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(57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 少なくとも 1.5 mg／gの乾燥量基準
JP 3609273 B2 2005.1.12 (57) 【 特 許 請 求 の 範 囲 】 【請求項１】 少 な く と も 1. ５ mg／ ｇ の 乾 燥 量 基 準 ゲ ニ ス テ イ ン 含 量 を 有 す る タ ン パ ク 質 単 離 物 を 含 む 大 豆タンパク質単離物。 【請求項２】 前 記 タ ン パ ク 質 単 離 物 が 、 約 1.５ ∼ 約 3. ５ mg／ ｇ の 乾 燥 量 基 準 ゲ ニ ス テ イ ン 含 量 を 有 す る 請求項１に記載の大豆タンパク質単離物。 【請求項３】 前 記 タ ン パ ク 質 単 離 物 が 、 少 な く と も 1. ０ mg／ ｇ の 乾 燥 量 基 準 ダ イ ゼ イ ン 含 量 を 有 す る 請 求項１に記載の大豆タンパク質単離物。 10 【請求項４】 少 な く と も 約 1. ０ mg／ ｇ の 乾 燥 量 基 準 ダ イ ゼ イ ン 含 量 を 有 す る タ ン パ ク 質 単 離 物 を 含 む 植 物タンパク質単離物。 【請求項５】 前 記 タ ン パ ク 質 単 離 物 が 、 約 1.０ ∼ 約 3. ０ mg／ ｇ の 乾 燥 量 基 準 ダ イ ゼ イ ン 含 量 を 有 す る 請 求項４に記載の植物タンパク質単離物。 【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】 本発明は、溶解性材料を植物タンパク質材料から抽出すること、及び大部分のグルコン（ 20 (2) JP 3609273 B2 2005.1.12 ｇｌｕｃｏｎｅ） イソフラボンが、タンパク質単離物中に保持されるアグルコンイソフ ラボンに転化されるような条件下で１種以上のβ−グルコシダーゼ酵素を用いて処理する ことによる、アグルコンイソフラボンが豊富な抽出物及び単離物の製造に関するものであ る。 【０００２】 【従来の技術】 イソフラボンは大豆などの植物タンパク質材料を含む種々のマメ科植物中に生じる。これ らの化合物には、ダイジン、６’’−ＯＡｃダイジン、６’’−ＯＭａｌダイジン、ダイ ゼイン、ゲニスチン、６’’−ＯＡｃゲニスチン、６’’−ＯＭａｌゲニスチン、ゲニス テイン、グリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）、６’’−ＯＭａｌグリシチン、グリシテイン 10 （ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ） 、ビオカニンＡ、ホルムオノネチン及びクメステロール（ｃｏ ｕｍｅｓｔｅｒｏｌ） が含まれる。典型的に、これらの化合物は、大豆の本来の苦いフ レーバーに関するものであり、また、単離物及び濃縮物などの商品の製造の際の焦点は、 これらの材料を除去しなければならないことである。例えば、大豆フレークを水性アルカ リ媒体で抽出する、従来の大豆タンパク質単離物製造方法では、多くのイソフラボンを、 抽出剤に可溶化し、通常は、タンパク質の酸性沈降物に続いて廃棄されるホエー中に可溶 化させたままで維持して、単離物を形成する。酸性沈降タンパク質単離物中の残存イソフ ラボンは、通常、該単離物を徹底的に洗浄することにより除去する。 【０００３】 最近では、大豆などの植物タンパク質中に含有されるイソフラボンが、以下の文献に記載 20 されたような、乳ガン細胞及び前立腺ガン細胞などのヒトガン細胞の増殖を抑制し得ると 認識されている：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ， Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ． １７９， Ｎｏ．１， 第６ ６１−６６７ 頁（１９９１年８月３０日）のＰｅｔｅｒｓｏｎとＢａｒｎｅｓによる“ Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕ ｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ， Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｆｒ ｏｍ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ ”；Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ， Ｖｏｌ．２２， 第３３５−３４５ 頁 （１９９３年） のＰｅｔｅｒｓｏｎ及びＢａｒｎｅｓによる “Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈａｎｉｎ Ａ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｇ 30 ｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙ ｒｏｓｉｎｅ Ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ”；及びＭｕｔａｇｅｎｓ ａ ｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｅｔ， 第２３９−２５３ 頁（１ ９９０年）のＢａｒｎｅｓらによる“Ｓｏｙｂｅａｎｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｍａｍｍａｒ ｙ Ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ”。 【０００４】 上記イソフラボンのうち、数種のものは、グルコース分子が結合したグルコシドとして又 はグルコン（ｇｌｕｃｏｎｅ） として存在する。６’’−ＯＡｃゲニスチンなどのグル コンの数種は、グルコース分子自体の６つの部分に結合したアセテート基を含む。グルコ シドを含む全てのイソフラボンは医学的評価の点で興味深いが、最も興味深い特定のイソ フラボンは、グルコース分子が結合していないアグルコンである。これらのイソフラボン は、グルコン又はイソフラボングルコシドほど水溶性が高くない。このカテゴリー内の特 定のイソフラボンは、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインである。これらのア グルコンは、以下の一般式を有する： 【０００５】 【化１】 40 (3) JP 3609273 B2 2005.1.12 【０００６】 式中、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 及びＲ４ は、Ｈ、ＯＨ及びＯＣＨ３ からなる群から選 10 択される。従って、それは、アグルコンであり、本発明が関連するこれらの材料が豊富な 植物タンパク質単離物である。 当該技術分野において、グルコンイソフラボンを、アグルコンイソフラボンに転化する方 法が知られている（例えば、オバタらの日本特許出願第２５８６６９号に記載されている ）。そのような方法では、中程度の転化のみが達成され、そのようなことは、特に大規模 な商業作業には望ましくない。また、例えば前記文献’６６９号に記載された公知の方法 では、タンパク質材料からイソフラボンを除去することが教示されており、いかにしてア グルコンイソフラボンが豊富なタンパク質抽出物又は単離物を製造するかについて記載す るところがない。従って、少なくとも大部分の及び好ましくは実質的に全てのグルコンイ ソフラボンをアグルコンイソフラボンに転化する方法、及びアグルコンイソフラボンが豊 20 富なタンパク質抽出物及び単離物を製造する方法が要求される。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】 従って、本発明の目的は、アグルコンイソフラボンが豊富な抽出物及びタンパク質単離物 を提供すること、及びそれらを製造する方法を提供することである。これらの及びその他 の目的は、以下に記載する本発明の詳細な説明に具体的に開示される。 【０００８】 【発明の概要】 本発明により、アグルコンイソフラボンが豊富な植物タンパク質抽出物及び単離物、及び それらを製造する方法が提供される。そのような抽出物を製造する方法には、グルコンイ 30 ソフラボンを含む植物タンパク質材料を、該植物タンパク質材料の等電点付近より高いｐ Ｈを有する水性抽出剤を用いて抽出すること、及びそのグルコンイソフラボンと十分な量 のβ−グルコシダーゼ酵素１種以上とを、該抽出物中の少なくとも大部分のグルコンイソ フラボンがアグルコンイソフラボンに転化されるのに十分な時間、温度及びｐＨで反応さ せ、それにより、アグルコンイソフラボンが豊富な抽出物を製造することが含まれる。ま た、本発明により、そのような抽出物の製造法が提供され、該抽出物に追加β−グルコシ ダーゼが添加されて、アグルコンイソフラボンが豊富な抽出物が製造される。更に、本発 明により、アグルコンが豊富なタンパク質単離物を得る方法が提供され、それは、前記抽 出物のｐＨを、タンパク質材料の等電点付近に調整して、タンパク質材料を沈降させ、ア グルコンイソフラボンが豊富なタンパク質単離物を製造することによる。得られたアグル 40 コンイソフラボンが豊富な単離物を、その後、分離し、脱水して、乾燥した、アグルコン が豊富な単離物を形成することができる。また、本発明により、比較的高い割合で、植物 タンパク質材料からイソフラボンを回収する方法が提供される。 【０００９】 【発明の実施の形態】 本発明を大豆製品に関連して記載するが、また、本発明の方法は、大豆材料からアグルコ ンイソフラボンが豊富な抽出物及び単離物を製造するのに特に適するものであるが、それ にもかかわらず、本発明の方法は、一般に、イソフラボンを含む種々の植物タンパク質源 からタンパク質抽出物及び単離物を製造するのに適するものである。そのような源の例は 、大豆又は大豆材料を含む植物タンパク質材料である。本件明細書において使用する用語 50 (4) JP 3609273 B2 2005.1.12 “大豆材料”とは、大豆又はいずれかの大豆誘導体を意味する。 【００１０】 好ましい実施態様での抽出物又は単離物についての出発材料は、オイルが溶剤抽出により 除去された大豆フレークである。そのフレークは、そのタンパク材料の等電点付近より高 いｐＨ、好ましくは約６．０∼約１０．０のｐＨ、及び最も好ましくは約６．７∼約９． ７のｐＨを有する水性抽出剤を用いて抽出する。水性抽出剤のｐＨを高くしたい場合には 、典型的なアルカリ試薬、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化カルシ ウム等を使用してもよい。望ましいイソフラボン化合物は、典型的には、水性抽出物中に 可溶化する。また、水性抽出物中のこれらの化合物の回収を最大にするために、大豆フレ ークの抽出物に対する重量比を、特定のレベルに調節して、タンパク質材料中の本来のイ 10 ソフラボンをできるだけ多く可溶化するのが望ましい。 タンパク質及びイソフラボンの抽出は、第１抽出物を使用してフレークを抽出し、タンパ ク質及びイソフラボンの水性抽出物を得る、水性抽出剤とフレークの重量比が約８：１∼ 約１６：１でのフレークの対向流抽出を含む種々の方法で行うことができる。あるいはま た、第１段階における抽出剤とフレークの重量比を約１０：１とし、その後の新鮮な抽出 剤を用いたフレークの第２抽出を約６：１又はそれ未満の抽出剤のフレークに対する重量 比で行う２段階抽出法（両段階における溶剤とフレークの重量比の合計が、約１６：１の 溶剤とフレークの合計重量比を越えないようにする）を使用してもよい。 【００１１】 不溶性材料を除去した後、得られた水性タンパク質抽出物（可溶化イソフラボンを含む） 20 を、その後、１種以上のβ−グルコシダーゼ酵素と反応させて、グルコース分子が結合し たグルコン形態のイソフラボンの大部分、及び好ましくは実質的に全てをアグルコンイソ フラボンに転化する。β−グルコシダーゼ酵素についての最適ｐＨ範囲は、使用する特定 のβ−グルコシダーゼ酵素により変動するであろうが、典型的には、約４∼約８の範囲で 変動するであろう。典型的には、抽出物のｐＨを調節して、特定の酵素が、それを用いる 反応前に最も活性化となるｐＨ範囲付近とする。典型的には、そのｐＨは、食用酸（ｅｄ ｉｂｌｅ ａｃｉｄ）（例えば酢酸、硫酸、リン酸、塩酸又は他の適切な任意の試薬など ）の添加により調節する。 β−グルコシダーゼ酵素は、大豆材料中に天然に存在し得、又は微生物の成長により得る ことができ（本件明細書においては“残存”酵素と称する）、又はタンパク質抽出物に添 30 加してもよい。添加した酵素は、本件明細書において、“追加酵素”と称する。一般に、 大豆材料又は抽出物中の残存酵素濃度が、グルコン形態のイソフラボンの大部分、及び好 ましくは実質的に全てをアグルコン形態に転化するのに不十分である場合には追加酵素を 添加すべきである。イソフラボンの転化に十分な酵素の量は、存在する酵素のタイプ、酵 素濃度の分布、システムのｐＨ及び存在する酵素の活性度を含む多数の因子により変動す る。一旦、十分な濃度の酵素を存在させて、残存酵素若しくは追加酵素のいずれかを介し て又はその両方を介して、タンパク質抽出物に含まれるグルコンイソフラボンの少なくと も大部分、及び好ましくは実質的に全てがアグルコン形態に転化されるのに十分な時間、 温度及びｐＨで、可溶化イソフラボンを有するタンパク質抽出物をβ−グルコシダーゼ酵 素と反応させる。 40 【００１２】 好ましい追加β−グルコシダーゼ酵素にはバイオペクチナーゼ（Ｂｉｏｐｅｃｔｉｎａｓ ｅ）１００Ｌ及び３００Ｌ、バイオペクチナーゼＯＫ７０Ｌ、ラクターゼＦ及びラクトザ イム（Ｌａｃｔｏｚｙｍｅ） が含まれる。ラクターゼＦはＡｍａｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ １０００， Ｔｒｏｙ， ＶＡ ２２９７４から入手可能であり、約４∼約６の最適ｐＨ範囲を有し 、また、ラクトザイムは、Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｉｖｉ ｓｉｏｎ， Ｎｏｖｏ Ａｌｌｅ， ＤＫ−２８８０ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍ ａｒｋ から入手可能であり、最適ｐＨが約７である。バイオペクチナーゼ１００Ｌ、バ イオペクチナーゼ３００Ｌ及びバイオペクチナーゼＯＫ７０ＬはＱｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒ 50 (5) JP 3609273 B2 2005.1.12 ｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓａｒａｓｏｔａ， Ｆｌｏｒｉｄａから入手可能である。追加酵 素は、大部分及び好ましくは実質的に全てのグルコンイソフラボンをアグルコンに転化す るのに十分な量で添加する。追加酵素を添加するのが必要である場合には、添加する酵素 量は、乾燥量基準でのタンパク質沈降物の約０．５∼約５重量％とする。 他のクラスの適切な酵素は、エステラーゼ酵素である。これらの酵素は、それらが、イソ フラボン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ） からアセテート及びマロネート基を除去するこ とによりアセテート及びマロネート複合体をグルコンイソフラボンに転化するので、本件 明細書に記載の好ましい実施態様の方法に十分適するものであると思われる。最も好まし い態様においては、両タイプの酵素、β−グルコシダーゼ及びエステラーゼ酵素を利用す る。 10 【００１３】 好ましい実施態様の方法は、好ましくは、１段階工程であり、非常に高い程度のイソフラ ボン転化（グルコン形態からアグルコン形態への転化）が、比較的短時間で、かつ比較的 容易に及び安価で達成される。本件明細書において使用する用語“１段階”反応工程は、 一般に、いくつかのプロセス・パラメータ値が反応工程中、維持される反応工程を意味す る。これらのプロセス・パラメータには、ｐＨ及び温度が含まれる。 非常に高い程度の転化は、大豆材料抽出物中に存在するグルコン形態のイソフラボンの大 部分、及び好ましくは実質的に全てがアグルコン形態に転化されるものである。用語“大 部分”とは、グルコンイソフラボンがアグルコンイソフラボンに転化される程度が少なく とも約５０％であることを意味する。用語“実質的に全て”とは、グルコンイソフラボン 20 がアグルコンイソフラボンに転化される程度が少なくとも約８０％、及び最も好ましくは 少なくとも約９０％であることを意味する。 【００１４】 いかなる特定の理論に限定されることを望む訳ではないが、本件明細書に記載の方法の驚 くべき、予期せぬ高い程度の転化は、１段階反応工程の間に利用するプロセス・パラメー タの組合せにより生じると考えられる。反応システムのｐＨは、第１段階反応工程の間、 約４∼約８の値又はその付近、及び最も好ましくはイソフラボン複合体の反応前に酵素が 最も活性化される値で維持するのがよい。反応システムの温度は、第１段階反応工程の間 、約４０∼約６０℃の温度又はその付近、及び最も好ましくは約６０℃の温度で維持する のがよい。一般に、本件明細書に記載の第１段階工程により、実質的に全てのグルコンイ 30 ソフラボンをアグルコンに転化するのに必要とされる時間は、約２∼約２４時間である。 １種以上でのβ−グルコシダーゼ酵素を用いた反応の後、ｐＨを、酸の添加により、大豆 タンパク質の等電点、一般には、約４．０∼約５．０、及び好ましくは約４．４∼約４． ６に調節する。ｐＨを等電点に調節することにより、低溶解性アグルコンが豊富である、 凝乳形態のタンパク質が沈降する。沈降後、凝乳即ち沈降タンパク質を遠心分離などによ りホエーから分離して、アグルコンイソフラボンが豊富なタンパク質単離物を形成する。 【００１５】 好ましい実施態様において、沈降タンパク質材料の洗浄は、完全に避けるか又は最小とし て、タンパク質沈降物からのアグルコンイソフラボンの除去を実質的に低減し、それによ り、たとえアグルコンイソフラボンの水中への溶解性が他のイソフラボンより低くても、 40 該アグルコンが豊富な単離物が得られる。従って、水での酸沈降タンパク質の洗浄は、完 全に避けるか、又は水と沈降タンパク質材料の重量比が約２：１∼約６：１で水を用いる 単一洗浄に制限してもよい。たとえ長く洗浄を行っても、より少ないイソフラボンが回収 されるが、酸沈降凝乳の洗浄を行わないことにより、望ましい濃度でイソフラボンを豊富 に含む単離物が得られる。中程度の洗浄により、乾燥量基準で約１．５∼約３．５ｍｇ／ ｇのゲニステイン含量、及び約１．０∼約３．０ｍｇ／ｇのダイゼイン含量を有するタン パク質単離物が得られる。 酸沈降タンパク質を、その後、従来の方法で、遠心分離又は濃縮の組合せにより脱水し、 乾燥する。好ましい実施態様は、特定の脱水手段に限定されないが、噴霧乾燥などの従来 の乾燥技術を用いて、乾燥単離物を形成するのが好ましい。本件明細書に記載の方法によ 50 (6) JP 3609273 B2 2005.1.12 り、増加量のアグルコンイソフラボンを有する単離物が得られる。 【００１６】 また、本発明により、イソフラボンを、非常に高い割合で、大豆材料などの植物タンパク 質材料から回収する方法が提供される。本件明細書に記載の方法により得られる回収レベ ルは、典型的には、出発植物タンパク質材料中の特定のイソフラボンの全ての形態の合計 をベースとして、少なくとも５０％、好ましくは、６５％、及び最も好ましくは８０％で ある。いかなる特定の理論に限定されることを望む訳ではないが、高い程度の回収は、本 件明細書に記載の転化反応と、本件明細書に記載の種々の処理作業との組合せにより得ら れると考えられる。比較的溶解性のグルコンイソフラボン複合体を、特定の処理段階で、 低溶解性アグルコン形態に転化することにより、得られる生成物において、供給材料から 10 のイソフラボンの高い割合での回収が可能となる。 以下の実施例は、具体的な記載であるが、本発明の実施態様を制限するものではない。 【００１７】 【実施例】 抽出した脱脂大豆フレーク（粉末）５ｇを水５ｇに添加し、ｐＨを７及び８に調節するこ とによりサンプルを製造した。ラクターゼＦ又はラクトザイム０．２５ｇを、酵素濃度が 各サンプル中の固形分の約５重量％であるように各懸濁液に添加した。サンプルを、４０ ℃で及び６０℃でインキュベートした。サンプルは、酵素を添加する前（ｔ＝０）、目標 温度で２４時間のインキュベート後に回収した。ラクターゼＦ又はラクトザイムについて ２４時間のインキュベート後の大豆フレーク（粉末）中のイソフラボンの変化及び割合分 布を表１に示す。サンプルは、追加酵素の添加前に殺菌せず、微生物及び汚染物の増殖は 阻害されなかった。 【００１８】 【表１】 20 (7) JP 3609273 B2 2005.1.12 10 20 【表２】 30 (8) JP 3609273 B2 2005.1.12 10 20 【表３】 30 (9) JP 3609273 B2 2005.1.12 10 20 30 【００１９】 これらのデータから、残存酵素及び追加酵素の組合せにより達成可能な転化の程度が示さ れる。残存酵素の源は、微生物増殖によるものであっても又は内在性大豆酵素であっても 40 よい。イソフラボン複合体のアグルコンへの有意な転化はｐＨ８、６０℃で２４時間イン キュベートした大豆フレーク（粉末）において起こった。本件明細書に記載したそれぞれ のタイプのイソフラボンの濃度は、全ての形態のイソフラボンタイプの合計をベースとす るものである。 他の一連のサンプルは、脱脂大豆フレークの１６％水性懸濁液を形成することにより製造 した。サンプルは、ｐＨ４．５及び７に調整し、４５℃で２４時間インキュベートした。 副サンプルを０及び２４時間で取り出した。全てのサンプルを、イソフラボン含量につい て分析した。表２は、２４時間、ｐＨ４．５及び７で４５℃でのインキュベート後の脱脂 フレークにおける、計算上のイソフラボンの割合分布の変化を示す。 【００２０】 50 (10) JP 3609273 B2 2005.1.12 【表４】 10 20 【表５】 30 【表６】 40 (11) JP 3609273 B2 2005.1.12 10 【００２１】 20 これらのデータは、タンパク質材料中の残存酵素により達成可能な転化の程度を示す。イ ソフラボン複合体のアグルコンへの有意な転化が、ｐＨ７で４５℃の温度で２４時間イン キュベートしたものに生じた。 他の一連の実験において、大豆から誘導されるタンパク質単離物中のゲニステイン及びダ イゼインの回収割合（ｐｅｒｃｅｎｔ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を調べた。回収割合は、単離 物中のゲニステイン（又はダイゼイン）の量で決定し、大豆出発材料中の全ての形態のゲ ニステイン（又はダイゼイン）の全量をベースとする割合としての量で示した。脱脂大豆 粉末１００ｇを、３２℃の温度で水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨ９．７に調 整した水１０００ｇを用いて抽出した。これにより、水と粉末の重量比が１０：１となっ た。粉末を、抽出により分離し、ｐＨ９．７で温度３２℃の水性抽出物６００ｇで再抽出 30 した。第２抽出段階で、水と粉末の重量比が６：１となった。粉末を、遠心分離により分 離し、第１及び第２抽出物を組合せ、ｐＨを４．５に調節して、酸沈降凝乳及び大豆ホエ ーのスラリーを形成した。そのスラリーを５０℃に加熱し、酵素ラクターゼＦの凝乳２乾 燥重量％を添加した。スラリーを１６時間５０℃で反応させて、グルコンイソフラボンの アグルコン形態への転化を完全なものとした。酸沈降凝乳を遠心分離によりホエーから分 離して、アグルコンが豊富な単離物を形成した。水を用いた、沈降凝乳の更なる洗浄は避 けた。単離物において回収されたゲニステイン量は、出発大豆材料（脱脂大豆粉末）中の 全ての形態のゲニスチン及びゲニステインの全量の８６％であった。同様に、単離物にお いて回収されたダイゼインの量は、７５％であった。 【００２２】 40 大豆製品中のイソフラボンの定量化方法を以下に記載する。イソフラボンを、サンプル（ 噴霧乾燥又は微細パウダー）０．７５ｇと８０／２０のメタノール／水溶剤とを混合する ことにより大豆製品から抽出した。その混合物を、２時間、室温で、オービタルシェーカ ーを用いて震盪した。２時間後、残存している未溶解材料を、ワットマンＮｏ．４２ろ紙 でのろ過により除去した。ろ液５ｍｌを、水４ｍｌ及びメタノール１ｍｌで希釈した。 抽出したイソフラボンを、ベックマンＣ１８逆相カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロ マトグラフィー）により分離した。イソフラボンをカラムに入れ、開始時はメタノール８ ８％、水１０％及び氷酢酸２％で、終了時はメタノール９８％及び氷酢酸２％の溶媒勾配 で溶出した。０．４ｍｌ／分の流量で、イソフラボン−ゲニスチン、６’’−Ｏ−アセチ ルゲニスチン、６’’−Ｏ−マロニルゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン、６’’−Ｏ 50 (12) JP 3609273 B2 2005.1.12 −アセチルダイジン、６’’−Ｏ−マロニルダイジン、ダイジン、グリシチン及びその誘 導体及びグリシテインの全てが明らかに分離した。ピーク検出は、２６２ｍｍのＵＶ吸光 度によるものである。ピークの確認は、質量分析計により行った。 【００２３】 定量化は、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｏｍｍｅｒｖｉ ｌｌｅ， ＮＪ． から購入した純粋な標準物質（ゲニスチン、ゲニステイン、ダイジン 及びダイゼイン）を用いることにより達成される。応答因子（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃ ｔｏｒ：統合領域（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｒｅａ）／濃度） を、上記化合物のそれ ぞれについて計算し、使用して、未知のサンプルの定量化を行った。純粋な標準物質が入 手不可能である複合形態については、応答因子は、親分子（ｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕ 10 ｌｅ） のものであると仮定したが、分子量の相違については修正を行った。グリシチン の応答因子は、分子量の相違について修正をしたゲニスチンについてのものと仮定した。 この方法により、それぞれ別個のイソフラボンの定量化がなされる。便宜上、全ての複合 形態がそれらの各々の非複合形態に転化されるのなら、全ゲニステイン、全ダイゼイン及 び全グリシテインを計算することができ、これらの化合物の総重量が示される。また、こ れらの合計は、酸分解を用いて複合形態を転化する方法により直接測定することができる 。 当然、前述では、本発明の好ましい実施態様を記載しただけであり、請求の範囲に記載し たような精神及び広い態様から逸脱することなく種々の変更及びが可能であると理解され 、それは、均等論を含む特許法の原理に従って解釈されるべきである。 20 (13) JP 3609273 B2 2005.1.12 フロントページの続き (74)代理人 100096194 弁理士 竹内 英人 (74)代理人 100074228 弁理士 今城 俊夫 (74)代理人 100084009 弁理士 小川 信夫 (74)代理人 100082821 弁理士 村社 厚夫 (72)発明者 ジェローム エル シェン アメリカ合衆国 ミズーリー州 ６３１０９ セント ルイス キース プレイス ５９３７ (72)発明者 バーバラ エイ ブライアン アメリカ合衆国 ミズーリー州 ６３１３０ ユニヴァーシティー シティー パーシング アベ ニュー ７０３９ 審査官 鈴木 恵理子 (56)参考文献 特開平０９−０２３８２２（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９７／０３７５４７（ＷＯ，Ａ１） 特開平０１−２５８６６９（ＪＰ，Ａ） 7 (58)調査した分野(Int.Cl. ，ＤＢ名) C07K 14/415 A23J 3/16 A23J 3/34 A23L 1/30∼305 A23L 1/20