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フルオレセイン標識 M30サイトデス
フルオレセイン標識 M30サイトデス M30 CytoDEATH, Fluorescein ヒトサイトケラチン18のカスパーゼ分解産物の検出用、フルオレセイン標識マウスモノクローナル抗体（クローン M30） Cat No. 2 156 857 250テスト（100μl） Ver. 6.0 1. 製品の概要 形 状 緑色の溶液（100μl） 抗体はタンパク質の存在で安定化されています。 特 長 利 点 簡便 特 徴 使用しやすい標準的なプロトコール。明瞭な結果に より、アポトーシス細胞が最も簡単に正常細胞から 判別できます。 ア ポ トー シ ス カスパーゼが切断したサイトケラチン18を検出：カ を簡単に検出 スパーゼ活性は最も初期のアポトーシスの、マーカ ーの一つです。 パ ラ フィ ン 包 ルーチン的に固定された組織サンプルに有用。過去 埋組織に有用 に溯る研究が可能です。 経 済 的 で 簡 単 培養細胞への二次試薬が必要ありません。 な取り扱い 抗体のタイプ クローン M30、マウス IgG2b 特異性 ・抗体は細胞骨格タンパク質であるヒトサイトケラチン18（CK18）の、カ スパーゼに切断されたフォルマリン抵抗性エピトープと結合します。 ・M30抗体の免疫反応は、アポトーシス細胞の原形質に限定されます。 ・高度に増殖中の細胞の核抗原との、非特異的な交叉反応性が見られ ます。 2. 背景情報 アポトーシスでのカスパーゼの機能 アポトーシスは、自己を組織的に破壊する、内在性の自殺機構にお けるプロセスです。それは、細胞内タンパク質の切断を通じて進行し ます。このプロセスを仲介するプロテアーゼはカスパーゼ（Cysteinyl －asparatic acid proteases）と呼ばれています。カスパーゼは、様々 なアポトーシス誘導剤により活性化される、前駆酵素として発現しま す。いったん活性化されると、一つのカスパーゼが、カスパーゼのカ スケード活性化を開始します。 調 製 モノクローナル抗体（moAb）を得るために、Balb－c－マウス に CK18関連ペプチドを注射します。 最初の腹腔内注射の8週間後に、Balb－c－マウスの脾臓細胞を P3 －X63－Ag8.635ミエローマ細胞と融合させます。陽性ハイブリドー マを限界希釈でクローン化します。ハイブリドーマの上澄を、ビオチ ン標識ペプチドとの反応性によりスクリーニングします。免疫染色に より、生細胞でもネクローシス細胞でもない培養細胞と反応する抗体 を産生する、ハイブリドーマ細胞株の一つが得られました（No. 30）。 詳細な研究は、moAb が特異的にアポトーシス上皮細胞と反応する 事を示しました。 アポトーシスの検出における技術 サイトケラチン、特にサイトケラチン No. 18はアポトーシスの初期 イベントで影響を受けます。M30サイトデス抗体は正常細胞の CK18 は検出せず、CK18のカスパーゼ特異的切断部位を認識します。それ ゆえ、M30サイトデスは単一細胞や組織におけるもっとも初期のアポ トーシスの決定に有用で信頼性のあるツールです。 抗体の精製 抗体は硫安沈殿とその後のイオン交換クロマトグラフィーにより精 製されました。フルオレセインで標識し、ゲルろ過で精製された後、 10 mM リン酸ナトリウム、100 mM NaCl、0.5% BSA（w/v）、0.01% メチルイソチアゾロン（MIT） （v/v）、pH 7.0に希釈されました。 3. 操作法と必要な材料 3. 1 細胞の免疫蛍光やフローサイトメトリーの操作法 アプリケーション ・免疫細胞化学 ・フローサイトメトリー ・免疫組織化学 ・パラフィン包埋組織切片（二次増幅試薬が必要） ・凍結切片 その他の必要な試薬 ・PBS（製品番号1 666 789） ・メタノール ・Tween 20（製品番号1 332 465） ・BSA ワーキング溶液の調製 以下の表には免疫蛍光やフローサイトメトリーに必要な追加のワー キング溶液が記載されています。 ワーキング溶液 アプリケーションには、抗体ストック溶液をインキュベーションバ ッファーで1：250に希釈します。 溶 液 組 成 保存 / 安定性 洗浄バッファー 0.1 % の Tween 2－8℃で4週間 20を含む PBS インキュベーシ 1 % の BSA と 2－8℃で4週間 ョンバッファー 0.1 % の Tween 20を含む PBS 保存 / 安定性 ストック溶液は、2～8℃でラベルの有効期限まで安定です。 注：凍結融解の繰返しは避けてください。 品質管理 抗体は細胞モデル（HeLa 細胞を TNF－α / アクチノマイシン D 処 理）を使用して機能試験されています。 15 使 用 洗浄ステップ 抗体ワーキング 溶液の調製 抗体ワーキング溶液の調製 抗体ストック溶液をインキュベーションバッファーで1：250に希釈 します。 注：抗体溶液には沈殿があってはいけません。必要なら、溶液を使用 前に高速で遠心します。 抗体ワーキング溶液の調製 抗体ストック溶液をインキュベーションバッファーで1：250に希釈 します。 注：抗体溶液には沈殿があってはいけません。必要なら、溶液を使用 前に高速遠心してください。 プロトコール サンプル材料の調製 免疫組織化学のプロトコールを始める前に、以下の表に記載されて いる通りに、パラフィン包埋組織切片を脱パラフィンしてください。 注：この操作法の間、切片を乾燥させてはいけません。 ステップ アクション 1 PBS で細胞を洗浄します。 2 －15～－25℃で30分間、氷冷の純粋エタノールで固定し ます。 3 細胞を洗浄バッファーで2回洗浄します。 4 ・洗浄バッファーを除去します。 ・15～25℃で60分間、100μl の M30サイトデスワーキン グ溶液でインキュベートします。 5 細胞を洗浄バッファーで2回洗浄します。 6 …を使用する場合： こうします： ステップ アクション 1 パラフィン包埋切片をインキュベーター中に37℃でオー バーナイト静置します。 2 フォルマリン固定、パラフィン包埋組織切片を脱パラフ ィンします： ・キシロールのコプリンジャーを2個（2－5分） ・エタノールのコプリンジャーを2個（96%、浸漬30回） ・エタノールのコプリンジャーを1個（70%、浸漬30回） ・メタノール /H2O（3％） のコプリンジャーを1個、15～ 2 25℃で10分 3 再蒸留水で10分間リンス。 蛍光顕微鏡 スライド上で細胞を実験します。 フ ロ ー サ イ ト メ ト 細胞を 0.5ml の PBS で希釈し、分 リー 析まで暗所で保存します。 3. 2 免疫組織化学の操作法 3. 2. 1 始める前に はじめに 以下の操作法は、免疫組織化学での M30サイトデスを使用したア ポトーシスの検出について記載しています（パラフィン包埋組織）。 他の検出法やサンプル材料を使用する場合、条件を変更し、至適化 する必要があります。 注：フルオレセイン標識 M30サイトデスの蛍光強度は、蛍光顕微鏡 で組織中のアポトーシス細胞を直接観察するには適していません。 シグナルは、POD 標識抗フルオレセイン（TUNEL POD）と、発色 基質である AEC あるいは DAB との組み合わせによる二次標識で増 強されます。 3. 2. 2 免疫組織化学のプロトコール プロトコール 抗原の回復のために、以下に記述されたプロトコールに正確に従っ てください。 ステップ アクション 1 ・クエン酸バッファーを750 Ｗの電子レンジで沸騰する までインキュベーションします。 ・組織切片をスライドラックに静置し、熱したクエン酸 バッファー中に入れます。溶液が沸騰するまで、電子 レンジをオン（750Ｗ）にします。 ・溶液が沸騰したら、電子レンジの設定を“Keep warm” （約100W）に変更します。 ・この設定で15分間インキュベートします。 注：至適な形態のためには、切片の下に泡ができないよ うに沸点の少し下に溶液を保つ事をお勧めします。 2 溶液を15～25℃で5分間おき、クールダウンします。 3 PBS 中で3回洗浄し、別の PBS のジャーで2分間インキュ ベートします。 4 15～25℃で10分間、インキュベーションバッファーで切 片を覆います。 5 インキュベーションバッファーを取り除き、100μl の抗 体ワーキング溶液を湿式のチャンバー内で15～25℃で1時 間加えます。 6 洗浄バッファーでスライドを洗浄します（3個のジャーを 使用し、各ジャーで30回浸漬します）。 7 ・調製品を50－100μl の TUNEL POD で覆います。 ・湿式のチャンバー内で37℃、30分間インキュベートし ます。 8 スライドを洗浄バッファーで洗浄します（3個のジャーを 使用し、各ジャーで30回浸漬します）。 9 スライドを用時調製した基質溶液（DAB あるいは AEC） で、15～25℃で明瞭な色の展開が見えるまで（1－5分）イ ンキュベーションします。陰性コントロールは、このイ ンキュベーション時間でいかなる色の展開も観察されて はいけません。 10 再蒸留水中で、数回リンスする事で反応を停止します。 11 最後に Harries のヘマトキシリンなどで切片をカウンタ ー染色（短時間の浸漬）し、切片を封入します（Kaysers の グリシンゲラチンなど）。 その他の必要な試薬 ・TUNEL POD（製品番号1 772 465） ・DAB 基質（製品番号1 718 096）あるいは ・AEC ・PBS（製品番号1 666 789） ・Tween 20（製品番号1 332 465） ・BSA ・Harries マトキシリン ・Kaysers グリセリンゲラチン ・クエン酸 ・NaOH、1 N ワーキング溶液の調製 以下の表には免疫組織化学に必要な追加のワーキング溶液が記載さ れています。 溶 液 組 成 保存安定性 洗浄バッファー 0.1 % の Tween 2－8℃で4週間 20を含む PBS インキュベーシ 1 % の BSA と 2－8℃で4週間 ョンバッファー 0.1 % の Tween 20を含む PBS クエン酸バッフ 2 g/l の ク エ ン 2－8℃で4週間 ァー 酸、pH 6、1 N NaOH で調製 使 用 洗浄ステップ 抗体ワーキング 溶液の調製やブ ロッキングステ ップ 抗原の回復 16 4. 結 果 免疫組織化学 アポトーシス細胞は原形質の内側に広範囲に染色されます。顆粒構 造が、アポトーシスの後期相に観察されます。 CK18の保存されたアポトーシス断片の染色が、血管内部に観察さ れる事があります。 マクロファージはそのアポトーシス細胞やアポトーシス小体の貧食 作用により、陽性染色を見せる事があります。 核の染色が観察された場合、これはアポトーシスに関連せず、高度 に増殖している組織に時々見られます（培養細胞では決して観察され ません）。 この非特異的な染色を減少させるために、抗体を十分希 釈して使用してください。 5. 2 参考文献 1 Caulin C., Salvesen G.S., and Oshima G.（1997）Caspase Cleavage of Keratin 18 and Reorganization of Intermediate Filaments during Epithelial Cell Apoptosis. J. Cell Bio l., 138, 1379-1394. 2 Leers M. P. G., Kölgen W., Björklund V., Bergman T., Tribbick G., Persson B., Björklund P., Ramaekers F.C.S., Björklund B., Nap M., Jörnval H., and Schutte B.（1999）Immunocytochemical detection and localization of a cytokeratin 18 epitope exposed during early apoptosis. J. Patholog y, 5, 567-572. 3 Kronberger, B., Rüster, B., Lee, J-H., Sarrazin, C., Roth, W.K., Herrmann, G., and Zeuzem, S.（2000）. Hepatocellular proliferation in patients with chronic hepatitis C and persistently normal or abnormal aminotransferase levels. J Hepatology 2000; 33, 640-647. 4 Yu, D-C., Chen, Y., Dilley, J., Embry, M., Zhang, H., Nguyen, N., Amin, P., Oh, J., and Henderson, D.（2001）. Antitumor Synergy of CV787, a Prostate Cancer-specific Adenovirus, and Paclitaxel and Docetaxel. Cancer Research 61, 517-525, January 15, 2001. 5 Michael-Robinson, J.M., Biemer-Hüttmann, A-E., Purdie, D.M., Walsh, M.D., Simms, L.A., Biden, K.G., Young, J.P., Leggett, B.A., Jass, J.R., and Radford-Smith, G.L.（2001）. Tumour infiltrating lymphocytes and apoptosis are independent features in colorectal cancer stratified according to microsatellite instability status. Gut 200 1; 48, 360-366. 6 Bantel, H., Ruck, P., Gregor, M., and Schulze-Osthoff, K.（2001） . Detection of elevated caspase activation and early apoptosis in liver diseases. European Journal of Cell Biology 80, 230-239, March 2001. 7 Roy, H. K., Karoski, W. J., Ratashak, A., Smyrk, T. C. （2001）. Chemoprevention of intestinal tumorigenesis by nabumetone: induction of apoptosis and Bcl-2 downregulation. British Journal of Cancer Vol. 84, No. 10, 1412-1416, May 1, 2001. フローサイトメトリー 以下の図は、フルオレセイン標識 M30サイトデスで染色後の、正 常およびアポトーシス HeLa 細胞分析の典型的なヒストグラムを示し ています。 図：HeLa 細胞は、10 ng/ml の TNF- αと5μg/ml のアクチノマイシン D で、 37℃で3時間処理され、アポトーシスが誘導された。処理の後、細胞は 3.2.2の操作法に従い、フルオレセイン標識 M30サイトデスで染色された。 点線 = 正常細胞のヒストグラム 実線 = アポトーシス細胞のヒストグラム マーカー M1で分析された細胞がアポトーシス細胞である。 5. 付 記 5. 1 トラブルシューティングの表 問 題 非特異的染色（核の 染色） ラベリングインデッ クスが高すぎる バックグランドが高 すぎる シグナルが無いか弱い 原因の可能性 抗体濃度が高すぎる 推 奨 濃度を下げる。 抗体濃度が高すぎる 濃度を下げる。 洗浄ステップが短すぎる PBS/Tween 20 を 各 5 分間、2 回行う。 不適切なインキュベー インキュベーション ション時間と温度 時間が適切か確認す る。 す べ て の 試 薬 が 使用前に適切な温度 になっているか確認 する。 サイトケラチン 18 の 特定のサンプル中の、 発現が弱いか無い サイトケラチン 18 の 発 現のコントロールと して、CHEMICON よ り供 給 されて いる 抗 サイトケラチン No.18 （MAB3404）を使用す る事が可能である。 17