生体試料中分析および皮膚透過性 について

ナノマテリアルの安全性確認における
健康影響評価手法の確立に関する研究
生体試料中分析および皮膚透過性
について
徳永 裕司（国立衛研・環境衛生化学部）
１．フラーレンの生体試料中の分析に
ついて
２．酸化チタンの経皮吸収について
フラーレンの生体試料中の分析について
はじめに
ナノマテリアルの応用分野
フラーレン、カーボンナノチューブをはじめとするナノマテリアルはさまざまな分野
で応用されているが・・・
注目の度合い
ナノマテリアルのベネフィットの面がおもに注目されており、対するリスクの面につ
いての評価・調査研究は始まったばかり・・・
フラーレンの生体試料中の分析について
はじめに
フラーレンについて
＊グラファイト、ダイヤモンドにつぐ炭素同素体
＊直径1nmの球状分子
＊自然界にも存在
＊有機溶媒に可溶
フラーレンの有用性について
＊金属ドープ、化学修飾が可能
＊ラジカル種を捕集する
＊酵素活性を阻害する
・
・
・
抗ガン剤、抗エイズ剤等、
医薬品に応用されつつあ
る
産業用ナノマテリアル
の安全性評価？？
フラーレンの生体試料中の分析について
研究計画（対象物質：フラーレン（無修飾C60））
検討項目1：分析条件の確立
分析機器：LC-MS and/or LC-MS/MS
＊分離カラムの検討
＊移動相の検討
＊定量イオンの選択
＊その他の諸条件検討
定量下限値を決定
検討項目2：生物試料を対象とした分析法の確立
抽出法：組織からの抽出法の検討
抽出液のクリーンナップ
フラーレンの生体試料中の分析について
研究計画（対象物質：フラーレン（無修飾C60））
検討項目1：分析条件の確立
分析機器：LC-MS/MS
＊プローブ、イオンモードの選択
→APCI ネガティブイオンモード
＊定量イオンの選択
→m/z = 720
＊分離カラム、移動相の検討
→ODS系逆相カラム
→移動相（メタノール、アセトニトリル、トルエン等）
グラジエント法の検討
フラーレンの生体試料中の分析について
分析条件の検討（LC-MS/MS）
◇HPLC
装置：Waters Alliance 2695
☆カラム：Waters Atlantis dC18 or
Develosil RPFULLERENE（C30）
☆移動相
ポンプA
ポンプB
トルエン
アセトニトリル
トルエン：2-プロパノール（ 9 ： 1 ）
2-プロパノール
（アイソクラティック法）
☆流量：0.2∼1ml/min
☆注入量：5∼50μl
フラーレンの生体試料中の分析について
分析条件の検討（LC-MS/MS）
◇MSD
装置：Waters Micromass Quattro micro API
イオン化：APCI（ネガティブ）
C60
プレカーサイオン プロダクトイオン
720
720
Cone
120
Coll Energy
60
C70
840
840
120
Corona(uA)： 15 ; プローブ温度（℃）：400
＊C70はサロゲートとしての使用を想定しており、 C60と同一条件
で分析が可能であるかどうかを検討した。
60
フラーレンの生体試料中の分析について
移動相の条件の検討
◇移動相
A：トルエン： 2-プロパノール
（ 9： 1）
B：2-プロパノール
◇分離カラム
Atlantis dC18
◇流速
0.2ml/min
◇注入量
5μ l
◇カラムオーブンの温度
40℃
C60
C70
A：30％
B：70％
A：40％
B：60％
A：50％
B：50％
フラーレンの生体試料中の分析について
移動相の条件の検討
◇移動相
A：トルエン
B：アセトニトリル
C70
C60
A：40％
B：60％
◇分離カラム
Atlantis dC18
◇流速
0.2ml/min
A：50％
B：50％
◇注入量
5μ l
◇カラムオーブンの温度
40℃
A：60％
B：40％
フラーレンの生体試料中の分析について
分離カラムの検討
◇移動相
A：トルエン
B：アセトニトリル
C60
C70
A：70％
B：30％
◇分離カラム
Develosil RPFULLERENE
◇流速
1ml/min
◇注入量
5μ l
◇カラムオーブンの温度
30℃
A：60％
B：40％
フラーレンの生体試料中の分析について
C60
注入量の検討
◇移動相
A：トルエン
B：アセトニトリル
50μl
40μl
◇分離カラム
Develosil RPFULLERENE
30μl
◇流速
1ml/min
20μl
15μl
10μl
5μ l
C70
フラーレンの生体試料中の分析について
検討結果のまとめ
◇分離カラム
Develosil RPFULLERENE
C60
◇移動相
A：トルエン：70％
B：アセトニトリル：30％
アイソクラティック法
C70
◇流速
1ml/min
◇カラムオーブンの温度
30℃
◇注入量
20μｌ
◇分析時間
20min
フラーレンの生体試料中の分析について
検討結果のまとめ
1000
◇分離カラム
Develosil RPFULLERENE
◇流速
1ml/min
y = 4.0399x + 111.39
2
R = 0.9993
800
700
y = 3.8955x + 42.079
2
R = 0.9993
600
面積値
◇移動相
A：トルエン：70％
B：アセトニトリル：30％
アイソクラティック法
C60
900
500
C70
400
300
◇カラムオーブンの温度
30℃
◇注入量
20μｌ
◇定量下限値
20μg/L
◇分析時間
20min
200
100
0
0
50
100
150
濃度（μ
濃度（μg/L）
/L）
200
250
フラーレンの生体試料中の分析について
研究計画（対象物質：フラーレン（C60））
検討項目2：生物試料を対象とした分析法の確立
抽出法：組織からの抽出法の検討
→組織にフラーレンを添加し、ホモジナイズして溶媒
（トルエン等）で振とう抽出、濃縮操作→測定溶液の調整
（移動相で希釈等）
→クリーンナップの操作（？）
フラーレンの生体試料中の分析について
組織からの抽出法
組織（50
∼150mg）をホモジナイズ管にとり、
0.01M SDSを
組織（50∼
150mg）をホモジナイズ管にとり、0.01M
SDSを0.5ｍ
0.5ｍL、
サロゲートのC70
を加え静かにホモジナイズする
サロゲートのC70を加え静かにホモジナイズする
ホモジネートを遠沈管に移し、
トルエン1mL
×5回、酢酸0.5mL
で洗いこみする
トルエン1mL×
回、酢酸0.5mLで洗いこみする
2分間振とうし、その後15
分間超音波処理する
分間振とうし、その後15分間超音波処理する
遮光し、室温で5
遮光し、室温で5時間振とうする
2分間振とうし、その後15
分間超音波処理する
分間振とうし、その後15分間超音波処理する
2000ｇで遠心分離後、トルエン層をSPC
に分取する
で遠心分離後、トルエン層をSPCに分取する
トルエン5ml
を加え、2
2分間振とうし、その後15
分間超音波処理する
トルエン5mlを加え、
分間振とうし、その後15分間超音波処理する
2000ｇで遠心分離後、トルエン層をSPC
に合わせる
で遠心分離後、トルエン層をSPCに合わせる
抽出液（10mL
）を窒素気流下で濃縮し、1mL
1mLの一定量とする
の一定量とする
抽出液（10mL）を窒素気流下で濃縮し、
フラーレンの生体試料中の分析について
組織からの抽出法
脳
肝臓
標準試料
標準試料
マウスの肝臓、脳をもちいて
フラーレンの添加回収試験を行った。
＊組織にフラーレンのトルエン溶液
(1mg/L溶液を
0.5ml))を添加し、
(1mg/L溶液を0.5ml
その後抽出操作をした。
回収率
脳：94.6
％（C60
C60）、
）、82.0
82.0％（
％（C70
C70）
）
脳：94.6％（
肝臓：85.2
％（C60
C60）、
）、96.0
96.0％（
％（C70)
C70)
肝臓：85.2％（
→良好な回収率を得た
＊妨害ピークは観察されず
→クリーンナップは不要！
酸化チタンの経皮吸収について
目的
ナノマテリアルは、近年、紫外線遮へい剤の酸化
チタンとして化粧品分野への応用が急速に進んで
いる。しかし、ナノマテリアルの生体影響については
不明な点が多い。
酸化チタンの培養細胞に対する安全性及び経皮
的な透過性を検討する観点から、培養細胞あるい
は３次元培養ヒト皮膚モデルに粒子径の異なる酸
化チタンを暴露し、細胞毒性及び透過性を検討し
た。
酸化チタンの経皮吸収について
測定に用いたサンプル
微粒子酸化チタン： LU-175
平均粒子径
： 20 nm
結晶形
：ルチル型、コーティング無し
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
通常酸化チタン
平均粒子径
結晶形
： LU-205
： 250 nm
：ルチル型、コーティング無し
酸化チタンの経皮吸収について
CHO細胞を用いた毒性試験
CHO細胞（5×104 cells/mL）を96穴マイクロプ
レート（表面積0.5 cm2/well）に0.1 mLずつ播種し、
37℃、２日間培養後、LU175及びLU205を分散
した培地（RPMI 1640-10% FBS）0.1 mLを添加
し24時間培養した。
培地を除き、培地で５倍希釈したテトラカラーワン
0.1 mLを加えて２時間培養し、475 nm付近の吸
光度を測定し、細胞の生存率を測定した。
酸化チタンの経皮吸収について
CHO細胞中の酸化チタンの存在部位
CHO細胞（5×104 cells/mL）を60 mm 皿に５ mLずつ播種し、37℃で２
日間培養した。LU175あるいはLU205の0.2％を分散した培地5 mLを60 mm
皿に添加し24時間培養した。ＰＢＳで５回細胞を洗浄した。
トリプシンで処理して細胞をはがし、５分間、超音波を照射した。細胞膜を破
砕した後、3,000 rpm 10分遠心分離を行い、得られた沈殿を５mLのPBSに
懸濁し、9,000 gで10分間遠心分離を行った。上清を更に4℃で100,000 g
で1時間遠心分離した。 ①100,000 gで得られた沈殿（ミクロゾーム）並びに②
9,000 gの遠心分離で得られた沈殿（膜画分）に濃硝酸を５ mL加えて２時間
放置した。マイクロウエーブオーブンで沈殿を湿式分解した後、 酸化チタンの
含量をICP-MSで測定した。
一方、 100,000 gで遠心分離して得られた上清（サイトゾール）に硝酸を最
終濃度が７％になるよう加え、 酸化チタンの濃度をICP-MSで測定した。
酸化チタンの経皮吸収について
３次元培養ヒト皮膚モデルでの透過実験
0.1 mL of LU175 or LU205 0-1% in medium
Plastic ring (0.5 cm2 )
24 well plate
0.5 mL of medium
Vitrolife-skin 37℃,1-24 hr
Medium: ①LDH assay
②ICP-MS
Cells: HE staining
酸化チタンの経皮吸収について
ICP-MSの測定条件
ICP-MS (HP-4500) conditions
RF power
RF refraction current
Plasma gas current
Carrier gas current
Peri pump
Monitaring mass
Integrating interval
Sampling Period
:1250W
: 5W
: 15 L/min
: 0.85 L/min
： 0.2 rps.
: m/z 48 (Ti)
: 0.1 sec.
: 0.31 sec.
酸化チタンの経皮吸収について
マイクロウエーブオーブンで湿式分解前後での
Ｔｉのカウントの相違
25000000
before digestion
after digestion
count
20000000
15000000
10000000
5000000
0
LU175 500 ppb
LU205 500 ppb
Effect of digestion on LU175 and LU205 count
酸化チタンの経皮吸収について
ICP-MSによる酸化チタンの検量線
30000000
LU175
y = 49854.804x - 426703.881 r = 0.999
LU205
Ti
20000000
count
検出限界 LU175:1.4 ppb, LU205: 0.8 ppb
10000000
y = 8488.051x - 85562.020 r = 0.999
y = 2547.392x + 6235.925 r = 1.000
0
0
100
200
300
400
500
600
Calibration curves of LU175, LU205 and Ti
TiO 2 conc.(ppb)
酸化チタンの経皮吸収について
CHO細胞に対する細胞毒性
125
LU175
LU205
Viability (%)
100
75
ＩＣ５０
LU175: 0.12%
LU205: >1%
50
25
0
0.01
0.10
1.00
TiO 2 concentration(%)
Fig.1
Effect of crystal size of TiO 2 on viability against CHO cells
酸化チタンの経皮吸収について
CHO細胞中の酸化チタンの存在部位
酸化チタン濃度 (μg/well)
細胞膜画分
ミクロソーム画分
サイトゾール画分
LU175
酸化チタン存在比（％）
細胞膜画分
ミクロソーム画分
サイトゾール画分
LU175
LU205
62.9
0.22
0.17
870
1.2
0.32
LU205
99.4
0.35
0.25
99.8
0.13
0.07
酸化チタンの経皮吸収について
酸化チタンの３次元培養皮膚モデルに対する透過性
1h
LU175
LU175
LU175
LU175
LU205
LU205
LU205
LU205
0.1%
0.2%
0.5%
1%
0.1%
0.2%
0.5%
1%
430
814
1150
796
226
466
320
268
1h
LU175
LU175
LU175
LU175
LU205
LU205
LU205
LU205
0.1%
0.2%
0.5%
1%
0.1%
0.2%
0.5%
1%
0.43
0.41
0.23
0.08
0.23
0.23
0.06
0.03
透過量（ｎｇ/cm2）
0-2h
0-4h
0-24h
788
1236
1630
1144
1796
2348
1550
1836
2440
1068
1402
1746
332
398
674
612
728
928
668
954
1264
456
730
1012
透過率（％）
0-2h
0-4h
0.79
0.57
0.31
0.11
0.34
0.3
0.13
0.05
0-24h
1.2
0.9
0.37
0.14
0.41
0.36
0.19
0.08
1.6
1.2
0.49
0.17
0.69
0.46
0.25
0.11
酸化チタンの経皮吸収について
酸化チタンの３次元培養皮膚モデルに対する透過性
3000
LU175 0.1%
LU175 0.2%
LU175 and LU205 penetrate amount (ng/cm 2 )
LU175 0.5%
2000
LU175 1%
LU205 0.1%
LU205 0.2%
1000
LU205 0.5%
LU205 1%
0
0
4
8
12
16
20
24
Incubation time (h)
酸化チタンの経皮吸収について
まとめ
１．粒子径の小さい酸化チタンは大きいものに比較して単層培
養細胞に対する細胞毒性が強く、IC50は0.12%であった。
２．Vitrolife-skinの経皮吸収試験では、LU175の0.5%の懸濁液
を用いた場合、2440 ng/cm2の酸化チタンがreceivor側に観
察されたが、細胞毒性は見られなかった。
３．角層のバリヤー機能により酸化チタンの吸収が制限され、皮
膚モデルに与える影響は小さいことが示された。
４．酸化チタンが細胞内にある程度移行することが示された。