Comments
Description
Transcript
クローンプールライブラリーを用いた目的クローンの迅速PCRスクリーニング
クローンプールライブラリーを用いた 目的クローンの迅速 PCRスクリーニング ゲノムライブラリーもしくは cDNA ライブラリーから特定の たクローンプールプレートの 1 ウェルを寒天培地に播き、得 塩基配列をもつクローンをスクリーニングする場合、一般的 られた 384 個のシングルコロニーについて 2 次 PCR スク には PCR やハイブリダイゼーションが用いられます。どちら の方法にも一長一短がありますが、特殊な技術が不要で簡便 リーニングを行った（図1）。 結果として、約 1 万クローンのライブラリーから、96 穴プ かつ迅速なのは PCR を用いる方法です。しかし、PCR では レート1枚と 384 穴プレート1枚の 2 度の PCR のみで10 数万クローン規模の多検体を処理するのに大きな労力がかか 遺伝子すべてについてフォスミドクローンを取得すること ることが最大のネックでした。 ができた。最終的に得られたフォスミドクローンをシーケン タカラバイオでは、以下の一連の作業を受託サービスとして シングにより塩基配列を確認し、目的の遺伝子配列がクロー 提供しております（弊社ホームページ、カスタムサービスの ニングされていることを確認した。 項参照） 。 【方法】 ・ライブラリー作製 ・ライブラリーから 50∼200 種類の任意のクローンを （1）フォスミドライブラリーの作製 ハタケシメジのゲノム DNA を使用し、フォスミドライブラ プールして増幅 リーを作製した。 ・目的遺伝子を PCR スクリーニング 本稿では、フォスミドライブラリーから10 種類の遺伝子をス クリーニングした例をご紹介します。 （2）クローンプールライブラリーの作製 フォスミドライブラリー（パッケージング液）を宿主大腸菌 に感染させ、形成されたコロニーを約100 種類ずつ増幅し ■本実験の概要 ハタケシメジよりゲノム DNA を抽出し、フォスミドライブラ リーを構築した。1 ウェルに約100 種類のクローンが含ま た後に 96 穴プレート 1 枚に整列化した。 （3）1 次 PCR スクリーニング れるように 96 穴プレート1枚分のクローンプールライブラ 10 遺伝子それぞれについて、80∼500 bpの増幅産物が得 リー（ゲノムサイズの約10 倍をカバー）を調製した。EST 解 られるようにプライマーを 1 組ずつ設計し、作製したクロー 析データより選択した10 遺伝子についてプライマーを設計 ンプールプレート 1 枚分の 96 ウェルのグリセロールストッ し、クローンプールプレートを使用して 1 次 PCR スクリー クを鋳型として TaKaRa Ex Taq ®（Code RR001A）を用い ニングを行った。それぞれの遺伝子に関してバンドの得られ て PCR 反応を行った。 【フォスミドライブラリーの作製】 【クローンプールライブラリーの作製】 （パッケージング液） （20%グリセロールストック） ・宿主大腸菌に感染 させて展開 ・約100 クローン ごとに増幅して プレートに整列化 a a 96 穴プレート ・ゲノムサイズの 10 倍をカバー 【コロニーピッキング】 a 384 穴プレート ・384 個のシングルコロニーを ピックアップし、グリセロール ストックプレートを調製する。 ・10 遺伝子それぞれについ て PCR スクリーニング用 のプライマーを設計する。 【2 次 PCR スクリーニング】 a ・シグナルの得られた クローンが目的遺伝 子がクローニングさ れているフォスミド クローンである。 図1 クローンプールライブラリーを用いた迅速 PCR スクリーニング法の概要 32 ● BIO VIEW No.48 【1 次 PCR スクリーニング】 ・増幅の確認で きたウェル を 1個選択し、そ のウェルを寒 天培地に播く。 a 【クローンの確認】 a ・2 次スクリーニングで選択した クローンのフォスミド DNA を調製し、 それを鋳型に再度 PCR。 ・フォスミド DNA を鋳型とし、 PCR に使用したプライマーを用いて シーケンシングを行い、塩基配列を確認。 ・制限酵素処理により同一クローンを選別。 （4）2 次 PCR スクリーニング 10 遺伝子それぞれについて、1 次 PCR スクリーニングで増 表1 PCR スクリーニングの結果一覧 遺伝子 1次スクリーニング 幅が認められたウェルのうちから任意の 1 ウェルを選択し、 No. ID ヒット数 選択した ウェル クロラムフェニコールを含む寒天培地に播いた。384 個の 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A C E G H I K L M N 18/96 14/96 6/96 6/96 24/96 4/96 32/96 14/96 5/96 10/96 G02 G02 G02 E07 F02 G01 G01 F09 F02 E07 シングルコロニーをピッキングし、384 穴プレート1枚分の グリセロールストックを調製した。各ウェルのグリセロール ストックを鋳型とし、1 次スクリーニングで使用したプライ マーを用いて TaKaRa Ex Taq ® による PCR を行った。 （5）クローンの確認 増幅が認められたクローンについて、フォスミド DNA を調 製し、それを鋳型として再度 PCR で確認した。その後、スク 2 次スクリーニング ヒット数 1/384 1/384 2/384 1/384 1/384 4/384 5/384 4/384 1/384 2/384 ＊ 目的クローン G04 O21 A04, P06 M01 N12 C13, H15, J15, N19 C16, H18, I19, J16, M01 E20, F14, G05, N04 H04 A09, O23 ＊：各遺伝子について1クローンのみ（下線）をシーケンス確認に使用した。 リーニングに使用したプライマーを用いてシーケンシング による確認も行った。 【結果と考察】 （1）フォスミドライブラリーの作製 調製したフォスミドライブラリーについては、タイターが高 く、平均インサート長も約 43.5 kbp で、かつそのサイズの 分布も均一であったため、良質のライブラリーであると判断 した。得られたクローンは約 43 万 7 千クローンであった。 今回の結果である1∼ 5 クローンはその想定数の範囲内と言 える。 （5）クローンの確認 2 次スクリーニングで複数のクローンが得られた 5 遺伝子 （E、I、K、L、N）のクローンについて制限酵素処理後、電気 泳動によりバンドパターンを比較したところ、一種類の遺伝 子のスクリーニングで得られた複数のクローンは、すべて同 一の制限酵素パターンを示した。このことから、複数個得ら （2）クローンプールライブラリーの作製 れたクローンはすべて同一のクローンであることが示唆され ハタケシメジのゲノムサイズを 40 Mbとすると、以下の計算 た。そこで 10 遺伝子のそれぞれについて1クローンずつを により 96 穴のクローンプールプレート 1 枚でゲノムサイズ 選択して塩基配列を確認したところ、すべてのクローンで目 の約10 倍をカバーしていることになる。 的遺伝子配列がクローニングされていることが確認できた。 43.5 kb × 100 clones × 96 well ／ 40 Mb ＝10.44 倍 （3）1 次 PCR スクリーニング 電気泳動の結果、10 遺伝子すべてにおいて、鋳型とした 96 ウェルのうち 5 ∼ 32 ウェルで増幅が確認できた（表1） 。 プレート 1 枚でゲノムサイズの約10 倍をカバーしていると いう計算上、ゲノム上に遺伝子が 1コピーあるのなら10 ウェ ル前後がヒットしてくると考えられるので、遺伝子 A、H、K 以外のほとんどは想定数の範囲であると考えられる。ただ し、この 3 遺伝子に関しては、 18 ウェル以上で増幅が見られ ■まとめ 以上のように、クローンプールライブラリーを用いた PCR スクリーニング法により、それぞれ 96 穴プレート 1 枚と 384 穴プレート1枚の 2 度の PCR のみで、約1万クローン のフォスミドライブラリーから、10 種類の目的遺伝子がク ローニングされたフォスミドクローンをすべて単離すること ができました。ご参考のために、本解析の場合の受託作業料 金を以下に示します。 ていることから、ゲノム上に複数コピーの遺伝子が存在する、 ・ゲノム DNA 調製 ¥100,000 ∼ もしくはクローニングバイアスがかかりやすくクローニング ・フォスミドライブラリー作製 ¥500,000 ∼ されやすい領域に存在する可能性が示唆された。 ・クローンプールライブラリー作製（96穴プレートあたり）∼¥48,000 （4）2 次 PCR スクリーニング 10 遺伝子それぞれについて 384 穴プレート 1 枚分の PCR ・ PCR スクリーニング（1遺伝子あたり） ¥70,000 ・フォスミドクローンのシーケンス解析（2リード） ¥17,000 を行って電気泳動をしたところ、鋳型とした 384 クローン クローンプールライブラリーは、フォスミドライブラリーの のうち 1∼ 5 クローンで目的の大きさの DNA 断片が得られ みならず、cDNA や BAC ライブラリー等からでもスクリー た（表1）。 ニング可能です。お気軽にお問い合わせください。 今回のクローンプールプレートは 1 ウェル当たり約100 種 類のクローンが含まれるように調製しており、もし 1 次スク 【お問い合わせ先】 リーニングでヒットしたクローンがそのウェルに1 種類含ま タカラバイオ（株）ドラゴンジェノミクスセンター TEL：0593-29-8560 FAX：0593-29-8556 れるのであれば、2 次スクリーニングでは100 個に1 個、つ まり 384 個では 3.8 個のクローンが得られる計算になる。 BIO VIEW No.48 ● 33