分取クロマトグラフィー ～見れば得する!セミ分取システムの実用的な使い方

見れば得する！
セミ分取システムの実用的な使い方
内容
1.セミ分取HPLC
システム、応用例、留意点
2.超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）
を使用した分取の紹介
分取HPLCとは
医薬品や天然物質などから、目的の化合物を高純度で
単離・精製することを目的としたHPLC
・セミ分取HPLC：
カラム内径が10mm以上、50mm未満のカラムを用いた分取HPLC
・分取HPLC：
カラム内径が50mm以上のカラムを用いた分取HPLC
・フラクションコレクター、リサイクルバルブなどと
組合わせて用いる
スケールに対する各パラメータの関係（計算値）
スケール
カラム内径(mm)
充填剤粒子径(µm)
基準流量(mL/min)
基準注入量(µL)
分析
3
セミ分取
4.6
3～10
0.4
5～10
ポンプラインアップ
1
10～25
10
20
5～10
4.7
50～200
18.9
200～500
ポンプ名
PU-2080
PU-2086
PU-2087
流量範囲 (mL/min)
～10
～20
～50
分取クロマトグラフィーシステム
セミ分取HPLCシステムの流路例（1）
セミ分取HPLCシステムの流路図
4
2
5
3
1
2
6
1
7
廃棄
8
【システム構成装置】
1. 溶媒
5. カラム
2. 溶媒ポンプ
6. 検出器（UV、PDA、RI、CD検出器）
3. ダイナミックミキサー
7. フラクションバルブユニット or 3WAY バルブ
4. オートサンプラー
8. フラクションコレクター
セミ分取HPLCシステムの流路例（2）
リサイクル分取の流路図
3
4
2
5
6
廃棄
7
1
【システム構成装置】
1. 溶媒
5. 検出器（UV、PDA、RI、CD検出器）
2. 溶媒ポンプ
6.フラクションバルブユニット
3. オートサンプラー
7. フラクションコレクター
4.カラム
フラクションコレクター対応
ChromNAV
Chromatography Data System
Fraction Collector
Controller
FC-2088-30
ADVANTEC CHF122SC
Gilson 223 Sample Changer
フラクションコレクター 分画の方法
ADVANTEC CHF 122SCの場合
(1)時間分画
(2)条件分画♯1
レベル（絶対値）
スロープ（傾き）
レベル and スロープ
レベル or スロープ
(3)条件分画♯2
レベルによる分画
スロープによる分画
複数CHで得られたクロマトグラムの値の論理演算
(4)ディスカード※
(5)手動での分取
(1)-(3) の単独もしくは組み合わせにより分画する。
※条件分画で、分画条件が不成立の区間を回収するときに
設定します。
ディスカードの例
フラクションコレクターの条件設定
ソフトウェアの充実、使いやすさ ～シミュレーション機能～
シミュレーション
機能を使うことで、
設定ミスなどによ
る取り逃しを回避
コレクション結果表示
分画結果とクロマトグラムの関連付け
フラクションコレク
ターとChromNAV
を併用することで
皆様の分析を
より良くサポート
分取HPLC応用例
リサイクル分取クロマトグラフィー
一度カラムから溶出した不分離ピークを、カラムに繰り返し通すことで、長いカラムを使用し
た場合や、あるいはカラムを数本連結した場合と同等の効果を得ることができます。これに
より、得られた高分離能ピークを分取することで、効果的な分取精製が可能になります。
リサイクル分取システムの流路図
ポンプ
リサイクルキット
オートサンプラ
オートサンプラー
カラム
検出器
リサイクルバルブ
廃液
フラクションコレクタ
フラクションコレクター
例えば・・・
リサイクル分取 応用例
必ず、目的成分の部分のみをリサイクルさせる。これ以外の部分は、排出または、一回目に分取する。
リサイクル1回目
【測定条件】
Column：
Eluent：
Flow rate：
Wavelength：
Sample：
Megapak GEL 201C (20mm I.D. x 500mmL, 5µm)
Chloroform
3.0mL/min
254nm
Polystyrene oligomer
2回目
3回目
n=5
n=6 n=4
4回目
5回目
6回目
分取1～3
リサイクル
ポリスチレンオリゴマ（n=4,5,6）の
リサイクル分取
リサイクル分取の留意点
サンプルループでの広がり
5mLサンプルループ使用
（内径1.0mm）
リサイクル
モード
通常測定
AS-2058の機能：リサイクルモード
リサイクルモードは、ある一定の時間が経過した後、バルブをInject側に
切り替えることにより、ピークの広がりの要因を減らす役割をする。
分取時の留意点
試料負荷量（注入容量、濃度）の
ピーク形状への影響
分離する程度に試料負荷量 (容量、濃度) を増加させる。
Analytical Sample
Zinj
容量と濃度の overload 時のピーク形
状は一般的に右図のようになる。
＊右図中段は、サンプル溶解溶媒が移動
相溶媒よりも溶出力が小さい場合
Volume Overload
Zinj
Zinj
Zinj
Concentration Overload
分取においては、ピークが分離されていれば、
overload によるピーク形状の変化は問わない。
→なるべく多くの量を処理したいため。
Zinj
サンプル溶解溶媒の影響(1)
セミ分取HPLC
2mL注入の場合
N:理論段数
Acetonitrile
N=1478
N=10172
N=10920
N=3592
Acetonitrile/Water(85/15)
移動相と同じ
N=14617
Acetonitrile/Water(50/50)
N=14861
Acetonitrile/Water(25/75)
1: Naphthalene, 2: Fluorene, 3: Anthracene, 4: Pyrene, 5: Chrysene, 6: Benzo[a]pyrene (0.01mg/mL each)
Column: CrestPak C18（ 10mm I.D. x 250mmL, 5µm ）, Eluent: Acetonitrile/ Water (85/15)
サンプル溶解溶媒の影響(2)
セミ分取HPLC
移動相
0.1% TFA in Methanol/Water (30/70)
サンプル溶解溶媒
及び注入量
10mg/mL
in 100% Methanol
1mL注入
注入した絶対量は同量
2mg/mL
上記試料を超純水で
5倍希釈
（in 20% Methanol）
5mL注入
感度と注入量に適当なセルの選択
セミ分取HPLCの場合（等量注入）
標準セル： Path 10mm, Volume 17µL
分取セル： Path 1mm, Volume 21µL
標準セル
分取セル
Column: CrestPak C18（10mm I.D. x 250mmL, 5µm）, Eluent: Acetonitrile/Water（85/15）,
Flow rate: 4.7mL/min, Injection volume: 80µL, Wavelength: UV254nm, Sample: PAHs (0.2mg/mL)
超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）
Green and Clean Separation
超臨界流体クロマトグラフィー (SFC)とは
移動相に超臨界CO2を用いた、高速高分離を実現できる分離
分析法。 シリカゲルカラムを使用した場合、順相クロマトグラフィーに似
た保持挙動を示します。
SFCの特長
①ハイスループット
HPLCと比べて、分析時間1/2～1/10へ短縮可能
②低コスト
HPLCと比較すると、安価なCO2を移動相として利用することや、分取
の場合、溶出後の後処理が簡便になることで、トータルコストを大幅
に削減
③安全かつ環境にやさしい
CO2は引火性が無いため安全です。また、CO2はリサイクル品を使用
Green and Clean Separation
HPLC, SFCによる分析データの比較
Flavanone
HPLC
Mobile phase:
Flow rate:
Column:
Column temp.:
Wavelength:
Hexane/EtOH (75/25)
0.5mL/min
CHIRALPAK AD-H (4.6mmI.D. x 150mmL)
40ºC
250nm
SFC
3.5min
CO2:
Modifier:
Column:
Column temp.:
Pressure:
Wavelength:
1.2mL/min
EtOH 0.8mL/min
CHIRALPAK AD-H (4.6mmI.D. x 150mmL)
40ºC
20MPa
250nm
5µm
O
11min
O
5µm
3µm
1min
CO2:
Modifier:
Column:
Column temp.:
Pressure:
Wavelength:
5.0mL/min
EtOH 2.5mL/min
CHIRALPAK AD-3 (4.6mmI.D. x 150mmL)
40ºC
20MPa
250nm
Green and Clean Separation
SFCシステム
分析用SFC
セミ分取用SFC
流量： 1～8 mL/min
カラム： 2～4.6 mmI.D.
分取用SFC
流量： ～20 mL/min
カラム：4.6～10.0 mmI.D.
安全弁
流量： ～120 mL/min
カラム：10.0～30.0 mmI.D.
SFC基本流路図
自動圧力調整弁
カラムオーブン
ミキサ
CO2
送液ポンプ
カラム
検出器
CO2ポンベ
オートサンプラ
ストップバルブ
回収ビンまたは
モディファイア溶媒
モディファイア
送液ポンプ
フラクションコレクタ
分取効率を向上させるための工夫
スタックインジェクション（SF-NAV使用時）
①
Inj.
②
Inj.
① ② ③
Inj.
Inj.
③
Inj.
注入のイメージ
Inj.
大幅に短縮
サンプルの注入間隔を短くし、クロマトグラムを
オーバーラップさせることにより効率的に分取することがでる。
スタックインジェクションによるフラバノンの分離
CD
Intensity [μV]
100000
O
0
O
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
Retention T im e [m in]
100.0
カラム: CHIRALPAK IA (20mmI.D.x250mmL)
CO2流量: 34mL/min
モディファイア: CH3OH 6mL/min
カラム温度: 40ºC
圧力: 20MPa
波長: 310nm
サンプル: フラバノン 31.1mg/mL, 1000L
UV
1000000
900000
800000
700000
μV
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
-100000
0
20
40
60
Time (min)
80
100
フラバノンの回収率と光学純度
Fraction1
光学純度: 99.9±0.1%
回収率: 82.1%
カラム: CHIRALPAK IA (4.6mm I.D.X250mmL)
CO2 流量: 3.2mL/min
モディファイア: MeOH; 流量: 0.8mL/min
カラム温度: 40ºC
圧力: 20MPa
Fraction2
光学純度: 99.9±0.1%
回収率: 85.5%
24時間運転すると
精製量 各4.8g
ワルファリンの分離回収における効率とコスト比較
分取SFC
5 min
運転時間
溶媒コスト
溶媒廃棄コスト
分取HPLC
20min
分取 SFC/分取HPLC
1/4
1/7
1/4
＜算定方法: 何れも CHIRALPAK-IA φ20 x 250mm を用いた場合＞
分取SFC条件：
CO2 / MeOH = 35 mL/min / 10.5 mL/min, Warfarin (10mg Inj.）, 20MPa, CD 240nm
分取HPLC条件：
Hexane / Ethanol = 12mL/min / 3mL/mmin, Warfarin (10mg Inj.）, CD 254nm
溶媒コスト：
試薬ベース
溶媒廃棄コスト：
¥10,000 / 180L
制御ソフト：
SF-NAV
まとめ
■ 分取を行う場合、適切なシステムを選択することが必要
流速、注入量、検出器（セル容量）など
■ 機能が充実したソフトウエアを使用することで、作業効率
が向上
■ セミ分取クロマトグラフィーにおける留意点を理解すること
で、より効率的な分取精製が可能
■ リサイクル分取などの手法やSFCを有効に用いることで、
分取精製の効率化だけでなく、コスト削減や環境負荷の
低減も可能