(1)2014/15シ ーズンのインフルエンザワク ご ン株について

第 7回 厚 生 科 学
義会 予防接種 ロワクチ ン分科会
研究開発及 び生産 饉流通部会
5月 23日
平 成 26年
(金 )
10:00∼
12:30
厚生労働省専用第 22会 議室 (18階 )
第
2 議
題
(1)開
発 優 先 度 の 高 い ワ ク チ ン等 の 開 発 状 況 に つ い て
○武田薬品工 業株式会社
○一般財団法人化学及血清療法研究所
(2)厚
生労働 科学研究 研 究班発 表
○長谷川秀樹参 考人 ( 国立感染症研究所病理部)
新興再興感染症に対す る経鼻 ワクチ ンの 開発 ・実用化に関す る研究
0 保 富 康宏参考人 ( 医薬基盤研究所霊長類医科研究セ ンター )
粘膜免疫誘導型新規結核 ワクチ シの 開発
○岡田全 司参考人 ( 国立病院機構近畿中央胸部疾患セ ンター 臨床研究セ ンター )
多剤耐性結核に対す る新規治療用 D N A ワ
クチ ンの 開発 口実用化 に関す る研究
3 報 告事項
ーズンのインフルエンザワク ン株について
(1)2014/15シ
ご
( 2 ) 新 型イン フル エ ンザ ワクチ ン細胞培養事業 の公募結果 について
4 閉
会
￨
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, 配 付資料
資料 1
―
資料 2
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武
-般
田薬品工 業株式会社 提 出資料
財団法 人化 学及血 清療法研究所 提 出資料
資料 3 長
資料 4 - 1 保
谷川参考人 提 出資料
富参考人 , 提 出資料 1
資料 4 = 2 保
資料 5 岡
富参考 人 提 出資料 2
資料 6
資料 7
資料 8
1
,￨
田参考人 提 出資料
2 0 1 4 / 1 5 シ ァ ズ ンの イ ンフル エ ンザ ワクチ ン株
2 0 1 3 / 1 4 シ ニ ズ ンの 国内外 の イ ンフル エ ンザの流 行状況報告
新 型イ ンフル エ シザ ワクチン細胞培養事業の公募結果
厚 生 科 学 審 議 会 予 防 接 種 ・ワクチ ン分 科 会
研 究 開発 及 び 生 産 ・流 通 部 会 委 員
平成 26年 5月 23日
(委員)
伊藤 澄 信
◎庵原 俊 昭
独 立行政法人国立病院機構本部研究センター臨床研究統括部長
独 立行政法 人国立病院機構二重病院院長
小森 貴
公
益社団法人 日本医師会感染症危機管理対策担当常任理事
坂元 昇
全
国衛生部長会副会長 (川崎市健康福祉局医務監)
○西島 正 弘
昭 和薬科大学 学長
福島 若 葉
大 阪市立大学大学院医学研究科公衆衛生学准教授
細矢 光 亮
福 島県立 医科大学小児科学講座教授
三村 優 美子 青 山学院大学経 営学部教授
森 康 子
神
戸大学大学院医学研究科臨床ウイルス学分野教授
山口 照 英
国 立医薬品食品衛生研究所客員研究員
◎ :部 会長
○
:部 会長代理
厚 生 科 学 審 議会 予 防接種 ・ワ クチ ン分科 会
研 究 開発 及 び生産 ・流 通 部 会 参 考 人
平成 26年 5月 23日 、
(参考人)
小河原 修
武 田薬品工業株式会社 ワクチンビジネス部臨床開発グルー プ
グルー プマネジャー
城野 洋 一郎 一 般財団法人化学及血清療法研究所理事
長谷 川 秀 樹 国 立感染症研究所感染病理部長
保富 康 宏 独 立行政法人医薬基盤研究所霊長類医科学研究 セ ンター 長
岡田 全 司
独 立行政法人国立病院機構近畿 中央胸部疾患 セ ンター 臨床研
究 セ ンター 長
小 田切 孝 人 国 立感染症研究所イ ンフル エ ンザ ウイル ス研究 セ ンター 長
Better Health,Brighter Future
武田薬品における哄
‐ノロウイルスワクチ1輔
2 0 1 4 年5 月2 3 日
ワクチンビジネス部 小河原 修
The norovirusPhoto: ALAMY
TakedaPharmaceuticalCompanyLimited
本 国の内容
あ
４ １
ノロウイルスワクチン開発
ァ 予 防接種 ・
ワクチン分科会研 究開発及び生産 ・
流通部 会 に
おいて選定 された、開発優 先度 の高 いワクチン
2.
日本 における開発 中のワクチン
/ TAK-816(ヒ ブワクチン)
/TAK-850(細 胞培養季節性インフルエンザワクチン)
TakedaPharmaceutkalCompa!rylimited
ノロウイルスワクチン開発
背景
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・ノロウイルス急性 胃腸炎は、急性 胃腸炎全体 の約半数 を占めている。
一 青少年 や成人を含め、全ての年齢層 における原因ウイルスである。
・5歳 未満 の小 児 では、ロタウイルスに続 いて2番 目の急性 胃腸炎の原因ウイルスと
なっている。
一 有効 なロタウイルスワクチンは存 在 するため、ノロウイルスがt全 世界 の小 児に
対し最 も重要な胃腸系疾患 の原 因ウイルスとなりつつある。
・嘔吐や下痢などの症状 は、非常に重篤な場合 がある。
一 世界的 に、若年 小児や高齢者 の入 院率 が高い。
-5歳 未満の小児 では、年間に71,000人から200,000人が死 亡する(主に発展
途 上 国)。
一 先進 国では、年間に20,000人以上の高齢者 が死亡する。
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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ノロウイル スワクチ ン開 発
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
ノロウイルスワクチン開発
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疾患 ´予防するごとα 猪
重 篤な疾 患 や 合 併症 を誘発 しやす い乳 幼 児 及 び
高齢 者
感染 しやす い、あるいは感 染拡 大 の 懸念 がある、
以下 のような集 団
・ 医療従事者/ 養 護施設勤務者
・食物取扱者
・船舶渡航者/ ス タッフ
・海外渡航者
・軍隊
・入院患者
・免疫不全者
TakedaPharmaceutical Company Limited
開発 中のノロウイルスワクチン
あ
0 2種 類 のノロウイルス抗原 から構成 される2価 ワクチン(筋肉内接種)
― ノロウイル ス抗 原 ( G l . 1 、
GII.4:ヒ
トで発 症 する主 要 抗 原 )
― VLPs(Virus_Like PatticlesIウ イルス様 粒 子 )
・ アジュバントとして、水酸化アルミニウム及びMPL(GSK)を 含む
・ ViruS―Like Particles:
― ウイルスカプシド構造を正確に構成する
「 ウイルス遺伝子を含まない(感染/発 症しない)
― 大規模な細胞 培養で容易に製造できる
― 他のワクチンですでに使用されている(例:HPVワクチン)
Takeda Pharmaceutical Company LiEiited
開発 中 のノロウイルスワクチン
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試験デザイン
・評 価項 目:安全性、免疫原性
・第 二相試験、無作為プラセボ対象 二重盲検比較試験(用量漸増)
二 用量 :5ノ
50、150r150 μ
15、50ノ
5、15ノ
g(1回 目/2回目接種)
ント:MPL 50 μ
アジュノ
g
g+水 酸 化アルミニウム 500 μ
ヾ
… 健康成人(102名 :18‐
85歳 )
64歳 、65…
49歳 、50‐
・2回 接種(28日間間隔)
試験結果
・す べての用量で、忍容性が確認された ゛
・G!。1に対する抗体価は、Gl:.4よ
り高い免疫原性を示した
0 102例 中、5例に重篤な有害事象が発現したが、全ての症例つ クチンとの因果
関係は否定された
TakedaPhamaceutlcalComparyUmited
開発 中のノロウイルスワクチン
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Frey et a:。
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目)
ワクチン接種 :Day o(1回
目)とDay 28(2回
PanJg:すべての抗ノロウイルス抗体
Takcd. Pharmaccuth.l CompanyLimlted
開発 中のノロウイルスワクチン
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年齢に関係なく、各集団の大部分 が本 ワクチン1 回接種後 に免疫反応 ( 接種前 と比
較してG M T が 4 倍 以上の上 昇を示す) を示した
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ワクチン接種
Day O(1回
目)
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Takeda Pharmaceutical Comparry Limited
開発 中のノロウイルスワクチン
とソθ3-7θイ磁 庁 妨
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長期免度原性)
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成人 (85歳まで)では、本 ワクチン接種後 1年 間、血 清中抗体価 が持続 した
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Treanor et ai.,:CAAC,2012
Takeda Pharmaceutical CompatryLlmited
開発 中のノロウイルスワクチン
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試験デザイン
・評 価項 目 :安全性、免疫原性、有効性
・第 1/1相 試験、無作為 プラセボ対象 二 重盲検比較試験
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目/2回目)
用量 :50/50 g(1回
アジュバント:MPL 50 μ
g
g+水 酸化アルミニウム 500 μ
・ 健 康成 人 ( 1 3 2 名: 1 8 - 5 0 歳
)
・ 2 回 接種 ( 2 8 日間間隔)
・ GH.4ウ イルスチャレンジ(56日後)
試験結果
・ ワ クチンに関連 した重 篤 な有害事象は発現 しなかった
・ワ クチン接種によつて、抗体価 は上 昇 した
Takeda Pharmaceutical Company Limited
開発 中のノロウイルスワクチン
の
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とyθ3-7θ5.'蒻 炎 芝左夕 のノが芝ど″7房り
0 良 好 な安 全 性 と前 述 の 試 験 と同様 の 免 疫 原 性 を示 した。
・ プ ラセボ 群 と比 較 して、嘔 吐症 状 か つ/ ま たは 下 痢 症 状 の 発 症 を抑 制 した 。
一 ロ タウイルスワクチンと同程度の発症抑制効果
・ プ ラセボ群と比較して、ワクチン接種群ではノロウイルスの検出が低かつた。
一 感 染拡 大 の制御 に期待できる
Severe vomiting
AND/ORdiarrhea
0
4
100%
(0.0%)
(8.3%)
( ― , ―)
Moderate or severe
vomiting AND/OR
diarrhea
3
9
68%
(60%)
(18.8%)
(-112,908)
Mild, moderateor
severe vomiting
AND/ORdiarrhea
10
20
52%
(200%)
(41.7%)
(83,749)
0054
0068
0028
Bernstein et al,lD Week2013,October 2014
Takeda Pharmaceutical Company Limited
開発中のノロウイルスワクチン
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あ
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総
括
ノロウイルスワクチン(VLP)は 、ウイルスチャレンジ
おいてヽ嘔 p■ゃ下痢症 1犬などの発症を抑
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未満 の小 児
― 高齢者
一 海外渡航者、軍隊、医療従事者
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零
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本 ワクチンの開発 によって、ノロウイルスによる疾
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済
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戸
Takeda Pharmaceutical Company Limited
あ
日本 における開発 中のワクチン
４１
2.
TAK-816(ヒブワクチン)
一 審 査中(2013年9月 申請)
TAK-850(細 胞培養季節性 インフルエンザワクチン)
一 phase 1/2試験進行中
BLB-750(H5N1/プロトタイプ パンデミックインフルエンザワクチン)
- 2 0 1 4 年 3 月承認取得
Takeda Pharmaceutical Comparry Limited
資料 2
そ の先 に見 え る
あ な た の笑 顔 の た め に。
DP丁 ―
IP∨を含 む混合 ワクチンの石
丹究 開発
包土
糸
田月
音養 インフルエンザワクチンの開発
MRを 含 む混合 ワクチンの開発
2014.5.23予防接種・
ワクチン分科会研究開発及び生産流通部会
d●漑峨鵞
DP丁―
IPVを含む混合 ワクチンについて
｀
翻記合 ワクチンの社会 的二…ズ】
●平L児期の過密な接種スケジュールにおいて、接種スケジュー
ルの単純化 、被接種者 の負担軽減 、医療過誤防 止 、接種
もれ防止に寄与する混合 ワクチン
●.医療 経済学的 に受け入れやすいワクチン
′
JI生
●害令
1牛
十分配慮lノ
利傾1牛
に十分配慮
の高いワクチン
し、利便
安全性
ケジュール
各国 の混合 ワクチン接種:ス
ノ
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3理
５種 灌 合 を 使 用
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5)キヤリアの母●から生まれた児へは、Ql●力月で罐■
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、ⅢLn2014pr
化血研混 合 ワクチン開発概要
● 国 産 混 合 ワクチン供 給
●国内既承認 Hibワクチン (ActHibO)の導入 により、侵襲性 のHib
感染症 は激減した。今後ともHibワクチンは重要であり、国産化す
ることが望ましい。
●当所でHibワクチンを開発し、国内生産 ・
自給化を図る。
05'昆
ワクチン
大 切 な人 の た め に
f l .ち
たが ‖」来 る こ と
ケジュール
混合 ワクチン開発 接 種:ス
●DP丁口
IPV―Hib5'昆ワクチンl妾
種スケジューJレ
●第 6回 研究開発及び生産流通部会 におして 、DP丁―
IPVを含む混
合ワクチンの開発に当たつての留意事項として、初 回接種時期を現
在のHibワクチン(生後 2ヵ月 )に合わせる形で検討すべきとの方 針が
示された。
●接種スケジュールについては上言
目談しながら開
己を参考にPMDAと 本
発実施 予定。
大 切 な人 の た め に
田胞 土
糸
点
音養 インフルエンザワクチンの不」
本幸
発育鶏卵での生産
r _ たち が ‖: 来 る こ と
F
細胞培養での生産
製造期間が
約 6 ヶ月短縮
ワクチン
細胞 バンク
ウイルス培養
細胞 ・
ウイルスの精製
ウイルスの
不活化 。
精製
夕製造期間の短縮 ・
生産量アップにも柔軟に対応可能
発育鶏卵による生産では、生産開始前に鶏を育成し有精卵を準備する必要がある(約6ヶ月)。そのため、緊急の生産量アップには対応が困難。
細胞培養による生産では、凍結してある細胞バンクを融解するだけで製造がスタートでき、生産量アップにも柔軟に対応できる:
バンデミックウィルスは鶏に高病原性を示す可能性が高く、バンデミック発生時には卵の供給が困難となることが予想されるが、細胞による生産
は卵に依存しないため、バンデミック発生時でも安定生産が可能である。
発育鶏卵では全国民人分のパンデミックワクチンを製造するのに1年半から2年半かかるが、細胞培養は半年以内の製造を目指している。
′流行株にマッチしたワクチン生産
ウイルス分離から全て細胞を用いてワクチンを製造可能となった場合、鶏卵を通した時に比べて抗原変異が少ないと期待される。
′安全性向上
適格性と安全性が確認された細胞バンクを用い、減菌処理された密閉環境下で厳密に管理・
製造されるので、外来性因子の混入を排除できる。
卵由来の成分を含まないため、卵アレルギーの方へも安全に使用‐ る。
ノ( 切 = 人
細胞培養インフルエンザワクチンの開発
の た . l●に
ビたちが ‖1 , ( 7こと
」
バンデミックワクチン
H5Nlワ クチン
￨
￨
プロトタイプワクチン
・
基礎検討
・バンデミック製法をベースに季節性株 に合わせて製法検討
(抗原性変異、生産性評価 )
・剤型変更 :1価 スプリツト抗原(3口75‖ gHArdose)+AS03ア
⇒ 4価 スプリツト抗原(15口 9HⅣ 株′
dose)
果;誕
田I泡土
糸
音:養インフルエンザリクチンの言
ジュバント
人 Ч な フ、つ た r ) に
来
f _ たちがi 1 1 ること
● 製 造実績と製造コスト
ヾ
ンデミックワクチンとのシナ
ワクチンの早期開発とノ
季 節1生
ン
ー
●ノ
ヾ
ンデミックヘの即応体市Jを確実 に維持 していくための原材料 の
管理を可能とする。
製造要員の維持 ・
備蓄、製造設備 ・
・細胞株毎 のワクチン製造株 の選 定、SRD試 験等 の国家
検定整備
MRを 含 む混 合 ワクチンの開発
●11■
M―M―RO II(メ ル ク利D
Meisles.Mumps.and Rubella Virus Vaccine L市
e
●ワクチシ株
>弱 毒 生 麻しんウイルス (Edmonston B株)
>弱 毒 生ムンプスウイルス (Jさ
ryl LynnTM株
)
>弱 毒生風 しんウイルス (Wistar RA 27/3株
)
●
オリジナル 開発国 :米国 1978年
市販国 :67か国
化 血 研開発
名称 :乾燥弱毒麻しん おたふくかぜ 風 しん 混合 ワクチン
状況 :医薬品 申請を行 いt現在審査 中
瀞 聴ありがとうございました。
資料3
ロ
インフルエンザウイルス感染後の発症、重症化を
予防できるが感染防御するものではない。
・
ワクチン株 と流行株が一致したときには有効であるが、
株が一致しない場合 には効果が低い。
・
ワクチン株 と流行株の抗原性がかい離しており(特にH3)
流行株 に対するHI抗体価が上が りにくい。
・
新型インフルエンザウイルスのパンデミックにおいては
流行株を予測することは不可能である。
・
H5Nl沈 降全粒子不活化ワクチン(アメ
レミニウムアジュバント)は
発熱問題で小児 に対し使用できない。
汗訂υノIド ↑‖rJL7ド
Ъ反
鰤 細鰤 鰤 仙
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一
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200
Pan et.al.Nature communicationsllSep20l3
感染阻 止 !!
流行株 がワクチン株 一致しない変異株場合 にも
) がある。
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交又防御能 { c r O sρ
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予測不能な新型インフルエンザに対応できる !
局所及 び全身の副反応の少ないワクチン !
2
自然感染によって誘導 され る免疫 は、不活化 ワクチンの注射 によるもの
よりも、変異 ウイル ス感染 に対する交叉 防御能 が 高 い 。
( 1 9 6 0 年代から知られていた事実)
自然感染によつて誘導されるlgA抗 体 が交 叉防御 の原因
LA抗 体を誘導する経鼻ワクチンの開発研究
1)弱毒生ウイルスワクチン
2003年 、米国使用認可 (*2∼ 49歳 の世代に限定して使用)。
2)経 鼻不活化 ワクチン
経鼻不活化ワクチンの試み開始
●不活化ワクチンのみの経鼻投与ではlgA抗
体の誘導効率が低い。
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アジュバント併用経鼻不活化ワクチンの研究開始
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染ぞめぜあ
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ワクチン株と相 同 H5Nlウ イルスによる攻撃感染
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感染後 の生存率
鼻粘膜におけるウイルス量
0
2
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6
8
10
12
14
感染後 の 日数
鼻からウイルスが見つからない → 感染していない
4
感染後の生存率
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皮下
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０
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０
２
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異なるウイルス株 に対 しても効果あり !
マウス、サルを用いた実験 において
経鼻インフルエンザワクチンにより、
1.上気道にてウイルスの感染を阻止 する。→ 分泌型IgA
2.肺にウイルスが侵入してもウイルス性肺炎にならない。→IgG
3.流行株 と異なる変異ウイル スに対する交叉防御 。→ 分泌型 :gA
Ⅲ
l朧
では、ヒトではどうなのか ?
鼻腔の粘液中の抗体はインフルエンザウイルスを中和できるのか?
ヒトの鼻腔洗浄液中の機能的な抗体を測定することで、
経鼻インフルエンザワクチンの有効性を評価する。
5
■ In北
Ⅲ椰饂
0.24±0.11[monざmenc]
1.97±149[po!ymencl
(TotaL 2.211
o.79±
0.84
n mg/m1 lmg/酬O21.7m9/ml
andaFttil:3tmu°
針
中KurOno L and MOgi 6.Ann Oto:Rhino!Laryngo1 1987,96:419‐
Vaccine;
24
Inactivatedwhole virion vaccine
' ANictoilal210/2009( H3N2)[2010/llseasonl
X-187(4sw HA/dose)
250Fl /nostil
Subiects;50 healthy adults
SChedule;
admlnistration
Intranasal
l25oFl in eachnostril,45Fg HV500 Fll
Serum,Nasalwash
Neutra:セ
a ■o n ( N T ) t t t e r
Hemagg:utination inhibition(H:)titer
HA‐specific lgG and lgA ELiSA antibody titer
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Serum
Nasalwash
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“in17｀
6f蘭ゴ1麟 ζ
Criteria for serum
H!antibody
in EMA
GeometHc mean tner(GMT)
No std
M融
Se
珊 L躍
需
Conversionrate or
Significantincrease
(> 4-fold increase)
Protection rate
(titer;≧1:40)
16.2
68.8
12.4
38.8
>25
20146
4t.5%
(28.s-s8.4)
> 40%
13/46
28.3%
{147-418}
35/46
76.1%
1632-889,
7
- - - o - . - - - - @ - - - - ,1 9 . - - - ( o - - - -- € . - - . . - - o - -
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48.7
on vacdne
Vaccine: inact市ated whole u‖
05(H5Nl)
indonesiaノ
Highiv Pathogenic Avian influenza
A′5ノ
'
iBCDC‐
RG2〔 45 11g HA/dose)With Or without CVP
nOstril
2 5 0 μ: ノ
Subiects3 63 hea:thv adu:ts
ScheduieF
tion
intranasal administ口
n each nostdl,45 Hg HAr500 1J〕
( 2 5 0 1i」
十
十
Neutralization(NT)titer
Hemagglutination
Inhibition(Hl)titer
HA-specificlgGand lgA ELISAantibodytiter
8
免疫学 的にndⅣ eな 状態での全粒子不活化 ワクチ ン経鼻接種 による
抗体応答 の評価、CVP添 加の有無 による比較
A(H5N■ )単 身全粒子不活化 ワクチ ン (45‖g HAノdOSe)
=BCDC‐ RG2(Aノ IndOnesiaノ 5ノ05)
3週 間隔2回 の経鼻接種
﹄。中∞”
士
Ψ∞¨
63名
1 42 ネ(仏
的 8ク 月
鵬H田 (davD
血清 中和抗体価のまとめ
5.0
(く10)
Mean geometricincrease
(post-GMT/pre-GMT)
Conversionrate or
Significantincrease
(> 4-foldincrease)
164.5
32.9
22ノ25
88.0%
174.3-■ 01.7)
22ノ25
88.0%
01.7)
{74.3-■
5.0
(く 10}
84.8
1710
20/24
83.3%
(67.3-99.4,
20ノ24
83.3%
(67.3-99.4)
同ワクチンのアラム併用皮下接種、第 =/1相 試験での
抗体陽転率 (40倍以上かつ前比4倍以上):70.9%
9
ヒト生体内に存在する多量体 贈Aの 高次構造 と
ウイルス感染防御 における意義 は:
鼻腔洗浄液 に含まれる抗体
ゲル濾過クロマトグラフィー
10
s―
dlgA:分泌型二量体IgA
s―
plgA:分泌型多量体lgA
■８ 卜 ざ
﹁０トボ
︵
ＥＥ
17 nm甲
13 nm
s・
plgA1 9 d19A mlgA
SI“〈
nm)
lgG
(17′ 13)3=2.20
イー
４︰
ワクチン :全粒子不活化 ワクチン
RG2(H5Nl)
A/1ndonesia/05/2005 PR8-lBCDC―
5回
45μ
、
噴霧投与
g HA,CVP含 有 .3週 間隔
被験者 :健康成人男性 6名
採取 サンプル :鼻腔洗浄液 lL
ArLa● 5′」P035′ 2007(H5Nl)Ciad●
2.3.4
AMet Namrl■
+lgM tigA
Arindonesiar5/2005{H5Nl)Clad●
94曖 004(H5Nl)Clade l
digA
lgG+igA‐
・
21
，
ＥＥ
卜こ ，３３ＥＥニゴ﹂
，一
撻翼 黒 〓為 択二゛０ ︶
出襲量Ｓ ‘喘姜陣 盪ユ轟 書
12
13
・
￨・
経鼻インフルエンザワクチンは粘膜上 に分泌型 壇A抗 体を誘導し感染 を
阻止する。
・
￨・
鼻腱粘瞑上に誘導される分泌型LA抗 体は棄叉防御効果があり血中の
ヒG抗 体と比較し変異ウイルスに対しても有効である。
・
●・
全粒子ワクチンの経鼻接種によリヒトにおいて血中に加え鼻腔粘
不活1ヒ
膜上にインフルエンザウイルスを中和する抗体が誘導される。
・
●・
経鼻ワクチンにより誘導される分泌型LA抗 体は二量体、四量体、更に
しインフルエンザウイルスの中和に寄与している。
多量体1ヒ
経鼻インフルエンザワクチンは鼻粘瞑 上に分泌型多量体 壇A抗 体 を誘導する ,
事 によリインフルエンザウイルスに対する感染防御、交又防御 に寄与する。￨
日立 感 染症 研 究 所
(感染病理部、インフルエンザウイルス研究センター)
相内 章
鈴木 忠樹
E‖
y van Riet
伊藤 良
泉地 恭輔
池田 千将
中島典子
田村 慎―
佐 多徹太郎
倉田 毅
浅沼 秀樹
小田切 孝人
田代 員人
東 興 薬 品 工 業株 式会 社
上下 泰造
宮崎 隆
東 京 大 学 医科 学 研 究 所
― 戸 猛志
被験者 のポランティアとして参加
していただいた皆さん。
一 般 財 団法 人 阪 大 微 生 物 病 研 究 会
奥野 良信
石川 豊数
真鍋 貞夫
五味 康行
14
資料 4-1
流通部会
厚 生 科学審議会予防接種 ・
ワクチン分科会研究開発 及び生産 ・
平成 2 6 年 5 月 2 3 日
新規結核 ワクチンの研究開発
保富 康宏
独立行政法人医療基盤研究所=長 類医科学研究センター
三二大学大学院医学系研究科綱麟解明医学‖塵免覆JJ御
結核 は世 界中で発生している感染症であり、その被害 は甚大である。我 が 国で
も毎年、多くの発症者 が確認されており、先進国中では 中等度発症国である:結
核病変 で重要 であるのは肺を中心 とした呼吸器における病態である。そのために
結核予防 には全 身 の免 疫反応と同時 に、呼吸器粘膜 における結核菌特異的免
疫反応 の誘導 が重 要 である。
´ ｀
`矛 ヽ 、
望 ｏＯＥ ョｚ
効果なし!!
22 2324 2526
レス(HPIV2)
ヒトパラインフルエンザ2型ウイメ
―ヒト呼吸器 感染ウイルス
4′
ーパラミクソウイルスのRι
′
′
′
s
′
JrJソ
ι
b′
―negat市e stloand RNAウイル ス ∼15。
6 kb
―病原性 は殆 ど認 められない
‥感受性 はヒト、マカク属 のサル 、乳 のみ ハ ムスター
鵬原性(―)
分節型 (―)鎖RNA]
PⅣ2 genome[♯
HPIV2ベ クター
ーリバ ー スジエネティックス法 にて作製
―挿 入遺伝 子産物を非 常 に効率 よく発現
―M、 For HN遺 伝子欠損 で非増殖性
VeroT7/5 cell
5' - Not I - ggtcgccaccATG
-ATT-PM
Or
一
Tlansfection
Genome RNP
\
Virus protein
|
NP(R2)-IG-PM
P ( R 1 )- N o t I - 3 '
本g85Bの発現時間と発現量
‐ATT‐ PⅣ 2 NP cR2)‐
3'
lG‐PIV2 P(Rl)‐Not I‐
∞
０
５
∞
０
５
NDl層 ■I ND
０
rHPIV2-A』 5B HPIV2 Nttve:0
くＺ“〓 ユＺ ■２ ３，一■ 一τ ﹄
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B… 驚 ￨ ￨□
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飾iNP ttE∃
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５
Ｂ く
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Hours after infection
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Hows
24
48
m e r l a F●
e●
c●
rHPⅣ2-Ag85Bの 抗結核 ワクチン効果
5.50
5.00
4.50
︵
〇▼００コ︶⊃﹂０
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
E]t control ltags5B
DNA(x
2l+rHptv2-Ag8sB(x2l
rHptV2-As8sB(xa)l:Bcc
Ir
Induction of effectorcells in pulmonaryly-ph nodeand lung.
―
o
hP:V2
『
-rhPiV2■
985B
BGG
f : immunization
l: Mtb challenge
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Nalve
―
rhP陀
一
rhP!V2‐Ag85B
‐ o―
BCG
２
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↑:immuniaton
t:Mtb ChJbnge
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一
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BAL
LN
↑
↑
↑
↑
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02468
Weeks after lStimmunization
↑
↑
T
02468
on
weeks after lStimmuniza■
AttRA導
ヽ
…2003年 に設 立 (MD″ USA Cape Town′ 5outh Africa)
￨
´ Missioh:全 ての 年 齢 に対 し効 果 の ある結 核 ワクチンの 開 発 および これ ら知 識 か ら広 く ￨
公 衆 衛 生 上 の 問 題 の 解 決 に寄 与 す る9
ー
-Bill Gates財
団 、各 国 政 府 (米国 、英 国 、EU、 中 国 、オ ストラリア等 )の 支 援 により運 営 ￨
立 、運 営 してお ￨
-5outh Africa ttB ttccine initiative{SATBV::University of Cape設Town)を
り、世 界 中 の 結 核 ワクチンの 治 験 の 全 てに 関 与 して い る。
AERAS Portfolio
匝 ∃
Keepthe PipelineFilled
AIso, ExtendedPortfolio w
TuBerculosis VaccineI nitiative
[rBVU
4
Conso戯 血 ●五New l鵬 Vacc“ CDevoll,血 lnt
AEFぃ S
10
CLOBAL TB VACCINE FOUNDAnON
reateVaccineCo.Ltd
鶴
t 呵 s o w H 芹 Ⅲc A t t B L L 響
TUBRCULOSiS VACCINEINIT:AT:ヽ
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翔競
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新規結核ワクチン
新規結 核抗原
既知 のワクチン効果がある抗原 非発症者が認識している抗原 強毒化で発現する抗原
Providedfor non-commercial
researchand educationuse.
Not for reproduction,distributionor commercialuse.
鏃¨
Ⅷoい 321-15,お
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M田力2014 S洲 0204・
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This articleappearedin a journal publishedby Elseviei.The attached
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' r l'i "'-i i'I1,1'
,1,I i i l-r,: r'",:. il r:-i-l_r
) 727-1735
V a c c i n3e2 ( 2 0 1 4 1
Contentslistsavailableat ScierrceDirect
Vaccine
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SEVIIEIt
journal homepage: www.elsevier.com/locate/vaccine
of
of characteristics
Ag85Bvaccineby takingadvantage
Recombinant
O*,"*
humanparainfluenzatype 2 virus vectorshowed
by intranasalimmunization
immuneresponses
Mycobatteria-specific
Mitsuo l(awano',SatoruMizunod'",
KentaWatanabeo'i,Akihiro Matsgbara''b'1,
Inadat,TetsuyaNosaka',
Hiroyasu
Tsujimura',
Yusuke
TomotakaOkamura",
d,
Yasutomi"'l''I(azuhiroMatsuo Yasuhiro
. Loboratoryo! ImmunoregulationandvaccineResearch,
TsukubaPrimateResearchCenter,NationolInstituteof Biomedicallnnovation,Tsukuba,lbaraki
305-O843,lapan
b DivisionofTmmunoregulation,DepartmentofMolecular andF)eerimental Medicine,Mie lJniverity GraduateSchoolof Medicine,Tstt'Mie 514-8507'
-,
Japon
bepartmentofMioobiologr and MoleculorGenetics,Mie llniversity GraduateSchoolof Medicine,Tsr\Mle 514-8507,ldpon
d Risearchand DevelopmentDepartmen\JapsnBCGlrboratory, Kiyose,Tokyo2U-0022' Japon
' TheResearchInstituteof Tuberculosis,Kiyose,Tokyo204-8533'Jopan
*zuka, Mie 513-8670'Iapan
t Departmento1 pathologt, FocultyoJ Pharmaceuticalkience; furalka university of Medical Science,
ARTICLE INF0
ABSTRACT
Article history:
Received 24 May 2013
Received in revised fom
25 November 2013
Accepted 29 November 2013
Available online 29January 2014
KeWords:
Humanparainfluenz: virus
AgssB
Tuberculosis
Mucosalimmunity
as a vaccine vector in BALB/c mice. Replication-incompetent rhPIVz (M gene-eliminated) expressing
Ag85B (rhpIV2-Ag85B) was constructed by'reverse genetics technolory. lntranasal administration of
rtlplv2-Ag85B induced Mtb-specific immune responses,and the vaccinated mice showed a substantial
reduction in the number of CFU of Mtb in lungs and spleens. Unlike other viral vaccine Vectors, the
immune responses against Ag85B induced by rhPIV2-Ag85B immunization had an advantage over that
against the viral vgcror. In addition, it was revealed that rhPIV2-Ag85B in itselfhas an adjuvant activit1, through the retinoic acid-inducible gene I receptor. These findings provide further evidence for the
possibility ofrhPIV2-Ag'5B as a novel rB vaccine'
@ 2014 Elsevier Ltd. Art rights reserved.
l. Introduction
Abbreiatiora: BAI- bronchoalveolar lavage; BCG,Mycobacteriumbovis bacille
Calmettetu6rin: BEAScells,bronchialePithelialcells;hPIV2,humanparainfluqnza
NHBE
B|pe2 virus; pLN,pulmonary lymph node; Mtb, Mycobacftriumtuberculosis:
normal humanbronchialepithelial;rhPIVz-Ag85B,recombinanthPIv2expressing
Ag85B; TB,tuberculosis.
* Correspondingauthor at: laboratory of Immunoregulationand vaccine
center,NationalInstituteof BiomedicalInnoTsukubaPrimateResearch
Research.
vation, l-l Hachimandai,Tsukuba,Ibaraki305-0843,JaparlTel': +a1 29 837 2O53i
fax:+8129 8372053.
yasutolni@nibio
E-moilaildresses:
SoiP'
mie-uac.jp (Y.Yasutomi).
lrasutomiCDdoc.medic
1 Theseauthors contributed equally to this work
0254410X/$- seefront matter @2014ElsevierLtd.All rightsreserved'
h t t p : l / d xd o i o r g / 1 0l 0 l 6 / tv a c c i n 2e 0 1 31 1 1 0 8
Recombinant viral vector vaccines have several advantages for
preventing infection with pathogens [1]. The vaccines induce a
full spectrum of immune resPonsesincluding humoral and cellular immune responses.These immune resPonsescan be initiaUy
induced at the viral vector infection site such as mucosal immune
responses [2]. Moreover, the viral vector itself has adjuvant activities through the innate immune systems [3]. Pre-existing or
post-priming immune responsesagainst the vaccine vector itsell
however, could be an obstacle to effective immune responses
to recombinant Ag [41. Negligible immune resPonsesagainst
vector viruses compared with recombinant vaccine Ags after
immunization is consideredmost desirablefor recombinant viral
vaccines.
i
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1 727-1735
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予
Flg.l. ExprcssionofAg85BandadvantageouseffectsincellularimmuneresponseagainstAgSsBversusvirusvectorinimmunizedmice,(A)ConstructionofrhPnl2-Ag8sB,
(B) EQr€ss.ionof Ag85B(left panel) and NP (right panel) gene in BEAScells infected with rhPM2 or rhPfv2-Ag85B at eachtime point wiui deErmined by real-time PrCR
Total RNA was erdractedat 6, 24 and,lSh after infectiorl Fold increaseofeach arget gene was normalized to P-actin, and the expression levels are rcprerented :xs
relative values to nalve cells. Error bars representstandarddeviation ND indicates nondetected. (C) Epression ofAgEsB and NPproteins w:rs detectedby anti-Ag85Band
anti-NPantibodiesatOand
24hafterinfection,respectively.(Dand
E)Micewereimmuniz€dI (D)or2 (E)timeswitbrhPM orrhPM-&EsBata2-we€kinterualbyiritranesal
IIヽi`ヽ
F
Iヽlitil,1 ,I :1(lr二 i｀ I FD l「
κ waranabe era1/Vaadne 3201つ'727-1735
ρ
1729
2.3. Cellanlare
pulmonary TB in adults is variable and partial [5,6]. Therefore'
development of new vaccines is urgently needed for the elimina6on ofTB as a public health threat and should be a major global
public health prioritY.
Many infectious diseases,including TB, initially establish infection on mucosal surfaces.Therefore, the best defense against these
predominantly mucosal pathogens is mucosal vaccines that are
capable of inducing both systemic and mucosal immunity. However, the mucosal immune system is quite unique and is different
unlike other viral vaccine vectors using inserted antigen expression mechanisms of hPIV2. In the present study, we evaluated
the effectivenessof intranasal administration of Ag85B-expressednon-replicating human parainfluenza type2 virus (rhPIV2-fu858)'
which induces weak immune responsesagainst a viral vector' as a
novel mucosal TB vaccine.
2- Materials and methods
2.1. lmmunEation
Six-week-old BALB/c female mice were immunized with
Human bronchial epithelial cells (BEA$ cells) and primary
cultured normal human bronchial epithelial (NHBE) cells were
obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA) and Lonza (Walkersville, MD). These cellS were grown
in bronchial epithelial growth medium containing supplements
(Lonza). These cells were infected with rhPIV2 or rhPIV2-Ag85B
(MOI of 10) or treated with recombinant Ag85B (10U,g/ml) for
6-48 h in a 37 "C incubator with a 5%COzatmosphere.
2.4. FACSanolysb
Spleen, pulmonary lymph node (ptN), and bronchoalveolar
lavage(BAL)cells were obtained from immunized mice; and singlecell suspensions were prepared. The cells were incubated with
recombinant Ag85B protein (10 pg/ml final concentration) for 4h
in the presenceof BrefeldinA at 37'C with 5%CO2.The cells were
stained for surface markers with anti-CD3 and anti-CD4 (BD Biosciences,SanJoes,C.{) for 30min at 4"C, followed by fixation for
30min at 4"C in 2% paraformaldehyde.IFN-1 was detected by
staining with anti-lFN-1 (BD Biosciencbs)for 30min at 4'C Flow
cytometry data collection was performed on a FACSCanto II (BD
Biosciences).Fileswere analyzed using FACSDivaSoftware (BD Biosciences).BEAScells infected with rhPIV2-Ag85Bwere stained with
anti-ICAM-l (Biolegend, San Diego, CA) and analyzed as described
above.
2.5. Evaluation of Ag8iB-specific immune responsesby EUSfuT
assay
The number of Ag85B-specifiq lFN-T-secreting cells was determined by the EUSPOTassay according to the method reported
previously [11]. Triplicate samples of whole, CDz[*,and CD8* T
cells (separatedby a MACSsystem) (Miltenyi Biotec, BergischGladbach, Germany) collected from the spleen, pLN, and BAL were
plated at 1 x 106 cells/well. Thesecells were stimulated by addition
of 2 x 10s mitomycin C (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOftreated
syngeneic spleen cells infected with recombinant vaccinia virus
expressing Ag85B or rhPIV2-Ag85B.
2.6. Statbtical analysis
using 1 x 107 cFU of BCGTokyo by subcutaneousinjection.
22. lnfection assaY
Two weeks (rhP[V2-Ag85B-immunized mice) or 6 weeks
(BCG-immunized mice) after the final immunization, mice were
thaUenged with M. tubercttlosis(Mtb) Kurono strain by inhalation. This bacterial preparation and infection assaywere performed
as previously described ['l 2]. In brief, the mice were infected via
the airborne route by placing them into the exPosure chamber
of a Glas-Col aerosol generator- The nebulizer compartment was
filled with 5ml of a suspensioncontaining 106CFU of Kurono
strain so that approximately 50 bacteria would be deposited in
the lungs of each animal. Eight weeks after Mtb infection, mice
weri sacrificed and the preventive effects of the vatcine were
assessed.
Data are presented as means * SD.Statistical analyseswere performed using the Mann-Whitney U test. Statistically significant
differences compared with the control are indicated by asterisks.
3. Results
3.1. Characteristicsof rhPN2-Ag85B
A construction of rhPM2-Ag85B is shown in Fig. 1A To examine gene expression tevels of the inserted Ag85B' BEAS cells
were infected with rhPM2-Ag85B. Abundant and rapid exPression of mRM of Ag85B was observed in BEAScells infected with
rhPIV2-Ag85B compared with the exPressionof NP mRNA ( Fig.1B).
Theseresults were also confirmed byanalysis of protein expression'
(Fig.1C).Theproduction ofAg85Bwas earlierthan that of NP,which
is usually the earliest synthesized protein in hPIV2 infection.
‐5 per group)2 weeks after the nnalimmunization for examination by a
re collected
frOm immunized mice(■
‐5 per group).Spleen,PLN,and BAL cells
wё
inoculadon(■
tein(rAg853)
itro
lated cens were stlrnulated
ill with
ν syngeneic spleen celis infected with controi rhPIV2,rhPIV2-Ag85B,orrecombinantAg85B pЮ
ELISPOT assay.These is●
0n.d0i5c actoemdp abrye da sttoe ●t h e
P iく
d do an rs d. S dt ea 宙
t i s t i c a l l y J g n i n c a n t d i f F e r e n c e ss kasr(e,°
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t
s
t
a
n
(10 1Lglmi nnal conCentraJoh)for 24 h Erお
mulated with rhPIV2)
group s●
Kwatanobe et dL/ Vaccine
i2 (2014)1727-1735
rhPlV2-Ag8SB
or
Theseresponseswere consideredto be advantageous
effects
A
in cellular immune responseto insertedfu85B versusrhPIV2
vector.To confirmthis advantageous
response,cellsfrom immunized mice were re-stimulated in vifro with syngeneicspleen
cellsinfectedwith rhPIV2or rhPIV2-Ag85B.
Althoughresponses
to both Ag85Band rhPlv2 vectorwere observed,Ag85B-specific
responses
were clearlyseen,especiallyin pLNand BALcellsafter
single immunization (Fig. 1D).After performing immunization
twice,Ag8sB-specific
responseswere alsoseenin spleencellsas
boostereffectsmore than responsesto the vectorvirus (Fig.lE).
Theseresultsindicatedthat rhPIV2-Ag85B
immunizationelicited
insertedfu85B-specificimmune responses
without beinghidden
by v6ctorresponses.
Mtbkurono
sacrifice
2w
Ao85BDNA
I
hPlV2-Ao8sB
+ r 1++.4
BCG
q+
32. Intranasslsdministrationof rhPM2-Ag85BprevenB
infectionwith Mtbin inice
To investigatethe ability of intranasal administration of
rhPIV2-Ag85B
to elicit a protectiveeffectagainstpulmonaryTB,
rhPM2-Ag85B-immunized
micewereaerosol-infected
with highly
pathogenicMtb kurono strain [131.One group of mice were
intranasallyimmunized with rhPM2-Ag85B4 times at 2-week
intewals,andanothergroupof micewereintranasallyimmunized
with rhPM2-Ag85Btwice following intramuscularimmunization
with Ag85B Dl,lA twice (Fig. 2A). Intranasaladministrationof
rhPIr@,-Ag85B
resultedin a decrease3
in granulomatous
lesionsand
inflammatoryarea However,therewere no apparenthistopathologicaldifferences,
suchasinfiltratingcelltypes,betweenthe each
groupofmice,andtheseresultsaresimilarto the resultsofanother
studyfocusingonTBvaccine[ 14].Onthe otherhand,thesevaccine
effectswere clearlyseen by stainingfor acid-fastbacillus.Mice
immunizedwith rhPIV2-Ag85Bshoweda substantialreduction
in the infiltration 6f bacteria,and this inhibitory effecton bacterial expansionwas correlatedwith the numberof rhPIV2-Ag85B
intranasaladministrations(Fig.2B).CRJof Mtb in spleensfrom
both groupsof immunizedmicewas alsosignificantlylower than
thosein miceimmunizedwith the controlvector(Fig.2C).fu for a
preventiveeffecton Mtb infectioirin the lung,the miceimmunized
with rhPM2-Ag85B
clearlyshoweda substantialreductionin CFU.
∞
∞
Delayedinitial activation of effectorcells in lungs has been
reportedin the caseof Mtb infection [151.To control bacterial
expansionin the early phaseof infection,rapid Mtb Ag-specific
CD4*T cellresponses
arerequired.Thus,we next analyzedrecruitment of Ag85B-specific
IFN-1+CD4+T cellsin pLN and BALcells
in mice immunizedwith rhPIV2-Ag85B.
Mice were inffanasally
immunizedwith rhPIV2-Ag85Bor the controlvectorvirus3 times
∞
3.4. Analysisof Ag-specificeffectorcelk anil immuneresponses
in
pf,Ncellsand thelung
C
∞
Thecapacityotrnttr-ReA5B intranasalimmunizationto elicit
effectorcellsthat recognizeendogenously
expressedAg85Bwas
assessed.
Spleen,pLN, and BALcells obtainedfrom immunized
mice were re-stimulated in itro with syngeneicspleen cells
infectedwith therecombinantvaccinia
virusexpressingAg85B,
and
endogenously
expressed
Ag85B-specific
cellularimmuneresponse
was examinedby EUSPOTassays.Both CDzI*and CD8+splenocytesexhibitedAg85B-specific
responses,
andCD8*T cellsshowed
muchstrongerresponses
than thoseof CD4'T cellsin splenoqrtes
from miceimmunizedwith rhPM2-Ag85B
(Fig.3A).Ag85B-specific
responses
Werealsoseenin both CDzl*and CD8+T cellsat almost
the samelevelsin pLNand BALcells(Fig.3B and C).
Saci'iGe
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3.3. fg&SB-specific
immuneresponse
is elicitedby rhPN2-Ag4sB
administration
sacrifice
2.OO
1.50
1.00
Lung
Itcor,.ot
Spleen
oxale)+rlrPN2-Ag85B(re)
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l-[drervz-as85e(x4]
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:Bcc
Fl& 2. Repeatedimmunization with rhPlV2-Ag85Bresults in protection from TB.
(A) Groupsof mice were vaccinatedin this schedule.(B) Histological imagesofthe
lungsof MtFinfected mice.Groupsof mice(n - 10)immunized4 timeswith rhPl\r2
(leftpanel),2 timeswith Ag85BDNAvaccineand2 timeswith rhPM-Ag85B (middle panel) or 4 times with rhPIV2-Ag85B(right panel)were challengedby Mtb
infection,,{rrows point to tubercles.Lower panelsin (B) show magnifiedimages
of imagesin t}le middle panels.(C)lnhibition of bacterialgrowth by immunization
with rhPMl-Ag8sBin the lung andspleen.Groupsof miceimmunized2 timeswith
Ag85BDNAvaccineand 2 times with rhPM fg85B or immunized4 times with
rhPIv2-Ag85B or BCGwere challengedby Mtb infection.The numbersof Mtb CR,
in the lung and spleenwere determined by a colony enumerationassay.The bacterial load is representedas mean loglo CFUper organ.Eror bafs representstandard
deviations.Statisticallysignificantdifferencesareindicetedby asterisk (', P<0.05,
", P< 0.005).
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or BCG(n - 5 per
rhPIVZ-Ag8SB,
Frg:3. lnducrionof Ag8sB-specificcellular immune responsesin rhPtv2-Ag85B-immunizedmice. Mice were immunizedwith rhPIV2'
colltrtedgriup) accordingto rhi schiule shown in Fig.zA.Two irhptVj or rhprv2-Ag8sB)or 4 weeiks(Bcc1afterthe final immunization,the spteen'pLN.and BALwere
(right panels)T cellsand examinedfor IFN-t
isotaieacettsfrom the spleen(A), pLN(s), or BRt(c) were separatedinto whole (left panels),cD4* (middlepanels),and cD8'
(vac) or recombinantvacciniavirus
productionin an ELtspor assay.Thesecellswere stimulatedin vitro with syngeneicspleencells infectedwith conrol vacciniavirus
asterisks('' P<0-o1comParedto
carring the Ag85Bgene(vac-Agg5B)for 24 h. Errorbarsrepresentstandarddeviations.statisticallysignifcantdiferencesareindicatedby
the group stimulated with vac).
at 2-week intervals. Another group of mice were iminunized
with BCGby subcutaneous injection: Two weeks (rhPIV2-Ag85Bimmunized mice) or 6 weeks (BCG-immunized mice) after the final
immunization, all mice were challengedwith Mtb Kurono strain by
inhalation (F g. aA). At each time point after immunization or Mtb
challenge, the percentage and absolute number of fu85B-specific
IFN-1* CD4* cells were determined by flow grtometry. Before Mtb
challenge, the percentage of IFN-1' CD4* cells in pLN cells was
increased by immunization with rhPM2-Ag85B but not by BCG
immunization (Fig.48 and C, top). However,a significantincrease
in IFN-1* CD4*cellswas not detectedin BALcells(Fig.48and C' bottom). Interestingly, expansion of IFN-"y+CD4* cells occurred after
Mtb challenge in BAL cells more dramatically than that in pLN cells
in terms of absolute number (Fig. aC). These responsesinduced
by rhPlV2-Ag85B immunization were much stronger than those
induced by BCCimmunization.
Similariy, an increasein Ag85B-specificresponseswas obseryed
by the EilSPoT assay(Fig.4D). The number ofAg85B-specific IFN-1
secreting cells increased in pLN cells from mice immunized with
rhPIV2-Ag85B in a number of immunizations-dependent manner.
Furthermore, strong Ag8sB-specific responseswere detected after
Mtb challenge in pLN and BAL cells, and the responseswere much
stronger than those in BCGimmunized mice.
(Fig. 5B). The mRNA expression of intracellular recePtors, RIC-|,
MDA5, and TLF3, and the induction of qrtokines, IL-6 and IL-l5
were also enhanced by infection with rhPM2-Ag85B, whereas
these effects were not observed with the addition of recombinant
Ag85B protein (Fig. 5C and D). Furthermore, the expression of
ICAM-I was induced by infection with rhPM2-Ag85B (Fig' 5E).
Similar results were obtained after infection with rhPIV2 vector
alone or rhPIV2-GFP(Supplemental Fig. 2). Other co-stimulation
molecules, CD8O,CD86, ICAM-2 and selectin, were not detected
(data not shown).
To further investigate the participation of these receptors in
innate immune activation induced by rhPlV2-Ag85B infection'
expression of these receptors was knocked down by transfecting
siRN/r At 48 h after transfection with siRNA, expression levels of
these recejrtors were reduced by approximately 90%or expression
was no longer detectable (Fig. 5F). IFN-p production induced by
rhPIV2-Ag85B infection was inhibited when the cells were treated
with RIG{ siRNA For other receptors,MDA5 and TLR3'siRNAtreatment did not result in inhibition of IFN-p production induced
by rhPIV2-Ag85B infection (Fig. 5G). This result was confirmed
by phosphorylation of IRF3, which is a downstream molecule of
RIC-I in epithelial cells. The phosphorylation of IRF3 induced by
rhPlv2-Ag85B infection was inhibited when epithelial cells were
treated with siRNAof RlGl (Fig. 5H).
3.5. rhPM2-Ag85B induces innate immune responses
4. Discussion
We explored innate immune responses induced by
rhPIV2-Ag85B infection. We confirmed that Ag85B did not
affect the viability of rhPlV2-Ag85B infected cells (Supplemental
Fig. 7) 144-461.Type I IFNs were assessedafter infection with
rhPIV2-Ag85B in NHBE and BEAScells as an indication of innate
immune responses.Both types of cells showed mRNA expression
of type I IFNs after infection with rhPlV2-Ag85B but not after
addition of recombinant Ag85B Protein (Fig' 5A). Production of
IFN-p was also detected in the culture supernatant by ELJSA
In the present study, we demonstrated the effectiveness of
hPIV2 vectors for TB vaccines to induce systemic and mucosal
immune responses.The rhPlV2 vector is a weak immunogenic;
however, intranasal immunization with rhPIV2-Ag85B showed
more potent protection against pulmonary TB in BALB/cmice than
did conventional BCGvaccination. The rhPIV2-Ag85B shows a vaccine effect by itself alone, and this effect is more useful than the
effects of other vectors for TB vaccines.
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Fig4. AnalysisofAg-specificeffectorcellsandtheseimmuneresponsesinpLNandBAL(A)Groupsofmicewereimmunizedwithrhplv2,rhplv2-Ag85B,orBCG(n-10per
group)andchallengedby Mtb infectionin this schedule.(B) Representative
flow cytometryplots of IFN:.y+cellson gatedcDzt*cellsfrom pLN(top panels)and BAL(bottom
panels)are shown.Numbersshown besidethe gatesrepresentthe percentageswithin cD4+T cells.(c) Kineticsof recruitmentofAgSsB-specificlFN-1-cells in
lLN (top
panel)andBAL(bottom Panel).AbsolutenumbersoflFN-'y+CD4+cell populationsat eachtime pointsare shown.Errorbarsrepresentstandarddeviaribns.(D) tsolitedcells
from the PLNand BALat eachtime Point were examinedfor tFN-1productionin an ELTSPOT
assay,Thesecellswere stimulatedin vitro with syngeneicspleencetlsinfected
with controlvacciniavirus (Vac)or recombinantvacciniavirus carryingthe Ag858gene(Vac-PglSB)for24tr" Error barsrepresentstaniard devjations.
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NC
RIC‐ :
MDA5
Viral vectors are promising vaccine candidates for eliciting
Ag-specific immune responses [16,17]. Pre-existing anti-vector
antibodies, however, constitute an obstacle,for use in humans
[1 8-20].Although antibodies againsthPlV are known to cross-react
with Sendai virus, Sendai virus vector is considered to be effective for human use by intranasal administration [21 l. Additionally'
Sendaivirus vector is not affected by antibodies againstSendaivirrr!
for induction of T cell responses,especiallywhen it is administered
intranasally [4]. From these findings, inffanasal administration of
the hPIV2 vector is also considered to be effective for human use.
In fact, multiple administrations with rhPIV2-Ag85B also showed
preventive effectsmore clearlythan did immunization2 times with
rhPtV2-Ag85B(Fie.2).
Many viral vectors have been tested as recombinant viral vaccines eliciting suitable recombinantAg-specific immune responses'
and many of these vaccine.vectors are not vactine viruses such
as vaccinia virus Ankara (IVIVA), adenovirus, Sendai virus, and
CMV. These viral vectors have also been used in several vaccine fials in TB or HIV vaccine 122-241. Experience in the HIV
vaccine field has emphasized the importance of avoiding antivector immune responses when developing a vectored vaccine
[25]. lmmune tesponses to vaccine vectors Prevent the induction
of aimed immune responses against recombinant Ag. From these
findings, elimination of the immunogenicity of a vaccine vector is
critical for a recombinant viral vaccine.The immunogenicityof viral
vectors depends on the amount ofvector viral proteins. Approximately 80 poxvirus proteins are encoded by its over 130-300 kbp
and the adenovirus genome sizesare 26-45 kbp. The genome sizes
of these two viral vectors are much larger than that of hPIV2
(15.65kbp), and induction of immune responses to hPIV2 vector
mightbelowerthan otherviral vectors.lnTBvaccines,recombinant
vaccinia virus and adenovirus, which are immunogenic viruses, did
not show clear vaccine effects against TB infection by immunization with themselves alone. These two recombinant TB vaccines,
adenovirus and MVA were utilized as boost immunization after
These heterologous prime-boost strategies
BCG priming 126,27]1.
diminish immune responses to the vector virus and indicate the
possibility ofa practical and efficient strategy for prevention ofTB
[28,291.On the other hand, the most common method for obtaining an attenuated virus is gene elimination of the viral construct
protein to make a replication-deficient virus in vivo. The rhPlV2
vector is a weak immunogenicity by elimination of structural protein (M) gene; however, the rhPIV2-Ag85B shows a vaccine effect
by immunization with itself alone, and this effect is more useful
than the effects of other vectors for a recombinant TB vaccine.
The hPIV2 vector has an additional advantage over other viral
vectors. The inserted Ag85B gene, which is only 978 bp, is a minor
component of rhPlV2-Ag85B. Despite that the cellular immune
response against Ag85B had an advantage over that against the
virus vector in mice. This advantageouseffect is thought to depend
expressionlevelsarc representedas relativevaluesto the control.Culturesupernatants were also colleted, and amounts of secretedIFN-a and IFN-p were
measuredby EIISA(B). Expressionof ICAM-1was alsoconfirmedby FACSanalysis in BEAScells(8, right Panel).Dataareaveragesof$iplicate samPlesfrom three
identical experiments,and error bars representstandarddeviations.Statistically
cells are
significantdifferencesbetweencontrol cells and rhPlv2-A885B-infected
indicatedbyasterisks(', P< 0.01). BEAScellswere treatedwith siRNAtargetingRIG
I, MDAs,TLR3,or the negativecontrol siRNA(NC)for 48 h. DePletionof tJremwas
TLR3
器躍 霊
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譜
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鵬 翻忠IJ躍
馳¥牌I柵
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with NCor siRNAtargetingRIGI (AR) for48 h wereinfectedwith rhPM-Ag85B or
not infected(control).Whole IRF3and phosphorylatedn"F3(plRf3) were detected
by immunoblotting6 h after infection(H).
ヽ:11'
1734
K WatanabeetpL/ Voccine
32 (2014)1727-1735
on Ag85Bexpressionmechanisms.
Thefrequencywith which viral
RNApolymerasereinitiatesthe next mRNAat genejunctions is
imperfect,and this leadsto a gradientof mRNAabundancethat
decreas_es
accordingto distancefromthegenome3' end[301.Insertion of the Ag85Bgeneinto the 3' proximal first locusbetween
the leadersequenceand the NPgeneresultsin the highestlevel
of geneexpression.Ag85Bis transcribedearlierand more abundantly than'other viral products(Fig. iB and c). il;;6.rry
of rhPIV2-Ag85Bleadsto elicit strongerAg85B-specific
immune
Mtb-specific mucosal immunity. lmmunization with
rhPIV2-Ag85Bshowed significantprotection againstTB without any prime vaccineor additionof an adjuvantin mice.Further
studieswill contributeto the ultimategoal of establishinga new
vaccinestrategythat candefinitelypreventMtb infection.
Aclicrowledgements
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Grantsfrom the
work was supportedby HealthScienceResearch
with an insertedgeneproduct[31,321.We
du,no]Ij:^:::.:
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effectsand provided sufficientimmunogenici,v
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vaccineeffect againstMrb in mice. Theser.t"ltr""; ;g;;r;l;;;
intranasaladministration,
of rhplV2-Ag85Bdoes
il;:
"ilfi; J.; ffi;
tronal rallureas a vaccrneby multipte administration;
featuresofthe rhplV2vectoraredefinitely"au.nt"g.r'f*.ff"f*f
use.
Another major feature of rhPIV2-Ag85B is effective prevention
ofTB by intranasal administration. Vaccination in the respiratory
tract may enhance protection against Mtb infection, since Mtb
initially establishes infection on mucosal surfaces of the respiratory tract. Indeed, a number of recombinant TB vaccines have
been developed and evaluated for respiratory mucosal immunization [33-35]. It is important to note that lack of Ag-specific
effector cells persists even up to about 21 days after pulmonary
Mtb infection caused by a bacterial component [15.36]. In the
present study, the arrival of Ag-specific T cells was detected in
lung and pfN by rhPIV2-{g858 immunization, and this arrival of
effector cells was recognized faster than BCGimmunization after
Mtb challenge (Fig. 48 and C). We were able to establish a novel
intanasal vaccine, rhPIV2-Ag85B, against TB by utilizing various
advantages of intranasal administration. Nasal administration of
a vaccine to induce mucosal and systemic immune responseshas
several advantages other than the induction of effective immune
responses. lt is even possible that inffanasal administration of
replication-incompetent rhPIV2-Ag85B limits the areas of infection in respiratory organs and induces a respiratory tract mucosal
immune response in addition to a systemic immune response
against TB. Our study suggested that intranasal administration
of rhPM2-Ag85B, which can induce both mucosal and systemic
immune responsesagainst Mtb, has a great advantage as a TB vaccine.
Attempts have been made to use various types of adjuvants
for enhancing an immune responses to vaccines, including vaccines against TB [37 l. In fact, a protein-based TB vaccine required
the addition of an adjuvant to induce effective immune responses
[38-41 l. For the generation of adaptive immune responses,induction of innate immunity is crucial for vaccines tb elicit potent
Ag-specific immune responses.Pattern recognition receptors have
been studied as potential targets for an adjuvanl dsRNA is a
dominant activator of innate immunity because viral dsRNA is
recognized by TLR3, RIG-I, and MDA5 [42,431.As a result, it was
demonstrated that the rhPIV2 vector had a potent adjuvant activity as dsRNA recognized by the RIG-I receptor and enhanced not
only local innate immunity but also systemic adaptive immunity.
It is possible that no extra addition of an adjuvant is required to
prevent TB by vaccination with rhPIV2-Ag85B. Furthermore, the
inhibitory effects on the growth of rhPIV2-Ag85B in vivo by IFN
through the innate receptor are not required to consider since the
rhPIV2 vector is replication-incompetent dnvivo by elimination of
the M gene(Fig. 1A).
ln summary, our results provide evidence for the possibility of rhPIV2-Ag85B as a novel intranasal vaccine for eliciting
MinistryofH-ealth'laborandwelfareofJapanandtheMinistryof
culture' Sports'scienceand rechnologyof Japan'This
:lT-tI-:" alsosupportedby a gant from the cooperativeLink of
Y,t--Y:t
(CLUSfor EconomyRevitalization
UniquescienceandTechnology
TER)-Promoted
by the Minish-yof Education'culture' sportsand
Technology'Japan'
Appendix A. Supplementary date
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in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.
2 0 1 3 . 11 . 1 0 8 .
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(10)):1251-8.
,
11,1
i-i.:, )':
1735
κ waranabe eta1/Vadne32 r2014,1727-1735
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2002:86oune(1-2)):33-8
l営
(6)):1849-54
ｎｕ
資料 5
ワクチン分科会研究開発及び生産 ・
厚生科学審議会予防接種 ・
流通部会
26年5月23日
(平成
)
多剤耐性結核に対する新規治療用DNAワ クチンの
「
開発 ・
実用化 に関する研究
(及び結 核予防 ワクチン研究)」
独立行政法人国立病院機構
近畿 中央胸部疾患センター ・
臨床研究センター
岡 田全 司
厚生労働科学研究 費補助金 新型インフルエンザ 等新興 口
再興感染症
研究事業 ( 新興 ・
再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事 業) ( 平成2 5 Ⅲ
2 7 年 度)
多剤耐性結核 に対する新規治療用 DNAワ クチンの
開発 口
実用化 に関する研究
研究代表者 (独 )国立病院機構近畿中央胸部疾患センター 研 究 の 統 括
岡田 全 司
臨 床研究センター長
研究分担者 ・
研究項 目
中島俊 洋 (ジェノミディア株式会社)
金 田安史
―
井上義
露 ロー成
( 大阪大学大学院)
.
震蟹:象観鵬銚猥肺 謙“明
HVJロエンベ ロープの新 ワクチンロ
非臨床試験の計画。
全国 B近畿地区多剤耐性結核患者の医師主導治験 統括。
結核ワクチンの薬効解析。
(日立病院機構近畿中央)近 畿中央胸部疾患セの医師主導治験統括。結核治療効果。
( 日立病院機 構近畿 中央)
朝野和典 (大阪大学医学部附属病院)近畿地区多剤耐性結核の医師主導治験統括。細胞性免疫。
庄司俊輔 (国立病院機構東京病院)関 東地区多剤耐性結核患者の医師主導治験統括。
斎藤武文 (日立病院機構茨城東病院)茨城東病院の多剤耐性結核患者の医師主導治験統括.
三上 礼子
(東海大学)
松本智成 ( 結核予防会大阪病院) 大
熊 ノ郷 淳 (大阪大学大学院)
近
PMDAと の交渉 .製 薬会社 との交渉.プ ロトコール修正 。
阪府立病院、結核予防会大阪病院より患者 の 協力。
畿地区の結核診療施設の結核患者の医師主導治験統括ち
WH01暇 告 2013
(TB)Gontrol
GlobalTuberculosis
1. 結核 は世界 の 三 大感染症 の
2.
一つ 。
世界 の20億 人以上 (32%)は 、結核 に感染 している。
3. 860万 人ノ
年 が 新 たに結核発 症 した。(2012)
4.
5.
6.
年 が結核 によつて死 亡 している。
世界 中で約 130万人ノ
(2012)
結核根絶 は 、貧 困、人 口過剰 、ヒト免疫不 全ウイルス
(HiV)感染症合併 などの理 由で、非常 に困難 である。
年 (2012)が
多剤耐性結 核 (MDR‐TB)は 約45万 人ノ
発症 。17万 人 が死亡 。
3
■ F:GURE l.1
E s t i m a t e d n u m b e r o f n e w T B c a s e s i b 2y 0 0c 7o u n t r y ・
4
Numberof multldrug-reslstant
tuberculoslscasesestimatedto occuramongnotifled
● ●
Ｄヽβゞ
。。MDR‐ TB cases
1 10-199
: 2∞-1999
日■1 2 0 0 0 - 1 9 9 9 9 〈
‐
2 0 0 0 い4 9 9 9 9
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≧5 0 0 0 0
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5
多療
1.
htS reserved
o wHo 2013 All¨
剤耐性結核治療 における新 しい化学
法剤 に対 しては 、薬剤耐性結核菌 が
出現 。
2.結 核治療 ワクチンに対する耐性菌 は出
現 しないことが 予想される。
16
BCG Vacclne
(1)BCGワ クチンは 、結核 予防 に対 して乳幼児 に
有効 である。
(2)BCGワ クチンは 、成人結核予防 に対 して有効
ではない。(WHOの 報告)
(3)したがつて、成 人にも有効な新 しい結核 ワクチ
ンの 開発 が必須 である。
(4)BCGワ クチンは 多剤耐性結核 治療 に有効 でな
い
。
.
今 までの結核 ワクチンの研究概要
HVJ―Envelope/
HSP65DNAttIL-12DNAワ
クチン
研究成果
新 しい結核 ワクチンの 開発
HV」エンベロープ/Hsp65
D N A + I L - 1 2 D N A ワ クチ ン
はBCGよ りも1万倍強 力な
結核 予防ワクチン効果。
カニクイザル (ヒト結核感
染に最も近 い)結核予防
効果。CD8キ ラーTが 重要
でこれ を分化誘導。
多剤耐性結核 に対する世
界 で初 めての 治療 ワクチ
ンを発見した。超薬剤耐
個L結核菌 (XDR―TB)に 対
しても治療効 果。
サルで100%生 存率の画
期的な結核予防 ワクチン
効果。(BCG群 は33%)
4.
サルで治療 ワクチン効 果
100%生 存。キラーT分 化
に重 要な:L-2産生 を誘導。
IL…
2 産生 能とワクチン効
果 が 相関。
HSP65+IL-12 DNA
ワクチン
ソ
HVJ…エンベ ロープベクター :
非ウイルスベクター
HVJ:旦emagglutinating yirus apan
of」
臨床応用 のための
DNAワ クチン構築図
Con輌 ●“ 口of HSP65 and L―
12 0NA in one plasmid
研
/N田
出′
pA
pVAX1/Hsp65+[L-12
SO'6
7259 bp
.口6
□
p35
/
/
・｀
BomH 4551/P CMV
10
DNAワ クチン
HVJ‐エンベロープ:デリバリーシステムノ
に対するアジュバント
(flemagglutinating
Virusof lapan)
- Muhiple ftrdriom in one delivert sysEm (delivery + adirnantl
- Adjrram : indrrrion of NX/CTI+ repressionof TregYiathc astiwtion of IIC
- tliiedranisnr: nfrrd immune reactions medi.ted by RIG-I
T h ■c e : b
d tln pthogen
Infrrtlm
specjfic inrnuity
(Cll- kills infectedcells)
嗣 臨 由 mor
qrdbttc
Agprescnt*ion
Deathor
…
dCellS
inttion d腱 面 山 B"m山 "
(NK klL:dectedcells)
Dettccell
thepdn3elr
Maintemm€of
specificitnanmfty
(s!frdnedimrrdty)
〔Method〕
prophylacticvaccine
M.tuberculosis
Vaccine Vaccine Vaccine H37RV
｀ 3w´ ノ ヽ 3wノ
Ce
,aCH籠
ヽ_4wノ
n
v
II
lmmuneresponses
againstM.TB
CytotoxicT cell
Proliferation
Cytokines
etc.
{
GFUof M.tuberculosis
lung
liver
spleen
12
マウスの結核感染モデルを用いた
HVJ―エンベ ロー プ/Hsp65+IL-12 DNAワ クチン
(BCGよ り1万倍 強 力な)
log10
CFりM.TB 結 核感染 5週 間後の結核菌コロ=― 数
□ 10コ ントロール
■ I BCGワ クチン
□IHⅥ
言分
り雰3
踊【
13
lung log
mean*SD,n=5
5W Lung (X5,HE)
HSP65+:L‐ 12E′ HSP65+:L‐ 12E′
HSP65+lL‐ 12E
BCG′ HSP65+:L12E′
HSP65+:L12E
―
―
￨
HVJノHSP65DNA+lL口 12DNAワ クチンを接種 されたマウス
における結核菌 に対するCD8陽 性キラーT細 胞 の誘導
HSP65 DNA+IL-12 DNA vaccine
BCG
二
( ―
)
ｙ
５
︲
ｒ 一 ¨
Ｌ
・ ａ
︲
ｅ
ｏ
↓ab
:L-1,7,12,13,15,18,
:FNくガβ,TNFc
Okada et al
J:mmuno:1979 PNAS
1981
J_Exp.Med 1983 :nnm Rev 1986
Cancer Res 1997
ri+
ApoPtosis
・Destruction oftumor oe‖
・Destruction of virus infected ce‖s
・Destruction of bacteria infated
cens(m9)
12)DNAワ クチンは
(Hsp65.+lL‐
キラー丁細 胞免疫 とヘル バ ーT細 胞免疫を増強 した
Hsp65+lL‐ 12
DNAワ クチン
18 :L‐ 12
:L‐
￨
カニクイザルモデル
【
結核予防ワクチン効果】
■■
カニクイザルは、人間の結核感染モデル
で最高の動物モデルである。
(WalSh,Tan et alo Nature Medicine 1996)
結 核 空 洞 はカニ クイザ ル 結 核 感 染 モデ ル
で示される。
Co―worker
DL Babie Tan,
DL PaulヽSaunderson
Leonard Wood Memorial
カニクイザル を用 いたHVJ/Hsp65 DNA+IL… 12 DNA
vacdneとBCGを 使 つたプライム…ブー スト法
―― Gl:“G Tokyo+HVIliposom/Hsp65 DNA+IL-12 DNA
‐
―‐G2:HVI‖posom/Hsp65 DNA+IL-12 DNA+B“ (TokyOboost
―― G3:HVI!iposo腱川sp65●
lL-12 DNA :
…
…
…G4:BCG Tokyo
…
G5:Saline
BCG→
HVJ′DNA
HVJ′DNA
Sa:ine
HVJ′DNA→
BCG
350(day)
18
BCG
厚 生労働科学研究費補 助金
再興感染症
新 型インフルエンザ 等新興 ・
27年 度)
研究事業(平成25‐
多剤耐性結核 に対する
実用 化
新規 治療用 DNAワ クチンの 開発 ・
に関する研究
19
研究 目的
BGH pA
４１
新 しい結核 ワクチンの効果 と
安 全性の前臨床試験 。
毒性 ・
エンベ ロープノ
HSP65
HV」―
DNA+lL-12 DNAワ クチン
サルですでに結 核
(マウス ・
治療効果)
p35
I
Kanamycin
Hヽ/J:Hemaggluunating Virus of Japan
プラスミドDNAは 外国からの輸入ではなく国内のAMBiS社 で治験薬GMP製 造を計画
2.多剤耐性結核に対する結核治療ワクチンの臨床応用 ・
実用化
①結核は世界の最大感染症の一つ
②多剤耐性結核菌 (莫大な医療費、治療困難)の増加
丁B)の出現
③超薬剤耐性結核(XDR―
3.多斉1耐性結核患者に対する第 1相医師主導治験
4.岡 田は、新規ワクチンの有効性を、世界に先駆けてヒト結核に
した。
最も近いカニクイザルで明らか1こ
20
研究方法
〔多 剤耐性結核 に対する結核治療 ワクチン実用 化 〕
1 . 結核治療ワクチン前臨床試験及び第 1 相 医師主導治験 の組織
ー
( 1 ) 国 立病 院機構近畿 中央胸部疾患 センタ ( 岡田、井上 、露 口) 、東京病院 ( 庄司)
茨城 東病院 ( 斎藤)
( 2 ) 大 阪大学 ( 金田、朝野、熊 ノ郷)
o ) P M D A と の薬事戦略相談 ( ジェノミディア株 式会社 中島、東海大学 三上)
前臨床試験
個別面談実施。
① すでに、2013年5月31日 PMDA薬 事戦略相談・
添付資料 は事前面談 ・
対面助言 のレベルの資料内容と評価、すぐ事前面談。
2013年 6月 20日 PMDA薬 事戦略相談 ・
事前面談実施
結核予防 会大阪病院 ( 松本) より紹介
( 4 ) 多 剤耐性結核 近畿が最 多 : 大阪府 立病院 ・
国立病 院機構 呼吸器ネットワー ク6 5 施設リーダー( 岡田) 。日本 の5 0 % の 多剤耐性結核患者
2.前臨床試験 (薬効 口
毒性 ・
安全性 )(中島、金 田、熊 ノ郷 、朝 野、岡 田、井 上 )
3.国立 病院機構 病院を中心 に、多剤耐性結核患者 に対する第 1相 医師主導治験 :
(近畿中央 :井上、露 口、東京病院 :庄司、茨城東 :斎藤t大阪大学 :朝野、熊ノ郷)
4.評価 :
(1)安全性(主要):CTCAEを指標とする安全性の評価
1次):①多剤耐性結核菌 排菌陰性化。 ②多剤耐性結核菌の排菌数減少。
(2)有効性(冨
,
21
期 待される成果
臨床応用 〕
〔ヒト
新 しい 結 核 治 療 ワクチン
日
本邦で毎年200人の多剤耐性結核患者を治療 ・
救命
・
・
毎年200万人の結核死亡者を治療 救命可能
・
XDR…丁Bを治療 (世界で毎年50万人)
多剤耐性結核 ・
:スーパー ロ
スプレッダニ 多剤耐性結核を治療可能
(岡田、井上 、露 口、庄 司、齋藤、朝野、松本、熊ノ郷 、三上 )
潤詭二月1
〔第 1相 医師主導治験評価 〕
喀痰
琴
彎 ⇒
⇒
多剤耐性結核菌 0 個となる
ュ` r i ´
排菌陰性化
L m . 籠■ 蔭
皮内投与
①医療費節減。
② 日本で効果があれば、世界の多剤耐性結核 50万人/年
の治療。国際貢献。
22
結 核 感 染 したカニ クイザ ル を用 いた
12 DNAワクチンの 治療 効 果
HVJ―エ ンベ ロー プ/Hsp65+IL…
気道内感染
丁B
cha‖enge
Cynomolgus
monkey
5x102 cFU
' ↓
7 dayヽ
〆
だ
21 day ヽ
￨￨￨￨￨￨￨￨￨
Therapeutic Vaccine
独創 的な点
特色 ・
1.有
効性の実証〕
〔
ー HSP65
① カニクイザ ルの 結核 感染 モデルで、HVJロエンベ ロ プノ
DNA+lL‐12 DNAワ クチン投与群 では 、生 存率 の 改善 、血 沈 の
2の
改善 、Tリンパ 球 のHSP65抗 原 に対する増殖反応増 強 、lL‐
産 生 増強。
世界 でも類例 の ない独創 的 ワクチン
Human Vaccine 2013)
(Vaccine 2009、
生存率
frtt
T 細胞の増殖
11下 αお mer
1l n'eI.s rncr
IB IIlrdI●
●
舅 120
,D+>
岡 田 はW H O の
t>ll-tL
W G N D ( W o r k i n g G r o u p o f N e w T B D r u g ) 委 員会 委 員 に選 ばれ た ( 2 0 0 9 年か ら) 2 4
HVJエ ンベ ロー プ/Hsp65 DNA+IL-12 DNAワ クチン
(カニクイザ ル における結 核 治療 ワクチン効 果 )
1. 生存率 の 改善
2日 体 重 増 加
3: 赤沈 (赤血 球沈降速度)の改善
4. 胸部 X線 所見 の 改善
コ
5. 免疫 反 応 の 増 強
6.
リンパ球増殖反応
(1)丁
ヨ生
(2)IFN―
γ庭
2産生
(3)IL二
IL-2の 産 生と生 存 率 (結核 治 療 効 果 )
は 相 関 した 。
25
方法〕
〔
Ｓ
山
耐
鵬
鵬
HSP65+:L‐ 12 DNAワ クチン
結核菌数
0日
1日
8日
15日 30日
結核菌 に対する
免疫反応
ロ
キラーT細 胞
・
増殖反応
ロ
サイトカイン産生
26
超薬剤 耐性結核
Extensively Drug Resistant TB(XDR‐TB)
TB)
Extrelmely Drug Resistant TB(XDR‐
XDR―丁Bの 新たな定義
(1)少なくとも RFPと INHに 耐性 (MDR―TB)
(2)フルオノキノロン耐性
(3)以下の注射可能な薬剤 の1種以上耐性
アミカシン
カナマイシン
カプレオマイシン
XDR‐TBの 元来の定義
結核治療薬第ニラインの主要な抗生剤 のうち3種 類以上に耐性 のMDR―丁B
(アミノグリコシド系、ポリペプチド系、フルオロキノ由ン系、
チオアミド系、ツクロセリン系、パラアミノサリチル酸系)
27
超 薬 剤 耐 性 結 核
DrugResistant(XDR― 丁B)
Extensively
ExtremelyDrugResistant(XDR― 丁B)
薬 剤 名 濃
易比率法 )10
pM (簡
INH (簡 易比率法)0.2
RFP(簡
易比率法)40
EB (簡
易比率法)2.5
KM (簡
易比率法)20
EVM(簡
易比率法)20
TH (簡
易比率法)20
CS (簡
易比率法)30
PAS (簡 易比率法)0.5
LEFX(簡 易比率法)1.O
PZase
度 判 定 濃 度2判 定
R
R l.O R
R
R
R
R
R
S
R
R
薬 剤 名
SM (MGl丁
INH(MGl丁
RFP(MGI丁
EB (MGI丁
PZA(MG!T)
濃 度 判 定
) 1.O R
) 0.l
R
) 1.O R
) 5.O R
100 R
薬剤洗度単位 μ g/ml
R口・口
耐性
〕jず
斬竃県能
28
② マウス多剤耐性結核感染モデルで、ヮクチン投与群では肺 ・
肝臓 ・
牌臓の結核菌数が減少、更にマウス超多剤耐性結核
†B)感染モデルで、ワクチン投与群は、生存率を改善
(XDR‐
(Vaccine 2009,Human Vaccine 2011,2013)
TB)治療効果
超 多剤耐性結核 (XDR―
(生存曲線)
多剤耐性結核治療効果
■Gl:コントロー ル
．
．
０ ０
Ｓ一
≧ ョの
■ ， 一一
■G2ワ クチン
‐
・
― コントロー ル
…ロワクチン
１
２
今村賞 結核病学会賞受賞 (2012年)
遺伝子治 療 学会誌賞受賞 (2008年)
(多ヶ谷勇記念 ワクチン研究)イスクラ奨励賞 (2004年)
町h e r a p ecu 誦
vacdne」
国際学会招 へ い特別講演 ( l C A A C : 米国微生物学会) 第5 0 回2 0 1 0 年
３
29
結核菌 に対する治療 ワクチン
PBLノhu)の開発
生 体 内 ヒトモデル (SCID‐
SCIDマ ウス
健常人
又 はT B 患 者
PBL
TB菌
感染
結核治療
ワクチン
口
結核治療効果
肺 の結核菌数
肝 の結核菌数
牌の結核菌数
ロヒトロ ーT細
キラ
胞分化
・
ヘルバ ーT誘 導
ヒト・
・
ヒトロ
サイトカイン
I F N ―γ
:L-2
1L-6
TNF― α
結核に対する治療 ワクチン:
世界に先駆けての開発
TBに 対する治療 ワクチン
:L-2レセプター γ鎖 ノックアウトSCIDマ ウスを
用 いたSCID=PBL/huヒ ト免疫 モデ ル マ ウス
(Okada cancer Res 1997)
I
HSP65 DNA+:L‐12 DNAワ クチ
ンと化学 療法剤 ( R F P 、l N H ) との
結 核治療相乗効果
rm
caw+-e
( H S P 6 5 + I L - 1 2 ) D N A ワクチ ンとI N H との
結核治療相乗効果
(10glo CFU)
グループ
治療
l
lmf―
Gl
G2
HSP65+lL‐ 12DNA
G3
INH
G4
RFP
HSP65+:L‐
G5
-120NA
国GJ965■
NH
IG3」
12DNA
+:NH
□G 4 押
120NAN
‐
I G 5 1 W 6L 「
HSP65+:L-12DNA
G6
+RFP
12DNAlm
□G61SP6m‐
NH
G7
l G7m押
+RFP
HSP65+:L‐ 12DNA
G8
日 G8JISPm‐12DMW辮
+:NH
+RFP
INH0.O3mg/mouse
RFP0.1mg/mouse
* P<0.05
Student'st t&4
独創的な点
特色 ・
〔2.匡師 主 導 治験 の 実施 に 向 けた準 備状 況 〕
① PMDA薬 事戦略相談を実施。DNAワクチンで個別面談を実施済、事前
面談も6月に実施。
エンベロープ)については規格 ・
アジュバント(HVJロ
安全性の対面助言
を既に実施
② アジュバンHこついては、大阪大学が本年度よりGCP医 師主導治験を
実施する計画で、医師主導治験を支援する体制を確立
③ HVJロ エンベロープ
(1)不活性化センダイウイル不粒子
(2)一本鎖RNAが 強 力なアジュバント作用
(RIGJ活 性化 :キラーT分 化、NK分 化、制御T抑 制)
(3)癌治療 に臨床応用され、すでに治験薬GMP製 造
HVJ―エンベ ロープ
④ 民間企 業 と共同で開発を準 める計画 であり、本計画 に従つてGLP試 験
、治験薬 GMP製 造 (AMBiS社 )等を実施 し、3年 以内にGCP準 拠 の医
師 主導治験を実施可能
33
独創 的な点
特色 ・
3.萌
確な出回戦略〕
〔
院が国立病院機構等 に
① 多剤耐性結核など対応可能な病・
限定される感染症の治療用 ワクチンを、PMDA、 大阪大学、
遺伝子治療学会、企業が新技術 (DNAワ クチン)で開発、
ガイドライン策定 に繋げる産学官共同研究
② 民間企業 (ジェノミディア)が参加。薬事法 に基づく承認取得
までの出 回戦 略を明確 にした研究
論文
1.Okada All,et al.Human Vaccines and:nlrnunotherapeutics.2013
2.Kna Y etal.Human Vaccines and irnrnunotherapeutics.2013.
3.Okada M,et al.Clin Dev lmmunol.2011
4.Ktta Y et al.Human Vaccines.2011.
5.Okada M,et al.Human Vaccines.2011.
6.Okada M,et al.Human Vaccines.2010.
7.Okada M,et ali Vaccine.2009.
9.Yoshida S,et al.Vaccine.2006.
.
8.Okada M,et al.Vaccine.2007.
10.Kita｀
` et al,Vaccine.2005。
承認 取得までの ロニ ドマップ
(☆ :確認 申請、治験届 、オーファン申請、承認 申請、←→ :実施期間、点線の く…>:予 備検討など準備期間)
治験開始からの年度
規制 当局 ・
倫 理委 員会対応事項
オー77ン 申請/治 験届 (PI)
臨 床試験 関連事項
治験戦略策定 (含薬事戦略相談 )
国内多施設)
治験実施 (PI、
治験実施(PI、国内多施設)
承認申請と当局対応 (国内)
承認 、薬価収載、海外普及
治験薬 GMP製 造 (パイロットプラント)
研究計画
平成 25年 度
1.本 DNAワ クチンの用 法用量設定試験 (岡田、井 上 、露 口、中島、朝野、熊 ノ郷)
2.投 与経路最適化 (岡田、井 上 、露 口、朝野、熊 ノ郷)
3.毒 性試験 (中島、金 田、朝野、三上 )
4.GMP製 造 (中島、金 田、朝野)
5.PMDA薬 事戦略相談 ・
対面助言 (岡田、井 上 、三上 、中島)
平成 26年 度
1.本 DNAワ クチンの用法用量設定試験継続
2.投 与経路最適化継続
`
3.毒 性試験継続
式験製造を実施)、3ヶ月長期安定性データを取得
4.GMP製 造 :治験薬GMP製 造 (言
5.:RB申 請 :治験計画書案作成を完 了、lRB申請手続きを行 い承認取得 (岡田、井上 、露 口、
庄 司、斎藤 、松本、朝野、熊 ノ郷、三上 、中島)
平成 27年 度
1.毒 性試験 :次相用データ取得 (中島、金 田 、朝野、三上 )
2.GMP製 造 :治験薬GMP製 造、6ヶ月長期安定性データ取得 (中島、金 田、朝野)
3.医 師主導治験 :治験届、治験 (井上 、露 口、庄 司、齋藤 、松本 、朝野、熊 ノ郷 、三上 、中島)
36
予定される治験 の流れ
︲＊ ︲Ｑ
間
﹁
週
３
¨
〔多剤耐性結核患者 (lNH耐 性 +RFP耐
主要 評価項 目
安全性 ・
忍容性
副次的項 目
・
抗結核作用 ( 排菌減少)
・
免疫反応
目標症例数
3 名か ら6 名/ 用 量あたり
2 用量
実施施設
国立 病院機構 病院
3 施設
性)〕
スクリーニング
ブロトコル治療(Cyclel)
DNAワ
クチン投与 (皮内)
プロトコル治療終了
治験 の
実 施体制
本剤の医師主導治験実施体制 (安全性 ・忍容性 ・有効性の検証)
治験実施施設
(日立病院機構ネットワーク活用)
治験施設支援機関 :SMO
(早期 口
探索的臨床試験拠点活用)
本研究事業は、国内
human治
で籠rstJn‐
験 の実施 となる上 、
国内初となるプラスミ
ドDNAの 治療用DNA
ワクチン開発となる。
そのため 、薬事法上
の承認取得 に必要な
民間企業との連携 に
加え、ガイドラインの
策定 にも繋げる事 が
出来るよう国立病院
PMDAr
機構、厚労省′
医薬基盤研、日本遺
伝子治療学会(理事
長 :金田安史教授)と
連携した研究体制 と
する。
薬事法 上の承認取得
(民間企業との共同開発)
サイエンスの基盤
(基礎研機関と連携)
非臨床試験 ・
治験薬GMP製 造 ・
安定性試験
(ジェノミディア、AMBiS)中 島
分子 レベ ルでの ワクチン作用機序解明
日本遺伝子治療学会、
医薬基盤研究所、PMDA、
・
てガイドライン
力し
厚労省と協
平成25年 度 研究進捗状況
1.iCQ/Q5Dガ イドラインに従 い治験薬
製造用の本ワクテン(いA滓 HSP65
マスタTセ
DNA+ヒ トIL-12 DNA)の
ル バ ンク(MCB)を 分担研究者 中島
岡 田)
と共 にAMBiS社 で作製 (中島 ・
39
治験薬 GMP製 造 ワクチン
①
多剤耐性結核 に対する新規治療 用 DNAワ クチンの 開発を進
喬
と
:必
副
じ
亀
す
ι
汚̀器
響
‖
晃
霧
舅
乱
3f磐
畠
≦
1覇
駐
塁
② プラスミドDNAは 大腸菌を用 いてGMP製 造を実施するため、
安全性の確保 と品質 の安定化 に必要なバンクシステムを作
製 した。
、
③
④
入
手し
来成分を
、
動物由
株を
大腸菌のDH5α
立
り
遺伝研よ
国
に
ン
よ
ヨ
り
法
[r シ
翫
‰鉾電
夢
女鯵[覇
墓
糞
螂
製 甜冊
舗
課鮭紺撃,縄 一
のDNAと 制限酵素 地 図が
致
ー
ー
⑤ 確認後 に、1種 類 の大腸菌クロ ンを選択 してマスタ セル バ
ンクの作製を行 つた。
40
作成 したマスターセル バンク
治験薬GMP製 造 に必要なバンクシステムを構築する
ため、治験薬GMP製 造用大腸菌 について計 300本で
構成されるマスターセルバンクシステム を作成 した。
41
マスタニセル バ ンクの外観 とラベル
マスターセルバンクの各チューブに下記のように
ラベルを貼付 した
-0
マスターセル バ ンクの作製 のため 、選択した大腸 菌 の クローンを動物
由来成分を含まない培地 で拡 大培養を実施し、計 300本で構成される
バンクシステムを構築した[pVAX-lgHSP65-hIL1 2(DH5)]。
α
42
平成25年 度 研究進捗状況
2.作 製 され た本 ワクチンの 品質規格を
面。lCHの Q5B・Q5Dガ イドライン
評イ
準 拠 の特性解 析 、品質試験 。(中島)
43
構築 したマスターセル バンク(MCB)
システムの 品質検 査 項 目について
項目
規格
①薬剤感受性試験
カナマイシン耐性
②栄養要求性試験
栄養要求性なし
③グラム染色試験
グラム 陰性
④コロニー形態試験
大腸 菌 以外 の形態の コロニー なし
⑤ファージ否定試験
ファージ陰性
プラスミド確認
⑥制限酵素地図試験
理論サイズと一 致
生存率試験
⑦生菌数試験
mL以 上
107大 腸菌′
試験
宿主 の 同定試験
混入否定試験
44
構築 したバ ンクシステムについての 品質試験 の
結果、全ての 品質管理 項 目に適合 であることを
確認 したため 、製 造を行 つてプラスミドDNAの 暫
定規格設定 に必要な品質確認 データの 取得を
行 つた 。
プラスミドDNAの 治験薬 GMP製 造 と並行 して、
治験届までに必要な前臨床試験 パ ッケージ案
の作成を行 つた。
45
プラスミドDNAの 暫定規格 (案)について
試験
項 目
規格
試験 法
性状
①性状試験
②塩基配列
無色透明の液体
目視
参照配 列と一 致
2本 鎖 の配列解析
③制限酵素地図試験
理論サイズと一致
電気泳動法
④DNA濃 度
規定 から±10%以 内
吸光度 (A260)
⑤純度試験
既知異性体 として含量を95%以 上
OC+LN体 を分解物 とし、SC体 の含量を90%以 上
確認試験
定量試験
⑥吸光度比(A260rA280)
⑦宿主DNA
③宿主RNA
⑨宿主たん白買試験
HPLC法
1.80…1,97
吸光度
適合
電気泳動法
適合
電気泳動法
プラスミドDNAの 重量あたリー定量以下
ELiSA法
⑩たん白質含量試験
プラスミドDNAの 重量あたり,定 量以下
BCA法
⑪不溶性微粒子試験
⑫不溶性微異物試験
⑬pH試 験
適合
日局
適合
日局
規 定 から±1 0 % 以 内
日局
浸透圧
⑭浸透圧試験
規定 から±2096以 内
日局
無菌性
⑮無菌試験
①エンドトキシン試験
適合 (菌の増殖なし)
日局
m g 未 満)
適合 (50EU′
日局
純度試験
不溶性微粒子
不溶性微異物
pH
エンドトキシン
SC体 :Superco:l体(スー パーコイル状のプラスミドDNA)、 OC体 :Open c:rcular体
(開環状 のプ
ラスミドDNA)、 LN体 :Linear体(直鎖状のプラスミドDNA)
46
既 に国 内 における規制 当局である医薬 品医療
機器総 合機構 (PMDA)と の薬事戦 略相談を通
じて、品質規格 や試験 デザインの相談を進 めて
おり、両者 で合意 した内容 に従 つて治験届 に必
要 なデータパッケージを作成 した。
今後、作製 したバンクシステムを用 いて治験薬
GMPレ ベルで製造 したプラスミドDNAを 用 いて、
ー
安 全性試験 などの非臨床試験デ タ、治験薬
の 品質規格 の設定を進 め 、医師 主導治験 を実
施する予定である。
47
平成25年 度 研究進捗 状況
これを元 に、GMP
レベルの
pWつ ぐHSP65
DNA+ヒ トlL-12
DNAを 100mg作 成
(バツチで)0
これをサル に用 い
てこの ワクチンの 安
毒性試
全性試 験 口
験を行う計画を立
安由
BGH pA
p40
p35
mm“
“
"/`編
48
カニクイザルを用いた毒性試験 1(案)について:
一 般毒性 十安 全 性薬 理
試験動物
カニクイザル♂♀
被験物質
pVAXI -lg HSP65-hlLl 2+ HVJ-E
投与方法
投与期間
観察期間
投与経路 : 皮内投与
投与期間 : 2 週間
観察期間 : 投与期間 2 週 間 十回復期間2 週 間
群構成
評価項 目
安全性薬理
( 中枢神経 系)
抗体価測定
備考
投与群 : ♂♀で4 群 ( 対照群 + 3 用 量)
回復群 : ♂♀で2 群 ( 対照群 + 1 用 量)
一般状態観察
摂餌量測定
体重測定
血 液学的検査
血 液生化学的検査 眼検査
尿検査
剖検
器官重量測定
病理組織標本作製 及び検査
FOB(機 能観 察総合評価 法):投与前後 で実施
採血 を行 つて抗体価をELiSAで 測定
投与液 の濃度分析及び安定性分析を実施
49
カニクイザルを用 いた毒性試験 2(案 )
について :安全 性薬理 試験
試験動物
カニクイザル♂
被験物質
pVAXl‐ lgHSP65… h:L12+HVJ…
投与方法
評価
投与経路 :皮内
投与回数 :単回
,
評価時点 :投与前 と投与後 の適切なタイムポイントで評価を実施
群構 成
3群 (対照群 +2用 量 )
評価 項 目
( 呼吸器 系、循環器系)
血圧 (収縮期 血圧 ,拡 張期 血圧 ,平 均血圧 )
心拍数
心電図 (PR間 隔:QRS時 間,QT間 隔,QTc間 隔)
呼吸機能 (呼吸数,1回 換気量,分 時換気量)
体温
一 般状態
ビデオ撮影により投与前 から投与後 に、動物 の状態を観察し、各
評価時点の動物の状 態を観察する。
血圧
予めテ レメトリー 送 信 機 留置 手術を行 い 、術後 2週 間 以 上 経過 後
安定した循環 パラメー タが得られる個体を選抜する。
E
平成25年 度 研究進捗状況
Ｈ
劇
Ｇ
一
岬
螂
Ｂ
4.pHHSP65
pA
DNA+マ ウスIL―
12 DNAを 作成
した。
(70mgを作成
した)
pVAX午 昨 "引 マウカ H2
1176
5016
72Eg bp
p35
BamH1 4551
51
平成25年 度 研究進捗状況
5ロ マウスでこのワクチンの 平成 26年 度
信頼性 基準適合用試験 のための 用
法用 量試験 の 予備試験を実施 中。
井 上 、露 日、中島、朝野 、熊 ノ郷 と共
同研究 で実施 中。
52
用法検討 (DNAワ クチン投与回数検討)
(1)
DNAワ クチン
100μg DNArマ ウス
ワクチン
投与 回数
3回
4w後
又は6w後
7ト
8壇
層
責
括 竃
IL-6
TNFα
(2)
DNAワ クチン
ワクチン
投与回数
6回
DBA71マウス又は
C57BL/6マウス
(各群6匹)
生 体組織 ではHVJ由 来 の 蛋 白質 に対する免疫
反応 が惹起され 、抗体 による中和反応 が おこる
ことが考 えられるが 、遺伝子を封入 しないHV」―
Eとル シフェラー ゼ DNA封 入 HVJ―Eを 用 い た マ
ウス ヘ の 投 与 実 験 によ り、HVJ二圧を連 続 投 与 し
ても遺伝子発現の抑制は見られず、連続投与
が可能であることが明らかになつた。(金田)
ELiSA
培
ELiSA
!FN―γ
lL-2
1L-6
丁NFα
￨:
抗原刺激 ①HSP65 20μ
g/mi
② PPD
20μ
g/ml
③結核死菌 20μ
g/ml
(Linbro 24we‖)
用量検討 (DNAワ クチン投 与量検討)
4w-6w
EL:SA
IFN― γ
:L-2
:L-6
TNFα
DNA投 与量
ウス
① O μ g/マ
② 25
③ 100
④ 280
アジiバ ント量 ① O mNAu
② 100
③ 4o0
④ l120
56
用量検討 (アジュバ ント添加量 )
2w
EL:SA
:FN―γ
lL…
2
1L‐
6
TNFα
アジュバント量
① pDNA最適用量が280μ
gのとき:
70,280,巨
2列
甲NAu
② pDNA最適用量が100μ
gのとき:
100,匝
□1600 mNAu
③ pDNA最適用量が25μ
gのとき:
F ool,4oo,1600mNAu
増 殖反応 Assa
3H_丁dR
/we!:
JH 型 聖 ハ_ベスト
牌細胞
l x 105/we‖
抗原刺激 ①HSP65 10μg/ml
②PPD 20μ g/m!
③結核死菌 20μ
g/m!
(Linbro 96we‖
)
57
tr Vac.
千匡 卜 Ｆ
■ ( …)
□V a c .
-
61
結果
用量検討(DNAワ クチン投与量検討)C57B
L/6マウスやDBⅣ lマウスにワクチンを25μg
∼280μg投 与 し、4∼6w後 の牌細胞を抗原
Hsp65蛋 白でin vIFO刺
211L―
激 しiFN―
Y、lL口
6、丁NFα(丁
細胞免疫能)産生をELiSAで 解
析中。DNA量 が25μgでもlFN―
Y産 生を増強
しワクチン効果確認。(岡田・
井上 ・
中
露 口・
朝野 ・
島・
熊ノ郷)
62
平成25年 度 研究進捗状況
6.多 剤 耐性結 核 患者 の 調 査 と医 師 主
導 治験 に 向けての 計 画 (露 口、庄 司、
齋藤 、松 本 、熊 ノ郷 )
・
国立病院機構近畿中央胸部疾患センター
・
東京病院
・
茨城東病院
・
結核予防会大阪病院
‘０
多剤耐 性結核患者 の調 査
病院施設名
多剤 耐性結核 患者 数
(MDR―丁B)
国立病 院機構
近畿 中央胸部疾 患 センター
55例 (7年間)
特徴
超 多剤耐性結核
20例 (7年間)
東京病院
40例 (10年間)
7名
死亡
治療完 了 9
治療脱落 1
転 出 10
治療継続 8
(3名は後 に死亡)
入院中 1
不明 4
茨城東病院
10例 (12年間)
男性 多し。
不規則治療 が誘因
64
平成25年 度 研 究 進捗状況
7.医 師 主 導治験 に向けての組織 化
(大阪大学を中心 とした)
(朝野、熊ノ郷 、金 田)
65
平成25年 度 研究進捗状況
① 大阪大学医学部を中心 として統括する、本 ワクチンの
臨床治験 (医師主導第 二相治験)に向けて大 阪大学
医学部治験管理センター及び大阪大学未来医療 セン
ター治験管理センターで調整中。
② 医師主導治験 に向けての組織化 (大阪大学を中心 と
した)(朝 野、熊ノ郷、金 田)。
③ 平成25年 度 は、健常 人を対象 とした臨床試験および
マラリアワクチンのフェーズ I医 師 主導治験 の実施を
通 して、早期探索的臨床研究 の体制整備を行 い、結
核 ワクチンの 医師主導治験 の 実施 に向けての研究体
制 の整備を行つた。
66
マニ三アル等)
ガイドライン ロ
本研究 の 成果(発表論 文 ・
1. Okada M,Nakdima T,Kaneda Y,Tan E_V,McMurray D,Inoue Y,Tomono K,Kumanogo A,
Tuyuguchi K,Sholi S,Mikami A,Matsumoto T,Saito T.:A nove:therapeutic vaccine against
tubercu!osis in the cynomolgus monkey model and c‖nica!trial.7th Vaccine &ISV Congress.
joint
p.40-41.Oct.27-29,2013.Barce:ona,Spain(Ora:),Japanese Society of Vaccine(JSつ
session
2 . O k a d a M ( 1 番 目/ 9 人 中 ) , N a k a i i m a T ( 7 / 9 ) , K a n e d a Y ( 8 / 9 ) = N o v e : t h e r a p e u J c v a c c i n e s a g a i n s t
Nov.3,2013.
tubercu:osis and their synergistic ettcacy.p1156.44th Union Worid Coni Parisざ
".最
“
新医学 出版 中
3.岡 田全 司:結核 におけるワクチンヘ の期待 次世代型感染症 ワクチン
3版
小
Ql臥
小児 内科」「
。「
改訂
4.岡 田全 司(1/け結核 予防 (DNA)ワクチンの開発状況 予防接種
児外科」編集委 員会 共編 t東 京医学社 。1ヽ児 内科 45巻増刊号 281-283.2013.
5.岡 田全 司:結 核 の 免疫反応 「
免疫学的機 序 からみた呼吸器疾 患J 日 本胸部臨床
72(12):1336-45.2013.
6.岡 田全 司:はじめに (序論)「 結核―古くて新 しい感染症 …』 最新 医学 .68(11)2437-2438.2013.
2 439-2450.
問題点と最新 の知 見。最 新医学 .68(11ゝ
7.岡 田全 司(1/3洸
座談会 :結核 の現状 日
2013.
8.喜 多 洋 子 、岡 田全 司 』ヒト結 核 感 染 に最 も近 いカニ クイザ ル を用 いた 新 規 結 核 予 防 ワクチン開
―
―
2479-2487.2013.
発 及 び 臨 床 応 用 に向 けて 『結 核 古 くて新 しい感 染 症 」 最 新 医 学 .68(11ゝ
2488-2495.2013.
.68(11光
9.岡 田全 司(3/3)_多剤 耐性 結 核 治 療 ワクチンとT細 胞 免 疫 最 新 医学
"特
「
別 講 演 東京 2013年9月
10.岡 田全 司 新 しい結 核 治 療 ワクチンの 開 発 研 究 慈 恵 医科 大 学
29日
" 金
“
沢 2013年11
11.岡田全司 新規結核治療 ワクチンの開発研究 金沢大学薬学シンポジウム
月26日
67
マニュアル 等)
ガイドライン ロ
本研究 の 成果(発表論 文 ・
1 2 . ( K a n e d a Y . R I G - 1 / M A V S s i g n a l i n g p a t h w a y i n c a ns ce el re c ct ei lv le ―a p o p t o s i s . J . O n c o i m m _ ( i n
press)
13.Saga K,Kaneda Y.Vttosome therapy for cancer.BIomed Research intemationa:Gn pr
envelope
vector
14. Kaneda Y(4/4).Recent advance and development in antitumor efFect of
HV」
in malignant melanoma;from bench to c:inical app:ication. Cancer Gene ttherapy.20,599-605,
2013
15。日本遺伝子治療学会理事長 として以下の規制改革に貢献した。①再 生医療製品を対象にした
薬事 法の改正につき、遺伝子治療製品も盛り込むよう、日本遺伝子治療学会より厚労省 に依
頼 し、再生医療製品等、という形で盛り込まれた。②遺伝子治療の治験を始めるにあたつて必
要であつた確認 申請 の見直 し案を日本遺伝子治療学 会より内閣府の規制改革委員会 に提出
し、2013年8月に厚労省から確認 申請 の廃止が通知された。
‘υ
平成25年 度 研究進捗状況
8.PMDA対 面助言を計画中。
①中島俊洋、井上義一、岡田全司
が 打ち合わ せ
(会議 :当臨床研究 センター )
2013年 10月21日
三上 礼子 、井 上 義 一 、岡 臼全 司
が 打ち合わ せ
(会議 :当臨床研究 センタT)
2013年 10月22日
69
研究計画 の具体 的内容 と研究担 当項 目
H26年 度】
【
1.PMDA対 面助言(岡田、
、井上 、三上 、中島、朝野)
2013年9月 より遺伝子治療薬 の確認申請廃止 、PMDA
薬事戦略相談で合意する事 となった。
非臨床試験項 目設定、治験薬品質 ・
安全性、治験実施
計画等 の 、各項 目で合意を得る。
ガイドライン制定に繋げるため 、本年度 は毒性 ・
薬効薬
理試験項 目設定を完了、治験薬 の品質と安全性 に関す
る相談も開始
70
研究計画 の具体 的内容 と研究担 当項 目
H 2 6 1 年度 】
【
2.信 頼性基準 適合用法用量設定試験 (岡田、井上 、露 口、中島、朝野、熊 ノ
郷)
ー
動物 モデル で用法用量を最終 化、用法用量ともに予備デ タを基に2週 間
の 投与を目途 に最適 化を完 了
3.信 頼性 基準適合投与経路最 適化試験
治験 に使用予定 のデバ イスで投与、筋 内と皮内の比較 で最適投与経路決
定
4.GLP毒 性試験 (中島、金 田、朝野 、三上 )
PMDAと の 合意 内容 でGLP試 験実施 、治験届 に必要なデータをカニクイザ
ル、ラット等 で取 得
5.GMP製 造 :試験製造 、長期安定性試 験 (中島、金 田、朝野)
治験薬 と同様 の工程 で製造、3バッチ程度で暫定規格設定、lCH Q5Cガイド
ラインに従 つて3ヶ月安定性 デー タ取得
6.lRB申 請 :治験実施計画 書作成完 了、:RB申請 (岡田t井 上 、露 口、庄司、斎
藤 、松本、朝野 、熊ノ郷 、三上 、中島)
非臨床試験 デー タを基 に治験 実施計画書作 成、!RBへの 申請完 了
71
研究計 画 の具体 的内容 と研究担 当項 目
H27年 度 】
【
1.医 師主導治験 :治験届、治験 (井上 、露 回、庄 司、齋藤 、松本 、
朝野 、熊 ノ郷 、三上 、中島)
!RB承認 で治験実施計画書最終化、PMDAへ 治験届 、受理後
に医師 主 導治験開始、患者 へ の投与 は国 立病院機 構 の3病 院
で実施、患者リクルー ト支援 とデータマネジメントは大阪大学医
学部附属病院 が 実施
2.毒性試験 :次相用デニタ取得(中島、金田、朝野、三上)
第2相での承認申請を可能とする長期毒性データ取得、PMDA
の薬事戦略相談に応じてlヶ月∼6ヶ月で設定
3.GMP製 造 :治験薬GMP製 造、安定性試験(中島、金田、朝野)
治験薬GMP製 造で治験薬供給、
6ヶ月の長期安定性データ取得
72
予定される治験 の流れ
︲︲ ︲
間
乳
﹁
週
３
・
〔多剤耐性結核患者 (lNH耐 性 +RFp耐
主要 評価項 目
忍容性
安全性 ・
副次的項 目
・
抗結核作用 ( 排菌減少)
・
免疫 反応
目標症例 数
3 名か ら6 名/ 用 量あたり
2 用量
実施施設
国立 病院機構 病院
3 施設
性)〕
スクリーニング
ブロトコル治療lCyclel)
DNAワ
クチン投与 (皮内)
DNAワ
DNAワ
クチン投与 (皮内)
クチン投与
DNAワ
クチン投与 (皮内)
プロ トコル治療終了
2.
DNAワ クチンという新規範疇 の 医薬 ガイドライン策定
に繋 が り、医薬行政 に貢献
迅速 対応可能なワクチンの基盤技術開発 で新興 ・
再
興感染症対策 に対 して貢献
3日
国 立 病院機構 でワクチンの 医師 主 導治験体制を確
立 、国保有施設 の 新 たな活用 で民間企業 のみでは
難 しい感染症 ワクチン開発体制を強 化し、対感染症
ワクチン行政 に貢献
4.
治療用 DNAワ クチン開発 ガイドラインを世界 に先駆
け策定できる
5ロ
多剤耐性結核菌 の他者 へ の 感染 、医療費削減 、国
際的な保健衛 生に貢献
インフルエンザワクチン株 とその選定 プロセス
9月 中旬
2月 中旬
W H O 北 半球
ワクチン株
推奨会議
12月-1月 中旬
ンチン候補株
1選定と適性
式験の開始
﹁ 日 日ヽ ｌ Л
10月
下旬
2月上 旬
候補株試験成績
検討会
候補株 の追加
国内外の流行情報
流行株の解析情報
国立感染症研究所 が 実施
厚 生労働省
健康局長
10月 ¨
9月下 旬
ワクチン出荷
・
ー
2014/15シ ズンインフルエンザ HAワ クチン製造株 について
1.WHOが 推薦するワクチン製造株 の構成
WHOは 以下のインフルエンザ ウイルス株 の流行を予測 しており、ワクチン製造株 として推奨
している。
(1)A/カ リフォルニア/7/2009(HlNl)pdm09類似株
(2)A/テ キサ ス/50/2012株(H3N2)類似株
(3)B/マ サチュセッツ/2/2012類似株
2.我 が 国 のワクチン製造株 につ いて
ー ズンは 以下 の3株 をワクチン製造株 として選 定 した 。
上 記 WHO勧 告等を踏まえ、2014/15シ
(1)A/カ リフォルニア/7/2009(X-179A)(HlNl)pdm09
(2)A/ニ ューヨーク/39/2012(X-223A)(H3N2)
(3)B/マ サチュセッツ/2/2012(BX-51B)
※国立感染症研究所における検討の結果、
OA/HlNl pdm09ウ イルスの 殆どは、ワクチン株A/カリフォルニア/7/2009類似株で、2009年以来抗原性が殆ど変化していない。また、A/
カリフォルニア/7/2009ワクチン接種後のヒト血清 は、最近 の流行株とよく反応することなどから、A/カリフォルニア/7/2009{X-179A)(HlNl)
ー
pdm09(2013/14シ ズンと同じ)を選定した。
ー
OA/H3N2の 型については、卵馴化 によリウイルスの抗原性 が流行株 に比 べて、著しく異なる傾向を示 してる。2o13/14シ ズンのワクチン
卵馴化 による抗原性の変化は、幾分軽減されたものの期待したほどの改 善 は見られなか
株 であるA/テキサス/50/2012(X-223)(H3N2)の
ー
つた。2014/15シ ズンのワクチン株 は、A/テキサ ス/50/2012株(H3N2)類似株 であるワクチン製造候補株 のうち、卵目1化しても抗原性の
ー ー
総 合的 に最
変化 の程度 が比較的小さいことや増殖性、タンパク収量などの製造効率を踏まえ、A/ニュ ヨ ク/39/2012(X-223A)(H3N2)が
も適切であると判断し、製造株 として選 定した。
OB型 については、①国内外で山形系統が流行の主流であること、②国民の抗体保有状況調査では、山形系統に対する抗体保有レベル
ーズンのB/マサチュセッツ/2/2012ワ
クチン(BX-51B)接
種後のヒト
は、ビクトリア系統に対する抗体保有レベルより低いこと、③2013/14シ
ーズンと同
ー
ュ
血清抗体は2013/14シズンの流行株反応が良かつたことなどから、山形系統のB/マサチ セッツ/2/2012(BX-51B)(2013/14シ
じ)を製造株として選定した。
資料7
ワクチン分科会
厚生科学審議会予防接種 ・
研究開発及び生産 口
流通部会( H 2 6 . 5 . 2 3 )
ーズンの国内外のインフルエンザの
2013/14シ
流行状況報告
国立感染症研究所
インフルエンザ ウイルス研究センター
ヽセンター
田切孝人
長 Jヽ
A(Hl Nl)pdm09
43%
(71%of
subtyped A)
Datasource:FluNet (www.who.int/flunet),
GlobalInfluenza
Surveillance
and Response
System(11February2014)
Summary of clinical samples and isolates received,with collection dates since 2013'09'01
Numb€f
Number
received
propagotedl
Nurnler
Nunter
Nurnber
received
received
propagntedt
l September 2013-22Jan嘔 町 2011
Sornlreur
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卜l N l
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ViruS 1501ation of Network Labs′
2012‐2014
Nunber
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検 出報告数
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ｍ
検 出 報告 数
酬
0
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■ 2-5
ヨ 年
2013
20:4
(病原微生物検出情報 :2014年 5月9日 作成)
3225例{44.5%}
A(Hl)pdnt39
ー
週別型別インフルエンザウイルス分離 ・検出報告数の推移、2012/13&2013/14シ ズン
1587例
{21.9%)
A ぐ` 〕
検 出報告藪
四 ｍ ｍ ｍ 枷 ｍ
ｍ
ｍ ｏ
週
F
″
(28.6%}
{71.4%}
4
インフル エンザ ワクチン株 とその選 定 プ ロセス
日立感 染症研究所が実施
9月下旬
始1 ● ヮ
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1 接極
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ーズン
2012/13シ
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(x-17sA)(HlNl)pdmos
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2. N+++Z,lSo l2or2 lx-223XH3N21
3. sl7 ltttEy'Y
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● １． ２． ３．
. +2hrda1r7>ryj1ft#,O|il.fr,
● WHOが 推奨するワクチン株の構成
． ． ．
１ ２ ３ . wHoirtf*t61r7>*O;fr,
t. Nhl)7+ tV=7 lilzooelnrrr)pdmoeFfl*
2. tffiT,}|IilraLt
Ng,FU7 Is6t|2ot1(H3N2lf,g*
3. elTtV ztrr'Y l2l2orznolff;.
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(H3N2}FB*
NerFUT lt61l2011
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AlerFU7h6V2011(H3N2)
5
Blr17=>r>ltl2ot,
vaccine strain
selection
ワクチン製造株 (X‐
OO、 BX‐
00)
reassortant virlrs
High groMtth
Mixed infection
reassortant(hgr)
h i g h ‐y i e l d i n g
strain PR8
卵でのワクチン製造効率を上 げるために、ワクチンウイルスと卵高
増殖株(PR8〕
との間で遺伝子再集合ウイルス(HGR)が作製される
ワクチン製造所では、HGRを用いてワクチン製造を行なう
σ
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NYMC′
USA
parcnts
ワクチン原株
Al Cal17/ 20009( H1N1pdm09)
A/Tex/50/2012(H3N2)
ワクチン製造株 (卵高増殖株 )
AlTex/sO/2Ot2u-2231
I nux
I
*r*
B/Mass/02/2012(BX-513)
￨インフルエンザウイルスHA蛋 自の抗原領域のアミノ酸変イ
ビ￨:
Texas/50/2012
細 胞分離 ワクチン原株
Texas′
5 0f2012
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Texas/50/2012
ワクチン製造株
卵分離 ・
Texasr50r2□
12
e l g g uOl「
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Receptor
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site
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site
CDC
作図 :US―
3C.1
3C.1
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3N2)ワ
血清抗体と流行株
X13/50/2012“
クチンで誘導されるヒト
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との交叉反応性の評価
‐
. .
1200
1000
︵
Ｓ ︶卜Σ ０
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800
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200
11.0
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9.1
00
10
海外でのVacdne erecJveness〔V口 Studvから
● Skowronski DM et ai.Low 2012‐
'
13 inf:uenza Vaccine Effectiveness Associated with Mutations in the Egg‐adapted
H3N2Vaccine Strain not Antigenic Drift in Circu:ating Viruses PLOS One 2014
season 2012‐ 13 VEfbr
End―of‐
H3N2:41%(95%Ci 17¨
59%)Ⅳ E forthe
80%}
A(HlNl)pdm09:59%(95%Ci:16‐
85%〕′B(ViCtoria}:75%(95%Cl:29¨ 91%)
B(Yamagata}:67%(95%CI:30‐
● Dec:an But:er Mutations exp:ain poor showing of 2012 fiu vaccineo Studv raises questions over production of
■u v a c c i n e s i n c h i c k e n e g g s o N a t u r e N e w s & C o m m e n 2 7 M a r c hC D2C0 1d4a(tUaS)‐
H3N2:46%in adults aged 18-49′ 50%in those aged 50-64′ a disma:9%in peop:e aged over 65
season:protection
● SE Ohmit′MG Thompson′ JG Petrie et a:. :nfluen2a VaCCine efrectiveness in the 2012
2011…
against each circulating virus and the effect of prior vaccination on estirnates.Ciinicai infectious Diseases
Advance Access pubiished November 13′ 2013
2 012 season;
Vaccine used in the 2011‐
44 to 79)。
A(HlNl)pdm09:65%(95%Ci′
23 to S2).
A(H3N2):39%(95%Cl′
35 to 73).
B:58%{95%C:′
● CDC:nterim attusted estimates of seasona:influenza vaccine efrectiveness‐
62(07);119‐ 123′Feb 22,2013
A(H3N2):47%(95%Ci,35 to 58)
United States′Feb 2013 MMWE
B:67%{95%Ci′51‰ 78%}.
● EK:is‖
ing et a:. Infiuen2a VaCCine efrectiveness estimates in Europe in a season with three inf:uen2a
MOVE multicentre casetontro:studyp influenza season 2012/13
type/Subtypes circuiating:the l―
Eurosurvei:iance Feb 13;19(6)2014
A{HlNl}pdm09:50.4%〔95%Ci:28.4 to 65.6)
A(H3N2):42.2%(9596 Cl:14.9 to 60,7).
B:49。 3%(95%Cl:32.4 to 62.0).
ニ
ュ
1発育鶏り
￨(卵)で製造 されうイ￨ンフル■ンザ ワクチンの問題点 ￨
●ワクチンの緊急製造への対応は困難 (事前の卵生産調整が必要)
●ワクチン野生株 (原株)は卵での増殖性が低い
>製 造効率を上げるために卵での高増殖株 の開発が必要
増殖性を改善
>卵 での複数継代による馴化(adaptatbn)で
●卵で分離したA{H3N2〕
ワクチン株の確保 は困難
>2008/09シ ーズン頃からべH3N2)流行株 は培養細胞では分離できるが、ウイルス
の性状変化から卵で分離することが極めて難しくなつている。
>ワ クチンには卵分離株を使うことになつているため、ワクチンに採用できる
A(H3N2)株は、限定的で選択肢が少ない
●最近のA(H3N2〕
ワクチン株は卵馴化による抗原変異が顕著
>ヒ トのA{H3N2〕
流行株を卵で分離すると重要な抗原サイトにアミノ酸置換が起こ
り、細胞で分離したヒト流行株から抗原性が変化する
>こ の変異株を用いて作製した卵高増殖株 は、抗原変異の程度がさらに強くなる
傾向がある
#〕B/ビクトリア系統 ワクチン株も同様 に卵馴化による抗原変異が起 こる
#)Bノ
山形系統 7ク チンでは、株によつて抗原変異しないものがある
●卵口1化￨三
ょる抗原変異 はワクチンの有効性の低下に影響
●卵剛1化によるワクチン株の抗原変異の問題は、卵で製造する限り毎年起こる(世界 12
共通の深刻な問題)
●季節性インフルエンザワクチンヘの細胞培養 ワクチンの導入、
実用化 は一つの考 え方
>ワ クチン製造用種 ウイルスの準備、開発 (高増殖株 の作製
など)からヮクチン製造所での大規模製造まで、一貫して培
養細胞を用いることが必要
O
>卵 で分離した種 ウイルスを使用 した細胞培養 ワクチンでは、
卵馴化変異 の 問題を改善 できない
(一度起 こつた馴化変異は元に戻らない)
13
●製造調整の柔軟性
>バ ンデミック時の緊急製造、供給 に対応可能
●卵馴化の抗原変異を回避または軽減可能
>小 規模な事前検討では、A(H3N2)ウイルスで起 こる卵馴化 ロ
抗原変異 の問題は回避できている
>A(H3N2)ワ クチン候補株 の確保が容易になる。これにより、
候補株の選択肢が広がる
>ヒ トの流行株 に抗原性が近いワクチン供給が期待される
し⇒製造過程で起 こるワクチン株 の変化によるワクチン
効果の低下が軽減される可能性がある
14
ワクチン製造株を各 ワクチン製造所 の培養細 胞 へ 馴化させる必要あり
>製 造効率を上げるためには、それぞれの培養細胞で継代馴化が必要
継代馴化 によつて、抗原変異 が起 こるウイルスが確認されている
>バ HlNl)pdm09ウイルスでは、MDCK細 胞での継代で抗原変異する
し⇒ 別の培養細胞でも同様の問題が起こるか、要検討
>継 代回数が増すにつれて、遺伝子変具の頻度が高まる
ワクチン製造株 の品質の担保をどのような仕 組み で実施するのか
>迷 入ウイルス否定試験の実施の仕組みが未定
>ワ クチン製造候補株の遺伝子解析、抗原解析
し⇒ ワクチン製造株を感染研に提出させて解析を実施して担保 ?
ワクチン株選定法 の見直 しが必要
>単 一の株指定では、培養細胞によつては、増殖しない可能性がある
>ワ クチン製造株の供給の仕組みについて検討が必要
し 現時点では、細胞分離のワクチン候補株の供給体制が未整備
15
1壺
型聾堕壁望空三ンザヮクチン令の
本
●細胞培養法 による季節性イ ンフル エ ンザ ワクチ ンの製造
お よび実用化 には、多 くの解決すべ き課題 が ある
●提供されるワクチン種ウイルスによつては、ワクチン製造 でき
ない製造所が出てくる
>ワ クチン種ウイルスと製造用細胞との相性の問題
●製造効率 の 問題
>現 行の卵製造ワクチンを超える製造効率を担保できるか不明
>国 内全体のワクチン供給量に影響する
●製造 コスト、ワクチン価格 の問題
>卵 製造では不要だつた項目の品質保証試験コストが必要
>現 行の卵製造ワクチンと同等のコストで供給できるか
細 胞培養 ワクチンの導入 に際 しては、課題 の検討結
果、導 入体制 の整備状況 に応 じて、慎重な判断 が必要
16
新 型インフルエンザワクチン生 産体制整備事 業
第 2次 事業 の追加 公募分 の採択結果 について
資料 8
<事 業概要 >
・
鶏卵培養法 では 1年 半 ∼2年 を要する全 国民分 の新型インフルエンザ ワクチン生産期間
を約半年 に短縮するため、細胞培養法 による新型インフルエンザワクチンを日本国内 にお
いて生産 ・
供給 できる体制構築を図るための事業
<追 加公募 の実施 について>
・
昨年開催 した研究開発及び生産 ・
流通部会での意見を踏まえ、新型インフルエンザ発生
に備え、国民の安心確保と危機管理の観点から、新型インフルエンザ等対策政府行動計
6か 月以内に全国民分のパンデミックワクチンを製造』できる体制をよ
画 に記載されている『
り確実に確保するため、不足の2,500万
人分について、再度、広く公募を実施することとした。
<評 価 委 員会 の 開催 状 況 >
平成 25年12月25日 追 加 公 募 実施 (〆切 :平成 26年2月 10日)
平成 26年 3月 6日 第 8回 評価 委 員会
3月 27日 第 9回 評価 委 員会
<採 択事 業者 の 基準 額 及びワクチン生 産 量 >
採択事 業者名
基 準額
ワクチ ン生 産量
(製造後半年の量)
一 般財 団法 人 化 学及 血 清療法研究所
18,198,653,963F可
1,700万人分 以 上
武 田薬品工 業株式会社
7,166,880,000円
800万 人分 以 上