分 離を促進することが見出された。なぜなら、二特異性分子の半分だけにおける免疫グロブ リン軽鎖の存在が分離の簡単な方法を提供するからである。このアプローチはＷＯ９４／ 40 ０４６９０に開示されている。二特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、 Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)を参照のこと。 【０３１１】 ＷＯ９６／２７０１１またはＵ．Ｓ．Ｐ．５，７３１，１６８に記載される別のアプロ ーチに従い、抗体分子の対の間の界面を操作し、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二 量体のパーセンテージを最大限にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメイン のＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの １つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例、チロシンまたはトリプト ファン）を用いて置換する。大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」を 、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例、アラニンまたはスレオニン）を用いて置換 50 (83) JP 2012-511329 A 2012.5.24 することにより第２の抗体分子の界面上に作製する。これは、他の不要な最終産物（例え ばホモ二量体など）を上回りヘテロ二量体の収量を増加させるための機構を提供する。 【０３１２】 抗体フラグメントから二特異性抗体を生成するための技術が、文献に記載されている。 例えば、二特異性抗体を、化学結合を使用して調製することができる。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)には、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断され、Ｆ（ａ ｂ’）２フラグメントを生成する手順が記載されている。これらのフラグメントは、ジチ オール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在において還元され、隣接ジオールを安定化し 、分子間ジスルフィド形成を予防する。生成されたＦａｂ’フラグメントは次にチオニト ロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つが次にＦａｂ 10 ’−ＴＮＢ誘導体に再変換され、二特異性抗体を形成する。産生された二特異性抗体を、 酵素の選択的な固定化のための薬剤として使用することができる。 【０３１３】 Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的に共役し、二特異性 抗体を形成してもよい。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)には、完全 ヒト化二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメン トがＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方向性の化学的共役に供さ れ、二特異性抗体を形成した。このようにして形成された二特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受 容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合し、ならびにヒト乳房腫瘍標的に対 してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。 20 【０３１４】 組換え細胞培養から直接的に二価抗体フラグメントを作製し、単離するための種々の技 術も記載されている。例えば、二価ヘテロ二量体が、ロイシンジッパーを使用して産生さ れている。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪ ｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体 のＦａｂ’に連結させた。抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元され、単量体を形成し、次 に再酸化され、抗体ヘテロ二量体を形成した。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記載される「ダイアボディ」技術は、二特異性／二 価抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供している。フラグメントは、同じ鎖 上で２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメ 30 イン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグ メントのＶＨおよびＶＬドメインが、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメイ ンと追号することを強いられ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ ｓＦｖ）二量体の使用により二特異性／二価抗体フラグメントを作製するための別の戦略 も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)を参照のこと。 【０３１５】 ２を上回る価数を伴う抗体が検討される。例えば、三特異性抗体を調製することができ る。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)。 【０３１６】 例示的な二特異性抗体は、所与の分子上の２つの異なるエピトープに結合しうる。ある 40 いは、抗タンパク質アームを、白血球上で誘発因子、例えばＴ細胞受容体分子（例、ＣＤ ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、またはＩｇＧについてのＦｃ受容体（ＦｃγＲ） 、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ ＣＤ１６）などに結合するアームと組み合わせてもよく、細胞防御機構を特定のタンパク 質を発現する細胞に集中させる。二特異性抗体を使用して、特定のタンパク質を発現する 細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させてもよい。そのような抗体は、タンパク質結合アーム および細胞傷害性薬剤または放射性核種キレーター、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、Ｄ ＯＴＡ、またはＴＥＴＡなどに結合するアームを保有する。目的の別の二特異性抗体が目 的のタンパク質に結合し、組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。 【０３１７】 50 (84) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ８）多価抗体 多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも速くインター ナリゼーションされうる（および／または異化されうる）。本発明の抗体は、３つまたは それ以上の抗原結合部位（例、四価抗体）を伴う多価抗体（それはＩｇＭクラス以外のも のである）でありうるが、それは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現 により容易に産生することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはそ れ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域また はヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。このシナリオにおいて、抗体は、Ｆｃ領域 およびＦｃ領域のアミノ末端に３つまたはそれ以上の抗原結合部位を含みうる。本明細書 における好ましい多価抗体は、３∼約８、しかし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（ 10 またはそれからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましく は２つのポリペプチド鎖）を含み、それにおいてポリペプチド鎖は２つまたはそれ以上の 可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２） ｎ−Ｆｃを含みうるが、それにおいてＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２ の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２ はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖 は以下を含みうる：ＶＨ−ＣＨ１フレキシブルリンカーＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；また はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。本明細書における多価抗体は、好ましくは 、少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。 本明細書における多価抗体は、例えば、約２∼約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを 20 含みうる。本明細書で検討する軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含 み、場合により、ＣＬドメインをさらに含む。 【０３１８】 ９）ヘテロコンジュゲート抗体 ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、２ つの共有結合的に連結された抗体で構成される。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体 の１つをアビジンに、他をビオチンに共役することができる。そのような抗体は、例えば 、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化すること（Ｕ．Ｓ．Ｐ．４，６７６，９８０） およびＨＩＶ感染の処置のために提案されている。ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２ ００３７３、およびＥＰ０３０８９３６．抗体を、合成タンパク質化学において公知の方 30 法（架橋薬剤を含むものを含む）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されうることが検討 される。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合 を形成することにより構築してもよい。この目的のための適した試薬の例は、イミノチオ ラート（iminothiolate）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例 えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものを含む。ヘテロコンジュゲート 抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製してもよい。適した架橋薬剤は当技術分野 において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号において、多くの架橋技術と共に 開示される。 【０３１９】 １０）エフェクター機能操作 40 本発明の抗体を、Ｆｃエフェクター機能に関して改変し、例えば、抗体の抗原依存性細 胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変する （例、増強または除去する）ことが望まれうる。好ましい実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ １抗体のＦｃエフェクター機能を低下または除去する。これは、抗体のＦｃ領域において １つまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより達成されうる。あるいはまたは加え て、システイン残基をＦｃ領域中に導入してもよく、それによりこの領域における鎖間ジ スルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善さ れたインターナリゼーション能力および／または増加した補体媒介性細胞殺傷および抗体 依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 ( 1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと。増強した抗 50 (85) JP 2012-511329 A 2012.5.24 腫瘍活性を伴うホモ二量体抗体は、また、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-256 5 (1993)に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製されうる。あるいは、二重Ｆ ｃ領域を有し、それにより増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有しうる抗体を操作す ることができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参 照のこと。 【０３２０】 抗体の血清中半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に 記載する通りに、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）中に 取り込んでもよい。本明細書で使用する通り、「サルベージ受容体結合エピトープ」とい う用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏでの血清中半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（ 10 例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。 【０３２１】 １１）他のアミノ酸配列の改変 本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列の改変を検討する。例えば、抗体の結合親和性 および／または他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列バリ アントを、抗体核酸中へ適切なヌクレオチド変化を導入することによりまたはペプチド合 成により調製する。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失 、および／またはその中への挿入、および／またはその置換を含む。欠失、挿入、および 置換の任意の組み合わせを作製し、最終産物に達する（最終的な構築物が所望の特徴を保 有するという条件で）。アミノ酸変化は、また、抗体の翻訳後プロセスを変化させうる（ 20 例えばグリコシル化部位の数または位置を変化させるなど）。 【０３２２】 突然変異誘発のための好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の同定のための 有用な方法は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、CunninghamおよびWells によりScience, 244: 1081-1085 (1989)に記載される。本明細書では、残基または標的残 基の群を同定し（例、荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ など）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によ り置換し、アミノ酸抗原の相互作用に影響を与える。置換に対する機能的な感受性を示す それらのアミノ酸位置を、次に、置換の部位でまたはそれについて、さらなるまたは他の バリアントを導入することにより洗練する。このように、アミノ酸配列変異を導入するた 30 めの部位が事前に決定されており、突然変異それ自体の性質を事前に決定する必要はない 。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたは ランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で行ない、発現された抗体バリアントを所 望の活性についてスクリーニングする。 【０３２３】 アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチ ドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合体、ならびに単一または 複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う 抗体または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアン トは、酵素（例、ＡＤＥＰＴ用）または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへ 40 の抗体のＮまたはＣ末端への融合体を含む。 【０３２４】 別の型のバリアントは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異な る残基により置換された、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換的 な突然変異誘発についての最も大きな目的の部位は、超可変領域を含むが、しかし、ＦＲ 変化も検討される。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に以下の表Ａに示す。 そのような置換が生物学的活性において変化をもたらす場合、より実質的な変化（表Ａに おいて「例示的な置換」と命名され、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載 される）を導入してもよく、そして産物をスクリーニングする。 【０３２５】 50 (86) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【表２】 10 20 30 【０３２６】 抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド 骨格の構造（例えば、シートまたはヘリカル立体構造として）、（ｂ）標的部位での分子 の荷電または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の容積を保持することに対するそれらの効果に おいて有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然残基を、共通の側鎖特性 40 に基づいて以下の群に分ける： （１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ； （２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ； （３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ； （４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ； （５）鎖の方向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および （６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ 【０３２７】 非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴い うる。 50 (87) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０３２８】 抗体の適切な立体構造の保持に関与しない任意のシステイン残基も、一般的にセリンを 用いて置換し、分子の酸化的安定性を改善し、異常架橋を予防してもよい。逆に、システ イン結合を抗体に加え、その安定性を改善してもよい（特に抗体が抗体フラグメント、例 えばＦｖフラグメントなどである場合）。 【０３２９】 置換バリアントの特に好ましい型は、親抗体（例、ヒト化またはヒト抗体）の１つまた は複数の超可変領域の残基を置換することを含む。一般的に、結果として得られる、さら なる開発のためのバリアントは、それらが生成される親抗体と比べて、改善された生物学 的特性を有しうる。そのような置換バリアントを生成するための便利な方法は、ファージ 10 ディスプレイを使用した親和性成熟を含む。簡単に説明すると、いくつかの超可変領域部 位（例、６∼７の部位）を突然変異させ、各部位で全ての可能なアミノ置換を生成する。 このようにして生成された抗体バリアントを、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝 子ＩＩＩ産物への融合体として、糸状ファージ粒子から単価様式で提示する。ファージデ ィスプレイバリアントを、次に、本明細書に開示する通り、それらの生物学的活性（例、 結合親和性）についてスクリーニングする。改変のために候補超可変領域部位を同定する ために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する超可変 領域残基を同定することができる。あるいはまたは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造 を分析し、抗体とその標的の間での接触点を同定することが有益でありうる（例、ＰＤ− Ｌ１， Ｂ７．１）。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述する技術に 20 従った置換のための候補である。一旦、そのようなバリアントが生成されると、バリアン トのパネルを本明細書に記載する通りにスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連ア ッセイにおける優れた特性を伴う抗体をさらなる開発のために選択してもよい。 【０３３０】 抗体のアミノ酸バリアントの別の型は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変化させ る。変化により、抗体中で見出される１つまたは複数の炭水化物成分を欠失させること、 および／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を加えることを意 味する。 【０３３１】 抗体のグリコシル化は、典型的に、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、 30 アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物成分の付着を指す。トリペプチド配列、アスパ ラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任 意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物成分の酵素的付着のための 認識配列である。このように、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの 存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ連結グリコシル化は、糖Ｎ−アセチル ガラクトサミン（aceylgalactosamine）、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒ ドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着を指すが、５−ヒド ロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用してもよい。 【０３３２】 抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変化させることにより便利に達成 40 され、それは、上に記載するトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにする（Ｎ連 結グリコシル化部位のため）。変化は、また、本来の抗体の配列への１つまたは複数のセ リンまたはスレオニン残基の付加、またはそれによる置換により作製してもよい（Ｏ連結 グリコシル化部位のため）。 【０３３３】 本発明の抗体に対するアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子が、当技術分野に おいて公知の種々の方法により調製される。これらの方法は、限定はされないが、天然供 給源（天然アミノ酸配列バリアントの場合において）からの単離またはオリゴヌクレオチ ド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および先に調製され たバリアントまたは非バリアントバージョンのカセット突然変異誘発による調製を含む。 50 (88) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０３３４】 １２）他の抗体改変 本発明の抗体をさらに改変し、当技術分野において公知であり、容易に利用可能な追加 の非タンパク質成分を含むことができる。好ましくは、抗体の誘導体化のために適した成 分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定はされないが、以 下を含む：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコ ールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール 、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサ ン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム コポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリ 10 エチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド ／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例、グリセロール）、ポリ ビニルアルコール、およびその混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは 、水中でのその安定性のため、製造において利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量 でありうる、分岐または非分岐でありうる。抗体に付着するポリマーの数は変動しうるが 、１つを上回るポリマーが付着する場合、それらは同じまたは異なる分子でありうる。一 般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または型は、抗体誘導体が限 定条件下での治療において使用されるか否かなどにかかわらず、考察（限定はされないが 、改善される抗体の特定の特性または機能を含む）に基づいて決定することができる。そ のような技術および他の適した製剤が、Remington: The Science and Practice of Pharm 20 acy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Scienc e (2000)に開示される。 【０３３５】 Ｄ．医薬的製剤 治療用製剤は、保存のために、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意の医薬的に 許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより調製する（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub. , Gennaro Ed., Philadelphia, PA 2000）。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は 、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、バッファー、抗酸 化剤（アスコルビン酸を含む）、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウム；保 30 存剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例、Ｚｎ−タンパク質複合体）；キレート剤（例え ばＥＤＴＡおよび／または非イオン界面活性剤など）を含む。 【０３３６】 治療用薬剤が抗体フラグメントである場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に 結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づき 、標的タンパク質配列に結合する能力を保持する抗体フラグメントまたはペプチド分子さ え設計することができる。そのようなペプチドは、組換えＤＮＡ技術により化学的に合成 および／または産生することができる（例、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 90: 7889-7893 [1993]を参照のこと）。 【０３３７】 40 緩衝剤を使用し、治療の有効性を最適化する範囲にｐＨを制御する（特に安定性がｐＨ に依存的である場合）。緩衝剤は、好ましくは、約５０mM∼約２５０mMの範囲の濃度で存 在する。本発明を用いた使用のための適した緩衝剤は、有機酸および無機酸の両方ならび にその塩を含む。例えば、クエン酸、リン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸 、シュウ酸、乳酸、酢酸。加えて、緩衝剤は、ヒスチジンおよびトリメチルアミン塩（例 えばＴｒｉｓなど）で構成されうる。 【０３３８】 保存剤を加えて、微生物の増殖を遅らせ、典型的には０．２%∼１．０%（w/v）の範囲 で存在する。本発明を用いた使用のための適した保存剤は、以下を含む：オクタデシルジ メチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキソメソニウム；ベンザルコニウムハライド（ 50 (89) JP 2012-511329 A 2012.5.24 例、クロライド、ブロミド、ヨウ素）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール 、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラペン（例えばメチルまたはプロピルパ ラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、 およびｍ−クレゾール。 【０３３９】 等張化剤（時折「安定剤」として公知である）が存在し、組成物中の液体の張度を調整 または保持する。大きな荷電生体分子（例えばタンパク質および抗体など）と使用される 場合、それらはしばしば「安定剤」と呼ばれる。なぜなら、それらは、アミノ酸側鎖の荷 電基と相互作用することができ、それにより分子間および分子内の相互作用についてのポ テンシャルを減らす。等張化剤は、任意の量、０．１重量%∼２５重量%、好ましくは１∼ 10 ５%（他の成分の相対量を考慮に入れる）で存在することができる。好ましい等張化剤は 、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれより高い糖アルコール（例えばグリセリ ン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール など）を含む。 【０３４０】 追加の賦形剤は、以下の１つまたは複数としての役割を果たしうる薬剤を含む：（１） 膨張性薬剤、（２）溶解エンハンサー、（３）安定剤、および（４）変性または容器壁へ の付着を予防する薬剤。そのような賦形剤は以下を含む：多価糖アルコール（上に列挙） ；アミノ酸（例えばアラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アル ギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオ 20 ニンなど）；有機糖または糖アルコール（例えばスクロース、ラクトース、ラクチトール 、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビ トール、ミオイニシトース、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクティトール、グリ セロール、シクリトール（例、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元 剤（例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセ ロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなど）；低分子量タンパク 質（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブ リンなど）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドンなど）；単糖類（例、キシロ ース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例、ラクトース、マルトース 、スクロース）；三糖類（例えばラフィノースなど）；および多糖類（例えばデキストリ 30 ンまたはデキストランなど）。 【０３４１】 非イオン性サーファクタントまたは界面活性剤（「湿潤剤」としても公知）が存在し、 治療用薬剤を安定化させ、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療用タンパク質を保護 することを助け、それは、また、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を起こすこと なく、製剤が剪断表面ストレスに対して暴露されることを許す。非イオン性サーファクタ ントは、約０．０５mg/ml∼約１．０mg/ml、好ましくは約０．０７mg/ml∼約０．２mg/ml の範囲で存在する。 【０３４２】 適した非イオン性サーファクタントは以下を含む：ポリソルベート（２０、４０、６０ 40 、６５、８０など）、ポロキサマ（１８４、１８８など）、PLURONIC（登録商標）ポリオ ール、TRITON（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録 商標）−２０、TWEEN（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリ ン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化カスター油１０、５０、および６０、 グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪性酸エステル、メチルセルロース、およ びカルボキシメチルセルロース。使用することができる陰イオン性界面活性剤は、ラウリ ル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、およびジオクチルソジウム スルホネートを含む。陽イオン性界面活性剤はベンザルコニウムクロリドまたはベンゼト ニウムクロリドを含む。 【０３４３】 50 (90) JP 2012-511329 A 2012.5.24 製剤をｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために使用するために、それらは無菌的でなければな らない。製剤を、無菌ろ過膜を通じたろ過により無菌にしてもよい。本明細書における治 療用組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により 穴を開けることができるストッパーを有する静脈用溶液のバッグまたはバイアル中に置く 。 【０３４４】 投与経路は、公知の受け入れられた方法に従い、例えば適した様式での長期間にわたる 単回または複数回のボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈 内、病巣内、または関節内経路による注射または注入、局所投与、吸入あるいは持続放出 または延長放出の手段による。 10 【０３４５】 本明細書における製剤は、また、処置される特定の適応症について必要な１を上回る活 性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的な活性を伴うものを含みうる。ある いはまたは加えて、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、または増殖阻害薬剤を含 みうる。そのような分子は、意図される目的のために効果的である量で、組み合わせで適 切に存在する。 【０３４６】 活性成分は、また、例えば、コアセルベーション技術により、または、界面重合により 調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラ チン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（methylmethacylate）） 20 マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例、リポソーム、アルブミンマイクロスフェ ア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン 中に封入してもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 18th e dition, supraに開示されている。 【０３４７】 本明細書に記載するタンパク質および抗体の安定性は、非毒性「水溶性多価金属塩」の 使用を通じて増強されうる。例は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋ 、Ｃｕ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、Ａｌ２＋、およびＡｌ３＋を含む。上の多価金属陽イ オンと共に水溶性塩を形成することができる例示的な陰イオンは、無機酸および／または 有機酸から形成されるものを含む。そのような水溶性塩は、少なくとも約２０mg/ml、あ 30 るいは少なくとも約１００mg/ml、あるいは少なくとも約２００mg/mlの水中（２０℃で） での溶解度を有する。 【０３４８】 「水溶性多価金属塩」を形成するために使用することができる適した無機酸は、塩酸、 酢酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸、およびリン酸を含む。使用することができる適した有 機酸は、脂肪族カルボン酸および芳香族酸を含む。この定義内の脂肪酸は、飽和または不 飽和Ｃ２−９カルボン酸（例、脂肪族モノ、ジ、およびトリカルボン酸）と定義してもよ い。例えば、この定義内の例示的なモノカルボン酸は、以下を含む：飽和Ｃ２−９モノカ ルボン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、 ペラルゴン酸、およびカプリオン酸（capryonic）、ならびに不飽和Ｃ２−９モノカルボ 40 ン酸、アクリル酸、プロピオン酸、メタクリル酸、クロトン酸、およびイソクロトン酸。 例示的なジカルボン酸は、飽和Ｃ２−９ジカルボン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸 、アジピン酸、およびピメリン酸を含み、不飽和Ｃ２−９ジカルボン酸はマレイン酸、フ マル酸、シトラコン酸、およびメサコン酸を含む。例示的なトリカルボン酸は、飽和Ｃ２ −９トリカルボン酸、トリカルバリル酸、および１，２，３ブタントリカルボン酸を含む 。加えて、この定義のカルボン酸は、ヒドロキシカルボン酸を形成するための１つまたは ２つの水酸基を含みうる。例示的なヒドロキシカルボン酸は、グリコール酸、乳酸、グリ セリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、およびクエン酸を含む。この定義内の芳香 族酸は、安息香酸およびサリチル酸を含む。 【０３４９】 50 (91) JP 2012-511329 A 2012.5.24 本発明のカプセル化ポリペプチドを安定化することを助けるために使用することができ る一般的に用いられる水溶性多価金属塩は、例えば、以下を含む：（１）ハライド（例、 塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、およびチオシアネートの無機 酸金属塩；（２）脂肪族カルボン酸金属塩（例、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン 酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛、および酒石酸亜鉛）；な らびに（３）安息香酸塩（例えば、安息香酸亜鉛）およびサリチル酸塩の芳香族カルボン 酸金属塩。 【０３５０】 Ｅ．処置の方法： 疾患の予防または処置のために、活性薬剤の適切な投与量は、処置される疾患の型（上 10 で定義する）、疾患の重症度および経過（薬剤が予防的または治療的な目的のために投与 されるか否かにかかわらず）、過去の治療、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、なら びに主治医の判断に依存しうる。薬剤は、患者に対して、１回でまたは一連の処置にわた り適切に投与される。 【０３５１】 特定の実施態様において、本発明は、ＰＤ−１を通じたシグナル伝達を減弱させること に起因する、具体的にはＰＤ−１および／またはＢ７．１への結合を予防するＰＤ−Ｌ１ 抗体の適用による同時刺激、ならびにＴ細胞機能障害性障害の治療的処置に関する。 【０３５２】 １．感染 20 ＰＤ−１およびそのリガンド（「ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ」）は、急性および慢性感染を起 こす病原体に対する免疫防御を調節する際に重要な役割を果たす。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌシ グナル伝達は、効果的な抗菌免疫防御と免疫媒介性組織損傷の間でのバランスを調節する 際に重要な役割を果たす。例えば、ＰＤ−１ノックアウトマウスは、それらの野生型の対 応物よりも迅速にアデノウイルス感染を除去し、それらはより重度の肝細胞傷害を発生す る。Iwai et al., J. Exp. Med. 198: 39-50 (2003)。ヘルペス間質性角膜炎のマウスモ デルにおいて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の遮断は角膜炎を悪化させ、ＨＳＶ−１特異的エフェク ターＣＤ４ Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生および生存を増加させた。Jun et al., FE BS Lett. 579: 6259-64 (2005)。 【０３５３】 30 慢性感染を起こす微生物は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌシグナル伝達経路を利用して宿主免疫 応答を回避し、慢性感染をもたらす。慢性感染を起こすウイルスは、ウイルス特異的Ｔ細 胞を非機能的にし、それにより抗ウイルスＴ細胞応答を鎮静させることができる。Barber et al., Nature 439: 682-87 (2006); Wherry et al., J. Virol. 78: 5535-45 (2004) 。Ｔ細胞の消耗またはＣＤ８＋Ｔ細胞のアネルギーは、慢性感染の間での無効なウイルス 制御の重要な理由であり、マウスにおける慢性ＬＣＭＶ感染、ならびにヒトにおけるＨＩ Ｖ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＴＬＶ感染、ならびに霊長類におけるＳＩＶ感染の特徴で ある。ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が消耗する表現型内に階層的で、進行性の機能喪失 が現れ、細胞傷害およびＩＬ−２産生の消失が最初に伴い、エフェクターサイトカイン産 生が続く。 40 【０３５４】 ＰＤ−１が活性化時にアップレギュレーションされ、発現がＬＣＭＶ慢性感染を伴うマ ウスの消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞により高レベルで保持される。Barber et al., supra。Ｐ Ｄ−１：ＰＤ−Ｌ１結合を遮断する抗体の投与は、増強したＴ細胞応答およびウイルス負 荷における実質的な低下をもたらした。無効なＣＤ４＋ＴＨ応答を伴う持続感染マウスに おいて、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の遮断は、機能障害状態からＣＤ８＋Ｔ細胞を回復させ、 増殖、サイトカインの分泌、感染細胞の殺傷、および減少したウイルス負荷をもたらし、 慢性ウイルス感染症の処置のための治療アプローチを強く示唆する。 【０３５５】 ＬＣＭＶにおけるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌの役割の結果として、ヒトにおける慢性感染の処 50 (92) JP 2012-511329 A 2012.5.24 置に対してこの経路を標的化にすることにおいて強い興味が示されている。ＰＤ−１発現 はＨＩＶ特異的Ｔ細胞［Petrovas et al., J. Exp. Med. 203: 2281-92 (2006); Day et al., Nature 443: 350-54 (2006); Traumann et al., Nat. Med. 12: 1198-202 (2006)］ 、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞［Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006); Boni et al. , J. Virol. 81: 4215-25 (2007)］、およびＨＣＶ特異的Ｔ細胞［Urbani et al., J. Vi rol. 80: 11398-403 (2006)］で高い。ＰＤ−Ｌ１は、また、慢性ＨＢＶ感染を伴う患者 における末梢血ＣＤ１４＋単球および骨髄ＤＣ［Chen et al., J. Immunol. 178: 6634-4 1 (2007); Geng et al., J. Viral Hepat. 13: 725-33 (2006)］およびＨＩＶ患者におけ るＣＤ１４＋細胞およびＴ細胞［Trabattoni et al., Blood 101: 2514-20 (2003)］でア ップレギュレーションされる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮 10 断は、ＨＩＶ特異的、ＨＢＶ特異的、ＨＣＶ特異的、およびＳＩＶ特異的ＣＤ８＋および ＣＤ４＋Ｔ細胞の消耗を逆転させ、増殖およびサイトカイン産生を回復させる。Petrovas et al., J. Exp. Med. 203: 2281-92 (2006); Day et al., supra; Trautmann et al., supra; Boni et al., supra; Urbani et al., supra; Velu et al., J. Virol. 81: 581 9-28 (2007)。 【０３５６】 ＰＤ−１発現の程度は、また、Ｔ細胞消耗の程度および疾患の重症度を示すためのウイ ルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上の有用な診断マーカーでありうる。ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ 細胞でのＰＤ−１発現のレベルは、ウイルス負荷、下落するＣＤ４＋カウント、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏでのＨＩＶ抗原に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の減少した能力と相関する。ｉｎ 20 ｖｉｖｏでの観察に対応して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現とウイ ルス負荷の間に直接的な相関がある。D’Souza et al., J. Immunol. 179: 1979-87 (200 7)。長期非進行者は、顕著により低いＰＤ−１発現を伴う機能的なＨＩＶ特異的記憶ＣＤ ８＋Ｔ細胞を有する。有意にアップレギュレーションされたＰＤ−１（低下したＣＤ４＋ Ｔ細胞数、減少したＣＤ４＋Ｔ細胞数、減少したＨＩＶ特異的エフェクター記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞機能、および上昇した血漿中ウイルス負荷に相関する）を発現する典型的な進行者 とは対照的である。Zhang et al., Blood 109: 4671-78 (2007)。 【０３５７】 ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路は、また、細菌感染の慢性化に関与している。ヘリコバクター ピロリは、慢性胃炎および胃十二指腸潰瘍を起こし、胃癌の発生におけるリスクファクタ 30 ーである。Ｈピロリ感染の間に、Ｔ細胞応答は感染を除去するには不十分であり、持続性 感染に導く。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＨピロリへの暴露に続き、ＰＤ −Ｌ１が胃上皮細胞上でアップレギュレーションされる。胃上皮細胞はＭＨＣクラスＩＩ 分子を発現し、Ｈピロリ感染の間に重要なＡＰＣ機能を果たすと考えられる。ＰＤ−１か らＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｈピロリに暴露された胃上皮細 胞およびＣＤ４Ｔ細胞の培養においてＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生を増強する。抗体ま たはｓｉＲＮＡのいずれかを用いてＰＤ−Ｌ１を遮断することによって調節性Ｔ細胞の生 成が予防され、ＰＤ−Ｌ１がＨピロリ感染の間に調節性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞の間 での動力学を制御することによりＴ細胞抑制および持続感染を促進しうることを示唆する 。Beswick et al., Infect. Immun. 75: 4334-41 (2007)。 40 【０３５８】 寄生虫もＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１経路を利用し、免疫応答を抑制するマクロファージを誘 導している。マウスにおけるテニア・クラシセプス（Taenia crassiceps）（即ち、サナ ダムシ）感染の間に、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ２が活性化マクロファージでアップレギュ レーションされ、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＤ−１を発現する。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、または ＰＤ−Ｌ２の遮断は、サナダムシ感染マウスからのマクロファージによるｉｎ ｖｉｔｒ ｏでのＴ細胞増殖の抑制を有意に減少させた。Terrazas et al., Int. J. Parasitol. 35 : 1349-58 (2005)。マウスにおけるシストソーマ・マンソン（Shistosoma mansoni）感染 の間に、マクロファージは高レベルのＰＤ−Ｌ１およびより適度なレベルのＰＤ−Ｌ２を 発現する。抗ＰＤ−Ｌ１がこれらのマクロファージの能力を除去し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで 50 (93) JP 2012-511329 A 2012.5.24 のＴ細胞増殖を抑制したのに対し、抗ＰＤ−Ｌ２は効果を有さなかった。感染マウスから のマクロファージでのＰＤ−Ｌ１発現が感染の１２週間後に下落し、Ｔ細胞アネルギーに おける破綻に相関する。Smith et al., J. Immunol. 173: 1240-48 (2004)。 【０３５９】 ２．腫瘍免疫 腫瘍免疫についての経験的な証拠は以下を含む：（ｉ）自然寛解の観察、（ｉｉ）腫瘍 に対する検出可能であるが、しかし、無効である宿主免疫応答の存在、（ｉｉｉ）免疫不 全患者における原発および二次悪性腫瘍の増加した羅患率、（ｉｖ）腫瘍患者における増 加レベルの抗体およびＴリンパ球の検出、ならびに（ｖ）試験動物を種々の腫瘍型に対し て免疫化することができるとの観察。 10 試験では、大半のヒト腫瘍が、Ｔ細胞により認識されることができ、このように免疫応 答を誘導することが潜在的に可能である腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現することが示され ている。Boon et al., Immunol. Today 16: 334-336 (1995)。初期段階の臨床試験が、Ｔ ＡＡまたはＴＡＡを用いてパルスされた専門の抗原提示細胞を用いて癌患者にワクチン接 種することにより開始されている。Dudley et al., Science 298: 850-854 (2002); Gaje wski et al., Clin. Cancer Res. 7: 895s-901s (2001); Marincola et al., Adv. Immun ol. 74: 181-273 (2000); Peterson et al., J. Clin. Oncol. 21: 2342-2348 (2003)。 腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が、これらの試験の多くにおいて達成されている。 Mackensen et al., Eur. Cytokine Netw 10: 329-336 (1999); Peterson et al., supra 。腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の患者中への養子移入も追求されており、増殖した細胞傷害性Ｔ 20 細胞（ＣＴＬ）の腫瘍部位への帰巣が明らかになっている。Meidenbauer et al., J. Imm unol. 170: 2161-2169 (2003)。しかし、免疫エフェクター細胞の腫瘍浸潤にもかかわら ず、腫瘍増殖はほとんど制御されなかった。 【０３６０】 腫瘍微小環境が腫瘍細胞を免疫破壊から保護することができることが十分に立証されて いる。Ganss et al., Cancer Res. 58: 4673-4681 (1998); Singh et al., J. Exp. Med. 175: 139-146 (1992)。可溶性因子、ならびに膜結合分子（形質転換増殖因子β（ＴＧＦ −β）、インターロイキン（ＩＬ）−１０、プロスタグランジンＥ２、ＦＡＳＬ、ＣＴＬ Ａ−４リガンド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む）、 およびプログラム死受容体リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、別名Ｂ７−Ｈ１）は、腫瘍により発 30 現されることが見出されており、免疫回避を媒介すると考えられる。このように、腫瘍細 胞でのこのネガティブな免疫調節シグナルの遮断は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍特異的ＣＤ８ ＋Ｔ細胞免疫を増強するための有望なアプローチである。 【０３６１】 多くの腫瘍でのＰＤ−Ｌ１発現は、この抑制に対する成分であり、他の免疫抑制シグナ ルと協調して作用しうる。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達をネガティブに調節 する。ＰＤ−Ｌ１発現が、ｉｎ ｓｉｔｕで、多種多様な固形腫瘍（乳癌、肺癌、結腸癌 、卵巣癌、メラノーマ、膀胱癌、肝臓癌、唾液腺癌、胃癌、神経膠腫、甲状腺癌、胸腺癌 、上皮癌、頭頚部癌を含む）で示されている。Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-66 (2003); Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Hamanishi et al., PNAS 104: 3 40 360-65 (2007); Strome et al., Cancer Res. 63: 6501-5 (2003); Inman et al., Cance r 109: 1499-505 (2007); Konishi et al., Clin. Cancer Res. 10: 5094-100 (2004); N akanishi et al., Cancer Immunol. Immunother. 56: 1173-82 (2007); Nomi et al., Cl in. Cancer Res. 13: 2151-57 (2004); Thompson et al., PNAS 101: 17174-79 (2004); Wu et al., Acta Histochem. 108: 19-24 (2006)。 【０３６２】 免疫学的染色も種々の癌でのＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ発現を明らかにする。 【０３６３】 興味深いことに、癌は、また、慢性炎症疾患として特徴付けられている。Coussens et al., Nature 420: 860-867 (2002)。世界中の最高１５%の癌が直接的な感染源を有するが 50 (94) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ［Kuper et al., J. Intern. Med. 248: 171-183 (2000)］、多くのヒト腫瘍は慢性過敏 および炎症に関連する。Zou et al., Ntu. Rev. Cancer 5: 263-274 (2005)。 【０３６４】 疾患転帰に対する腫瘍でのＰＤ−Ｌ１発現に関連する試験では、ＰＤ−Ｌ１発現が、腎 臓癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、および膵臓癌（しかし、恐らくは小細胞肺癌ではな い）における好ましくない予後と強く相関することが示される。Hamanishi et al., Proc . Natl. Acad. Sci. USA 104: 3360-65 (2007), Inman et al., Cancer 109: 1499-505 ( 2007), Konishi et al., Clin. Cancer Res. 10: 5094-100 (2004); Nakanishi et al., Cancer Immunol. Immunother. 56: 1173-82 (2007); Nomi et al., Clin. Cancer Res. 1 3: 2151-57 (2007); Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 17174-79 (20 10 04); Wu et al., Acta Histochem. 108: 19-24 (2006)。また、これらの試験は、腫瘍で のより高いレベルのＰＤ−Ｌ１発現が腫瘍病期の進行およびより深い組織構造中への浸潤 を促進しうることを示唆する。 【０３６５】 ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路は、また、血液悪性腫瘍において役割を果たしうる。ＰＤ−１ またはＰＤ−Ｌ１はＢ細胞悪性腫瘍ではほとんど発現されないが、しかし、ＰＤ−Ｌ２は マントル細胞悪性腫瘍において過剰発現される。Brown et al., supra; Rosenwald et al ., J. Exp. Med. 198: 851-62 (2003)。ＰＤ−Ｌ１は、多発性ミエローマ細胞で発現され るが、しかし、正常形質細胞ではされない。ミエローマ細胞に応答したＴ細胞増殖が、Ｐ Ｄ−Ｌ１遮断によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増強される。Liu et al., Blood 110: 296-304 ( 20 2007)。ＰＤ−Ｌ１が一部の原発性Ｔ細胞リンパ腫、特に未分化の大細胞Ｔリンパ腫で発 現され、ＰＤ−Ｌ１は関連する濾胞樹状細胞ネットワークで発現される。Dorfman et al. , Am. J. Surg. Pathol. 30: 802-10 (2006)。マイクロアレイ分析では、さらに、腫瘍関 連Ｔ細胞がホジキンリンパ腫においてｉｎ ｓｉｔｕでＰＤ−１シグナルに応答すること が示唆される。Chemnitz et al., Blood 110: 3226-33 (2007)。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ １が、ＨＴＬＶ−１媒介性成人Ｔ細胞白血病およびリンパ腫においてＣＤ４＋Ｔ細胞で発 現される。Shimauchi et al., Int. J. Cancer 121: 2585-90 (2007)。これらの腫瘍細胞 はＴＣＲシグナルに対して反応低下しており、ＰＤ−１遮断がＴＮＦ−α（ＩＦＮ−γで はない）のそれらでの発現を増加させた。動物モデルにおける試験では、腫瘍でのＰＤ− Ｌ１発現がＴ細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、一部の場合において、増加した 30 腫瘍特異的Ｔ細胞死に導くことが実証される。Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (200 6); Hirano et al., Cancer Res. 65: 1089-96 (2005)。 【０３６６】 このように、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたＰＤ−Ｌ１を通じたシグナル伝達の抑 制は、Ｔ細胞機能を増強するためであり、腫瘍免疫を減弱する期待を示し、結果として、 癌のための効果的な処置でありうる。 【０３６７】 Ｆ．組み合わせ治療 本発明の方法を、慢性感染または癌の処置の公知の方法と組み合わせることができる（ 組み合わせもしくは追加の処置工程としてまたは治療用製剤の追加成分として）。 40 【０３６８】 １．癌： 腫瘍と戦うために宿主の免疫機能を増強することが、増加する興味の対象である。従来 の方法は以下を含む：（ｉ）ＡＰＣ増強、例えば（ａ）外来ＭＨＣ同種抗原をコードする ＤＮＡの腫瘍中への注射、または（ｂ）腫瘍の免疫抗原認識（例、免疫刺激性サイトカイ ン、ＧＭ−ＣＳＦ、同時刺激分子Ｂ７．１、Ｂ７．２）の確率を増加させる遺伝子を用い た生検腫瘍細胞のトランスフェクション、（ｉｉｉ）活性化した腫瘍特異的Ｔ細胞を用い た養子細胞免疫療法、または処置。養子細胞免疫療法は、腫瘍浸潤宿主Ｔリンパ球を単離 すること、ｉｎ ｖｉｔｒｏで集団を増殖すること（例えばＩＬ−２もしくは腫瘍または 両方による刺激を通じて）を含む。加えて、機能障害性である単離Ｔ細胞を、また、本発 50 (95) JP 2012-511329 A 2012.5.24 明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ適用により活性化してもよい。そのようにして 活性化されたＴ細胞を次に宿主に再投与してもよい。 【０３６９】 癌のための従来の治療は以下を含む：（ｉ）放射線治療（例、放射線療法、Ｘ線治療、 照射）または癌細胞を殺し、腫瘍を縮小させるための電離放射線の使用。放射線治療を、 外部光線放射線療法（ＥＢＲＴ）を介して外部にまたは近接照射療法を介して内部に施す ことができる；（ｉｉ）化学療法、または迅速に分裂する細胞に一般的に影響を及ぼす細 胞傷害性薬物の適用；（ｉｉｉ）標的治療、または癌細胞の調節解除タンパク質に特異的 に影響を与える薬剤（例、チロシンキナーゼ阻害剤、イマチニブ、ゲフィチニブ；モノク ローナル抗体、光力学的治療）；（ｉｖ）免疫療法、または宿主の免疫応答の増強（例、 10 ワクチン）；（ｖ）ホルモン治療、またはホルモンの遮断（例、腫瘍がホルモン感受性で ある場合）、（ｖｉ）血管形成阻害剤、または血管形成および増殖の遮断、ならびに（ｖ ｉｉ）緩和ケア、または疼痛、嘔気、嘔吐、下痢、および出血を低下するためにケアの質 の改善に向けられた処置。鎮痛剤（例えばモルヒネおよびオキシコドンなど）、制吐剤（ 例えばオンダンセトロンおよびアプレピタントなど）は、より侵襲性の処置計画を許すこ とができる。 【０３７０】 癌の処置において、以前に記載した癌免疫の処置のための従来の処置のいずれかを、本 発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与の前、それに続き、またはそれと同時に行ってもよい。加 えて、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、従来の癌処置、例えば腫瘍結合抗体（例、モノクロ 20 ーナル抗体、毒素抱合モノクローナル抗体）の投与および／または化学療法剤の投与など の前、それに続き、またはそれと同時に投与してもよい。 【０３７１】 ２．感染： 感染（例、急性および／または慢性）の処置において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投 与を、感染に対する自然宿主免疫防御の刺激に加えてまたはその代わりに、従来の処置と 組み合わせることができる。感染に対する自然宿主免疫防御は、限定はされないが、炎症 、発熱、抗体媒介性宿主防御、Ｔリンパ球媒介性宿主防御（リンホカイン分泌および細胞 傷害性Ｔ細胞（特にウイルス感染の間）を含む）、補体媒介性溶解およびオプソニン作用 （食作用を促進）、ならびに食作用を含む。反応性機能障害性Ｔ細胞に対する本発明の抗 30 ＰＤ−Ｌ１抗体の能力が、慢性感染、特に細胞媒介性免疫が完全回復のために決定的であ るものを処置するために有用でありうる。 【０３７２】 ａ．細菌 細菌感染に起因する感染のために、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、細菌感染を処置する ための標準治療と同時の、その前の、またはそれに続く投与と組み合わせてもよい。細菌 感染が、今日、抗菌抗生物質を用いて最も一般的に処置されるが、しかし、免疫化宿主か らの病原体特異的抗体を含む血清も効果的でありうる。 【０３７３】 毒素の分泌（毒素産生細菌）、不活性毒素を用いたワクチン接種および／または毒素の 40 毒性を遮断する治療用薬剤の投与の結果として病原性である細菌が、通常、効果的である （例、ポリクローナル血清、抗体、抗生物質など）。これらの生物は、クロストリジウム 属、バシラス属、コリネバクテリウム属、ビブリオ・コレラ（Vibrio chloerae）、ボル デテラ・パータッシス（Bordetella pertussis）、スタフィロコッカス属、ストレプトコ ッカス属を含む。また典型的にそのような従来の治療に応答するグラム陰性菌は、腸内細 菌（例、エシェリキア、クレブシエラ、プロテウス、エルシニア、エルウィニア（Erwina ））、サルモネラ、およびシュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）を 含む。カプセル化細菌（食作用およびオプソニン作用に対して耐性であり、このように、 しばしば、免疫クリアランスに対するより有意な攻撃を予防する）は以下を含む：ストレ プトコッカス属、ヘモフィルス属、ナイセリア属、クレブシエラ属、およびバクテロイデ 50 (96) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ス・フラジリス（Bacterioides fragillis）。 【０３７４】 細菌は、細胞に侵入することにより宿主防御を回避し、特定の攻撃後に血清抗体および 補体を回避するようになる。これらの感染のクリアランスは、Ｔリンパ球媒介性免疫にほ ぼ完全に依存的であり、特に慢性感染になる傾向がある。具体例は、サルモネラ（Ｓチフ ス（S. typhi）、Ｓコレレスイス（S. choleraesuis）、Ｓエンテリティデス（S. enteri tidis））、レジュネラ属、リステリア属、ブルセラ属、およびマイコバクテリウム属（ Ｍツベルクローシス（M. tuberculosis）、Ｍアビウム（M. avium）、およびＭレプレ（M . leprae）を含む）を含む。 【０３７５】 10 スピロヘータ（トレポネーマ属、ボレリア属、およびレプトスピラ属を含む）は持続的 で潜在的な感染を起こす細菌である。トレポネーマ・パラジウム（Treponema palladium ）は、疾患梅毒を起こす病原体であり、未処理で放置された場合、重度の病理学的結果を 有しうる性感染症である。疾患は明確な病期を通じて進行する。最初の臨床病期は、トレ ポネーマ接種部位での潰瘍または下疳である。これに続くのは、スピロヘータ血症および 継続する微生物の転移性分布の期間であり、第２期梅毒として公知である状態における感 染および消散の反復サイクルを含む。第２期梅毒の消散に続き、疾患は無症候性の潜伏期 に入り、それは第３期梅毒（重篤でしばしば致死的な状態である）に終わりうる。第３期 梅毒は以下を発現しうる：（ｉ）心臓、動脈瘤形成（aneurysis formuation）および二次 大動脈弁不全症を伴う大動脈炎（aortisis）として、（ｉｉ）中枢神経系（脊髄ろう、全 20 身麻痺）、（ｉｉｉ）眼（間質性角膜炎）、または（ｉｖ）耳（神経性難聴）。非性病性 形態は性病性形態の臨床発現に似ているが、しかし、主に直接的な接触および不良な衛生 により伝達される。それらは、イチゴ腫（Ｔパリズム（pallidum）亜種、ペルテニュ（pe rtenue））、ピンタ（Ｔカラテウム（carateum））、およびベジェル（Ｔパリダム（pall idum）亜種、エンデミクム（endemicum））を含む。 【０３７６】 梅毒のための処置は、ペニシリン（例、ペニシリンＧ）、テトラサイクリン、ドキシサ イクリン、セフトリアキソン、およびアジスロマイシンを含む。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗 体は、潜在的感染の期間を処置するために最も有利に投与されうる。 【０３７７】 30 ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）により起こされ、 ダニ咬傷を通じてヒトに伝達される。疾患は最初に限局性発疹として発現し、インフルエ ンザ様症状（倦怠感、発熱、頭痛、頚硬直、および関節痛を含む）が続く。後の発現は、 移動性および多関節の関節炎、脳神経麻痺および神経根障害を伴う神経および心臓の関与 、心筋炎、ならびに不整脈を含みうる。ライム病の一部の症例は持続的になり、第３期梅 毒に類似した不可逆的損傷をもたらす。 【０３７８】 ライム病のための現行の治療は、主に抗生物質の投与を含む。抗生物質耐性株は、ヒド ロキシクロロキンまたはメトトレキセートを用いて処置してもよい。神経因性疼痛を伴う 抗生物質に抵抗性の患者を、ガバペンチンを用いて処置することができる。ミノサイクリ 40 ンは、神経学的または他の炎症性発現を伴う遅発性／慢性ライム病において有用でありう る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、潜在的感染の期間を処置するために最も有利に投与されうる。 【０３７９】 ボレリア症の他の形態は、例えばB. recurentis、B. hermsii、B. turicatae、B. pari keri、B. hispanica、B. duttonii、およびB. persicaに起因するものなど、ならびにレ プトスピラ症（例、Ｌインタロガンス（interrogans））は、血液力価が肝内閉塞を起こ す濃度にまで達しない場合、典型的に自然に消散する。 【０３８０】 ｂ．ウイルス ウイルスの原因に起因する感染について、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ウイルス感染 50 (97) JP 2012-511329 A 2012.5.24 を処置するための標準的な治療の適用と同時の、その前の、またはそれに続く適用と組み 合わせてもよい。そのような標準的治療は、ウイルスの型に依存して変動するが、ほぼ全 例において、ウイルスに特異的なヒト血清含有抗体（例、ＩｇＡ、ＩｇＧ）の投与が効果 的でありうる。 【０３８１】 １）インフルエンザ インフルエンザ感染は、発熱、咳、筋肉痛、頭痛、および倦怠感をもたらし、それらは しばしば季節的流行において生じる。インフルエンザは、また、多くの感染後障害、例え ば脳炎、心筋心膜炎、グッドパスチャー症候群、およびライ症侯群などに関連する。イン フルエンザ感染は、また、正常な肺の抗細菌防御（例えば患者のインフルエンザからの回 10 復など）を抑制し、細菌性肺炎が発生する増加リスクを有する。 【０３８２】 インフルエンザウイルス表面タンパク質は、突然変異および組換えに起因する顕著な抗 原変異を示す。このように、細胞溶解性Ｔリンパ球は、感染後のウイルスの除去のための 宿主の一次媒体である。インフルエンザは３つの主な型に分類される：Ａ、Ｂ、およびＣ 。インフルエンザＡは、それがヒトおよび多くの他の動物（例、豚、馬、鳥、およびアザ ラシ）の両方に感染し、汎発性インフルエンザの主要な原因であるという点でユニークで ある。また、細胞が２つの異なるインフルエンザＡ株により感染される場合、２つの親ウ イルス型のセグメント化ＲＮＡゲノムが複製の間に混合し、ハイブリッドレプリカントを 作製し、新たな流行株をもたらす。インフルエンザＢは動物において複製せず、このよう 20 により少ない遺伝的変異を有し、インフルエンザＣがわずか１つの血清型を有する。 【０３８３】 大半の従来の治療は、感染に起因する症状の緩和であり、宿主の免疫応答は実際に疾患 を除去する。しかし、特定の株（例、インフルエンザＡ）はより重度の疾病および死を起 こすことができる。インフルエンザＡは、環状アミン阻害剤アマンタジンおよびリマンタ ジン（それらはウイルス複製を阻害する）の投与により臨床的および予防的の両方で処置 されうる。しかし、これらの薬物の臨床的有用性は、有害反応の比較的高い発生率、それ らの狭い抗ウイルススペクトル（インフルエンザＡのみ）、およびウイルスが耐性化する 傾向のために限定されている。主要なインフルエンザ表面タンパク質、赤血球凝集素、お よびノイラミニダーゼに対する血清ＩｇＧ抗体の投与が、肺感染を予防することができる 30 のに対し、粘膜ＩｇＡが上気道および気管の感染を予防するために要求される。インフル エンザのための最も効果的な現行の処置は、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンを用 いて不活化されたウイルスの投与を伴うワクチン接種である。 【０３８４】 ２）麻疹ウイルス ９∼１１日間のインキュベーション後、麻疹ウイルスに感染した宿主は、発熱、咳、鼻 感冒、および結膜炎を発生する。１∼２日間以内に、紅斑性、斑点状丘疹が発生し、急速 に全身にわたり広がる。感染は、また、細胞性免疫を抑制するため、宿主には、細菌重複 感染（中耳炎、肺炎、および感染後脳脊髄炎を含む）を発生するより大きなリスクがある 。急性感染は、特に栄養不良の思春期の若者において、重大な罹患および死亡に関連する 40 。 【０３８５】 麻疹のための処置はプールヒトＩｇＧの受動的投与を含み、暴露から１週間後までに与 えられたとしても、非免疫被険者において感染を予防することができる。しかし、弱毒化 生ワクチンを用いた事前の免疫化は、最も効果的な処置であり、免疫化されたものの９５ %超において疾患を予防する。このウイルスの１つの血清型があるため、１回の免疫化ま たは感染は、典型的に、続く感染からの生命のための保護をもたらす。 【０３８６】 より小さな割合の感染宿主において、麻疹がＳＳＰＥに発生しうるが、それは中枢神経 系の持続感染に起因する慢性の進行性神経障害である。ＳＳＰＥは、ビリオンの組み立て 50 (98) JP 2012-511329 A 2012.5.24 および出芽に干渉する欠損を伴う麻疹ウイルスのクローンバリアントにより起こされる。 これらの患者について、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたＴ細胞の再活性化（ウイルス クリアランスを促進するため）が望まれうる。 【０３８７】 ３）Ｂ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ−Ｖ）は、最も感染性の高い公知の血液由来病原体である。そ れは、急性および慢性肝炎および肝臓癌、ならびに一生の慢性感染の主要な原因である。 感染に続き、ウイルスが肝細胞において複製し、また、次に表面抗原ＨＢｓＡｇを放出す る。血清中の過剰レベルのＨＢｓＡｇの検出は、Ｂ型肝炎感染を診断するための標準的方 法として使用される。急性感染は消散しうる、または、それは慢性の持続的感染に発生し 10 うる。 【０３８８】 慢性ＨＢＶのための現行の処置はα−インターフェロンを含み、それは肝細胞の表面上 でのクラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を増加させ、それにより細胞傷害性Ｔ細胞 によるそれらの認識を促進する。加えて、ヌクレオシドアナログであるガンシクロビル、 ファムシクロビル、およびラミブジンが、また、臨床試験においてＨＢＶ感染の処置にお けるある程度の有効性を示している。ＨＢＶのための追加の処置は、ペグ化α−インター フェロン、アデフォビル（adenfovir）、エンテカビル、およびテルビブジンを含む。受 動免疫が抗ＨＢｓＡｇ血清抗体の親投与を通じて付与されうるが、不活性なまたは組換え ＨＢｓＡｇを用いたワクチン接種が、また、感染に対する耐性を付与する。本発明の抗Ｐ 20 Ｄ−Ｌ１抗体は、治療的利点のためにＢ型肝炎感染のための従来の処置と組み合わせても よい。 【０３８９】 ４）Ｃ型肝炎ウイルス Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ−Ｖ）感染が、肝炎の慢性形態に導き、肝硬変（cirrosis）を もたらしうる。症状はＢ型肝炎に起因する感染と類似し（ＨＢ−Ｖとは明確に異なる）、 感染宿主は１０∼２０年間にわたり無症候性でありうる。ＨＣ−Ｖ感染のための処置が、 α−インターフェロンおよびリバビリンの組み合わせの投与を含む。ＨＣ−Ｖ感染につい ての有望な潜在的治療は、プロテアーゼ阻害剤テラプレビル（ＶＸ−９６０）である。追 加の処置は以下を含む：抗ＰＤ−１抗体（ＭＤＸ−１１０６、Medarex）、バビツキシマ 30 ブ（bavituximab）（Ｂ２−糖タンパク質Ｉ依存的な様式で陰イオンリン脂質ホスファチ ジルセリンに結合する抗体、Peregrine Pharmaceuticals）、抗ＨＰＶウイルスコートタ ンパク質Ｅ２抗体（例、ＡＴＬ ６８６５ − Ａｂ６８ ＋ Ａｂ６５，XTL Pharmace uticals）、およびCivacir（登録商標）（ポリクローナル抗ＨＣＶヒト免疫グロブリン） 。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治療的利点のためにＣ型肝炎感染のためのこれらの処置 の１つまたは複数と組み合わせてもよい。 【０３９０】 プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびＮＳ５Ａ阻害剤は、Ｃ型肝炎感染を特異的に処置 するための本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせで使用してもよく、表Ｂに特定され る以下を含む。 【０３９１】 40 (99) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【表３】 10 20 30 40 【０３９２】 ５）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ） ＨＩＶはＣＤ４＋細胞（Ｔリンパ球、単球−マクロファージ、濾胞樹状細胞、およびラ ンゲルハンス細胞を含む）を攻撃し、ＣＤ４＋ヘルパー／誘導細胞が枯渇される。結果と して、宿主は細胞媒介性免疫における重度の欠損を獲得する。ＨＩＶ感染は、個人の少な くとも５０%においてＡＩＤＳをもたらし、性的接触、感染した血液または血液産物の投 50 (100) JP 2012-511329 A 2012.5.24 与、感染した精液を用いた人工受精、血液を含む針またはシリンジへの暴露、および感染 した母親から新生児への出産の間での伝達を介して伝達される。 【０３９３】 ＨＩＶに感染した宿主は無症候性でありうる、または、単核球症に似た急性疾患（発熱 、頭痛、咽頭炎、倦怠感、および発疹）を発生しうる。症状は進行性の免疫機能障害に進 行する（持続的な発熱、寝汗、体重減少、原因不明の下痢、湿疹、乾癬、脂漏性皮膚炎、 帯状疱疹、口腔カンジダ、および口腔毛状白板症を含む）。多数の寄生虫による日和見感 染症は、その感染がＡＩＤＳを発生する患者において共通である。 【０３９４】 ＨＩＶのための処置は抗ウイルス治療を含み、以下を含む：ヌクレオシドアナログ、単 10 独またはジダノシンもしくはザルシタビンとの組み合わせでのジドブジン（ＡＳＴ）、ジ デオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ラミブジン、スタブジン；逆転写阻害剤、例え ばデラビルジン、ネビラピン、ロビリドなど、ならびにプロテイナーゼ阻害剤、例えばサ キナビル、リトナビル、インジナビル、およびネルフィナビルなど。本発明の抗ＰＤ−Ｌ １抗体は、治療的利点のためにＨＩＶ感染のための従来の処置と組み合わせてもよい。 【０３９５】 ６）サイトメガロウイルス サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染は、しばしば、持続的で、潜在的で、および再発 性の感染に関連する。ＣＭＶが、単球および顆粒球−単球前駆細胞において感染し、潜在 性のままである。ＣＭＶの臨床症状は、単核球症様症状（即ち、発熱、肥大した腺、倦怠 20 感）および抗生物質に対するアレルギー性皮膚発疹を発生する傾向を含む。ウイルスは直 接接触により広がる。ウイルスが、尿、唾液、精液、およびより少ない程度で他の体液に 放出される。伝達は、また、感染した母親から彼女の胎児または新生児に、輸血および臓 器移植により生じうる。ＣＭＶ感染は細胞性免疫の全身損傷をもたらし、非特異的マイト ジェンおよび特異的ＣＭＶ抗原に対する損なわれた幼若化応答、細胞傷害能力の減弱、お よびＣＤ４＋リンパ球のＣＤ８リンパ球数の上昇により特徴付けられる。 【０３９６】 ＣＭＶ感染の処置は、抗ウイルス剤であるガンシクロビル、フォスカーネット、および シドフォビル（cidovir）を含むが、しかし、これらの薬物は典型的に免疫不全患者にだ け処方される。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治療的利点のためにサイトメガロウイルス 30 感染のための従来の処置と組み合わせてもよい。 【０３９７】 ７）エプスタイン・バーウイルス エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、持続的で潜在的な感染を確立することがで き、主にＢ細胞を攻撃する。ＥＢＶ感染は、感染性単核球症の臨床状態（発熱、咽頭炎（ しばしば浸出物を伴う）、全身性リンパ節腫脹、および脾腫大を含む）をもたらす。肝炎 も存在し、それは黄疸を発生しうる。 【０３９８】 ＥＢＶ感染のための典型的な処置は症状の緩和であり、ＥＢＶは特定の癌（例えばバー キットリンパ腫および鼻咽頭癌など）の発生に関連する。このように、これらの合併症の 40 結果の前でのウイルス感染のクリアランスは、大きな利益でありうる。本発明の抗ＰＤ− Ｌ１抗体は、治療的利点のためにエプスタイン・バーウイルス感染のための従来の処置と 組み合わせてもよい。 【０３９９】 ８）ヘルペスウイルス 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は感染宿主との直接接触により伝達される。直接感染 は無症候性でありうるが、しかし、典型的に、感染粒子を含む水疱をもたらす。疾患は疾 患の活動期間のサイクルとして発現し、それにおいて病変は、ウイルスが続く大流行のた めに神経節に潜在的に感染するにつれて出現し消滅する。病変は、顔、生殖器、眼および ／または手にありうる。一部の場合において、感染は脳炎も起こすことができる。 50 (101) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０４００】 ヘルペス感染のための処置は、主に症候性大流行を消散することに向けられ、全身的な 抗ウイルス医薬、例えば「アシクロビル（例、Zovirax（登録商標））、バラシクロビル 、ファムシクロビル、ペンシクロビルなど、ならびに局所投薬、例えばドコサノール（Ab reva（登録商標））、トロマンタジン、およびジラクチンなどを含む。潜在的なヘルペス 感染のクリアランスは大きな臨床上の利益でありうる。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治 療的利点のためにヘルペスウイルス感染のための従来の処置と組み合わせてもよい。 【０４０１】 ９）ＨＴＬＶ ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２）は性的接触、授乳、または 10 汚染血液への暴露を介して伝達される。ウイルスはＴＨ細胞（Ｔｈ１細胞と呼ばれる）の サブセットを活性化し、それらの過剰増殖およびＴｈ１関連サイトカイン（例、ＩＦＮ− γおよびＴＮＦ−α）の過剰産生をもたらす。これは、次に、Ｔｈ２リンパ球の抑制およ びＴｈ２サイトカイン産生（例、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３） の低下をもたらし、クリアランスのためにＴｈ２依存性応答を必要とする侵入生物に対す る適切な免疫応答を高める感染宿主の能力における低下を起こす（例、寄生虫感染、粘膜 抗体および液性抗体の産生）。 【０４０２】 ＨＴＬＶ感染は日和見感染を起こし、気管支拡張症、皮膚炎、およびスタフィロコッカ ス属およびストロンギロイデス属を伴う重複感染をもたらし、複数菌による敗血症からの 20 死亡をもたらす。ＨＴＬＶ感染は、また、直接的に成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫および進 行性の脱髄性上位運動ニューロン疾患（ＨＡＭ／ＴＳＰとして公知）に導くことができる 。ＨＴＬＶの潜在的感染のクリアランスは大きな臨床上の利益でありうる。本発明の抗Ｐ Ｄ−Ｌ１抗体は、治療的利点のためにＨＴＬＶ感染のための従来の処置と組み合わせても よい。 【０４０３】 １０）ＨＰＶ ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は主にケラチノサイトに影響を与え、２つの形態で 生じる：皮膚および生殖器。伝達は、直接接触および／または性的活動を通じて生じると 考えられる。皮膚および生殖器の両方のＨＰＶ感染は、疣贅および潜在的感染および時に 30 は再発性感染をもたらしうるが、それらは症状を制御し、疣贅の出現を遮断するが、しか し、感染を他に伝達することが可能である宿主を残す宿主免疫により制御される。 【０４０４】 ＨＰＶ感染は、また、特定の癌、例えば子宮頸癌、肛門癌、外陰癌、陰茎癌、およびと 口腔咽頭癌に導きうる。ＨＰＶ感染のための公知の療法はないが、しかし、現行の処置は イミキモッドの局所適用であり、それは免疫系を刺激し、患部を攻撃する。ＨＰＶの潜在 的感染のクリアランスは大きな臨床上の利益でありうる。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、 治療的利点のためにＨＰＶ感染のための従来の処置と組み合わせてもよい。 【０４０５】 ｃ．真菌 40 真菌感染、または真菌症は、一次感染または内因性微生物叢による免疫系低下を伴う宿 主での日和見コロニー形成をもたらす。真菌症に対する免疫は主に細胞性であり、好中球 、マクロファージ、リンパ球、および恐らくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。真 菌症は、典型的に、抗体および補体による直接的な殺傷に感受性ではない。一次感染に起 因する全身の非侵襲性真菌症は、ブラストミセス症、コクシジオイデス症（coccidioiodo mycosis）、ヒストプラスマ症、およびパラコクシジオイデス症を含む。真菌感染に起因 する慢性感染のために、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、これらの真菌症のための従来から 公知の処置のいずれかの前に、それと同時に、またはそれに続いて投与してもよい。 【０４０６】 ブラストミセス症は、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitis）に 50 (102) JP 2012-511329 A 2012.5.24 より起こされ、吸入により獲得され、一次肺感染または血行性の播腫性疾患（主に皮膚、 骨、および男性尿生殖路を含む）を産生する。一次暴露は無症候性でありうる、またはそ れはインフルエンザ様症候群を産生しうる。この疾患は慢性の無痛形態で発現しうる。疾 患は、また、例えばＡＩＤＳを伴う患者などにおいて免疫不全に関連する。Ｂ皮膚炎のた めの従来の治療は、イトラコナゾール、ケトコナゾール、またはアンホテリシンＢの静脈 内注射を含む。 【０４０７】 コクシジオイデス症は、コクシジオイデス・イミチスにより起こされ、吸入により獲得 され、一次肺感染、進行性肺疾患、または血行性の播腫性疾患（主に皮膚、皮下組織、骨 、関節、および髄膜を含む）を起こしうる。一次暴露は無症候性でありうる（６０%）ま 10 たはインフルエンザ様症候群に関連しうる。肺炎、胸膜炎、および肺空洞化が生じうる。 転移性発現は、皮膚病変（小節を含む）、潰瘍、より深い部位からの洞管およびいぼ状肉 芽腫、骨、関節、腱鞘、および髄膜（髄膜炎を含む）を含む。疾患は、また、例えばＡＩ ＤＳを伴う患者などにおいて免疫不全に関連する。コクシジオイデス症のための処置は、 特に非髄膜疾患の長期維持療法のためのケトコナゾール、イトラコナゾール、およびフル コナゾールを含む。髄膜形態は、通常、アンホテリシンＢの髄腔内投与を用いて処置され る。 【０４０８】 ヒストプラスマ症は、ヒストプラスマ・カプスラーツムにより起こされ、細網内皮系の 吸入により獲得された疾患であり、それにおいて微小な酵母がマクロファージ中に存在す 20 る。それは、一次肺感染、進行性の肺疾患または血行性の播腫性疾患（主に細網内皮系、 粘膜表面、および副腎を含む）を産生することができる。潜在的感染の再活性化は、しば しば、免疫不全を伴う患者において、例えばＡＩＤＳを伴う患者などにおいて生じる。一 次暴露は無症候性であり、インフルエンザ様症候群（肺炎、胸膜炎、肺空洞化、および縦 隔リンパ節腫脹を含む）に関連しうる。転移部位は、細網内皮系（肝脾腫、リンパ節腫脹 、貧血、白血球減少症、および血小板減少症）、粘膜（口腔鼻咽頭潰瘍）、胃腸管（吸収 不良）、および副腎不全を含む。大半の一次感染が、例えばＡＩＤＳを伴う患者などにお いて免疫不全に関連する場合、自然に消散し、再発は進行中であり、しばしば血行性肺炎 、ＡＲＤＳ、播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）、血行性に分布する膿疱性丘疹、および髄 膜炎に関連する。ヒストプラスマ症をアンホテリシンＢ（特に血行性播種を伴う急性疾患 30 の免疫不全患者において）、イトラコナゾール、およびケトコナゾールを用いて処置する 。 【０４０９】 パラコクシジオイデス真菌症は、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracocc idioides brasiliensis）により起こされ、一次肺感染または血行性の播腫性疾患（主に 皮膚、粘膜、細網内皮系、および副腎を含む）を産生することができる吸入により獲得さ れる真菌症である。感染は、最初は無症候性であるが、しかし休止状態であり、次に復活 しうる。この感染の処置ではケトコナゾール、イトラコナゾール、およびスルホンアミド を使用する。 【０４１０】 40 日和見病原体に起因する全身の侵襲性真菌症は、免疫不全宿主において生じ、カンジダ 症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、ムコール症、およびニューモシスティス症 を含む。欠陥がある免疫系において免疫応答を高めることにより、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ 抗体は、また、これらの状態の処置において、特に従来の治療と組み合わせた場合、治療 的価値を有しうる。 【０４１１】 カンジダ症（カンジダ・アルビカンス、Ｃトロピカリス（tropicalis）、Ｃグラブラタ （glabrata）により起こされる）、クリプトコッカス症（クリプトコックス・ネオフォル マンス（Cryptococcus neoformans）により起こされる）、アスペルギルス症（アスペル ギルス・フラーブス（Aspergillus flavus）、Ａフミガーツス（fumigatus）、Ａテレウ 50 (103) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ス（tereus）、およびＡニガー（niger）により起こされる）、およびムコール症（リゾ プス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾムコール属、アブシディア属、クンニング アメラ属、モルティエラ属、サクセネア属により起こされる）のための処置は、以下のイ ミダゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシンＢ（ フルシトシンを伴うおよび伴わない）の１つまたは複数により処置してもよい。ニューモ システィス（ニューモシスチス・カリニにより起こされる）は、最近原虫から真菌まで再 分類されており、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ＴＭＰ−ＳＭＺ）および静 脈内ペンタミジンイセチオネート、ならびにダプソン、ＴＭＰ−ダプソン、トリメトレキ セート、クリンダマイシン−プリマキン、およびとアトバクオンを用いて処置される。 【０４１２】 10 微胞子虫症は、微胞子虫寄生体により起こされ、最近、原虫から真菌まで再分類された 。それらはミトコンドリアの代わりにマイトソームを有する単細胞生物である。ヒトにお いて疾患を起こすことができる生物は以下を含む：エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（En terocytozoon bieneusi）、エンセファリトゾーン・ヘレム（Encephalitozoon hellem） 、エンセファリトゾーン・インテスティナリス（Encephalitozoon intestinalis）、エン セファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）、プレイストフォラ属（Plei stophora spp）、トラキプレイストフォラ・ホミニス（Trachipleistophora hominis）、 トラキプレイストフォラ・アンスロポフテラ（Trachipleistophora anthropophthera）、 ノセマ・コンノリ（Nosema connori）、ノセマ・オクラルム（Nosema ocularum）、ブラ キオラ・ベシキュラルム（Brachiola vesicularum）、ビタフォルマ・コルネアエ（Vitta 20 forma corneae）、ミクロスポリジウム・セイロネンシス（Microsporidium ceylonensis ）、ミクロスポリジウム・アフリカナム（Microsporidium africanum）、ブラキオラ・ア ルゲラエ（Brachiola algerae）。 【０４１３】 感染は、動物、汚染水、または別の感染宿主との直接接触からヒトに伝達されると考え られる。宿主細胞への感染後、胞子原形質が増殖し、分裂し、多核変形体を形成し、それ は複雑なライフサイクル（無性生殖および有性生殖の両方を含む）を有しうる。連続生成 による自己感染および慢性の衰弱性疾患がしばしば微胞子虫感染を特徴付ける。 【０４１４】 疾患の臨床発現は、種および宿主の免疫状態に依存して変動し、結膜炎（例、V. corne 30 ae）、慢性下痢、吸収不良、および消耗症（例、E. bieneusi、E. intestinalis）を含み うる。 【０４１５】 眼、腸の播種性小胞子菌症のための処置は、アルベンダゾールの投与を含む。フマジリ ンの局所適用も微胞子虫角結膜炎を処置するために効果的に使用されうる。他の薬物は、 反駆虫剤（例、アルベンダゾール）、抗生物質（例、フマジリン）、免疫調節剤（例、サ リドマイド）、抗原虫剤（例、メトロニダゾール）を含む。 【０４１６】 ｄ．原虫 寄生虫障害（例えばマラリア、住血吸虫症、およびレーシュマニア症など）に起因する 40 疾患が、開発途上国において最も流行しており、重要な健康問題になっている。これらの 疾患は特定の攻撃を引き起こす。なぜなら、それらは以下を含む種々の手段を通じて宿主 免疫を回避しうるからである：１）宿主細胞内での生存（例、リーシュマニア属）、２） 迅速に変化する表面抗原（例、トリパノソーマ）、および３）宿主抗原を提示することに よりそれら自身を宿主細胞として「偽る」（例、住血吸虫症）。癌の処置における臓器移 植と併用した免疫抑制薬物の使用、ならびにＡＩＤの世界的な罹患率は、プラスモジウム 属、トキソプラズマ属、リーシュマニア属、クリプトスポリジウム属、トリパノソーマ属 、および蠕虫からの潜在的または無症状性感染を復活させることができる。 【０４１７】 原虫寄生体感染に起因する慢性感染のために、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、標準的な 50 (104) JP 2012-511329 A 2012.5.24 抗原虫治療との組み合わせの、その前の、またはそれに続く投与と組み合わせてもよい。 【０４１８】 マラリアは、プラスモジウム属（例、Ｐオヴァレ（P. ovale）、Ｐマラリアエ（P. mal ariae）、Ｐファルシパルム（P. falciparum）、Ｐヴィヴァクス（P. vivax））の寄生体 により起こされ、雌のハマダラカ属の蚊の腸において発生するスポロゾイトとして感染サ イクルを開始する。ヒトへの伝達時、これらのスポロゾイトは、肝細胞に侵入し、炎症反 応を誘導することなく、その中で増える。これらの生物の子孫は、メロゾイトと呼ばれ、 次に赤血球細胞を侵入し、典型的に発熱および悪寒により特徴付けられる疾患の臨床段階 を開始する。感染が風土性である世界の地域において、ほとんど全ての住民が低∼中程度 の病原性の持続的な低レベルの慢性感染を抱え、増加レベルのＩｇＧ抗体を伴い、赤血球 10 中へのメロゾイト侵入からの保護を提供している。 【０４１９】 臨床疾患の処置および予防の両方のための現在利用可能な抗マラリア薬物は、以下を含 む：アルテメテル−ルメファントリン（治療、例、Coartem（登録商標）およびRiamet（ 登録商標））、アーテスネート−アモジアキン（治療）、アーテスネート−メフロキン（ 治療）、アーテスネート−スルファドキシン／ピリメタミン（治療）、アトバクオン−プ ログアニル、（治療および予防、例、Malarone（登録商標））、キニン（治療）、クロロ キン（治療および予防）、Cotrifazid（治療および予防）、ドキシサイクリン（治療およ び予防）、メフロキン、（治療および予防、例、Lariam（登録商標））、プリマキン（P. vivaxおよびP. ovaleのみにおける治療；予防のためにではない）、プログアニル（予防 20 ）、スルファドキシン−ピリメタミン（治療および予防）、ハイドロキシクロロキン（治 療および予防、例、Plaquenil（登録商標））。 【０４２０】 アネルギーＴ細胞の再活性化を通じて、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、マラリア寄生体 のクリアランスを助ける際に特に治療的でありうる。 【０４２１】 トキソプラズマ症は、トキソプラズマ属の寄生体により起こされ、しばしば無症候性で あるが、しかし、少数が臨床疾患を発生することができ、良性のリンパ節腫脹から中枢神 経系の急性から致死的な感染にまでおよびうる。感染の供給源は、生かまたは部分的に調 理されたブタ肉または羊肉中の嚢胞および感染ネコの糞便中を通過した卵母細胞を含む。 30 感染はヒトにおいて通常胃腸管を通じて生じ、原虫は実質的に全ての身体の細胞において （タキゾイトとして）侵入し、増殖する。これらのタキゾイトは、長期間にわたり生存可 能なままである、微小で緩徐に増殖する感染体（ブラディゾイト）で満たされた嚢胞を産 生することができ、潜在的な慢性感染をもたらす。免疫系不全を伴う宿主（例えば免疫抑 制薬物を服用中であるまたはＨＩＶに苦しむ宿主）は、特にトキソプラズマ症に苦しむ傾 向がある。 【０４２２】 原発性トキソプラズマ症を処置するために使用される医薬は以下を含む：ピリメタミン 、抗生物質を伴うおよび伴わない（例、スルファジアジン、クリンダマイシン、スピラマ イシン、およびミノサイクリン）。潜在的なトキソプラズマ症を、抗生物質アトバクオン 40 を用いて（クリンダマイシンを伴うおよび伴わず）処置してもよい。 【０４２３】 レーシュマニア症は、リーシュマニア属の寄生体により起こされ、皮膚および内臓のマ クロファージに感染し、スナバエを通じてヒトに伝達される。特異的血清抗体はほとんど ないまたはないため、活性化Ｔ細胞を通じた細胞媒介性免疫が、感染が除去される決定的 な経路であるように見える。旧世界リーシュマニア症は、熱帯潰瘍としても公知であり、 リーシュマニア属のいくつかの種により起こされる：Ｌトロピカ（L. tropica）、Ｌマジ ョール（L. major）、およびＬアエチオピカ（L. aethiopica）。新世界リーシュマニア 症は、種々の亜種により起こされる：Ｌメキシカーナ（L. Mexicana）およびＬブラジリ エンシス（L. braziliensis）。これらの寄生体は強い細胞媒介性免疫応答を誘導するが 50 (105) JP 2012-511329 A 2012.5.24 、しかし、臨床疾患の転帰は部分的に宿主応答に起因する。宿主が抑制されたまたは不適 当な細胞媒介性応答を高める場合、結果はびまん性の慢性皮膚リーシュマニア症であり、 自然治癒の希望はほとんどない（例、L. aethiopica、L. Mexicana）。宿主が過剰の細胞 媒介性応答を高める場合、応答はルポイドまたは再発性（recidiva）レーシュマニア症で あり、持続的な非潰瘍性リンパ小節を伴い、一次病巣（例、L. tropica）の辺縁に現われ る。再発性レーシュマニア症は、初期病変の１∼１０年後に現われうる。２つの形態（皮 膚および内臓）の疾患が存在し、皮膚形態は皮膚病変において発現し、細胞媒介性免疫は クリアランスに決定的である。内臓形態において、細胞媒介性免疫は不十分であるまたは 存在せず、疾患は臨床的にポリクローナルＢ細胞高γグロブリン血症、白血球減少症、脾 腫大、および上昇したＴＮＦ−α産生として発現する。 10 【０４２４】 ミルテホシン（例、Impavido（登録商標））およびパラミオシンは、皮膚および内臓の レーシュマニア症の両方のために現在利用可能な処置である。 【０４２５】 クリプトスポリジア症は、クリプトスポリジア属の原虫からの感染により起こされ、感 染宿主の糞便排泄物との直接的なヒトの接触に起因する。腸粘膜組織の感染は下痢をもた らしうる。疾患は、典型的に、急性感染として発現するが、しかし、それは特に免疫不全 の個人において慢性になりうる。処置は、典型的に、緩和的であり、特に水分補給である が、しかし、パロモマイシン、アジスロマイシン、および血清Ｉｇ（例、Lactobin-R（登 録商標））が感染を除去する際に成功してきた。 20 【０４２６】 トリパノソーマ症は、寄生体トリパノソーマ（例えば、Ｔブルセイ（T. Brucei）、亜 種ガンビエンセ（gambiense）、ロデシエンセ（rodesiense））により起こされ、ツェツ ェバエからの咬傷を通じてヒトおよびウシに感染する。この病原体が引き起こす攻撃は、 異なる表面抗原を提示する集団の連続生成に起因する。感染は、非特異的および非保護的 な血清免疫グロブリンの上昇レベルにより特徴付けられる。 【０４２７】 トリパノソーマ症のための処置は、以下の静脈内投与を含む：ペンタミジン（T.b. gam biense用）、静脈内スラミン（T.b. rhodesiense用）、エフロルニチン、メラルソプロー ル（ニフルチモクスを伴うおよび伴わない）。 30 【０４２８】 寄生虫様感染は、吸虫（例えば、シストソーマ属）、条虫、および線虫に起因し、好酸 球増加症およびレアギン抗体の共通の免疫応答（Ｔ細胞依存的である応答）を共有する。 【０４２９】 住血吸虫症（別名ビルハルジア）は、シストソーマ・マンソン、Ｓジャポニカム（S. j aponicum）、Ｓハエマトビウム（S. haematobium）、およびＳメコンギ（S. mekongi）に より起こされ、水中で卵としてライフサイクルを開始し、それは次にミラシジウムに孵化 し、それはカタツムリに侵入し、複数世代のスポロシストを作製する。これらは次にシス トソーマ属としてヒト宿主の血流に感染することができるフォークテール型セルカリアを 産生し、それは最初に肺、次に肝臓に移動する。これらの吸虫類は、最終的に、腸間膜小 40 静脈においてペアとなり、交尾し、そして卵を産む。これらの卵の多くは腸に移動し、排 泄され、一部が粘膜下組織、肝臓の門脈小静脈、および身体の他の臓器に捕捉される。捕 捉された卵に関連する肉芽腫性炎症は、慢性住血吸虫症の決定的な症状である。 【０４３０】 住血吸虫症のための処置は、Praziquantel（登録商標）、アンチモン、オキサムニクイ ン（S. mansoni）、およびMirazid（登録商標）の投与を含む。 【０４３１】 条虫感染は２つの群に分類されうる。１つは腸に住む成体条虫、例えばジフィロボスリ ウム・ラツム（Diphyllobothrium latum）およびタエニア・サギナタ（Taenia saginata ）などであり、限定された非液性免疫効果を有する。第２の群は、遊走性の組織被嚢幼生 50 (106) JP 2012-511329 A 2012.5.24 条虫、例えばヒメノレピス・ナナ（Hymenolepis nana）、エキノコックス・グラヌロスス （Echinococcus granulosus）、およびタエニア・ソリウム（Taenia solium）などを記載 し、それらは強い非経口の宿主応答および防御血清抗体を誘導する。ヒトにおいて最も重 大な条虫感染はエキノコックス症であり、それは肝臓、肺、脳、腎臓、または身体の他の 部分に移植された場合、包虫嚢胞の形成をもたらすことができる。 【０４３２】 エキノコックス症のための処置は、メトロニダゾール、アルベンダゾールの投与、およ び外科的介入、例えば除去、吸引、造袋術、または大網固定術などを含む。 【０４３３】 線虫は最も一般的に多彩で、広く分布する蠕虫であり、ヒトに感染し、障害（例えば旋 10 毛虫病、回虫症、フィラリア症、および糞線虫症など）を起こす。旋毛虫症は、トリキネ ラ・スピラリス（Trichinella spiralis）により起こされ、生肉または部分的に調理され た肉（例えばブタ肉など）におけるＴスピラリス（T. spiralis）の幼虫の摂取に起因し うる。ヒトにおいて、感染は、上昇したＩｇＭを伴う強い液性応答を誘発し、ＩｇＧ産生 が続き、Ｔリンパ球による抗体損傷された虫の迅速な排除が続く。 【０４３４】 腸において成虫を殺すための唯一の公知の処置は、チアベンダゾールであり、幼虫を殺 すための公知の処置はない。 【０４３５】 回虫属は、巨大線虫（アスカリス・ルンブリコイデス（Ascaris lumbricoides））とし 20 ても公知であり、糞便により汚染された物質の摂取に起因するヒトにおいて一般的な寄生 体である。患者が非常に長い期間にわたり無症候性のままであるが、幼虫期に身体を通じ て移動し、それらは内臓損傷、腹膜炎および炎症、肝臓または脾臓の腫張、毒性、および 肺炎を起こしうる。 【０４３６】 回虫症のための処置は、メベンダゾール（例、Vermox（登録商標））、ピペラジン、ピ ランテルパモエート（例、Antiminth（登録商標）、Pin-Rid（登録商標）、Pin-X（登録 商標））、アルベンダゾール、チアベンダゾール（ピペラジンを伴うまたは伴わない）、 ヘキシルレソルシノール、サントニン、およびアカザの油の投与を含む。本発明の抗ＰＤ −Ｌ１抗体を、回虫症の処置のためのこれらの治療の施行と組み合わせて、その前に、ま 30 たはそれに続いて施してもよい。 【０４３７】 フィラリア症は、フィラリア線虫により起こされ、媒介昆虫によりヒトの中に導入され る。オンコセルカ・ボルブルス（Onchocerca volvulus）は、オンコセルカ症または河川 盲目症を起こし、ブヨからの咬傷により伝達される。感染性幼虫自体は皮下にとどまり、 成人に発生し、線維形成性の宿主応答を誘導し、大量のミクロフィラリアを放出し、それ は皮下におよび眼全体に分散し、さらに角膜炎または網膜炎を誘導し、それらは次に角膜 を起こし、不透明になる。リンパ性フィラリア症は、ブルギア属およびブケレリア属によ る感染に起因する。時間とともに、リンパ組織（特に鼠径部における）の傷跡が排出を妨 げ、外観を損なう状態である象皮症をもたらしうる。 40 【０４３８】 フィラリア症のための一次処置は、抗生物質イベルメクチン、アルベンダゾール、およ びクエン酸ジエチルカルバマジン（ＤＥＣ、Hetrazan（登録商標））（イベルメクチンま たはアルベンダゾールを伴うまたは伴わない）の投与である。他の処置の見通しはドキシ サイクリンを含み、それは共生細菌（ボルバキア）を殺す。 【０４３９】 糞線虫症は、ストロンギロイデス属（例、Ｓステルコラリス（S. stercoralis）、Ｓフ レボルニ（S. fulleborni））の寄生体により起こされ、糞便によって汚染された土壌を 通じてヒトに渡る疾患である。それらは、自由生活サイクル（成虫に成熟するrabditifor m幼虫）、ならびに寄生サイクル（成虫に成熟するフィラリア型幼虫）の両方において存 50 (107) JP 2012-511329 A 2012.5.24 在しうる。それらは皮膚に侵入し、肺、次に咽頭に移動し、最終的に腸に存在する。スト ロンギロイデス属の自己感染も生じることが公知であり、それは本質的にはフィラリア型 幼虫の連続生成による反復感染である。 【０４４０】 感染は無症候性でありうるが、または胃腸管における疼痛および下痢、肺におけるレフ ラー症候群（即ち、好酸球増加症）および蕁麻疹により特徴付けることができる。血液の 好酸球増加症も存在しうる。ストロンギロイデス属の持続感染は、消化性潰瘍、胆嚢疾患 、およびクローン病によく似ているため、誤診は一般的である。それは免疫不全宿主にお ける特定の問題である。 【０４４１】 10 糞線虫症のための公知の処置は、イベルメクチン、アルベンダゾール、またはチアベン ダゾールであるが、しかし、この医薬は成虫だけを殺すため、反復投与が必要である。 【０４４２】 ｅ．ワクチン接種 ワクチン接種または疾患に対して免疫を誘導するための抗原材料の投与を定期的に使用 し、病原体による感染の効果を妨げる、または改善する。宿主免疫の増強は、感染性の病 原体だけでなく、罹患した（例、癌性）宿主組織でも見出される非所望の抗原に使用する ことができる。従来、ワクチンは、弱められたまたは死んだ病原体の全体に由来するが、 しかし、それらは、また、ヒトのクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ ）分子により特異的に認識されるインタクトな病原体上のペプチド提示エピトープであり 20 うる。特定の目的のペプチド抗原は、Ｔ細胞により特異的に認識されるものである。 【０４４３】 最近、治療的ワクチン接種を消耗したＣＤ８＋Ｔ細胞でのＰＤ−Ｌ１遮断の施行と組み 合わせることで、慢性感染マウスモデルにおいて増強された機能およびウイルス制御がも たらされることが示されている。Ha et al., J. Exp. Med. 205(3): 543-555 (2008).結 果として、本明細書に記載する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、また、ウイルス、細菌、真菌、また は原虫の浸潤に起因する感染（例、急性および慢性）ならびに腫瘍免疫を処置するための 抗原ワクチン接種（例、前、同時、または後での投与）と組み合わせてもよい。 【０４４４】 Ｇ．医薬的な投与量： 30 本発明の医薬的組成物の投与量および所望の濃度は、想定される特定の使用に依存して 変動しうる。適切な投与量または投与経路の決定は、当業者の能力の十分に範囲内である 。動物実験は、ヒトの治療のための有効量の決定のための信頼できるガイダンスを提供す る。有効量の種間スケーリングは、Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Inters pecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Y acobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46に定められる原理に従っ て実施することができる。 【０４４５】 本明細書に記載されるポリペプチドまたは抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの投与を使用する場 合、通常の投与量は、投与経路に依存し、１日当たり約１０ng/kg∼約１００mg/kg（哺乳 40 動物の体重）またはそれ以上、好ましくは約１mg/kg/日∼１０mg/kg/日まで変動しうる。 特定の投与量および送達の方法についてのガイダンスが、文献に提供されている。例えば 、米国特許第４，６５７，７６０号；第５，２０６，３４４号；または第５，２２５，２ １２号を参照のこと。以下が本発明の範囲内である：異なる製剤が異なる処置および異な る障害のために効果的でありうること、および、特定の器官または組織を処置することを 意図した投与が、別の器官または組織に対するそれと異なる様式での送達を必要としうる こと。さらに、投与量を、１回または複数回の別々の投与により、または持続注入により 投与してもよい。数日間またはそれより長い反復投与のために、状態に依存し、処置を、 疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続する。しかし、他の投与計画が有用でありうる。 この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより簡単にモニターされる。 50 (108) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０４４６】 Ｈ．製剤の投与 本発明の製剤は、限定はされないが、再構成された液体製剤を含み、抗ＰＤ−Ｌ１抗体 を用いた処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトへ、公知の方法に従って（例えばボ ーラスとしての静脈内投与、あるいはある期間にわたる持続的注入により、筋肉内、腹腔 内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路により）投 与される。 【０４４７】 好ましい実施態様において、製剤は、皮下（即ち、皮膚の下）投与により哺乳動物に投 与される。そのような目的のために、製剤を、シリンジを使用して注射してもよい。しか 10 し、製剤の投与のための他のデバイスを利用可能である。例えば注射デバイス（例、INJE CT-EASE（商標）およびGENJECT（商標）デバイス）；インジェクターペン（例えばGENPEN （商標）など）；オートインジェクターデバイス、無針デバイス（例、MEDIJECTOR（商標 ）およびBIOJECTOR（商標））；および皮下パッチ送達システムなど。 【０４４８】 特定の実施態様において、本発明は、１回用量投与ユニット用のキットに向けられる。 そのようなキットは、治療用のタンパク質または抗体の水性製剤の容器を含み、単一また は複数チェンバーの事前に充填されたシリンジを含む。例示的な事前に充填されたシリン ジは、Vetter GmbH, Ravensburg, Germanyから入手可能である。 【０４４９】 20 タンパク質の適切な投与量（「治療的有効量」）は、例えば、処置される状態、状態の 重症度および経過（タンパク質が予防的または治療的な目的のために投与されたか否かに かかわらず）、過去の治療、患者の臨床歴および抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する応答、使用さ れる製剤のフォーマット、ならびに主治医の判断に依存しうる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、患 者に、１回または一連の処置にわたり適切に投与され、患者に、以後の診断から任意の回 数で投与してもよい。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、単独処置としてまたは問題の状態を処置する 際に有用である他の薬物または治療と併用して投与してもよい。 【０４５０】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体のために、最初の候補投与量は、患者への投与のために約０．１∼２ ０mg/kgの範囲でありうるが、それは１つまたは複数の別々の投与の形態を取りうる。し 30 かし、他の投与計画が有用でありうる。そのような治療の進行は、従来の技術により簡単 にモニターされる。 【０４５１】 Ｉ．製造品 本発明の別の実施態様において、製造品が提供され、それは製剤を含む、好ましくはそ の使用のための説明書を提供する。製造品は容器を含む。適した容器は、例えば、ボトル 、バイアル（例、二重チェンバーバイアル）、シリンジ（例えば一重または二重チェンバ ーシリンジなど）、および試験管を含む。容器は、種々の材料（例えばガラスまたはプラ スチックなど）から形成されうる。容器は製剤を保持する。容器上にある、またはそれに 関連するラベルは、再構成および／または使用のための指示を示しうる。ラベルは、さら 40 に、製剤が皮下投与のために、および／またはＴ細胞機能障害性障害の処置のために有用 である、または意図されることを示しうる。製剤を保持する容器は、再構成製剤の反復投 与（例、２∼６回投与）を可能にする複数回使用バイアルでありうる。製造品は、さらに 、適した希釈剤（例、ＢＷＦＩ）を含む第２の容器を含みうる。希釈剤および凍結乾燥製 剤の混合時、再構成製剤中の最終的なタンパク質濃度は、一般的に、少なくとも５０mg/m lでありうる。製造品は、さらに、市販のユーザーの見地から望ましい他の材料を含みう る（他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および添付文書（使用説明書を伴 う）を含む）。 【０４５２】 本発明は、以下の例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。それらは 50 (109) JP 2012-511329 A 2012.5.24 、しかし、本発明の範囲を限定していると解釈すべきではない。開示を通じた全ての引用 が、本明細書により、参照により明確に組み入れられる。 【０４５３】 別の実施態様において、本発明は、オートインジェクターデバイス中に投与のための本 明細書に記載する製剤を含む製造品を提供する。オートインジェクターは注射デバイスと して記載することができ、活性化時に、患者または投与者から追加の必要な行為なしにそ の含量を送達するであろう。それらは、送達速度が一定でなければならず、送達の時間が 数秒より大きい場合、治療用製剤のセルフメディケーションのために特に適している。 【０４５４】 実施例１ 10 ファージライブラリーにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体の同定 抗ＰＤ−Ｌ１抗体を同定するためのライブラリー選別およびスクリーニング ヒト（R&D Systems，cat# 156-B7）およびマウス（R&D Systems，cat# 1019-B7）ＰＤ −Ｌ１−Ｆｃ融合体を、代替ライブラリー選別のための抗原として使した。具体的には、 ファージライブラリーを、最初にヒト抗原、続く３ラウンドにおいてマウス、ヒト、およ びマウス抗原に対して選別した。Nunc 96 well Maxisorp（登録商標）を標的タンパク質 （１０μg/ml）と４℃で一晩コートし、室温で１時間にわたりファージブロッキングバッ ファーＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および１%（w/v）ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）および０．０５%（v/v）tween-20）を用いてブロックした。抗体ファージライブラ リーＶＨ（例、Lee et al., J. Immunol. Meth. 284: 119-132, 2004を参照のこと）およ 20 びＶＨ／ＶＬ（Liang et al., J. Mol. Biol .366: 815-829, 2007を参照のこと）を別々 に抗原プレートに加え、室温で一晩インキュベートした。次の日、抗原コートされたプレ ートをＰＢＴ（０．０５% Tween-20を伴うＰＢＳ）を用いて１０回洗浄し、結合したフ ァージを５０mM ＨＣｌおよび５００mM ＮａＣｌを用いて３０分間にわたり溶出し、等 容積の１Ｍ Ｔｒｉｓベース（ｐＨ７．５）を用いて中和した。回収したファージをＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞において増幅させた。続く選択ラウンドの間、抗原コ ートプレートを用いた抗体ファージのインキュベーションを２∼３時間に低下させ、プレ ート洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加させた。 【０４５５】 ４ラウンドのパニング後、有意な濃縮が観察された。９６クローンをＶＨおよびＶＨ／ 30 ＶＬライブラリー選別から各々選び、それらがヒトおよびマウスの両方のＰＤ−Ｌ１−Ｆ ｃに特異的に結合するか否かを決定した。これらのクローンの可変領域をＰＣＲ配列決定 し、固有の配列クローンを同定した。 【０４５６】 目的の親クローンを、個々のクローンのＶＬおよびＶＨ領域をそれぞれＬＰＧ３および ＬＰＧ４ベクター（Lee et al., supra）中にクローン化し、哺乳動物ＣＨＯ細胞中で一 過性に発現させ、そしてプロテインＡカラムを用いて精製することによりＩｇＧ中に再フ ォーマットした。１３のファージ抗体を、それらが２９３細胞において発現された可溶性 ＰＤ−１−Ｆｃ融合体とヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ１の間での相互作用を遮断する能力に ついて評価した（ＩＣ５０値が表１に指定される−上半分）。ＹＷ２４３．５５は、ＰＤ 40 −１へのヒトＰＤ−Ｌ１の結合を遮断するための最低ＩＣ５０を伴う抗体であり、続く親 和性成熟について選択され、ヒトおよびマウスの両方のＰＤ−Ｌ１についてその親和性を 改善した。（表１）霊長類およびマウス種の両方に対して同程度の交差反応性を伴う（な らびにヒトに対する親和性を保持する）抗体は、実験モデルにおいて十分に特徴付けられ た同じ抗体をヒトの臨床試験において使用することができる点で、増強した価値の治療を 提供しうる。これによって、モデル特異的サロゲートの使用に起因する不確実性が回避さ れる。 【０４５７】 ＶＨライブラリーに由来するクローンの親和性改善のためのコンストラクトライブラリー ファージミドｐＷ０７０３（ファージミドｐＶ０３５０−２ｂ（Lee et al., J. Mol.B 50 (110) JP 2012-511329 A 2012.5.24 iol 340: 1073-1093 (2004)）に由来し、全てのＣＤＲ−Ｌ３位置に終始コドン（ＴＡＡ ）を含み、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価Ｆａｂを提示する）は、親和性成熟 のためにＶＨライブラリーからの目的のクローンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を移植する ためのライブラリーテンプレートとしての役割を果たした。ハードおよびソフトの両方の ランダム化戦略を親和性成熟のために使用した。ハードなランダム化のために、３つの軽 鎖ＣＤＲの選択された位置を伴う１つの軽鎖ライブラリーを、天然ヒト抗体を模倣するよ うに設計されたアミノ酸を使用してランダム化し、設計されたＤＮＡ縮重はLee et al.(J . Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)に記載された。ソフトなランダム化のために、ＣＤ Ｒ−Ｌ３の位置９１∼９４、および９６、ＣＤＲ−Ｈ１の２８∼３１および３４∼３５、 ＣＤＲ−Ｈ２の５０、５２、および５３∼５８、ＣＤＲ−Ｈ３の９５∼９９および１００ 10 Ａを標的化した；ならびに、ＣＤＲループ（Ｌ３／Ｈ１／Ｈ２およびＬ３／Ｈ３）の２つ の異なる組み合わせをランダム化のために選択した。ソフトなランダム化条件（それによ り選択された位置での約５０%の突然変異率が産生された）を達成するために、突然変異 ＤＮＡを、野生型ヌクレオチドを支持する塩基の７０−１０−１０−１０混合物を用いて 合成した（Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)）。 【０４５８】 親和性改善を生成するためのファージ選別 以前に同定されたファージクローンを、第１ラウンドのためのプレート選別に供し、５ または６ラウンドの溶液選別が続いた。ライブラリーを、ヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ１− Ｆｃに対してそれぞれ選別した（R&D Systems、それぞれｃａｔ．＃１５６−Ｂ７、ｃａ 20 ｔ ＃１０１９−Ｂ７）。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃのために、第１ラウンドのプレート選別 で、３つのライブラリーを、標的コートプレート（NUNC Maxisorp（登録商標）プレート ）に対して、１% ＢＳＡおよび０．０５% Tween-20中のファージインプット（約３ Ｏ ．Ｄ．／ml）を別々に用いて、２時間にわたり室温で選別した。第１ラウンドのプレート 選別後、溶液選別を実施し、選択のストリンジェンシーを増加した。溶液選別のために、 第１ラウンドのプレート選別から増殖させた１ O.D./mlファージを、１% Superblock（P ierce Biotechnology）および０．０５% Tween-20を含む１００μL緩衝液中で２０nmビ オチン化標的タンパク質（濃度は、親クローンファージのＩＣ５０値に基づく）を用いて 、３０分間にわたり室温でインキュベートした。混合物を、さらに、１% Superblockを 用いて１０×希釈し、１００μL/ウェルをニュートラアビジンコートされたウェル（５μ 30 g/ml）に、１５分間にわたり室温で、穏やかに撹拌しながら（ビオチン化標的がファージ に結合するように）適用した。ウェルをＰＢＳ−０．０５% Tween-20を用いて１０×洗 浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化されなかった標的を伴うフ ァージを含むコントロールウェルを、ニュートラアビジンコートされたプレート上で捕捉 した。結合したファージを０．１N ＨＣｌを用いて２０分間にわたり溶出させ、１／１ ０容積の１M Ｔｒｉｓ ｐＨ−１１により中和し、滴定し、次のラウンドために増殖さ せた。次に、５を上回るラウンドの溶液選別を、増加する選択ストリンジェンシーの２つ の方法を一緒に用いて行った。その第１は、ビオチン化標的タンパク質濃度を減少させる （４nMから０．５nMまで）ことによるオンレート選択のためであり、その第２は、過剰量 の非ビオチン化標的タンパク質（１００∼２０００倍以上）を加え、弱い結合剤を室温ま 40 たは３７℃のいずれかで競合除去することによるオフレート選択のためである。また、フ ァージインプットをより低いバックグラウンドファージ結合まで減少させた（０．１∼０ ．５O.D/ml）。マウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ標的について、ファージ選別方法は、ヒトＰＤ− Ｌ１ Ｆｃ抗原について上で記載されるものと類似であり、少数の改変を伴う。具体的に は、１００nmビオチン化マウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを、第１ラウンドのプレートパニングの 直後に溶液パニングのために使用した。４回の続くラウンドの溶液パニングにおいて、ビ オチン化標的を１０nMから１nMまで低下させ、２００∼５００倍過剰の非ビオチン化標的 を室温で加えた。 【０４５９】 親和性成熟させたクローンを、次に、さらに、以下の実施例に記載されるハイスループ 50 (111) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ手順を用いてスクリーニングした。 【０４６０】 ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ（シングルスポット競合） コロニーを、それぞれヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１標的についての７回目および６回 目のラウンドのスクリーニングから選んだ。コロニーを、一晩３７℃で、９６ウェルプレ ート（Falcon）において１５０μL/ウェルの２ＹＴ培地（５０μg/mlカルベニシリンおよ び１Ｅ１０／ml ＫＯ７）中で増殖させた。同じプレートから、親ファージの感染したＸ Ｌ−１コロニーをコントロールとして選んだ。96-well Nunc Maxisorp（登録商標）プレ ートを、ＰＢＳ中の１００μL/ウェルのヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質（ ２μg/ml）を別々に用いて、４℃で一晩または室温で２時間にわたりコートした。プレー 10 トを、６５μLの１% ＢＳＡを用いて３０分間にわたり、そして４０μLの１% Tween-20 を用いて別の３０分間にわたりブロックした。 【０４６１】 ファージ上清を、１００μLの全容積において、１０nmの標的タンパク質を伴うまたは 伴わないＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）緩衝液（０．５% ＢＳＡ、０．０５% Tween-20を伴うＰＢＳ）中で１：１０希釈し、Ｆプレート（NUNC）中で少なくとも１時 間室温でインキュベートした。標的タンパク質を伴うまたは伴わない７５μLの混合物を 、標的タンパク質コートされたプレートに並べて移した。プレートを穏やかに１５分間に わたり撹拌し、標的タンパク質コートされたプレートへの未結合ファージの捕捉を可能に した。プレートを少なくとも５回ＰＢＳ−０．０５% Tween-20を用いて洗浄した。結合 20 を、ＥＬＩＳＡ緩衝液中に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合抗Ｍ１３抗体を加 え（１：５０００）、３０分間にわたり室温でインキュベートすることにより定量化した 。プレートをＰＢＳ−０．０５% Tween-20を用いて少なくとも５回洗浄した。次に、１ ００μL／ウェルの１：１比率の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ ）ペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)）をウェルに加え、５分間にわたり室温でインキュベ ートした。反応を、１００μLの１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を各ウェルに加えることによ り停止し、５分間にわたり室温でインキュベートした。各ウェル中の黄色のＯＤ（光学密 度）を、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４５０nmで決定した。ＯＤ低 下（%）を以下の等式により算出した。 30 ＯＤ４５０nm低下（%）＝［（競争相手を伴うウェルのＯＤ４５０nm）／（競争相手を伴 わないウェルのＯＤ４５０nm）］×１００ 【０４６２】 親ファージ（１００%）のウェルでのＯＤ４５０nm低下（%）と比較し、ヒトおよびマウ スの両方の標的について５０%未満のＯＤ４５０nm低下（%）を有するクローンを、配列分 析のために選んだ。固有のクローンをファージ調製のために選択し、親クローンとの比較 により、ヒトおよびマウスの両方のＰＤ−Ｌ−Ｆｃに対する結合親和性（ファージＩＣ５ ０）を決定した。 【０４６３】 材料 40 ｈＰＤ−１−Ｆｃ、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｈＢ７．１−Ｆｃ、ｍＰＤ−１−Ｆｃ、ｍＰ Ｄ−Ｌ１−Ｆｃ、およびｍＢ７．１をR & D Systemsから購入した。ｈＰＤ−Ｌ１発現２ ９３細胞を、Genentechで、従来の技術を使用して生成した。Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒト ＩｇＧ ＦｃをJackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入した。 【０４６４】 タンパク質のコンジュゲーション ＰＤ−１−ＦｃおよびＢ７．１−Ｆｃタンパク質を、 ＥＺ−Ｌｉｎｋ ｓｕｌｆｏ− ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Pierce）を用いて３０分間にわたり室温で、製造業者に より記載される通りにビオチン化した。過剰の未反応ビオチンを、Quick Spin High Capa city Columns, G50-Sephadex（Roche）を用いて、製造業者により記載される通りに除去 50 (112) JP 2012-511329 A 2012.5.24 した。 【０４６５】 Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦｃをＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ ＮＨＳ−Ｅｓ ｔｅｒ（Meso Scale Discovery）を用いて、製造業者により記載される通りにルテニウム 標識し、過剰の未反応Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇを、Quick Spin High Capacity Column, G50-S ephadexを用いて除去した。 【０４６６】 ファージ抗体をテストするためのＥＣＬ細胞結合アッセイ ｈＰＤ−Ｌ１発現２９３細胞へのｈＰＤ−１−Ｆｃの結合の５０%阻害（ＩＣ５０）を もたらす抗体濃度を、電気化学発光（ＥＣＬ）細胞結合アッセイにより測定した。ｈＰＤ 10 −Ｌ１発現２９３細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、９６ウェルＨｉ ｇｈ Ｂｉｎｄプレート（Meso Scale Discovery）で２５μLのＰＢＳ中に１ウェル当た り２５，０００個の細胞を播種した。プレートを室温でインキュベートし、細胞が、プレ ートのカーボン表面に付着することを可能にする。２５μLの３０% ＦＢＳを各ウェルに 加え、プレートを３０分間にわたり軽く撹拌しながらインキュベートし、非特異的結合部 位をブロックする。プレートを３回、ＰＢＳを用いて、ＥＬＩＳＡマイクロプレートウォ ッシャー（ELx405 Select, Bio-Tek Instruments）で、穏やかな分注および吸引条件下で 洗浄する。ウェル中の過剰なＰＢＳを、プレートをペーパータオル上で吸い取ることによ り除去する。１２．５μLの２×濃度の抗体を、ＰＢＳ中の３%ＦＢＳ（アッセイ緩衝液） 中の各ウェルに、続いてアッセイ緩衝液中の１２．５μLの４μg/ml（２×濃度）のｈＰ 20 Ｄ−１ビオチンを加え、プレートを１時間にわたり軽く撹拌しながらインキュベートする 。プレートを、ＰＢＳを用いてマイクロプレートウォッシャーで３回洗浄し、プレートを ペーパータオル上で吸い取る。２５μLの２μg/mlのストレプトアビジン−ルテニウム（M eso Scale Discovery）を加え、アッセイ緩衝液中で、室温で３０分間にわたり穏やかに 撹拌しながらインキュベートする。ＰＢＳを用いてマイクロプレートウォッシャーで３回 洗浄し、プレートをペーパータオル上で吸い取る。サーファクタントを伴わない１５０μ Lの1×MSD Read Buffer（Meso Scale Discovery）を加える。放出されたルミネセンス光 をSector Imager 6000リーダー（Meso Scale Discovery）で、６２０nmで読み取る。ＥＣ Ｌ値を、アッセイにおいて使用されるテスト抗体の濃度を用いて、４パラメーターの非線 形最小二乗法を使用して分析し、アッセイにおける各競合相手のＩＣ５０値を得た。 30 【０４６７】 結果および考察： ヒトおよびマウスの両方のＰＤ−Ｌ１に結合した、ＹＷ２４３．５５に由来する１５の 固有ファージ抗体を選び、さらなる評価のために全長ＩｇＧ１抗体に再フォーマットした 。これらの抗体の軽鎖および重鎖可変領域配列を、図１１ＡおよびＢに報告する。 【０４６８】 １５の再フォーマットＡｂを、ヒトまたはマウスのいずれかのＰＤ−Ｌ１を発現する２ ９３細胞へのＰＤ−１の結合を遮断するそれらの能力について、電気化学発光（ＥＣＬ） 細胞結合アッセイを介してテストした。（表１−下半分：表１において、「フォーマット １」は、ヒトＰＤ−Ｌ１トランスフェクションされた２９３細胞への可溶性ヒトＰＤ−１ −Ｆｃ結合を記載する；「フォーマット２」は、マウスＰＤ−Ｌ１トランスフェクション された２９３細胞へのマウスＰＤ−１−Ｆｃ結合を記載する；「フォーマット３」は、マ ウスＰＤ−Ｌ１トランスフェクションされた２９３細胞へのヒトＰＤ−１−Ｆｃ結合を記 載する）全ての１５の親和性が改善されたＡｂが、マウスＰＤ−Ｌ１に対する有意な交差 反応性を獲得していたが、ＹＷ２４３．５５Ｓ７０を一次候補として選択し、ＰＤ−１に 対するヒトおよびマウスの両方の結合を遮断するその能力に基づいて追求した（表１：Ｉ Ｃ５０値がそれぞれ４９pMおよび２２pM）。 【０４６９】 40 (113) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【表４】 10 20 30 【０４７０】 実施例２ 抗ＰＤ−Ｌ１抗体の特徴付け（BIAcore） 組換えヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１ファージ抗体ＹＷ２４３．５ ５およびＹＷ２４３．５５Ｓ７０の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）により BIAcore（商標）−３０００機器を使用して測定した。組換えヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D 40 Systems、ｃａｔ＃１５６−Ｂ７）および組換えマウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D Systems 、ｃａｔ＃１０１９−Ｂ７）を、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に直接コートし、約５０ ０応答単位（ＲＵ）を達成した。動態測定のために、２倍連続希釈物（３．９nm∼５００ nm）を、ＰＢＴ緩衝液（０．０５% Tween-20を伴うＰＢＳ）中で、２５℃で、流速３０ μL/分で注射した。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、簡単な１対１の Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（BIAcore Evaluation Softwareバージョン3.2）を使用して 算出する。平衡解離定数（ｋＤ）を比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。 【０４７１】 測定された抗ＰＤ−Ｌ１ファージ抗体クローンＹＷ２４３．５５およびＹＷ２４３．５ ５．Ｓ７０の結合親和性を、下の表２に報告する。 50 (114) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【０４７２】 【表５】 10 【０４７３】 実施例３Ａ ヒト、アカゲザル、およびマウスのＰＤ−Ｌ１についての抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの特異性− 20 ＦＡＣＳおよび放射性リガンド細胞結合アッセイ この実施例は、ヒト、アカゲザル、およびマウスのＰＤ−Ｌ１についての本発明の抗Ｐ Ｄ−Ｌ１抗体についての特異性を示す。また、それは、トランスフェクションされた２９ ３細胞上の細胞膜で発現されたマウスおよびヒトのＰＤ−Ｌ１についてのＡｂの親和性を 示す。 【０４７４】 ヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１を、２９３細胞中に安定的にトランスフェクションした 。細胞を収集し、結合試験のために９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１５０， ０００個の細胞でプレーティングした。 【０４７５】 30 アカゲザルの血液をSouthwest Foundation for Biomedical Research（San Antonio, T exas）から得た。血液を等容積のＰＢＳを用いて希釈し、単核球の分離のために９６%Fic oll-Paque（GE Healthcare）上に重層した。赤血球の単核球を、赤血球溶解緩衝液（Ｑｉ ａｇｅｎ）を使用して溶解し、６ウェルプレートにおいて５ng/ml ＰＭＡプラス１μＭ イオノマイシンを用いて１．５×１０６個細胞/mlで一晩培養した。培養液は、１０%ウシ 胎仔血清、２０μM ＨＥＰＥＳ、およびGibcoからの以下の添加剤の１：１００希釈物を 伴うＲＰＭＩ １６４０であった：Gluta-MAX、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ス トレプトマイシン、および非必須アミノ酸。細胞を次の日に収集し、結合試験のために９ ６ウェルプレートに分注した（約１２０，０００個細胞／ウェル）。 【０４７６】 40 ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０またはHerceptin（登録商標）抗体コントロ ールを、１０μg/mlで開始し、３倍連続希釈物中で滴定し、細胞に５０μL容積中で２５ 分間にわたり氷上で結合させた。細胞を洗浄し、次に、抗ヒトＩｇＧ ＰＥ（Caltag）を 用いて２０μg/mlで２５分間にわたり氷上で結合させた。アカゲザル細胞を、また、ＣＤ ３ ＦＩＴＣおよびＣＤ４ ＡＰＣ（BD Biosciences）を用いて同時染色し、ＣＤ４＋Ｔ 細胞を区別した。 【０４７７】 全てのサンプルをBeckman Dickinson FACSCaliburで実行し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体濃度の 機能としてのＰＤ−Ｌ１結合データの平均蛍光強度を、Tree Star, Inc. FlowJo（登録商 標）ソフトウェアを使用して分析した：ＥＣ５０値（半最高結合に関連するＡｂ濃度）を 50 (115) JP 2012-511329 A 2012.5.24 、Kaleidagraphを使用して算出した。また、平衡結合試験を実施し、２９３細胞で発現さ れたヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１に対するＹＷ２４３５５Ｓ７０結合についての正確な 親和性（Ｋｄ）を定めた（実施例３Ｂ）。これらの値を下の表３にまとめる： 【０４７８】 【表６】 10 【０４７９】 実施例３Ｂ ヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの親和性測定−平衡結合放射 20 性リガンド細胞結合アッセイ ヒトまたはマウスのＰＤ−Ｌ１を用いてトランスフェクションされた２９３細胞を増殖 培地（１０%ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２mM Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン−ストレ プトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地からなる）中で、３７℃で５% ＣＯ２ において培養した。細胞を結合緩衝液（２% ＦＢＳおよび５０mM Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７ ．２を伴う５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いて洗浄し、９６ウェルプレート中に、 ０．２mLの結合緩衝液中に約２３０，０００個の細胞でプレーティングした。抗ＰＤ−Ｌ １抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０．ｈＩｇＧを、Ｉｏｄｏｇｅｎ方法を使用してヨード化 した。放射標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、遊離１２５Ｉ−ＮＡから、ゲルろ過により、 ＮＡＰ−５カラムを使用して精製した；精製されたＡｂは１７．４１μCi/μgの比放射能 30 を有した。一定濃度のヨード化抗体および減少濃度の連続希釈された非標識抗体を含む５ ０μL容積の競合反応混合物を、９６ウェルプレート中に置いた。ヒトＰＤ−Ｌ１および マウスＰＤ−Ｌ１を発現する２９３安定的トランスフェクタント細胞株を、増殖培地（１ ０%ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２mM Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン−ストレプトマイ シンを添加した５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地からなる）中で、３７℃で５% ＣＯ ２において培養した。細胞を結合緩衝液（２% ＦＢＳ、５０mM Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７． ２、および２mMアジ化ナトリウムを伴う５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いて洗浄し 、５０μLの競合反応混合物に、０．２mLの結合緩衝液中の約２００，０００個の細胞密 度で加えた。細胞を伴う各競合反応におけるヨード化抗体の最終濃度は∼１５０pM（∼１ ２０，０００cpm/０．２５mL）であり、細胞を伴う競合反応における非標識抗体の最終濃 40 度は変動し、５００nMで開始し、次に１０濃度について２倍ずつ減少した。細胞を伴う競 合反応物を２時間にわたり室温でインキュベートした。非標識抗体の各濃度についての細 胞を伴う競合反応物を３通りにアッセイした。２時間のインキュベーション後、競合反応 物をMillipore Multiscreenフィルタープレートに移し、結合緩衝液を用いて４回洗浄し 、結合ヨード化抗体から遊離物を分離した。フィルターをWallac Wizard 1470ガンマカウ ンター（PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.Wellesley, MA）でカウントし た。結合データを、NewLigandソフトウェア（Genentech）を使用して評価し、それはMuns onおよびRobardの適合アルゴリズムを使用し、抗体の結合親和性を決定する。Musson et al., Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980)。 【０４８０】 50 (116) JP 2012-511329 A 2012.5.24 Ｋｄ値は、スキャッチャード分析により決定された通り、ヒトおよびマウスのＰＤ−Ｌ １に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＥＣ５０値を確証する（表３に示す）。 【０４８１】 実施例４ 抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの選択性および親和性（ＩＣ５０） この実施例は、ＰＤ−１およびＢ７．１の両方に対するＰＤ−Ｌ１の結合を遮断するた めのその能力について本発明の全長抗ＰＤ−Ｌ１抗体を評価するために使用される結合選 択性および親和性（ＩＣ５０として）を示す。 【０４８２】 方法： 10 ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ ＥＬＩＳＡに対するｈＢ７．１−Ｆｃ−ビオチンおよびｈＰＤ−１ −Ｆｃ−ビオチン結合（フォーマット４）： Nunc Maxisorp 384ウェルプレートを、ＰＢＳ中の２５μLの２５０ng/ml ｈＰＤ−Ｌ １−Ｆｃを用いてコートした。ウェルをＰＢＳ中の０．０５% Tween（洗浄緩衝液）を用 いてマイクロプレートウォッシャーで３回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中の０．５% ＢＳＡ を用いてブロックする。１２．５μLの２×濃度の抗体を、各ウェルへ、ＰＢＳ中の０． ０５% Tween、０．５% ＢＳＡ（アッセイ希釈剤）中に、続いてアッセイ希釈剤中の１ ２．５μLの２５０ng/ml（２×濃度）のｈＢ７．１−Ｆｃ−ビオチンを加え、プレートを １時間半にわたり撹拌しながらインキュベートする。ウェルを、洗浄緩衝液を用いて６回 洗浄し、２５μLのストレプトアビジン−ＨＲＰ（アッセイ希釈剤中の１：４０，０００ 20 、GE Healthcare）を加える。プレートを３０分間にわたり撹拌しながらインキュベート し、洗浄緩衝液を用いて６回洗浄する。２５μLのＴＭＢ基質（Kirkegaard and Perry La boratories）を１時間にわたり加え、反応を２５μLの１Mリン酸を用いて停止する。吸光 度を４５０nmで読み、ＩＣ５０値を、実施例１におけるＥＣＬ細胞結合アッセイの下に記 載される通りに分析する。 【０４８３】 フォーマット５、６、７： ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃへのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチン結合（フォーマット５）のために、 フォーマットは、ｈＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチンがｈＢ７．１−Ｆｃ−ビオチンの代わりに 結合のために使用されたことを除き、上のアッセイと類似している。ＴＭＢ基質の反応時 30 間は１７分であった。 【０４８４】 ｍＰＤ−Ｌ１−ＦｃへのｍＢ７．１−Ｆｃ−ビオチン結合（フォーマット６）のために 、フォーマットは、ｍＰＤ−Ｌ１−ＦｃがｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの代わりにプレートをコー トするために使用されたこと、および、ｍＢ７．１−Ｆｃ−ビオチンがｈＢ７．１−Ｆｃ −ビオチンの代わりに結合のために使用されたことを除き、フォーマット５と類似してい る。ＴＭＢ基質の反応時間は７分であった。 【０４８５】 ｍＰＤ−Ｌ１−ＦｃへのｍＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチン結合（フォーマット７）のために 、フォーマットは、ｍＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチンが結合のためにｍＢ７．１−Ｆｃ−ビオ 40 チンの代わりに使用されたことを除き、上記のマウスＥＬＩＳＡと類似している。ＴＭＢ 基質の反応時間は５分であった。 【０４８６】 結果： 指定された結合対の間での相互作用を遮断するための親和性成熟ファージ抗ＰＤ−Ｌ１ 抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０のＩＣ５０の評価を、表４に報告する。ＹＷ２４３．５５ Ｓ７０は、ｈＢ７．１ ＦｃへのヒトＰＤ−Ｌ１の結合を遮断することができた（半最高 阻害濃度は３８pMであり、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断するためのそのＩＣ５０ 値（４２pM）と比較的同程度の濃度である）。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１およびＢ７．１の両 方との相互作用を遮断するためのＹＷ２４３．５５Ｓ７０の能力を測定するBiacore試験 50 (117) JP 2012-511329 A 2012.5.24 は、これらのＥＬＩＳＡでの結果と一致した（データ示さず）。 【０４８７】 【表７】 10 【０４８８】 実施例５ 抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ ＰＭＥＬ／Ｂ１６ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセ イによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強 この実施例は、ＰＭＥＬ Ｔ細胞受容体トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化時 での本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果を示す（メラノサイトペプチドｇｐ１００に応答し たγ−ＩＦＮ産生の増強により測定）。この手順において、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞がｇｐ１００ペプチドに特異的なＴＣＲを発現するＰＭＥＬ ＴＣＲトランスジェ ニックマウスから得られる。ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製に続き、複数回ラウンドの刺激を実施 20 し、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成および増殖し、それは次にＰＤ−１発現をアップレギュ レーションする。並行して、Ｂ１６メラノーマ細胞をＩＦＮ−γを用いて処置し、それら のＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレーションする。次に、細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存 在において同時培養し、ＩＦＮ−γ産生に対する効果を評価する。Ｂ１６細胞を三次刺激 のために選んだ。なぜなら、それらは、低レベルのｇｐ１００ペプチドを内因性に発現す るからである（ペプチドの外因性適用と反対）。さらに、これらの細胞が、また、ＰＤ− Ｌ２、Ｂ７．１、またはＢ７．２を発現しないため、ＰＤ−Ｌ１と無関係である追加シグ ナル伝達（例、ＰＤ−１を通じたＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ２誘導性シ グナル伝達を通じたシグナル伝達）の効果が最小限になる。 【０４８９】 30 ＰＭＥＬアッセイ： 図３に示す通り、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、IＦＮ−γ産生ＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞のパ ーセンテージおよび指定量のｇｐ１００ペプチドに応答して産生されるＩＦＮ−γの平均 レベルの両方を増強する。 【０４９０】 Ｄ．０１１．１０ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ： Ｏｖａ特異的ＴＣＲ Ｔｇ ＣＤ４＋Ｔ細胞を利用した同様のアッセイでは、ＰＤ−１ の発現を誘導するためのＯｖａペプチドを用いた事前の刺激に続き、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ の存在における増強されたＴ細胞増殖が示される（図４）。最終刺激において、ＰＤ−Ｌ １を発現する照射Ａ２０ Ｂ細胞を使用し、ＤＯ．１１．１０ Ｔ細胞に対して指定濃度 40 のＯｖａペプチドを提示した。とりわけ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の寄与が、より低い程 度（生理学的に関連する大きさの刺激をより厳密に反映するレベル）の抗原受容体刺激で より顕著である。 【０４９１】 材料および方法： ＰＭＥＬアッセイ 一次刺激（０∼４日目） 脾臓および腸間膜リンパ節をＰＭＥＬトランスジェニックＴ細胞受容体マウスから収集 した。臓器を単一の細胞懸濁液中に粉砕し、赤血球を溶解させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｃ Ｄ８＋Ｔ細胞単離キットおよびAutoMACSセルセパレーター（Miltenyi Biotec）を使用し 50 (118) JP 2012-511329 A 2012.5.24 て、製造業者の指示の通りに単離した。 【０４９２】 脾臓を非トランスジェニックの性別を一致させたマウスから単離し、単一の細胞懸濁液 中に粉砕し、赤血球を溶解させた。細胞を、０．１μg/mlのｇｐ１００ペプチドを用いて ３７℃で２時間にわたりパルスし、洗浄した。 【０４９３】 細胞を、９６ウェル平底プレートにおいて、２００，０００個のＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ 細胞および７５，０００個のｇｐ１００パルス脾細胞と共に４日間にわたり同時培養した 。培養液は、イスコフ改変ダルベッコ培地＋１０%ウシ胎仔血清＋２０μM ＨＥＰＥＳ、 およびGibcoからの以下の添加剤の１：１００希釈物：Gluta-MAX、ピルビン酸ナトリウム 10 、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸であった。 【０４９４】 二次刺激（４∼７日目） ＰＭＥＬ培養物をスピンダウンし、培地を、マルチチャネルピペットを使用して吸引し た。新鮮培地を加え、混合して細胞を洗浄し、別のスピンが続いた。大部分の培地を除去 し、抗体（Herceptin（登録商標）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、またはなし）を、最終 濃度１０μg/mlで加えた。条件を２通りのウェルにおいて設定し、平均ＩＦＮ−γ産生を エンドポイントで評価できるようにした。 【０４９５】 ＤＣ−１細胞を、０．１μg/mlのｇｐ１００ペプチドを用いて２時間にわたり３７℃で 20 パルスし、洗浄した。Ｇｐ１００パルスされたＤＣ−１細胞を、４０，０００個細胞／ウ ェルで、洗浄されたＰＭＥＬ培養物に加えた。ＰＭＥＬおよびＤＣ−１＋抗体を３日間に わたり同時培養した。 【０４９６】 三次刺激（７∼８日目） ６日目の三次刺激の１日前に、Ｂ１６メラノーマ細胞を、２０ng/mlのマウスＩＦＮ− γ（R&D Systems）を用いて一晩インキュベートし、それらのＰＤ−Ｌ１発現をアップレ ギュレーションした。 【０４９７】 ７日目、ＰＭＥＬ培養物をスピンダウンし、培地を、マルチチャネルピペットを使用し 30 て吸引した。新鮮培地を加え、混合し、別のスピンが続いた。大部分の培地を除去し、抗 体を最終濃度１０μg/mlで加えた。 【０４９８】 ＩＦＮ−γを用いた一晩の刺激後、Ｂ１６細胞を洗浄し、ｇｐ１００なし、１ng/mlの ｇｐ１００（ｇｐ１００低）、および１０ng/mlのｇｐ１００（ｇｐ１００高）のいずれ かを用いた２時間のインキュベーションのために３群に分けた。細胞を洗浄し、次に、洗 浄されたＰＭＥＬ＋Ａｂ培養物を４０，０００個細胞／ウェルで加え、一緒に一晩インキ ュベートした。 【０４９９】 ８日目 ＩＦＮ−γ細胞内染色 40 Golgi-Plug（BD Biosciences）を、培養の最後の５時間にわたり、製造業者の指示の通 りに加えた。ＩＦＮ−γ細胞内染色を、BD Biosciences Cytofix/Cytoperm Fixation/Per meabilization Solutionキットを使用して、製造業者の指示の通りに行い、全ての染色抗 体もBD Biosciencesからであった。細胞を、ＣＤ８ａ ＰＥおよびＴｈｙ１．１ ＦＩＴ Ｃを用いて表面染色し、飽和濃度のＩＦＮ−γ ＡＰＣを用いて細胞内染色した。 【０５００】 全てのサンプルをBeckman Dickinson FACSCaliburで実行し、データを、Tree Star, In c. FLOWJO（商標）ソフトウェアを使用して分析した。 【０５０１】 Ｄ０１１．１０ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ 50 (119) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウスからの脾臓および腸間膜リンパ節を収集し、 単一の細胞懸濁液中に粉砕し、赤血球を溶解させた。細胞を、７２時間にわたり、６ウェ ルプレートにおいて密度１×１０６個細胞／mlで、Ｏｖａペプチド（０．３μM）を用い て培養した。培養液は、ＲＰＭＩ １６４０＋１０%ウシ胎仔血清＋２０μM ＨＥＰＥＳ 、およびGibcoからの以下の添加剤の１：１００希釈物：Gluta-MAX、ピルビン酸ナトリウ ム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸であった。 【０５０２】 一次刺激後、細胞を収集し、マウスＣＤ４ Ｔ細胞精製キットを使用し、製造業者（Mi ltenyi Biotec）の指示の通りに精製した。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を次に一晩静置し た。 10 【０５０３】 次の日、細胞を収集し、洗浄し、照射された（１０，０００ラッド）Ａ２０細胞と同時 培養した。同時培養を、９６ウェルＵ底プレートにおいて３通りのウェルに設定し、４０ ，０００個のＡ２０細胞に対して５０，０００個のＣＤ４＋Ｔ細胞を伴い、滴定されたＯ ｖａペプチドおよび抗体は最終濃度２０μg/mlであった。４８時間後、培養物を一晩、１ μCi/ウェルの３Ｈチミジンを用いてパルスし、次の日に凍結させた。プレートを後に解 凍し、セルハーベスターで収集し、ベータ−カウンターで読んだ。 【０５０４】 実施例６ 抗ＰＤ−Ｌ１による混合リンパ球反応におけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増強された増殖 20 図５は、ＭＨＣ不適合ドナーからの細胞に応答した、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を増強 する抗ＰＤ−Ｌ１（例、ＹＷ２４３．５５．Ｓ１）の能力を実証する。応答性ＣＤ８＋Ｔ 細胞を、ドナーＡの全血から、最初にＣＤ８＋Ｔ細胞RosetteSep（登録商標）（StemCell Technologies）を製造業者の指示の通りに使用して濃縮した。細胞を次に等容積のリン 酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により希釈し、Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）に重層する ことにより勾配遠心分離により分離した。分離後、細胞を、ＣＤ８ ＡＰＣ（BD Bioscie nces）を用いて染色し、７８%のＣＤ８＋Ｔ細胞であることが見出された。細胞を、２． ５μMのＣＦＳＥトレーサー染料（Molecular Probes）を用いて蛍光標識した。 【０５０５】 同種抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たすために、単核球をドナーＢからの全 30 血から最初に単離し、次にＣＤ３＋Ｔ細胞を枯渇させた。血液を等容積のＰＢＳを用いて 希釈し、単核球をＦｉｃｏｌｌ上での勾配遠心法後に単離した。細胞を、CD3 FITC（BD B iosciences）を用いて染色し、洗浄し、次に抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Miltenyi Biote c）を用いてインキュベートした。ＣＤ３ ＦＩＴＣポジティブ細胞を次にAutoMACSセル セパレーター（Miltenyi Biotec）で枯渇させた。細胞を次にセシウム照射器において２ ５００ラドで照射した。 【０５０６】 細胞を、９６ウェル平底プレートにおいて１５０，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞および１ ５０，０００個のＡＰＣと共に５日間にわたり抗体（１０μg/ml）を用いて同時培養した 。培養液は、ＲＰＭＩ １６４０＋１０%ウシ胎仔血清＋２０μM ＨＥＰＥＳ、およびGi 40 bcoからの以下の添加剤の１：１００希釈物：Gluta-MAX、ピルビン酸ナトリウム、ペニシ リン／ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸であった。 【０５０７】 ５日目に、細胞を収集し、洗浄し、ＣＤ８ビオチン、続いてストレプトアビジン−Ｐｅ ｒＣｐ（BD Biosciences）を用いて染色した。サンプルをBeckman Dickinson FACSCalibu rで実行し、データを、Tree Star, Inc. FlowJoソフトウェアを使用して分析した 【０５０８】 ＭＨＣ不適合ドナーからの細胞に応答したＣＤ８ Ｔ細胞の増殖における約４５%増強 が、抗ＰＤ−Ｌ１の存在において観察された。 【０５０９】 50 (120) JP 2012-511329 A 2012.5.24 実施例７ ＬＣＭＶｉｎ ｖｉｖｏモデルに対するＰＤ−Ｌ１遮断の効果 慢性刺激の条件下のＴ細胞は、阻害的受容体ＰＤ−１の発現をアップレギュレーション し、維持することが示されている。その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のい ずれかによるＰＤ−１の連結は、慢性的に活性化されたＴ細胞の抵抗状態に寄与し、その 同種抗原に対するその応答を減弱する。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に持 続感染したマウスにおいて、ＰＤ−１またはそのリガンドＰＤ−Ｌ１の遮断は、慢性的に 抵抗性であるＴ細胞を再活性化するために十分であり、抗ウイルスＴ細胞応答の大きさお よび機能的な質を増強する。同様に、ＨＩＶまたはＨＣＶに慢性的に感染されたヒトは、 その活性がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の遮断によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増強されうる刺激 10 に対して抵抗性であるＴ細胞を示す。従って、ＬＣＭＶモデルにおけるＰＤ−Ｌ１遮断の 活性は、抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫を増強するための治療的な潜在能力を示唆する。 【０５１０】 マウスにおけるＬＣＭＶｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、本発明者らは、マウスＩｇＧ２ ａ重鎖およびマウスカッパ軽鎖定常ドメインの上流にファージ由来の重鎖および軽鎖可変 領域配列をクローン化することにより、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＹＷ２４３．５５Ｓ７ ０）を再フォーマットしている。ＰＤ−Ｌ１発現細胞の抗体媒介性の細胞傷害を、Ｆｃγ 受容体結合を阻害することにより妨げるために、位置２６５（アスパラギン酸）および２ ９７（アスパラギン）をアラニンに変化させた（ＤＡＮＡ）。Shields, RL et al J. Bio l Chem 2001 276 (9): 6591-6604。慢性感染において抗ウイルス免疫を増強するための抗 20 ６ ＰＤ−Ｌ１抗体の能力をテストするために、マウスを、０日目に、２×１０ プラーク形 成単位（ｐｆｕ）のクローン１３ ＬＣＭＶまたはＬＣＭＶのアームストロング株（参照 コントロールとして）を用いて感染させた。実験計画の模式図が図６に見られる。クロー ン１３を用いた感染は慢性感染をもたらし、増殖するが、しかし、ウイルスを効率的に除 去することができないＴ細胞により特徴付けられ、アームストロングＬＣＭＶは感染の８ ∼１０日以内に除去される。１４日目、マウスで、抗ＰＤ−Ｌ１またはコントロールｍＩ ｇＧ（１０mg/kg用量３×／週で送達）のいずれかを用いた処置を開始した。２１および ２８日目に、血液および組織におけるＣＤ８ Ｔ細胞機能およびウイルス力価の分析を実 施した。 【０５１１】 30 Barber et. al, Nature 439: 682-7 (2006)の公開データと一致して、この実施例は、 慢性ＬＣＭＶ感染における２週間の処置計画に続く、ＬＣＭＶに対する細胞傷害性リンパ 球応答を増強するための抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの能力を示す。図７Ａは、ｇｐ３３ ＬＣＭ Ｖ特異的ペプチドに応答してその細胞表面上にＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の %を示す。ＣＤ１０７ａ（通常細胞内で発現される）の原形質膜発現は、脱果粒プロセス を伴い、従って脱果粒のためのサロゲートマーカーとしての役割を果たす。急性アームス トロングＬＣＭＶ感染からの細胞の応答に比べて、慢性株（クローン１３）を用いて感染 させた動物からの細胞は脱顆粒が損なわれており（コントロールＩｇ群）、ＰＤ−Ｌ１遮 断が、アームストロング感染において観察されるものと同程度のレベルまでＣＤ８＋脱顆 粒を回復させることができた。同様に、７Ｂは、コントロールＩｇと比べて、抗ＰＤ−Ｌ 40 １処置群におけるＬＣＭＶ ｇｐ３３に応答したＩＦＮ−γ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の増加% を実証する。 【０５１２】 次に、血液および組織中のＬＣＭＶウイルスを低下または根絶させることに対する抗Ｐ Ｄ−Ｌ１ Ａｂの影響をテストした。図８Ａにおいて、グラフは、クローン１３ ＬＣＭ Ｖを用いた感染後２１および２８日目での、コントロールＩｇおよびＰＤ−Ｌ１処置され た動物の示された組織における対数ウイルス力価を示す。抗体処置を感染後１４日目に開 始した。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、血液、肝臓、脳、肺、および腎臓中のウイルス力価におけ る高度に有意な低下をもたらした。印象的なことに、マウス５匹中３匹において、α−Ｐ Ｄ−Ｌ１ Ａｂが血中ＬＣＭＶ力価を検出未満のレベルまで低下させた（＜１×１０−５ 50 (121) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ）。同等の計画での続く実験において、血液および肝臓におけるウイルス根絶が、１０mg /kgまたは２mg/kg ３×／週のいずれかの用量で、抗ＰＤ−Ｌ１を用いて２週間にわたり 処置された５匹中５匹のマウスにおいて観察された（データ示さず）。下のグラフでは、 血液中でのウイルス力価の低下の動態を示し、コントロールと比べた、２８日目での抗Ｐ Ｄ−Ｌ１処置群における平均低下９６．８%が実証される。これらのデータは、慢性感染 におけるＴ細胞応答の阻害におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の重要性を支持し、慢性感 染（例えばＣ型感染およびＨＩＶなど）を伴うヒトから得られたＴ細胞に対するｉｎ ｖ ｉｔｒｏでのＰＤ−Ｌ１遮断の効果と一致する。 【０５１３】 材料および方法： 10 ＬＣＭＶ ｇｐ３３ペプチドに応答したＣＤ８ Ｔ細胞による%ＩＦＮガンマ産生の決定 脾臓を感染マウスから単離し、単一の細胞懸濁液を、完全培地：ＩＭＤＭ（Invitrogen Inc., Carlsbad, CA）（１０%熱不活化ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミン、１００U/ mlペニシリン／ストレプトマイシン、および１０mM ２−メルカプトエタノールを含む） 中で臓器を破砕することにより生成した。赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５M Ｎ Ｈ４Ｃｌ、１０mM ＫＨＣＯ３、０．１mM ＥＤＴＡ）を使用して溶解した。抗原特異的 ＣＤ８ Ｔ細胞応答を測定するために、脾細胞を完全培地中で洗浄し、ＬＣＭＶペプチド ＧＰ３３（KAVYNFATC, ProImmune Inc., Bradenton, FL）を用いて４時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。１×１０６個の脾細胞を９６ウェル平底プレート中で１００ng /mlのＧＰ３３ペプチドを用いて１００単位/mlのヒトインターロイキン２（Sigma-Aldric 20 h, St. Louis, MO）、１μL/mlのブレフェルジンＡ、および１μL/ml（１：１０００希釈 ）のモネンシン（BD pharmingen）および抗ＣＤ１０７ａ ＦＩＴＣ（クローンＩＤ４Ｂ ， BD Biosciences, San Jose, CA）の存在において培養した。インキュベーション後、 細胞を、２%ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中で１回洗浄し、細胞表面マーカーを、蛍光色素 抱合抗体を使用して染色した：抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３．６７、BD Biosciences , San Jose, CA）、抗ＣＤ４ ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（クローンＲＭ４−５，BD Biosc iences, San Jose, CA）、および抗ＰＤ−１ ＰＥ（クローンＪ４３、BD Biosciences, San Jose, CA）。細胞内ＩＦＮ−γについての染色を、Cytofix Cytoperm Plusキット（B D Biosciences, San Jose, CA）を使用し、製造業者の指示に従い、抗ＩＦＮ−γ ＰＥ −Ｃｙ７（クローンＸＭＧ１．２，eBioscience Inc. San Diego, CA）を使用して行った 30 。ＧＰ３３特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を検出し、新鮮脾細胞をＧＰ３３五量体（ＡＰＣに 連結されたＨ２−Ｄｂ，ProImmune Inc., Bradenton, FL）を用いて、製造業者の指示に 従って染色した。データを、BD FACSAria（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用して 収集し、FlowJo Software（Tree Star Inc. Ashland OR）を用いて分析した。 【０５１４】 ＬＣＭＶウイルス力価の決定： ＭＣ５７線維肉腫細胞を、完全ＩＭＤＭ中のＬＣＭＶ含有血液または組織ホモジネート の１０倍連続希釈物を用いて感染させる。反応物を、次に、組織培養インキュベーターに おいて３７℃で２∼６時間にわたりインキュベートし、次に１%メチルセルロースを含む ＤＭＥＭを用いて重層する。これには３∼５日間にわたるインキュベーションが続き、次 40 に、メチルセルロース層を吸引により除去する。細胞をＰＢＳ／４%パラホルムアルデヒ ドを用いて固定し、次に０．５% Triton-xを用いて２０分間にわたり透過性化し、ＰＢ Ｓ中で洗浄し、次に１０% ＦＣＳ中で１時間にわたり軽く揺らしながらブロックする。 ＬＣＭＶについての染色を、ＶＬ４抗体を用いて行い（１時間）、２回洗浄し、次にブロ ッキング緩衝液中の抗ラットＨＲＰ（１：４００）を用いて現像する。これには３回の洗 浄が続き、次にｏ−フェニレンジアミン基質（SIGMA P8806-50TAB ３mg/錠）をウェルに 加えて現像する。 【０５１５】 実施例８ 癌におけるＰＤ−Ｌ１遮断 50 (122) JP 2012-511329 A 2012.5.24 現在、多くの腫瘍が、ＰＤ−１リガンドの発現を、抗腫瘍Ｔ細胞応答を減弱させるため の手段として利用することが明らかである。いくつかのヒトの癌が、腫瘍および腫瘍浸潤 白血球の両方で上昇レベルのＰＤ−Ｌ１を発現すると特徴付けられており、この上昇した ＰＤ−Ｌ１発現は、しばしば、より悪い予後と関連する。マウス腫瘍モデルでは、腫瘍内 のＰＤ−Ｌ１発現における類似の増加が実証され、腫瘍免疫を阻害する際でのＰＤ−１／ ＰＤ−Ｌ１経路についての役割が実証される。 【０５１６】 本明細書において、本発明者らは、同系Ｃ５７Ｂ６マウスにおけるＭＣ３８．Ｏｖａマ ウス結腸直腸癌細胞の同所性腫瘍増殖に対するＰＤ−Ｌ１遮断の影響を実証する実験を提 示する（図９Ａ）。これらの細胞は、レトロウイルス形質導入を介してオボアルブミンを 10 発現し、フローサイトメトリーにより評価された通り、それらの細胞表面でＰＤ−Ｌ１（ ＰＤ−Ｌ２ではない）を発現する（ヒストグラム−図１０Ａ）。マウスを、０日目に、０ ．５百万個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を用いて皮下接種した。１日目または１４日目に、マ ウス（腫瘍が平均サイズ２５０mm3に達していた場合）１０匹のマウス／群を、１０mg/kg 抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ２４３．５５Ｓ７０マウスＩｇＧ２ａ−ＤＡＮＡ）、コントロールＩ ｇ、または遮断抗ＣＴＬＡ４ Ａｂ（ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）３×／週を用いて、試 験の期間中に処置した。ＰＤ−Ｌ１の遮断（初期または後期のいずれかの介入）は、腫瘍 増殖を予防する際の単剤治療として高度に効果的である。対照的に、ＣＴＬＡ４（Ｔ細胞 で発現される別の阻害分子）の遮断は、腫瘍増殖を阻害する証拠を示さなかった。これら の結果は、抗腫瘍免疫応答の抑制におけるＣＴＬＡ４／Ｂ７を上回るＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ 20 １軸の固有の役割を実証し、ＰＤ−１およびＢ７．１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断す る抗体を用いたヒト癌の処置のための潜在能力を支持する。 【０５１７】 ＭＣ３８．Ｏｖａ同系腫瘍モデル：方法。０日目に、７０匹の動物に、１００マイクロ リットルのＨＢＳＳ＋ｍａｔｒｉｇｅｌ中の０．５百万個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を用い て皮下接種した。１日目に開始し、２０匹のマウスを２処置群（以下を参照のこと：グル ープ１またはグループ２）の１つに補充した。残りの４０匹のマウスで、１４日目まで腫 瘍を増殖させた。これらの４０匹の内、同様のサイズの腫瘍を伴う３０匹のマウスを、３ 処置群（グループ３∼５）の１つに補充した。腫瘍を測定し、マウスを２×／週で体重測 定した。異なる腫瘍容積のために以下の処置群に補充されなかったマウスは、安楽死させ 30 た： 【０５１８】 グループ１：抗ｇｐ１２０抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、１日目、３×／週 グループ２：抗ＰＤ−Ｌ１抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、１日目、３×／週 グループ３：抗ｇｐ１２０抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、１４日目、３×／週 グループ４：抗ＰＤ−Ｌ１抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、１４日目、３×／週 グループ５：抗ＣＴＬＡ−４抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、１４日目、３×／週 ＊＊＊グループ１および２は１日目に；グループ３、４、および５は１４日目に投与を開 始した。 【０５１９】 40 実施例９ 抗腫瘍効果を提供するための他の薬剤との抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせまたは免疫増強治療 −ＭＣ３８．Ｏｖａモデル ０日目に、１５０匹の動物に、１００マイクロリットルのＨＢＳＳ＋ｍａｔｒｉｇｅｌ 中の０．５百万個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を用いて皮下接種した。マウスで腫瘍を増殖さ せる。マウスを体重測定し、１１日目まで２×／週で測定した（腫瘍容積が１００∼２０ ０mm3である場合）。１１日目に、腫瘍測定に続き、マウスを以下の１２処置群の１つに 補充する。異なる腫瘍容積のために以下の処置群に補充されなかったマウスは、安楽死さ せる。ゲムシタビン（グループ４）処置は１２日目に開始され、残りの抗体群のための処 置は１４日目に開始される。全容積は不活性賦形剤中で１００μLであり、追加の詳細が 50 (123) JP 2012-511329 A 2012.5.24 以下に報告される： 【０５２０】 グループ１：抗ｇｐ１２０抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、３×／週×５、ｎ＝１０ グループ２：抗ＰＤ−Ｌ１抗体、１０mg/kg ＩＰ、１００μL、３×／週×５、ｎ＝１０ グループ３：抗ＶＥＧＦ抗体、５mg/kg ＩＰ、１００μL、２×／週×５、ｎ＝１０ グループ４：ゲムシタビン、４０mg/kg ＩＰ、１００μL、１２、１６、２０日目、ｎ＝ １０ グループ５：抗ＰＤ−Ｌ１抗体 ＋ 抗ｇｐ１２０抗体、ｎ＝１０ グループ６：抗ＰＤ−Ｌ１抗体 ＋ 抗ＶＥＧＦ抗体、ｎ＝１０ グループ７：抗ＰＤ−Ｌ１抗体 ＋ ゲムシタビン、ｎ＝１０ 10 グループ８：抗ｇｐ１２０抗体 ＋ ゲムシタビン、ｎ＝１０ グループ９：抗ｇｐ１２０抗体 ＋ 抗ＶＥＧＦ、ｎ＝１０ 【０５２１】 １２日目：グループ１からのマウスを、ＣＢＣ分析のために、麻酔下で眼窩後から出血 させた（１００マイクロリットル）。 １４日目および２２日目：グループ４からのマウスを、ＣＢＣ分析のために、麻酔下で 眼窩後から出血させた（１００マイクロリットル）。 １９日目：全てのマウス（グループ４を除く）を、ＣＢＣ分析のために、麻酔下で眼窩 後から出血させた（１００マイクロリットル）。 ２６日目：全てのマウス（グループ４を除く）を、ＰＫ分析のために、麻酔下で眼窩後 20 から出血させた（１００マイクロリットル）。 【０５２２】 腫瘍を測定し、マウスを２×／週で体重測定した。体重減少（＞１５%）を示す動物で は、毎日体重測定し、それらが＞２０%の体重を失った場合に安楽死させる。マウスを、 腫瘍容積が３，０００mm3を超えた場合、または、腫瘍が形成しない場合には３ヶ月後に 安楽死させる。この試験は（図１０）、ＰＤ−Ｌ１遮断が、α−ＶＥＧＦおよびゲムシタ ビン単独の誘導計画よりも効果的であったことを示す。 【０５２３】 実施例１０ 哺乳動物細胞における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の発現 30 この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、潜在的なグリコシル化形態の 抗ＰＤ−Ｌ１抗体の調製を例示する。 【０５２４】 ベクターｐＲＫ５（ＥＰ ３０７，２４７を参照のこと。１９８９年３月１５日公開） を発現ベクターとして用いる。場合により、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする ＤＮＡを、選択された制限酵素を用いてｐＲＫ５中に連結し、連結方法（例えばSambrook et al., supraに記載される通りに）を使用して、そのようなＤＮＡの挿入を可能にする 。 【０５２５】 一実施態様において、選択された宿主細胞は２９３細胞でありうる。ヒト２９３細胞（ 40 ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）を、組織培養プレートにおいて、培地（ウシ胎児血清およ び場合により栄養成分および／または抗生物質を添加したＤＭＥＭなど）中でコンフルエ ンスまで増殖する。ｐＲＫ５抗体をコードする約１０μgのＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝 子［Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)］をコードする約１μgのＤＮＡと混合 し、５００μLの１mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１mM ＥＤＴＡ、０．２２７M ＣａＣｌ ２中に溶解する。この混合物に、５００μLの５０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２ ８０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＮａＰＯ４の液滴を加え、沈殿を１０分間にわたり２５℃ で形成させる。沈殿を懸濁させ、２９３細胞に加え、約４時間にわたり３７℃で沈ませる 。培養液を吸引除去し、ＰＢＳ中の２mlの２０%グリセロールを３０秒にわたり加える。 ２９３細胞を次に無血清培地を用いて洗浄し、新鮮培地を加え、細胞を約５日間にわたり 50 (124) JP 2012-511329 A 2012.5.24 インキュベートする。 【０５２６】 トランスフェクションから約２４時間後、培養液を除去し、培養液（単独）または２０ ０μCi/mlの３５Ｓシステインおよび２００μCi/ml ３５Ｓメチオニンを含む培養液を用 いて交換する。１２時間のインキュベーション後、条件培地を回収し、スピンフィルター で濃縮し、１５%ＳＤＳゲル上に添加する。処理されたゲルを乾燥させ、選択された期間 にわたりフィルムに暴露させ、抗体の存在を明らかにしてもよい。トランスフェクション された細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーションを受け（無血清培地中）、培地 を選択されたバイオアッセイにおいてテストする。 10 【０５２７】 代替技術において、抗体を、Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981)に記載される硫酸デキストラン方法を使用して一過性に２９３細胞に導入してもよ い。２９３細胞を最高密度までスピナーフラスコ中で増殖させ、ｐＲＫ５抗体をコードす る７００μgのＤＮＡを加える。細胞を最初にスピナーフラスコから遠心により濃縮し、 ＰＢＳを用いて洗浄する。ＤＮＡデキストラン沈殿物を細胞ペレットで４時間にわたりイ ンキュベートする。細胞を、２０%グリセロールを用いて９０秒間にわたり処理し、組織 培養培地を用いて洗浄し、スピナーフラスコ（組織培養培地、５μg/mlウシ血清、および ０．１μg/mlウシトランスフェリンを含む）中に再導入する。約４日後、条件培地を遠心 し、ろ過して細胞および細片を除去する。発現された抗体を含むサンプルを、次に、任意 の選択された方法（例えば透析および／またはカラムクロマトグラフィーなど）により濃 20 縮し、精製することができる。 【０５２８】 別の実施態様において、抗体をＣＨＯ細胞中で発現させることができる。ｐＲＫ５中に 連結された抗体をコードするＤＮＡを、公知の試薬（例えばＣａＰＯ４またはＤＥＡＥデ キストランなど）を使用してＣＨＯ細胞中にトランスフェクションすることができる。上 に記載する通り、細胞培養物をインキュベートすることができ、培地を培養液（単独）ま たは放射標識（例えば３５Ｓメチオニンなど）を含む培地を用いて交換することができる 。抗体の存在を決定後、培養液を、無血清培地を用いて交換してもよい。好ましくは、培 養物を約６時間にわたりインキュベートし、次に条件培地を収集する。発現された抗体を 30 含む培地を次に濃縮し、任意の選択された方法により精製する。 【０５２９】 抗体のエピトープタグ付きバリアントは、また、宿主ＣＨＯ細胞において発現させても よい。ｐＲＫ５中に連結された抗体をコードするＤＮＡは、ｐＲＫ５ベクターからサブク ローン化してもよい。サブクローンインサートはＰＣＲを受け、インフレームで選択され たエピトープタグ（例えばポリｈｉｓタグなど）と共にバキュロウイルス発現ベクター中 に融合させることができる。抗体インサートをコードするポリｈｉｓタグ付きＤＮＡを、 次に、安定クローンの選択のための選択マーカー（例えばＤＨＦＲなど）を含むＳＶ４０ 駆動ベクター中にサブクローン化することができる。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆 動ベクターを用いて（上に記載する通り）トランスフェクションすることができる。標識 を上に記載する通りに実施し、発現を検証してもよい。ポリＨｉｓタグ付き抗体を含む培 40 ２＋ 養液を、次に、濃縮し、任意の選択された方法（例えば Ｎｉ キレート親和性クロマ トグラフィーなど）により精製することができる。 【０５３０】 抗体を、また、ＣＨＯおよび／またはＣＯＳ細胞において一過性発現手順により、ある いはＣＨＯ細胞において別の安定的な発現手順により発現させてもよい。 【０５３１】 ＣＨＯ細胞における安定発現を、以下の手順を使用して実施する。タンパク質をＩｇＧ 構築物（イムノアドヘシン）として発現させ、それにおいてそれぞれのタンパク質の可溶 性形態（例、細胞外ドメイン）のためのコード配列をＩｇＧ１定常領域配列（ヒンジ、Ｃ Ｈ２、およびＣＨ２ドメインを含む）に融合させる、および／または、ポリＨｉｓタグ付 50 (125) JP 2012-511329 A 2012.5.24 き形態である。 【０５３２】 ＰＣＲ増幅に続き、それぞれのＤＮＡを、標準技術を使用し、Ausubel et al., Curren t Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons(1997)に記載され る通りにＣＨＯ発現ベクター中にサブクローン化する。ＣＨＯ発現ベクターを、目的のＤ ＮＡの適合する制限部位５’および３’を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトリングを可能に するように構築する。ＣＨＯ細胞におけるベクターを使用した発現が、Lucas et al., Nu cl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996)において記載されており、ＳＶ４０初期プロモ ーター／エンハンサーを使用し、目的のｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ ）の発現を駆動する。ＤＨＦＲ発現によって、トランスフェクションに続くプラスミドの 10 安定的な維持のための選択が許される。 【０５３３】 １２マイクログラムの所望のプラスミドＤＮＡを、約１０００万個のＣＨＯ細胞中に、 商業的に利用可能なトランスフェクション試薬SUPERFECT（登録商標）（Quiagen）、DOSP ER（登録商標）またはFUGENE（登録商標）（Boehringer Mannheim）を使用して導入する 。細胞を、Lucas et al., supraに記載される通りに増殖する。約３×１０−７個の細胞 を、以下に記載する通りに、さらなる増殖および生産のためにアンプル中に凍結させる。 【０５３４】 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水槽中に置くことにより解凍し、ボルテックスに より混合する。内容物を遠心チューブ（１０mLの培地を含む）中にピペットで加え、１０ 20 ００rpmで５分間にわたり遠心する。上清を吸引し、細胞を１０mLの選択培地（５% ０． ２μm Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ処理済みウシ胎児血清を伴う０．２μmろ過済みＰＳ２０）中 に再懸濁する。細胞を、次に、１００mLスピナー（９０mLの選択培地を含む）中に分注す る。１∼２日後、細胞を２５０mLスピナー（１５０mLの選択増殖培地で満たされている） 中に移し、３７℃でインキュベートする。別の２∼３日後、２５０mL、５００mL、および ２０００mLスピナーに３×１０５個細胞／mLを播種する。細胞培地を、遠心および産生培 地中での再懸濁により新鮮培地と交換する。任意の適したＣＨＯ培地を用いてもよいが、 米国特許第５，１２２，４６９号（１９９２年６月１６日公開）に記載される産生培地を 実際に使用してもよい。３Ｌ産生スピナーに１．２×１０６個細胞/mLで播種する。０日 目に、細胞数およびｐＨを決定する。１日目に、スピナーをサンプリングし、ろ過空気を 30 用いた散布を始める。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃にシフトさせ 、３０mLの５００g/Lグルコースおよび０．６mLの１０%消泡剤（例、３５%ポリジメチル シロキサンエマルジョン、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）を採取する。産生 を通じて、ｐＨを必要に応じて調整し、約７．２に保つ。１０日後、または生存が７０% 未満に下落するまで、細胞培養物を遠心および０．２２μmフィルターを通じたろ過によ り収集する。ろ液を４℃で保存するか、または、直ぐに精製用のカラムに添加する。 【０５３５】 ポリＨｉｓタグ付き構築物のために、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を使 用して精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に濃度５mMで加える。条件培地を、 ４℃で２０mM Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液（０．３M ＮａＣｌおよび５mMイミダゾ 40 ールを含む）中で平衡化された６mlのＮｉ−ＮＴＡカラム上に流速４∼５ml/分でポンプ 注入する。添加後、カラムを追加の平衡緩衝液を用いて洗浄し、タンパク質を、平衡緩衝 液（０．２５Mイミダゾールを含む）を用いて溶出する。高度に精製されたタンパク質を 、続いて、保存緩衝液（１０mM Ｈｅｐｅｓ、０．１４M ＮａＣｌ、および４%マンニト ール、ｐＨ６．８を含む）中で、２５ml G25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱 塩し、−８０℃で保存する。 【０５３６】 イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）構築物を、以下の通りに、条件培地から精製する。条件 培地を、２０mM Ｎａリン酸緩衝液、ｐＨ６．８中で平衡化された５ml Protein Aカラ ム（Pharmacia）上にポンプ注入する。添加後、カラムを、１００mMクエン酸、ｐＨ３． 50 (126) JP 2012-511329 A 2012.5.24 ５を用いた溶出前に、平衡緩衝液を用いて十分に洗浄する。溶出されたタンパク質を、１ ml分画をチューブ（２７５μLの１M Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含む）中に回収すること により直ぐに中和する。高度に精製されたタンパク質を、続いて、ポリＨｉｓタグ付きタ ンパク質について上に記載する通りに保存緩衝液中で脱塩する。均一性を、ＳＤＳポリア クリルアミドゲルによりおよびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定により評価す る。 【０５３７】 実施例１１ Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体の発現 この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え発現による非グリコシル化形態の抗ＰＤ− 10 Ｌ１抗体の調製を例示する。 【０５３８】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択されたＰＣＲプライマーを 使用して増幅される。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応す る制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターを用いてもよい。適したベクター の例はｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉに由来する；Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)を 参照のこと）であり、それはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を 含む。ベクターを、制限酵素を用いて消化し、脱リン酸化する。ＰＣＲ増幅された配列を 、次に、ベクター中に連結する。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐ プロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、お 20 よびエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＮＰＯＲコード領域、ラムダ転写ターミネータ ー、およびａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。 【０５３９】 ライゲーション混合物を次に使用し、選択されたＥ．ｃｏｌｉ株をSambrook et al., s upraに記載される方法を使用して形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖す るためのその能力により同定し、抗生物質耐性コロニーを次に選択する。プラスミドＤＮ Ａを単離し、制限分析およびＤＮＡ配列決定により確認することができる。 【０５４０】 選択されたクローンを液体培養培地（例えば抗生物質を添加したＬＢブロスなど）中で 一晩増殖させることができる。一晩培養物を続いて使用し、大規模培養物に接種してもよ 30 い。細胞を次に所望の光学密度まで増殖させ、その間に発現プロモーターがオンになる。 【０５４１】 数時間にわたる細胞培養後、細胞を遠心により収集することができる。遠心により得ら れた細胞ペレットを、当技術分野において公知の種々の薬剤を使用して可溶化することが でき、可溶化された抗体を次に、抗体の強固な結合を可能にする条件下で金属キレートカ ラムを使用して精製することができる。 【０５４２】 抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、また、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ポリＨｉｓタグ付き形態で、以下 の手順を使用して発現させてもよい。抗体をコードするＤＮＡを、最初に、選択されたＰ ＣＲプライマーを使用して増幅させる。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限 40 酵素部位に対応する制限酵素部位、ならびに効率的で信頼できる翻訳開始、金属キレート カラムでの迅速な精製、およびエンテロキナーゼを用いたタンパク質分解除去を提供する 他の有用な配列を含む。ＰＣＲ増幅されたポリＨｉｓタグ付き配列を、次に、発現ベクタ ー中に連結し、それを使用して５２株（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clp P(lacIq)）に基づくＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換する。形質転換体を、最初に、ＬＢ（５ ０mg/mlカルベニシリンを含む）中で、３０℃で撹拌しながらＯ．Ｄ．６００が３∼５に 達するまで増殖させる。培養物を、次に、ＣＲＡＰ培地（３．５７gの（ＮＨ４）２ＳＯ ４、０．７１gクエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６gのＤｉｆｃ ｏ酵母抽出物、５．３６gのSheffield hycase SF（５００mLの水中）、ならびに１１０mM ＭＰＯＳ， ｐＨ７．３、０．５５%（ｗ／ｖ）グルコース、および７mM ＭｇＳＯ４ 50 (127) JP 2012-511329 A 2012.5.24 を混合することにより調製する）中で５０∼１００倍希釈し、約２０∼３０時間にわたり ３０℃で撹拌しながら増殖する。サンプルを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を 検証し、バルク培養物を遠心し、細胞をペレットにする。細胞ペレットを、精製および再 折り畳みまで凍結する。 【０５４３】 ０．５∼１L発酵物（６∼１０gペレット）からのＥ．ｃｏｌｉペーストを１０容積（ｗ ／ｖ）の７Mグアニジン、２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中に再懸濁する。固形の亜硫 酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加え、それぞれ最終濃度０．１Mおよび ０．０２Mにし、溶液を一晩４℃で撹拌する。この工程は、全てのシステイン残基がスル フィトライゼーション（sulfitolization）によりブロックされた変性タンパク質をもた 10 らす。溶液を４０，０００rpmで、Beckman Ultracentifugeにおいて３０分間にわたり遠 心する。上清を３∼５容積の金属キレートカラム緩衝液（６Mグアニジン、２０mMトリス 、ｐＨ７．４）を用いて希釈し、０．２２ミクロンフィルターに通してろ過し、浄化する 。条件に依存し、浄化された抽出物を、金属キレートカラム緩衝液中で平衡化された、５ mlのQiagen Ni NTA金属キレートカラムに添加する。カラムを、５０mMイミダゾールを含 む追加の緩衝液（Calbiochem, Utrol grade）ｐＨ７．４を用いて洗浄する。タンパク質 を、２５０mMのイミダゾールを含む緩衝液を用いて溶出する。所望のタンパク質を含む画 分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて算出さ れた吸光係数を使用して、２８０nmでのその吸光度により推定する。 【０５４４】 20 タンパク質を、以下からなる新たに調製された再折り畳み緩衝液に緩徐にサンプルを希 釈することにより再折り畳みさせる：２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３M ＮａＣ ｌ、２．５M尿素、５mMシステイン、２０mMグリシン、および１mM ＥＤＴＡ。再折り畳 み容積は、最終的なタンパク質濃度が５０∼１００マイクログラム/mlとなるように選ぶ 。再折り畳み溶液を、４℃で１２∼３６時間にわたり穏やかに撹拌する。再折り畳み反応 は、ＴＦＡを最終濃度０．４%（ｐＨが約３）まで加えることにより停止させた。タンパ ク質のさらなる精製前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターに通してろ過し、アセトニ トリルを２∼１０%の最終濃度まで加える。再折り畳みタンパク質を、Poros R1/H逆相カ ラムで、０．１%ＴＦＡの移動緩衝液を使用し、１０∼８０%のアセトニトリル勾配を用い た溶出を伴い、クロマトグラフィーにかけた。Ａ２８０吸光度を伴う画分の一定分量をＳ 30 ＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、均一な再折り畳みタンパク質を含む画分をプール する。一般的に、大半のタンパク質の適切に再折り畳みされた種が、最も低いアセトニト リル濃度で溶出される。なぜなら、それらの種は最もコンパクトであり、その疎水性内部 が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているからである。凝集した種は、通常、より高い アセトニトリル濃度で溶出される。所望の形態からの誤って折り畳まれた形態のタンパク 質の分離に加えて、逆相工程はサンプルからエンドトキシンも除去する。 【０５４５】 所望の折り畳まれた抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む画分をプールし、アセトニトリルを、溶液 に向けられた穏やかな窒素気流を使用して除去する。タンパク質を、２０mM Ｈｅｐｅｓ 、ｐＨ６．８（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、および４%マンニトールを伴う）中に、透析 によりまたは調整緩衝液で平衡化されたG25 Superfine（Pharmacia）樹脂を使用したゲル ろ過により製剤化し、ろ過滅菌する。 40 (128) 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (129) 【図５】 【図６】 【図７】 【図８】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (130) 【図９】 【図１０】 【図１１Ａ】 【図１１Ｂ】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (131) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【配列表】 2012511329000001.app 【手続補正書】 【提出日】平成23年6月10日(2011.6.10) 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】００３９ 【補正方法】変更 【補正の内容】 【００３９】 【図１】図１は、細胞表面分子のＢ７ファミリーによるＴ細胞の同時刺激を描く図示的な 例示である。 【図２】図２は、ＰＭＥＬ／Ｂ１６ Ｔ細胞刺激アッセイの実験デザインを示す概略図で ある。 【図３】図３は、メラニン細胞ペプチドｇｐ１００に応答したＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞 における増強したＩＦＮ−γ産生を通じた抗原特異的Ｔ細胞機能に対する抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの効果を示す棒グラフである。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージおよ びＩＦＮ−γ産生のそれらのレベルの両方が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在における刺激の間 に増加された。 【図４】図４は、ＯｖａパルスＡ２０ Ｂ細胞／ｍＰＤ−Ｌ１ ＡＰＣを用いた二次刺激 における抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ ＹＷ２４３．５５．Ｓ１によるＯｖａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細 胞の増殖における増強を通じた抗原特異的Ｔ細胞機能に対する抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂの効果 を示す棒グラフである。 【図５】図５は、混合リンパ球反応における抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ１によ るヒトＣＤ８Ｔ細胞の増殖における増強を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ＣＦＳＥ の強度において希釈により測定された増殖性細胞のパーセントも報告されている。 【図６】図６は、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ ＹＷ２４３．５５Ｓ７０のキメラ形態を用いた慢 性ＬＣＭＶの処置の実験デザインの概略図である。矢印は、２×１０６pfuクローン１３ ＬＣＭＶを用いた感染後１４日目に開始された６用量の抗ＰＤ−Ｌ１のタイミングを示す 。 【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０による 慢性ＬＣＭＶ感染のｉｎ ｖｉｖｏでの処置に続くｅｘ ｖｉｖｏでの細胞における増強 されたＣＤ８エフェクター機能を示すグラフである。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０によるＰ Ｄ−Ｌ１の遮断が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱果粒を増加させ（表面ＣＤ１０７Ａの増加により 測定される）（図７Ａ）、ＬＣＭＶペプチドｇｐ３３に応答して%ＩＦＮ−ガンマ産生細 胞を増加させた（図７Ｂ）。ｇｐ３３特異的細胞の頻度を、Ｈ２−Ｄｂ ｇｐ３３ペンタ マーを用いた染色により明らかにした。 【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０による 慢性ＬＣＭＶ感染のｉｎ ｖｉｖｏでの処置に続くｅｘ ｖｉｖｏでの細胞における増強 されたＣＤ８エフェクター機能を示すグラフである。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０によるＰ Ｄ−Ｌ１の遮断が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱果粒を増加させ（表面ＣＤ１０７Ａの増加により 測定される）（図７Ａ）、ＬＣＭＶペプチドｇｐ３３に応答して%ＩＦＮ−ガンマ産生細 胞を増加させた（図７Ｂ）。ｇｐ３３特異的細胞の頻度を、Ｈ２−Ｄｂ ｇｐ３３ペンタ マーを用いた染色により明らかにした。 【図８】図８Ａおよび８Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの処置に続く 慢性ＬＣＭＶ感染における血液および組織ＬＣＭＶ力価における低下を示す。図８Ａにお いて、種々の示された組織からのウイルス力価を、それぞれＡｂ処置後の２１日目および ２８日目、１週間目および２週間目に分析した。図８Ｂにおいて、血清ウイルス力価を０ 、７、１４、２１、および２８日目に分析し、ＬＣＭＶ接種が０日目に生じて、処置が１ ４日目に始まる。 (132) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【図９Ａ】図９Ａは、樹立された腫瘍の治療的処置（腫瘍が２５０mm３である１４日目に 開始された処置）に続く抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適用の結果として、ＭＣ３８．Ｏｖａ結腸癌 腫瘍増殖における有意な低下を示す。図９Ｂは、フローサイトメトリーにより測定された 組織培養におけるＭＣ３８．Ｏｖａ細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現の表面レベルを示すヒス トグラムである。ＰＤ−Ｌ２は、ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞により発現されない。 【図９Ｂ】図９Ａは、樹立された腫瘍の治療的処置（腫瘍が２５０mm３である１４日目に 開始された処置）に続く抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適用の結果として、ＭＣ３８．Ｏｖａ結腸癌 腫瘍増殖における有意な低下を示す。図９Ｂは、フローサイトメトリーにより測定された 組織培養におけるＭＣ３８．Ｏｖａ細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現の表面レベルを示すヒス トグラムである。ＰＤ−Ｌ２は、ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞により発現されない。 【図１０】図１０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍の増殖に対す るＰＤ−Ｌ１遮断処置単独および抗ＶＥＧＦまたはゲムシタビンとの組み合わせの効果を 示すグラフである。 【図１１Ａ】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ−Ｌ １抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を伴う ＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ａ−１】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ａ−２】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ａ−３】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ａ−４】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ｂ】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ−Ｌ １抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を伴う ＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ｂ−１】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ｂ−２】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【図１１Ｂ−３】図１１Ａ−Ｂは、ファージディスプレイにより同定された１１の抗ＰＤ −Ｌ１抗体のそれぞれ重鎖および軽鎖可変領域配列である。陰付きバーは、種々の定義を 伴うＣＤＲを示し、囲みエリアは、ＨＶＲの範囲を示す。 【手続補正２】 【補正対象書類名】図面 【補正対象項目名】全図 【補正方法】変更 【補正の内容】 (133) 【図１】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (134) 【図２】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (135) 【図３】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (136) 【図４】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (137) 【図５】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (138) 【図６】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (139) 【図７Ａ】 【図７Ｂ】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (140) 【図８】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (141) 【図９Ａ】 【図９Ｂ】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (142) 【図１０】 【図１１Ａ】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (143) 【図１１Ａ−１】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (144) 【図１１Ａ−２】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (145) 【図１１Ａ−３】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (146) 【図１１Ａ−４】 【図１１Ｂ】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (147) 【図１１Ｂ−１】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (148) 【図１１Ｂ−２】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (149) 【図１１Ｂ−３】 JP 2012-511329 A 2012.5.24 (150) JP 2012-511329 A 2012.5.24 【国際調査報告】 10 20 30 40 (151) JP 2012-511329 A 2012.5.24 10 20 30 40 (152) JP 2012-511329 A 2012.5.24 10 20 30 40 (153) JP 2012-511329 A 2012.5.24 10 20 30 40 (154) JP 2012-511329 A 2012.5.24 10 20 30 40 (155) JP 2012-511329 A 2012.5.24 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ａ６１Ｋ 45/00 (2006.01) Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｋ 31/7068 (2006.01) Ａ６１Ｋ 31/7068 Ａ６１Ｋ 39/00 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/00 Ｚ Ａ６１Ｐ 31/12 (2006.01) Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/04 (2006.01) Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/10 (2006.01) Ａ６１Ｐ 31/10 Ａ６１Ｐ 33/02 (2006.01) Ａ６１Ｐ 33/02 Ａ６１Ｐ 35/00 (2006.01) Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 (2006.01) Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 10 (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,S K,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR, BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,I S,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE ,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW 20 （特許庁注：以下のものは登録商標） １．ＵＮＩＸ (72)発明者 チャン，ジャンヌ アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４１５８、サンフランシスコ、ベリー・ストリート ３００ 、ユニット ８０７ (72)発明者 チウ，ヘンリー アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４１１６、サンフランシスコ、２０ティーエイチ・アベニュ ー ２３３４ 30 (72)発明者 レハー，ソフィー・エム アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４０３７、モンタラ、アーヴィング・ストリート ９４５ (72)発明者 メッカー，ヘザー アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４３０３、パロ・アルト、シー・ロマ・ヴェルデ・アベニュ ー ７３３ (72)発明者 マリアタサン，サンジーヴ アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４０３０、ミルブレー、エンシーナ・ドライブ １２９１ (72)発明者 ウー，ヤン アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４４０４、フォスター・シティ、ブライス・ストリート １ 40 １６０ Ｆターム(参考) 4B024 AA01 BA61 CA01 CA09 CA11 CA20 DA03 DA06 EA04 GA11 HA01 HA11 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 4C084 AA19 MA02 NA05 ZB262 ZB322 ZB332 ZB352 ZB382 ZC202 ZC751 4C085 AA03 AA13 CC08 CC22 4C086 AA01 EA17 MA02 MA04 NA05 ZB26 ZB32 ZB33 ZB35 ZB38 ZC20 ZC75 4H045 AA11 BA10 CA40 DA75 EA20 FA74