(7) 腸管吸収実験手技 - J

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昭 和47年1月20日
実 験 手 技 シ リー ズ
(7)
腸 管吸 収 実験 手 技
徳 島大学 医学部栄養学科
萩
平
種 々の 物 質 で 腸 管 吸 収 を 観 察 す る方法 は 今 まで
博
低 く,生 命 維 持 に 大 量 必 要 な糖,ア
ミノ酸,あ
る
数 多 く発表 され て い るが,こ
こで は比 較 的操 作 が
種 の塩 類 な どは,も つ と効 率 の よい機 構 で吸 収 さ
簡 単 で再 現 性 のす ぐれ たin
vivoお よびin
れ る必 要 が あ る.腸 管 は この よ うな物 質 を,能 動
vitro
の 方法 を い くつ か解 説 す る こ とに と どめ る.水 分
輸 送 と呼 ば れ る特 別 な機 構 で 吸収 して い る.能 動
の腸 管 腔 内 か らの 吸収 あ るい は腸 管 腔 内へ の分 泌
輸 送 とは,あ
を 調 べ るに は封 管法 が最 も適 して い る が,そ の他
逆 らつ て,生 物 膜 を通 過 す る こ とを い い,エ ネ ル
る物 質 が 電気 的 あ るい は 濃度 勾 配 に
の物 質 の 吸収 は 以下 述 べ る方 法 の いず れ か を採 用
ギ ーを 必 要 とす る もの で あ る.し た がつ て,エ ネ
す る こ とに よつ て知 る こ とが 出来 る.実 験 目的 に
ル ギ ー産 生 を阻 害 す る物 質 の存 在 で能 動 輸 送 は阻
応 じて どの 方法 を選 択 す る か を決 定 す る た め に
害 され る.拡 散 で は 吸収 速 度 が 濃度 差 に比 例 して
は,あ
増 大 す るの に反 して,能 動 輸 送 で は,あ る濃 度 以
らか じめ小 腸 に は どの よ うな吸 収 機 構 が あ
る のか,知
つ て い る方 が便 利 で あ る と考 え る の
で,概 説 し て お きた い.
I.
速 度 は 比例 的 に は増 大 しな い(飽 和 現 象satumtion
吸収 機 構
phenomenon)す なわ ち,酵 素 反 応 に お け るKmの
特 殊 な 場 合 を 除 い て,哺 乳 動 物 の腸 管 吸 収 機構
は 次 の2つ で あ る.
A.
上 に な る とそ れ 以上 に外 界 濃 度 を上 げ て も,吸 収
よ うな もの が存 在 す る.ま た 能 動 輸 送 で は,構 造
類 似物 質 問 に拮 抗 阻 害 が認 め られ,低 温 で吸 収 速
拡散(passive diffusfon)
腸 管 に 限 らず 一 般 に 膜 の両 側 に 存 在 す るあ る物
度 は 減退 す る.
II. in vivoの
質 の濃 度 差 に 比例 して 吸 収 速 度 の 変化 す る場 合 を
A.
拡 散 とい い,理 論 的 に はFickの
1900年Reid1)に
法 則 に した が う
もの で あ る.拡 散 に よつ て 吸 収 され る物 質 は濃 度
勾 配 に逆 らつ て 吸収 され る こ とは な く,エ ネ ル ギ
ー産 生 を阻 害 す る物 質 の 共 存 下 で も 阻 害 を受 け
封 管法(tied
実験法
loop method)
よ り開 発 され た 方法 で,そ
の
後,改 良 が加 え られ,水 分 の吸 収,分 泌 を 含 む す
べ て の物 質 の 吸収 を調 べ る こ とが 出来 る.
a.24時
間絶 食 に した動 物 を,麻 酔 下 背 面 固 定
ず,=構 造 類 似物 質 に よ る拮 抗 阻 害 な ど も認 め られ
して 開 腹,2つ
な い.ま た,一 般 に拡 散 速 度 は分 子 が大 き くな る
択 し,一 方 を対 照,他 方 を実 験 に用 い る.
の隣 接 した 小 腸 の適 当 な部 位 を 選
じよ うな大 き さの分 子 で も
b. 使 用 部 分 を体 温 程 度 に 温 め た 生 理 食 塩 液 で
脂 溶 性 物 質 は拡 散 速 度 が早 く,弱 酸,弱 塩 基 で は
洗 浄 す る.
c. 一 端 を結 紮 し,他 端 よ り一 方 に は 被 検 液 を
ほ ど緩 慢 とな るが,同
メ ジ ウ ムのpHに よ り拡 散 速 度 は大 い に影 響 され,
電 価 を もつ分 子 が少 な い 条件 下 で最 も よ く吸 収 さ
れ る.
B.
能 動 輸 送(active transport)
(註1)他
方 に は対 照 液 を注 入 す る と(註2)と
もに結 紮 す る.こ の際,注 入 量 を 記 録 して お く.
d. 一 定 時 間 後,動 物 を殺 し,小 腸 を と り 出
腸 管 の重 要 な生 理 機 能 は,消 化 と吸 収 で あ る.
し,封 管 中 の被 検 液 お よび 対 照 液 を そ れ ぞ れ 適 当
大 抵 の水 溶 性 非 脂 溶 性 物 質 の拡 散 速 度 は きわ め て
な容 器 に と り,少 量 の対 照 液 で洗 浄 し,さ きに採
感染症学雑誌
24
表1
封 管 法 に よ る ヒ ス チ ジ ン の 吸 収(ネ
取 し た 液 と合 わ せ て 容 量 を 測 定 す る.
e.
最 初 の 被 検 液,実
ズ ミ,空
bable referem
吸 収 性 指 標 物 質(nonabsor-
svbstance)を
被 検 液 お よ び,対
液 中 の 被 検 物 質 の 濃 度 を 測 定 し,吸 収 量 は μmoles
に 加 え て お く の が 便 利 で あ る.最
あ る い はmg/10cm,ま
る の は,分
子 量 で4,000の
ル で,1%あ
る い は4%溶
後 の 濃 度(比
濁 度 で 測 定 可 能)か
す る.こ
た は9乾
燥 重 量/時 間 で 表 現
の 方 法 で 行 な わ れ た 実 験 の 一 例 を 表1に
示 す.
(註1)被
検 物 質 一 通 常10∼20mM程
る一 を 溶 解 す る 液 は,下
度を用い
記 のKrebs-Ringer燐
酸
る 潅 流 実 験 やin
vitroの 実 験 で,通
に95%
CO2を
O2
5%
め や や 不 便 で あ る.前
る こ とが 出 来 る の で,今
使 用 しな けれ ば な らぬた
者 で は100%
後,被
Riner燐
O2を
を 進 め る.
酸 緩 衡 液 の 組成
0.90%
NaCl(0.154M)
1.15%
KCl(0.154M)
4ml
1.22%
CaCl2(0.11M)
3ml
2.11%
KH2PO4(0.154M)
1ml
3.82%
MgSO4・7H2O(0.154M)
1ml
0.1M燐
酸 緩 衡 液pH
12ml
(17.8g
1lに
使用す
検物 質 は この緩 衡
液 を 使 用 す る こ とを 前 提 に し て,話
Krebs
下 に述 べ
気 ま た は気 相
100ml
7.4
Na2HPO4・2H20+20ml
INHCl水
で
す る)
Krebs
Ringer燐
る が,CaC12を
験 で は,こ
な ら,上
酸 緩 衡 液 の 組 成 は 上 の 通 りで あ
加 え る と白濁 す る た め腸 管 吸 収 実
れ を は ぶ く 必 要 が あ る.も
し使 用 す る
の1/4位 量 な ら 加 え る こ と が 出 来 る.
(註2)注
入 量 が 少 な す ぎ る と,吸
収 面 積 の低
下 か ら吸 収 速 度 も 減 退 す る し,注
入量 が 多過 ぎ る
と血 流 に 影 響 を お よ ぼ す の で,注
意 を 要 す る.
(註3)長
時 間 吸 収 実 験 を 行 な つ た り,水
吸 収 あ る い は 分 泌 を 観 察 す る に は,封
分の
管内の最終
照液
も よ く使 用 さ れ
ポ リエ チ レ ン グ リ コ ー
液 と し て 用 い,反
応前
ら液 量 を 推 定 す
ほ とん ど吸収 され な い
標 物 質 と し て 使 用 し得 る.プ
ア レ イ ン(BSP)イ
緩 衡 液 を 用 い る の が 便 利 で あ る.Krebs-Ringer重
炭 酸 緩 衡 液 も よ く使 用 さ れ て い る が,以
る こ とが 出 来 る.CrCl3も
の で,指
第1号
腸)
液 量 を 知 る た め に,非
験 後 の被 検 液 お よび対 照
第46巻
ロ ムス ル フ
ン ドシ ア ニ ン グ リー ン(I
図1a
潅流装置
昭 和47年1月20日
CG)は
25
前 二 者 よ り多 く吸 収 さ れ る が ,定
単 な た め 用 い ら れ る こ と が あ る.こ
れ ら はin
vivo
潅 流 装 置 を 用 い る 実 験 に も応 用 可 能 で あ る.
B.
潅 流 装 置(in
Quastel2)に
研 須 田 研 究 室3)でin
e.
阪大蛋 白
vivoの 吸 収 実 験 に 使 用 す る
た め 作 成 さ れ た も の で あ る.実
ム ス タ ー,モ
験 動 物 と し て は,
ル モ ッ トな ど 用 い ら れ る
て い な い と き は エ ア ー ポ ン プ の 送 気 量 を ,適
宜加
減 す れ ば よ い.
f.
開 し,使
を 加 え,生 理 的 食 塩 液 で 小 腸 内 腔 を 十 分 洗 浄 す る.
部 の 被 検 液 をD管
を 通 じ てA管
に
使 用 す る 小 腸 の 長 さ は,少
気 の み がC,
が 少 な す ぎ る とA管
量
よ りD管 へ の 逆 流 が 多 く,送
量 が 減 退 す る の で 注 意 を 要 す る.
装 置 はA,B2つ
の ガ ラ ス 管 とCの
分岐 し
法 は 図1aに
ス 加 工 業 者 に 発 注 す れ ば 作 成 し て 貰 え る) .
よ う にA,C両
管 は 約3cmの
ー ル チ ェ ー ブ でi接続 し
,A,B両
の ビニ ール
エ ミス 輸 血 セ ッ ト1型(注4)を
端 に 組 織 を 傷 害 し な い よ うに ヤ ス リを
か け て 鈍 に し た 輸 血 セ ッ トの ビ ン 針 を 接 続 す る.
一 つ の装 置 作 成 に輸 血 セ
ッ ト2個 を 必 要 とす る.
B管 を400∼41℃
ビ ン針 を 図1bの
1aのDの
の 恒 温 槽 に 入 れ,2つ
の
よ うに 細 い ゴ ム 管 で 連 結 し,図
部 分 を ピ ン チ コ ッ ク で 閉 鎖 し てA管
り被 検 液 一10∼20mM液
一 をC管
ビ ン針 の接 続
よ
の ふ く らみ の あ
る と こ ろ よ り少 し 上 に く る ま で 入 れ る.
図1b
A管
i.
,ゴ
ム 管 を は ず す.
の ビ ン針 は 上 部 切 開 部 よ り
,B管
止 血 鉗 子 を は ず し ,A管
の ビ
紮 す る.
上 部 よ り1cm位
下
検 液総 量 を 記 録 し て お
く.
j.
ビニ
管 の 下 に は 約50
cmの ビ ニ ー ル チ ュ ー ブ を 連 結 す る.こ
c.
h.
ま で 被 検 液 を 補 給 し,被
販 され て い な い の で ガ ラ
上あ る
2つ の ビ ン針 近 く で 止 血 鉗 子 を 用 い て ビ ニ
ー ル チ ェ ー ブ を は さみ
ン針 は 下 部 切 開 部 よ り挿 入 し て ,結
た 細 い ガ ラ ス 管 の 三 部 か ら成 り,寸
示 し た 通 りで あ る.(市
な く と も30cm以
こ と が 望 ま し い.
g.
を 通 過 し 被 検 液 を 送 りこ ま な い し ,流
利 用 し,先
所に小切開
に
うに 空 気 の 流 量 が 多 い と き に は,空
チ ェ ー ブ は,ジ
用 せ ん とす る 小 腸 部 分 の2ヵ
を 通 つ てA管
に も述 べ る よ
図1aの
麻 酔 して 背面 測定 した動 物 の腹 部 を正 中 切
の 球 部 よ りD管
送 りこ む こ とを 利 用 した も の で,後
b.
被検液
流 し
の 潅 流 装 置 は エ ア ー ポ ン プ よ り送 られ る 空
a.
へ 空 気 に よ つ て 被 検 液 が う ま く押 し 上 げ
られ て い る の を 見 る こ とが 出 来 る し,A管
置 を 適 当 に 縮 少 す れ ば マ ウス に も用 い られ
D,A管
に
の 温 度 上 昇 か ら も 判 定 す る こ と が 出 来 る.潅
る.こ
の が れ る 際,球
,A管
潅 流 が うま く行 な わ れ て い る 場 合 に はC管
か らA管
が,装
気 が,図1aC管
の上 端 にエ ア
らの ゴ ム管 を つ な ぎ
被 検 液 を み た す.
よ りin vitroの
実 験 に 用 い られ た 装 置 を 応 用 し て1960年
ピ ン チ コ ッ ク を は ず し,C管
ー ポ ン プ(注5)か
vivo circulation method)
1953年Darlington,
ラ ッ ト,ハ
d.
量が簡
40℃ の 生 理 的 食 塩 液 に 浸 した ガ ー ゼ を 小 腸
表 面 の 乾 燥 を 防 ぐた め か け て お く.
k.
約10分 後,A管
ml)し,以
後20分
よ り試 料 を 採 取(0
ご と,あ
る い は30分
.1∼0.2
ご とに一
図2
潅 流 装 置 に よ る ガ ラ ク トー スの 吸収(ラ ッ ト)
10mMガ
ラ ク トー ス 小 腸60cm潅
流 液 量63.5ml
感 染 症 学雑 誌 汐第46巻
26
第1号
時 間 また は2時 間 に わ た って 同 様試 料 を採 取 し,
腸 お よび 回腸 末 端 に小 切 開 を加 え,生 理 的 食 塩 液
そ れ ぞ れ 濃 度 測 定 を 行 な う.使 用 す る腸 管 の長 さ
で 小 腸 内 容 を 洗 浄,排 出 す る.
に も よ るが50∼70cm使 用 す れ ば,試 料 採 取 量 を 除
い て 通 常2時 間 で5∼6mlの
水 分 減 少(吸
b.
腸 間 膜 脂 肪 組 織 が で き るだ け 小腸 に 附着 し
な い よ うに注 意 し なが ら全 腸 管 を 腸 間 膜 よ り剥 離
収)
が 認 め られ る.
1. 最 後 に 動 物 を 殺 し,使 用 した腸 管 の長 さま
し,生 理 的 食 塩 液 を い れ た シ ャー レに 移 す.
c. 直 径1.5mm長 さ約30cmの ス テ ン レス棒 を 小
た は乾 燥 重 量 を 測 定 し,吸 収 量 は μm01esま た は
腸 の 一端 漿 膜 側 に お き,漿 膜 側 を腸 管 腔,つ
まり
mg/10cmま た は9乾 燥 重 量/時 間 で 表 わ す.
粘 膜 側 に お し こん で い くと,反 転 小腸 が得 られ る
(注6).全 腸 管 を 一 時 に 反 転 す る こ とが 困 難 な場
この方 法 で行 なわ れ た 実 例 を 図2に 示 す.
広 島県 佐 伯 郡 大 野 町 更 池1990
合 に は,適 当 な長 さに 切 断 して 行 な えぽ よい.
d. 長 さ3∼4cmに
反 転 小 腸 を 切 断 し,一 端 を
日本 メデ ィ カル サ プ ライTel 08295-(6)0160
結 紮 す る.結 紮 糸 は両 端 と も1cm位 残 して お く方
(注4)ジ
(注5)熱
エ ミス輸 血 セ ッ トI型
帯 魚 な どの 飼 育水 槽 に と りつ け られ
る小 型 エ ア ー ポ ン プ100V5Wの
もの.
III. in vitmの 実 験 法
A.
が 以 後 のi操作 に 便 利 で あ る.
e. 結 紮 糸 を ピンセ ッ トで つ か み,反 転 小腸 の
他 端 を 濾 紙 上 に お き粘 膜 側 に 附 着 して い る食 塩 液
を 濾 紙 に しみ こませ る.こ の際,粘 膜 細 胞 が 傷 害
反 転 腸 管 サ ック法(everted sac method)
1954年Wilson,
Wiseman4)に
よ り開 発 され,
in vitroの 吸 収 実 験 に 最 も よ く 用 い られ て い る も
され る の で反 転 小 腸 全 体 を 濾 紙 上 に おい て は な ら
の の1つ で あ る.反 転 小 腸 サ ック法 の特 徴 は,1)
な い.
f. 以 上 の よ うに 処置 した反 転 小 腸 片 を シ ャ ー
直 接 吸 収 に 関 与 す る粘 膜 側 が 反 転 され て い るた め
レの蓋 の上 に お く.以 下,能 動 輸送 実験 を例(注
酸 素 で 飽 和 され た メ ジ ウ ムに 直接 接 触 し,特 に エ
7)に
ネ ル ギ ー供 給 を 必 要 とす る能 動 輸 送 の 実 験 に 最 適
で あ る.2)内
液(漿 膜 側)の 容 量 は 外 液(粘 膜
側)に 比 して 少 量 で 内 液 の 濃 度 変 化 を 観 察 す るの
が 容 易 であ る.3)漿
膜 側 に も液 を 注 入 す るた め
g.
と り説 明 し て ゆ くこ とに す る.
被 検 液 一 通 常5mM液(特
別 の場 合,た
と
えば 塩 基 性 ア ミノ酸 な どの場 合 は1mM)-5m正
を50ml
h.
meyerフ
2mlの
ラス コに とる.
ツ ベ ル ク リン 用 注 射 器 に 筋 注 用 注
小 腸 が 伸 展 し,粘 膜 側 表 面 積 の増 大 を きた し,吸
射 針 を つ け 正 確 に2mlの
収 を 容 易 に す る,こ とな どで あ る.
この方 法 は,小 動 物 の腸 管 吸 収 実 験 に用 い られ
あ げ る.注 射 針 は組 織 傷 害 を 防 ぐた め,先 端 を ペ
るが,特 別 の理 由 の な い限 りハ ムス タ ーが最 も使
用 す る.
i. 反 転 小 腸 の結 紮 して い な い 端 に 注 射 針 を 挿
用 しや す い 動 物 で あ る.体 重100∼1209の
ハム
ス タ ー で あれ ば 全 小 腸 の長 さは30cm内 外 で,ア
ノ酸,糖
で,イ
ミ
な どの能 動 輸 送 は 他動 物 に 比 して 活 溌
ンキ ュ ベ ー シ ョン後,粘 膜 傷 害 も少 な く取
り扱 い やす い動 物 で あ る.ラ
る動 物 で あ るが,イ
ッ トも よ く用 い られ
ンキ ュベ ー シ ョン後,粘 膜 細
目盛 まで 被 検 液 を 吸 い
ンチ で切 断 しヤ ス リを か け,ま
る くした もの を 使
入 し,結 紮 糸 で軽 く一 回 結 び,注 射 器 内 の被 検 液
を注 入 す る.注 入 量 は 図3aの
よ うに小 腸 が 少 し
弩 曲す る程 度 とす る.
j. 注 入 が終 る と注 射 針 を ひ き抜 く と同時 に軽
く結 紮 して い た と ころ を きつ く しめ,も
う一 度 結
胞,粘 液 な ど脱 落 が 少 しあ り,モ ル モ ッ トで は腸
ん で 結紮 を完 了 す る と小 さな ソ ーセ ー ジ様 の 反 転
管 を腸 間膜 か ら よほ ど注 意 深 くは が さな い と腸 管
小 腸 サ ックが 得 られ る.余
に 穴 を あ け る心 配 が あ り,ま た 他 動 物 に く らべ腸
く.
k.
管 の収 縮 が 著 明 で,取 り扱 い が 少 し困 難 で あ る.
a. 断 頭 に よ り脱 血 した 動 物 を 開 腹 し,十 二 脂
分 の糸 は 切 断 し て お
注 入 量 は 注 射 器 の 目盛 か ら 正 確 に 読 み と
り,記 載 して お く(初 期 量initial volume).
昭 和47年1月20日
27
図3a
図3c
図3b
に つ い て い る 被 検 液 を 濾 紙 に 吸 着 さ せ る.
p.
自動 天 秤 に 糸 の 輪 の 部 分 を か け,重
さを は
か る(W1).
q.
サ ッ クの糸 のつ い て い ない 方 を 小試 験 管 の
口 に お き,小
r.
切 開 を 加 え て 内 液 を 採 集 す る.
eあ る い は0と
紙 に 吸 い と り,重
同様 附着 して い る内液 を濾
さ を は か る(W2),W1-W2が
最 終 内 液 量(finalvolume)で
1.
反 転 小 腸 サ ッ ク を さ き に 準 備 し たmeyer
フ ラ ス コ 中 に 入 れ,図3bの
02に
置 換 し,図
よ うに 約30秒 気 相 を
の 栓 を は ず し,直
ち に4号
meyerフ
ゴム
間 振 湯(80回/分)
表2
5mM
C14パ
よ び 図4
の 方 法 の 実 例 潮 示 し た も の で あ る.
ス タ ー で は,回
腸 下 部 を除 い て
ミ ノ酸 な ど の 能 動 輸 送 速 度 に 差 は な い が,
お り,実 験 に 際 し て は,同
じ部位 を使 用す るの が
望 ま し い.』
同 じ操 作 で 粘 膜 側
(注7)拡
反 転 小 腸 サ ッ ク 法 に よ るC14ノ
リ ン(1750
収 量 はΔ μmoles/
ラ ッ トで は 部 位 に よ る 差 の あ る こ と も報 告 さ れ て
紮 糸 の とこ ろ
よ う な 形 の 糸 を か け る.
糸 を 指 さ き で づ か みeと
cpm/ml)使
.
応 後 の 内液 お よび 外 液
重 量/時 間 で 表 現 す る.表2お
(注6)ハム
糖,ア
サ ッ ク は 乾 い た シ ャ ー レに い れ,結
o.
反 応 前 の 被 検 液 ,反
は,こ
ラ ス コ を37℃1時
反 応 終 了 後 外 液 を 試 験 管 に と り,反 転 小 腸
に 図3cの
t.
100mg湿
培 養 す る.
n.
両 結 紮 間 の 小 腸 湿 重 量 を 測 定 す る(Ww)
の 被 検 物 質 の 濃 度 を 測 定 し,吸
栓 で 密 封 す る.
m.
あ る.
s.
ミリ ン の 吸 収(ハ
用.37℃1時
散 速 度 を 知 る た め に は 内 液 にKreb
ム ス タ ー 空 腸)
間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン
感染症学雑誌
28
図4
図5
反 応 後 の粘 膜 側 お よび漿 膜 側 の バ リ ン濃 度
Ringer燐
酸 緩 衡 液 を 使 用 し,他
は 能動 輸送 実験 と
同 じ よ うに 操 作 す れ ば よ い.特
に拡散速度の遅い
物 質 に つ い て は,反
第46巻
第1号
試 験 管 法 の装 置
応 後 に 内 液 を採 取 す る ときサ
ッ ク に 附 着 し て い る 被 検 液 に 汚 染 さ れ な い よ う注
意 を 要 す る.わ
た し ど も は これ を 防 ぐた め に,一
端 に 細 い ビ ニ ー ル チ ュ ー ブ を 挿 入 し,内
液 を入 れ
た 後 ビ ニ ール チ ェ ー ブを 結 紮 す る特 製 の反 転 小腸
サ ッ クを 使 用 し て い る.反
食 塩 液 で 洗 浄 し,ビ
応 後 は サ ックを 生理 的
ニ ール チ ェ ー ブを 切 断 して 注
射 器 で 内液 を 採 取 す れ ば よ い.
B.
試 験 管 法(tube
method)
反 転 小 腸 サ ッ ク法 で は,時
間 的 に 内 液 か ら試 料
c. 反 転 小 腸 サ ッ ク法 と同 じ く3∼4cmの
を 採 取 し,吸 収 の 様 相 を 調 べ る こ とが 出 来 な い.こ
を結 紮 した 反 転 小 腸 を 作 成 し,ガ
の 欠 点 を お ぎ な うた め に,1958年Crane,Wilson5)
接 続結 紮 す る.
d. 内 液 の(注10)注
に よ り考 案 さ れ た も の で あ る.
a.原
著 の 装 置 は(注8)図5の
mmの 内 容15mlの
主 体 で あ る.ガ
射 器 に 接 続 した 針 の さ きに 細 い ビ ニ ール チ ュ ー ブ
を つ けた も ので 行 な い,小 腸 の下 端 か らゆ つ く り
ガ ラス管 を 挿 入 した も のが
結 紮 部 に達 す る ま で入 れ る.
e. 内液 の注 入 が終 れ ぽ ガ ラス管 部 分 を 予 温 し
し くび れ が い れ て あ る.ガ
い ポ リエ チ レ ン チ ュ ー ブ を つ け,試
(注9)で
b.
て あ る試 験 管 に 接 続 し,100%02を
通 気 す る.
方には細
験 管 の底 に く
い けれ ども,15分 位 イ ンキ ュベ ー トす る と緊 張 が
れ が 通 気 口 で,他
は排気 口
緩 和 して くる の で,内 液 が 結 紮 部 まで 到 達 し てい
な けれ ば追 加 し,全 注 入 量 を 注 射 器 の 目盛 りか ら
あ る.
被 検 液― 被 検 液 の 濃 度 は1∼5mM―10ml
を 試 験 管 に と り,37℃
ラス
(註11)こ の 時 期 で は 小 腸 が 収縮 し,緊 張 度 は 高
管 の 両 側 に1/1静 脈 用 注 射 針 を 挿 入 し,一
つ つ く よ うに す る.こ
入 は,ツ ベ ル ク リン用 注
ム 栓 に 上 部60
ラス管 の下 部 に反 転 小 腸 を 結 紮 し
や す い よ うに,少
ラス管 の下 部 に
よ うに95×15
試 験 管 と,No.1ゴ
×10mm下 部50×5mの
一端
で 予 温 す る.
読 み とつ て お く.
f. イ ンキ ュベ ー シ ョンを は じめ て20分 位 経 過
昭 和47年1月20日
し て か ら,通
と,試
29
気 し な が ら指 さ き で 排 気 口 を ふ さ ぐ
験 管 内 圧 の 上 昇 と と も に,内
を 上 昇 す る の で25∼50μl採
以 後5分
間 隔20分
通気装置
取 し て0タ
イ ム と し,
ま で 同 じ 要 領 で 試 料 を 採 取 し,
濃 度 を 測 定 す る.吸
収 速 度 は 反 転 小 腸 サ ック法 に
準 じ て 表 現 す れ ば よ い.図6はCraneら5)に
図6試
図7
液 は ガ ラス 管
よつ
験 管 法 に よ る6デ オ キ シ グル コー スの 能
動 輸送5)
C.
組 織 蓄 積 法(註12)(tissue
accumulatfon met-
hod)
能 動 的 に吸 収 され る物 質 が 小腸 粘膜 細 胞 に と り
に 行 な わ れ た.6デ
オ キ シ グル コ ース の能 動 輸 送
を示 した 実 験 例 で あ る.
(注8)原
著 の 寸 法 に と らわ れず,適
積 さ れ る こ と を 利 用 し た も の で,1954
年Agarら6)に(註13)よ
当 に修 正
して 実 験 す る こ と も可 能 であ る。
(注9)通
こ ま れ,蓄
気 す る と料 腸 粘 膜 か らの粘 液 の た め
り行 な わ れ た も の で あ
る.あ
る 物 質 が 能 動 輸 送 さ れ る か 否 か を し らべ た
り,あ
る物 質 の 能 動 輪 送 に お よぼす 各 種 物 質 の
影 響 を 観 察 し た り,あ
るい は 能 動 輸送 が近 似 的 に
外 液 の 粘 稠 度 が 高 ま り,排 気 口か ら気 泡 と と もて
Michaelis-Mentenのhineticsに
外 液 を噴 出 させ る こ と もあ り,排 気 口は 口の大 き
ら,酵
い 方 が 有 利 で あ る.
constant)の 測 定 な ど に も ち い られ る.こ
(註10)内 液 は反 転 小 腸 サ ッ ク法 と同 じ く,実
験 目的 に応 じて選 択 す る.
(注11)通 気 量 は 外液 に 小 さな 気 泡 が 絶 え ず
7∼8コ
認 め られ る程 度 と し,量 が 多 くな る と外
液 が 排 気 口 よ り噴 出す る の で,注 意 を 要 す る.な
お,通 気 装 置 は 図7の
あ る.
よ うな手 製 の も の で十 分 で
素 反 応 に お け るkmに
著 と異 り,わ
a.
3mmに
した が うこ とか
相 当 す るkt(transport
た し ど も の 実 験 法 を 主 に 記 載 す る.
反 転 し た ハ ム ス タ ー小 腸 を ハ サ ミで 幅2∼
輪 切 りに し て,生
理 的 食 塩 液 に ひ た し,部
位 に よ る 吸 収 差 を 除 く た め,十
b.
こで は原
分 撹 搾 す る.
反 転 小 腸 切 片 を ガ ー ゼ の 上 に と り,附 着 し
て い る 生 理 的 食 塩 液 を 吸 い と り,200∼300mgと
り,mg単
位 ま で 正 確 に 秤 量 し て 記 載 し て お く.
感染症学雑誌
30
表3
第46巻
第1号
(註13)原 著 では 小 腸 を 反 転 せ ず,そ
組 織 蓄 積 法 に よ る リジ ンの 吸 収
(ハ ム ス タ ー 小 腸)
0.5cm位 め長 さに 切 り,29の
の まま
切 片 を20mlの
液 に 浸 して通 気 しな が ら,1時
被検
間 イ ンキ ュ ベ ー ト
して い る.被 検 液 は5∼20mM程
度 の もの を使 用
し,蓄 積 量 は,μmoles/乾 燥 重 量9/時 間 で表 わ し
て い る.こ の 方 法 で は,組 織 内 へ の物 質 の と りこ
み は20分 位 まで 直線 的 に 行 な わ れ,50分 位 で 平衡
状 態 に 達 す る とい う.ラ ッ トの腸 管 で は,dの
1mMリ
ジ ンC14(4900cpm/ml)使
吸 収 速 度=(小
用
腸 切 片 内 水 分 量*+除
100
×
ジ ンcpm
/湿 重量
作 の とこ ろで 粘 膜 が 濾 紙 に 附 着 し,組 織 が そ こな
蛋 白 液 量)
わ れ る の で,反 転 し ない 腸 管 を 用 い る方 が 有 利 で
遠 心 上 清cpm/
×
1mMリ
あ る.
* 小 腸切 片 内 水 分 量 は湿 重 量 の80%
1)
c.
50ml
秤 量 した 組 織 切 片 を 被 検 液5mlの
meyerフ
ラ ス コ に と り,反
入つた
転 小 腸 サ ッ ク法
Reid,
J.
2)
相 を 置 換 し て,10∼20分37℃
で
イ ンキ ュ ベ ー トす る.
d.反
応 終 了 後,被
E.W.:
生 理 的 食 塩 液 で 洗 浄 し た 後,濾
紙 の
織 に5%三
塩 化 酢 酸 を 加 え て,
Potter-
testine,
4)
ホ モ ジ エ ナ イザ ー で ホ モ ジ ネ ー ト
重 量/10∼20分
で 表 現 す る.表3は
5)
(注12)被
検 物 質 と し て,こ
の 方 法 の 場 合,放
射 性 同 位 元 素 で 標 識 した 物 質 を 使 う の が 便 利 で あ
る.組
織 か ら の 回 収 率 は,ア
ル ギ ニ ン,グ
ス な ど 一 部 の 物 質 を 除 い て,95%前
ル コー
後 で あ る.
to
6)
R.K.
method
for
of
145•\146,
1958.
W.T.,
uptake
Biochim.
the
the
in-
The
for
use
the
substances
surface,
and
the
absorption
Agar,
on
1960.
Wiseman:
intestine
serosal
B6
through
124•\130,
of
amino
of
study
of
from
.J.
the
Physiol.,
123:
1954.
Crane,
The
G.,
and
of
vitamin
47:
small
the
116•\125,
1953.
Yoshikawa
acids
transferance
mucosal
こ の 方 法 の 実 験 例 で あ る.,
of
Biochem.,
and
194•\207,
S.,
L-amino
everted
Absorpintestine,
absorption
effect
of
T.H.,
of
the
.し,遠 心 上 清 中 の 被 検 物 質 濃 度 を 定 量 し,μmoles
uptahe/100mg湿
The
J.
Wilson,
sacs
Elvehjemの
I.
Quastel.:
surviving
43:
Sugawa.,
Intestinal
absorption
上 に と り,組 織 に 附 着 し た 食 塩 液 を 吸 い と る.
e.組
T.,
Suda:
acids
を 約30mlの
J.H.
isolated
Biophys.,
H.,
of maltose,
1900-1901.
and
from
Biochem.
Akedo,
absorption
436•\444,
W.A.,
of sugars
M.,
検 液 は 試 験 管 に と り,組 織
26:
Darlington,
Arch.
3)
Intestinal
Physiol.,
tion
の と き と 同 様,気
操
T.H.,
study
sugars,
J.
F.J.R.
of
Biophys.
Wilson:
of the
Appl.
Hird
amino
Acta.
14:
of
vitro
intestinal
Physiol.
and
acids
In
rate
by
G.S.
the
80•\84,
12:
Sidhu:
intestine,
1954.