...

PF ビームライン 6B および 6C における Cocksfoot mottle virus

by user

on
Category: Documents
6

views

Report

Comments

Transcript

PF ビームライン 6B および 6C における Cocksfoot mottle virus
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
PF ビームライン 6B および 6C における
Cocksfoot mottle virus の X 線データ収集
難波一徳 1,2,*, 藤井佳史 1, 藤本瑞 1, 御子柴義郎 3, 水野洋 1
(1 独法生物研, 2 筑波大院バイオ, 3 独法農研機構)
1
背景
コックスフットモットルウイルス(Cocksfoot mottle virus ; CfMV)は Sobemovirus
に属する、直径 28nm の球状 RNA ウイルスであり、主にイネ科植物に感染し黄
色いモザイク状の病斑を呈する。欧州では既に 1964 年に Serjeant らにより同定
され、その他にも、Cocksfoot mild mosaic virus、Cocksfoot streak virus など同
Sobemovirus に属するウィルスが次々と同定されている。本研究で用いた CfMV
は、1978 年に岩手県盛岡市、栃木県西那須野地方、長野県伊那地方で発生が確
認され、オーチャードグラスのモザイク病から、血清学的方法により同定され
た 2)。特に CfMV 等の Sobemovirus は極めて安定で容易に汁液伝染するため、こ
れら Sobemovirus 属
による作物被害は欧州においても大きな問題となってお
3) 4)
り、防除の試みの一環として、核酸の解析、血清学的研究が進められている。
現在 CfMV ファミリーは全部で8種類同定されているが、本研究で用いられた
サンプルは岩手県盛岡市で発見された CfMV 盛岡株(日本分離株)を用いた。
CfMV の病徴は極めて顕著である。特に気温の低い初春や晩秋には症状は極め
て明瞭であり、植物体全体がクロローシスの症状を呈している株は、離れてい
る場所からでも容易に発病が認められる。晩秋において罹病株は枯れの程度が
顕著であり、株全体がやや開いた形となる。夏期、生育の良好なときには症状
が不明瞭なことが多いが、明瞭にモザイク症状を呈している株も見られる。ま
た一株のうち、一部のみ発病していることも少なくない 2)。CfMV に感染した罹
病株の病徴は、CfMV の種類、また宿主植物種により様々である。軽徴なモザイ
ク症状を呈するもの、鮮明なモザイク症状を呈するもの、激しい壊疽病斑を呈
するものなど多様な病徴を示す。感染宿主として、オーチャードグラス
(*現阪大蛋白研)
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
(品種:アキミドリ)、コムギ(品種:フジミコムギ、赤笑出)、オオムギ(品
種:竹林茨城2号)、ライムギ(品種:ぺトクーザ)、エンバク(品種:前進)
などに顕著な感染発病がみられている。特にオーチャードグラスとコムギには
汁液伝染により 80∼90%の確率で感染発病する。コムギは特に感受性が高く、
白色のストリーク・モザイクの病斑を呈する本ウイルスの検定植物として利用
できる。
2
ウイルスの精製・結晶化
2-1 精製
CfMV を汁液接種し、10日後のコムギ病葉 100g をホモジェナイズし、クロ
ロホルムによる清澄化を行なった。6,300G / 20min で遠心操作を行い、さらに上
清を 12,300G / 100min で遠心操作し沈澱物を回収し、0.1M ホウ酸緩衝液により
懸濁した。4℃下で一晩靜置し、ショ糖密度勾配遠心(10-40% sucrose)により分離
し、ウイルス画分を回収した。90,000G / 60min で遠心操作を行い、沈殿物を純
化ウイルス試料とした。100g の病葉から平均 19.7mg の精製 CfMV を得た。
2-2 結晶化
X 線結晶解析では X 線回折による反射を得るために、サンプルの結晶化を行
なわなければならない。CfMV の結晶化は常法であるハンギングドロップ蒸気拡
散法、シッティングドロップ法、バッジ法などで検討を行ったが、最終的に2
層の比重の異なるオイル中に沈澱剤と CfMV 試料液のドロップを作成しウイル
スの結晶化を行なう方法を用い、0.1M-Tris、pH7.0、8% PEG10000、50mM NaCl、
20℃の条件下約30日で、1.0mm 大の良質の結晶を得た(Fig.1)。
Fig.1 CfMV の結晶
[0.8×0.8×1.0mm]
5% PEG10000 , 0.1M Tris-HCl
50mM NaCl , pH7.0, 20℃の条件下で作成
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
3
X 線測定(BL6B)
X 線測定は高エネルギー加速器研究機構の放射光施設 BL6B で大型 IP (400×
800mm)および巨大分子用坂部式ワイセンベルクカメラを用いて行なった。
3-1 X 線反射強度測定の結果
X 線波長 1.0Å、コリメーター径 0.2mm、カメラ半径 976.9mm、1フレームの
測定範囲 0.5°、露光時間 166.7 秒で測定を行ったところ、最大 3.2Å分解能のX
線回折像を得た(Fig.2)。測定条件を以下に示す。
施設 BL6B での X 線回折実験の測定条件
結晶の大きさ(mm)
0.8×0.8×0.8
温度(℃)
20
コリメーター径[φ] (mm)
0.2
X 線波長(Å)
1.00
カメラ距離 (mm)
976.9
カメラ半径 (mm)
572.7
測定範囲[ω](°)/フレーム
振動速度 (deg / sec)
0.5
0.003
重なり度 (°)
0
露光時間 (sec)
166.7
3-2 結晶学的パラメーターの計算
X 線回折データの処理は Silicon Graphics 社製のワークステーションを使用し
た。またデータ処理ソフト DENZO、SCALEPACK5)、MOSFLM6)を使用した。
DENZO に よ り 得 ら れ た 各 イ メ ー ジ か ら の 回 折 デ ー タ を プ ロ グ ラ ム
SCALEPACK により、スケーリング及びマージングを行った。CfMV では、3.5
Åの分解能を示す反射が得られ、その場合1枚の Imaging Plate(0.5°)につき
40000 以上の反射数が確認され、データの処理を行う際には SCALEPACK の中
でも scalepackenormous を使用した。
指数付けの結果、CfMV の結晶は a=760.3(Å)、b=760.5(Å)、c=620.6(Å)の斜
方晶系であることが解った。結晶がX線ダメージをうけるため、今までのとこ
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
ろデータセットは一部しか得られていない。
解析データ処理の結果
Cell parameter
C222
a=760.3(Å) b=760.5(Å) c=620.6(Å)
Resolution
100∼4.0(Å)
4.3∼4.0(Å)
R-marge
18.8%
37.3%
Completeness
22.6%
14.8%
334492
43592
Unique reflections
⇦
Fig.2
CfMV の回折データ
[放射光施設 BL6B 大型 IP による]
矢印は 3.5Åの分解能位置
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
X 線測定(BL6C)
4
最近(平成 13 年 6 月 30 日)、BL6C に新たに設置されたワイセンベルクカメラ
6 号機 Galaxy を利用してデータを測定する機会を得た。
4-1 X 線反射強度測定の結果
X 線波長 0.898Å、コリメーター径 0.2mm、カメラ半径 400.0mm、1フレーム
の測定範囲 0.5°、露光時間 180.0 秒、oscillation で測定を行ったところ、最大反
射強度 3.4Å分解能の反射回折像を得た(Fig.3)。以下に測定条件を示す。
施設 BL6C での X 線回折実験の測定条件
結晶の大きさ(mm)
0.6×0.6×0.5
温度(℃)
20
コリメーター径[φ] (mm)
0.2
X 線波長(Å)
0.898
カメラ距離 (mm)
400.0
測定範囲[ω](°)/フレーム
振動速度 (deg / sec)
0.5
0.0028
重なり度 (°)
0
露光時間 (sec)
180.0
4-2 考察
Galaxy で常温測定下最大 3.4Åの回折を得た。一つの結晶で最大 45 枚のイメ
ージデータを連続して得ることができ、10shot まで平均分解能は約 3.7Åであっ
た。Galaxy はカメラ距離 400.0mm であり、BL6B のワイセンベルクカメラで測定
した際のカメラ距離 967.9mm の約半分である。CfMV 結晶の格子定数は a=760.3,
b=760.5, c=620.6(Å)と大きく、0.5°(ω)分の反射数は 40,000 以上にもなるため、
反射データがオーバーラップする可能性を予想していた。しかしながら実際は、
反射データは低角から 3.7Å付近まで非常によく分離しているように見える
(Fig.3,4)。現在のところ、今回のデータの指数付けには至っておらず、データの
評価ができないが、近い将来解析プログラムの整備等により、本ワイセンベル
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
クカメラでの超分子複合体、ウイルスなどの超分子のデータ収集も可能になる
と思われる。Galaxy は IP の読み取りが自動化されているので、データの連続測
定が可能である。またクライオ条件下のデータ測定も可能になっているため、
クライオ条件が確立されていれば、重なりを少なくするための小さい振動角で
の測定等、少数の結晶でも良質な巨大分子X線データの収集が容易になると思
われる。Galaxy が早く一般使用可能になることを期待する。
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
参考文献
1) 鳥山重光,與良清.日植病報. 45, 565(1979).
2)鳥山重光,日植病報. 48, 514-520(1982).
3)Catherall, P.L. C.M.I./A.A.B.Descriptions of Plant Viruses. No.23(1972).
4)Huth,W. C.M.I./A.A.B.Descriptions of Plant Viruses. No.107(1972).
5)Otwinowski, Z. Oscillation Data Reduction Program'', in Proceeding of the
CCP4 Study Weekend: ''Data Collection and Processing, '' Compiled by:
Sawyer,L.,Isaacs, N., and Bailey, S., SERC Daresbury Laboratory, England,
56-62(1993).
6) The Rossmann Fourier autoindexing algorithm in MOSFLM.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1999 Oct;55 ( Pt 10):1690-5.
構造生物 Vol.7 No.2
2001 年9月発行
PMID: 10531518
Fly UP