RapiFluor-MS標識、ACQUITY UPLC H-Class Bioシステム

Rapi Fluor-MS 標識、ACQUITY UPLC H-Class Bioシステム
および蛍光 /ACQUITY QDa MS 検出器による
遊離 N 型糖鎖モニタリングの新機能
Eoin F.J. Cosgrave, Matthew A. Lauber, Robert Birdsall, and Sean M. McCarthy
Waters Corporation, Milford, MA, USA
アプリケーションのメリット
■■
■■
はじめに
遊離 N 型糖鎖分析のサンプル前処理の時間
バイオ医薬品の開発において、安全性、有効性、薬効に影響を及ぼす製品の重
短縮
要品質特性（CQA; critical quality attributes ）に関与する特性解析と糖鎖プロファ
日常的にすべてのピークの質量情報と蛍光
情報を得ることで糖鎖モニタリングの信頼
性向上
イリングのモニタリングは重要です。グリコフォームの構造の特性解析が必要
であることは広く認知されており、質量分析計（MS）は糖鎖の同定に重要な役
割を果たしています。
プロファイルが確立されると多くの場合、蛍光検出を組み込んだ分析法は下流
へと移管されます。多くの場合、特性解析後に検出されたそれぞれのピークの
質量情報を取得したいという要望があります。しかし、質量情報の取得は、コ
ストがかかるために質量分析計が不足することや、有意義で有用なデータを得
るためには MS 専門の分析者が必要なことなどの多くの理由から困難でした。
本アプリケーションノートでは、Rapi Fluor-MS 標識試薬、ACQUITY UPLC H-Class
ウォーターズのソリューション
Rapi Fluor-MS™ Glycan
Performance Test スタンダード
GlycoWorks™ Rapi Fluor-MS N -Glycan キット
ACQUITY® QDa ® MS 検出器
ACQUITY UPLC® H-Class Bio システム
Bio システム、蛍光 /ACQUITY QDa MS 検出器による IgG の遊離 N 型糖鎖プロファ
イルのモニタリングを紹介します。この新しいワークフローでは、30 分以内
で糖タンパクから迅速に分析用サンプルを前処理することが可能です。
さ ら に、Rapi Fluor-MS 標 識 は 前 例 の な い MS 応 答 1 を 実 現 す る た め、ACQUITY
QDa を 用 い た 質 量 検 出 が 可 能 と な り ま す。 本 ア プ リ ケ ー シ ョ ン ノ ー ト で は
Rapi Fluor-MS によってもたらされる感度の向上と荷電状態プロファイルや、そ
の蛍光と検量検出に対する一般的な有用性と、様々な IgG の糖鎖構造に対して
得られる ACQUITY QDa MS 検出器のマススペクトルの品質について議論します。
ACQUITY UPLC FTN
ACQUITY UPLC 蛍光検出器（FLR）
ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide カラム
Empower ® 3 CDS ソフトウェア
キーワード
糖鎖、グリコフォーム、標識糖鎖、
ピークモニタリング、質量検出、
蛍光検出、IgG
1
実験条件
Rapi Fluor-MS Glycan Performance Test ス タ ン ダ ー ド（ 製 品 番 号
186007983）は DMF / アセトニトリル / 水 = 22.5%:55.5%:22% 混合
LC 条件
液 25 µL に希釈し、そのまま使用しました。それぞれの分析ではオ
LC システム：
ACQUITY UPLC H-Class Bio
検出器：
ACQUITY UPLC 蛍光検出器、
ACQUITY QDa MS 検出器
カラム：
ンカラムで遊離標識 N 型糖鎖 32 pmol に相当する 2 µL を注入しま
した。LC /MS グレードのアセトニトリルと水は Pierce から購入しま
した。ギ酸アンモニウムはウォーターズ ギ酸アンモニウム緩衝液
ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 、
130Å、1.7 µm、2.1 ×150 mm
（製品番号 186004742）
カラム温度：
60 ℃
サンプル温度：
10 ℃
注入量：
2 µL
を加えることで調製しました。UPLC ® システムは、質量検出器に
おける付加イオンを低減するために、不揮発性塩を必要としない
アプリケーション専用の装置を使用しました。
結果および考察
既存の分析ワークフローに質量検出を加えることで糖鎖の迅速か
蛍光検出器設定
つ明確な同定が可能になります。従来は意味のある質量情報を取得
するためには、適切な感度の高分解能の装置を必要とし、困難な
サンプリングレート： 5 points/sec
励起波長：
265 nm
蛍光波長：
425 nm
作業でした。この問題を克服するために、新規標識試薬 Rapi Fluor-
MS を使用することができます。Rapi Fluor-MS は劇的に N 型糖鎖の
MS 感度と荷電状態の両方を向上させます。
ACQUITY QDa MS 検出器設定
これを実証するために、Rapi Fluor-MS 標識糖鎖のマススペクトルを
従来の蛍光標識試薬である 2-AB で標識された糖鎖のマススペクト
サンプリングレート： 5 points/sec
質量範囲：
500 ｰ 1250 Da
コーン電圧：
15 V
ルと比較しました。この分析は、特徴的に非常に広い質量範囲を
有する飛行時間型質量分析を用いて行われました。異なる標識技
術の荷電状態の特性をより客観的に観察しました。
キャピラリー電圧： 1.5 kV
図 1 に示すように、Rapi Fluor-MS を使用した場合、シグナル強度が
プローブ温度：
500 ℃
イオン化法：
ESI+
移動相 A：
アセトニトリル（Pierce 、LC/MS グレード）
移動相 B：
- Glycan Analysis（製品番号 186007081）を 1 L の水にすべての溶液
飛躍的に向上しました。同様に興味深い事として Rapi Fluor-MS 標識
50 mM ギ酸アンモニウム、pH 4.4、
（LC/MS グレード、
ウォーターズ ギ酸アンモニウム緩衝液）
移動相 C：
アセトニトリル（LC/MS グレード）
移動相 D：
アセトニトリル（LC/MS グレード）
時間
流量
(mL/min)
%A
%B
Initial
35.0
36.5
39.5
42.5
47.4
55.0
75
54
0
0
75
75
75
25
46
100
100
25
25
25
0.400
0.400
0.200
0.200
0.200
0.400
0.400
%C
0
0
0
0
0
0
0
%D
の使用により検出された糖鎖イオンの荷電状態のシフトです。図に
示されるように、Rapi Fluor-MS 標識 FA2 はほとんどすべてが [M+2H]2+
の荷電状態を取っており、より複雑な構造ではより高い [M+3H]3+
の荷電状態を取り始めています。それぞれの場合で少なくともひ
とつはより高い荷電状態を取っているため、m/z が ACQUITY QDa
MS 検出器の質量範囲に入ります。したがって、Rapi Fluor-MS により、
費用効果が高くユーザーフレンドリーな ACQUITY QDa MS 検出器を
利用した N 型糖鎖モニタリング実験が可能になります。
0
0
0
0
0
0
0
SYNAPT® G2-S は Rapi Fluor-MS と 2-AB 標識 N 型糖鎖の価電状態
の評価に使用しました。実験条件の詳細は参考文献 1 を参照し
てください。
Rapi Fluor-MS 標識、ACQUITY UPLC H-Class Bioシステムおよび蛍光 /ACQUITY QDa MS 検出器による遊離 N 型糖鎖モニタリングの新機能
2
RapiFluor-MS
[M+2H]2+
2-AB
[M+H]+
3.5e6
FA2
ACQUITY QDa
Mass Detection
Window
ACQUITY QDa
Mass Detection
Window
FA2BG2S2
2.9e4
[M+2H]2+
[M+2H]2+
1.2e5
5.3e2
[M+3H]3+
500
500
2000 m/z
2000 m/z
図 1. RapiFluor-MS 標識 N 型糖鎖の荷電状態。2 種類の N 型糖鎖標識試薬 RapiFluor-MS と 2-AB の飛行時間型 ESI+ マススペクトル。
ACQUITY QDa MS 検出器 取得ウインドウ範囲内で検出されたプロトン化イオンを緑で表示。ACQUITY QDa MS 検出器の質量範囲を
ザーが簡単に意味のある質量情報を得ることができ
FA2G2S2 - 894.7
FA2BG2S2 - 962.2
A2 - 815.1
器は豊富な質量分析のトレーニング経験がないユー
FA2G2 - 1050.3
FA2G2S1 - 1196.0
240.00
FA2G1S1 - 1114.6
のデータが収集できるように、ACQUITY QDa MS 検出
FA2B - 989.6
A2G1a - 896.2
A2G1b - 896.0
せることができるということです。日常的にこれら
EU
光学系の定量を促進するために蛍光検出と組み合わ
FA2BG2 - 1151.8
480.00
A2G2 - 977.1
要なことは、ACQUITY QDa MS 検出器は、ピークの
均質性および質量情報のデータを裏付けるとともに、
FA2G1b - 969.2
FA2BG1a - 1070.7
FA2BG1b - 1070.6
の日常的な検出は Rapi Fluor-MS 標識で可能です。重
FA2G1a - 969.3
FA2 - 888.2
上述のように、ACQUITY QDa MS 検出器の N 型糖鎖
FA2BG2S1 - 865.3
それぞれのスペクトルの破線で表示。
0.00
るように設計されています。
6
3.2x10
これを実証するために、IgG の Rapi Fluor-MS 標識遊離
ACQUITY QDa MS 検出器の両者でモニターしました。
図 2 に示すように、同定に利用される蛍光と、それ
ぞれの糖鎖のピークの割り当てを容易に確認できる
ACQUITY QDa MS 検出器データの両方の検出器チャン
ネルで高品質のデータが得られました。Empower ソ
フトウェアでは図 2 に示すように、成分および質量
情報を簡単にデータを見直すためのピークの注釈と
して付けることが可能です。
2.4x10
Intensity
N 型糖鎖サンプルを分離し、溶出する糖鎖を蛍光と
6
6
1.6x10
8.0x10
5
0.0
10
15
20
Retention Time (min)
25
30
。それぞれのピーク
図 2. IgG 糖鎖の蛍光（上）と 5 点平均でスムージングした TIC クロマトグラム（下）
には、Empower のデータ管理ソフトウェアで成分名とベースピーク質量の注釈が付けられています。
Rapi Fluor-MS 標識、ACQUITY UPLC H-Class Bioシステムおよび蛍光 /ACQUITY QDa MS 検出器による遊離 N 型糖鎖モニタリングの新機能
3
ACQUITY QDa で N 型糖鎖構造を検出する能力は重要ですが、特に詳細にデータを解析する必要がある場合、
N 型糖鎖モニタリングのスペクトル品質がさらに重要となります。したがって、前述したクロマトグラムで
検出されたピークに関連付けられた MS データの品質を検討しました。図 2 で割り当てられたそれぞれの
ピークのスペクトルを図 3 に表示します。 ACQUITY QDa MS 検出器では糖鎖の相対存在量、分子量または
シアル酸含量に関わらず、クリーンで簡単に解釈できる Rapi Fluor-MS 標識糖鎖のマススペクトルが取得でき
ます。明らかに、Rapi Fluor-MS と ACQUITY QDa MS 検出器を一緒に用いることで、N 型糖鎖の日常的なモニ
タリングにおける割り当ての信頼性を高めるために非常に有益なデータを提供することができます。
24000
18000
A2
[M+2H] 2+
815.3
600000
0.80% RPA
450000
FA2
[M+2H] 2+
888.2
200000
150000
20.51% RPA
60000
FA2B
[M+2H]2+
4.43% RPA
989.6
45000
12000
300000
100000
30000
6000
150000
50000
15000
0
24000
18000
600
800 1000 1200
m/z
A2[3]G1
896.0
[M+2H] 2+
0.54% RPA
0
480000
360000
600
800 1000 1200
m/z
FA2[6]G1
969.3
[M+2H] 2+
19.17% RPA
0
360000
270000
600
800 1000 1200
m/z
FA2[3]G1
[M+2H]2+
0.85% RPA
969.2
0
200000
150000
12000
240000
180000
100000
6000
120000
90000
50000
0
24000
18000
600
800 1000 1200
m/z
FA2B[3]G1
1070.6
[M+2H] 2+
0.85% RPA
60000
600
800 1000 1200
m/z
FA2G1S1
1114.7
[M+2H]2+
2.86% RPA
20000
60000
45000
A2G2
[M+2H] 2+
1.14% RPA
977.1
600
800 1000 1200
m/z
FA2G2S2
0
600000
450000
600
800 1000 1200
m/z
FA2G2
[M+2H]2+
14.56% RPA
1050.2
0
24000
18000
300000
12000
9000
150000
6000
0
0
200000
150000
40000
0
36000
800 1000 1200
m/z
18000
6000
80000
600
27000
12000
0
0
600
800 1000 1200
m/z
FA2G2S1
1196.0
[M+2H]2+
9.16% RPA
80000
60000
600
800 1000 1200
m/z
FA2BG2S1 865.3
[M+3H]3+
2.34% RPA
0
80000
60000
100000
40000
40000
50000
20000
20000
0
600
800 1000 1200
m/z
0
600
800 1000 1200
m/z
0
A2[6]G1
896.0
[M+2H]2+
1.23% RPA
600
800 1000 1200
m/z
FA2B[6]G1 1070.7
[M+2H]2+
5.21% RPA
600
800 1000 1200
m/z
1151.7
FA2BG2
[M+2H]2+
2.20% RPA
600
800 1000 1200
m/z
FA2BG2S2
962.4
[M+2H]2+
1.87% RPA
600
800 1000 1200
m/z
894.6
[M+3H] 3+
1.72% RPA
30000
15000
0
600
800 1000 1200
m/z
図 3. 図 2 に示すクロマトグラムで同定されたそれぞれの糖鎖構造の積算スペクトル。同定された構造は A2 のようなシンプルな構造から、FA2G2S2 のような IgG
サンプル中に存在するより複雑な構造までにまたがっています。RPA（Relative Peak Area）= 蛍光検出に基づく相対ピーク面積
Rapi Fluor-MS 標識、ACQUITY UPLC H-Class Bioシステムおよび蛍光 /ACQUITY QDa MS 検出器による遊離 N 型糖鎖モニタリングの新機能
4
結論
参考文献
グリコシル化（糖鎖付加）はほとんどのタンパク質医薬品において複雑かつ重要
な特徴で、十分に特性解析され、開発から商業化にわたる製品のライフサイク
ル全体にわたってモニターされる必要があります。本アプリケーションノート
で示したように、Rapi Fluor-MS は、試料調製時間と複雑さを大幅に低減し、蛍
1. Lauber, M. A.; Brousmiche, D. W.; Hua, Z.; Koza, S. M.;
Guthrie, E.; Magnelli, P.; Taron, C. H.; Fountain, K. J., HILIC
分析のための新規蛍光・MS 検出標識試薬による遊離 N 型
糖鎖の迅速サンプル調製法
Waters Application Note 720005275JA 2015.
光感度を向上し、さらに劇的に MS 感度を向上します。糖鎖の MS 感度を向上
することで Rapi Fluor-MS 標識は ACQUITY QDa での質量検出を可能とし、これに
より、バイオ医薬品の開発中に検出された構造のピークモニタリングで高い信
頼性が得られます。
Rapi Fluor-MS 標 識 お よ び ACQUITY UPLC H-Class Bio シ ス テ ム と ACQUITY QDa MS
検出器による HILIC-FLR-MS は、バイオ医薬品の N 型糖鎖プロファイルをモニター
するための比類のないソリューションを提供します。
日本ウォーターズ株式会社 www.waters.com
東京本社 〒140 -0001 東京都品川区北品川 1-3-12 第 5 小池ビル T E L 03-3471-7191 FAX 03-3471-7118
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ショールーム
東京 大阪
サービス拠点
東京 大阪 札幌 福島 静岡 富山 名古屋 徳島 福岡 Waters、ACQUITY、QDa、ACQUITY UPLC 、Empower、SYNAPT、UPLC および The Science of W hat ’s Possible は Waters Corporation の登録商標です。
GlycoWorks および RapiFluor-MS は Waters Corporation の商標です。その他すべての登録商標はそれぞれの所有者に帰属します。
©2016 Waters Corporation. Produced in Japan. 2016 年 6月 720005352JA PDF