大腸癌におけるKRAS,BRAF遺 伝子突然変異 とDNAメ チル化

岡 山医学会 雑 誌
第117巻September2005,
pp.
97-103
平 成16年 度 岡 山 医学 会 賞(山
大 腸 癌 に お け るKRAS,BRAF遺
永 坂 岳 司*,松
内 田 卓 之,石
能 登 原 憲司,磯
原 長 秀,笹
井 龍 宏,長
崎 博 司,田
伝 子 突 然 変 異 とDNAメ
本 博 美,高 畑 隆 臣,竹
尾 厚 樹,小 南 賢吉 郎,中
中 紀 章
田 正 範,木
川 仁 志,神
田 賞)受 賞 論文
チ ル化
村 圭 吾
原
健
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 消化器 ・腫瘍外科学
キ ー ワ ー ド:Co1orectalCancer,MSI,DNAMethylation,
KR4S
mutation,、
BRAF
mutation
の 原 因 に な る と考 え られ る.本 稿 で は,大
は じ め に
に,我
こ の 約10年 間 に お い て 遺 伝 子 情 報 に 関 す る研 究 は 飛
躍 的 な 進 歩 を 示 し た.そ
の 一 つ に は,全
ノ ム(実
解 読 さ れ た と し て,2003年4
際 は98.8%)が
し て,こ
ヒュー マ ンゲ
の 宣 言 は,本
ス トゲ ノ ム 時 代 の 到 来 を 意 味 し た.そ
々 の 得 た デ ー タ を 含 め て,Geneticの
異 常 を示
す マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト不 安 定 性 (Microsatellite
insta-
bility;MSI),RAS/RAF/ERKpathwayの
異,そ し てEpigeneticの
月14日 に ヒ ュ ー マ ン ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トの 終 了 が 宣 言
さ れ た こ と で あ る.そ
腸 癌 を 中心
突然 変
異 常 を示 すDNAmethylation
の 関 連 性 に つ い て 概 説 す る.
格的なポ
マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト不 安 定 性
の ポ ス トゲ ノ ム
(Microsatellite
instabil-
ity:MSI)
研 究 の 一 分 野 と して 「エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク (epigenetic)」
が 注 目 さ れ て い る.近
年,様
々 な種 類 の癌 や他 の 多 因
子 疾 患 の 細 胞 中 の ゲ ノ ムDNAま
て い る ピ ス トン に,メ
た はDNAと
1993年,マ
結合 し
イ クロ サ テ ラ イ ト不 安 定 性 (Microsatellite
instability;MSI)と
チ ル化 や ア セ チ ル化 な どの酵 素
現 在 呼 ば れ る腫 瘍 に 特 徴 的 な塩 基
配 列 の 異 常 が 報 告 さ れ た3).マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト不 安 定
的 な 修 飾 の 変 化 ま た は 異 常 が 報 告 さ れ て い る1).こ の よ
性 とは,DNA中
う な 修 飾 は 遺 伝 子 の 転 写 や 発 現 に 影 響 を 与 え る と考 え
反 復 配 列 の 異 常 を 言 う.具 体 的 に は,あ
ら れ,こ
に お い て はCAの
れ が 疾 患 の 発 病 原 因 の ひ とつ で は な い か と推
の マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト(microsatellite)
る種 の 癌 細 胞
繰 り返 し配 列 等 に 代 表 さ れ る マ イ ク
定 さ れ て い る2).こ れ ら の 修 飾 は エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク と
ロ サ テ ラ イ トの 反 復 回 数 が,正
呼 ば れ,正
多 くな っ た り,少 な くな っ た り して い る.こ う し たDNA
常 な生体 細 胞 に お い て は生 体 維 持 の た め に
必 要 な メ カ ニ ズ ム で もあ り,そ
の 異 常 は 疾 患(癌 な ど)
常 細 胞 の それ に比べ て
内 の 繰 り返 し配 列 異 常 を マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト不 安 定 性
(microsatellite
instability,MSI)と
呼 ぶ.MSIは
す べ て の 癌 に 認 め ら れ る わ け で は な く,こ のMSIを
平 成17年6月
*Division of
受理
Gastroenter01ogy
,Bay1or
University
Medical
高 頻 度 に 認 め る 癌 はMSI-H(microsatellite
Center,
3500Gast0nAve,DallaSTX75246
instability-high)と
定 義 さ れ る.MSI-Hは,遺
伝性
電 話:214-820-2692
E-mai1:[email protected]
大 腸 癌 の1つ
jp
で あ る 遺伝 性 非 腺 腫 性 大 腸 癌
(Lynch
◆ プ ロ フ ィール ◆
永坂
岳司
平 成7年 岡 山大 学 医学 部 卒 業.平 成7年4月
所 属.平 成9年4月
か ら平 成9年3月
の2年 間 は岡 山大 学 医 学部 麻 酔 ・蘇 生科 学 教 室 に
に岡 山大 学 医学 部消 化 器 ・腫 瘍 外 科 学教 室 に入局.平 成11年4月
科 入 学.平 成12年 か ら,大 腸癌 を 中心 と した消 化器 癌 の 研 究 を始 め る.平 成16年3月
田中 紀 章教 授 の 御 高配 に よ り,米 国 テ キサ ス 州 ダ ラス にあ るBay-or
Boland先
生 の下 にResearch
Fellowと
して留 学.現 在 も留 学 中 で あ る.
97
に 岡 山大 学 大学 院 医 学 研究
同 卒業 .平 成16年10月 か ら,
University Medical Centerの
Richard C .
syndrome/hereditary
nonpolyposis
cer[HNPCC])に
確 認 さ れ4-6),ま
(mismatch
で あ り,そ
colorectalcan-
た,DNAミ
repair
protein)を
ドす る 遺 伝 子(MMRgene)の1つ
dr0me/HNPCCの
RAS/RAF/ERKpathway
mutation)がLynchsyn-
Ras蛋
原 因 であ る こ と も同年 に報 告 され
た ろ8).MSI-HはLynch
syndrome/HNPCC以
大 腸 癌 に も 認 め ら れ,大
腸 癌 の10∼20%に
白 の1つ
で あ るKR24S遺
膵 臓 癌 で は95%,大
外 の
腸 癌 で は30∼50%存
癌,子
す るRaf蛋
白 の1つ
が メ ラ ノ ー マ で は66%,大
れ る.こ
とが 報 告 さ れ た22).ま た,同
に 認 め ら れ るMSI-Hは
外 の 大 腸癌
現 在,sporadicMSI-Hと
下 流 に位 置
伝 子 の突 然 変 異
腸 癌 で10%存
在 して い る こ
時 に 大 腸 癌 で はMMRの
伝 子 の突 然 変 異
を伴 う こ と も示 され た23).興味 深 い 事 実 と して はKRAS
チ ル 化(DNA
シ ン 塩 基 の5位
遺 伝 子 の 突 然 変 異 を伴 う癌 はBRAF遺
methylation)
哺 乳 類 のDNAに
伝 子 の突 然 変
異 を 伴 わ な い とい う こ と で あ る.ま た,こ のBNAF遺
お い て は,主
にCpG配
列の シ ト
伝 子 の 突 然 変 異 はsporadicMSI-H癌
に メ チ ル 基 が 付 加 さ れ る こ と を 言 う.
そ し て,哺 乳 類 のCCGGと
%が
のRasの
欠 損 して い る癌 群 に 高 率 にBRAF遺
分
類 さ れ る.
DNAメ
在 す る こ とが
で あ るBRAF遺
宮 内 膜 癌 に お い て も大 腸 癌 とほ ぼ 同 様 の 頻 度 で 認 め ら
syndrome/HNPCC以
伝 子 の突 然 変 異 は
知 られ て い る18-21).2002年 に,そ
認 め られ る
こ と が 報 告 さ れ て い る9,10).大 腸 癌 以 外 の 癌,胃
のLynch
伝 子 のプ ロ モー
れ て い る16,17)(図1a-e).
コー
で あ るhMSH2の
生 殖 細 胞 変 異(Germline
原 因 の 多 くは
で あ るhMLH1遺
タ ー 領 域 の メ チ ル 化 に よ る 遺 伝 子 の 不 活 性 化 と考 え ら
ス マ ッチ 修 復 蛋 白質
protein;MMR
し て,SporadicMSI-Hの
MMRgeneの1つ
認 め られ る特 徴 で あ る こ と もす ぐに
に特 徴 的 であ る
こ と も す ぐ に 解 明 さ れ た24,25).Lynch
HNPCCに
い う配 列 に お い て は55∼70
お い て はBRAF遺
ら れ ず,KRAS遺
メ チ ル 化 さ れ て い る11,12).メチ ル 化 を 認 め な いCpG
syndrome/
伝 子 の突 然 変 異 は認 め
伝 子 の 突 然 変 異 の 頻 度 はBRAF遺
配 列 の 多 くは ク ラ ス タ ー を 形 成 し て お り,こ れ はCpG
伝 子 の 突 然 変 異 を認 め な い 非 遺 伝 性 大 腸 癌 群 と ほ ぼ 同
islandsと
率 で あ る.
呼 ば れ る.CpGislandsは
人 間 の約 半 数 の
KRAS遺
遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に 認 め られ る13).例 え ば,
Takai
and
JonesのCpG
islandsの
定 義14)に 従 い,ク
伝 子 の 突 然 変 異 の 多 く は コ ド ン12,13に
中 し て お り(図1f),ま
ロ モ ソー ム18q21∼23領
域 に つ い て 解 析 を行 う と,ク
は コ ド ン600(図1g,は
ロ モ ソー ム18q21∼23領
域 に は177の 遺 伝 子 が あ り,こ
あ っ た が,最
れ ら遺 伝 子 の 中 で,プ
ロ モ ー タ ー 領 域(こ
こ で は転 写
開 始 位 置 よ り3kb上
流 か らエ キ ソ ン1ま
で とす る)
ロ モ ー タ ー 領 域 にCpG
87(49%)認
め ら れ,そ
islandsを
じ め の 報 告 で は コ ド ン599で
ド ン600に
修 正 さ れ た)に 集 中 し て
大 腸 癌 に お けるMSl,RAS/RAF/ERKpathway,DNA
methylationの
関連 性
の 中 でプ
認 め る遺伝 子 数 は
め ら れ る こ と に な る.癌
伝 子 の突 然 変 異
い る22,23,26).
お よ び イ ン トロ ン を含 め た 遺 伝 子 領 域 にCpGislands
を 認 め る遺 伝 子 数 は104(59%)認
近,コ
たBRAF遺
1993年 のMSIの
報 告 か ら2002年 のBRAF遺
の 突 然 変 異 の 報 告 を経 て,大
に お い て は腫 瘍
steinら
化 状 態 を 呈 す る こ と が 報 告 さ れ て い る2).1999年
の み で は 語 れ な い こ と を示 し た と考 え ら れ る.ま
に
Toyotaら
に よ りCpGislands
(CIMP)と
い う概 念 が 提 唱 さ れ た15).大 腸 癌 の 中 に は,
の 提 唱 し たadenoma-carcinoma
sequence19)
た,
こ れ ら一 連 の 解 析 結 果 に よ り,sporadicMSI-Hと
Phenotype
様 々 な 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 お よ び1ocusに
伝子
腸 癌 発 癌 経 路 はVogel-
抑 制 遺伝 子 な どの プ ロ モー ター領 域 の 異常 な 高 メ チル
Methylator
集
CIMPお
よ びBRAF遺
伝 子 の 突 然 変 異 が ほ ぼ1つ
で 結 ば れ た こ とに も な っ た.我
高メチ
線
々 は発 癌 に お け るエ ピ
ル 化 を 呈 す 群 が 存 在 し,こ れ らの 多 くは,先 のsporadic
ジ ェ ネ テ ィ ッ クの役 割 を重 要 視 し,KRASお
MSH-H癌
腸癌
遺 伝 子 の 突 然 変 異 を伴 う大 腸 癌 群 に は お の お の 異 な っ
示 す癌 群 は大 別 す る と遺 伝 性
たエ ピ ジェ ネ テ ィ ッ ク異常 の機 構 が 存 在 す るの で は な
と オ ー バ ー ラ ッ プ し て い る.現
に お い て,MSI-Hを
(Lynch
syndrome/HNPCC)と
MSI-H)の2種
類 で あ り,Lynch
の 原 因 の 多 く はMMRgeneのGermline
在,大
よびBRAF
非 遺 伝 性(sporadic
い か と仮 説 を立 て,合 計234症 例 の 非 遺 伝 性 の 大 腸 癌 組
syndrome/HNPCC
織 を対 象 に,11の 遺 伝 子 プ ロ モ ー ター 領 域 お よびLocus
の メ チ ル 化 の ス テ イ タ ス,KRASお
Mutation
98
よ びBRAF遺
エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク/ジ ェ ネ テ ィ ッ ク変 化 と大 腸 癌:永
a
hMLH1
promoter
region
b
C
d
e
f
g
図1a.hMLH1プ
NSお
ロ モ ー タ-領 域 及 び 解 析 方 法 の 模 式 図
よ びNASは
メ チ ル化 の 有 無 に 依 存 し な い プ ラ イ マー を示 し,MSは
ロ モー ター 領 域 に お け る各CpG配
hMLH1プ
例 を示 す.Tは
-カ ー ,Mcは
坂 岳 司,他14名
列 を示 す .b.hMLH1プ
ロ モ ー タ― 領 域 の3'領 域 に お け るDNAメ
腫 瘍,Nは
正 常 粘 膜 を示 す.Mは
メ チ ル 化 特 異 的 な プ ラ イ マー を 示 す .縦 線 は ｈMLH1プ
ロ モ ー ター 領 域 の5'領 域 に お け るDNAメ
チ ル化 の 解 析 の 一 例.c.
チ ル 化 の 解 析 の 一 例.MSSは
マ イ ク ロサ テ ラ イ ト不 安 定 性 の 認 め ら れ な い 症
メチ ル 化 を 認 め た もの を,Uは
メチ ル 化 の 認 め られ な い もの を示 す.SMは
サ イ ズマ
メチ ル 化 の コ ン トロー ル,Ucは
非 メチ ル化 の コ ン トロ― ル を 表 す.d.MLH1蛋
白の 免 疫 染 色 陽 性 症 例(hMLH1
プ ロ モ ー ター 領 域 の メ チ ル 化 を 認 め な か っ た 症 例) .e.hMLH1蛋
白 の 免 疫 染 色 陽1性症 例(hMLH1プ
ロ モ ー ター 領 域 の メ チ ル 化 を
認 め た 症 例).f.BRAF遺
伝 子 コ ドン600の 突 然 変 異 の 一 例.g.KRAS遺
伝 子 コ ドン12の 突 然 変 異 の一 例 .ア ス タ リ ス クは 今 回 の
解 析 に 使 用 したEnrich
PCR-RFLPプ
ラ イマー 内 の 人]1的 ミ スマ ッ チ を示 す
99
〔
文 献17参 照).
伝 子 の 突 然 変 異,MSIス
学 的 にKRAS遺
テ イ タ ス の 検 討 を行 い,統
伝 子 突 然 変 異 群,BRAF遺
然 変 異 群,KRASお
よ びBRAF遺
を示 さ な い 群 に お け るDNAメ
sporadicMSI-H群)は,`あ
計
1oci'に の み 高 率 にDNAメ
伝 子突
ら れ る(data
伝 子 に突 然 変 異
HNPCCの
チ ル 化 ス ペ ク トラ ム の
伝 子 突 然 変 異 群(n=21)に
お け る メチ ル
化 遺 伝 子 数 の 平 均 値 は7.2(95%CI;6.6-7.9)に
KRAS遺
伝 子 突 然 変 異 群(n=72)に
チ ル 化 が 起 き て い る と考 え
not shown).ま
た,Lynch
syndr0me/
メ チ ル 化 ス ペ ク トラ ム はKRI4S遺
伝子 の
伝 子 の 突 然 変 異 を伴 う群 と 同 じ で あ り,KRAS遺
対 し,
子 の 突 然 変 異 を伴 わ な い もの は,、KRASお
お け るメ チル 化
よびBRAF
not shown).現
お よ びBRAF遺
メ チ ル 化 が 先 に 起 こ る の か,そ れ と もBRAF,KRIAS
伝 子 に 突 然 変 異 を示 さ な い 群(n=
にお け るメチ ル化 遺
伝 子 数 の 平 均 値 は 有 為 に 異 な る こ とが 示 さ れ た.誤
の な い よ う に 記 載 を追 加 す れ ば,BRAF遺
変 異 群(そ の 多 くはsp0radicMSI-H群)の
メ チ ル 化 を 高 率 に 伴 い,そ
の 他 の 群 はDNAメ
を伴 わ な い と考 え ら れ るか も しれ な い が,そ
く,な
ん ら か のDNAメ
100%に
表1、BRAF突
解
お わ り に
伝子突然
BRAF遺
み がDNA
チ ル化
然 変 異 群(BRAF-mt),、Km8突
す べ てx2testに
syndr0me/HNPCCの
可 能 性 を 秘 め て い る.実
HNPCCと
たは
然 変 異 群(KmS-mt),及
よ る.
100
メチ ル
診 断 に有 用 とな る
際 にLynch
syndrome/
家 族 歴 か ら診 断 さ れ た 症 例 の う ち,MMR
遺 伝 子 のGermline
おけ る臨床 的特 長
p-valueは
伝 子 の 突 然 変 異 お よ びhMLH1の
化 はLynch
うで は な
伝 子 突 然 変 異 群(ま
癌 の 初 期 に お い て 異 常 なDNA
後 の 展 開 が 待 た れ る と こ ろ で あ る.
チル 化 の 異 常 は ほ ぼ大 腸 癌 の
認 め ら れ,BRAF遺
在,発
の 突 然 変 異 が 先 に 起 こ る の か は 立 証 さ れ て い な い.今
お け る メ チ ル 化 遺 伝 子 数 の 平 均 値 は1.0(95%
CI;0.79-1.3;p<0.0001)と3群
伝
遺 伝 子 に 突 然 変 異 を示 さ な い 群 と同 じで あ っ た(data
遺 伝 子 数 の 平 均 値 は1.8(95%CI;1.5-2.1),N(RAS
141)に
たは
突 然 変 異 を 伴 う も の は 非 遺 伝 性 の 大 腸 癌 のKRAS遺
違 い を立 証 し た17)(表1-3,図2).
BRAF遺
る特 定 の 遺 伝 子,ま
び 、BRAF,Km8の
mutationが
確 認 さ れ る の は50%
突 然 変 異 を示 さ な い 群(Wt)に
エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク/ジ ェ ネ テ ィ ッ ク変 化 と大 腸 癌:永
表2、BRAF突
然 変 異 群(BRAF-mt),KRAS突
に お け るDNAメ
Mは
メ チ ル化 を,Uは
表3BRAF突
然 変 異 群(KRAS-mt),及
な い群(Wt)に
の比較
非 メ チ ル 化 を示 す.p-valueは
びBRAF,KRASの
お けDNAメ
す べ てx2testに
然 変異群
よ り得 られ た値 で あ る.
の 領 域 の1つ
突 然 変 異 を示 さ
で あ る,癌
チ ル化 遺 伝 子 数 の 平 均 値
以 下 で あ る9).MSI-Hを
示 す 大 腸 癌 か らSporadic
そ ら く,異
チ ル 化 の 前 に は 更ピ ス トン ・コー ド'の 変 化
が あ り,こ
の 変 化 に 随 伴 し て 引 き起 こ さ れ る 現 象 な の
た,RNAに
よ るsilencingの
方 向 は,診
除外 す るこ とに よ り
drome/HNPCC診
た,近
年,急
,よ
り有 効 なLynch
MSI
化 を確 認 す る こ とで 可 能 で あ る.し
syn-
臨 床 上 で 使 用 で き る レベ ル で は な い.こ
断 が 可 能 に な る か も し れ な い27).ま
結果
う1つ
断 マ ー カ ー と し て の 利 用 で あ る.少
も,癌 組 織 と正 常 組 織 の 区 別 が あ る程 度,DNAメ
-Hを
常
なDNAメ
引 き起 こ さ れ る 現 象 の 一 つ か も しれ な い.も
頼 区 間 を 示 す.p-value
よ り 得 ら れ た 値 で あ る.
伝 子 の発 現 の不 活 性 化 に必 ず
チ ル 化 は 必 要 で は な く,お
か も し れ な い.ま
はKruskal-Wallis'testに
チ ル化 の異 常 につ
の 方 向 に 向 か う も の と考 え られ る .
チ ル 化 が 引 き起 こ さ れ る分 子 生 物 学 的
一 つ はDNAメ
し もDNAメ
標 準 誤 差 を,95%CIは95%信
のDNAメ
い て は,今 後 は2つ
な機 構 の 解 明 で あ る.遺
S.E.は
突 然 変 異 を示 さ な い群(Wt)
チ ル化 の特徴
然 変 異 群(BRAF-mt),KRAS突
(KRAS-mt),及
びBRAF,KRASの
坂 岳 司,他14名
の
な くと
チル
か し な が ら,ま
だ
れ ら を解 決 す
る よ う な 方 法 論 な ど の 展 開 が 待 た れ る と こ ろ で あ る.
速 に 進 展 し て い る 「エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク 」
101
図2BRAF遺
伝 子 突 然 変 異 群 お よ びKRAS遺
伝 子 突 然 変 異 群 に お け るDNAメ
黒 い 四 角 は メ チ ル 化 を 示 し,白 い 四 角 は 非 メ チ ル 化 を 示 す.MSI-HはMicrosatellite
instability-1owを
表 し,MSSはmicrosatellite
stableを
表 す(文
献10お
102
チ ル化 スペ ク トラ ム
instability-highを
よ び17参
照).ま
た,V599Eは
表 し,MSI-Lはmicrosatellite
現 在 で はV600Eで
あ る.
エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク/ジ ェ ネ テ ィ ッ ク変 化 と大 腸 癌:永
謝
mapping using CpG islands. Nat Genet (2000) 26(1), 61
-63.
辞
本 稿 で述べ た研 究 内容 は,岡 山大学 医学 部消 化器 ・腫 瘍外 科
14) Takai D, Jones PA: Comprehensive analysis of CpG
islands in human chromosomes 21 and 22. Proc Natl
Acad Sci USA (2002) 99 (6), 3740-3745.
15) Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman JG, Baylin
学教 室 で行 わ れた もの です.田 中紀章 教授,松 原長 秀先 生,現
在 はお お もと病 院副 院長 で あ られ る礒 崎博 司先 生 の御指 導 に深
謝致 します.サ ンプル な どの収集 に あ た りま して は,消 化 器 ・
腫瘍 外科 学教 室 の先 生方,関 連病 院 の先生 方 の御理解,御 協 力
に深 謝 致 します.ま た,金 光病 院 の石 田理事 長,難 波院 長,前
SB, Issa JP. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96 (15),
8681-8686.
16) Miyakura Y, Sugano K, Konishi F, et al.: Extensive
methylation of hMLH 1 promoter region predominates
in proximal colon cancer with microsatellite instability.
Gastroenterology (2001) 121(6), 1300-1309.
17) Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K, et al.: Colorectal cancer with mutation in BRAF, KRAS, and wildtype with respect to both oncogenes showing different
田副院 長,江 添外 科 部長,小 川 内科部 長,牧 泌 尿器科 部 長 の御
理解,御 協 力 に感 謝 致 します.
文
坂 岳 司,他14名
献
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