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公開特許公報 特開2015
〔実 53 頁〕 公開特許公報（Ａ） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許出願公開番号 特開2015-186480 （Ｐ２０１５−１８６４８０Ａ） (43)公開日 平成27年10月29日(2015.10.29) (51)Int.Cl. Ａ２３Ｌ ＦＩ 1/30 テーマコード(参考) (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/30 Ｚ Ａ６１Ｋ 31/047 (2006.01) Ａ６１Ｋ 31/047 Ａ６１Ｐ 43/00 (2006.01) Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 39/00 (2006.01) Ａ６１Ｐ 39/00 Ａ２３Ｌ (2006.01) 1/305 Ａ２３Ｌ 審査請求 1/305 有 請求項の数2 ＯＬ 外国語出願 （全72頁） 最終頁に続く (21)出願番号 特願2015-105690(P2015-105690) (22)出願日 平成27年5月25日(2015.5.25) ユニバーシティー (62)分割の表示 特願2011-506488(P2011-506488) フォルニア，ユーエスシー の分割 ズ 平成21年4月24日(2009.4.24) ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ (31)優先権主張番号 61/047,680 ＥＲＮ (32)優先日 平成20年4月24日(2008.4.24) ＳＴＥＶＥＮＳ (33)優先権主張国 米国(US) アメリカ合衆国 原出願日 (71)出願人 510282239 オブ サウザン カリ スティーブン ＯＦ ＳＯＵＴＨ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ，ＵＳＣ カリフォルニア州 ９０ ０８９−２５６１，ロサンゼルス，マクリ ントックアベニュー イーイービー ３７４０，スィート １３１，ヒューズセンタ ー (74)代理人 100096024 弁理士 柏原 三枝子 最終頁に続く (54)【発明の名称】化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するための食事組成物ならびに方法 (57)【 要 約 】 （修正有） 【課題】化学療法、放射線療法、酸化ストレス、および加齢を防御するための有用な新規 食事組成物並びに方法の提示。 【解決手段】単糖、二糖、及び多糖の置換物としてのグリセロールを含む食事組成物であ って、化学療法又は酸化ストレスに暴露した動物又はヒトへの前記食事組成物の投与が前 記化学療法若しくは酸化ストレスの前３−１０連日、前記化学療法若しくは酸化ストレス の後２４時間、又はそれらの組み合せで行われる食事組成物。当該食事組成物が前記化学 療法又は酸化ストレスに対して前記動物又はヒトを防御するために用いられる食事組成物 。０−０．２重量％のＬ−メチオニン、及び各々少なくとも０．０５重量％の量のＬ−ト リプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、 Ｌ−スレオニン、並びにＬ−バリンを含み、タンパク質を含まない食事組成物。 【選択図】なし ( 2 ) JP 1 2015-186480 A 2015.10.29 2 【特許請求の範囲】 チンの使用は多くの悪性腫瘍を有効的に治療することが 【請求項１】 できるが、薬物誘発性のそれぞれ心毒性と腎毒性によっ 単糖、二糖、および多糖の置換物としてのグリセロール て薬物の全潜在能力は制限される。したがって、癌標的 を含む食事組成物であって、化学療法または酸化ストレ 性を損なわずに正常細胞を選択的に防御し、望ましくな スに暴露した動物またはヒトへの前記食事組成物の投与 い毒性を軽減することによって、化学慮法の有益性が立 が前記化学療法もしくは酸化ストレスの前３−１０連日 証され、そして臨床転帰を良くするであろう。 、前記化学療法もしくは酸化ストレスの後２４時間、ま 【発明の概要】 たはそれらの組み合せで行われることを特徴とする食事 【０００５】 組成物。 本発明は、化学療法、放射線療法、酸化ストレス、およ 【請求項２】 10 び加齢を防御するために有用な新規食事組成物ならびに 請求項１に記載の食事組成物において、当該食事組成物 方法に関する。 が前記化学療法または酸化ストレスに対して前記動物ま 【０００６】 たはヒトを防御するために用いられることを特徴とする したがって、一つの形態では、本発明は、０−０．２重 食事組成物。 量％のＬ−メチオニン、およびそれぞれ少なくとも０． 【発明の詳細な説明】 ０５重量％の量のＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシ 【技術分野】 ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン 【０００１】 、Ｌ−スレオニン、およびＬ−バリンを含み、タンパク ［関連出願］ 質を含まない食事組成物を特徴とする。本組成物は、さ 本出願は、２００７年３月２８日に出願された米国仮出 らに、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラ 願第６０／９０８，６３６号、および２００７年６月７ 20 ギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グル 日に出願された米国仮出願第６０／９４２，５６１号の タミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ 優先権を主張する２００８年３月２８日に出願された米 −チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンか 国特許出願第１２／０５８，６００号の一部継続出願で ら成る群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含 ある。本出願は、また、２００８年４月２４日に出願さ むことができる。 れた米国仮出願第６１／０４７，６８０号の優先権を主 【０００７】 張する。米国特許出願第１２／０５８，６００ならびに もうひとつの形態では、本発明は、０−０．２重量％の 米国仮出願第６０／９０８，６３６号、第６０／９４２ Ｌ−トリプトファン、および少なくともそれぞれ０．０ ，５６１号、および第６１／０４７，６８０号の内容は ５重量％の量のＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ 、これらのすべての参照により本明細書中に組み入れら −ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ− れる。 30 スレオニン、Ｌ−バリンを含み、タンパク質を含まない 【０００２】 食事組成物を特徴とする。本組成物は、Ｌ−アラニン、 ［財政的支援］ Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイ 本発明は、一部、米国国立衛生研究所の助成、ＡＧ２０ ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン ６４２、ＡＧ０２５１３５、ＧＭ０７５３０８、および 、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アル 神経科学計画（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂｌｕｅ ギニン、およびＬ−ヒスチジンからなる群から選択され ｐｒｉｎｔ）の支援を受けてなされたものである。した る１つまたは複数のアミノ酸をさらに含むことができる がって、米国政府は特定の権利を有する。 。 【０００３】 【０００８】 ［技術分野］ さらにもう一つの形態では、本発明は、それぞれ０−０ 本発明は、概して、疾患の治療に関する。より具体的に 40 ．２重量％の量のＬ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン は、本発明は、化学療法、放射線療法、酸化ストレスお 、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ− よび加齢を防御するための食事組成物ならびに方法を提 フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ− 供する。 アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ 【背景技術】 −システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ 【０００４】 −グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン 現代の化学療法は、癌関連症状の緩和によって癌患者の 、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを含み、タン 生活の質を改善することができ、多くの悪性腫瘍の生存 パク質を含まない食事組成物を特徴とする。 も顕著に延長することができる。しかし、不可避の中毒 【０００９】 性副作用により薬物投与の用量強度と投与頻度がしばし さらにもう一つの形態では、本発明は、単糖、二糖、お ば制限される。例えば、ドキソルビシンまたはシスプラ 50 よび多糖の代替物としてグリセロールを含む食事組成物 ( 3 ) JP 2015-186480 3 A 2015.10.29 4 を特徴とする。 【００１４】 【００１０】 本発明における上述した特徴および本発明の他の特徴な また、本発明の範囲には、化学療法、放射線療法、酸化 らびに入手法とそれらの使用法は以下の記述と同時に付 ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御する方 随する図面を参照することによってより明白となり、最 法も含まれる。本発明の方法は、本発明の組成物を動物 上の理解が得られるであろう。本図面は、本発明の典型 またはヒトに投与し、それによって、化学療法、放射線 的な実施態様のみを描写するものであり、その範囲に限 療法、酸化ストレス、または加齢から動物またはヒトを 定されるものではない。 防御することを含む。本発明の方法は、さらに、動物ま 【図面の簡単な説明】 たはヒトを化学療法、放射線療法、または酸化ストレス 【００１５】 に暴露することを含むことができる。幾つかの実施態様 10 【図１】グラフ（Ａ）生存率％、（Ｂ）メチオニン食体 では、本組成物は、暴露過程前に連日３−１０日間、暴 重％、（Ｃ）メチオニン摂餌量、（Ｄ）治療後体重％、 露過程後２４時間、またはそれらの併用によって動物ま および（Ｅ）日付関数としての治療後の摂餌量。マウス たはヒトに投与される。幾つかの実施態様では、本組成 はドキソルビシン治療前に低メチオニンアミノ酸混合物 物は、加齢から動物またはヒトを防御するため、３回目 （ＬＭＡ１）で処理した。 の食事毎または３−１０日毎に投与される。 【図２】グラフ（Ａ）生存率％、（Ｂ）治療後体重％、 【００１１】 および（Ｃ）日付関数としてのトリプトファン食体重％ 加えて、本発明は、８１３−９５７キロカロリー以下の 。マウスはドキソルビシン治療前に低トリプトファンア 総エネルギーを供給し、もし炭水化物が食材に存在する ミノ酸混合物（ＬＴＡ１）で処理した。 場合は該炭水化物の割合は該総エネルギーの半分以下で 【図３】グラフ（Ａ）日付関数としての摂餌、（Ｂ）血 あり、３０−３６グラム以下のタンパク質を含有する該 20 液グルコース濃度、（Ｃ）時間関数としての生存率％、 食材を供給しながら、対象者に栄養を供給し得る該食材 および（Ｄ）日付関数としての体重％。マウスはパラコ を含む低カロリー食事またはノンカロリー食事を特徴と ート処理前にグリセロール食を与えた。 する。幾つかの実施態様では、食材は総エネルギー７０ 【図４】ストレス耐性と寿命の調節におけるＳｃｈ９， ０キロカロリー以下を供給しうる食材である。 Ｔｏｒ１，およびＲａｓ２間の遺伝子相互作用。（Ａ− 【００１２】 Ｄ）３日目の野生株（ＤＢＹ７４６）およびＴｏｒ１， さらに、本発明は、１日に動物またはヒト体重当たり１ Ｓｃｈ９またはＲａｓ２欠損細胞に熱ショック（５５℃ １キロカロリー以下のエネルギー、および１日に該動物 ：Ａ，１０５分；Ｂ，７５分；Ｃ，１５０分；およびＤ またはヒト体重当たり０．４グラム以下のタンパク質を ，１２０分）または酸化ストレス（１００ｍＭ過酸化水 供給し、食事中に炭水化物が存在する場合は、該炭水化 素６０分；または２５０μＭメナジオン３０分）を暴露 物の割合は該総エネルギーの半分以下である該食事を供 30 させた。（Ｅ）１００万個細胞当たりｃａｎ 給しながら、栄養を供給しうる該食事を動物またはヒト 測定した突然変異頻度の時間経過。４回の実験の平均を に投与することによって、化学療法、放射線療法、酸化 示す。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｆ）最少完全培地 ストレス、または加齢から動物またはヒトを防御する方 中（ＳＤＣ）の野生株（ＤＢＹ７４６）、ｔｏｒ１Δ、 法を供給する。幾つかの実施態様では、食事は１日当た およびＳＣＨ９または構造的活性型Ｒａｓ２（ｒａｓ２ り総エネルギー７００キロカロリー以下を供給すること Ｖ ができる。本方法は、さらに、動物またはヒトを化学療 時的生存率。（Ｇ）野生株（ＤＢＹ７４６）およびＴｏ 法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露することを ｒ１，Ｓｃｈ９，Ｒａｓ２またはこれらを同時に欠損す 含むことができる。幾つかの実施態様では、食事を暴露 る突然変異株の経時的生存率をグラフに示す。データは 過程前の３−１０日間、暴露過程を２４時間、またはそ 少なくとも４回の実験の平均を表す。エラーバーはＳＥ れらの併用によって動物またはヒトに投与する。幾つか 40 Ｍを示す。非線形曲線適合により計算された平均寿命に の実施態様では、加齢から動物またはヒトを防御するた ついては表２を参照のこと。（Ｈ）酵母の長寿命調節経 めに、食事を３食毎または３−１０日毎に投与する。 路。Ｓｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓによって制御され 【００１３】 る栄養センサー経路はプロテインキナーゼＲｉｍ１５に 本発明は、さらに、化学療法から動物またはヒトを防御 収斂する。一方、ストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２、Ｍ する方法を供給する。本方法は、１サイクルの化学療法 ｓｎ４，およびＧｉｓ１はストレス応答性遺伝子をトラ の４８−１４０時間前、化学療法後４−５６時間、また ンス活性化し、寿命延長につながる細胞防御を増強する はそれらの併用によって担癌動物または癌患者を絶食さ 。ＣＲの前長寿命効果は部分的にＳｃｈ９，Ｔｏｒ，お せ、該動物またはヒトを化学療法に暴露することを含む よびＲａｓによって介在され、多くはまだ確認されてい 。幾つかの実施態様では、１サイクルの化学療法前後１ ないさらなる機序も必要とするかもしれない。 ８０時間以下の間、該動物またはヒトを絶食させる。 50 ａ ｌ １ ９ Ｒ 変異株で ）のいずれかを過剰発現する突然変異株の経 【図５】長寿命変異株の遺伝子発現特性。（Ａ）野生型 ( 4 ) JP 2015-186480 A 2015.10.29 5 6 細胞に比較して２．５日目におけるｔｏｒ１Δ，ｓｃｈ ９を欠損する変異株の寿命。データは３実験の平均とＳ ９Δ，およびｒａｓ２Δ変異株の２倍超上方制御または ＥＭを表す。（Ｅ）グリセロール生合成遺伝子を欠損す 下方制御された遺伝子の数のベン図。マイクロアレイ解 る培養３日目の変異株の熱ショック（５５℃）および酸 析を三重で実施した。データは上方／下方制御遺伝子を 化ストレス（５００ｍＭの過酸化水素、６０分）耐性。 表す。（Ｂ）ｓｃｈ９Δバックグラウンドを持つ長寿命 【図９】グリセロールのストレス耐性と寿命に対する効 の変異株において最も上方制御された遺伝子の欠損変異 果。（Ａ）細菌の熱感受性ルシフェラーゼを発現する３ 体の寿命。各株につき独立して３回から４回の実験を実 日目の野生型（ＤＢＹ７４６）とｓｃｈ９Δ変異株に熱 施した。データはペアを組み合わせてプールした実験の ストレス（４２℃、６０分）を加えた。データは平均と 平均およびＳＥＭを表す。 ＳＥＭ，ｎ＝３。 【図６】（Ａ）グリセロール代謝の模式図。図示の目的 10 定、両側を表す。（Ｂ）グリセロール（図に示された濃 のために、３種すべての長寿命変異体の中で野生株と比 度）で３０分前処理した野生型細胞における熱ストレス 較して２０％超上方制御された遺伝子を赤く表示し、下 （４２℃、６０分）後のルシフェラーゼ活性の回復。デ 方制御された遺伝子を緑色に表示した。（Ｂ）２．５日 ータは平均とＳＥＭ、ｎ＝３を表す。（Ｃ）ＳＤＣ中で 目の野生株（ＤＢＹ７４６）と比較したｓｃｈ９Δ，ｔ 増殖する３日目の野生型細胞を水で３回洗浄し、グリセ ｏｒ１Δ，およびｒａｓ２Δ変異株のグリセロール生合 ロール存在下または非存在下で２４時間高濃度のＮａＣ 成遺伝の発現レベルを倍数変化で表す。（Ｃ）３日目の ｌ（２Ｍ）に暴露した。その後細胞を３回洗浄して、塩 野生株（ＤＢＹ７４６）およびｓｃｈ９Δ細胞における を除き、連続的に希釈し、ＹＰＤプレートに播種した。 ＧＰＤ１ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ解析 （Ｄ）３日目の野生型とｓｃｈ９Δ変異株を高濃度（２ 。データは、平均とＳＥＭ、ｎ＝４を表す。 ０５，ｔ検定、両側、ｓｃｈ９Δ ＊ ｐ＜０． ｖｓ．ＷＴ。 ＊ ｐ＜０．０５、独立ｔ検 および４Ｍ）のＮａＣｌに２４時間暴露した。（Ｅ）図 20 のようにグリセロールを補充したＳＤＣ中で増殖する野 【図７】Ｓｃｈ９欠損変異株はエタノールを代謝し、グ 生型細胞の経時的生存率。データは平均とＳＥＭ，ｎ＝ リセロールを蓄積する。（Ａ）１日目と３日目に野生株 ３を表す。（Ｆ）ｉｎ （ＤＢＹ７４６）とＳｃｈ９欠損細胞の細胞内グリセロ 野生型培養１日目に希釈し、ＳＣ−Ｔｒｐプレート上（ ール量を測定した。データは、解析した５培養の平均と 炭素源なし）または炭素源としてグルコース（２％グル ＳＥＭを表す。（Ｂ）野生型およびｓｃｈ９Δ培養液中 コース）、エタノール（０．８％ＥｔＯＨ）またはグリ のグリセロール濃度。データは解析した５−７培養の平 セロール（３％グリセロール）を補充したプレート上に 均およびＳＥＭを表す。 、両側、ｓｃｈ９Δ ＊ ＊ ｓｉｔｕ生存アッセイ。ＳＤＣ ｐ＜０．０１、独立ｔ検定 播種した。２日毎にトリプトファン（または追加のグル ｖｓ．ＷＴ。（Ｃ−Ｄ）野生型（ コースとともに）をプレートに添加した。トリプトファ Ｃ）およびｓｃｈ９Δ（Ｄ）培養液中のグリセルールお ン添加２日後にコロニー形成をモニターした。データは よびエタノール濃度。データは解析した３−５培養の平 30 平均とＳＥＭ、ｎ＝３を表す。（Ｇ）正常（ＳＣ＋２％ 均とＳＥＭを表す。（Ｅ）１日目の野生型とｓｃｈ９Δ グルコース）、カロリー制限（ＳＣ＋１％グルコース） 変異株の中性脂肪のナイルレッド染色。ナイルレッド染 、またはグルコース／グリセロール（ＳＣ＋１％＋１％ 色は右側に、位相顕微鏡は左側に示す。バー、１０μｍ ）培地中で増殖した野生型（ＤＢＹ７４６）およびｍｓ 。 ｎ２Δ 【図８】グリセロール生合成遺伝子の欠損は、Ｓｃｈ９ 。データは解析した４培養の平均とＳＥＭを表す。（Ｈ の欠損に関連して寿命の伸長とストレス耐性を逆転させ ）ＳＤＣ培地中で増殖した３日目の野生型細胞を水で３ た。（Ａ）培養液中のグリセロール濃度。データは解析 回洗浄し、グリセロール（０．１％または１％）添加ま した４培養の平均とＳＥＭを表す。 ＊ ＊ ｐ＜０．０５、 ｐ＜０．０１、独立ｔ検定、両側、ｓｃｈ９Δ ．ｒｈｒ２Δ ＊ ｖｓ ｓｃｈ９Δ。（Ｂ）野生型（ＤＢＹ７４ 40 ｍｓｎ４Δ ｇｉｓ１Δ変異株の経時的生存率 たは非添加水（ＣＲ／極度の飢餓）中でインキュベート した。プロットは同様な結果が得られた３回の反復実験 の代表的な実験（重複の平均）を示す。（Ｉ）ＳＤＣ中 ６）、ｓｃｈ９Δ、ｒｈｒ２ΔおよびＲｈｒ２を欠損す で増殖する酵母を図に示した時点で試料採取（１ｍｌ） るＳｃｈ９欠損変異株の寿命。グリセロール（最終濃度 した。［１，２，３− １％）を培養１日目のｒｈｒ２Δ ｓｃｈ９Δ培養に添 ｎｃ．）を一定量加え、撹拌下、３０℃で２４時間イン 加した。データは解析した４−５培養の平均とＳＥＭを キュベートした。その後、細胞を水で３回洗浄した。細 表す。（Ｃ）３日目の細胞を熱ショック（５５℃、１０ 胞［ ５分）または過酸化水素（１５０ｍＭ，６０分）で暴露 １４１０，ファルマシア社）し、細胞数（ＣＦＵによる した。提示した細胞株は、野生型（ＤＢＹ７４６），ｒ 生存率）で標準化した。データは解析した４培養の平均 ｈｒ２Δ、ｓｃｈ９Δ、ｒｈｒ２Δ とＳＥＭを表す。 ｓｃｈ９Δである ３ ３ Ｈ］グリセロール（ＡＲＣ Ｉ Ｈ］量をシンチレーション測定（Ｗａｌｌａｃ 。（Ｄ）野生型（ＢＹ４７４１）、ｓｃｈ９Δ、および 【図１０】糖質をグリセロールで置換した食事はパラコ Ｇｐｄ１，Ｇｐｄ２，またはＲｈｒ２を欠損し、Ｓｃｈ 50 ート毒性からマウスを防御した。 ( 5 ) JP 2015-186480 A 2015.10.29 7 8 １群５匹からなる２群はそれぞれ対照食またはグリセロ びＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸に対する効果。３０週齢のＣＤ− ール食を６日間自由に与えられた。（Ａ）体重１００ｇ １マウスを７２時間絶食させ、屠殺した。深麻酔下に心 当たりの摂餌量はグリセロール食摂餌群がやや多かった 穿刺により血液を採取し、直ちに血糖を測定した。血漿 。（Ｂ）パラコート注入前に血糖値を測定した（摂餌開 のＧＨ濃度およびＩＧＦ−Ｉ濃度（Ｃｏｈｅｎ）を解析 始６日後。 ＊ ｐ＝０．０５、独立ｔ検定、両 した。ＧＨは拍動性のホルモンであり、ゆえに、有意な 側）。（Ｃ）５０ｍｇ／ｋｇパラコート（ＰＢＳ中７． 結果を得るためには大きなサンプルサイズを要する。マ ５ｍｇ／ｍｌ）腹腔内注入後の生存曲線。（Ｄ）パラコ ンホイットニーのＵ検定により計算したＩＧＦＢＰ−１ ート処理後のマウス体重。 以外は全てのＰ値はスチューデントのｔ検定により計算 【図１１】症例１の血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； した。 （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球、 10 【図２４】絶食／カロリー制限に応答するストレス耐性 ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ； の保存された調節経路。酵母では、Ｓｃｈ９，Ｔｏｒ， （Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）体重。 およびＲａｓによって制御される栄養感知シグナル伝達 【図１２】症例１、化学療法後の自己申告による副作用 経路はプロテインキナーゼＲｉｍ１５に収斂する。続い 。 て、ストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２，Ｍｓｎ４，およ 【図１３】症例２、化学療法後の自己申告による副作用 びＧｉｓ１がストレス応答性遺伝子をトランス活性化し 。 、細胞防御を増強して寿命が延長する。マウスとヒトで 【図１４】症例３、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； は、短期間の絶食により循環ＩＧＦ−Ｉ濃度が有意に低 （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球 下する。部分的に保存されるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経 、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ 路はＡｋｔによってＦｏｘＯ転写因子ファミリーが負に ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）。前立腺特異 20 調節される。ＲａｓとＴｏｒはＩＧＦ−Ｉの下流領域に 抗原（ＰＳＡ）濃度。 も機能するが、ストレス耐性と加齢の調節における役割 【図１５】症例３、化学療法後の自己申告による副作用 は十分に解明されていない。５型アデニルシクラーゼ（ 。 ＡＣ）を欠損するマウスはストレス耐性であり、アデニ 【図１６】症例４、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； ルシクラーゼ欠損酵母と似ている。特に、ＩＧＦ−Ｉ， （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球 Ａｋｔ，Ｒａｓ，ＴｏｒおよびＰＫＡの過剰な活性化を 、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ もたらす発癌遺伝子の突然変異はヒト癌の中で最も一般 ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 的である［２０］。 【図１７】症例４、化学療法後の自己申告による副作用 【図２５】ＩＧＦ−Ｉ減少によるＣＰ処理に対するｉｎ 。 ｖｉｔｒｏＤＳＲ。初代ラットグリア細胞とラットグ 【図１８】症例５、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； 30 リオーマ細胞株（Ｃ６，９ＬおよびＡ１０−８５）を試 （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球 験した。（Ａ）細胞を１％血清加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で 、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ プレインキュベートし、抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ；（Ｈ）前立腺特異抗 抗体α−ＩＲ３（１μｇ／ｍｌ）で２４時間中和した。 原（ＰＳＡ）濃度。 ＣＰ処理（１５ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝１２）後、細胞毒性（ 【図１９】症例６、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； ＬＤＨ法）を調べた。（Ｂ）細胞を１％（ＳＴＳ）また （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球 は１０％ＦＢＳのいずれかを添加した培地中で２４時間 、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ プレインキュベートした。ＣＰ処理（１５ｍｇ／ｍｌ； ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 ｎ＝１２）後、細胞毒性（ＬＤＨ法）を調べた。（Ｃ） 【図２０】症例９、血球数臨床検査値。（Ａ）好中球； 細胞をｒｈＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）添加または （Ｂ）リンパ球；（Ｃ）白血球、ＷＢＣ；（Ｄ）赤血球 40 非添加１％血清加培地中で４８時間プレインキュベート 、ＲＢＣ；（Ｅ）血小板；（Ｆ）ヘモグロビン、Ｈｇｂ した。ＣＰ処理（１２ｍｇ／ｍｌ；ｎ＝２１）後、細胞 ；（Ｇ）ヘマトクリット、Ｈｃｔ。 毒性（ＬＤＨ法）を調べた。スチューデントｔ検定によ 【図２１】症例１０、化学療法後の自己申告による副作 る 用。 【図２６】Ｒ 【図２２】絶食または非絶食での化学療法後の自己申告 まで増殖させ、１０％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で による副作用。（Ａ）データは本実験のすべての患者に （Ａ）２４時間または（Ｂ）４８時間ＤＸＲ（０−５０ よって報告されたすべてのサイクル後のＣＴＣ評価の平 ０μＭ）処理した。生存率は、非処理に比べた相対的な 均を表す；（Ｂ）データは絶食および非絶食サイクルの ＭＴＴ還元度により決定した；平均±ＳＤ、スチューデ 整合によるＣＴＣ評価の平均を表す。 ントのｔ検定による 【図２３】７２時間絶食の体重、グルコース濃度、およ 50 ＊ ， ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ Ｐ＜０．０００１。 ＋ およびＲ ＊ − 細胞をコンフルエントになる Ｐ＜０．０５， ＊ ＊ Ｐ＜０．０１ Ｐ＜０．００１；同一ＤＸＲ濃度におけるＲ ＋ ( 6 ) JP 2015-186480 9 細胞ｖｓ．Ｒ − A 2015.10.29 10 細胞。（Ｃ）コメット解析。ＩＧＦ−Ｉ ラノーマ担癌ＬＩＤマウスと対照マウス間の生存率比較 Ｒを過剰発現する細胞またはＩＧＦ−ＩＲを欠損する細 。（Ｄ）（Ｃ）のデータは、全ての死亡が転移およびＤ ＋ 胞（Ｒ およびＲ − ）を５０μＭのＤＸＲで１時間処理 ＸＲ毒性の両方に起因することを表す。ゆえに、本デー ＋ 細胞に有意なＤＮＡ障害が観察さ タはＤＸＲ毒性関連の死亡のみを表すために解析された 細胞はＤＸＲ誘発ＤＮＡ障害を防御した。 。（Ｅ）ＬＩＤマウスおよび対照マウスの体重。（Ｆ） した。ＤＸＲ処理Ｒ れたが、Ｒ − スチューデントのｔ検定による ＊ Ｐ＜０．０００１；Ｒ − 対照 Ｒ ＊ − ｖｓ．Ｒ ＋ ＊ ＊ 対照 ＤＸＲ；Ｒ ＋ Ｐ＜０．０１， ＊ ＊ ｖｓ．Ｒ ＋ ＤＸＲ ｖｓ．Ｒ 対照マウスおよびＬＩＤマウスにおけるＤＸＲ誘発心筋 ＤＸＲ； 症。心不全は、急性ＤＸＲ毒性の主要な結果である［７ − ６］。ＤＸＲ処理対照マウスからの心臓の組織標本スラ ＤＸＲ。２つの独立した実験から同様の結果が得られた 。代表的な実験を示す。 イドは、筋原線維の欠損と免疫細胞の浸潤を示したが、 10 一方、ＤＸＲ依存性の心筋症はＬＩＤマウスには観察さ 【図２７】Ｓ．セレビシエにおけるＤＸＲに対するＳｃ れなかった。ヘマトキシリン ｈ９／Ｒａｓ２欠損のによるＤＳＲの効果。（Ａ）野生 スライドを示す。バー、１００μｍ。 型（ＤＢＹ７４６）、ｓｃｈ９Δ，ｓｃｈ９Δｒａｓ２ 【図３０】短期間絶食（ＳＴＳ）と低ＩＧＦ−Ｉに対す Δ，ＲＡＳ２ ａ ｌ １ ９ ｖ ａ ｌ １ ９ 株をＯＤ６ ，およびｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ ｖ エオジン染色。代表的な る応答における分別的なストレス耐性（ＤＳＲ）のモデ ＝０．１で播種し、グルコース ル。正常細胞は、絶食または増殖シグナルの欠如に対し 培地中で別々に増殖させ、播種開始２４時間後にＤＸＲ 、細胞周期停止の実行およびエネルギー維持へのシフト （２００μＭ）で処理した。生存率を適切な選択培地上 によって対応する。癌細胞の特徴の一つは、外部の調節 でのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）として測定した。 シグナル（ＩＧＦ−ＩＲ，Ｒａｓ，およびＡｋｔを含む ３つの独立した実験からのデータを平均±ＳＥとして示 ）にかかわらず増殖する、または増殖モードを維持する ０ ０ す。スチューデントのｔ検定による ｃｈ９Δｒａｓ２Δ １ ９ ＊ Ｐ＜０．０５，ｓ 20 ｖｓ．ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ 。（Ｂ）突然変異頻度の時間経過、１０ たりのＣａｎ ｒ ６ ｖ ａ ｌ 個細胞当 能力であることから、癌細胞は、絶食および低ＩＧＦ− Ｉに対する応答において防御維持モードに入ることがで きず、または一部のみ入ることが予想される。 突然変異体として測定。示す株は、野生 【図３１】絶食による分別的なストレス耐性。正常細胞 型（ＷＴ）、Ｓｃｈ９および／またはＲａｓ２を欠損す では、Ａｋｔ，Ｒａｓおよび他の癌原遺伝子を含むＩＧ る細胞、ならびに構造的に活性なＲａｓ２ ｖ ａ ｌ １ ９ を Ｆ−Ｉの下流エフェクターおよび他の増殖因子経路が絶 過剰発現する細胞。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３−５ 食に起因する増殖因子の減少に応答して下方制御される 実験）を表す。細胞を１日目にＤＸＲ（２００μＭ）で 。この下方制御は増殖を阻止／減少し、化学療法に対す 処理した。野生型無処理細胞の突然変異頻度を対象とし る防御を促進する。対照的に、発癌突然変異は、増殖シ て報告した。スチューデントのｔ検定による ０５，ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ ２ ｖ ａ ｌ １ ９ ＊ Ｐ＜０． ｖｓ．ｓｃｈ９ΔＲＡＳ 30 。 グナルから独立性により、腫瘍細胞のＳＴＳに対する応 答を低下させる。それゆえ、癌細胞は、絶食状態に対す る応答ができず、または一部の応答のみに留まり、酸化 【図２８】種々の高用量化学療法剤で処理したＬＩＤマ ストレスおよび高用量化学療法に対して防御する代わり ウスにおけるストレス耐性試験。 に、増殖促進を続ける。 ＬＩＤおよび対照マウスは（Ａ）１００ｍｇ／ｋｇエト 【図３２】絶食哺乳類細胞における分別的ストレス耐性 ポシド（Ｅｔｏ，Ｐ＝０．０６４）の単回注入、（Ｂ） 。初代ラットグリア細胞、ラットグリオーマ細胞株（Ｃ ５００ｍｇ／ｋｇＣＰ（Ｐ＝０．００１）単回注入、（ ６，Ａ１０−８５，およびＲＧ２）、ヒトグリオーマ細 Ｃ）４００ｍｇ／ｋｇ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ 胞株（ＬＮ２２９）およびヒト神経芽細胞腫細胞株（Ｓ ，Ｐ＝０．１４８）単回注入、（Ｄ）ドキソルビシン（ Ｈ−ＳＹ５Ｙ）を試験した（ ＤＸＲ）２回注入、を受けた。最初の２０ｍｇ／ｋｇは ０．０１）。 ０日目に、２回目の２８ｍｇ／ｋｇは２２日目（Ｐ＝０ 40 【図３３−１】短期間絶食（ＳＴＳ）はマウスを化学毒 ．０２２）に注入された。生存率％で評価された毒性を 性から防御する。３種の異なる遺伝的背景（Ａ：Ａ／Ｊ 示す。Ｐｅｔｏのログランク検定によるＰ値。 Ｂ：ＣＤ−１ ＊ ｐ＜０．０５， ＊ ＊ ｐ＜ Ｃ：ヌード）のマウスを４８−６０時 【図２９】メラノーマ担癌ＬＩＤマウスにおける２サイ 間絶食させ、高用量エトポシド（１００−１１０ｍｇ／ クルの高用量ＤＸＲに対する分別的ストレス耐性（ＤＳ ｋｇ）でチャレンジした（ Ｒ）。（Ａ）実験手順のスケジュール。（Ｂ）２サイク ＜０．００５）。 ルの高用量ＤＸＲで処理したＢ１６Ｆｌｕｃメラノーマ 【図３３−２】短期間絶食（ＳＴＳ）はマウスを化学毒 担癌ＬＩＤマウスおよび対照マウスの生物発光画像。５ 性から防御する。（Ｅ）８週齢のＣＤ−１雌性マウスを 匹のマウスを無作為に選択し、実験の間中腫瘍の進行ま １２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン投与前４８時間と投与後 たは退縮のモニターを続けた。（Ｃ）２サイクルの高用 ２４時間絶食させた（ｐ＜０．０５）。（Ｆ）１５週齢 量ＤＸＲ（Ｐ＜０．０５）で処理したＢ１６Ｆｌｕｃメ 50 のＡ／Ｊ雌性マウスを４８時間絶食させ、１６ｍｇ／ｋ ＊ ＊ ｐ＜０．０１， ＊ ＊ ＊ ｐ ( 7 ) JP 11 2015-186480 A 2015.10.29 12 ｇのドキソルビシンでチャレンジした（ｐ＜０．０５） ミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン 。 、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、および 【図３４Ａ】神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける Ｌ−ヒスチジンを含有する。 分別的ストレス耐性。（Ａ）ＮＸＳ２（神経芽細胞腫） 【００１８】 担癌マウスを高用量のエトポシド（８０ｍｇ／ｋｇ）に 本発明の２番目の食事組成物は、０−０．２重量％（例 よる化学療法前に４８時間絶食（ＳＴＳ）させた。 えば、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０． 【図３４Ｂ】神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける １５％）のＬ−トリプトファンおよび少なくとも０．０ 分別的ストレス耐性。（Ｂ）実験手順。 ５重量％（例えば、０．１％，０．５％，１％，または 【図３４Ｃ】神経芽細胞腫を有する絶食マウスにおける ２％）のＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイ 分別的ストレス耐性。（Ｃ）ＳＴＳはＮＸＳ２細胞をド 10 シン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオ キソルビシンとシスプラチンに対する感受性を増強する ニン、Ｌ−バリンを含有するが、タンパク質は含有しな かもしれない。 い。幾つかの実施態様では、本組成物は、また、Ｌ−ア 【図３５】Ｂ１６メラノーマ細胞を有する絶食マウスに ラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ− おける分別的ストレス応答性。ＳＴＳはＤＸＲに対する システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ− Ｂ１６メラノーマ細胞の感受性を増強する。：化学療法 グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、 ４８時間前の絶食によりマウスはより高い腫瘍奏効を示 Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンから成る群から し、この応答はバイオルミネッセンス技術の使用により 選択される１つまたは複数のアミノ酸を、例えば、それ さらに定量化された。 ぞれ少なくとも０．０５重量％量（例えば、０．１％、 【発明を実施するための形態】 ０．５％、１％、または２％）含有する。幾つかの実施 【００１６】 20 態様では、本組成物は、正常量のそれぞれＬ−メチオニ 本発明は、少なくとも部分的に、減少レベルのメチオニ ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ ン、トリプトファン、すべてのアミノ酸、またはタンパ −フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ ク質を含む食事組成物、単糖、二糖、および多糖の代替 −アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、 物としてのグリセロールを含む食事組成物、ならびに減 Ｌ―システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、 少レベルのエネルギー、炭水化物、またはタンパク質の Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシ 低カロリーまたはノンカロリー食事、および絶食が、化 ン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジンを含有する 学療法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から対 。 象を防御するために使用できるという予想外の発見に基 【００１９】 づいている。 本発明の３番目の食事組成物は、Ｌ−メチオニン、Ｌ− 【００１７】 30 トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ より具体的には、本発明の一の食事組成物は、０−０． −リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ ２重量％（例えば、０．０２％、０．０５％、０．１％ −バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アス 、または０．１５％）のＬ−メチオニンおよび少なくと パラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ− も０．０５重量％（例えば、０．１％、０．５％、１％ グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン 、または２％）のそれぞれＬ−トリプトファン、Ｌ−イ 、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ヒスチジ ソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニル ンを、それぞれ０−０．２重量％量（例えば、０．０２ アラニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−バリンを含有す ％、０．０５％、０．１％、または０．１５％）を含有 るが、タンパク質は含有しない。幾つかの実施態様では するが、タンパク質は含有しない。 、本組成物は、また、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン 【００２０】 、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミ 40 本発明の第４番目の食事組成物は、単糖（例えばグルコ ン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、 ース）、二糖、および多糖の代替物としてグリセロール Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ を含有する。 −ヒスチジンから成る群から選択される１つまたは複数 【００２１】 のアミノ酸を、例えば、それぞれを少なくとも０．０５ 本発明の食事組成物は、化学療法、放射線療法、酸化ス 重量％（例えば、０．１％、０．５％、または２％）含 トレス、または加齢から動物またはヒトを防御するため 有する。幾つかの実施態様では、本組成物は、正常量の に使用することができる。より具体的には、動物または それぞれＬ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ− ヒトは本発明の食事組成物を摂食することができる。動 ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ス 物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化スト レオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギ レスに暴露される場合、動物またはヒトの正常細胞は防 ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタ 50 御されるが、癌細胞等の異常細胞は防御されない。例え ( 8 ) JP 13 2015-186480 A 2015.10.29 14 ば、動物またはヒトが化学療法、放射線療法、または酸 法、放射線療法、酸化ストレス、または加齢から動物ま 化ストレスに暴露される前に連日３−１０日間本組成物 たはヒトを防御する方法を供給する。もし、炭水化物が を動物またはヒトに投与することができる。本組成物は 食事中に存在する場合、炭水化物の割合は該エネルギー 、また、暴露後２４時間動物またはヒトに投与すること の半分以下である。幾つかの実施態様では、本食事は、 ができる。好ましくは、本組成物は、動物またはヒトを １日当たり７００キロカロリー未満（例えば、６００、 化学療法、放射線療法、または酸化ストレスの暴露する ４００、または２００キロカロリーまたは０キロカロリ 前に連日３−１０日間、および暴露後２４時間の両方を ー）の総エネルギーを供給することができる。該動物ま 動物またはヒトに投与することができる。動物またはヒ たはヒトが化学療法、放射線療法、または酸化ストレス トを加齢から防御するために、組成物は３回目の食事毎 または３−１０日毎に投与することができる。 に暴露される場合、該動物またはヒトの正常細胞は防御 10 されるが、癌細胞等の異常な細胞は防御されない。例え 【００２２】 ば、本食事は該動物またはヒトが化学療法、放射線療法 化学療法の実施例として、エトポシド、ドキソルビシン 、または酸化ストレスに暴露する前に３―１０連日該動 、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホス 物またはヒトに投与することができる。本食事は、該暴 ファミド、ドセタキセル、シクロホスファミド、カルボ 露後２４時間該動物またはヒトに投与することもできる プラチン、ＧＭＺ、およびパクリタキセルが挙げられる 。好ましくは、本食事は、該動物またはヒトを化学療法 が、これらに限定されるものではない。これらの薬物は 、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前３−１ 個別にまたは併用で使用することができる。 ０連日および該暴露後２４時間の両方を該動物またはヒ 【００２３】 トに投与することができる。加齢から動物またはヒトを 本発明は、また、低カロリー食事またはノンカロリー食 防御するために、本食事を３回目の食事毎または３−１ 事を供給する。該食事は８１３−９５７キロカロリー以 20 ０日毎に投与することができる。 下（例えば、７００、５００、３００、１００キロカロ 【００２６】 リー以下、または０キロカロリー）の総エネルギーと、 さらに、本発明は、化学療法の前後に担癌動物または癌 ３０−３６ｇ以下（例えば、２０、１０、または５ｇ以 患者を絶食させることによって、化学療法から動物また 下、または０ｇ）のタンパク質を供給しながら、対象者 はヒトを防御する方法を供給する。例えば、担癌動物ま に栄養を供給することが可能な食材を含有する。もし、 たは癌患者を１サイクルの化学療法前４８−１４０時間 炭水化物が本食材中に存在する場合は、炭水化物の割合 または化学療法後４−５６時間絶食させることができる は総エネルギーの半分以下である。 。好ましくは、担癌動物または癌患者を１サイクルの化 【００２４】 学療法前４８−１４０時間および化学療法後４−５６時 本発明の食事は、化学療法、放射線療法、酸化ストレス 間絶食させる。動物またはヒトが化学療法に暴露される 、または加齢を防御するために、動物またはヒトに（例 30 場合、該動物またはヒトの正常細胞は防御されるが、癌 えば、１日１回、または３回に分けて）投与することが 細胞は防御されない。幾つかの実施態様では、該動物ま できる。 たはヒトを１サイクルの化学療法の前後１８０時間以下 例えば、本食事を動物またはヒトに化学療法、放射線療 絶食させられる。 法、または酸化ストレスに暴露する前に連日３−１０日 【００２７】 間動物またはヒトに投与することができる。本食事は、 化学療法前４８−６０時間、化学療法後±２４時間の絶 該暴露後、２４時間動物またはヒトに投与することもが 食はマウスを防御し、癌細胞の化学療法に対する感受性 できる。好ましくは、本食事を、動物またはヒトに化学 を増強することが動物で観察された。さらに、以下に示 療法、放射線療法、または酸化ストレスに暴露する前に すように、癌患者においては、絶食または極めて低カロ 連日３−１０日間、および該暴露後２４時間の両方を動 リーの食事は化学療法から患者を防御したが、癌細胞は 物またはヒトに投与することができる。加齢から動物ま 40 防御しなかった。極めて低カロリーの該食事／絶食は、 たはヒトを防御するためには、３回目の食事毎にまたは また、癌細胞の化学療法に対する感受性を増強すると思 ３−１０日毎に投与することができる。 われた。絶食は種々の癌細胞の種々のタイプの化学療法 【００２５】 に対する感受性を増強したことも動物実験で観察された 本発明は、さらに、動物またはヒト体重ｋｇ当たり１日 。加えて、動物実験では、絶食によりＩＧＦ−Ｉの７５ １１キロカロリー以下（例えば、８、５、または２キロ ％の低下がもたらされ、ＩＧＦ−Ｉの７５−９０％の低 カロリー以下、または０キロカロリー）のエネルギーと 下は動物を防御し、化学療法に対する癌細胞の感受性を 、動物またはヒトの体重当たり１日０．４ｇ以下（例え 増強するのに十分であった。さらに、ヒト臨床試験では ば、０．３、０．２または０．１ｇ、または０ｇ）のタ ５日の絶食および／または低カロリー／低タンパク質／ ンパク質を供給しながら、栄養を供給することができる 低糖質のいずれかにより７５％以上のＩＧＦ−Ｉの低下 食事を動物またはヒトに投与することによって、化学療 50 がもたらされたことが観察された（Ｔｈｉｓｓｅｎ ｅ ( 9 ) JP 15 ｔ ｅｗ ａｌ．（１９９４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ 2015-186480 A 2015.10.29 16 Ｒｅｖｉ えに、タンパク質欠乏食における低メチオニンアミノ酸 １５（ｌ）：８０−１０１）。ゆえに、極めて低 混合物（ＬＭＡ１）の実験用げっ歯類における化学療法 カロリー／低糖質だけでなく極めて低タンパク質の食事 毒性からの防御に対する効果を調べた。化学療法前の５ が化学療法から動物およびヒトを防御し、多くの種類の 日間、８匹のマウスにＬＭＡ１混合物をタンパク質フリ 癌細胞の化学療法に対する感受性を増強するであろう。 ー食と併用で投与した（ハーラン社，ＴＤ．０７７８９ 【００２８】 ）。ＬＭＡ１混合物中のメチオニンレベルは対照食のレ 以下の実施例は本発明の範囲を説明することを意図する ベルの２０％であった（ＴＤ．０７７８８）。５日のＬ が、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。か ＭＡ１食の後、マウスに高用量のドキソルビシン（ＤＸ かる実施例は使用することが可能な典型的な実施例であ Ｒ，広く使用される化学療法剤）を静脈内注射した。毒 るが、当業者に公知の他の手順も代わりに使用すること 10 性の程度を調べるため、毎日マウスの体重減少と異常な が可能である。事実、通常の当業者は、本発明の教示に 行動をモニターした。体重と摂餌を毎日記録した。ＬＭ 基づき、必要以上の実験無しに、容易にさらなる実施態 Ａ１処理マウスは対照群に比較してより迅速に体重減少 様を想像し、実行することができる。 から回復した（図１）。さらに、ＬＭＡ１処理マウスは 【実施例１】 、高用量化学療法後、対照マウスに比べ有意に高い生存 【００２９】 率を示した（それぞれ６３％ 癌を治療するための戦略は、主に腫瘍細胞に対する毒性 。 を増強することに集中してきた。本発明者は、腫瘍を殺 【００３１】 すことに集中する古典的な腫瘍中心の薬物開発から離れ ＬＴＡ１混合物 、正常細胞の防御を増強することに集中してきた。最近 メチオニン制限と同様に、低濃度のトリプトファン食も 、本発明者は短期間絶食（ＳＴＳ；４０−６０時間）に 20 寿命の延長と癌を含む若干の加齢関連疾患の減少を示し より化学療法に対する宿主抵抗性が増強する一方、同時 ている（４−７）。長寿とストレス耐性の間に強い関連 に化学療法誘発アポトーシスに対する腫瘍の感受性が増 性があるという事実に基づいて、本発明者らは、他のト 強することを報告した（分別的ストレス耐性、ＤＳＲ） リプトファン源欠乏下において低トリプトファンアミノ （１）。ＳＴＳの根拠は、増殖因子抑制とカロリー制限 酸混合物でのマウスの処理も寿命延長に加えてストレス （ＣＲ）が種々の生物の寿命を延ばし、ストレス耐性を 耐性の増強も提供することができると考えた。化学療法 増強するという加齢の分野におけるＤｒ．Ｌｏｎｇｏの 前１０日間、８匹のマウスにタンパク質欠乏食（ハーラ 仕事に由来する。しかし、ＳＴＳは宿主を分別的に防御 ン社，ＴＤ．０７７９０）と併用でＬＴＡ１混合物の処 するための強力な方法ではあるが、臨床設定における応 理を行った。ＬＴＡ１混合物中のトリプトファンレベル 用は制限してきた。ゆえに、本発明者は、化学療法に対 は対照食のレベルの２０％であった（ＴＤ．０７７８８ する宿主抵抗性を増強することもできる代替的な薬剤介 30 ）。毒性をＬＭＡ１混合物実験で実施された場合と同様 入を調べた。研究を通じて、本発明者は、化学療法剤に に調べた。ＬＴＡ１混合物は化学療法後の体重管理を改 対する宿主の防御の増強を提供する３つの有望な薬剤を 善し、対照に比べ体重減少のより迅速な回復をもたらし 決定した。化学療法に対する耐性増強に有効であった本 た（図２）。また、ＬＴＡ１混合物処理マウスは、対象 薬剤は１）メチオニン制限アミノ酸混合物（ＬＡＭ１） と比べて４倍高い生存率であった（５０％ 、２）トリプトファン制限アミノ酸混合物（ＬＴＡ１） ．５％）（図２）。 、および３）グリセロール（Ｇ１）であった。ＬＭＡ１ 【００３２】 は、本食事が他のメチオニン源を欠乏する場合のみ有効 Ｇ１混合物 であり、ＬＴＡ１は本食事が他のトリプトファン源を欠 カロリー制限は、酵母から哺乳類までの範囲のモデル生 乏する場合のみ有効である。最後に、Ｇ１はグルコース 物においてストレス耐性を増強し、寿命を延長する（Ｌ 制限食との併用時に有効である。興味深いことに、ＬＭ 40 ｏｎｇｏ，２００３）（８，９）。絶食が複数の化学療 Ａ１とＬＴＡ１は等カロリーで、摂食も同等であるにも 法に対する防御効果を示し、炭素源のグリセロール置換 かかわらず、ＬＭＡ１／ＬＴＡ１処理により動物は体重 が酵母の寿命の延長とストレス耐性に好ましい効果を示 低下特性を示した。これは、ＬＭＡ１／ＬＴＡ１が該動 すという我々の最近の結果を考慮して、マウスにおける 物を「増殖／再生」から「維持」へとエネルギーをシフ グリセロール摂餌のトキシンに対する防御効果を調べた トさせ、ゆえに、化学療法毒性に対する耐性を増強して 。１群５匹のマウスから成る２群のそれぞれに２種類の いることを示唆する。 等カロリー食、対照食（４０％デンプン／砂糖／マルト 【００３０】 ースデキストリンを補充したＴｅｋｌａｄ ＬＭＡ１混合物 形飼料）またはグリセロール含有Ｇ１食（４０％グリセ メチオニン制限は、実験用げっ歯類の寿命を延ばし、ス ロール補充）を６日間自由に摂餌させた。グリセロール トレス耐性を高めることが示されている（２，３）。ゆ 50 食のマウスは対照食のマウスよりやや多く摂餌したが、 ｖｓ．１３％）（図１） ｖｓ．１２ ８６０４固 ( 10 ) JP 2015-186480 17 A 2015.10.29 18 ６日目には両群とも血糖値の１８％の減少を示した（図 マウスにおけるドキソルビシン実験 ３）。その後、両群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇのパラコ マウスをＬＭＡ１またはＬＴＡ１で処理した後、２４− ートを腹腔内に１回投与し、正常食（８６０４固形飼料 ２６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（ベッドフォード ）に戻した。パラコートは肝細胞と肺細胞のＳ期停止を ボラトリーズ社）を３０ゲージのインスリン用注射器（ もたらし（１０）、死に至ることが知られている（１１ ベクトンディッキンソン社）で静脈内注射した。ドキソ ）。対照群のマウスは３日目までにすべて死亡したが、 ルビシンは精製水中に溶解し、生理食塩水で最終濃度５ グリセロール食マウスの５匹中３匹はパラコート毒性を ｍｇ／ｍｌに希釈した。全てのドキソルビシン注射の後 完全に防御し（図３Ｃ，ｐ＜０．０５）、パラコート処 、生理食塩水／ヘパリンで洗浄して、血管内皮細胞の損 理５日後に正常な体重に回復した（図３Ｄ）。これらの 傷を最少にした。毒性と有効性を調べるため、マウスの 結果は、炭素源をグリセロールで置換した食事はインビ 10 体重減少と一般的行動を常時モニターした。体重は実験 ボの酸化ストレス耐性を増強し、より高等な真核生物の 期間中毎日１回記録した。瀕死状態と判断したマウスは カロリー制限を模倣する可能性を有していることを示す 二酸化炭素麻酔により屠殺し、剖検を実施した。心毒性 。 は、急性のドキソルビシン毒性による死亡の主要な原因 【００３３】 であるので、組織レベルで障害の程度を調べるため組織 材料と方法 標本スライドを作成した。 ＬＭＡ１およびＬＴＡ１ 【００３８】 ＬＭＡ１およびＬＴＡ１は純粋な合成アミノ酸混合物に マウスにおけるグリセロール食 基づいており（１）、ハーランテクラッド社で我々のた 体重１８−２４ｇのＡ／Ｊマウスに４０％グリセロール めに１／２インチのペレット状に注文生産された。対照 食（Ｗ／Ｗ）を６日間与えた。 （ＴＤ．０７７８８）、ＬＭＡ１（ＴＤ．０７７９０） 20 本食は６０重量％のペレット（ハーランテクラッド社， 、およびＬＴＡ１（ＴＤ．０７７８９）を含むすべての Ｄｉｅｔ８６０４）と４０重量％のグリセロール（バイ 群は等カロリー食（３．９Ｋｃａｌ／ｇ）を摂餌した。 オサーブ社，米国ニュージャージー州）から成っていた 【００３４】 。簡潔には、ペレットをフードプロセッサーで細かく粉 ＬＭＡ１混合物：体重２５−３０ｇのＣＤ−１マウスに 砕し、ＵＳＰグレードのグリセロールと混合した。ペレ 化学療法前５日間正常（０．８６％）または低（０．１ ット粉末と混合する時には、グリセロールの密度（１． ７％）レベルのメチオニンを含有する純粋合成アミノ酸 ２６ｇ／ｍｌ）を考慮した。食物は４日間乾燥した。グ 混合物を予め摂餌させた。 リセロールは吸湿性であることから、大気中の湿気を吸 【００３５】 い取り、乾燥過程の最初の３日間でペレット重量を３％ ＬＴＡ１混合物：体重２５−３０ｇのＣＤ−１マウスに 増加させ、その後安定な重量を維持した。血糖値は６日 化学療法前５日間正常（０．８６％）または低（０．１ 30 目に測定した。無菌の３１ゲージ針を用いて尾静脈を最 ７％）レベルのトリプトファンを含有する純粋合成アミ 少に穿刺し、短時間出血させた。血糖値は、Ｐｒｅｃｉ ノ酸混合物を予め摂餌させた。 ｓｉｏｎ 【００３６】 ト ラボラトリーズ社）により測定した。グリセロール ラ Ｘｔｒａ血糖モニタリングシステム（アボッ は主に肝と腎で代謝されるので、これらの臓器を剖検時 に組織学的検査用に採取した。 【００３９】 マウスにおけるパラコート試験 ６日間のグリセロール食の後、マウスにパラコート（シ グマ社）を注入した。パラコートはリン酸緩衝食塩水中 40 に溶解して７．５ｍｇ／ｍｌに調製し、３１ゲージ注射 器（ベクトン ディッキンソン社）を用いて５０ｍｇ／ ｋｇを腹腔内に注入した。パラコート投与後、速やかに 動物を正常食（ハーランテクラッド社，Ｄｉｅｔ ８６ ０４）に戻した。マウスは４日間２時間毎にモニターし 、体重を実験期間中毎日１回記録した。体重測定は、グ リセロール食期およびパラコート後期の２期に分けて解 析した。マウスがストレスの徴候または痛みを示し、ま た、高度に訓練され、経験を積んだ研究者が回復の可能 性が無いと判断した時には、マウスを屠殺した。肺は主 【００３７】 50 要な標的臓器であるので、屠殺したマウスを剖検し、組 ( 11 ) JP 19 2015-186480 A 2015.10.29 20 織学的検査用に肺を採取した。簡潔には、肺のスライス 命延長に対するカロリー制限（ＣＲ）の効果は、Ｔｏｒ を４％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し ，Ａｋｔ，およびＲａｓを含む経路の下方制御が関わる 、４μｍ厚に薄切し、Ｈ＆Ｅ染色した。 かもしれない。ここで、我々は、酵母Ｓｃｈ９（Ａｋｔ 【００４０】 およびＳ６Ｋの両哺乳類キナーゼのホモローグ）が、Ｔ 文献 ＣＡサイクルと呼吸から解糖とグリセロール生合成への １．Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ｄｉｅ ＦＭ，Ｗｅｉ ｃｈｉ Ｇ，＆ ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ｉｎｇ 代謝スイッチに関連する遺伝子の共通セットを制御する Ｆ，Ｂｉａｎ ネットワークの中心成分であることを示唆する遺伝的な ＶＤ（２００８）Ｐｒｏ データおよび遺伝子発現データを提供する。経時的な生 Ｓｃｉ ＵＳＡ． ＲＡ，Ｂｕｅｈｎｅｒ Ｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｓｍｉｔｈ− Ｃ，Ｓａｆ Ｍ，Ｍａｄｉａ Ｌｏｎｇｏ ２．Ｍｉｌｌｅｒ ｎｇ Ｌ，Ｌｅｅ ＪＭ，Ｓｉｇｌｅｒ Ｗｈｅｅｌｏｃｋ Ｃｅｌｌ ＤｅＦｅｌｉｃｅ Ｒ，＆ 成し、遊離した。長寿命のｓｃｈ９Δ、ｔｏｒ１Δ、お よびｒａｓ２Δ変異株で最も上方制御されたもののうち 、グリセロール生合成遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２または Ｎ，Ｍａｔｉａｓ ＪＲ， ＲＨＲ２の欠損は、ｓｃｈ９Δ変異株における経時的寿 Ａ，＆Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＡ（ 命延長とストレス耐性を逆転させるのに十分であった。 １９９３）Ｊ Ｎｕｔｒ ４．Ｏｏｋａ １２３，２６９−２７４． Ｈ，Ｓｅｇａｌｌ 炭素源としてのグリセロールをグルコースまたはエタノ ＰＥ，＆Ｔｉｍｉｒ ＰＳ（１９８８）ＭｅｃｈＡｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ ４３，７９−９８． ５．Ｓｅｇａｌｌ ７６）Ｍｅｃｈ ＰＥ＆Ｔｉｍｉｒａｓ Ａｇｅｉｎｇ Ｓｅｇａｌｌ Ａｇｉｎｇ Ｄｅｖ ＰＳ（１９ 20 ５，１０９− ＰＳ，Ｈｕｄｓｏｎ スに対する耐性が増強された。これらの結果は、“炭素 【００４３】 Ｍａｓｏｒｏ Ｄｅｖ ＶＮ（２００１）Ｅｘｐ Ｇｅ ＥＪ（２００５）Ｍｅｃｈ ＢＫ，Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｌｉｆｅ Ａｇ ＫＫ，＆ 30 ）。Ａｋｔ／ＰＫＢは高度に保存されたセリン−スレオ ニンキナーゼであり、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉ Ｍ，Ｙａｍａｇａｍｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｔ（１９９６）Ａｒｃｈ Ｋ Ｋ，＆ ことが示されている（Ｐａｒａｄｉｓ Ｔｏｘｉｃｏ Ｅ，Ｇｉｏｒｇｉｏ Ｍ Ｓ，ＰｅｌｉｃｃｉＧ，Ｒｅｂｏｌｄｉ ＰＰ，Ｌａｎｆｒａｎｃｏｎｅ Ｌ，＆Ｐｅｌｉｃｃｉ ＰＧ（１９９９）Ｎａｔｕｒ 40 ４０２，３０９−３１３． １２．Ｒｏｇｅｒｓ １９６５）Ｊ ＱＲ Ｎｕｔｒ ｓ ｅｌｅｇａｎｓのＤａｆ−２長寿命経路で機能する ｅｔ ａｌ．， １９９９）。類似する長寿命調節経路もショウジョウバ エとマウスで同定されている（Ｋｅｎｙｏｎ，２００１ １１．Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ Ｐ，Ｐａｎｄｏｌｆｉ ａｎｄ Ｆｉｎｃｈ，２００３ Ｍ ７０，５１４−５１８． ，Ｍｅｌｅ ２００１；Ｌｏｎｇｏ ６４，１３２３−１３２８． １０．Ｍａｔｓｕｂａｒａ ，Ｋｉｔａｚａｗａ し、長寿命を調節する潜在的な機序が多くの真核生物に おいて保存されていることを示唆する（Ｋｅｎｙｏｎ， Ｍ（２００７）Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ Ａｋｔ／ＰＫＢ，Ｔｏｒ，およびＲａｓ経路の活性を減 少させる突然変異は、幾つかのモデル生物の寿命を延長 １２６，９１３−９２２． Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ Ｔａｎａｋａ 序論 ３６，１１０１−１１３６． ９．Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅ することにより、グルコース濃度が減少し、酸化ストレ 防ぐための新しい戦略を提供することを示唆する。 ＰＥ（１９８４）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ｒｏｎｔｏｌ ｌ ＤＢ，＆ ５，２３５−２４２． ７．Ａｎｉｓｉｍｏｖ ｏＩ らされる寿命延長と同様な延長がもたらされた。マウス 源置換”（ＣＳＳ）が、加齢を遅らせ、細胞を障害から ６．Ｔｉｍｉｒａｓ ｅｉｎｇ ールで置換すると、カロリー制限または絶食によりもた 食をグルコース中心の炭水化物からグリセロールに置換 １２４． ８． 欠乏させ、蓄積脂肪を減少させるが、グリセロールを合 Ｍ（２００５）Ａｇ ４，１１９−１２５． ３．Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈ ａｓ 存期間中、ＳＣＨ９欠損変異株は細胞外のエタノールを Ｇ，Ｃｈａ 10 ＆ Ｈａｒｐｅｒ ）。酵母では、哺乳類キナーゼＡｋｔ／ＰＫＢおよびＳ ６Ｋとの高度な配列同一性を共有するＳｃｈ９は、栄養 感知経路の一部であり、その下方制御は経時的寿命（Ｃ ＬＳ，非分裂酵母集団の生存時間）を３倍にまで延長す る（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ＡＥ（ ８７，２６７−２７３． Ｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。 Ｇタンパク質も進化上保存され、グルコース／ 増殖因子に応答して細胞分裂に関係する。ＲＡＳ２の欠 【実施例２】 損は酵母のＣＬＳを２倍にする（Ｆａｂｒｉｚｉｏ 【００４１】 ｔ ａｌ．，２００３）。哺乳類では、Ｒａｓの寿命制 ｅ ＳＣＨ９調節炭素源置換はカロリー制限と同様な寿命延 御における役割は確定的に証明されてはいないが、Ａｋ 長効果がある ｔとともに、ＲａｓはＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の主要な 【００４２】 メディエーターの一つであり、加齢を促進することが示 要約 されている（Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，２００４；Ｌ 酵母からマウスまでの範囲の生物において証明された寿 50 ｏｎｇｏ，２００４）。細胞増殖と細胞周期進行を調節 ( 12 ) JP 2015-186480 21 A 2015.10.29 22 するもう一つの保存されている栄養応答性経路は、線虫 ポスト Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとショウジョウバエの寿命調節と関 使用される（Ｇｒａｙ 連するとされてきたラパマイシン標的プロテインキナー ｌｌｉｅａｎｄ ゼＴＯＲを含む。ＬＥＴ−３６３／ＣｅＴＯＲのノック グルコース／エタノール培地中での増殖から水への転換 ダウンは、成中寿命の第１日目にスタートして、線虫の は、非分裂細胞の極度のＣＲ／絶食状態に似る。ＣＲの 寿命を２倍以上にした（Ｖａｌｌａｉ この極度の態様は野生型の酵母の経時的な生存率を二倍 ｅｔ ａｌ．， ダイオーキシックシフト期の間の炭素源として ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｉ Ｐｒｉｎｇｌｅ，１９８０）。酵母の ２００３）。同様に、哺乳類ｍＴＯＲ相互作用タンパク にする（Ｆａｂｒｉｚｉｏ 質ｒａｐｔｏｒの線虫相同分子種であるＤａｆ−１５の ０３）。ＲＬＳとは対照的に、ＣＲ誘発性のＣＬＳの増 活性低下は、寿命延長を促進する（Ｊｉａ 加はＳｃｈ９によって部分的にのみ介在される（Ｆａｂ ．，２００４）。ハエでは、ドミナント ｅｔ ａｌ ネガティブｄ 10 ｒｉｚｉｏ Ｌｏｎｇｏ，２０ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗｅｉ ＴＯＲまたはＴＯＲ阻害ｄＴｓｃ１／２タンパク質の過 ａｌ．，２００８）。 剰発現も寿命延長につながる（Ｋａｐａｈｉｅｔ 【００４６】 ａｌ ａｎｄ ｅｔ ．，２００４）。さらに、ＣｅＴＯＲのノックダウンは 異なる生物における栄養感知経路と寿命調節との間の連 食事制限（ＤＲ）の対象である線虫の寿命をさらに延長 鎖を示す広範な一連の成果にもかかわらず、加齢の過程 はせず、ＴＯＲ阻害は栄養豊富な食物の有害な効果から を遅らせる原因となる重要な機序はいまだに分かりにく ハエを防御するので、少なくとも一部分はＴＯＲによっ い。異なるモデル生物に見られてきた寿命延長と異なる て介在されるＤＲの有益な効果が示唆される（Ｈａｎｓ ストレスチャレンジに耐える能力との間の直接的な相関 ｅｎ 性は、細胞防御の活性化が重要な生存戦略を意味するこ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋａｐａｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。 とを示す（Ｌｏｎｇｏ 【００４４】 20 ａｎｄ Ｆａｂｒｉｚｉｏ，２ ００２）。我々の以前の研究は、スーパーオキサイドが ２種のＴＯＲ相同分子種ＴＯＲ１とＴＯＲ２が酵母で確 加齢と加齢依存性の死亡に重要な役割を果たしているこ 認されている。Ｔｏｒ１とＴｏｒ２のいずれもラパマイ とを示唆するが、スーパーオキサイドに対する防御は、 シン感受性様式における増殖関連シグナル伝達を介在す ＳＣＨ９とＲＡＳ２における突然変異の寿命に対する潜 る一方、Ｔｏｒ２は加えてアクチン細胞骨格の細胞周期 在的な効果の一部を説明するのみである（Ｆａｂｒｉｚ 依存的な構築の制御においてラパマイシン非感受性の機 ｉｏ 能を有する（Ｌｏｅｗｉｔｈ ａｌ，２００２） ｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓ２の経路との間の関係、お 。ＴＯＲ経路活性の低下は酵母の複製寿命（ＲＬＳ）の よび寿命に対するＣＲ依存性効果の機序との間の関係は 延長をもたらし、個々の母細胞によって作製される娘細 良く理解されていない。ここで、我々は、Ｓｃｈ９は言 胞の数（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍ うに及ばずＴｏｒとＲａｓによって制御される遺伝子の ｏｒｔｉｍｅｒ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９５９） 30 セットの発現変化がグリセロール生産への代謝スイッチ ａｎｄ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。カロリー制限とＳｃ は、Ｓｃｈ９不活性化の時に得られる数に匹敵する（Ｋ につながり、それは細胞防御と寿命延長の増強をもたら ａｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｋａ すという証拠を提供する。炭素源としてグルコースまた ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００５ はエタノールをグリセロールで置換することは、細胞防 ）。さらに、ハイスループット法で個々の酵母の欠損変 御と寿命延長の促進におけるカロリー制限と同様に効果 異株のＣＬＳを測定した結果、Ｔｏｒ経路に関連する遺 的である。糖類をグリセロールで置換した食事は、また 伝子欠損を保有する幾つかの長寿命株を同定した（Ｐｏ 、酸化ストレスからマウスを防御したことから、炭素源 ｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｔｏｒ１活性と 置換（ＣＳＳ）は、高等真核生物におけるカロリー制限 ＣＬＳの間の逆相関を指示するさらなる事実が最近提供 または絶食の防御効果の一部の引き金を引く可能性があ されている（Ｂｏｎａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００ ７）。 ることを示唆する。 40 【００４７】 【００４５】 結果 Ｔｏｒ１とＳｃｈ９の両酵母の加齢調節機能は、カロリ ＳＣＨ９とＲＡＳ２およびＴＯＲ１との間の遺伝的相互 ー制限（ＣＲ）依存性ＲＬＳ延長を介在する。いずれか 作用 の経路の下方制御は、培地のグルコース含有量を低下す 遺伝的アプローチを使用して、我々は、ストレスと寿命 る効果に良く似ており、ｓｃｈ９Δまたはｔｏｒ１Δ変 に対する細胞防御の調節におけるＳｃｈ９，Ｔｏｒ１， 異株がカロリー制限された時にはＲＬＳの更なる延長は およびＲａｓ２の間の関係を調べた。Ｔｏｒ１活性の欠 観察されない ａｌ． 損に起因する寿命とストレス耐性に対する効果は、Ｓｃ ，２００５ｂ）。発酵性の増殖中に生産されるエタノー ｈ９またはＲａｓ２欠損株に見られる活性ほど強固では ルは、酵母細胞が迅速な増殖から遅い出芽へと転換し、 ない。我々は、ｓｃｈ９Δノックアウト株とｔｏｒ１Δ （Ｋｅａｂｅｒｌｅｉｎ ｅｔ 実質的に増殖を止めるダイオーキシックシフト期および 50 ｓｃｈ９Δ二重ノックアウト株との間の平均寿命また ( 13 ) JP 23 2015-186480 A 2015.10.29 24 はストレス耐性の何らかの有意差を見出さなかった（図 伝子を活性化するストレス応答性転写因子（ＴＦｓ）Ｍ ４Ａおよび４Ｇ）。対照的に、ＳＣＨ９プロモーター域 ｓｎ２／４およびＧｉｓ１を正に調節する。興味深いこ にトランソポゾン挿入を有する変異株におけるＴＯＲ１ とに、Ｒａｓ２欠損に関連するストレス耐性と寿命延長 の欠損は、ＳＣＨ９発現のみを減少させる（Ｆａｂｒｉ の増強は、ＳＴＲＥ結合ＴＦｓＭｓｎ２／４とＰＤＳ結 ｚｉｏ ａｌ．，２００１）が、この欠損は、熱 合Ｇｉｓ１の両方を必要とする一方、ｓｃｈ９Δ介在性 およびスーパーオキサイド産生剤メナジオンに対する耐 の長寿命調節は、主に後者に依存する（Ｆａｂｒｉｚｉ 性の更なる増強をもたらしたが、過酸化水素に対する耐 ｏ ｅｔ 性の増強はもたらされなかった（図４Ｂ）。このことは ２００８）。これらの結果は、共通の下流エフェクター 、ＴＯＲ１がＳｃｈ９経路の更なる不活化に寄与するこ がＳｃｈ９とＲａｓ２によって異なって調節されること とを示唆する。この結果は、Ｓｃｈ９がラパマイシン感 10 を示す。事実、ｒａｓ２Δｓｃｈ９Δ二重ノックアウト 受性Ｔｏｒ複合体Ｉ（ＴＯＲＣ１）の直接標的であるこ 細胞は、それぞれ単独の欠損変異株に比べてより高いス とを示す最近の研究と一致する（Ｕｒｂａｎ ａ トレス耐性を示した（図４Ｄ）。該二重ノックアウト細 ｌ．，２００７）。事実、ＴＯＲＣ１成分をコードする 胞は、また、野生型細胞に比べ平均寿命における５倍の ＴＣＯ８９の欠損、またはラパマイシン処理のいずれか 増加を示した（図５Ｇ）。しかし、ｓｃｈ９Δｒａｓ２ によってＴＯＲＣ１の活性を減少させると、熱および過 Δｔｏｒ１Δ三重欠損変異株は、寿命とストレス耐性に 酸化水素に対する細胞耐性が増強される。Ｓｃｈ９活性 つき何らの更なる増強も示さなかった（図４Ｄおよび４ は、突然変異頻度の加齢依存性の増加と関連するので（ Ｇ）。これらの結果は、Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９とＲａｓによ Ｆａｂｒｉｚｉｏ ａｌ．，２００５）、我々は って制御されるシグナル伝達系に平行して、しかし一部 経時的変化の間のゲノム不安定性調節におけるＳｃｈ９ は連結して構成される寿命調節ネットワークを表す（図 とＴｏｒ１との間の相互作用を調べた。ｔｏｒ１Δ変異 20 ４Ｈ）。 株は１日目と７日目の間のゲノム不安定性（ＣＡＮ１遺 【００５０】 伝子の加齢依存性突然変異頻度で測定した）に対する感 長寿命変異株の遺伝子発現特性 受性が野生株よりやや低い一方、ｔｏｒ１Δｓｃｈ９Δ Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９経路とＲａｓ経路の下流にある寿命延 二重変異株における突然変異頻度の変化はｓｃｈ９Δ変 長のメディエーターを調べるため、我々は、３つの主要 異株の該変化に比べ有意ではなかった（図４Ｅ）。ＴＯ な長寿命変異株：ｓｃｈ９Δ，ｔｏｒ１Δおよびｒａｓ Ｒ１の過剰発現は、ｓｃｈ９Δのストレス耐性形質をや ２ΔのすべてにつきＤＮＡマイクロアレイ解析を実施し や減少させたのみであった。しかし、ｔｏｒ１Δのスト た。２．５日培養の長寿命変異株と野生型細胞から全Ｒ レス耐性と寿命延長はＳＣＨ９の過剰発現によって消滅 ＮＡを抽出した。この日数は、未だ分裂しているより若 した（図５Ｆ）。まとめると、これらのデータは寿命調 い日数（１−２日目）の細胞の小さなフラクションから 節におけるＴｏｒとＳｃｈ９との間の共有のシグナル伝 30 生ずる可能性があるノイズならびにより遅い日数（４− 達経路と一致し、Ｓｃｈ９シグナル伝達におけるＴｏｒ ５日目）において正常に生ずる全般的な代謝低下とその １の上流の役割を示唆する（図４Ｈ）。 結果としての遺伝子発現の低下のいずれも避けるために 【００４８】 選択された（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ＴｏｒとＲａｓ／ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達のいず ２００３）。全ＲＮＡから得られたｃＲＮＡをＳ．セレ れもストレス応答性（ＳＴＲＥ）遺伝子を調節すること ビシエに存在する５８４５遺伝子の内５８４１遺伝子の が知られている（Ｚｕｒｉｔａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａ 検出を許容する遺伝子チップとハイブリダイズした。各 Ｃａｒｄｅｎａｓ，２００５）。構造的に活性な 遺伝子型の３つの独立集団を解析した。計８００遺伝子 ｎｄ ｅｔ Ｒａｓ２（ｒａｓ２ ｅｔ ｖ ａ ｌ １ ９ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｅｉ ａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｌｏｎｇｏ， ）を異所性に発現するこ は、野生型細胞に対して２倍を超える発現の変化を示し とによってＲａｓ活性を増強させると、ｔｏｒ１Δ変異 た。これらの中で、６３遺伝子は、３つの変異株のすべ 株の寿命延長とストレス耐性が逆転された（図４Ｆ）。 40 てにおいて２倍を超えて上方制御され、２５遺伝子は一 反対に、ＲＡＳ２の欠損は、ストレス耐性に関してｔｏ 貫して下方制御されていた（図５Ａ）。最も上方制御さ ｒ１Δに対する相加効果をもたらすが、寿命については れた７種のｍＲＮＡレベルおよびｔｏｒ１Δおよびｓｃ 相加効果をもたらさなかった（図４Ｃおよび４Ｇ）こと ｈ９Δ変異株のいずれにおいても最も下方制御された遺 から、Ｔｏｒ１とＲａｓ２による寿命調節の重複が示唆 伝子の１種を定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザ された。 ンブロットにより確認した。長寿命変異株の対比較に基 【００４９】 づき、長寿命変異株では上方および下方制御遺伝子は有 我々は、以前にＴｏｒ１，Ｓｃｈ９，およびＲａｓ２に 意に重複しており、このことから、Ｒａｓ，Ｔｏｒ，お よって調節される寿命の調節が、プロテインキナーゼＲ よびＳｃｈ９を中心とする寿命調節ネットワークが下方 ｉｍ１５に収斂することを示した（Ｗｅｉ 制御遺伝子の共通のセットを制御していることが示唆さ ｅｔ ａｌ ．，２００８）。Ｒｉｍ１５は、細胞防御に関与する遺 50 れた（表１）。これら３つの長寿命変異株に共通する特 ( 14 ) JP 25 2015-186480 A 2015.10.29 26 徴を調べるため、我々は、ウィルコキソンランクテスト 変異株がグルコース取り込みが最大化される絶食様モー によるマイクロアレイデータの遺伝子オントロジー（Ｇ ドに入っている可能性が示された。変異株および野生型 Ｏ）解析を行った。 細胞では１−２日目には細胞外グルコースが枯渇してい データは、３つの長寿命変異株すべてに共通の変化を示 ることを考慮すると、２．５日目に発酵用に使用可能な しているが、ＧＯカテゴリー解析は、ｒａｓ２Δ変異株 主要な基質は、おそらく後期指数増殖期にある酵母によ および他の２変異株との間の発現パターンの相違を示し って正常に蓄積されているグリコーゲンであろう（Ｗｅ た。この結果は、我々のＳｃｈ９およびＲａｓ２によっ ｒｎｅｒ−Ｗａｓｈｂｕｒｎｅｅｔ て制御される２つのパラレルシグナル伝達経路の遺伝的 ）。 解析と一致し、同一の寿命調節経路におけるＳｃｈ９と 【００５４】 Ｔｏｒの役割と合致する（表１および図４Ｈ）（Ｗｅｉ 10 静止期生存率、胞子形成、減数分裂およびストレス応答 ，２００８）。 に関わる遺伝子（ＦＭＰ４５，ＧＲＥ１，ＩＭＥ１，Ｒ 【００５１】 ＰＩ１，ＳＰＳ１００，およびＴＡＨ１）は３つの長寿 ａｌ．，１９９３ 命変異株すべてにおいて最も上方制御された遺伝子の中 にあった。長寿命変異株における寿命延長およびストレ ス耐性へのこれらの寄与を調べるため、われわれは、最 も上方制御された遺伝子の一つと組み合わせて、ＳＣＨ ９，ＲＡＳ２，またはＴＯＲ１の欠損を保有する二重変 異株のセットを創出した。ＦＭＰ４５またはＹＤＬ２１ ８Ｗのいずれかの欠損はｓｃｈ９Δ変異株の平均寿命を 20 やや減じた（図５Ｂ）一方、ｒａｓ２Δ変異株には効果 はなかった。ＩＭＥ１またはＲＰＩ１の欠損は、Ｓｃｈ ９の欠損に起因するストレス耐性または寿命延長のいず れにも影響しなかった（図５Ｂ）。最も下方制御された 遺伝子ＹＬＲ０１２Ｃ欠損は、該細胞の寿命またはスト レス耐性に有意に影響しなかった。 【００５５】 エルゴステロール生合成において機能するタンパク質を コードする幾つかの遺伝子は長寿命変異株では上方制御 されていた。エルゴステロールは酵母では優勢なステロ 30 ールであり、構造的にコレステロールと密接に関連する 。細胞膜の構造成分であることに加え、エルゴステロー ルはリン脂質合成、脂質ラフト形成、シグナル伝達、お 【００５２】 よび好気的なエネルギー代謝に影響する（Ｐａｒｋｓ 長寿命変異株の発現特性の遺伝子オントロジー解析（Ｇ ｅｔ Ｏ）。有意な上方または下方制御カテゴリーを示す（ｐ のいずれかの欠損はｓｃｈ９Δ変異株の熱および酸化ス ＜０．０１）。多試験エラーを修正するためｑ値も算定 トレス耐性のいずれにも有意な減少の原因となる。しか した。 し、われわれのマイクロアレイ解析で最も上方制御され 【００５３】 たエルゴステロール生合成遺伝子ＥＲＧ５の欠損は、ｓ 寿命延長に関連する代謝変化 ｃｈ９Δ変異株と関連する寿命延長または低ストレス耐 長寿命変異株と野生型細胞との間の遺伝子発現特性の比 40 性を逆転させなかった。特に３つの長寿命変異株すべて 較により、ＴＣＡサイクル、酸化的リン酸化、ミトコン で上方制御されたエルゴステロール生合成遺伝子は、ス ドリアリボソームタンパク質、およびミトコンドリア標 クワレンからエルゴステロールへの変換に関わる遺伝子 的タンパク質の機能を含むミトコンドリアタンパク質を であり、分子状酸素を要求し、しばしばＮＡＤＰＨから コードする遺伝子の一貫した下方制御が示された。解糖 ＮＡＤＰ 系／発酵系遺伝子発現は代わりに上方制御されたが、糖 この上方制御は、これらの長寿命変異株のポスト・ダイ 新生遺伝子は上方制御されなかった。興味深いことに、 オーキシック期生存期間中の低酸素環境を反映し、そし 高グルコース濃度で阻害されることが知られる（Ｏｚｃ て、細胞の酸化還元状態と生存との関連を示唆している ａｎ ａｎｄ ａｌ．，１９９５）。ＨＭＧ１またはＥＲＧ２８ ＋ への酸化に関わる。 Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９９９）高親和性 のかもしれない。まとめると、これらの結果は、長寿命 グルコース輸送体または仮想のグルコース輸送体をコー 変異株中で最も上方制御された遺伝子の中で、多くの単 ドする幾つかの遺伝子は、上方制御されており、長寿命 50 一遺伝子の欠損は寿命には殆ど効果がないことを示して ( 15 ) JP 2015-186480 27 A 2015.10.29 28 いる。 長に必要である 【００５６】 グリセロール生合成の寿命制御における役割をさらに調 長寿命変異株におけるグリセロール生合成遺伝子の高発 べるため、我々は、ｓｃｈ９Δの背景における酵母ＤＬ 現 −グリセロール−３−ホスファターゼＲｈｒ２を欠損す ＴＣＡサイクル遺伝子および呼吸遺伝子の低発現と解糖 る株を作製した。このｒｈｒ２Δｓｃｈ９Δ二重変異株 系／発酵系遺伝子の高発現に加えて、我々は、解糖流量 は、グリセロールを細胞外に蓄積することができなかっ と限定された呼吸能の増強がある場合に、オーバーフロ た（図８Ａ）。ＲＨＲ２の欠損は、ＤＢＹ７４６遺伝的 ーした代謝の副産物であるグリセロールの代謝に関与す 背景におけるＳＣＨ９の欠損と関連する寿命延長ならび る遺伝子が上方制御されることも観察した（図６Ａおよ にＤＢＹ７４６遺伝的背景におけるＳＣＨ９の欠損に関 び６Ｂ）。グルセロール代謝に関与する遺伝子（２１遺 10 連する熱および酸化ストレス耐性を破壊した（図８Ｂお 伝子）の有意な上方制御がｓｃｈ９Δおよびｒａｓ２Δ よび８Ｃ）。酵母ＫＯコレクション（ＢＹ４７４１の遺 変異株に観察された（それぞれｐ値０．００５８および 伝的背景）を用いて、我々は、グリセロール生合成鍵遺 ０．０１４２，ウィルコキソンランクテスト、片側）。 伝子欠損株においてＳＣＨ９を欠損させた。ＮＡＤ依存 酵母では、グリセロールは解糖中間物であるトリアシル 性グリセロール−３−リン酸脱水素酵素遺伝子のＧＰＤ グリセロールまたはジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨ １またはＧＰＤ２のいずれかの欠損は野生型ＢＹ４７４ ＡＰ）のいずれかから生産される（図６Ａ）。トリアシ １細胞における有意な寿命の変化をもたらさなかった。 ルグリセロールの加水分解を担うリパーゼをコードする しかし、ＧＰＤ１またはＧＰＤ２のいずれかの欠損は、 遺伝子は、やや上方制御される一方、ＤＨＡＰからのグ Ｓｃｈ９欠損と関連する寿命延長の逆転につながった（ リセロール生産に要求される鍵酵素をコードしているＧ 図８Ｄ）。同様に、ＲＨＲ２の欠損はｓｃｈ９Δ変異株 ＰＤ１およびＧＰＤ２は、長寿命変異株の全てにおいて 20 の寿命延長を破壊した（図８Ｄ）。対照的に、ＤＬ−グ より高い発現レベルを示し（図６Ｂおよび６Ｃ）、これ リセロール−３−ホスファターゼの重複性イソザイムの らの変異株によって利用されるグルコースの一部はグリ Ｈｏｒ２欠損は、ｓｃｈ９Δ変異株の寿命には影響しな セロール生合成に向けられることが示唆された。 かった。これら２つのイソザイムの相違は、Ｒｈｒ２は 【００５７】 細胞における優勢なイソザイムであるという事実で説明 事実、３日目に野生型細胞と比較してｓｃｈ９Δ変異株 できよう（Ｎｏｒｂｅｃｋ では高レベルの細胞内グリセロールが観察された（図７ ）。Ｒｈｒ２の主要な役割と一致して、Ｒｈｒ２のイン Ａ）。野生型細胞では、細胞外グリセロールレベルは２ ヒビターをコードするＹＩＧ１のｍＲＮＡレベル（Ｇｒ 日目にはピークに達したが、３日目までには大部分が枯 ａｎａｔｈ 渇していた。しかし、ｓｃｈ９Δ培養では、９日目まで すべてにおいて下方制御されていた（図６Ｂ）。特に、 の培養液中ではるかに高いレベルのグリセロールが測定 30 一部のｒｈｒ２Δ培養は再増殖／ギャスピングｇａｓｐ された（図７Ｂ）。 ｉｎｇを示したが、ＢＹ４７４１の遺伝的背景にあるｒ 対照的に、指数増殖中（たいがいはポスト ダイオーキ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ｅｔ ａｌ．，２００５）は長寿命変異株 ｈｒ２Δ変異株の寿命は、野生型細胞と同様であった（ シック期であるが）に生産されたエタノールは、ｓｃｈ Ｆａｂｒｉｚｉｏ ９Δ変異株では初期には枯渇していたが、野生型細胞で 【００５９】 ｅｔ は枯渇せず（図７Ｃおよび７Ｄ）（Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｒｈｒ２およびＨｏｒ２のいずれも欠損する細胞は、ス ｅｔ ａｌ．，２００５）、野生型細胞におけるエタノ ーパーオキシドアニオン生成剤パラコートに高感受性で ールの生合成と遊離からｓｃｈ９Δ変異株におけるグリ あることが示されており、浸透ストレスを超えた細胞防 セロールの生合成と遊離への代謝スイッチが示唆された 御におけるグリセロール生合成の役割が示唆される（Ｐ 。グリセロール蓄積は、他の炭素源の枯渇によっても同 ａｈｌｍａｎ 時に起こり得た。脂肪体のナイルレッド染色により、ｓ 40 ｃｈ９Δ変異株のストレス耐性におけるグリセロール生 ｃｈ９Δ変異株ではトリアシルグリセロールおよび他の 合成遺伝子の役割を試験した。熱およびペルオキシド誘 中性脂肪のレベルが野生型細胞に比べすべての日数で一 発酸化ストレスに対する高感受性はＲＨＲ２ヌル株に観 貫して低いことが示された（図７Ｅ）。このことは、脂 察されたが、ＢＹ４７４１を背景とするｇｐｄ１Δ，ｇ 質をグリセロールに変換する脂肪分解性酵素のｍＲＮＡ ｐｄ２Δ，またはｈｏｒ２Δ変異株では観察されなかっ レベルが、わずかではあるが一貫して増加していたこと た（図８Ｅ）。さらに、Ｒｈｒ２インヒビターＹｉｇ１ と一致する。細胞外グリセロールの蓄積は、また、ｔｏ を欠損する細胞は、野生型細胞を少し上回るストレス耐 ｒ１Δおよびｒａｓ２Δ変異株でも生じたが、ｓｃｈ９ 性であった（図８Ｅ）。ｓｃｈ９Δ変異株のストレス耐 Δ変異株で観察されたものに比べてより低かった。 性形質は、ＧＰＤ１，ＧＰＤ２，またはＲＨＲ２の欠損 【００５８】 によって部分的に逆転した（図８Ｅ）。グリセロール生 グリセロール生合成遺伝子はｓｃｈ９Δにおける寿命延 50 合成経路における一つの酵素の欠損が他の酵素の活性化 ｅｔ ａｌ．，２００４）。 ａｌ．，２００１）。我々は、ｓ ( 16 ) JP 29 2015-186480 A 2015.10.29 30 によって代償され得るようなストレスに対するグリセロ 般的なストレス応答の一部である可能性が示唆された。 ール介在性の応答の重複性があるように思われる。ＳＣ これらのデータは、高浸透圧増殖条件が酵母におけるＲ Ｈ９の欠損は、おそらくＨｏｒ２レベルの上方制御によ ＬＳとＣＬＳを延長するという報告とも一致する（Ｋａ るｒｈｒ２Δの熱および過酸化水素に対するストレス耐 ｅｂｅｒｌｅｉｎ 性を大いに増強した。グリセロールホスファターゼ（Ｒ ｋａｍｉ ｈｒ２およびＨｏｒ２）はグリセロール生産の律速酵素 関して、長寿命ｓｃｈ９Δ変異株でグリセロール濃度が ではない（Ｐａｈｌｍａｎ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかし、寿命に ａｌ．，２００１） 高い培養３日目（図７Ｂ）に野生型酵母に細胞外グリセ ので、Ｇｐｄ１およびＧｐｄ２の上方制御は、ＳＣＨ９ ロールを添加したが（０．１％および１％）、何らの有 欠損細胞におけるｒｈｒ２Δストレス感受性形質の救援 益な効果も示されなかった（図９Ｅ）。 に寄与する可能性もある。同様な重複はＧｐｄ１および 10 【００６２】 Ｇｐｄ２間にも存在する。どちらかの単一欠損変異株で グリセロールはカロリー制限の加齢効果に影響せずに炭 は、有るか無しかの効果であるが、ｇｐｄ１／２Δ二重 素源を供給する ノックアウト株は熱および過酸化水素処理に高感受性で エタノールは炭素源としてプロエイジングシグナル伝達 ある。ｓｃｈ９Δｇｐｄ１Δｇｐｄ２Δ三重変異株は液 を誘発し、細胞死を促進する。 体培養において厳しい増殖欠損と低い飽和密度を示し、 蒸発させる、または酵母を使い古された培地から水に切 上位研究のためのこの変異株の使用中止を余儀なくされ り替えることのいずれかによってエタノールを除去する た。まとめると、これらの結果は、ＳＣＨ９欠損変異株 という極度のカロリー制限／絶食条件を提供することに における細胞防御と寿命延長の促進にグリセロール生合 よって、酵母の経時的寿命が延長される（Ｆａｂｒｉｚ 成が重要性であることを強調する。 ｉｏ 【００６０】 20 グリセロール依存性寿命延長の機序 ｅｔ ａｌ．，２００５）。このエタノール利用 とグリセロール生合成の代謝的切り換えは、プロエイジ ング炭素源（グルコースとエタノール）の有害な効果を グリセロールは、部分的にその化学シャペロンとしての 除去し、ｓｃｈ９Δ変異株の培養におけるカロリー制限 機能の故に、ストレスを防御できる（Ｍｅｎｇ に似た環境を作成する（図７Ｄ）。酵母の生存における ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｅｏｃａｒｉｓ，２００６；Ｗｏ 異なる炭素源の役割を解明するため、我々は、プレート ｊｄａ，２００３）。グリセロールの熱誘導タンパク質 上で細胞の生存をモニターするインサイツアッセイを使 ミスフォールディングに対する防御の役割を調べるため 用した。この方法は、われわれが、ａ）他のすべての栄 、我々は野生型細胞とｓｃｈ９Δ細胞における熱感受性 養の存在下で異なる炭素源の効果を調べること、ｂ）カ の細菌ルシフェラーゼ（Ｐａｒｓｅｌｌ ａｌ． ロリー制限のＲＬＳ研究に使用される実験条件と同様な ，１９９４）の活性喪失と回復を調べた。野生型細胞を ｅｔ 、全実験にわたり細胞が暴露される炭素源の量を正確に 熱ストレス（５５℃、１時間）に暴露させた結果、∼８ 30 制御することを可能にした。 ０％のルシフェラーゼ活性の低下があったが、ｓｃｈ９ 【００６３】 Δ変異株では２０−４０％の活性喪失のみが観察された １日齢のトリプトファン栄養要求性細胞をトリプトファ （図９Ａ）。この結果は、ｓｃｈ９Δ変異株のストレス ン欠損ＳＣプレート（ＳＣ−Ｔｒｐ）に播種した。２日 耐性形質の増強と一致する（図４）。しかし、野生型細 毎に、同じ日に作成した一連のプレートの一つにトリプ 胞を低濃度のグリセロールで前処理したが、ルシフェラ トファンを加えて増殖させ、生存をモニターした。我々 ーゼ活性の熱誘導による喪失と回復に対する効果はなく は、コロニー形成をモニターして細胞の生存率を決定し （図９Ｂ）、ｓｃｈ９Δの熱耐性形質は細胞外グリセロ た。２％グルコース添加ＳＣプレートに播種した約２０ ールに依存しないことが示された。ＢＹ４７４１の遺伝 ０個の野生型ＤＢＹ７４６細胞の生存曲線は、標準液体 的背景において同様な結果が得られた。 培地例の該曲線と良く似ている（図９Ｆ）。ＳＣ−Ｔｒ 【００６１】 40 ｐプレートから炭素源を除去すると、平均寿命の７０％ グリセロールの細胞内蓄積は浸透ストレスに対する防御 増加がもたらされたが、この増加は低濃度のエタノール にも寄与する（Ａｌｂｅｒｔｙｎ の存在により部分的に逆転され（図９Ｆ）、我々の以前 ９４；Ｗｏｊｄａ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９ ａｌ．，２００３）。培地に の知見と一致した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， ０．１％のグリセロールを添加した結果、野生型酵母の ２００５）。グルコースの高レベルグリセロール（３％ 浸透ストレス耐性がわずかに増強された（図９Ｃ）。高 ）による置換はグルコースまたはエタノールで見られた 濃度のＮａＣｌに暴露された場合、ｓｃｈ９Δ変異株と ようなプロエイジングの引き金を引くことはなかった（ ｒａｓ２Δ変異株は、ｔｏｒ１Δ変異株に比べ高浸透圧 図９Ｆ）。従って、長寿命ｓｃｈ９Δ変異株におけるグ に対する耐性の増強を示し、同様に野生型細胞よりも優 リセロール生合成への代謝スイッチは遺伝的に誘発され れた防御であったことから（図９Ｄ）、高浸透圧に対す る「炭素源置換」を表し、カロリー制限の場合と同様に る耐性の増強は、すべての長寿命変異株に共有される一 50 効果的であり得るといえよう。 ( 17 ) JP 31 2015-186480 A 2015.10.29 32 【００６４】 の後５０ｍｇ／ｋｇのパラコートを腹腔内に１回投与さ グリセロール培地にスイッチ後の寿命延長はＣＲ転写因 れ、正常食（８６０４固形飼料）に戻された。パラコー 子に依存する トは肝細胞と肺細胞のＳ期停止をもたらし（Ｍａｔｓｕ カロリー制限により誘発される酵母の細胞防御と寿命延 ｂａｒａ 長は、プロテインキナーゼＲｉｍ１５およびその下流の が知られている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ストレス応答性転写因子Ｍｓｎ２／４とＧｉｓ１に依存 ，１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃ し、これらのすべてはＳｃｈ９，Ｔｏｒ，およびＲａｓ ｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４０２／ｎ６ により負に調節されている（Ｗｅｉ ｅｔａｌ．，２０ ７５９／ｆｕｌｌ／４０２３０９ａ０．ｈｔｍｌ−ａ１ ０８）。酵母をグルコース（２％）またはグルコース／ 。対照群のすべてのマウスは３日までに死亡したが、グ グリセロール（各１％）のいずれかを含有する等カロリ 10 リセロール食のマウス５匹の内３匹はパラコート毒性を ー培地で増殖させると、グルコース／グリセロール培地 完全に防御し（図１０Ｃ，ｐ＜０．０５）、パラコート 中で培養した酵母において平均寿命の１．５倍の増加が 処理５日後には正常な体重に回復した（図１０Ｄ）。こ 観察された（図９Ｇ）。このグルコース／グリセロール れらの結果は、炭素源をグリセロールで置換した食事は 食の長寿命効果はカロリー制限の場合と同様、大部分が 、インビボの酸化ストレス耐性を増強し、高等真核生物 ストレス応答性転写因子に依存していた（図９Ｇ）。 におけるカロリー制限に似た可能性を有することを示し 【００６５】 ている。 グリセロールはｓｃｈ９Δ変異株によって取り込まれる 【００６７】 ｓｃｈ９Δ変異株における代謝スイッチは、グルコース 考察 ／エタノールまたは他の炭素源からプロエイジング／死 酵母、虫、ハエ等のモデル生物は、共通の進化起源を有 シグナル伝達を除去するだけでなく、長期間生存のため 20 する寿命調節経路の発見のための道具である。これらの の炭素源も生産する。我々は、野生型細胞をエタノール 内、インスリン／ＩＧＦ−Ｉ様経路は、酵母とマウスの 含有培地から０．１％グリセロールを含有する水に切り ように系統発生学的に遠い生物の長寿命を制御している 換えた。極度のカロリー制限によるものに加えて寿命の 。Ａｋｔ，Ｔｏｒ，およびＲａｓは哺乳類のＩＧＦ−Ｉ わずかな延長が観察され（図９Ｈ）、グリセロールが飢 シグナル伝達経路で機能し、異なるモデル生物で寿命調 餓条件下で栄養補給またはさらなる防御を提供する可能 節に関連している（Ｋｅｎｎｅｄｙ 性が示唆された。事実、我々は、大部分の細胞外グルコ ００７；Ｌｏｎｇｏ ースが欠乏した後にポスト・ダイオーキシック期に入っ 。本研究では、我々は、長寿命調節経路が呼吸から解糖 たＳ．セレビシエが外部の［１，２，３− ３ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、死亡に至ること ｅｔ ａｌ． ｅｔ ａｌ．，２ ａｎｄ Ｆｉｎｃｈ，２００３） Ｈ］グリセ およびグリセロール生合成へのシフトを制御しているこ ロールを活発に取り込むことを示す（図９Ｉ）。グリセ とを示す。プロエイジングの炭素源とグリセロール蓄積 ロールのかかる利用は、また、野生型細胞においてグリ 30 の除去につながるこの代謝切り換えは、炭素源を除去す セロールの異化に関与する遺伝子が極度のカロリー制限 ることなしにカロリー制限に似るｓｃｈ９Δ培養の環境 ／絶食（水）条件下で上方制御されることを示す我々の を作る。 マイクロアレイ解析により支持される。 【００６８】 【００６６】 遺伝的データとゲノムデータは、我々の以前の仕事に一 食事性の炭素源としてのグリセロールの置換はマウスに 致する、Ｓｃｈ９とＲａｓによって制御される２つの平 おけるストレス耐性を増強する 行する長寿命シグナル伝達経路を示した（Ｆａｂｒｉｚ カロリー制限は、酵母から哺乳類の範囲のモデル生物に ｉｏ おいてストレス耐性を増強し、寿命を延長する（Ｌｏｎ 性の有益な効果は相加的であり（図４Ｄおよび４Ｇ）、 ｇｏ，２００３； ｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ二重変異株は、最も長寿命な遺伝 Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２ ｅｔ ａｌ．，２００１）。両経路の低下した活 ００７；Ｍａｓｏｒｏ，２００５）。グリセロールを炭 40 的変異株の一つである（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ ａｎｄ 素源として置換すると酵母の寿命とストレス耐性に有益 Ｇｅｍｓ，２００２）。遺伝的データと一致して、２． な効果が見られるという観点から、我々はマウスにおけ ５日齢のｒａｓ２Δ変異株の遺伝子発現特性は、分別的 るＣＳＣの効果を調べた。１群５匹、２群のマウスにそ に発現する遺伝子の約６７％が他の二つの変異株では有 れぞれ対照食（４０％デンプン／ショ糖／マルトースデ 意に変化しないことを示す（図５Ａ）。我々のＴｏｒ経 キストリン添加固形飼料Ｔｅｋｌａｄ ８６０４）また 路と他の２つの寿命調節経路との間の相互作用について はグリセロール食（４０％グリセロール添加）の等カロ の遺伝的解析により、ストレス耐性、長寿命、および加 リー食のいずれかを６日間自由に与えた。グリセロール 齢に依存するゲノム不安定性の調節におけるＴｏｒ１経 食のマウスは、対照食のマウスよりわずかに多く摂餌し 路とＳｃｈ９経路の間の強い重複が示された。他の研究 たが、６日目までには両群のマウスは１８％の血糖低下 者が提供してきたもの（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。両群のマウスはそ 50 ｌ．，２００４）、およびＴＯＲＣ１によるＳｃｈ９の ｅｔ ａ ( 18 ) JP 2015-186480 33 直接リン酸化の証明（Ｕｒｂａｎ A 2015.10.29 34 ａｌ．，２０ いる。増殖に必要なエネルギーは主に発酵から得られる ０７）と一致して、ＴＯＲＣ１はＳｃｈ９の上流でこれ 。対照的に、我々の経時的長寿命研究は、発酵が最小化 らの読み出しの調節に機能することも示唆する。我々の される非分裂期における集団の生存率をモニターするこ マイクロアレイ解析は、ＴｏｒとＲａｓによって制御さ とによって実施されている（Ｆａｂｒｉｚｉｏ れる一連の遺伝子間の類似点だけでなく相違点も示して Ｌｏｎｇｏ，２００３）。 いる。一方、ＴＯＲ１欠損は、ｒａｓ２Δ変異株の熱シ 【００７０】 ョック耐性をさらに増強し、他方では、さらなる寿命延 長寿命変異株の遺伝子発現特性は、鍵遺伝子の発現誘導 長は見られなかった。さらに、構造的な活発なＲａｓ２ にはグリセロール生合成を必要とすること示した。ｓｃ の過剰発現は、ＴＯＲ１の欠損に関連してＣＬＳ延長を ｈ９Δ培養において高レベルの細胞外および細胞内グリ 破壊し、２つの経路とおそらくＴＯＲＣ１上流の役割と 10 セロールが検出され、トリクリセリドの異化がグリセロ の重複が示唆された。 ール産生に寄与すると思われた（図７）。 【００６９】 このグリセロール産生へのシフトは、長寿命変異株の生 ｒａｓ２Δ変異株に見られた高度の異なる発現特性にも 理機能における基礎的な代謝変化を表す。興味深いこと かかわらず、３つの長寿命変異株のすべてにおいて重要 に、Ｓｉｒ２ならびにもう一つのＣＲに依存し、および な代謝経路に関わる遺伝子の発現パターンに有意な同一 依存しない寿命調節関連の遺伝子を欠損する変異株（Ｋ 性がある。ゲノム規模の関連性（転写因子結合モチーフ ａｅｂｅｒｌｅｉｎ 濃縮試験）と遺伝的解析により、Ｔｏｒ／Ｓｃｈ９およ ｅｂｅｒｌｅｉｎ びＲａｓシグナル伝達による長寿命の調節は、プロテイ ｅｔ ンキナーゼＲｉｍ１５とその下流のストレス応答性転写 タノールも枯渇している（Ｆａｂｒｉｚｉｏ 因子Ｍｓｎ２／４およびＧｉｓ１に依存することが示さ 20 ｌ，２００５）。ｓｃｈ９Δ変異株の様なｓｉｒ２Δ変 れた（Ｃｈｅｎｇ 異株の発現特性解析は、グリセロール生合成遺伝子の上 ｅｔ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｅｉ ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｉｎ ａｌ．，２０００）は、プロエイジング炭素源エ ｅｔ ａ ａｌ，２００８）。最も顕著な結果は、３つの長 方制御を示し、Ｓｉｒ２依存性の寿命調節におけるグリ 寿命変異株すべてで解糖／発酵に関与する遺伝子が一貫 セロール生合成の役割が示唆された（Ｆａｂｒｉｚｉｏ して上方制御される一方、ミトコンドリアに関与する遺 ｅｔ ａｌ．，２００５）。 伝子は３つの長寿命変異株のすべてで下方制御されたこ 【００７１】 とであり、解糖ならびにＴＣＡサイクルと酸化的リン酸 ｓｃｈ９Δ変異株におけるグリセロール生合成に必要な 化を含むミトコンドリア機能の減少を支持する細胞状態 遺伝子を欠損させることによってなされる遺伝的解析は が示唆された。我々の結果の一部は、ｔｏｒ１Δ変異株 、グリセロールの生産が寿命の調節とストレス耐性に必 では呼吸が上方制御されていることを示す最近の結果（ 要であることを示している（図８）。グリセロール生合 Ｂｏｎａｗｉｔｚ 成の増加は、幾つかの明瞭な機序による寿命調節に寄与 ｅｔ ａｌ，２００７）と矛盾する 30 と思われる。この矛盾は、観察の時点が異なることによ する可能性がある。第一に、Ｓｃｈ９を欠損する細胞は って説明が可能であろう。Ｂｏｎａｗｉｔｚと共同研究 、グルコースとエタノールを利用し、非プロエイジング 者らは、野生型酵母に関連して指数増殖期または培養１ 炭素源であるグリセロールを蓄積し、蓄積されたグリセ 日目のｔｏｒ１Δにおいてより高い呼吸率を測定した。 ロールは効率的に“自ら課した”ＣＳＳをもたらし、増 ２日目までにはこの違いはもはや観察されなかった（Ｂ 殖培地中のグルコースを低下させ、またはエタノールを ｏｎａｗｉｔｚ 除去することによって得られるＣＲは、酵母のＣＬＳを ｅｔ ａｌ．，２００７）。複製寿命 における呼吸の役割はいまだ明らかではない。一方では 延長する（Ｆａｂｒｉｚｉｏ 、増加した呼吸はＣＲ（０．５％グルコース）の有益な ；Ｓｍｉｔｈ 効果を介在することが示されており（Ｌｉｎ ｌ．， ｅｔ ａ ２００２）、もう一方で、低グルコース含有培 40 地（０．０５％グルコース）上での増殖は、呼吸欠損酵 母の複製寿命を延長することができる（Ｋａｅｂｅｒｌ ｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５ ａｌ．，２００７；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。反対に、低濃度のエタノールを 添加することにより、ＣＲまたはＳＣＨ９欠損により誘 発された寿命延長は逆転させられる（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ここに、我々は、Ｓｃｈ ａｌ．，２００５ａ）。さらに、Ｊａｚ ９を欠損する細胞はプロエイジング炭素源を枯渇し、グ ｗｉｎｓｋｉのグループによる研究では呼吸が複製寿命 リセロール生合成を活性化することを示す。グルコース に直接影響はしないことが示された（Ｋｉｒｃｈｍａｎ およびエタノールのようには加齢を促進しない“ファン ｅｔ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。 トム炭素源”として活動することに加え、グリセロール この寿命に関する呼吸の異なる効果には、寿命研究に使 はマイナーではあるが更に絶食状態下にある細胞の生存 用された実験系も寄与している可能性がある。複製寿命 を増強する原因となったことから、グリセロールは栄養 の解析は、細胞がグルコースと他の栄養に常時暴露され 的な支援を与えることが示唆され、このことは非分裂細 ている実質的で豊富なＹＰＤ培地で大部分が実施されて 50 胞によるグリセロールの取り込みから確認された（図９ ( 19 ) JP 35 2015-186480 A 2015.10.29 36 Ｈおよび９Ｉ）。二番目に、グリセロールが浸透ストレ れ形質転換して作製した。熱感受性細菌ルシフェラーゼ ス耐性を増強し、新規合成または熱不活化タンパク質を を発現する株（Ｐａｒｓｅｌｌ，１９９４）は酵母をプ 安定化し／復元する分子シャペロンとして機能すること ラスミドｐＧＰＤ−ｌｕｘＡＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ．ｃｏ から、グリセロールの生産と蓄積は、細胞の防御に寄与 ｍ）を保有する形質転換酵母により作製した。酵母の経 する可能性がある。三番目に、グリセロールの生産は、 時的寿命は、前述の如く測定した（Ｆａｂｒｉｚｉｏ ＮＡＤ：ＮＡＤＨ比率の維持に寄与することから、本生 ａｎｄ 産は細胞の酸化還元平衡調節によって加齢に影響する可 ％グルコース含有ＳＤＣで増殖させ、前述の如くアミノ 能性がある（Ａｎｓｅｌｌ 酸、アデニン、およびウラシルを添加した（Ｆａｂｒｉ Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ｅｔ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７； ａｌ．，２００１；Ｒｉｇｏｕｌ ａｌ．，２００４）。Ｅａｓｌｏｎらは、 10 Ｌｏｎｇｏ，２００３）。簡潔には、酵母を２ ｚｉｏ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，２００３）。酵母の生存 率は４８時間毎にコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）をモ 最近、マレイン酸−アスパラギン酸ＮＡＤＨシャトル構 ニターして測定した。３日目のＣＦＵ数は、最初の生存 成成分の過剰発現が酵母の複製寿命を延長すること示し 率（１００％）と考えられ、日齢依存性の致死率を決定 ている（Ｅａｓｌｏｎ ａｌ．，２００８）。し するために使用した。プレート上の生存率アッセイ用に かし、後者の２つの機序は長寿の増強に有意に寄与する 、トリプトファン栄養要求性株の１日目のＳＤＣ培養液 可能性は低い。何故なら、培養物への外部グリセロール を希釈し、炭素源のない、またはグルコース（２％）ま の添加は熱誘導タンパク質不活化（図９Ｂ）または野生 たはグリセロール（３％）を添加したＳＣ−Ｔｒｐプレ 型細胞の経時的生存率（図９Ｅ）に対する効果が少ない ート（約２００細胞／プレート）に播種した。実験期間 か、何らの効果もないのである。加えて、我々は、野生 中プレートを３０℃でインキュベートした。２日毎に２ 型細胞に細菌ＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）または代 ｍｇ／ｍｌのトリプトファン０．５ｍｌをプレートに加 替性オキシダーゼ（ＡＯＸ）を過剰発現させたが、酵母 20 えた。グルコースを含有しないプレートにはトリプトフ における両方のＮＡＤＨ酸化の増加（Ｖｅｍｕｒｉ ｅ ァンに加えて１ｍｌの５％グルコースを加えた。３０℃ ａｌ．，２００７）は該細胞の寿命を有意に変えな でのインキュベーション２−３日後にコロニー形成をモ ｔ ｅｔ かった。 ニターした。 【００７２】 【００７４】 我々のマウスにおける結果は、食事におけるグルコース ＤＮＡマイクロアレイ解析とデータ処理 を中心とする炭水化物の一部のグリセロール置換は、血 ２．５日目の野生型酵母および変異株の培養液（ｎ＝３ 糖濃度の低下と致死量のパラコート投与に対するマウス ）を回収し、酸フェノール法により全ＲＮＡを抽出した の耐性の増加に十分であることを示す。ゆえに、酵母に 。該ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ おいて観察される自己生産ＣＳＳは、食事中のグルコー ｐ Ｙｅａｓｔ スの他の炭素源による置換が哺乳動物へ応用可能である 30 して、遺伝子発現測定値を得た。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔ ことを示唆する。加齢経路の保存と広範な種の寿命延長 ｏｒ におけるカロリー制限の役割の観点から、高等真核生物 タ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）の処理に採用した。“ においてグリセロールが抗加齢の役割を果たす可能性を 不変集合”アプローチをプローブレベルでの正規化に使 さらに調べることが重要であろう。 用し、“モデルベース”法を用いて要約し、各プローブ 【００７３】 セットについての発現を得た（Ｌｉ 実験手順 ，２００１）。遺伝子レベルでピアソン相関係数０．９ 酵母株と増殖条件 ６を超える高い一致が同一株からのレプリケート間で得 ＤＮＡマイクロアレイ解析に使用されたすべての株は、 られた。 前述の一段階遺伝子置換によるＤＢＹ７４６に由来する 【００７５】 （ＭＡＴα，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３Δ，ｔｒ 40 ＧＯ解析 ｐ１−２８９，ｕｒａ３−５２，ＧＡＬ ｈｍａｎｎ ｅｔ ＋ ）（Ｂｒａｃ ａｌ．，１９９８）。 ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉ ａｒｒａｙにハイブリダイズ Ａｆｆｙ Ｐａｃｋａｇｅをマイクロアレイデー ａｎｄ Ｈｏｎｇ 遺伝子オントロジーＧＯ（ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ− ｆｔｐ．ｓｔａｎｆｏｒｄ，ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｇｏ／ｏ 二重欠損変異株をＤＢＹ７４６およびＢＹ４７４１に作 ｎｔｏｌｏｇｙ／を参照）データは各ノードが特異的な 製した（ＭＡＴα，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅ アノテーションを持つ遺伝子の集合に対応した有向非巡 ｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）。ＳＣＨ９，またはｒａｓ 回グラフ（ＤＡＧ）として構築された。我々の解析では ２ ｖ ａ ｌ １ ９ を過剰発現する株はＤＢＹ７４６をプラス 、良くアノテートされ、統計解析に十分な数の遺伝子（ ミドｐＨＡ−ＳＣＨ９（テキサス大学医学部Ｍｏｒａｎ ３０遺伝子以上）を含むＧＯカテゴリーのみが含まれて ｏ博士から寄贈）またはｐＭＷ１０１（ｐＭＦ１００の おり、末端の有益なＧＯ（ＴＩＧＯ）カテゴリーとして Ｃｌａ Ｉ−ｒａｓ２ ｖ ａ ｌ １ ９ −Ｈｉｎｄ ＩＩＩフ ラグメントを保有するプラスミドＲＳ４１６）でそれぞ 50 定義された：４４の細胞成分、５３の分子機能、および １０９の生物学的過程。ＴＩＧＯカテゴリーが有意に上 ( 20 ) JP 2015-186480 37 A 2015.10.29 38 方または下方制御されているかどうかを調べるため、ウ Ｐａｒｓｅｌｌ， ィルコキソンランクテストを実施した。最終的に、“ｑ 菌ルシフェラーゼを発現する酵母を熱ショック（４２℃ 値”パッケージを用いて複数の試験誤差を訂正するため 、６０分）にかけた。熱ショック終了１０分前にシクロ に各試験のｑ値を計算した（Ｓｔｏｒｎｅｙ ヘキシミド（最終２０μＭ）を培養液に加えた。この培 ａｎｄ １９９４）。簡潔には、熱感受性細 Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００３）。 養液をサンプル採取し、ルシフェラーゼ基質デカノール 【００７６】 （シグマ社）と混合し、シグナルをルミノメーター（Ｌ ストレス耐性アッセイ ｕｍｉｎｏｓｋａｎ 熱ショック耐性は、３日目のポストオーキシック培養か ィフィック社）中で迅速に測定した。 ら取り出した細胞の段階希釈液をＹＰＤプレート上に播 【００８０】 種し、５５℃（熱ショック）および３０℃（対照）で６ 10 マウスにおけるパラコート毒性 ０−１５０分インキュベートして測定した。熱ショック 体重１８−２４ｇの６週齢Ａ／Ｊマウスに２種の食事、 後、プレートを３０℃に戻し、２−３日インキュベート 対照食（４０％デンプン／ショ糖／マルトースデキスト した。酸化ストレスアッセイについては、３日目の細胞 リンを添加したＴｅｋｌａｄ をｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液でＯＤ６ はグリセロール食（４０％グリセロールを添加したＴｅ ０ ０ ＝１に希 Ａｓｃｅｎｔ，サーモサイエンテ ８６０４固型試料）また 釈し、１００−２００ｍＭの過酸化水素で６０分処理し ｋｌａｄ た。もう一つの方法として、細胞をｐＨ７．４のリン酸 ｉｓｉｏｎ カリウム緩衝液中２５０μＭのメナジオンで３０分処理 ズ社）を用いて血糖レベルを測定した。パラコート（リ した。対照細胞または処理細胞を段階希釈して、ＹＰＤ ン酸緩衝食塩水中７．５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内に１回注 プレート上に播種し、３０℃で２−３日インキュベート 入した（５０ｍｇ／ｋｇ）。パラコート投与後速やかに した。浸透ストレス耐性については、３日目の細胞を水 20 マウスを正常食（Ｄｉｅｔ で２回洗浄し、塩緩衝液（２または４ＭのＮａＣｌ）中 ラッド社）で維持した。４日間、２時間毎にマウスをモ に再懸濁した。３０℃、２４時間振とうしながらインキ ニターし、実験期間中１日１回体重を記録した。ストレ ュベート後、細胞を水で洗浄して塩を除去し、段階的に スまたは痛みの徴候を示した場合および回復のチャンス 希釈してから、ＹＰＤプレート上に播種した。プレート がないと判断した場合にはマウスを屠殺した。 を３０℃で２−３日インキュベートした。 【００８１】 【００７７】 文献 ナイルレッド染色 Ａｌｂｅｒｔｙｎ， 細胞（１ｍｌＳＤＣ培養）をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍ ， ａｎｄ ｌＰＢＳ中に再懸濁した。１０μｌのナイルレッド（ア ８６０４固型試料）を６日与えた。Ｐｒｅｃ Ｘｔｒａ 試験紙（アボットラボラトリー ８６０４， ハーランテク Ｊ．， Ｈｏｈｍａｎｎ， Ｐｒｉｏｒ， Ｂ．Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ （１９９４）． ｏｆ ｔｈｅ セトン中０．１ｍｇ／ｍｌ）を細胞懸濁液に加え、室温 30 ｏｓｍｏｔｉｃ−ｓｔｒｅｓｓ 、暗闇で５分インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回 ｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 洗浄し、ライカ蛍光顕微鏡でイメージングした。 ｅ： 【００７８】 ｃｏｓｅ グリセロール測定 ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 細胞内グリセロール量用に、細胞を水で３回洗浄した。 ｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ｍｌ培養物からの細胞ペレットを０．５ｍｌのトリス Ｃｕｒｒ 緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）に再懸濁し、細胞片を Ａｎｓｅｌｌ， 除去するためにその後５分煮沸し、次いで３０秒スピン Ｈｏｈｍａｎｎ， した。細胞抽出液または細胞を取り除いた培地からの上 ．Ｍ．， 澄みをそれぞれ細胞内または細胞外グリセロール濃度の 40 ． Ｔｈｅｔｗｏ 測定に用いた。グリセロール濃度は、ＵＶベースのグリ ｅａｓｔ セロールアッセイキット（ベーリンガー・マンハイム社 ｏｌ ／Ｒ−バイオファーム社）を用いて測定した。該アッセ ｎａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ イを９６穴プレートフォーマットに導入するために、該 ＧＰＤ２ ｈａｖｅ 製造業者が推奨するプロトコルを修飾した。各サンプル ｉｎ ｏｓｍｏａｄａｐｔａｔｉｏｎ は二つの組でアッセイし、データをストックグリセロー ｏｘ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． ルの段階希釈により作成した標準曲線に適合させた。 ｏｓｍｏｔｉｃ Ｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉ ａｎｄ ｇｌｕ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｅｈｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ． Ｇｅｎｅｔ ２５， １２−１８． Ｒ．， Ｇｒａｎａｔｈ， Ｓ．， Ｋ．， Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ， ａｎｄ Ａｄｌｅｒ， Ｌ． Ｊ （１９９７） ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｙ ＮＡＤ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃｅｒ ３− ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ ｂｙ ＧＰＤｌ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｒｅｄ Ｅｍｂｏ Ｊ １６， ２１７９−２１８７． 【００７９】 Ｂａｋｋｅｒ， ルシフェラーゼアッセイ ．Ｍ．， ルシフェラーゼの熱不活性化を前述のように測定した（ 50 ｅｒ， Ｂ．Ｍ．， Ｏｖｅｒｋａｍｐ， ｖａｎ Ｍａｒｉｓ，Ａ．Ｊ．， Ｐ．， Ｌｕｔｔｉｋ， Ｍ．Ａ．， Ｋ Ｋｏｔｔ ｖａｎ ( 21 ) JP 2015-186480 39 Ｄｉｊｋｅｎ， Ｊ．Ｔ． ｒｙ ｆ ＮＡＤＨ Ｓ ａｎｄ Ｐｒｏｎｋ， Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｎ Ｒｅｖ ２５， ｏ ｌａ， Ｅ． Ｂ．， ． （２００４）． ａｇｉｎｇ ＦＥＭ ｏｍｙｃｅｓ １５−３７ ． Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｂｉｏｌ Ｎ．Ｄ，， Ｌａｐｏｉｎｔｅ， Ｍ．， ｄ Ｇ．Ｓ． Ｓｈａｄｅｌ， ｄｕｃｅｄＴＯＲ ｓ Ｃｈａｔｅｎａｙ− Ｐａｎ， ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｖｉａ ｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｒａｃｈｍａｎｎ， Ａ．， ， Ｃｏｓｔ， Ｌｉ１ Ｊ．Ｄ． ｆｒｏｍ ｏｆ ｄｅｒ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ａｎｄ Ｄｅｓｉ 20 ｓｔｒａｉｎｓ ｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ： ａ ｉｃａｔｉｏｎｓ． ｃ ｕｓｅｆｕｌ ａｎｄ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｙｅａｓｔ １４， ａｐｐｌ ３２． Ｃｈｅｎｇ， Ｃ， ｅ， Ｈ．； Ｌｏｎｇｏ， ｉ， Ｌ．Ｍ． ｏｆ Ｆａｂｒｉｚｉｏ， （２００７）． ｉｎ ｌｏｎｇ− ｓｔｒａｉｎｓ ｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｅ．， ， （２００８）． Ｓ．Ｊ． ｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｌｉｃ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ Ｄｅｖ ２２， Ｆａｂｒｉｚｉｏ， ， Ｌ．， ｚｏ， ｏ， Ｃ， Ａ．， ６５５−６６７． Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｍｏｙ， ３）． Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． ＳＯＤ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｒｅａｍ ｏｆ Ｓｃｈ９ ｎｇｅｖｉｔｙ ｓ １６３， ｉｎ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｙｅａｓｔ． ｌｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐ．， ａｎｄ （２００３）． ｌｉｆｅ Ｃｅｌｌ （２００ ｄｏｗｎｓｔ ３５−４６． Ｆａｂｒｉｚｉｏ， ｇｉｃａｌ Ａ．， Ｇｒａｌｌａ， Ｔｈｅ Ｌｏｎｇｏ， ｃｈｒｏｎｏｌｏ ｓｐａｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ａｇｉｎｇ ２， ７３−８１． Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｐ．， Ｐｏｚｚａ， Ｆ．， Ｓ． Ｄ．，Ｇｅｎｄｒｏｎ， Ｌｏｎｇｏ， ａｎｄ Ｌ 30 ０１）． ｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｂｙ Ｓｃｈ９ ｉｎ Ｖ．Ｄ． （２０ ｏｆ ｌｏｎｇｅｖ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｙｅａｓｔ， Ｓｃｉｅｎｃ Ｋ．， Ｍｏｄｉｇ， Ｔ．， Ｆ Ｇｅｎｏｍ ｏｒｓｍａｒｋ， Ａ．， Ａｄｌｅｒ， Ｌ．， ａ ＢＭＣ Ｆ．， Ｓｋ ａｎｄ Ｔｈｅ ２８８−２９０． Ｌｉｄｅｎ， ＹＩＧ１ Ｇ． （２００５）． （ＹＰＬ２０１ｃ） ｏｔｅｉｎ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｍａｌａｔｅ ａｔｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｈｕｔｔｌｅ ｃ 40 ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｎｏｖｅｌｍｅｔａｂｏ ｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ２５７−１２６８． ｒｅｓｔｒ ｐｒ ｉｎｒｅｇｕｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｇｒａｙ， Ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｅｄ Ｌｉｎ Ｊ． Ｖ．， Ｙｅａｓｔ ２２，１ Ｐｅｔｓｋｏ， Ｇ．Ａ． ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｇ．Ｃ．， Ｒｉｎｇｅ， ｙｅａｓｔ． Ｇｅｎｅ Ｄ．， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｗｅｒ Ｌ．Ｌ．， Ｓｉｎｇｅｒ， ｎｅｒ−Ｗａｓｈｂｕｒｎｅ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ Ｄｏｓｓｅｎ， Ｄｉａｓｐｒｏ， Ｊ．Ｓ．， Ｇｒａｎａｔｈ， Ｖａｒｄａｖａｓ，Ｒ．， Ｌｉｏｕ， Ｖ．Ｎ．， Ｌ．Ｌ．， Ｃ．Ｍ．， ９３１−９４４． Ｐ．， Ｐ．， Ｌｉｏｕ， ｅ ２９２， ｃａｌｏｒｉｅ ｉｎ １２３， ｅｘｐｒｅ ＮＡＤＨ ａｒｅ ｌｉｆｅ−ｓ Ｃｅｌｌ ｙｅａｓｔ ｉｃｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓ ｅｘｔｒｅｍｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． ｌｉｖｅ Ｗａｎｇ，Ｃ， ｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｌｏｃｋｓ ｐａｎ Ｓ Ｐｌｅｔｃｈｅｒ， ｍｏｄｉｆｉｃ Ｔｓａｎｇ， Ｃ， −ａｓｐａｒｔａｔｅ ｉｒ２ ｎｄ ｉｎｎｅｒ， Ｋ．， Ｇ ２１９． Ｅａｓｌｏｎ， Ｃ， ＭｃＧｒｅｗ， Ｍ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． ８， Ｃ Ｗｅｉ， Ｐ．， Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｔｉｏｎ ｉｃｓ Ｖ．Ｄ．， Ｌ．， Ｖ．Ｄ． （２００５）． ｒｏｍｙｃｅｓ １１５−１ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ． ｐｌａｓｍｉ ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｃｈｅｎｇ， Ｅ．Ｂ．，ａｎｄ Ｐ．， Ｓａｃｃｈａｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， Ｅ． ａ Ｐ．， Ｇａｔｔａｚｚｏ， Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ， （１９９８）． ｉｖｅｄ ．， ｉｓ １０５５−１０６７． ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ， ２６５−２７７． Ｈｉｅｔｅｒ， ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｄｓ ｍｉｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ５， Ｃ．Ｂ．， ｇｎｅｒ ｓｅｔ ｏｆ Ｇ．Ｊ．，Ｃａｐｕｔｏ， Ｊ．， Ｂｏｅｋｅ， ｓｐａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏ ｇｅｎｅ Ｍｅｔａｂ Ｒｅ 10 ｅｘｔｅｎｄ ｌｉｆｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｎ． Ｙ．， ａｎ （２００７）． ｉｎ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． １６６， Ｖ．Ｄ ａｎ ａｌｔｒｕｉｓｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｂｏｎａｗｉｔｚ， ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ， ｍｅｄｉａｔｏｒｏｆ Ｓａｃｃ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 2015.10.29 40 Ｊ．Ｐ．， （２００１）． ａｎｄ A “Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｇａｔｔａｚ ｃｅｎｃｅ Ｄｉａｓｐｒ ｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｊ．Ｗ．， Ｇｒａｌ 50 ｉｏｌ Ｍ． （２００４）， ｂｅａｕｔｙ”： ｑｕｉｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６８， １８７−２０６． ｃｅ Ｍｏｌ Ｂ ( 22 ) JP 2015-186480 41 Ｈａｎｓｅｎ， Ｍ．， Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｌｅｅ， ． Ｄ．， （２００７）． ｉｏｎ ｂｙ ｈｉｂｉｔ Ｌｉｂｉｎａ， Ｌｉｆｅｓｐａｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｇｅｖｉｔｙ． Ｅｕｒ Ｓｕｐｐｌ Ｊｉａ， ， ａｎｄ Ａｇｉｎｇ Ｔｈｅ （２００４）． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ｗｉｔｈ ａｎｇ， ｅｌｅｇａ ｎｄ Ｐ．， Ｊ．Ｒ．， ．， Ｂｒｏａｃｈ， ｓ， Ｍ．（２００４）． Ｄ ｍｕｎｉｃａｔｅｓ ｔｏ ｎｅｓ ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｄｅｖ ａｎｄ ｉｃａｔｉｖｅ １８， ｌｉｆｅ Ｋａｐａｈｉ， ｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｉａｅ ｅｄ ． ｂｙ ａ ｔｏ ｃａｌｏｒｉｅ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ａ ｅｓｐａｎ Ｇｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ 30 ＴＯＲ ｏｓ ｓｐａ ａ Ｅ．Ｏ．， Ｗｅｓｔｍａｎ， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｋ． ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｃｕ Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｄａｕｇｈｔｅｒ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍ．， Ｈｕ， Ｔｓｕｃｈｉｙａ， Ｅ．Ａ．， Ｓ．， Ｄａｎｇ， Ｋ 40 ｄｕｅ ．Ｋ．， Ｎ．， ２００７）． ｔａｒｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｍ．， ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ， （２００５ａ）． ｓｐａｎ Ｄ．， ｌｉｆｅ １２７， ｃｅｌ ｃｅｒｅｖｉ ｄｉｓ ｓｐａｎ． １９８５−１９ ｇ． ｃａｌｏｒｉｅ Ｒｕｍｉｎａｔｉｏｎｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ ３２３− Ｋｅｎｙｏｎ， ｅｒｖｅｄ １， ｅ６９． Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｂ． Ｋ． ｏｒ Ｍ．， ａｎｄ （２００５）． Ｋｅｎｎｅ Ｌａｒｇｅ−ｓ 50 Ｌｉｆｅ Ｍ． Ｋ （ ｏｎ ｄｉｅ ａｎｄ ａｇｉｎ Ｓｃｉ６４， １ １３２８． ｙｅａｓｔ． Ｇ Ｓｔｅｆｆｅｎ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ ＰＬｏＳ Ｂ．Ｋ．， ａｎｄ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， ｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｙ， ｐａｔｈｗａｙ． ｏｌｄ ｍｏｔｈｅｒｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｅｔ ｍｏ ９３． Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｂ． Ｊ ｂｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｙ ８０５６− ８０６６． ｅｒｒ， Ｊｒ．， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｓ． ｏｆ ｌｉｆ Ｋ．， Ａｕｓｔｒｉａｃｏ （１９９４）． ｆｒｏｍ Ｓ ８８５−８９０． Ｂ． ｓｉａｅ ２２， ｇｅｎｅｓ Ｂｉｏｌ １４， ， Ｎ．Ｒ．， ｌｓ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ， Ｌ． Ｄ．， ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｄｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌａｔ Ｂｉｏｌ Ｂ．Ｍ．， Ｈａ ａｎｄ Ｂｅｎｚｅｒ， ｃｅｒｅｖｉ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｚｉｄ， Ｖ．， （２００４）． Ｇｕａ Ｈｉｇｈ ｌｉｆｅ ｎ ３１０， １１ ａｐｉｎ， Ｋｅｎｎｅｄｙ， （２００２）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｃｏｍ ｒｒ ｅｘｔｅｎｄｓ ｂｙ ＴＯＲ Ｋｏｓｌｏｖｅｒ， Ｇ．Ｒ．， Ｌ． ｓｐａｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐ．， Ｍ．， Ａｎｄａｌｉｓ， ｍｏｌａｒｉｔｙ ａ ｒｅｐｌ Ｔ．， Ａ．Ａ．， ｒｅｎｔｅ， Ｓ．， （２００５ｂ）． ｏｆ ｙｅａｓｔ Ｓｃｈ９ ｉｎ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， ａｎｄ Ｂ．Ｋ． ｒｐｅｒ， ２４９１−２５０５． Ｆｉｎｋ， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ Ｋｉｘｋ ｔｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｉｚｅ． Ｄ．， Ｅ．Ｏ．， ９３−１１９６． ｐｏｔｅｎｔｉａ ｃｅｌｌ Ｋ．Ｔ．， Ｒ Ｋ．Ｋ．， Ｅ．Ａ．， Ｈｕ， ｕｔｒｉｅｎｔｓ． Ｌ Ｔｙｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｇｒｏｗｔｈ ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｌ， Ａ ｄｙｎａｍｉｃ ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｎｄ Ｒｕｐｅｓ， Ｓｃｈｎｅｐｅｒ， Ｍ．， Ｐｏｗｅｒｓ， Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ３８９７−３９０６ 20 Ｊ．Ｒ．， ｃｅｒ Ｄｅｖ １３， Ｓｔｅｆｆｅｎ， Ｋｅｎｎｅｄｙ， ａｎｄ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｎ．｝ Ｋｅｒｒ， ｌａｎｄ， ｍｅ ｓｐａｎ． ３ｒｄ， Ｗｅｓｔｍａｎ， ｐａｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３１， ａｎｄ ｌｏｎｇｅ ２５７０−２５８０． ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｉｆｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ａｎｄ （１９９９）． ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． ． ｌ ｂｙ ． Ｗ．， Ｃ． Ｍ． ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｖｉｓｉａｅ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｈａｒｏｍ， ａｌｏｎｅ Ｔｈｅ ＴＯ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔａｂｏｌｉｓｍ ｖｉｔｙ ｌｏｎ 10 Ｍ．， ＭｃＶｅｙ， ＳＩＲ２／３／４ ａｎｄ Ｒｉ ｌａｒｖａｌ ｇ Ｄｅｖ １２６ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ． Ｄ．， ｉｎｓｕｌｉｎ ｈｗａｙ ｎｓ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ｃａｅｎ ａｎｄ ｙｅ ａｇｅｉｎｇ Ａｇｅｉｎｇ （２００４）． Ｄ．Ｌ． ｐａｔｈｗａｙ ｔｈｅ Ｍｅｃｈ ｉｎ ， １７−２１． ｉｎ Ｓ２３−２７． Ｃｈｅｎ， ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＳＩＲ２ Ｍ． Ｊ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｎｅｓ． ｅｘｔｅｎｓ ｉｎ ａｘｉｓ １， Ｋ．， ｄｄｌｅ， Ｒ ａｓｔ Ｃ ６， ９５−１１０． ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ １５１ ｃａｌｅ Ｎ．， ｔｈａｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｔｈｅ Ｓ．， ａｎｄ Ｋｅｎｙｏｎ， ｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ． Ｃｅｌｌ 2015.10.29 42 Ｔａｕｂｅｒｔ， Ｓ．Ｊ．， A Ｃ． （２００１）． ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｇｉｎｇ． Ａ ｃｏｎｓ ｓｙｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０５， １６５−１ ６８． Ｋｉｒｃｈｍａｎ， Ｐ．Ａ．， Ｋｉｍ， ｆ Ｓ．， ( 23 ) JP 2015-186480 43 Ｌａｉ， Ｃ．Ｙ．， Ｓ．Ｍ． ｌｌｅ （１９９９）． ｉｎａｎｔ ｏｆ ｎｅｔｉｃｓ Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ， ｎｖｉｒｏｎ ２００４， ｐｅ３６． Ｉｎｔｅｒｏｒｇａｎｅ Ｌｏｎｇｏ， Ｖ．Ｄ．， ａｎｄ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍ ， Ｐ． ｉｎ ｆ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ａ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｓａｃ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． １５２， Ｌｉ， Ｈ．， １）． Ｃｌｕｓｔｅｒ−Ｒａｓｃｈ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｓｉｏｎｄａｔａ． Ｇｅ Ｈｏｎｇ， ａｔｅｇｙ Ｆ． （２００ ｔｏ ｍｏｄｅｌｓ ｇｅｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｅｘｐｒｅ Ｂｉｏｌ Ｌｉｌｌｉｅ， Ｓ． ｅ， （１９８０）．Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｊ．Ｒ． ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｒｉｎｇｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｍｉｔａｔｉｏｎ． ， ａｎｄ Ｊ ｃａ ｉｎ ， Ｓ．Ｊ．， ａｎｄ ＩＲ２ ｌｉ １４３ ｂｙ ｉｎ ｌｉｆｅ−ｓｐａｎ ｃａｌｏｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｓ Ｓ．Ｊ．， Ａ．Ａ．， Ｃ， ｂｙ ｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ． ａｇｅｉｎｇ． Ａ．， Ｋｉｔａｚａｗａ， Ｋ．， ａｎｄ Ｍ． Ｐａｒａｑｕａｔ ａｒｒｅｓｔ ｈｏｕ， ｒｉｎ ａｎ 30 ｄｓ Ｃａ ｂｉｔ ｅ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｊａｃｉｎｔｏ， Ｓ．， Ｊ．Ｌ．， Ｐ．， ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ Ｗ．， ｃｒｅａｔｉｎｅ ｈｅ ｗｈｉｃｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ． ｉｓ ｒａ ｈａｖｅ ｄ Ｍｅｌｅ， ｏｔｈｅｒ ａｙ． Ｓｃｉ Ｓ．， Ｐｅｌｉｃｃｉ， ｐ６６ｓｈｃ Ｌ．， ａｎｄ Ｐ． Ｇ． （１９９９）． ａｄａｐｔｏｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｐａｎｉｎ ｍａｍｍａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４０２， ３０９ −３１３． Ｒ．Ｋ．， ａｎｄ ｔｏｎ， （１９５９）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０， ａｎ Ｊ．Ｒ． ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒａｓ： ２． ｐａｔｈｗ Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｅ 50 Ｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ， Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｇ． Ｐ．， Ｐａｎｄｏｌｆｉ， ｇｒｏ （２００４）． Ａｇｉｎｇ Ｅ．， Ｇｉｏｒｇｉｏ， ｃｅｌｌ ｐｒｏ−ａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｌｌｓ． Ｖ．Ｄ． ｔｈｅ ｒａｂ ｋｉｎａｓ Ｃｅｌｌ ｉｎ ４５７−４６８． ａｉ ７０１−７０９． Ｐｅｌｉｃｃｉ， 40 Ｚ ｐｒ ａｎｄ ｈｅｐａ Ｐ．Ｐ．，Ｌａｎｆｒａｎｃｏｎｅ， Ｂｏｎｅ ｏｆ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｏｆ Ｍ．， Ｅ．， ａｎｄ ｆｏｌｄｉｎｇ Ｉｎｔ ＪＢｉｏｃｈｅｍ ａ ｖｉｖｏ． Ａｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ３ ＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｓ−ｐｈ ｌｉｖｅｒ Ｐａｒｋ， Ｙ．， ａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ３３， Ｈａｌｌ，Ｍ．Ｎ． ｐａｍｙｃｉｎ Ｌｏｎｇｏ， Ｆ．， Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ， Ｌｏｒｂｅｒ Ｊｅｎｏｅ， Ｔｗｏ Ｔ． （１９ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｒａｔ ｒ ４１８， Ｏｐｐｌｉｇｅｒ， ｏｎｅ Ｋａｗａｍｏｔ Ｈ． （２００１）．Ｒｏｌｅ ｏｌｉｎｅ， Ｃｕｌ ｅｘｔｅｎｄｓ Ｄ．， ｏｎｌｙ Ｙ．， Ｔａｎａｋａ， ５１４−５１８． ｎｆａｎｔ， （２００２）． Ｍ．， Ｙａｍａｇａｍｉ， ， Ｒｅｂｏｌｄｉ， Ｃｒｅｓｐｏ， Ａｇｅｉｎｇ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒ．， Ｍｅｃｈ ９１３−９２２． Ｔｏｘｉｃｏｌ７０， ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒ， Ｏｖｅｒ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌｓ ４４−３４８． Ｌｏｅｗｉｔｈ， （２００５）． ｃｈ Ｌ． （２００２）． Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｅ．Ｊ． ｏｆ ｃａｌｏｒｉｃｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ ｎｄ Ｇ．Ｒ．， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ２９９， １３ ２１２６−２１ Ｐ．Ａ．， Ｆｉｎｋ， Ｇｕａｒｅｎｔｅ， ｌｏｒｉｅ ｗｔｈ Ｋ．， ａｓｅ Ｓｔｕｒｔｚ， Ｄｅｆｏｓｓｅｚ， ｏｔｔａ，Ｖ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓ Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， Ａｎｄａｌｉｓ， Ｌ．Ａ．， ｇ， ｅｎａｒｉａｎｓ？ Ｍｅｎｇ， Ｌｉｎ， ｄ ｃｅｎｔ ９６）． ２８． ， ｍｏｄｅ ｏ， ｅｘｔｅｎｓｉ ２８９， Ｃ ｔｏ ｈｅａｌｔｈｙ Ｍａｔｓｕｂａｒａ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉａｅ． Ｆｉｎｃｈ， ｆｒｏｍ ｄｗａｒｆ ｎ ａｎｄ （２０００）． 20 ＮＡＤ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： Ｍａｓｏｒｏ， Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ． ｆｏｒ ｏｎ Ｖ．Ｄ．， Ｄｅｖ１２６， Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ （２００３）． ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｄｅｆｏｓｓｅｚ， ｆｒｏｍｙｅａｓｔ ５９， ９０３−９０８． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ｒｅ ｓｔｒ ４２−１３４６． １３８４−１３９４． Ｌｉｎ， ．Ｅ． ｏ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｌｏｎｇｏ， ２， 10 Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｓ？ Ｓｃｉ ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３１． Ｈ．， （２００２）． ｓｉｓｔａｎｃｅ： １７９−１９０． ａｎｄ 2015.10.29 44 ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ A Ｃ． １８３， Ｊｏｈｎｓ Ｌｉｆｅ ｓｐ ｙｅａｓｔ ｃｅ １７５１−１７５ Ｃ．Ｊ．， Ｂｕｒｔｎｅｒ， Ｒ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｂ．Ｋ．， ａｎｄ ( 24 ) JP 2015-186480 45 Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ， ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆ ｙｅａｓｔ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅ ｓｐａｎ． ＪＧｅｒｏｎｔｏｌ Ｓｃｉ Ｎｏｒｂｅｃｋ， ．， ａｎｄ ｅｓ ｏｆ ｏｆ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎｄ ｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｅｗ． Ａ．Ｋ ｆｏｒ ａｔｉｏｎｏｆ Ｇｐｐ２ｐ ．， ｑｕｉｓｔ， ｉｓｏｅｎｚｙｍ ｂｙ ｏｓｍｏｓｅｎｓｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅ ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｈｅｍ Ｍ． Ｓ．， ａｎｄ ｐａｔ １３ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ Ｐａｈｌｍａｎ， Ａｎｓｅｌｌ， ．， ａｎｄ Ｔｈｅ Ｒ．， Ａｄｌｅｒ， ｙｅａｓｔ ｐｈａｔａｓｅｓ ａｒｅ ６３， Ｇｐｐｌｐ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｔｒｅｓｓ． ３５５５−３５６３． Ｔｏｋｅｒ， ａｎｄ ＰＤＫ１ ａｎｄ Ａ．， ＡＧＥ−１ ｔｈａｔ ｉｎ ５２． Ｂ．Ｋ．， ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｌｉｆｅ ｓｐ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ １７４−１８４． Ｈ．， Ａｖｅｒｅｔ， Ｎ．，Ｂｕｎｏｕｓｔ， ｔｈｅ ｔｏ ｃ ＮＡＤＨ ｙｅａｓｔ ｏｓｍｏ Ｃｈｅｍ ５６− ２ Ｍｏｌ Ｌ． （ ａｎｄ ｒ ｃｙｔｏｓｏｌｉ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｄ．Ｌ．， ， Ｊ．Ｍ．， ｉｅ Ａ Ｍａｎｏｎ， ２ ２５７， ７３−８１． Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｈ．， ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．， Ｉ．Ｌ．， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｓｉａｅ． ｏｘｉｄａｔ Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏ Ｇｒａｎｄｉ ａｎｄ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ， ２００４）． ｃ Ｎ．， Ｘ．， Ｐａｈｌｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅ Ｍ．， Ａｇｕｉｌａｎｉｕ， Ｃａｍｏｕｇｒａｎｄ， Ｃ， 40 ｉｓ Ｅ Ｓ．Ｄ． ａｎｄ Ｆｉｅｌ Ｄｅｖ ２０， Ｇ． （１９９９）． Ｊｒ．， Ｍａｔｅｃｉｃ， Ｊ．Ｓ． ＭｃＣｌｕｒｅ Ｍ．， ａｎｄ （２００７）． ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒ ｅｘｔｅｎｄｓ ｅ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ ｔｏ ａｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｄｅｖ Ｃａｌｄｗｅｌｌ， Ｓ． （２００６）． Ｒｉｇｏｕｌｅｔ， ｄｉｆｆｅｒｅ １３， ｓｉｇｎ ｉｒｔｕｉｎｓ． ｄｉａｐａｕｓ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｓ Ｍ．， Ｋａｅｂｅ ｎｅｓ ｉｎ Ｔｈｏｍａｓ， ＰＩ３ Ｗ．， ３ｒｄ， ｈｅｘｏｓｅ Ｇｐｐ２ｐ Ｂｉｏｌ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ． ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ａｉｌｉｏｎ， ｈｏｍｏｌｏｇ ａｌｓ ｎｓ． Ｓ．， Ｒｕｖｋｕｎ， ｕｃｅ ｅ Ｊ １６５−１７５ ｐａｔｈｗａｙ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ７６， ３， ＴＯＲ ３−ｐｈｏｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃ，ａｎｄ Ｐａｒａｄｉｓ， ｒｌｅｉｎ， ａｎ （２００１）． ａｎｄ ｉｖｅ Ｇｅｎｅｔ ｅｒ−Ｖａｚｅｉｌｌｅ， ｅｌｌｕｌａｒ ｔｉｃ， ｐｒｉｖａｔｅ Ｓ 30 ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｏｆ ｏｒ Ｈｏｈｍａｎｎ， ｎｔｉａｌｌｙ Ｇｅｍｓ， ｐｕｂｌｉｃ ．， ａｎｄ Ｈｓｐ ４７５−４７８． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ （２００２）． Ｋ ｆｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒ ５５４−５６９． Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３７２， Ｇｒａｎａｔｈ， ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｎａｔｕｒｅ Ａ．Ｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄ Ｄ． ｄｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ａ．Ｋ．， ．， ａｎｄ Ｍ．Ａ．， （１９９４）． ， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｋｏｗａｌ， Ｌ．， ａｎｄ ｏｆ （１９９９）． ２２７− ２３ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ， Ｐｏｗｅｒｓ， ８７５−１３８８１． Ｏｚｃａｎ， ｒ ． ｋｉｎａ 20 ２７１， ｓｔｅｒｏｌ ３０， ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ？ ＮａｔＲｅｖ ｍｉｔｏｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ． ａｇｅｉｎｇ： ｒｅｇｕｌ ｎ− Ｊ Ｂｉｏｌ ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｅ ｏｆ Ｄ．Ａ．， Ｓｉｎｇｅｒ， １０４． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ ｂｙ （１９９５） ｐｈｙｓｉｏｌ ｉｎ ｙｅａｓｔ−−ａ ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ３−ｐｈｏｓ ｏｓｍｏｔｉｃ Ｓ．Ｊ．， ０． ｃｈａｒａｃｔ 10 ａｎｄ ａｎｄ Ｌｉｐｉｄｓ （１９９６）． ｇｅｎｅｓ Ｊ．Ｈ． ｅｆｆｅｃｔｓ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｖｉｄｅｎｃｅ ｈｗａｙ． ｌｉｆ Ｂｉｏｌ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ＧＰＰ２ Ｃｒｏｗｌｅｙ， Ｌ． ｔｗｏ Ｓｍｉｔｈ， ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒｓｅｌｌ， ＤＬ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ− ｏｆ ＧＰＰｌ ａｎｄ ｏ Ｌ．Ｗ．， Ｂｌｏｍｂｅｒｇ， ａｎｄ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． ｉｏｎ Ａ Ｐａｈｌｍａｎ， Ａｄｌｅｒ， ｐｈａｔａｓｅ ｓ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎ．， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｐａｒｋｓ， ６３， １１３−１２１． Ｊ．， Ａｋｈｔａｒ， Ａ．， Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｅｄ 2015.10.29 46 Ｍ． （２００８）． ｔ Ｓｃｉ A Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ６， Ｓ ６４ ９−６６２． ｅｌｅｇａ Ｓｔｏｒｅｙ， １４３８−１４ ａｎｉ， 50 Ｊ．Ｄ．， ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒ Ｒ． （２００３）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ( 25 ) JP 47 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ａｄ １００， ９４４０−９４ Ｕ Ｓ Ａ Ａｃ ｅｖａｔｅｄ Ｊ．， Ａ．， Ｓｏｕｌａｒｄ， Ｌｉｐｐｍａｎ， ｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ｗａｎｋｅ， Ｄ．， Ａｍｍｅｒｅｒ， Ｈ．， ｉｓ ｉｎ Ｖ．， ｅｔ ａｌ． ａ （２００７）． ｏｆ Ｃｅｌｌ ２６， ｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｌｏｇｙ （２００５）． Ｔｏｒ ｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ： ６６３−６７４ ｐａｔｈｗａｙｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｏｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ Ｋｏｖａｃｓ， Ｃｅｌｌ ａｎｄ 【実施例３】 ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｎａｔｕｒｅ ４２６， Ｖｅｍｕｒｉ， Ａ．， ｉｎ ７）． ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ６２０． Ｊ．Ｅ．， ｒｅｄｕｃｅｓ ａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔ ４， ６３−７１． 要約 絶食は、Ｅ．ｃｏｌｉからマウスまでの範囲の生物をし 20 Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｉｏｎ ｏ ｅｌｅｇａｎｓ． Ｅｉｔｅｍａｎ， ｅｘｐｒｅ 【００８２】 ｋｉｎａｓｅ Ｃ． Ｇ．Ｎ．， ＭｃＥｗｅｎ， Ｌ．， Ｍｕｌｌ ｔｗｏ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ． Ｌ．， ｎ ＡＭＰ−ｐｒｏｔｅｉ ｃｅｒｅｖｉｓ Ｙ．， ＴＯＲ Ｍ．Ｅ． ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ Ｏｒｏｓｚ， ｏｆ １１９３−１２０４． ｄ Ｃａｒｄｅｎａｓ， Ｔａｋａｃｓ−Ｖｅｌｌａｉ （２００３）． Ｍｉｃｒｏｂｉ ＴＯＲＣ１ 10 Ｚｈａｎｇ， Ｆ． ｐａｔｈｗａｙｓ． ｃ ｏｆ ＭＡＰ Ｓｃｈ９ Ｋ．， ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｃ Ｓ．Ａ．， ａｎ Ａ．Ｌ．， ｅｒ， ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ １４９， ｓｓｉｏｎ Ｔ．， ｉｓ Ｚｕｒｉｔａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ， ． Ｖｅｌｌａｉ， ｉｎ Ｓａｃ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ ｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ｒｉｅｚｍａｎ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｍｏｌ Ｈ Ａｎｒａｔｈｅｒ， Ｇ．， ｍａｊｏｒｔａｒｇｅｔ ｉａｅ． Ａ．， Ｓ．， Ｍｕ Ｄ．， Ｄｅｌｏｃｈｅ， Ｏ．， ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｕｂｅｒ， 2015.10.29 ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ４５． Ｕｒｂａｎ， A 48 ｗｉｄｅｓｔｕｄｉｅｓ． Ｓｃｉ 2015-186480 て酸化障害を含む種々の障害に対する顕著な耐性を与え Ｍ． るモードに切り換えることが良く知られている。以前の Ｏｌｓｓｏｎ， 研究は、４８時間絶食が、防御系の負の調節における癌 Ｊ． （２００ 遺伝子の役割と一致して、化学療法（分別的ストレス耐 ｏｘｉｄａ 性）に対してマウスを防御する効果があるが、癌細胞に ＮＡＤＨ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｍｅｔ 対しては無いことを実証した。患者は一般的に癌専門医 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ により化学療法前は通常に食事することを推奨される。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ それは、一つにはかなりの部分の患者が以前の化学療法 ｄ １０４， ２４０２−２４０ サイクルにより体重を減少させ、または、弱っていると Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７． いう理由で、絶食が化学療法を受ける患者に有害である Ｗｅｉ， ， Ｍ．， Ｊ．， ｉ， Ｆａｂｒｉｚｉｏ， Ｇｅ， Ｌ．， Ｈ．， ａｎｄ ００８）．Ｌｉｆｅ ｂｙ ｐｅｎｄｓ ｏｎ ｒｉｐｔｉｏｎ ｍ ｏｆ ｈ９． ｓｐａｎ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｅａｓｔ １０例の誰も空腹以外に絶食そのものに起因する重大な 副作用を報告しなかった。絶食または非絶食で化学療法 Ｔｏｒ， ４， Ｒ．Ａ． ｐｈａｓｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 種々の悪性腫瘍を診断された患者の１０症例を記述する ｔｒａｎｓｃ ａｎｄ Ｓｃ を受けた５例の患者における通常の毒性基準（ＣＴＣ） ｅｌ３． に基づく自己申告による副作用は、絶食が疲労、脱力、 Ｍ．， Ｂｒ Ｇ．Ｃ．， および胃腸の副作用を防ぐ可能性を示している。癌の進 40 （１９９３）． ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｉａｅ． 時間）および後（２４−５６時間）に自発的に絶食した ｄｏｗｎｓｔｒｅａ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｓｉｎｇｅｒ， ここで、われわれは、化学療法治療の前（４８−１４０ 。絶食とともに平均４サイクルの化学療法を受けたこの Ｗａｓｈｂｕｒｎｅ， Ｅ．， Ｌ ｄｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔ Ｒｅｖ Ｒ．， ， ｙ の減少を阻止しなかった。治療係数の増強における絶食 ｃｅｒｅｖｉ ｔｈｅ の役割を決定するには対照臨床試験が要求されるが、こ ５７， ３ こに提供されたこの１０症例は、化学療法との組み合わ せにおける絶食が安全であり、高度に有益である可能性 Ｉ．， Ａｌｏｎｓｏ−Ｍｏｎｇｅ， Ｂｅｂｅｌｍａｎ， Ｗ．Ｈ．， 行をモニターすることができたすべての患者において、 絶食が化学療法依存性の腫瘍マーカーまたは腫瘤サイズ ８３−４０１． Ｗｏｊｄａ， 可能性があると多くの人に考えられているからである。 （２ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｉｍ１５ Ｒａｓ／ＰＫＡ， ａｕｎ， Ｃ， Ｖ．Ｄ． ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＰＬｏＳ Ｗｅｒｎｅｒ− Ｃｈｅｎｇ， Ｌｏｎｇｏ， ｃａｌｏｒｉｅ Ｐ．， Ｈｕ 30 ａｎｄ Ｊ．Ｐ．， Ｍａｇｅｒ Ｓｉｄｅｒｉｕｓ， （２００３）． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｏｓｍｏｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｍ． ｈｉｇｈ ａｎｄ ｅｌ 50 を示している。 【００８３】 序論 化学療法は、広範な悪性腫瘍を診断された患者の生存を 延長することができるが、その正常な細胞および組織に ( 26 ) JP 49 2015-186480 A 2015.10.29 50 対する毒性は用量強度、頻度、および有効性を制限する く完了し、７ポンド低下したが、絶食を止めて数日以内 。例えば、ドキソルビシンまたはシスプラチンの使用は に回復させた（図１１Ｈ）。最初の化学療法薬投与後３ 多くの悪性腫瘍を有効に治療することができるが、薬物 日間患者は軽度の疲労、口渇としゃっくりを経験したが 誘発性のそれぞれ心毒性および腎毒性がこれら薬剤の最 、それにもかかわらず彼女は毎日の活動を保持すること 大能力を制限する。 ができた（１日に１２時間の就労）。対照的に、その後 ゆえに、悪性細胞に対する毒性を損なわずに正常細胞を の化学療法サイクル（２または３回目）において、彼女 選択的に防御することによって不要な毒性を軽減するこ は非絶食で化学療法を受け、中等度のひどい吐き気、嘔 とは、癌治療を増強するための望ましい戦略である。 吐、腹部仙痛、下痢および疲労を訴えた（図１２）。こ 【００８４】 れらの重い副作用により彼女は通常の仕事のスケジュー 最近、細胞培養において、および神経芽細胞担癌マウス 10 ルを止めざるを得なかった。４回目および最後のサイク において、癌細胞ではなく、正常細胞を分別的に高用量 ルの間、異なる療法ではあったが、彼女は再び絶食を選 化学療法から防御する可能性のある絶食に基づく治療介 択した。この療法は化学療法前１２０時間、化学療法後 入が報告された（Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ２４時間の絶食から成っていた。注目すべきことに、予 ２００８ ＰＮＡＳ）。神経芽細胞腫異種移植マウスモデルにおい 測された以前の治療による蓄積されたダメージにもかか て、高用量エトポシド治療前４８時間に水のみをマウス わらず彼女の自己申告による副作用はより少なかった。 に消費させた。絶食は高用量エトポシドで治療したマウ 患者の毒性に関する自己申告と一致して、血液分析の結 スの防御に極めて有効であり、自由に摂餌したマウスは 果は、絶食が血液細胞を防御する有益な効果を持つ可能 高用量エトポシドにより５０％死亡したが、該絶食は神 性を支持している。４日目の化学療法サイクルとその後 経芽細胞腫の転移依存性の死亡を大幅に遅延させた の計１４０時間の絶食の後、好中球、ｗｂｃ，および血 Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ ２００８ （ ＰＮＡＳ）。 20 小板数は、８０日前の化学療法開始以来最高のレベルに 【００８５】 到達した（図１１Ａ，ＣおよびＥ）。特に、予想された ここに我々は、種々のタイプの癌を診断された１０症例 ナディアおける数は入手不能であった。全体的に見て、 を提示する。これらの症例は、化学療法前後に自発的に 血球数と自己申告調査は、絶食が安全であり、この患者 絶食した。正常細胞と癌細胞の分別的防御における絶食 に対しては化学療法の毒性的副作用に対する防御を絶食 の有効性を決定するには適切に制御された臨床試験が必 が与えた可能性が示唆された。 要であるが、患者の自己申告による健康アウトカムと血 【００８８】 液データ読み出しに基づいてここに提示された結果は、 症例２： 絶食が安全であり、癌細胞死を阻害せずに化学療法に起 ６８歳の白人男性で、２００８年２月に食道癌と診断さ 因する複数の副作用を軽減した可能性を示唆する。 れた。診断時までにはステージＩＶと一致する左の副腎 【００８６】 30 への転移がＣＴ−ＰＥＴスキャンで発見された。最初の 結果 化学療法剤は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とシス 化学療法を受けている１０例の癌患者がこの症例シリー プラチン（ＣＤＤＰ）であった。化学療法レジメンと同 ズで提示される。その内女性は７例、男性は３例で、年 時に彼は最初の２サイクルの化学療法の間、局所照射も 齢中央値は６１歳（４４−７８歳の範囲）である。４例 受けた。この期間中、患者は極度の脱力、顕著な疲労、 は乳癌、２例は前立腺癌、４例は卵巣癌、子宮癌、非小 下痢、嘔吐および末梢神経障害を含むひどい副作用を経 細胞肺癌、または食道腺癌であった。これらすべての患 験した（図１３）。さらに、患者は、大部分は放射線治 者は、彼らを治療する癌専門医の監視のもとで化学療法 療に起因すると思われる極度の口内炎に続き激しい嚥下 前計４８−１４０時間および化学療法後２４−４０時間 障害を訴え、それゆえ経皮的内視鏡下胃瘻造設術（ＰＥ 自発的に絶食した。全ての患者は絶食に良好に耐えた。 Ｇ）を実施し、７日後、除去された。３回目のサイクル 空腹、および血圧の低下は長い絶食期間後に患者が訴え 40 の間に、５−ＦＵ投与は重度の悪心と治療抵抗性の嘔吐 た共通の症状であった。 により中断を余儀なくされた（図１３）。化学療法と放 【００８７】 射線の積極的なアプローチにもかかわらず、彼の病気は 症例１： 進行した。右副腎、右肺下葉、左仙骨および烏口突起へ ５１歳女性、ステージＩＩＡの乳癌で、ドセタキセル（ の新規な転移の発生が２００８年８月に実施されたＣＴ ＤＴＸ）とシクロホスファミド（ＣＰ）によるアジュバ −ＰＥＴにより発見された。これらの進行により、ドセ ント化学療法が推奨されていた。彼女は最初に化学療法 タキセルと５−ＦＵ（５−ＦＵは９６時間投与された） サイクルの前に絶食した。絶食療法は、化学療法前１２ の併用でカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）を含む彼の化学 ０時間と化学療法後６０時間（計１８０時間）の完全な 療法レジメン（４サイクル目）の増強が促進された。患 カロリー欠乏から成り、その間、彼女は水とビタミンの 者は、化学療法前７２時間と化学療法後５１時間の絶食 みを摂取した。患者はこの長い絶食を主要な不都合もな 50 を４回目のサイクルの間取り入れた。化学療法後５１時 ( 27 ) JP 51 2015-186480 A 2015.10.29 52 間の絶食の根拠は５−ＦＵの持続投与に対する防御のた 者は、非生殖線のアンドロゲン生合成に重要な一連の反 めである。患者は約７ポンド減ったが、その内４ポンド 応を触媒するミクロゾーム酵素ＣＹＰ１７を選択的に阻 は正常食への復帰後最初の２∼３日間に回復した。この 害することができる薬物アビラテロンのフェーズＩＩＩ サイクルの間３種類の化学療法剤が併用で使用されたが 臨床試験に登録された。この臨床試験中、患者のＰＳＡ 、自己申告による副作用は中等度の疲労が含まれるのみ レベルは２０．９ｎｇ／ｍｌまで上昇した（図１４Ｈ） であった。５回目のサイクルの前に彼は再び絶食を選択 。その結果、化学療法を再開したが、今回は絶食と分別 した。以前に受けたような９６時間の５−ＦＵの注入を 的ストレス耐性に関する動物モデルの研究に基づき（Ｒ 受ける代わりに、同用量の５−ＦＵを４８時間以内に投 ａｆｆａｇｈｅｌｌｏ 与し、絶食療法も薬物投与前４８時間と薬物投与後５６ 化学療法前の絶食を選択した。彼の絶食スケジュールは 時間に修正した。興味深いことに、自己申告による副作 10 薬物投与前６０時間、薬物投与後２４時間であった。 用が非常に低かっただけでなく、ＣＴ−ＰＥＴにおいて 更新された絶食／化学療法によりＰＳＡレベルは速やか 主要な食道の腫瘤、副腎、および右肺下葉の結節の縮小 に低下し、特に、患者は無視できる副作用を報告した（ が表示され、臨床的な奏効の増強もあった。６、７、８ 図１５）。最後の３サイクルの間、絶食以外に患者はテ 回目のサイクルの間、患者は化学療法治療（上記参照） ストステロン（１％クリーム）を化学療法前に５日間適 の前後に絶食し、軽度の副作用のみが報告された。この 用された。テストステロンとともにＰＳＡレベルは劇的 癌は非常に悪性な癌であり、化学療法が良好に耐容され に上昇した。それにもかかわらず、絶食を併用した３サ たにもかかわらず、患者の病は進行し、２００９年２月 イクルの化学療法によりＰＳＡは３４．２から６．４３ に死亡した。 ｎｇ／ｍｌに低下した（図１４Ｈ）。 【００８９】 【００９０】 症例３： 20 ２００８ ＰＮＡＳ）、患者は 症例４： この患者は７４歳白人男性で、２０００年７月に両側性 ６１歳白人女性で、２００８年６月に未分化非小細胞癌 の前立腺癌、グリーソンスコア７、ＰＳＡレベル５．８ と診断された。左肺下葉に限局した腫瘤は、生検結果と ｎｇ／ｍｌと診断された。２０００年９月に前立腺摘除 相関してＰＥＴスキャンにより代謝亢進状態にあること 術を実施し、ＰＳＡが１．４ｎｇ／ｍｌに上昇した２０ が明らかになった（２００８年６月）。同スキャンにお ０３年１月までＰＳＡレベルが検出不能となった。ビカ いて、広範な転移性疾患が複数の縦隔および左門部周囲 ルタミドおよびフィナステリドと一緒に酢酸ロイプロリ のリンパ節に示された。骨、肝、脾、および膵臓への転 ドを疾患制御のために処方した。しかし、これらの薬剤 移も観察された。ドセタキセル７５ｍｇ／ｍ ２ ２ およびカ の投与はテストステロン欠乏に関連する重度の副作用に ルボプラチン５４０ｍｇ／ｍ より２００４年４月に休薬を余儀なくされた。その結果 れた。彼女は通常食を取っていたが、最初の５サイクル による初期治療が計画さ 、疾患制御のため、トリプトレリン、パモ酸、ニルタミ 30 の間各治療後に平均４ポンドを失った。これは化学療法 ド、サリドマイド、シクロホスファミドおよびケトコナ による毒性である可能性が最も高い。患者はもとの体重 ゾールを含む異なる薬剤が投与された。しかし、２００ に戻るのに約３週間を要したと報告した。経験した副作 ７年１月には患者のＰＳＡレベルが９に達し、２００７ 用の内、彼女は重度の筋痙縮、下肢神経障害、顕著な疲 年３月には新規な転移が骨スキャンにより表示され、ス 労、口と舌の痛み、できやすいあざ、腸不快感、下痢便 テージＤ２と一致する疾患が確認された。２００７年６ 秘交代症を訴えた（図１７）。同一薬物と用量から成る 月にドセタキセル治療が週１回の頻度で開始されたが、 ６回目のサイクルの間、患者は化学療法前４８時間、化 患者のＰＳＡレベルは４０．６ｎｇ／ｍｌに達した（図 学療法後２４時間絶食した。この間患者は約６ポンド失 １４Ｈ）。同年８月にアバスチンが薬物療法に加味され ったが、１０日以内に回復した。２日以内に回復した軽 た。これらのサイクルの間患者は、金属味、めまい、も 度の疲労と便秘以外には、彼女が以前の５サイクル中に の忘れ、短期記憶障害および末梢神経障害を含む化学療 40 経験したいずれの副作用も訴えなかった。さらに、彼女 法による顕著な副作用を経験した（図１５）。それにも は６回目と最後のサイクル後、彼女のエネルギーが急速 かかわらず、臨床的奏効は陽性であり、ＰＳＡ値は正常 に回復し、該薬物投与後３日のみで３マイル歩くことが 化された（図１４Ｈ）。２００７年１２月には骨スキャ できたと報告した。 ンは全体的な改善を示した。２００８年に化学療法治療 ２００９年２月に実施された最後のレントゲン検査によ を止めた後、彼のＰＳＡは急速に上昇した。もう１度ド り、ベースラインＰＥＴスキャンと比べた場合、肺病変 セタキセルが処方された。２００８年１月から同年５月 （主要な腫瘤）および脾臓、膵臓、および脊椎等の陽性 まで患者は２１日毎にドセタキセルを受けた。これらの 病巣を有する他の臓器の改善が示された。 治療サイクルの間、彼は以前２００７年に経験したと同 【００９１】 様の副作用を経験したが、疲労と脱力が重症化した（図 症例５： １５）。２００８年６月には、化学療法は中止され、患 50 ６６歳白人男性で、１９９８年７月に前立腺癌、グリー ( 28 ) JP 53 2015-186480 A 2015.10.29 54 ソンスコア８と診断された。同年に実施された陽性前立 この発見はＣＴスキャンで確認され、２０を超える新規 腺シンチ試験により、右腸骨リンパ節に放射性トレーサ 結節が同一領域で視覚化された。また、この試験では幾 ーの取り込み増加が示された。これらの所見は、ステー つかの異常（低密度画像ＭＴＳ）が脾領域に、および脊 ジＤ１疾患と一致する。１９９８年に最初は、患者は酢 椎に退行性変化が見られた。これらの結果に基づき、タ 酸ロイプロリドとビカルタミドを受けた。１９９９年９ キソール、カルボプラチン、およびアバスチンを含む新 月にはこれらの薬物を止め、フィナステリド治療が開始 規治療レジメンが選出された。２００８年８月に注入が された。２０００年１２月には、ＣＴスキャンにより限 開始され、３週毎に実施された。同時に、患者は高用量 局性の疾患の進行が疑われた。ＰＳＡベースライン１． ビタミンＣ（５０ｍｇ／ｄａｙ）を補充した。２００８ １で彼は酢酸ロイプロリドによる２回目のサイクルを開 年９月、ＣＴスキャンを用いた再評価により、サイズと 始したが、今回は高線量（ＨＤＲ）小線源療法と強度変 10 複数のびまん性、両側性の肺結節数の低下が示された。 調放射線療法（ＩＭＲＴ）の追加による外照射も右閉鎖 しかし、１１月にはＣＴスキャンにより主要な結節の一 神経リンパ節に受けた。この後、２００２年迄週１００ つが．５から．８ｃｍに増大し、疾患の進行が確認され ｍｇのナンドロロンによる治療が続けられた。翌年には た。１日目にゲムシタビン、８日目にゲムシタビンとド 、ビカルタミド、トリプトレリンパモ酸塩等の異なる薬 セタキセルから成る新規療法が処方された。しかし、総 剤が処方され、ナンドロロンが疾患制御のために使用さ 量（９００ｍｇ／ｍ れた。しかし、彼のＰＳＡレベルは治療が中断される毎 、患者は持続性の好中球減少（図１９Ａ）と血小板減少 に急速に上昇した。２００８年４月、コンビデックスス （図１９Ｄ）を経験し、追加治療が断念させられた。２ キャンにより３×５ｃｍの骨盤の腫瘤と左水腎症が示さ 回目のサイクルの間、患者は減量したゲムシタビン（７ れた。それゆえ、腎摘除とステントの左尿管への装着が ２０ｍｇ／ｍ 行われた。同年６月、ＰＳＡレベルの上昇と新規ＣＴス 20 と血小板減少を発症し、最初のスケジュールの完了は困 キャンによる左腸骨域の更なる腫瘤の確認により、ドセ 難となった。その結果、患者は化学療法前６２時間と化 タキセル（２１日スケジュールの１回目サイクル、６０ 学療法後２４時間の絶食を始めることを決定した。彼女 ｍｇ／ｍ ２ ２ ２ ２ ）のゲムシタビンの最初の投与後 ）を受けたが、再び持続性の好中球減少 、および２−８回目サイクル、７５ｍｇ／ｍ は副作用の全体的な減少と血球数の改善を報告した。我 ）による治療が促された。動物実験に基づき、患者は 々は、ナディアが僅かで、あまりはっきりせず、好中球 化学療法前６０−６６時間の絶食と化学療法後８−２４ 数、リンパ球数、および白血球数のピークが著しく高い 時間の絶食を決定した（表Ａ）。絶食中、患者は意識朦 ことに注目した（それぞれ図１９Ａ，Ｂ，およびＣ）。 朧と有意な血圧低下を経験したが、自己申告による副作 さらに、ゲムシタビン単独は急速かつ急激な血小板数の 用は、絶食−ドセタキセルの７回の連続サイクル後に発 低下をきたし、回復に１１−１２日を要した。しかし、 生した足の軽度な振動感覚以外は殆ど存在しなかった。 最初の絶食／ゲムシタビン併用治療後は血小板数が減少 しかし、彼はしびれ、知覚異常、または痛みを報告しな 30 せず、むしろ増加した（図１９Ｄ）。血小板ナディアは かった。これらの結果は、大部分の患者がこの薬剤のま 以前の化学療法単独に比較してより低レベルに達したが さに２−４サイクル後に一種の神経障害を発症するとの 、今回は化学療法剤３剤を１剤の代わりに投与しており 考えを強くする。一方、血球数は１回目のサイクル以外 、相加効果がこれらの深いナディアの説明になり得る。 は治療を通して定常値を示し（図１８Ａ）、血球数も絶 それにもかかわらず、血小板数のリバウンドが化学療法 食依存性の防御の利益得ている可能性が示唆される。最 単独に比べ絶食／化学療法治療中でははるかに明確であ 後に、ＰＳＡレベルは化学療法サイクルの間、一貫して った（図１９Ａ，ＢおよびＣ）。この複数の絶食／化学 低下し、絶食は前立腺癌細胞を殺すことを阻害はしない 療法サイクル後の血小板の顕著な回復およびより急速な ことが示唆された（図１８Ｈ）。 回復は、この戦略が巨核芽球に対して防御効果を有し、 【００９２】 症例６： 血小板、好中球およびリンパ球をより速やかに再増殖さ 40 せる可能性を示唆する。 ４４歳白人女性で、２００７年７月に１０×１２ｃｍの 【００９３】 右卵巣腫瘤が発見された。患者は複数（３０＋）のバイ 症例７： オプシーをしたが、すべて癌は陰性であり、卵巣嚢の関 ここに、我々は、ステージＩＩＡ乳癌（ＨＥＲ２＋）と 与は示されなかった。これらのことに基づいて、最終診 診断された５３歳白人女性を紹介する。２００８年に乳 断はステージＩＡ卵巣癌肉腫となった。最初に実施され 腺腫瘍摘出手術後、患者は３週毎の化学療法を４サイク た治療は、イホスファミドとシスプラチンによる６サイ ル受けた。その療法はドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ クルコースで、患者はこのコースを２００７年７月から とシクロホスファミド（６００ｍｇ／ｍ １１月まで受けた。２００８年１月に実施された彼女の った。４サイクルを通して患者は化学療法投与前６４時 最初のＣＴスキャンは卵巣外の疾患を示さなかった。７ 間、および化学療法投与後２４時間絶食した。報告され ヶ月後、ＭＲＩにより複数の新規結節が肺に示された。 50 た副作用は軽度の脱力と軽度の短期記憶障害であり、他 ２ ２ ） ）の併用であ ( 29 ) JP 55 2015-186480 A 2015.10.29 56 の副作用は報告されなかった。 が、患者は以前に経験した大部分の副作用が一貫して軽 【００９４】 減したと報告した。このことは他の患者が経験したこと 症例８： および我々の前臨床データと一致する。 この患者は４８歳白人女性で、乳癌と診断され、アジュ 【００９７】 バント化学療法を推奨された。 我々は、モニターした１０例の患者すべてにつき、通常 彼女の化学療法レジメンは、ドキソルビシン（１１０ｍ の毒性基準尺度に基づく副作用の重症度に関する自己申 ｇ）とシクロホスファミド（１１００ｍｇ）の併用を３ 告評価を得た。我々は１０例全ての患者の自己申告によ 週毎を４サイクル、その後、パクリタキセルとハーセプ る副作用の評価を示す（図２２Ａ）。化学療法のすべて チンを週１回、１２週間から成っていた。最初の化学療 のサイクルと組み合わせて絶食した５例の患者は大部分 法治療（ＡＣ）前に患者は４８時間絶食し、なんらの副 10 の副作用につき極めて低い重症度を報告した。軽度の脱 作用も言及されなかった。２回目のサイクルの間、患者 力と脱毛のみが複数の患者から報告された。絶食または は化学療法前６０時間の絶食を組み込み、薬物投与後５ 自由食の両方とともに化学療法を受けた５例の患者につ 時間まで継続した。興味深いことに、絶食後には彼女は いては、自己申告による多くの副作用の重症度の一般的 何らの苦痛も表現しなかった。彼女は化学療法による脱 かつ大きな軽減が絶食との組み合わせに存在した。悪心 毛を経験したが、他には疲労、脱力、悪心、嘔吐、およ 、嘔吐、下痢、腹部仙痛、および口内炎は、絶食した１ び下痢等の通常報告される化学療法による副作用に苦し ０例の全ての患者の報告からは実質的になかったが、こ められることはなかった。 れらの症状の内少なくとも１つは自由に摂食した５例の 【００９５】 内４例の患者により報告された。 症例９： 【００９８】 この患者は７８歳の老婦人で、ＨＥＲ２陽性乳癌と診断 20 絶食または非絶食で少なくとも１サイクルの化学療法を された。診断により乳腺腫瘍摘出手術を実施し、彼女の 受けた５例の患者につき、患者が絶食または非絶食した 乳房から３個の腫瘤を摘出した。術後患者は感染症を発 化学療法の最も近接する２サイクルのみを考慮すること 症し、ドレナージ設置のため２回目の手術実施を強いら によって我々は自己申告された副作用の重症度を決定し れた。種々の試みがなされたが、全乳房切除は避けられ た（図２２Ｂ）。疲労および脱力等の症状は有意に軽減 なかった。６サイクルのカルボプラチン（４００ｍｇＡ されていた（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０ ＵＣ６）とドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ ２ ）、その後６ ０１９３）が、悪心と嘔吐は絶食と組み合わせた場合ま カ月のトラスツズマブによる補完的アジュバント化学療 ったく経験されなかった（図２２Ｂ）。特に、ＣＴＣベ 法が癌専門医によって指示された。化学療法治療を通し ースの調査に含まれる副作用はなくその平均重症度は絶 て患者は薬物投与前後に絶食した。患者によって採用さ 食によって上昇した（図２２ＡおよびＢ）。 れる絶食療法は異なった（表Ａ参照）が、軽度の疲労と 30 【００９９】 脱毛のみが報告された。さらに、好中球、リンパ球、白 化学療法の毒性副作用の多くは蓄積性であるので、我々 血球および血小板レベルを含む全白血球数は正常範囲内 は絶食および非絶食と関連付けた化学療法の副作用のす であった（図２０）。このことから、絶食は化学療法毒 べての調査データを比較した。勇気づけられることに、 性から血液細胞を防御し得ることが示唆される。 絶食サイクルの大部分が治療の後半部分に実施されたに 【００９６】 もかかわらず、より良い自己申告による健康結果が全て 症例１０： の患者によって報告された。少数の異質な癌患者群から この患者は７４歳老婦人で、２００８年にステージＩＶ の調査結果は、癌患者において絶食が安全かつ良く忍容 の子宮体部漿液性腺癌と診断された。その結果、手術と され、また、複数の化学療法依存性の副作用を改善する アジュバント化学療法が指示された。手術法は、腹式子 可能性も示唆する。バイアスが患者による副作用の評価 宮全摘術プラス両側卵管卵巣摘除術から成っていた（Ｔ 40 に影響するが、化学療法後に減少する複数の血球タイプ ＡＨ−ＢＳＯ）。加えて、骨盤リンパ節、大動脈周囲リ 数を改善する傾向は、絶食が実際に異なる化学療法薬に ンパ節および上大静脈リンパ節を切除した。最後に、右 対して防御する可能性を示唆する。特に、絶食は、酵母 尿管の顕著な肥大により、右腎摘除も実施した。それに からマウスまでの範囲の生物を種々の毒とストレスから 加え、カルボプラチン（４８０ｍｇ）およびパクリタキ 防御することが知られており、ゆえに、ヒトにおける複 セル（２８０ｍｇ）の６サイクルを３週毎に適用した。 数の化学療法薬に対する防御効果は驚くにはあたらない 最初の治療前に患者は通常の食事を摂った。彼女は疲労 。 、脱力、脱毛、頭痛を経験し、また、胃腸不快感も訴え 【０１００】 た（図２１）。対照的に、２回目のサイクル前と残りの 飲水に加え化学療法の前後に絶食した患者の一部は、本 治療の間、患者は薬物投与前後に絶食した（表Ａ参照） 出願に記載されたカロリーレベルまたはタンパク質レベ 。化学療法薬は中毒性副作用の蓄積が良く知られている 50 ルを超えない極めて低カロリーの範囲の食事を消費した ( 30 ) JP 57 2015-186480 A 2015.10.29 58 が、本防御効果を経験し続けた。 【０１０１】 考察 癌治療の間の一般的に推奨される食事は、栄養不足を防 ぎまたは逆転させること、やせた体重を維持すること、 および栄養関連の副作用（食欲の減退、悪心、味覚変化 または腸の変化）を最少化するという全体的なゴールに 基づいている（Ｄｏｙｌｅ， ｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｎｇ ａｎｄ ｍｅｎｔ， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｆｔｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ａ Ｄｕｒｉ Ｔｒｅａｔ 10 ２００６）。標準的な化学療法後の食事に 反して、本シリーズの大部分の患者は、絶食が実行可能 で、疲労、脱力、悪心、嘔吐および腹部仙痛等の副作用 を軽減することによる利益を報告した。絶食中にめまい 、空腹、または頭痛を含む軽微な愁訴があったが、仕事 中に正常な活動を妨げないようなレベルであった。 【０１０２】 体重減少は癌患者の主要な関心である。これは、癌自体 、化学療法または胃腸障害後の食欲減退によるかもしれ ない。特にこの症例では、絶食中の体重減少は大部分の 20 患者で速やかに回復し、事実これらの治療完了後患者ら は元の体重に到達した。絶食とともにおよび非絶食で化 学療法を受けた患者にとって、化学毒性の副作用は絶食 サイクル中減弱されると思われた。この介入によって軽 減されると思われる症状は主に胃腸および全身性であっ た。 【０１０３】 非悪性細胞では、絶食等の環境的に困難な条件は、生物 が増殖／再増殖を抑制することを刺激し、そのエネルギ ーを維持／修復に転換させ、およびその生存のチャンス 30 【実施例４】 を最大化する（Ｌｏｎｇｏ， 【０１０５】 ， Ｃｅｌｌ ｒｅｖｉｅｗ ２００５）。ゆえに、ＩＧＦ−Ｉ等の増殖因子は減 ＩＧＦ−Ｉは正常細胞および悪性細胞において化学療法 少し、絶食応答における異常タンパク質応答（ＵＰＲ） に対する分別的耐性を調節する の増加等のストレス耐性機序は増加する。癌の６つの特 【０１０６】 徴において記載の通り、正常細胞はこれらの変化に応答 要約 し、悪性細胞は増殖シグナルの自給自足により非応答性 骨髄抑制、胃腸障害、および疲労を含む化学療法毒性副 であろう（Ｈａｎａｈａｎ， ｏ 作用は癌治療の用量と期間を制限する。幾つかの化学療 ２０００）。ゆえに、絶食は癌細 法防御物質は薬物依存性および組織特異的な防御を供給 ｆ ｃａｎｃｅｒ， Ｈａｌｌｍａｒｋｓ 胞に対する薬物活性を減じることなく、化学療法毒性か ら正常細胞を選択的に防御するであろう。 しているが、これらの化合物が正常細胞と癌細胞の分別 40 【０１０４】 的な防御において広い役割を有することができるかどう かは知られていない。最近、我々は短期絶食（ＳＴＳ） が癌細胞ではなく正常細胞およびマウスを化学療法から 選択的に防御する（分別的ストレス耐性、ＤＳＲ）こと を報告した。ここに、我々はＳＴＳ依存性防御の機序を 調べた。マウスでは、７２時間絶食はＩＧＦ−Ｉを７０ ％まで低下させ、ＩＧＦ−Ｉ阻害物質ＩＧＦＢＰ−１の レベルを１１倍増加させた。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉシ グナル伝達の低下は、グリオーマ細胞ではなく、初代グ リア細胞をシクロホスファミドから防御し、マウス胎児 50 線維芽細胞（ＭＥＦ）をドキソルビシン依存性のＤＮＡ ( 31 ) JP 59 2015-186480 A 2015.10.29 60 障害から防御した。循環ＩＧＦ−Ｉレベルが７０−８０ 資を支持する。 ％低下しているＬＩＤマウスは、試験した化学療法薬４ 【０１１０】 薬の内３薬を防御し、ドキソルビシン処理したメラノー 正常細胞と癌細胞は多くの様式で異なるが、すべての癌 マ担癌ＬＩＤマウスの６０％が長期生存を伸ばしたのに 細胞を正常細胞から差別する特徴はほとんどない。癌の 対し、すべての対照マウスは癌転移または化学療法毒性 特質のレビューで記載したように、正常細胞が癌化する のいずれかで死亡した。これらの結果はＩＧＦ−Ｉが癌 のに必要とされる多くの条件の内増殖シグナルにおける 細胞ではなく、正常細胞における防御の潜在的な阻害物 自給自足および増殖抑制シグナルに対する非感受性は特 質であることを示唆する。 に重要である［２０］。増殖シグナルにおける自給自足 【０１０７】 序論 は、条件に関係なく増殖経路を構造的に活性化する原因 10 となる癌遺伝子における機能獲得型の突然変異によって 殆どの化学療法剤は、正常細胞に用量を制限する毒性に しばしば可能となる（例えばＩＧＦ−ＩＲまたは下流の つながる著明な障害をもたらして、患者に対する短期お Ｒａｓ，Ａｋｔ，ｍＴｏｒ，など）。特に、ＲＡＳ／Ｒ よび長期副作用のいずれも有する。薬物開発は、癌特異 ＡＦ／ＭＡＰＫおよびＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路 抗原を標的とする抗体［１］または狭い治療指数を有す は、ＣＲと絶食［２１］、おそらくＩＧＦ−Ｉシグナル る薬剤［２，３］等の一連の選択的抗腫瘍剤によりこれ 伝達の減少により下方制御され得る。一方、増殖抑制シ らの副作用を減らしてきたが、毒性は癌治療を制限し続 グナルに対する非感受性は、腫瘍抑制遺伝子（例えば、 けている。ゆえに、不要な毒性副作用を減じる介入は多 Ｒｂ，ｐ５３，ＰＴＥＮなど）の機能喪失突然変異によ くの化学療法薬の有効性を増強することができよう。 るものであり、癌細胞が抗増殖シグナルを無視すること アミホスチン、グルタチオン、メスナ、およびデクスラ を可能にする［２０，２２］。Ｓ．セレビシエについて ゾキサン等の化学防御化合物が研究され、特定の組織の 20 の我々の研究では、我々は、Ｒａｓ，ＡｋｔおよびＳ６ 薬物依存性防御を供給することを示してきたが、これら Ｋの相同体はカロリー制限依存性ストレス耐性の主要な の化合物の使用は無病生存期間または全生存期間を増加 メディエーターであることを示した。我々は、ＩＧＦ− することを示してはいない［４，５］。最近、我々は短 Ｉ／Ｒａｓシグナル伝達が酸化障害に対してラット神経 期絶食（ＳＴＳ）が広範囲の正常細胞に防御を提供する を増感し［２３］、ＲＡＳ癌遺伝とＡＫＴ癌遺伝子の相 が、悪性細胞には提供しないか、またははるかに少なく 同体が酵母を種々のストレス暴露と化学療法薬に対し増 、生存率の改善につながっていることを報告した［６］ 感させることも報告した［６，２４］（図２４）。増殖 。 と維持の調節シグナルに対する正常細胞と癌細胞の異な 【０１０８】 る応答は、我々の分別的ストレス耐性戦略の基礎である 正常な条件下では、生物の有限なエネルギー源は増殖と 。 維持の間で精巧に平衡が保たれている［７］。しかし、 30 【０１１１】 絶食条件等の困難な環境下では、エネルギーを成長から 患者にとって治療期間中の長期かつ極端な食事制限の実 維持へ転換することによって、増殖を犠牲にして防御と 施は不可能または不本意であるという理由により、絶食 生存を増強する［８］。種々のモデル動物における加齢 の臨床適用は制限されてきたであろうことから、我々は 研究は、カロリー制限と増殖促進ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の 絶食のＤＳＲに対する有益な効果を介在する可能性のあ 欠乏が多くの生理学的特徴を共有し、寿命とストレス耐 る経路を調べた（図２４）。 性を増加させることができることを示している［９］。 【０１１２】 【０１０９】 結果 増殖ホルモン（ＧＨ）はその増殖効果の主要なメディエ 短期絶食は増殖促進ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の成分を調節す ーターであるＩＧＦ−Ｉの産生を直接調節する［１０］ る 。絶食中、新しい環境に対する生理学的適応の結果とし 40 分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）に対する絶食の有益な効 てＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸における幾つかの変化が起きる。 果におけるＧＨ，ＩＧＦ−Ｉの役割を調べるため、ＳＴ ヒトでは、短期絶食（３６−７２時間）に応答してＧＨ Ｓ実施マウスにおけるＧＨ／ＩＧＦ−Ｉおよびにその結 分泌が増加するにもかかわらずＩＧＦ−Ｉレベルは劇的 合タンパク質ＩＧＦＢＰ−１と−３の循環レベルを測定 に減少する［１１−１４］。マウスでは短期絶食（２４ することからスタートした。ＣＤ−１マウスを７２時間 −７２時間）によりＧＨとＩＧＦ−Ｉのいずれも減少す 絶食させ、血液を採取してグルコースレベルと血漿ＧＨ る［１５，１６］。ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達が欠乏する 、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦＢＰ−１と−３のレベルを 長寿命生物は複数のタイプのストレスに耐性であること 測定した。ＳＴＳ７２時間後、マウスは約２０％の体重 も示されている［１７−１９］。我々の仮説は、絶食に を減らし、糖レベルは４１％まで減少し、ＧＨレベルは 応答するＩＧＦ−Ｉの低下は増殖促進経路を多くの細胞 わずかに増加し、ＩＧＦ−Ｉレベルは７０％減少した（ で抑制するというものであり、エネルギーの維持への投 50 図２３Ａ−Ｄ）。ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）を ( 32 ) JP 2015-186480 61 A 2015.10.29 62 活性化し得るＩＧＦ−Ｉのバイオアベイラビリティは、 減少、結果としてＩＧＦ−Ｉを含む増殖因子の減少は、 ＩＧＦ結合タンパク質によって調節されている。絶食マ １５ｍｇ／ｍｌＣＰの初代グリアに対する毒性を軽減し ウスでは、通常ＩＧＦ−Ｉのシグナル伝達を減らすＩＧ たが、Ｃ６グリオーマ細胞は軽減しなかった（図２５Ｂ ＦＢＰ−１のレベルが１１．４倍増加していた（図２３ ）。我々は、また、ＩＧＦ−Ｉを培養液に添加すること Ｅ）。これらの結果は、ヒトおよびラットでは絶食に応 によって高用量ＣＰ毒性に対するＩＧＦ−Ｉ上昇の効果 答してＩＧＦＢＰ−Ｉが増加することを示す報告［１６ を試験した。１００ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−Ｉ（成人ヒト血 ，２５，２６］と一致し、マウスにおけるその過剰発現 清の低い正常範囲）［３２］でのプレインキュベーショ はＩＧＦ−Ｉの捕捉によって効果的に増殖を遅らせるこ ンにより初代混合グリアに対するＣＰ毒性の３倍の増強 と示す報告とも一致する。他方、７２時間絶食は、短期 がもたらされたが、Ｃ６グリオーマ細胞に対してはＣＰ 絶食ヒトおよびラットの報告［１６，２７］と一致して 10 毒性を増強しなかった（図２５Ｃ）。同様な結果がＩＧ ＩＧＦＢＰ−３レベルを４２％まで減らした（図２３Ｆ Ｆ−Ｉと酸化ストレス剤パラコートで併用処理した初代 ）。ＩＧＦＢＰ−３の減少についての機序の説明は明白 ニューロンおよびニューロン様褐色細胞腫細胞（ＰＣ１ ではないが、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−Ｉ非依存性効果 ２）について得られた。これらの結果は、我々の絶食お ［２８］、またはＩＧＦ−Ｉへの親和性の増加による可 よびＤＳＲについての以前の研究［６］と一致し、ＩＧ 能性がある［２７］。 Ｆ−Ｉシグナル伝達の下方制御が化学療法毒性から正常 【０１１３】 細胞を防御し得るが、癌細胞では防御しないという仮説 以前に我々は、低グルコース（正常な１００ｍｇ／ｄｌ を支持する。 に対して５０ｍｇ／ｄｌ）および低血清（１％ウシ胎児 【０１１５】 血清；結果的にＩＧＦ−Ｉを含む幾つかの増殖因子が減 マウス胚線維芽細胞におけるＩＧＦ−ＩＲ欠損またはス 少）でプレインキュベートした初代グリア細胞がアルキ 20 トレス耐性における過剰発現の効果 ル化化学療法剤であるシクロホスファミドに対する防御 分別的なストレス耐性に関与する機序の検討を開始する を増強したが、グリオーマ細胞ではかかる増強は見られ ため、我々はｉｇｆ１ｒ欠損（Ｒ なかったことを示した［６］。絶食マウスのグルコース −ＩＲ過剰発現（Ｒ レベルはＩＧＦ−Ｉレベルの劇的な減少とともに同様な 胞（ＭＥＦ）をＤＸＲで処理した［３３］。全ての細胞 レベルに低下した（図２３ＢおよびＤ）。ゆえに、主要 は増殖の差を最少化するためコンフルエントになるまで な増殖促進因子ＩＧＦ−Ｉの低下はＤＳＲに対する絶食 増殖させ、ＤＸＲで２４時間または４８時間処理した。 の効果の一部を介在する可能性がある（図２３Ｄおよび ＤＸＲ処理２４時間後、Ｒ Ｅ；図２４）。 より高い生存率を示した。この効果は２５μＭで最も顕 【０１１４】 著であり、８０％を超すＲ 低下したＩＧＦ−Ｉシグナル伝達は高用量シクロホスフ 30 胞は３０％のみの生存であった（図２６Ａ，Ｐ＜０．０ ァミドからグリオーマ細胞ではなく初代グリア細胞を防 ００５）。細胞を４８時間処理した場合同様な結果が観 御する 察され、Ｒ ＩＧＦ−Ｉ様シグナル伝達は、単純な酵母から虫、ハエ れぞれ５０％ 、およびマウスまでの範囲の生物において寿命とストレ ０．０２）。 ス耐性の調節に関わっている［９，２９−３１］。イン 【０１１６】 ビトロでの化学療法薬に対するＤＳＲにおけるＩＧＦ− ＩＧＦ−Ｉが如何にして化学療法毒性を防御するかを調 Ｉシグナル伝達の役割を調べるため、我々は、正常細胞 べるため、我々はコメット解析を用いてＤＮＡ障害を測 およびそれに相当する癌細胞株をアルキル化細胞障害性 定した。ＤＸＲ誘発ＤＮＡ障害はＲ 薬剤であるシクロホスファミド（ＣＰ）で処理する前に ＋ ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）阻止抗体、異なる血 40 を超える差があった（図２６ＣおよびＤ、Ｐ＜０．００ 清濃度、または過剰なＩＧＦ−Ｉのいずれかとともにイ １）。特に、Ｒ ンキュベートした。初代混合ラットグリア（アストロサ 質転換に耐性を示した。このことは線維芽細胞が培養中 イト＋５−１０％ミクログリア）および３種のラットグ にしばしば自発的に形質転換することを考慮すると注目 リオーマ細胞株（Ｃ６，Ａ１０−８５および９Ｌ）を試 に値する［３４］。これらの結果は、低下したＩＧＦ− 験した。全ての細胞は増殖率の違いを最少にするために Ｉシグナル伝達が酸化依存性のＤＮＡ障害を軽減するこ コンフルエントになるまで増殖させた。最初に、拮抗す とによって正常細胞を防御するという我々の仮説を支持 るＩＧＦ−ＩＲ抗体（αＩＲ３）とのプレインキュベー する［３５］。 ションによりＣＰ毒性に対して初代グリアが防御された 【０１１７】 が、３種のグリオーマ細胞株は防御されなかった（図２ Ｓ．セレビシエにおけるＩＧＦ−ＩＲ下流エレメント相 ５Ａ）。血清レベルにおける通常の１０％から１％への 50 同体の役割 − ＋ およびＲ − 細胞）またはＩＧＦ 細胞）を有するマウス胚線維芽細 ＋ − − 細胞はＲ ＋ 細胞に比較して 細胞が生存したが、Ｒ ＋ 細 細胞の２５μＭでの生存率はそ ｖｓ．１２％であった（図２６Ｂ，Ｐ＜ − 細胞と比較してＲ 細胞で有意に高く、コメット解析で評価した場合３倍 − 細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原による形 ( 33 ) JP 63 2015-186480 A 2015.10.29 64 ＩＧＦ−ＩＲの下方制御が化学毒性とそのＤＮＡ障害へ Ｈ分泌およびＩＧＦ−Ｉ産生を減らすために使用される の効果を防御する機序を理解するため、我々はＳ．セレ 。また、オクトレオチドは絶食に応答してソマトスタチ ビシエ単純モデル系に取り掛かった。酵母を使用する理 ンが上昇することから選択された［３８］。以前の報告 論的根拠は、我々の以前の研究で示した酸化ストレス、 で、我々は短期絶食（ＳＴＳ）が、トポイソメラーゼＩ ＤＮＡアルキル化、および熱ストレスに対する細胞防衛 Ｉを阻害し、広範に使用される化学療法薬である高用量 の調節における哺乳類のＲａｓとＡｋｔまたはＳ６Ｋの エトポシドに対してＤＳＲを供給することを示した［６ 相同体のＲａｓ２およびＳｃｈ９、およびＩＧＦ−ＩＲ ］。ここで、我々はこのエトポシドに対する防御がオク の下流にあるＳＣＨ９およびＲＡＳ２相同体の中心的シ トレオチドによるＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸阻害によって獲得 グナル伝達の役割に基づいている［６，２４，３６］。 、または増強され得るかどうかを試験した。興味深いこ 我々は、ＤＸＲ耐性に対するＲＡＳ２およびＳＣＨ９欠 10 とに、オクトレオチドおよび他のソマトスタチン類似体 損の効果を試験した。ＤＳＲをさらに調べるため、我々 は２つの異なる効果：ソマトスタチン受容体によって介 はヒト発癌性のＲａｓ突然変異のモデルとなる構造的に 在される腫瘍に対する直接作用［４０，４１］および増 活性なＲＡＳ２（ＲＡＳ２ ｖ ａ ｌ １ ９ ）を発現する遺伝 殖ホルモン遊離の阻害およびＩＧＦ−Ｉの低下による間 子で形質転換した細胞も調べた。ＳＣＨ９（ｓｃｈ９Δ 接的な効果［４０−４２］によって、多数の癌に治療効 ）またはＳＣＨ９およびＲＡＳ２（ｓｃｈ９Δｒａｓ２ 果を有することが知られている［３９］。我々は、とり Δ）の欠損は、その野生型（ＷＴ）株と比較してＤＸＲ わけ悪性度が高く、神経芽細胞腫（ＮＢ）のモデルであ に対する有意な防御を供給した（図２７Ａ）。しかし、 る腫瘍株（ＮＸＳ２）を選択した［４３］。ＮＸＳ２細 我々の哺乳類研究に類似して、癌遺伝子様ＲＡＳ２ ｌ １ ９ ｖ ａ の発現はＲＡＳ２およびＳＣＨ９欠損によって供 給される防御を逆転させた。ＤＸＲ処理４８時間後、Ｗ 20 ＴおよびＲＡＳ２ ｖ ａ ｌ １ ９ 胞の静脈内注入によって肝、腎、副腎、および卵巣を含 む複数の臓器に一貫した転移形成が生じた［４３］。 高用量のエトポシド（８０ｍｇ／ｋｇ）の単回注入によ 発現細胞の５０％は生存し って、治療しなければ４０日以内に転移して死亡してい たが、ｓｃｈ９Δの７０％およびｓｃｈ９Δｒａｓ２Δ たであろう担癌マウスの寿命が延長された。我々の以前 の９０％超が生存した（図２７Ａ）。この効果は、ＤＸ の研究では、ＳＴＳは急性の化学毒性関連の死亡を顕著 Ｒ処理７２時間後はさらに明白であり、ｓｃｈ９Δｒａ に減少させたが、癌細胞に対する部分的な防御も供給し ｓ２Δおよびｓｃｈ９Δは高度に防御された（それぞれ た［６］。我々の今回の結果は、オクトレオチドが化学 ８８％および７０％の生存）が、この防御はＲＡＳ２ ｖ 療法から動物を防御するには十分ではないが、ＳＴＳと ａ ｌ １ ９ の発現により逆転された（ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ の併用によりＮＸＳ２のエトポシドに対する感受性が高 ｖ ａ ｌ １ ９ ；２７％生存）。分別的なＤＸＲ耐性の分子 められていることを示している。しかし、通常はヒトの 機序を調べるため、我々は、ＤＮＡ突然変異頻度をモニ ＧＨ産生を減じるために使用されるオクトレオチドはマ ターし、Ｃａｎ ｒ コロニー／１０ ６ 細胞として測定した 30 ウスではＩＧＦ−Ｉレベル低下作用はマイナーであり、 ［３７］。ＤＸＲ処理は全ての株で突然変異頻度を増加 ゆえにオクトレオチドによる宿主防御の欠乏はＩＧＦ− させた。生存解析に一致して、ｓｃｈ９Δおよびｓｃｈ Ｉレベルについてのマイナーな効果によって説明可能で ９Δｒａｓ２Δは最も低い突然変異頻度を示したが、Ｒ あろう。恒常的な機序がソマトスタチンの効果に拮抗し ＡＳ２ ｖ ａ ｌ １ ９ 発現は突然変異頻度を増加させた（図 ２７Ｂ）。ｓｃｈ９ΔにおけるＲＡＳ２ （ｓｃｈ９ΔＲＡＳ２ ｖ ａ ｌ １ ９ ｖ ａ ｌ １ ９ 発現 ）は、Ｓｃｈ９欠損に 、オクトレオチド治療に対する急速な耐性につながり、 ゆえにＩＧＦ−Ｉレベルの有意な減少に失敗した可能性 がある。 よって供給される防御を完全に逆転させ、突然変異頻度 【０１１９】 の３倍の増加をもたらした（図２７）。これらのデータ オクトレオチドが直接または間接にＮＸＳ２細胞に対す は、低下したＲａｓ２およびＳｃｈ９シグナル伝達の有 る増感効果を示すかどうかを調べるため、我々はＮＸＳ 益な効果が少なくとも部分的には細胞におけるＤＮＡ障 40 ２細胞をオクトレオチドとエトポシドでインビトロ処理 害に対する防御の増強によること、および癌遺伝子の発 した。オクトレオチドはエトポシドの細胞培養における 現によって逆転されることを示唆する。 ＮＸＳ２細胞に対する毒性を変化させず、マウスにおけ 【０１１８】 るオクトレオチドの増感効果は間接的であることが示唆 オクトレオチドがＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞を増感させ された。同時にこのことは、オクトレオチド単独では絶 るが、高用量エトポシドに対してマウスを防御しない 食様の宿主防御を供給しないが、癌細胞を増感させるこ ＩＧＦ−Ｉの低下が哺乳類培養細胞において分別的な化 とによってＳＴＳにより供給される癌細胞に対する部分 学療法防御を供給することから、我々はＧＨ／ＩＧＦ− 的な防御を逆転させる可能性があることを暗示する。オ Ｉ軸の薬理学的な操作がインビボにおいてＤＳＲを誘導 クトレオチドが化学療法に対する他の腫瘍の感受性を増 し得るかどうかを調べた。ソマトスタチン類似体オクト 感させる可能性を調べるさらなる研究が必要である。 レオチドは臨床において主に先端巨大症患者におけるＧ 50 【０１２０】 ( 34 ) JP 65 2015-186480 A 2015.10.29 66 ＬＩＤマウスにおける高用量化学療法に対するストレス 。ＤＸＲ注入後５日間に体重減少はＬＩＤマウスでより 耐性の増強 明白であったが、体重を減少し続け、毒性のサインを示 ＩＧＦ−ＩＲまたはその下流のエレメントが遺伝的に破 した対照とは異なり、ＬＩＤマウスはその後３週後の間 壊されたマウスは、酸化ストレスに対しより耐性である にはそれらの体重を回復させた。２番目のＤＸＲ注入（ ことが知られている［１７，４４］。ＩＧＦ−Ｉシグナ ２８ｍｇ／ｋｇ）は対照マウスにかなりの量のＤＸＲ関 ル伝達の減少が化学療法に対して防御するかどうかを決 連死（２５％生存）をもたらしたが、ＬＩＤマウスは１ 定するため、我々は、アルブミン駆動Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ ００％の生存であった（図２８Ｄ，ｎ＝５／ＬＩＤ， 組み換え系［４５］を用いて、絶食７２時間後のマウス ｎ＝４／対照，Ｐ＝０．０２２）。 に似た循環ＩＧＦ−Ｉ［４６］の７０−８０％減少を出 【０１２１】 生後に来たす条件付き肝ｉｇｆ１遺伝子欠損（ＬＩＤ） 10 メラノーマ担癌ＬＩＤマウスにおける高用量ドキソルビ トランスジェニックマウスモデルを試験した（図２３Ｄ シンに対する分別的なストレス耐性 ）。このＬＩＤマウスは化学療法耐性におけるＩＧＦ− 次に、我々は、主に肺に転移する悪性度の高いメラノー Ｉと絶食の機序の関連性を調べるためのモデルを供給す マ細胞株（Ｂ１６Ｆｌｕｃ）を移植したＬＩＤマウスを る［４７］。最初に、エトポシドとＳＴＳ／オクトレオ モニターすることによってインビボＤＳＲ試験を実施し チドについての我々の有望な結果に基づき、我々は高用 た［５３］。Ｂ１６ＦｌｕｃはＢ１６マウスメラノーマ 量エトポシドでＬＩＤマウスを検証した。驚いたことに 細胞株の発光性の誘導細胞である。ゆえに、腫瘍の進行 、１００ｍｇ／ｋｇのエトポシド単回投与に対してＬＩ と縮小を可視化でき、生物発光画像技術（ＢＬＩ）を用 Ｄマウスは対照マウス（マウスはｌｏｘＰ−隣接ｉｇｆ いてインビボで定量することができる［５３］。ＬＩＤ １遺伝子はホモ接合性であるが、ｃｒｅリコンビナーゼ マウスとその対照マウスにＢ１６Ｆｌｕｃ（２ｘ１０ を欠損する）に比べ防御されず［４５］、生存率はＬＩ 20 細胞／マウス）メラノーマ細胞を静脈内に注入し、高用 Ｄマウスと対照マウスそれぞれ５０％ ｖｓ．８８％で 量のＤＸＲで２サイクル治療した（図７Ａ，ｎ＝４／Ｌ あった（図２８Ａ、ｎ＝１０／ＬＩＤ，ｎ＝９／対照、 ＩＤ−Ｂ１６，ｎ＝５／ＬＩＤ−Ｂ１６−ＤＸＲ，ｎ＝ Ｐ＝０．０６４）。その後、我々のインビトロ結果に基 ８／対照−Ｂ１６，ｎ＝７／対照−Ｂ１６−ＤＸＲ）。 づきＬＩＤマウスでＣＰを試験した。５００ｍｇ／ｋｇ ＩＧＦ−Ｉは形質転換、抗アポトーシス、腫瘍増殖、お のＣＰで処理したＬＩＤマウスは有意により高い耐性を よび転移において主な役割を果たす［５４］が、ＬＩＤ 示し、ＬＩＤマウスと対照マウスの生存率はそれぞれ７ マウスとその対照マウスのいずれも癌移植後早くも２５ ０％ ｖｓ．３０％であった（図２８Ｂ，ｎ＝２０／群 日目には転移に屈し始めた。２サイクルの高用量ＤＸＲ ，Ｐ＝０．００１）。さらに、ＬＩＤマウスがそれらの はすべてのマウスで転移を遅延させ生存時間を延長した 平均体重を１０％のみ失ったのに対し、対照マウスは２ （図２９ＢおよびＣ）。ＤＸＲ治療した対照マウスのか ０％失った。生存ＬＩＤマウスは何らの毒性サインも示 30 なりの数が心筋症のサインがあって毒性で死亡（４３％ さなかった。低下したＩＧＦ−Ｉによる防御の範囲を決 ）したが、ＬＩＤマウスはＤＸＲ毒性では一匹も死なな 定するため、我々は化学療法薬の異なるクラスを表す２ かった（図２９ＤおよびＦ）。加えて、ＬＩＤマウスは つの追加薬５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とドキソ 体重維持で軽度の有意性を示した（図２９Ｅ）。癌移植 ルビシン（ＤＸＲ）を試験した。シクロホスファミドは ９０日後には化学療法を受けたすべての対照マウスは癌 ＤＮＡアルキル化剤［４８］、５−ＦＵは代謝拮抗剤［ 転移またはドキソルビシン毒性で死亡していたが、２サ ４９］、ＤＸＲは挿入剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻 イクルの高用量ＤＸＲ治療を受けたＬＩＤマウスの６０ 害剤［５０，５１］、およびエトポシドはトポイソメラ ％は癌がなく、明らかな毒性副作用もなかった（図２９ ーゼＩＩ阻害剤［５２］である。高用量の５−ＦＵで処 Ｂ，Ｐ＜０．０５）。すべてのＬＩＤマウスの死亡は癌 理後、ＬＩＤおよび対照における生存率は改善され、そ 転移によるものであった。ＤＸＲで治療されたＢ１６Ｆ れぞれ５５％ ｌｕｃ注入対照およびＬＩＤマウスにおける癌の進行と ｖｓ．１０％であったが、その差は有意 40 ５ ではなかった（図２８Ｃ，ｎ＝１１／ＬＩＤ，ｎ＝１０ 死亡は同様であり、循環ＩＧＦ−Ｉの低下は高用量化学 ／対照、Ｐ＝０．１４８）。同様であるが、より明白な 療法から癌細胞ではなく宿主を防御することが示唆され 効果がＤＸＲにつき得られた。高用量の単回注入後げっ た。 歯類の尾静脈に不可逆性の障害を引き起こし得るエトポ 【０１２２】 シドおよび他の薬物と異なり、ＤＸＲは２−３サイクル 考察 注入ができる。ゆえに、化学療法の複数のサイクルの効 以前の報告において、我々は、短期絶食（ＳＴＳ）に基 果を試験するため、我々は２サイクルの高用量ＤＸＲで づくＤＳＲ法が高用量化学療法に対して癌細胞ではなく ＬＩＤマウスを検証した。最初のＤＸＲ注入（２０ｍｇ 、宿主を防御することを記述した。この記述の基礎には ／ｋｇ）は何らの毒性関連死ももたらさなかったが、全 、細胞が種々の侵襲に対して細胞を防御するために残存 てのマウスで著しい体重減少につながった（図２８Ｄ） 50 するエネルギー源を使う目的で絶食に応答して侵入する ( 35 ) JP 2015-186480 67 A 2015.10.29 68 非分裂または低分裂「維持モード」の存在があると思わ Ｄマウスに起因する我々の結果に基づき、循環ＩＧＦ− れる（図３０）。ここに我々は、哺乳類のＤＳＲ調節に Ｉを減らす戦略が特定の化学療法薬の毒性を増強する可 おけるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの役割を調べ、循 能性もある。それゆえ、各薬物とＩＧＦ−Ｉ低下／遮断 環ＩＧＦ−Ｉの大きな低下は化学療法に対して癌細胞で 療法の間の適合性は、候補として考慮される前に前臨床 はなく宿主を防御することができることを見出した。低 試験で注意深く試験されるべきである。 レベルのＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＲの下流の２つの主 【０１２４】 要な経路の成分であるＲａｓおよびＡｋｔを含む細胞内 要約すれば、我々のマウスにおける研究は、循環ＩＧＦ の分裂促進シグナル伝達経路を縮小させることができる −Ｉの大きな低下は癌細胞ではなく、宿主に耐性の増強 。この細胞分裂刺激の低下は正常細胞に細胞周期を停止 を供給することができ、ゆえに、絶食を必要とすること させ［５５，５６］、Ａｋｔ，Ｒａｓ／ＥＲＫ，ＦＯＸ 10 なく癌治療を増強するための方法の基礎を供給する。し Ｏ，ＳｉｒＴ１，およびＥＲストレス応答［６，１８， かし、絶食とＩＧＦ−Ｉ低下の組み合わせはさらに明確 ２３，３５］を含むタンパク質によって制御される機序 な効果を供給し得る。循環ＩＧＦ−Ｉの低下が種々の癌 によってエネルギーを修復へ転換させる、それによって に利用される可能性があることに注目することは重要で 高度な防御“維持モード”［６，５６］に進入させると ある。 我々は信ずる。一方、癌細胞は増殖シグナルにおいて自 【０１２５】 給自足であり、生理学的な抗増殖シグナルに低応答また 方法 は応答しない［６，２０，３５］。これは、完全なコン 細胞株 フルエント下で処理された我々のＲ ＋ − 細胞に 初代混合グリア細胞は、前述のように１−３日齢のスプ 観察されたＤＸＲに対する分別的な防御を説明できるで ラーグドーリーラット新生児（チャールスリバー社）の あろう。加えて、我々の酵母実験は、ＲＡＳおよび／ま 20 大脳皮質から取得した［５８］。１０％ウシ胎児血清（ たはＡＫＴ／Ｓ６Ｋの相同体の欠損がＤＸＲに対する防 ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１０−１４ 御を促進するが、発癌性のＲＡＳ２ およびＲ ｖ ａ ｌ １ ９ の発現が 日間培養した細胞をアッセイに使用した。 細胞分裂と独立して防御を逆転させることを示している Ｃ６，Ａ１０−８５、および９Ｌラットグリオーマ細胞 。これらの結果は、ＲａｓからＰＴＥＮ／ＡＫＴ から 株はＣｈｅｎ博士（南カリフォルニア大学）のご厚意に ＰＫＡ経路の範囲の経路を活性化する発癌性の突然変異 より提供され、Ｒ が癌細胞におけるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達下方制御の防 士（トーマスジェファーソン大学）のご厚意により提供 御効果を逆転させるのに十分である可能性があり、ゆえ され、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、５％炭 に宿主および種々の癌の分別的防御を許容するという可 酸ガス、３７℃で維持された。Ｒ 能性を高める。特に、ＩＧＦ−ＩＲは正常細胞において れぞれヒトＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するまたはＩＧＦ− Ｒａｓ、Ａｋｔなどを活性化することができる多くの受 30 ＩＲを欠損するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）であり、 容体の内に単なる一つであり、それゆえ、分別的なスト 前述のように作製された［３３］。Ｒ レス耐性を供給するために下方制御することができる受 ｒ遺伝子を標的破壊されたマウス胚に由来３Ｔ３様細胞 容体の内のただ一つであると説明することができよう。 である［３３］。Ｒ 【０１２３】 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下 前臨床試験は、ＩＧＦ−ＩＲ標的戦略が、多発性骨髄腫 にヒトｉｇｆ１ｒ 、前立腺癌、乳癌、結腸癌に加えて他の癌の治療に有効 １８日のスプラーグドーリーラット大脳皮質からの初代 であり得ることを示している［４２，５７］。かかる薬 ニューロンを０．５ｍＭのＬ−グルタミン、２５μＭの 剤に見られる抗腫瘍効果は、ＩＧＦ−ＩＲ不活化に起因 Ｌ−グルタミン酸および２％Ｂ−２７を添加した神経培 するアポトーシスに依存すると考えられる［５７］。し 養用基礎培地（インビトロジェン社）中に分離し、ホウ かし、ＩＧＦ−ＩＲ遮断は正常細胞においてアポトーシ 40 酸塩緩衝液（０．１５Ｍ，ｐＨ８．４）に溶解した１０ スを開始させることもでき、血液細胞の増殖／回復に介 μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジンでプレコートした９６穴プ 入することによって高用量化学療法に対して防御しない レートに６４０細胞／ｍｍ 可能性があることに注目しなければならない。我々のＬ Ｂ−２７および０．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加した ＩＤマウスで観察されたように、低下したＩＧＦ−Ｉは 神経培養用基礎培地中、５％炭酸ガス、３７℃で４日間 ＩＧＦ−ＩＲ遮断とは異なり、癌細胞死をもたらすこと 維持した。ＰＣ１２ラット褐色細胞腫細胞株（ＡＴＣＣ はないが、化学毒性に対する正常細胞の耐性を選択的に ）を１５％ウマ血清および２．５％ウシ胎児血清を添加 増強することができ、かつ、癌細胞の化学療法に対する したＦ１２Ｋ培地中、５％炭酸ガス、３７℃で維持した 感受性を高める可能性がある。これは、ＬＩＤ−ＴＲＡ 。 ＭＰモデルにおける前立腺癌の正常な進展に関する我々 【０１２６】 の最近の観察と一致する［４６］。エトポシド処理ＬＩ 50 インビトロＩＧＦ−Ｉ調節 ＋ およびＲ ＋ − 細胞はＢａｓｅｒｇａ博 ＋ およびＲ − 細胞株は、Ｒ − − 細胞はそ 細胞はｉｇｆ１ 細胞から得られ、 ｃＤＮＡを発現する［３３］。胎生 ２ で播種した。ニューロンは ( 36 ) JP 2015-186480 69 A 2015.10.29 70 すべての細胞は処理前にコンフルエントまで増殖させた 必須培地（インビトロジェン社）で２４時間処理した。 。ＩＧＦ−ＩＲ活性化の阻害は１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／ ＰＣ１２細胞はポリ−Ｄ−リシン被覆９６穴プレート上 Ｆ１２中２４時間の抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体 に５ｘ１０ （αＩＲ３，１μｇ／ｍｌ；カルビオケム社）で達成し ２４時間増殖させた。両タイプの細胞のいずれもその後 た。血清制限は、細胞を１０％または１％ＦＢＳのいず 適切な培地で１００μＭのパラコート単独、またはその れかを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中２４時間のインキュ ３０分後ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＧＦ ベートにより実施した。ＩＧＦ−Ｉ処理は、細胞を１％ −Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独で処理した。生存はＭＴ ＦＢＳおよびｒｈＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒ Ｔ還元アッセイにより決定し、対照に対する処理のパー ｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ セントで表した。 ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ，レホヴ ４ 細胞／穴で播種し、１％ＨＳ加Ｆ１２Ｋで ォト、イスラエル）加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で４８時間の 10 【０１２８】 インキュベートにより実施し、中年ヒトのＩＧＦ−Ｉレ インビトロ生存アッセイ ベル範囲内であることが示された［３２］。 細胞毒性は、ＣｙｔｏＴｏｘ 【０１２７】 ｏａｃｔｉｖｅ インビトロ薬物処理 ｙ キット（プロメガ株式会社）を用いて遊離した乳酸 初代グリアおよびＣ６，Ａ１０−８５，および９Ｌラッ トグリオーマ細胞を２ｘ１０ ４ 細胞／穴で播種し、９６ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａ 脱水素酵素（ＬＤＨ）またはメチルチアゾリルジフェニ ル−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）還元能のいず 穴プレートで４８時間インキュベートして増殖の差が最 れかで測定した。ＭＴＴはミトコンドリア（代謝的に活 小化する処理前にコンフルエントに達した。種々のＩＧ 性名細胞）の中でミトコンドリア還元酵素により還元さ Ｆ−Ｉ調節前処理後、シクロホスファミド（ＣＰ，シグ れて、不溶な紫ホルマザン結晶が生成し、この結晶は界 マ社）で処理した。グリア細胞はチトクロムＰ４５０を 20 面活性剤の添加により溶解した［１］。簡潔には、ＭＴ 発現することが報告されており、ゆえに、プロドラッグ ＴをＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌに調製し、１％ＦＢＳ加Ｄ ＣＰを代謝することができる［５９，６０］。ＣＰは１ ＭＥＭ／Ｆ１２培地中に希釈して最終濃度０．５ｍｇ／ ％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で４０ｍｇ／ｍｌに調製 ｍｌとし、アッセイ用とした。実験処理後、培地を１０ し、ろ過滅菌した。原液は４℃で２週間以内貯蔵した。 ０μｌのＭＴＴで置換し、細胞を３７℃で３−４時間イ 細胞は１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で種々の濃度の ンキュベートした。ホルマザン結晶を１００μｌ溶解緩 シクロホスファミド（０−１５ｍｇ／ｍｌ）で１０時間 衝液（（ｗ／ｖ）１５％ＳＤＳ，（ｖ／ｖ）５０％ジメ インキュベートした。Ｒ ＋ − およびＲ 細胞は２ｘ１０ ４ チルホルムアミド、ｐＨ４．７）で３７℃一晩（１６時 細胞／穴に播種し、９６穴プレート中でインキュベート 間）溶解した。生存は処理細胞の対照細胞に対するＭＴ し、また、ドキソルビシン（ＤＸＲ）処理前にコンフル Ｔ還元レベルの割合で表した。 エント（２日間）に増殖した。ＤＸＲは無菌生理食塩水 30 マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ 中で５ｍｇ／ｍｌに調製した。細胞をＤＸＲで２４時間 ０（モレキュラーデバイス社）およびＳｏｆｔＭａｘ およびＭＴＴ還元による生存解析前４８時間処理した。 Ｐｒｏ オクトレオチド存在または非存在下で（１０および５０ ）を用いて５７０ｎｍで吸収を読み取った。 μＭ）、異なる濃度のエトポシド（１−３μＭ）で７２ 【０１２９】 時間処理したＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞をスクレイピン コメット解析手順 グにより回収し、完全培地で洗浄し、トリパンブルー（ 細胞を培地（１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で１０ ０．０４％；シグマ社；セントルイス市、ミズーリ州） ５ で３７℃１分インキュベートした。その後、細胞をビル 処理した。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、製造 ケル計算盤（Ｔｅｃｎｏｖｅｔｒｏ、モンザ 業者の推奨する手順に従ってコメット解析（トレビジェ ミラノ、 ２５ ３．０ソフトウェア（モレキュラーデバイス社 ／ｍｌに希釈し、５０μＭのＤＸＲで３７℃、１時間 イタリア）中に設置し、位相差顕微鏡（オリンパス光学 40 ン社、ガイザーズバーグ、メリーランド州）にかけた。 工業株式会社、東京、日本）にてカウントした。顕微視 コメット画像はＮｉｋｏｎ 野（各処理につき４視野カウントした）あたりのトリパ ０蛍光顕微鏡により獲得し、Ｃｏｍｅｔ ンブルー陽性細胞（すなわち死細胞）、トリパンブルー フトウェア（ＴｒｉＴｅｋ 陰性細胞（すなわち生細胞）、および全細胞をカウント ）で解析した。各遺伝子型／処理群毎に１００−３００ した。死（または生）細胞の割合は、死（または生）細 細胞をスコア化した。 胞数を視野当たりの全細胞数で割って算出した。酸化ス 【０１３０】 トレスに対するＩＧＦ−Ｉの効果を決定するため、初代 血漿ｍＧＨ，ｍＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦＢＰ−１およ ラットニューロンおよびＰＣ１２細胞をＩＧＦ−Ｉおよ び−３の測定 びパラコートで処理した。皮質ニューロンは２１ｍＭグ 前述のように、Ｒ＆Ｄシステム（ミネアポリス、ミネソ ルコースおよび１％ウマ血清を添加したイーグルの最少 50 タ州）からの組み換えマウスＩＧＦ―Ｉタンパク質およ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３０ Ｓｃｏｒｅソ Ｃｏｒｐ．，ｖｅｒ１．５ ( 37 ) JP 71 2015-186480 A 2015.10.29 72 びモノクローナル抗体を用いて学内のＥＬＩＳＡ法によ 脱水、または下半身不随等で健康障害のサインを示した って血漿ｍＩＧＦ−Ｉ、およびｍＩＧＦＢＰ−１および 場合、キシリジン（２％キシロール， −３のアッセイを実施した［６１］。ｍＧＨレベルはラ ｒｌ， ット／マウスＧＨ 屠殺した。 ＥＬＩＳＡキット（アルプコダイア Ｂｉｏ９８ Ｓ ミラノ、イタリア）で麻酔後、頸椎脱臼により グノスティックス社）により測定した。 【０１３５】 【０１３１】 ＬＩＤマウスにおける化学療法治療に対するストレス耐 血糖測定 性 ７２時間絶食後、２％吸入イソフルレンによりマウスを ７５−１００週齢のＬＩＤマウスをヒト発癌モデルのた 麻酔し、左室心穿刺により血液を採取した。血糖はＰｒ めに使用した［６３］。肝がＩＧＦ−Ｉ産生の主要な供 ｅｃｉｓｉｏｎ 給源なので、条件付き肝ｉｇｆ１遺伝子ノックアウトマ Ｘｔｒａ血糖モニタリングシステム（ 10 アボットラボラトリーズ社、米国）を用いて測定した。 ウスは循環ＩＧＦ−Ｉレベルを８０％まで低下させてい 【０１３２】 る［４６］。アルブミンは生後１０日に肝で発現される マウスにおけるＳＴＳ／オクトレオチド処理 が、ｉｇｆ１遺伝子欠損に起因して、ＬＩＤマウスは、 マウスＮＸ３ＩＴ２８細胞株は前述の通りＧＤ２−陰性 ｉｇｆ１遺伝子ノックアウト（ｉｇｆ１−／−）マウス Ｃ１３００マウス神経芽細胞腫細胞株（Ａ／Ｊ背景）を のように早期死亡、増殖遅延、または発育障害を経験し Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからのマウス後根神経節細胞と ない［４５，６４，６５］。ＬＩＤマウスおよび対照マ ハイブリダイズして作製した［６２］。ＮＸＳ２亜系統 ウスに１００ｍｇ／ｋｇのエトポシドを静脈内に投与し は、その後、ＧＤ２を高発現するＮＸ３ＩＴ２８細胞の た。ＣＰは５００ｍｇ／ｋｇを投与した。ＣＰは生理食 選択によって創製した［４３］。体重１５−１８ｇの雌 塩水に４０ｍｇ／ｍｌで溶解し、腹腔内に注入した。５ 性Ａ／ＪマウスはＨａｒｌａｎ −フルオロウラシル（５−ＦＵ，シグマ社）は４００ｍ ｅｓ（Ｈａｒｌａｎ ｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ 20 Ｉｔａｌｙ，Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏａ ｇ／ｋｇを腹腔内に注入した。ドキソルビシン（ＤＸＲ Ｎａｔｉｓｏｎｅ，イタリア）より購入し、特定の ，シグマ社）は生理食塩水中で５ｍｇ／ｍｌに調製し、 ウイルスおよび抗原フリー条件下無菌ケージ内で飼育し 最初２０ｍｇ／ｋｇ、２２日後に２８ｍｇ／ｋｇで静脈 た。すべての手順はｌｉｃｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｅｔ 内に注入した。全ての薬物は異なるカテゴリーから選択 ｈｉｃａｌ ｔｈｅ Ｎａ した。ＣＰはＤＮＡアルキル化剤［４８］、５−ＦＵは ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ Ｉｎ 代謝拮抗剤［４９］、ＤＸＲは挿入剤およびトポイソメ ｓｔｉｔｕｔｅ，ジェノア、イタリア、およびイタリア Ｒｅｓｅａｒｃｈ ラーゼＩＩ阻害剤［５０，５１］、およびエトポシドは 保健省によってレビューおよび承認された。Ａ／Ｊマウ トポイソメラーゼＩＩ阻害剤である［５２］。エトポシ スは１ｍｇ／ｋｇ／日量のオクトレオチド（ＯＣＴ， ド、ＣＰ、５−フルオロウラシル、およびＤＸＲは活性 ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ 酸素種（ＲＯＳ）を増やし、酸化ストレスをもたらすこ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ，レ 30 ホボト、イスラエル）を４日間１００μｌの液量で尾静 とを示した［６６−６９］。すべてのマウスは毎日体重 脈より緩徐に投与して４日間前処理した。オクトレオチ 減少と疼痛およびストレス症状をモニターした。末期の ド処理４日後、マウスに前述の通りＮＸＳ２細胞（２０ 瀕死にあると決定されたマウスはＣＯ２ 麻酔下に安楽死 ０，０００細胞／マウス）を静脈内に注入した［４３］ させ、剖検を実施した。実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ 。腫瘍細胞を注入後、一部の動物を４８時間絶食させ、 ａｌ その後、８０ｍｇ／ｋｇのエトポシド（Ｔｅｖａ Ｐｈ ｍｍｉｔｔｅｅ（南カリフォルニア大学、ロサンゼルス Ｂ．Ｖ．，Ｍｉｊｄｒｅｃｈｔ，オランダ） 、カリフォルニア州）および国立衛生研究所ガイドライ ａｒｍａ を静脈内に単回投与した。化学療法後ＯＣＴをさらに４ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏ ンに従って実施した。 日間連日投与した。非食事介入対照群とＯＣＴ処理群も 調べた。 Ａｎｉｍａｌ 【０１３６】 40 ＬＩＤマウスにおけるＤＸＲに対する分別的ストレス耐 【０１３３】 性 オクトレオチド前処理：１ｍｇ／ｋｇ／日、１−４日目 分別的ストレス耐性を調べるため、マウスに高転移性メ 、４日間 ラノーマ細胞を注入した。７５−１００週齢のＬＩＤマ ＮＸＳ２：４日目に２００，０００／マウス ウスおよび対照マウスを使用した。Ｂ１６Ｆｌｕｃメラ ＳＴＳ：４日目から６日目（腫瘍細胞注入後） ノーマ細胞はＵＣＬＡのノア エトポシド：７日目に８０ｍｇ／ｋｇ なる贈呈であった。Ｂ１６Ｆｌｕｃ細胞はＢ１６細胞の オクトレオチド後処理：８−１１日目 類縁体であるが、ＣＭＶプロモーターの駆動によるホタ 【０１３４】 ルルシフェラーゼ遺伝子の安定な形質転換により光を生 毒性と有効性を決定するため、体重減少と一般行動につ 産する［５３］。注入前に、細胞を洗浄し、無菌生理食 き定期的にマウスをモニターした。動物は、腹部膨張、 50 塩水に懸濁した。各マウスに１００μｌ中の２ｘ１０ クラフト博士からの寛大 ５ ( 38 ) JP 2015-186480 73 A 2015.10.29 74 細胞を注入し、その後、別の１００μｌ無菌生理食塩水 増殖条件 を尾に残存する細胞の洗浄のために注入した。腫瘍接種 酵母の経時的寿命を使い古されたＳＤＣ培地で４８時間 ３日後、最初のＤＸＲ（ベッドフォード研究所）注入は 毎にコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）を測定すること １６ｍｇ／ｋｇの投与量であった。最初のＤＸＲ投与２ によってモニターした。１日目のＣＦＵ数は最初の生存 週後に２回目のＤＸＲを１２ｍｇ／ｋｇ投与した。マウ （１００％）と考えられ、加齢依存性の致死率の決定用 スのストレス症状または疼痛を毎日観察し、体重を記録 に使用した［７３］。培養物は１日目に２００μＭのＤ した。末期の瀕死状態にあるマウスはＣＯ２ 麻酔下に屠 ＸＲで１回処理した。 殺し、剖検を実施した。更なる組織学的検査用に心臓を 【０１４１】 採取した。 突然変異頻度の測定 【０１３７】 10 野生型株および変異株に発生する突然変異のタイプを特 生物発光画像法 徴づけるために、我々は、ＣＡＮ１（ＹＥＬ０６３）遺 生物発光画像法（ＢＬＩ）用にＬＩＤマウス群および対 伝子の突然変異頻度を測定した［７４，７５］。Ｃａｎ 照マウス群から５匹のマウスを無作為に選択し、実験期 ｒ 間中追跡した。すべてのＢＬＩ画像の手順は南カリフォ 、複雑な現象および全体の染色体再配置を含む他のＤＮ ルニア大学（ＵＳＣ）Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ 突然変異は大部分点突然変異および小さな挿入／欠失 Ｉｍ Ａ突然変異に起因する［３５］。経時的な加齢培養から ａｇｉｎｇコア施設で実施した。イメージングの前に、 細胞を２日毎に選択培地上に播種した。突然変異頻度は 吸入イソフルレン（２％）を用いてマウスを麻酔し、６ 前述したように生細胞数に基づき計数した［３６，３７ ０μｌ、５０ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ基質ルシフェ ］。 リン（ゼノジェン・コーポレーション）を注入した。 【０１４２】 １０分後、マウスを仰臥位にてイメージ化し、ＩＶＩＳ 20 文献 ２００光学的画像システム（ゼノジェン コーポレー １． Ｃｏｌｌｉｎｓ ション）を用いて２分スキャンした。シグナル強度は検 ２００６） 出器によりフォトン計数率／単位体面積／対立体角単位 ｏｌｅｃｕｌａｒ として数量化した（フォトン／ｓ／ｃｍ ン単位）。イメージはＩＶＩＳ ＮＧ ＩＭＡＧＥ ２ ／ステリジア ｉｃｓ． ２００およびＬＩＶＩ ３Ｄ（ゼノジェン Ｎｅｗ コーポレーショ ２． Ｍｉｎｉ Ｅ， 【０１３８】 Ｔ （２００６） 組織学的研究 ｏｌｏｇｙ ２サイクルの高用量ＤＸＲ後、メラノーマ担癌ＬＩＤマ 30 ウスおよび対照マウスの組織学的検査用に心臓を採取し Ｂｉｏｌ ２： ６８９ Ｓ， ｋｈｓｏｎ ｂｒａｘａｎｅ， 、１０％中性緩衝ホルマリン（ＶＷＲ）に貯蔵した。試 ｒ−ｆｒｅｅ， 料をパラフィン包埋し、５μｍに薄切し、Ｈ＆Ｅ染色し ｔｉｃｌｅ た。ＵＳＣ ｆｏｒ Ｍｅｄｉ 、解析した。 ＡＭ， ｐｈａｒｍａｃ ｖ７−１２． ｎｏｖｅｌ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｒ ｏｆ ａｄｖａ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １７： １２６ Ｌｉｎｋｓ Ｍ， Ｌｅｗｉｓ Ｃ （１９９９ ３−１２６８． ） Ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ： ジ、マサチューセッツ州）のＤ．ボットシュタインによ ｉｅｗ り提供されたＤＢＹ７４６（ＭＡＴα，ｌｅｕ２−３， ｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａ ｒｅｖ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｄｒｕｇｓ ５７：２９３−３ ０８． 株は前述の通りである［７１］。すべての変異株は、一 ５． 段階遺伝子置換によるＤＢＹ７４６背景に由来する［７ ， Ｋｅｗａｌｒａｍａｎｉ ２］。 ， Ｍｅｒｏｐｏｌ 【０１４０】 Ａ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ すべての実験はマサチューセッツ工科大学（ケンブリッ ）株につき実施された。ｓｃｈ９Δ変異 Ｍａ Ｃｒｅｍｏｐｈｏ ４． ５２，ＧＡＬ ＧＭ， Ｂ， （２００６） 酵母株 １１２，ｈｉｓ３Δ１，ｔｒｐ１−２８９，ｕｒａ３− Ａｎｎ Ｍａｎｉｋｈａｓ ｅｔ ａｌ． ａ ｆｏｒｍ ｃａｎｃｅｒ． 40 Ｍａｚｚｅｉ Ａｆａｎａｓｙｅｖ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｎｃｅｄ Ｓ， Ｃａｃｉ Ｓｕｐｐｌ ５： Ｇｒｅｅｎ ＭＲ， Ｏｒｌｏｖ ｃｉｎｅの病理学教授ダオー博士とともに試料を観察し Ｎｏｂｉｌｉ Ｃｅｌｌｕｌａｒ １７ 調べた［７０］。本臓器を採取し、氷冷ＰＢＳで洗浄し ＋ ｍ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ． て記述されていることから、我々は組織レベルで心臓を 【０１３９】 ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔ Ｂ， ＬａｎｄｉｎｉＩ， Ｏｎｃｏｌ ３． た。心不全がＤＸＲ投与後の急性毒性の主要な原因とし ｏｆ ｃａｎｃｅｒ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ａｇｌｉ Ｓｃｈｏｏｌ （ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｐ −７００． ン）ソフトウェアにより解析した。 Ｋｅｃｋ Ｉ， Ｗｏｒｋｍａｎ 50 ９） Ｈｅｎｓｌｅｙ ＭＬ， Ｈａｇｅｒｔｙ ＫＬ Ｔ， Ｇｒｅｅｎ ＤＭ ＮＪ， ｅｔ ａｌ． （２００ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌ ( 39 ) JP 2015-186480 75 ｉｎｉｃａｌ ｃａｌ ａｎｄ ｕｓｅｏｆ ： ２００８ｃｌｉｎｉ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｇ， ｕｐ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｅｃｔａｎｔｓ． Ｊ ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎ ｐｒｏ Ｏｎｃｏｌ ， ｅｔ ＦＭ， ａｌ． Ｗｅｉ ｓ Ｍａｄｉａ Ｆ Ｓｔａｒｖａｔｉｏ ｂｕｔ ｎｏｔ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ｃ ｃｈ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ｄ １０５： ８２１５−８２２ Ｕ Ｓ Ａ Ａｃａ ０． ３６ ｈｏｕｒ ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ Ｋｉｒｋｗｏｏｄ Ｐ （２００５） ， ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｅｃｈ ＴＢ， Ｓｈａｎｌｅｙ Ｆｏｏｄ Ａｇｅｉｎｇ Ｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ． Ｄｅｖ １２６： Ｍ １０１１− 20 １０１６． ８． Ｓｈａｎｌｅｙ （２０００） ｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｒｙ ５４： ９． ＤＰ， Ｋｉｒｋｗｏｏｄ Ｃａｌｏｒｉｅ ａｇｉｎｇ： ａ ａｎａｌｙｓｉｓ． ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｂｊｅｃｔｓ ｈｙｐｏｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｎｄ ｗｉｔｈｓｅｖｅｒｅ ｆｉｃｉｅｎｃｙ． ｔ Ｍｅｔａｂ １４． Ｄｉｓｏｒｄ Ｍｅｒｉｍｅｅ ｒｏｅｓｃｈ ｌｉｋｅ ＥＲ ０３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ： ｆｒｏｍ ｓ ｔｏ ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １０． Ｄｗａｒｆ Ｈｅａｌｔｈｙ ｅｖｉｅｗ： Ａ ｒｏｌｅ １３４２−１３４６． （２００５） ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｒｍｏｎｅ／ｉｎｓｕｌｉｎ− ｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍａｌｉａｎ ＬＥ１ ９） ３７１８− Ｔｈｉｓｓｅｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＪＭ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ ｈｏｒｍｏｎｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ａｓｔｉｎｇ． ｅｓ １３． １５： ｈｕｍａｎｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｒｏｗｔｈ ９５− ｏｆ Ｈｏｒｍ ｓ Ｎｕｔ Ｈ （２００５） ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｎｏｒｒｅｌｕｎｄ ｈ （１９９ ｉｎｓｕｌｉｎ− 40 １６７−１７６． ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｔｈ Ｂｒａｚｅａｕ ｏｆ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｒｉｖａｔｉｏｎ Ｒ Ｍ， ｏｎ ｔｈｅ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｉｓｓｕｅ Ｊ Ｒｏｒｓｔａ Ｅｆｆ ｆｏｏｄ ｄｅ ｕｌｔｒａｄｉａ ｒｈｙｔｈｍ ａ ｓｏｍａｔｏｓ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｔｈ １０４： １７３３−１７３８． １６． Ｊ， Ｆｒｙｓｔｙｋ Ｊ， Ｄｅｌｈａｎｔｙ Ｓｋｊａｅｒｂａｅｋ Ｃ （１９９９） ｉｎｇ Ｂａｘｔｅｒ Ｒ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃ ＩＧＦ ｓｙｓｔｅｍ ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｄ ｒｅｆｅｅｄｉｎｇ Ｐｈｙｓｉｏｌ １７． ＧＦ−Ｉ ｉｎ ｒａｔｓ． ２７７： Ｄｕｃｏｓ Ａ， ｅｔ ａｌ． ａｎｄ ４２１： （２００３） Ｉ ｌ ｔｏ ｉｎ ｍｉｃｅ １８２−１８７． Ｍｕｒａｋａｍｉ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｖｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｃｅ Ｐ， ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｓｓ ｓ ＲＪ Ｊ Ｍ， Ｄｕｐｏｎ ｓｔｒｅｓｓ １８． Ｓ （２００６） Ｓｔｒ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｌｉ ｍｏｄｅｌｓ． Ｅｘｐ Ｇｅｒ １０１４−１０１９． Ａｙｙａｄｅｖａｒａ Ｔｈａｄｅｎ Ａｍ Ｂ， Ｌｅｎｅｕｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｎ Ｅ２４５−２５２． ｒｅｃｅｐｔｏｒ ． Ｎａｔｕｒｅ ｄｕｒ ｆａｓｔｉｎｇ Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｉｆｅｓｐａｎ Ｐ Ｃ， ｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＪＪ， （２００８） ｎｇｅｖｉｔｙ Ａｉｍａｒｅｔｔｉ 50 ｔｈ Ｐ （１９７９） ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ １９． ＩＧＦ ｉｎ Ｍｅｔａｂ ５５ ＧＳ， ｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｆ Ｆ ｓｔａｔｅｓ． ｄ Ｏ， ｏｎｔｏｌ４１： ｔｏ Ｊ， Ｉｎｓｕｌｉｎ− ｆａｃｔｏｒｓ ｆａｓｔｅｄ Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ ｇｒｏｗｔ １２２． Ｍａｃｃａｒｉｏ １５． Ｇｅｌｏｅｎ ａｎｄ ｅ ｍａｍ １２３３−１ ＴＪ， Ｚａｐｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ３７２３． ｒ １２． Ｃｌｉｎ ｔ Ｊ， ｔａｒｖａｔｉｏｎ ５７： ｉｎ ｇｒ ２５： ｄｅ Ｒｅｌａ ： ９９９−１００２． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ Ｒｅｖ ｇｒｏｗｔｈ ＪＰ， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｌｉｋｅ Ｍｉｎｉｒ ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｇｉｎｇ． １４６： １１． Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ 30 ２９９： Ｂａｒｔｋｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＧＨ Ｏｂｅｓ （１９８２） ｇｒｏｗｔｈ ｔａｔｉｎ （２０ Ｉｎｔ Ｊ ｓｕ ２３９． ｎｄ ＣＥ ｏｂｅｓｉｔｙ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｌｉｆｅ−ｈｉｓ Ｆｉｎｃｈ Ｅ ｆａｓｔｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｉ ｗｉｔｈｓｉｍｐｌｅ ｅ ｒａｔ． ＶＤ， （２００１） ａｎｄ ｍｅｔ ｎ ｇｒｏｗｔｈ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｔ ａｘｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔ ７４０−７５０． Ｌｏｎｇｏ ｇｙ Ｔ Ｃ， ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｅ ｆｅｄａｎｄ ７． Ｂ ｅｔ ａｌ． ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ 10 ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｃｉ Ｆ， ｆｆｅｃｔｓ ａｂｏｌｉｃ Ｃ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｎｏｒｍａｌ ｅｌｌｓ Ｌｅｅ Ｍ， （２００８） ｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｅｓｓ Ｌ， Ｓ，Ｇａｕｎａ ａｓｓｏｎｅ ｅｎｔｓ Ｒａｆｆａｇｈｅｌｌｏ Ｓａｆｄｉｅ Ｇｒｏｔｔｏｌｉ ｏｎ ２７ １２７−１４５． ６． 2015.10.29 76 Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｄａｔｅ： A ａｎｄ Ｓ， Ａｌｌａ Ｒ， Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｒｅｉ ｌｏ ｒｅｓｉｓｔ ＰＩ３Ｋ−ｎｕｌ ( 40 ) JP 2015-186480 77 ｌ ｍｕｔａｎｔｓ． Ｃｅｌｌ ７： ， Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ａ （２０００） ｇ Ｘｉｅ Ｐ， ｌ． Ｌ， Ｊ， ｄ Ｒａｓ ｔｈｅ ｏｌ Ｃｈｅｍ ＫＷ ｅｔ ｏｆ ｄｉｅｔ ｔｈｅ （２００４） Ｂ， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ １０： ＶＢ （２００８） Ｒｅｄｕｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｍｅｔａｂ Ｗｅｉ Ｇｅ Ｍ， Ｌｉｆｅ ｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｅａｍ ｏｆ Ｓｃｈ９． ２５． Ｍ， １５ Ｒａｓ／ＰＫＡ， ＰＬｏＳ Ｗａｓｓ ＪＡ （１９９３） ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ− ｇｒｏｗｔｈ ｔｅｉｎ ｆａｃｔｏｒ Ｋａｔｚ Ｃｏｌｌｅｔｔ−Ｓｏｌｂｅｒｇ ｋｅｒ Ｌ， ｎ ＣＡ， ｐｒｏｔｅｉｎ− ａｎｄ ｆａｓｔｉｎｇ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ａｌ． ｏ ｆａｃ Ｊ， Ｎｏｒｒｅｌｕｎｄ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ＪＯ， １ ｌｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２２７ Ａｔｚｍｏｎ Ｄ， Ｌｉｕ Ｎ 50 ａｌ ｉｎ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ０５： ３４３８−３４４２． ３１． Ｙａｎ Ｌ， ｏｎｎｏｒ ｅｔ ＪＰ， ｌｌ Ｕ Ｓ Ｖａｔｎｅｒ Ｉｖｅｓｓａ Ｐ Ａ １ ＤＥ， Ｏ’Ｃ Ａ， Ｇｅ Ｔｙｐｅ ５ Ｈ， ａｄｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｉ ａｎｄ ｐｒ ｓｔｒｅｓｓ． Ｃｅ １３０： ２４７−２５８． Ｍａｎｅｔｔａ Ｌ， Ｊ， Ｂｒｕｎ Ｃａｌｌｉｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ． ｔ ｏｆ ＧＦ−Ｉ ｉｎ Ｓｃｉ ａｌ． （２００７） ３２． ｕｔ ｍｕｔ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ． ｒｏｃ ａｘｉｓ Ｍ Ｅｆｆｅｃ ｏｎ ｔｈｅ ＧＨ／Ｉ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ ｔｉｏｎｓｈｉｐ ＪＦ， Ａ， Ｐｒｅｆａ （２００２） ｔｒａｉｎｉｎｇ ｃｒｉｎｏｌ Ｆｒｙｓｔｙｋ Ｂ， ｅｔ ｇｒｏ Ｊ Ｃｌｉ ８３： ４４ Ｇ， Ｃｈｏ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ｓｔａｓｉｓ． Ｍｏｌｌｅｒ ｏｎ ｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏ Ａｍ ｍｅｎ： ｇｌｕｃｏｓｅ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８３： ｒｅｌａ ｈｏｍｅｏ Ｅｎｄｏ Ｅ９２９−９３ ６． ３３． Ｈ， １ ｓｉｇ ｃｏｒｔｉ ２６−４４３０． ２７． ｇｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｉｍｏｕｎ Ｐ， Ｂａ 40 ｅｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ− ｆａｃｔｏｒ− ｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ Ｅｎｄｏ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｇ ｌｉｋｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｏｌ Ｊ Ｓａｔｉｎ−Ｓｍｉｔｈ Ｓｔａｎｌｅｙ ｂｉｎｄｉｎｇ 30 ３５７−３６２． ＭＳ， Ｄｕａｌ Ｈｗａｎｇ ａｔｉｏｎｓ ｅｌ３． Ｃｌｉｎ ３９： ａｎｄ ． （２００８） ｗｔｈ ｔｒａｎ ａｎｄ ＭＯ， ｏｔｅｃｔｓ ２６． ｖｅｌｓ ｄ Ｓｕｈ Ｙ， ｎｃｒｅａｓｅｓ （Ｏｘｆ） Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｅｘｐ ３０． ｐｒｏ ｆａｓｔｉｎｇ． ｔｏｒ ａｌ． Ｔｈｅ ３３−４０ ： ９４−１０４． ｐｒｏ ｃｒｉｎｏｌ （１９９８） ｅｎｚｙｍｅｓ． ｄｕｒｉｎｇ ｌｏｎｇｅｄ ｆ Ｋｅｎｎｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ （ＩＧＦＢＰ）−１ ＬＥ， Ｒａｋｏｃｚ ＭＡ， ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｈｏｌｌｙ ｕｌａｔｉｏｎ ＨＭ， Ｒｏｍａｎｉｃｋ ＩＧＦ−Ｉ 20 Ｐ， Ｈｕ ４： Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ ｇｒｏｗｔｈ ｄｏｗｎｓｔｒ ＡＭ， ３ １７５： ｌｉｋｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ− Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ＳｉｒＴ１ Ｔｏｒ， Ｇｅｎｅｔ Ｃｏｔｔｅｒｉｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏ ｆａｃｔｏｒｓ Ｐ （２００２ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ （２００２） ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｒｉｍ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｈｅｎ ｓ ｏｆ ｏｗｔｈ Ｎｅｕｒｏｎｓ． ｓｐａｎ ８８： ３２９ ａｃｔｉｏｎ ｙ ＭＡ ｅｔ Ｍｅｔａｂ ｕｎｅｘｐｅ ｙ ＳＧ， ３８−４８． ＣｈｅｎｇＣ， ｂｙｃａｌｏｒｉｅ ａ ｃｏｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉ Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｈ， （２００８） ｎ ８： ｓｙｓｔ Ｊ Ｃｌｉｎ ｅｆｆｅｃｔｓ： ． Ｊ ＭｃＢｕｒｎｅｙ ／ＩＲＳ−２／Ｒａｓ／ＥＲＫｌ／２ Ｌｅｅ ＫＷ， ｆａｃｔｏｒ ７８９−７９９． Ｌｏｎｇｏ ｆａｃｔｏｒ ｆａｓｔｉｎｇ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ２９． ＭＷ， ｇｒｏｗｔｈ ｃｔｅｄ ｇｅｎｅｓ Ｗ， Ｊ， ｉｎｓｕｌｉ ） Ｎｕｃｌｅａｒ Ｊ Ｂｉ ｔｈｅｙ Ｘｕ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏ ａｎ 10 ． Ｙ， ２４． ｏｆ ｇｒｏ ｏｎ ｔｈｅ ｄｕｒｉｎｇ ２８． Ｋｉｎｚｌｅｒ Ｌｉ Ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔ ２−３２９８． ２８０２５−２８０３５． ２３． ｎｇ Ｔｈｅ ｈｏｒｍｏｎｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｐａｔｈｗａｙｓ Ｎａｔ ＰＩ３Ｋ ｏｆ ｍｉｃｅ． ２８２： ｅｍ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｋｉｎ ｔｈｅ ｒｏｌ． ｅｔ ａｌ． ｎ−ｌｉｋｅ Ｏｕｙａｎ Ｈ， Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｎｄ ｏｆ Ｄｏａｎ ｏｎ ｗｔｈ ５７−７０． Ｙ， ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｃａｌｏｒｉｅ ｅｘｅｒｃｉｓｅ １００： Ｊｉａｎｇ Ｃｈｅｎ ｒ ２２． ｈａｌｌｍａｒｋｓ Ｃｅｌｌ （２００７） ａｒｙ Ｄ， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ． ２１． ＪＳ， （２００３） Ｈａｎａｈａｎ 2015.10.29 78 Ａｇｉｎｇ １３−２２． ２０． A Ｄｒａｋａｓ Ｒ， Ｔｕ ｇａ Ｒ （２００４） ｌｌ ｓｉｚｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｘ， Ｂａｓｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ ( 41 ) JP 2015-186480 79 ｌａｔｉｏｎ ｇ ｏｆ １ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎ ｎｕｃｌｅａｒ ４１． ｐｈｏ Ｚａｌａｔｎａｉ Ｖ （１９８９） ３−ｋｉｎａｓ ｉｔｒｏｓｏｂｉｓ（２− ｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ｓｃｉ ｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ａ １０１： ９２７２−９２７６． Ｂａｓｅｒｇａ ＩＧＦ−Ｉ Ｒ Ｃｅｌｌ ＶＤ， Ｌｉｅｂｅｒ Ｊ （２００８） ｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ ９： Ｍａｄｉａ Ｗｅｉ Ｍ， ＷＣ， ｉｔｙ Ｆ， ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍａｄｉａ ｇｅｎｏｍｉｃ Ｊ Ｆ， Ｇａｔｔａｚｚｏ Ｓ ＭｅｃｈＡｇｅｉｎ Ｍ， ｖｉｖｏ ｏｆ Ｂａｎｄｏ Ｈ， Ｍｅｌｅ Ｓ， Ｅ， Ｇｉｏｒｇｉｏ Ｐｅｌｉｃｃｉ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｇ， Ｒｅ ａｌ． （１９９９） Ｔｈ Ｈｅｊｎａ Ｂｒａｉｎ Ｍ， ｌｉｎｉｃａｌ Ｍ ｒｏｌｅ ｂ Ｄ， ａｎｄ ｅ ｈｅ ｄ ｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ７４９ ａｇｅｎｔｓ： ｎｏｔｈｉｎｇ？ Ｔｈｅ ４６． ｓｏｍａｔｏｓｔａ ａｓ ａｎｔｉｎｅｏｐ ｍｕｃｈ Ａｎｎ Ｓｕｓｉｎｉ ２００６） Ｃ， １ ｉｃ １７： Ｌ （ ｏｔ １７３３−１７４２． ｇ ｔ ｉｎｓ Ｓｃｉ Ｕ Ｉ Ｓ ＬＪ， Ｈｗａｎ ＪＷ， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｉｃｅ Ｉｇｆｌ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ｅ ｄｅｌ ｉｎ Ｔ ｄｒａｍａｔ ｔｈｅ ｃｉｒ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｄｕｃｅ ｏｎ． Ａｎｎ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈ， Ｓａｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｗｔｈ ａｎａｌｏｇｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｃｏｂｂ （２００８） ｅｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ｕｓ Ａｃａｄ ｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｌ Ｂｕｓｃａｉｌ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｏｎｃｏｌ Ｎａｔｌ Ｍｅｈｔａ ＲＡＭＰ Ｎｏｒｍａｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ Ａｎｚｏ Ｍ， ａ Ａｃｃｉｌｉ ７３２４−７３２９． ｃｕｌａｔｉｎｇ Ｒａｔｉｏｎａｌｅｆｏｒ ｉ ＪＬ， Ｓｔａｎ Ａ， （１９９９） ｇ ＤＬ， ａｄｏ ６５３−６６８． ｓｐａｎ ４０２： ３０９ Ｓ， Ｌｉｕ ａｂｓｅｎｃｅ ． Ｐｒｏｃ ｃ 40 ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｏｄ Ｒｅｓ （２００２） ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｌａｓｔｉｃ ｅｔ ａｌ． ｒｏｗｔｈａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｉｎｇｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｉｆｅ Ｂ， Ｂｕｔｌｅｒ Ａ ９６： Ｒａｄｅｒｅｒ Ｐ， ｅｔ Ｙａｋａｒ ｎａｒｄ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ： ｍ Ｉｎｓｔ −３１３． ４５． Ｓｏｍａｔｏｓｔａ ｂｏｎｅ １５８６−１５９４． Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ２２６−２３１． ｏｆ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ ｎ ｍａｍｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ 30 Ｈ， （１９９７） ｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ． ａｓ Ｊ Ｎａｔｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｆｆｅｃｔ ｅ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ａｄａｐｔｏｒ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ４０． ｔｏｍａ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｒｅｌｅａｓｅ ３： ｎｅｕｒｏｂｌａｓ ｅ ｐ６６ｓｈｃ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｂｏｕｔ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｍ， ４５−４９． Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅｒａｐｙ ＤＮＡ ｃａｎｃｅｒ． Ｒ， Ｖａｒ （１９９７） ｓｙｓｔｅｍ Ｓａｉｔｏ ｔｉｎ ｅｔ ａｌ． ｍｏｄｅｌ １２８： Ｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｂｏｌｄｉ ｄａｍ Ｎａｔ Ｇｉｌｌｉｅｓ ｓｉｍｐｌｅ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ， ＣＳ， ＶＤ ａｎｄ ３９． Ｘｉａｎｇ Ｌｏｎｇｏ Ｄｅｖ ｉｎ Ｃ， ｆａｃ ４： ５０５−５１８． Ｌｏｄｅ ＨＮ， ８９： （２００ ＳＥ （２００４ ｇｒｏｗｔｈ Ｐ， ａｇｅ ｔｉｎ ＭＮ， Ｓｃｈｅｒｎｈａｍｍ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． ａｒｒｏｗ． Ｂｉ Ｃ ４９： １８１０−１８１５． ＮＭ， Ｄｏｌｍａｎ ｆｏｒ ｉｎ 20 Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４４． ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍ， ｅｒｒｏｒｓ Ｗｅｒｎｅｒ／Ｂｌｏｏ ｆｏｒ ３８． ｅｄ ａｎａｌｏｇｕｅ ＥＳ， Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ ＳＤ， ｐｒｅｖ ６７−８１． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ａ ａ ｋｉ Ｌｏｎｇｅｖ ＳＣＨ９ Ｄ−Ｔｒｐ−６−ＬＨ−ＲＨ Ｐｏｌｌａｋ ４３． ｈａｍ １６０ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ． ｔｏｒｓ Ｃ， ｃａ ｇｏｌｄｅｎ ） Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｂｕｒｈａｎｓ （２００８） ｓｙｓｔｅｍ． １８０： ７） ｅｒ ｃａ Ｂｉｏ Ｇａｔｔａｚｚｏ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ４２． ｅｖ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３７． 10 ａｎｔ Ｃｅｌｌ ＦａｂｒｉｚｉｏＰ， ｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎ ｏｌ ＭＲ， ａｇａｉｎｓｔ Ｍｏｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｆ Ｎ−ｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ＲＣ− ９０３−９１０． ３６． ： ａｎｄ Ｒｅｓ ２５ Ｔｕｒｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｙ ｓｔｅｒｓ Ａ ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍ ｉｎ Ｓｙｒｉａｎ ａｎｃｅｒ ｉ−ａｇｅｉｎｇ ｇ Ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ Ｅｘｐ Ｌｏｎｇｏ Ｖｉｊｇ ｍ Ｓ １−６． ３５． ｌ ｉｎ Ｕ ｎｃｅｒ （１９９９） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ３： Ａｃａｄ Ａ， Ｓｃｈａｌｌｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３４． 2015.10.29 80 ｕｐｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒ A ａｘｉｓ ｂｕｔ ｇｒｏ ｄｏｅｓｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ Ｒｅｓ ６８： ３３４２−３ ３４９． 50 ４７． Ｐａｔｅｌ ＡＣ， Ｎｕｎｅｚ ＮＰ， Ｐ ( 42 ) JP 2015-186480 81 ｅｒｋｉｎｓ ＳＮ， ｒｓｔｉｎｇ ＳＤ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｅｒ ｉｎ Ｊ （２００４） ＪＣ， Ｈｕ Ｂ （２００３） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｂａｌａｎｃｅ Ｎｕｔｒ ｏｎ ｔｉｏｎ ｃａｎｃ ｉｎｇ ａｌｔｅｒｅｄ １３４： ｉｃ ３３９４Ｓ− ｄｅ Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ ＪＨ Ｊｏｎｇｅ （２００５） ａｍｉｄｅ． ４９． ， ＭＥ， Ｈｕｉｔｅｍａ ５６． Ｓ， Ｂｅｉｊｎｅｎ ｅｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ４４： ｏｆ Ｃｌｉｎ ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｌｏｎｇｌｅｙ ｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ： （２００３） ＤＰ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｇｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ， Ｃｒｏｔｈｅｒｓ ｉｓ ｏｆ （１９９８） ｏｆ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ＤＮＡ ｒｏｃ ５： Ｎａｔｌ ｎｇ Ｔｅｗｅｙ ３： Ｌ， Ｃｈａｒ 20 ＤＮＡｄａｍａｇｅ Ｕ Ｓ Ａ ＩＩ． ｓｉｄｅ： ｆｏｕｒ ｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｅ ＫＲ Ｔａｏ Ｙ， ３４： ５３． Ｃｒａｆｔ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ ＭｃＣａｒｔｈｙ ｓ Ｊ （１９８０） ｍ ５９． Ｇｅｎｇ Ｊ， ９９８） ａｌ． （２００５） ｌｉｖｅ ｒｍａｔｏｌ ５４． ｍｉｃｅ． １２５： Ｓａｍａｎｉ ｅＲｏｉｔｈ ｈｅ Ｄ， ｒｏｌｅ ｉｎ Ｊ Ｃａｎ ｅｓ ｃａｎｃｅｒ ａｓｔａｓｉｓ： ｌｚ Ｄｅ Ｙａｋａｒ ｔｈｅ ＢＪ， ＶｏＩｋ ｙｔｅｓ Ｐ４５０ ｉｏｎ （２００７） Ｔ ５７６−５８８． ６１． Ｈｗａｎｇ ａｎｄ ｍｅｔ ｅｎ ａｎｄ ｒｅｃ ｏｎｔｏｇｅｎｙ ｉｎｓｉｇｈｔｓ． ２０−４７． ５５． Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ Ｐａｒｄｅｅ ｎ−ｌｉｋｅ Ａ 50 ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ Ｋｎｏｔｈ Ｒ ３ ａｎｄ ｏｆ ａｓｔｒｏｃ ｌｏｃａｌｉｚａｔ ｂｙ ｐｈｅｎ Ｒｅｓ ３９： ＰＤ， Ｃｏｈ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｕｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｓｕｌｉ ｆａｃｔｏｒ ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｙｔｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＬ， Ｌｅｅ Ｐ （２００８） ）−Ｉ， Ｋ， Ｒ ＰＪ， Ｓｔｏ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ｇｒｏｗｔｈ ２８： Ｂｒａｉｎ Ｂ （１９９４） ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｙｔｏｉｎ． ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｅｎｔ ｃ ｒａｔ ｇｌｉ Ｇ， ： ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌ ｓｙｓｔｅｍ （１ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｅ． ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓ， ＩＧＦ ＨＷ ｉｎｄｕｃｔｉｏ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ ｃｈｒｏｍｅ 40 １５９−１６５． ＡＡ， ｔ ８５： ８９ Ｓｔｒｏｂｅｌ ， Ｇｅｂｉｃｋｅ−Ｈａｅｒｔｅｒ ＬＭ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ ＢｒｏｄｔＰ ｏｆ ＫＷ， Ｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ７８４： ２７６−２８３． ６０． Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ ｏｆ ｏｆ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎ Ｃ６ ｃｅｌｌ Ｌｉａｕ Ｂｉｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ Ｒ， ｄｅ Ｖｅｌｌｉ ｃｅｌｌ ｃｕｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｏｍａ Ｂｒｕｈｎ ５９１−６０２ ｒａｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｓｅ ， ｉｎ ＫＤ， Ｊ Ｃｅｌｌ ｄｅｖ Ｐｒｉｎｓ Ｎａｔ Ｃｌ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａ ＢＤ， ｅｔ ４： ｐ ｐｅｒｓｐ ０−９０２． Ｅｔｏｐｏ Ｅｕｒ ｇ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｓｓｕｅ． １５１４−１５２１． ｓｃｅｎｔｉｍａｇｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ． ５８． ４６６−４６ 30 ｏｆ ｓｉｇｎａ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｔｈｗａｙ− ｉｎ Ｍｅｃ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｖ， Ｂｏｕｒｈ ｄｉｓｅａｓｅ： Ｌｉｕ ＬＦ ｕｙｅｎ Ｒｅｓ ６１： Ｅ（２００７） ＢＤ， （１９９８） Ｎ， ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ＩＩｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． ｃｅｒ Ｐｉｎｚｉ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ ２２６： ａ Ｃａｎｃｅｒ ＴＣ， Ｙａ ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ ｏｆ ｎｏｒ Ｊ， Ｄｅｕｔｓｃｈ ｎ ａｎｄ Ｈａｎｄｅ ｆｏｒ ｓｅ ９ ８． ５２． ｃ ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐ ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＭＶ， Ｐａｒｄ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｒｏｗｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ５２７−５３２． ． Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅ ａｍｍａｌｉａｎ ｅ ＤＲ ａｄｄｕｃｔｓ． Ｈａｌｌｉｇａｎ （１９８４） Ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌｓ． ｒｏｗｔｈ ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｓｃｉ ＫＭ， ｃｅｌｌ ｌｉｎｇｏｆ １１５６１−１１５６５． ５１． ｄ Ａｃａｄ Ｒｅｓ５： ｈａｎｉｓｍｓ ｓｔｒａ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＤＭ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｔｈｅｒａ Ｐｒｏｇ Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ ５７． ３３０−３３８． ＳＭ， ｏｆ ｃｈｅ ＡＢ （２００１） ｍａｌ ５−ｆｌ ａｃｔｉｏｎ Ｚｅｍａｎ ｔｈｅ ｔｏｘ ４３０１−４３０５． ＤＢ， Ｈａｒｋｉｎ ＰＧ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ ａｇｅｎｔｓ． ｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃ ａｇａｉｎｓｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｃｅｒ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈ 10 １１３５−１１６４． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ５０． ｏｆ ｎｏｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ ＡＤ， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｐｅｕｔｉｃ ３３９８Ｓ． ４８． 2015.10.29 82 Ｂａｒｒｅｔｔ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｉｃｅ． A （ＩＧＦ ｐｒｏｔｅｉｎ− ＩＧＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｉ ( 43 ) JP 2015-186480 83 ｓｕｂｕｎｉｔ． Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ ＩＧＦ Ｇｒｅｅｎｅ Ｘ， ） Ｍｉｎｎａ ２： ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ６５−７４． Ｓｈａｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ Ａ， Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ ｃｏｇｅｎｅ ２２： ｅｔ ａｌ． （１９７５ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｎ ＮａｔｌＡｃａｄ ｒｄ Ｊｅｍａｌ Ｅ， Ｓｃｉ Ｕ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｅｉｎ ７ （２００８） ＸｕＪ， Ｃａｎｃｅｒ ２００８． ８： Ｓｉｅｇｅｌ ＣＡ ｇｈ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ ｗａｙｓ． ５ ７０． Ｌｉｕ ＪＰ， ｉｎｓ ＡＳ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｔｒａｔｉａｄｉｓ ａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ａ Ｉｇｆ−１） ｐｔｏｒ Ｊ， Ｐｅｒｋ ＥＪ， （１９９３） ｎｕｌｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ−ｌｉｋｅ Ｂａｋｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄｔｙｐｅ （Ｉｇｆｌｒ）． １ ＩＧＦ Ｃｅｌｌ １９８８） ｃ ｆｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌ 20 ｆａｃｔｏｒ Ｉ （ ｒｅｃｅ ｒｔｓｏｎ ＥＪ， （１９９３） ｋｅ ｈ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｕ ＪＰ， ７１． Ｒｏｂｅ ｉｎ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ７５： ６６． Ｔｓａｉ−Ｔｕｒｔｏｎ ＢＴ， Ｔａｎ Ｙ， Ｍ， ｅｍｂｒ ａｓｔ． ７２． Ｃｏｓｔ ＧＪ， ｅｔ ａｌ． （２００ Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｈｕ ｆｒｏｍ ｉｎｖｏｌ ｉｓｉａｅ ｃｅｌｌｓ ｓｔｒｅｓｓ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｘｉｃｏｌ ６７． Ｍａｎｄａ ００３） ｏｆ Ｓｃｉ ａｎｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ． ９８： Ｋ， Ｂｈａｔｉａ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｏｆ Ｔｏ ＡＬ （２ ｔｉｏｎｓ． 40 ７３． ｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄ ｌｉｆｅ ｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ｍｉｃｅ． １９： Ｃｅｌ ３６７−３７ ２： ７４． Ｋｕｒｏｓｕ ｉｋｉ Ｔ， ６ Ｔ， Ｍｉｕｒａ Ｆｕｋｕｄａ Ｏ （２００３） ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｇｅｎ ｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｔ， Ｍ Ｃ， ＢＣＬ ｏｘｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ 50 Ｅ， Ｌｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｔｈｅｒ Ｙｅａｓｔ １４： Ｔｈｅ ｃｅｒｅｖ ａ ｕｓｅｆｕｌ ａｎｄ ｓｐａｎ ｓｅｔ ｇｅｎｅ ｄｉｓ ａｐｐｌｉｃａ １１５−１３２． Ｐ， Ｌｏｎｇｏ ＶＤ ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ７３−８１． Ｆａｂｒｉｚｉｏ Ｐ， Ｇａｔｔａｚｚｏ Ｂａｔｔｉｓｔｅｌｌａ Ｃｈｅｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｙｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． ２． ６８． ｉｎ Ｄａｖｉｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ Ｆａｂｒｉｚｉｏ （２００３） ｉｎ ＣＭ， ２８８−２９０ ＣＢ， ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｃｌ ｓｔｒｅｓｓ Ｆ， ｓｔｒｅｓｓ Ｃａｐｕｔｏ Ｓ２８８Ｃ： ａｇａｉｎｓｔ ａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｕｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｏｎ ４８： ４７ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏ （１９９８） ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ２１６−２３０． Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｃａｒｄｉｏｔｏ Ｒｅｓ ２９２： Ｂｒａｃｈｍａｎｎ Ｊ， ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｉｎ ｈｅａｒｔ： ｂｙ Ｓｃｈ９ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａ， ｇｒａｎｕｌｏｓａ （ ． Ｕ ｖｅｓ ＣＥ Ｇｅｎｄｒｏｎ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ Ｌｕｏｎｇ ｍａｎ Ｐｏｌｉｔｉ Ｐ， Ｐｏｚｚａ ＳＤ， ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒｏｗｔ ＣＯＶ４３４ ｆｏｒ ＶＤ （２００１） ７） ｉｎ ｒａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｎ ｏｆ 30 Ｌｕｄｅｒｅｒ Ｒｅｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｕｓｅｄ Ｌｏｎｇｏ Ａ ７３−８２． Ｓ， ＢＫ， Ｍｙｅｒｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉ ｆａｃｔｏｒｓ Ｂｉｏｐｈｙｓ ６６−４７６９． ７５： ５９ Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ Ｒｏｌｅ ｇｒｏｗｔｈ ｙｏｎｉｃ Ｊ， ｐａｔｈ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｅｔｃｈｅｒ Ｂａｋｅｒ ｏｆ ＡＭＰＫ ４３３−４４０． ｒａｄｉｃａｌ ｘｉｃｉｔｙ． −７２． ６５． ３３２： Ｓｉｎｈａ ｓｙｎ ｔｈｒｏｕ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ ＰＭ１ Ｅｆｓ Ｍｉｃｅ ｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ ７１−９６． ６４． ＣＯＸ−２ ｇｅｎｉｓｔ ｉｎ ｃｈｅｍｏ−ｒｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ Ｒ， Ｗａ ｅｔ Ｊ， Ｐａｒｋ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｓｔａｎｔ Ｏｎ ４４５９−４４６８． ｓｙｍ Ｓ Ａ （２００５） ｉｎ ｃｅｌｌｓ． ＪＴ， Ｈａ ＯＪ 10 Ｙ， Ｈｗａｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｓ． Ａ， Ｈａｏ ６９． ｂｙ ｃｈｅｍ ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｂ−ｃｅｌｌ ４９２３−４９２７． ６３． ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｗ， ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａＸ ｐａｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ Ｊ， Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｈｙｂｒｉｄ １８： ＬＡ， ｈａｌａｚｏｎｉｔｉｓ 2015.10.29 84 ｄ−ｌａｂｉｌｅ ６２． A Ｃ， ｅｔ ｒ２ ｂｌｏｃｋｓ ａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． ５５−６６７． Ｌ， Ｗｅｉ Ｍ， ａｌ． （２００５） ｅｘｔｒｅｍｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉ ｌｉｆｅ−ｓｐ １２３： ６ ( 44 ) JP 85 ７５． ｌａ Ｆａｂｒｉｚｉｏ ｏ Ｌ， Ｃ， Ｂａｔｔｉｓｔｅｌ Ｒ， ｅｔ ａｌ． ４） Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｏｒ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍ エトポシドに対し選択的に正常細胞とマウスを防御する ｍｅｄｉａｔ が、神経芽細胞腫細胞に対してはインビトロおよびイン ａｇｉｎｇ ビボにおいてそれぞれまったく防御しないか、またはマ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ イナーな防御を供給したことを報告した（分別的ストレ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． １６６： ７６． Ｍ， ｚｚａ 的経路が示された。最近、我々は短期絶食（ＳＴＳ）が （２００ ａｌｔｒｕｉｓｔｉｃ ｉｎ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ス耐性，ＤＳＲ）。我々のＤＳＲ仮説は、ストレス耐性 １０５５−１０６７． Ｖｉｌｌａｎｉ Ｚｕｎｉｎｏ 2015.10.29 対する細胞および生物の防御における絶食調節性の遺伝 Ｇａｔｔａｚｚ ＬＬ， ａｎ A 86 Ｐ， Ｖａｒｄａｖａｓ Ｌｉｏｕ 2015-186480 が発癌経路によって阻止されること、また、それゆえ癌 Ｆ， Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ Ｆ， Ｍｏｎｔｉ 細胞ではストレス耐性が活性化され得ないという事実に Ｅ， Ｒｏ 10 Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖ スを防御するかどうかを調べ、かつ、異なる悪性細胞の ｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｉｎｄ 化学療法耐性に対するＳＴＳの効果を調べてきた。報告 ｕｃｅｄ （１９９１） 基づいている。我々は、他の薬剤に対してＳＴＳがマウ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｄｕｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ． ＣｈｅｍｏｔｈｅｒＰｈａｒｍａｃｏｌ ｂｙ ｒｅ されたＳＴＳ療法は化学療法投与前の４８−６０時間の Ｃａｎｃｅｒ 絶食から成っている。ここに我々は、シスプラチンに対 ２８： ３ する防御には化学療法前４８時間、化学療法後２４時間 ６５−３６９． の絶食を要することを示す。ルシフェラーゼを発現する 【実施例５】 メラノーマ細胞および神経芽細胞腫細胞を用いて、我々 【０１４３】 はインビボ化学療法の効果をモニターした。我々の結果 骨髄抑制、胃腸障害、および疲労を含む化学療法の毒性 は、ＳＴＳは化学療法毒性から宿主を防御するが、神経 副作用は用量と癌治療期間を制限する。幾つかの化学防 20 芽細胞腫細胞は防御せず、複数のサイクルのドキソルビ 御剤が特定組織の防御を供給することが示されてきたが シン治療に対してメラノーマ細胞を増感させる可能性が 、正常細胞と癌細胞に対する分別的効果は制限されてい 示唆されることを確認した。これらの結果は、短期絶食 る。最近、我々は、短期絶食（ＳＴＳ）が化学療法に対 が広範囲の化学療法に対する正常細胞および癌細胞の分 して癌細胞ではなく、正常細胞を選択的に防御する（分 別的な防御に効果がある可能性を有し、化学療法の有効 別的ストレス耐性、ＤＳＲ）ことを報告した。ここに我 性と健康アウトカムを増強する可能性を示している。 々はＳＴＳ依存性防御の機序を調べた。マウスでは、７ 【０１４６】 ２時間絶食はＩＧＦ−Ｉを７０％まで減らし、ＩＧＦ− 材料と方法 Ｉ阻害物質ＩＧＦＢＰ１のレベルを１０倍増加させた。 細胞培養 ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の低下はシクロホ 初代混合グリア細胞は１−３日齢のスプラーグドーリー スファミドから初代グリアを防御したが、グリオーマ細 30 ラット新生児（チャールスリバー社）の大脳皮質から取 胞は防御せず、かつ、ドキソルビシン依存性ＤＮＡ障害 得した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加ＤＭＥＭ／Ｆ に対してマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を防御した。 １２培地（インビトロジェン社）で１０−１４日培養し 循環ＩＧＦ−Ｉレベルが７０−８０％低下しているＬＩ た細胞を使用した。Ｃ６，Ａ１０−８５，９ＬおよびＲ Ｄマウスは試験した４つの化学療法薬の内３つに対して Ｇ２ラットグリオーマ細胞株ならびにＬＮ２２９ヒトグ 防御を示し、ドキソルビシンで治療したメラノーマ担癌 リオーマ細胞株はチェン博士（南カリフォルニア大学） ＬＩＤマウスは低化学毒性で長期生存率を有意に改善（ のご厚意により提供され、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細 ＬＩＤマウスおよび対照マウスそれぞれ６０％ 胞腫細胞株は１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、 ｖｓ． ０％）していた。これらの結果は、ＩＧＦ−Ｉが癌細胞 ５％ＣＯ２ 下、３７℃で維持された。 ではなく正常細胞における潜在的な防御阻止剤であるこ とを示唆する。 【０１４７】 40 哺乳類細胞のＳＴＳ処理 【実施例６】 初代グリア、グリオーマまたは神経芽細胞腫細胞を９６ 【０１４４】 穴マイクロタイタープレートに２０，０００−３０，０ 複数の化学療法剤に対する分別的防御のための短期絶食 ００細胞／穴で播種し、２日間インキュベートした。処 に基づく戦略 理前に細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し 【０１４５】 た。すべての処理は５％ＣＯ２ 下、３７℃で実施された 要約 。グルコース制限は、細胞を低グルコース（０．５ｇ／ 化学療法の副作用は癌治療の主要な制限因子である。化 Ｌ）または正常グルコース（１．０ｇ／Ｌ）のいずれか 学防御剤の開発が進められてきたが、これらは薬物およ を添加したグルコースフリーＤＭＥＭ（インビトロジェ び組織特異性により広範には使用されていない。我々の ン社）、１％血清で２４時間インキュベートして実施し 以前の研究により、絶食の役割および種々のトキシンに 50 た。血清制限は、１０％または１％ＦＢＳのいずれかを ( 45 ) JP 87 2015-186480 A 2015.10.29 88 添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を２４時間インキュベ ウス神経芽細胞腫ＮＸＳ２細胞株（２００，０００／マ ートして実施した。 ウス）を静脈内に注入した。腫瘍細胞注入後、一部の動 【０１４８】 物群を４８時間絶食させ、その後、８０ｍｇ／ｋｇのエ インビトロ薬物処理 トポシドを１投与量で静脈内に投与した。非絶食の対照 シクロホスファミド（ＣＰ，シグマ社）をインビトロ化 群（ＮＸＳ２群）のマウスも調べた。分別的ストレス耐 学療法研究に使用した。ＳＴＳ処理後、細胞を１％ＦＢ 性をさらに調べるため、Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスにＢ１ Ｓ加ＤＭＥＭ／Ｆ１２中種々の濃度のシクロホスファミ ６Ｆｌｕｃメラノーマ細胞を注入した。注入前に細胞を ド（６−１５ｍｇ／ｍｌ）で１０時間インキュベートし 洗浄し、無菌生理食塩水に再懸濁した。各マウスは１０ た。生存はＭＴＴ／ＬＤＨアッセイにより決定し、対照 ０μｌ中の２×１０ に対する処理の％比で表した。 10 ５ 個の細胞を受け、その後、別の１ ００μｌの無菌生理食塩水を尾に残存する細胞の洗浄の 【０１４９】 ために受けた。マウスは無作為に選択し、実験中追跡し マウスにおけるストレス耐性 た。生物発光画像法をＵＳＣ小動物イメージングセンタ Ａ／Ｊマウス、ＣＤ−１マウスおよび胸腺欠損ヌード／ ーで実施した。シグナル強度を定量した（フォトン／Ｓ ｎｕマウスを使用した。体重１５−１８ｇの６週齢雌性 ／ｃｍ Ａ／Ｊマウス（ハーラン社、イタリア）および体重２０ 【０１５１】 −２２ｇの４週齢雌性胸腺欠損（Ｎｕｄｅ−ｎｕ）マウ 結果 ス（ハーラン社）を４８時間絶食させ、その後、それぞ 図３１−３５参照。 れ８０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのエトポシド 【０１５２】 （テバファーマ、オランダ）を静脈内に注入した。体重 結論 １８−２０ｇの４週齢雌性ＣＤ−１マウスを６０時間絶 20 短期絶食（ＳＴＳ）はインビトロおよびインビボで化学 食させ、その後、１１０ｍｇ／ｋｇのエトポシドを静脈 毒性に対するストレス耐性を誘導することができる。Ｓ 内に注入した。すべてのマウスに化学療法後食事を提供 ＴＳ誘導ストレス耐性は種々の通常の化学療法に適用可 し、体重減少と一般行動を毎日モニターした。また、異 能である。ＳＴＳは哺乳類細胞および担癌マウスにおい なる化学療法剤シスプラチンの実験をＣＤ−１マウスで て化学療法薬に対する分別的ストレス耐性（ＤＳＲ）を 、ドキソルビシンをＡ／Ｊマウスで実施した。 与えた。ＳＴＳは化学療法に対する癌細胞の感受性を増 【０１５０】 感させる。 マウスにおける分別的ストレス耐性（ＤＳＲ） 【０１５３】 体重１５−１８ｇの６−７週齢雌性Ａ／Ｊマウス（ハー 本明細書で引用される全ての出版物はこれらのすべての ラン社、イタリア）を特定のウイルスと抗原がフリーな 参照により本明細書中に組み入れられたものとする。 ２ 条件下で無菌封入体の中で飼育した。Ａ／Ｊマウスにマ 30 【図１】 【図２】 ／ステリジアン単位）。 ( 46 ) 【図３】 JP 【図６】 【図４】 【図７】 【図５】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 47 ) 【図８】 JP 【図１０】 【図１１】 【図９】 【図１２】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 48 ) 【図１３】 JP 【図１６】 【図１４】 【図１７】 【図１５】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 49 ) 【図１８】 JP 【図２０】 【図２１】 【図１９】 【図２２】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 50 ) 【図２３】 JP 【図２５】 【図２４】 【図２６】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 51 ) 【図２７】 JP 【図２９】 【図２８】 【図３０】 【図３１】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 52 ) 【図３２】 JP 【図３３−２】 【図３４Ａ】 【図３３−１】 【図３４Ｂ】 【図３４Ｃ】 2015-186480 A 2015.10.29 ( 53 ) JP 2015-186480 A 2015.10.29 【図３５】 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. Ａ２３Ｌ (72)発明者 ＦＩ 1/307 (2006.01) テーマコード（参考） Ａ２３Ｌ 1/307 ロンゴ，ヴァルトル アメリカ合衆国 ニュー カリフォルニア州 シティー ３７４０，スィート オブ サウザン ９００８９−２５６１，ロサンゼルス，マクリントックアベ イーイービー １３１，ヒューズセンター，シー／オー カリフォルニア，ユーエスシー スティーブンズ ユニバー