学術会議プログラム

学術会議プログラム
11 月 27 日（金）9：00~17：40
（口演時間 25 分・ディスカッション時間 10 分）
8:30~ 9:00
開場，受付開始（千成），ポスター掲示（葵）
9:00~ 9:10
開会の辞・会議長挨拶
会長 小川 隆広
9:10~ 9:45
一般口演 1
DL 會田 英紀（北海道医療大）
未成熟筋組織を用いた組織誘導 ‐ 軟骨誘導から骨誘導へ ‐
○林 達秀
愛知学院大学歯学部 歯科理工学講座
9:45~ 10:20
一般口演 2
DL 近藤 尚知 (岩手医大)
脳由来神経栄養因子による歯周組織再生促進
○柴 秀樹、武田 克浩、藤田 剛、栗原 英見
広島大学大学院医歯薬学総合研究科先進医療開発科学講座歯周病態学分野
10:20~ 10:55
一般口演 3
DL 西村 正宏 （長崎大）
培養細胞を使った医療の実現 －安全性・有効性の確保について－
○畠 賢一郎
(株)ジャパン・ティッシュエンジニアリング 研究開発部
10:55~ 11:05
Coffee break（フロアディスカッション）
11:05~ 11:40
一般口演 4
DL 安彦 善裕（北海道医療大）
歯髄幹細胞における新しい幹細胞マーカー
○本田 雅規
日本大学歯学部解剖学教室Ⅱ講座
11:40~ 12:20
臨床問題提起基調講演
Can’t see the wood for the trees?
○山下 潤朗
DL 船登
彰芳（金沢市開業）
– Wound closure and the PDL –
Department of Biologic Materials and Sciences, Division of Prosthodontics
University of Michigan, School of Dentistry
12:20~ 13:00
昼食（フロアネットワーキング）
13:00~ 13:35
一般口演５
DL 馬場 一美 （昭和大）
細胞接着における基質―細胞間インターフェースの観察
○山本 玲子
物質・材料研究機構 生体材料センター
13:35~ 14:10
一般口演６
DL 安彦 善裕（北海道医療大）
歯周病における IL-1 の働き
○石原 裕一，亀井 英彦，神谷 洋介，小澤 佑介，水谷 大樹，鈴木 万里代，
黒柳 隆穂，白水 紀充，野口 俊英
愛知学院大学 歯学部 歯周病学講座
14:10~ 14:45
一般口演７
DL 後藤 哲哉（九州歯科大）
Microgroove による骨芽細胞動態制御に関する in vitro 的研究
○松坂 賢一
東京歯科大学・口腔科学研究センターhrc7・臨床検査学研究室
14:45~ 14:55
14:55~ 15:30
Coffee break（フロアディスカッション）
一般口演８
DL 吉野 文彦（神奈川歯科大）
アミノ酸誘導体による骨生体材料の多機能化
○山田 将博
東京歯科大学有床義歯補綴学講座
-4-
15:30~ 16:05
一般口演９
DL 後藤 多津子 （九州大）
電子スピン共鳴法を用いた二酸化チタンから産生する活性酸素種の性格づけ
－チタンオッセオインテグレーションにおける活性酸素種の役割－
○李 昌一 神奈川歯科大学歯学部生体管理医学講座薬理学分野•ESR 研究室
16:05~ 16:40
一般口演 10
DL 柴田 陽 （昭和大）
チタンのエイジング現象とその回復手段
○堀 紀雄
神奈川歯科大学顎口腔機能修復科学講座クラウンブリッジ分野
16:40~ 16:55
総会
17:00~ 17:40
ポスター発表質疑応答ならびに賞のファイナリストの審査（会場：葵）
17:40~ 19:00
懇親会
ホテル ルブラ王山 2 階 葵
ポスター発表演題
11 月 27 日（金）17：00~ 17：40
（演題の太字表記が再生補綴医学会若手賞ファイナリスト）
1．UV 処理を施した二酸化チタンコートガラス上における単一骨芽細胞の初期接着力定量的評価
昭和大学歯学部 1 歯科補綴学教室, 4 口腔生化学教室 2UCLA 歯学部ワイントロープセンター
3
(独)物質材料研究機構生体材料センター金属生体材料グループ
○宮内 知彦 1,4, 山田 将博 2, 山本 玲子 3, 須澤 徹夫 4, 上條 竜太郎 4, 小川 隆広 2, 馬場 一美 1
2. ラット歯根膜由来間葉系幹細胞様細胞による PI3K/Akt 依存的な Tie-2 陽性血管構造の形成
1
岩手医科大学 歯学部 先進歯科医療研究センター 2 岩手医科大学 歯学部 口腔生化学講座
3
北海道大学 大学院歯学研究科 口腔健康科学講座 口腔分子生化学教室 4 北海道大学 大学院歯学
研究科 口腔病態学講座 口腔診断内科学教室 5 北海道大学 大学院歯学研究科 学術支援部
○大久保 直登 1,2,田村 正人 3,北川 善政 4,加茂 政晴 2,客本 斉子 2,帖佐 直幸 2,高橋 典子 2,
飯塚 正 5,石崎 明 2
3．機能的MRIを用いた味覚認知機能に関する空間的、時間的解析
-塩味、甘味によるヒトの脳活動についてa
九州大学大学院 歯学研究院口腔画像情報科学分野 b 九州大学大学院 医学研究院臨床放射線科学
分野 c 九州大学 病院医療技術部 d 九州大学大学院 歯学研究院口腔機能解析学分野
○中村 優子 a,後藤 多津子 a,徳森 謙二 a,吉浦 敬 b,小林 幸次 c,中村 泰彦 c,本田 浩 b,
二ノ宮 裕三 d,吉浦 一紀 a
4．成体歯根膜における神経堤由来細胞の分布と幹細胞マーカーの発現
1
新潟大学大学院・医歯学総合研究科・生体歯科補綴学分野 2ノースカロライナ大学・チャペルヒル校・
デンタルリサーチセンター 3.ミシガン大学・歯学部
○加来 賢1, 2, 小松 義広3, 三品 裕司3, Ko Ching-Chang2, 魚島 勝美1
5．分極エナメル質の石灰化能
昭和大学歯学部歯科理工学教室
○田中 玲奈,柴田 陽,宮崎 隆
6．ヒアルロン酸‐アパタイトハイブリッドの骨誘導に対する生物学的評価
九州歯科大学 １形態機能再建学, ２頭頚部構造解析学 ３九州工業大学 大学院生命体工学研究科
○田中 謙光１，２,後藤 哲哉２,森田 由美３,宮崎 敏樹３,小林 繁２,高橋 哲１
-5-
7．TGF-1 は BMP-2 による異所性骨化を強力に促進する
昭和大学歯学部 1 歯科補綴学, 2 口腔生化学, 3 顎口腔疾患制御外科学, 4 東北大学大学院歯学研究科
顎口腔機能創建学分野, ５昭和大学歯学部口腔生理学
○舘 慶太 1,2,高見 正道 2,佐藤 華 3,本田 義知４,望月 文子５,井上 富雄５,新谷 悟 3,鈴木 治４,
上條 竜太郎 2,馬場 一美 1
8．新たに発見された紫外線照射チタンの抗酸化機能
a
UCLA ワイントロープセンター生体再建研究所 b 東京医科歯科大学 部分床義歯補綴学分野
○上野 剛史 a, 山田 将博 a, 堀 紀雄 a, 岩佐 文則 a, 五十嵐 順正 b, 小川 隆広 a
9．中高齢者歯槽骨由来骨芽細胞の樹立と機能解析
1
愛知学院大学歯学部 歯周病学講座 2 東京理科大学 基礎工学部 生物工学科
3
大阪大学大学院歯学研究科 口腔分子免疫制御学講座 生化学教室
○相野 誠１）,斎藤 正寛２）,米田 俊之３）,野口 俊英１）
10．新規開発デキストリン‐二酸化チタン複合骨補塡材
愛知学院大学歯学部 歯科理工学講座
○浅井 崇文,林 達秀,濱島 聡一朗,佐藤 大和,朝倉 正紀,桐山 喬至,森 慎太郎,河合 逹志
11．間葉系幹細胞の骨形成系細胞誘導におけるヒストン脱アセチル化阻害剤の影響について
新潟大学大学院 医歯学総合研究科生体歯科補綴学分野
○秋葉 陽介,加来 賢,魚島 勝美
12．新規化学修飾法により細胞接着タンパク質を固定化したチタン表面の細胞適合性時間経過によるチタン
の生物学的老化とその回復
北海道医療大学歯学部口腔機能修復・再建学系１歯周歯内治療学分野,2 咬合再建補綴学分野,3 生体材
料工学分野
○門 貴司 1),會田 英紀 2),日高 竜宏 1),遠藤 一彦 3),古市 保志 1)
13．歯髄幹細胞の分化能とメカニカルストレス応答に関する検討
愛知学院大学歯学部 1 有床義歯学講座, 2 内科学講座
○秦 正樹 1),小島 規永 1),尾澤 昌悟 1),小林 泰子 2),成瀬 桂子 2),松原 達昭 2),田中 貴信 1)
14. UV 処理チタンへの初期細胞接着に関する研究
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles 2 神奈川歯科大学 顎口腔機能修復科学講座 3 東京歯科大学 有床義歯学講座
○岩佐 文則 1),堀 紀雄 1.2),山田 将博 1.3〕,鈴木 丈夫 1),上野 剛史 1),小川 隆広 1)
15. N-アセチルシステイン含有レジン添加型グラスアイオノマーセメントの生物学的評価
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles 2 東京歯科大学 有床義歯学講座
○南川 元 1),山田 将博 2),上野 剛史 1),岩佐 文則 1),小川 隆広 1)
16. トリプトアミン誘導体、SST-VEDI-1 はアポトーシスを抑制し、骨芽細胞の最終分化を促進する
1
日本大学歯学部解剖学教室第Ⅰ講座 2 日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門 3 金沢大学大学
院自然科学研究科薬学系薬化学研究室
○三上 剛和 1,2）, 染井 正徳 3）,高城 稔 1,2）
17. IL-2 により活性化された末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）の骨形成原細胞への影響
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles 2 日本大学歯学部歯科補綴学教室Ⅱ講座
○月村 直樹 1,2）,石上 友彦 2）,小川 隆広 1）
-6-
臨床問題提起基調講演
Keynote lecture to address clinical and translational issues
Can’t see the wood for the trees? – Wound closure and the PDL –
Junro Yamashita, DDS, MS, PhD
Department of Biologic Materials and Sciences, Division of Prosthodontics
University of Michigan, School of Dentistry
It is generally due to technical or diagnostic problems when a GTR, root coverage, or GBR procedure
fails. Components of tissue engineering triad, namely, cells, growth factors, and scaffold, are essential to
make bone regeneration happen. This is especially true when it comes to a large bone defect. A
combination of a better scaffold and growth factor release is being extensively studied in an effort to
improve the outcome of regeneration therapy. However, it may not be critical to use an exogenous
growth factor and scaffold in the regeneration of relatively small bone defects, such as alveolar bone
defects, as far as space-maintenance and wound closure are secured. In such a defect blood clot (fibrin
scaffold) and cytokine release from activated platelets and other cells would regenerate a bony tissue
successfully.
Advanced periodontitis or tooth loss results in alveolar bone resorption. This means that alveolar bone
resorption follows loss of the periodontal ligament (PDL). One of important functions of the PDL is to
maintain alveolar bone surrounding a tooth by bone remodeling. Therefore, regeneration of the PDL
would be imperative for alveolar bone regeneration and its long-term maintenance. It could be said that
alveolar bone formation follows spontaneously as long as the PDL exists. Since osseointegrated implants
are devoid of the PDL, research will be required as to how implants maintain alveolar bone for the
long-term or what modification on implants is needed for the long-term bone maintenance. In this lecture
the current status of dental regeneration therapy will be reviewed by focusing on wound closure and the
PDL.
-8-
木を見て森を見ず？ 歯科再生治療における創の閉鎖と歯根膜の意義
山下 潤朗
Department of Biologic Materials and Sciences, Division of Prosthodontics
University of Michigan, School of Dentistry
臨床で Guided Tissue Regeneration (GTR)，Root Coverage （根面被覆術）或いは Guided Bone
Regeneration (GBR)の失敗を経験すると，手技の未熟さは当然のことであるが，成長因子やスキャフォー
ルドの役割について考えさせられることがある．骨再生を細胞，成長因子，スキャフォールドの３要素を使
って理論的に構築することの正当性は言うまでもない．.特に，おおきな硬組織欠損を再建する場合には
きわめて重要な概念である。しかしながら，歯槽骨の再生という，どちらかといえば小さな欠損を再生する
場合に，人工スキャフォールドや成長因子の応用がどれほど臨床結果に貢献しているのか疑問に思うこ
とがある．空間の確保，安定した創の閉鎖を達成できるならば，天然スキャフォールドであるフィブリン網，
時間的に制御されたサイトカインの放出をより効果的に組織再生に利用することが可能となるはずであ
る．
歯周病の進行，歯の喪失は歯槽骨の吸収を引き起こす．言い換えれば，歯根膜の喪失が歯槽骨の吸
収を引き起こすのである．歯根膜は，骨の改築に寄与し歯槽骨 (Bundle bone) を常に理想的な状態に
維持している．このことは，歯槽骨の再生とその維持には歯根膜の再生が不可欠であることを示しており，
極論を述べれば，歯根膜さえ再生すれば歯槽骨の再生は自ずとついてくるのかもしれない．骨結合イン
プラントは歯根膜が存在しないので，長期的に骨をどのようなメカニズムで維持していくのか，また，骨を
維持するためにはインプラントにどのような工夫が必要なのか，今後の研究課題となるであろう．本講演
では，臨床例を供覧しながら創の閉鎖と歯根膜に焦点を当て歯科再生治療の現状を総括する．
略歴
山下 潤朗
Assistant Professor
Department of Biologic Materials and Sciences, Division of Prosthodontics
University of Michigan, School of Dentistry
1991
1993
1997
2004
歯学士
北海道大学
補綴専攻課程修了 東京医科歯科大学
博士（歯学）
東京医科歯科大学
MS (Periodontics)
University of Michigan
Diplomate, American Board of Periodontology
日本補綴歯科学会専門医
Editorial Review Board, IJOMI
Editorial Review Panel, J Periodontology
主要研究領域：破骨細胞の起源，PTH 投与による骨増生機序の解明
-9-
招待口演
Oral presentation #1
Tissue induction using immature muscular tissue: From cartilage induction to bone induction
Tatsuhide Hayashi
Department of Dental Materials Science Aichi-Gakuin University School of Dentistry
Common clinical approaches to the problem of injury, loss, or non-function of a tissue or organ include
reconstructive surgery and organ transplantation. Tissue engineering is a field of research that investigates the
reparation and regeneration of tissues and organs. Successful tissue engineering relies on a combination of cells,
cytokines and appropriate scaffolding.
Recent experiments have attempted to induce cartilage from immature muscular tissue (IMT) in vitro using
BMP as a source of cytokines, and collagen membrane, poly lactic acid/ poly glycolic acid copolymer
membrane and e-PTFE (expanded-Polytetrafluoroethylene) membrane as scaffolds. Excellent results were
obtained when using e-PTFE membrane. Consequently, in subsequent experiments, only e-PTFE membrane has
been used as scaffold. In addition, in subsequent experimental process, it was decided to try bone induction
because osteoblastic cells and osteoids were also spontaneously induced in a different area of the tissue in which
cartilage had been induced in some specimens.
After the completion of the culturing, the induced tissues were analyzed by X-ray observations, and the genes,
elements, histological findings and protein levels, namely, a relatively strong radiopacity was observed in the
findings based on both soft X-ray and micro CT observations. The expression of all osteoblastic marker genes
was confirmed on each day. The gene expression level of osteocalcin was low, however, osteopontin and
collagen type I were upregulated during the culture period. Osteoblastic cells and osteoids were observed by
H-E staining and collagen type I, osteopontin and osteocalcin were detected in the osteoids by immunostaining.
In addition, Ca and P were detected in the extracellular matrix by EDS and were confirmed at almost the same
position based on the findings of synchronized images. As a result, the tissue differentiated from IMT was thus
concluded to be bone-like tissue.
In addition, these induced bone-like tissues in vitro were implanted subcutaneously into the backs of
3-week-old, male Sprague-Dawley (SD) rats to examine whether it has the potential to ossify. The radiopacity
was observed on the soft X-ray films every week after implantation. One week after implantation, the migration
of numerous capillaries was observed in histological observation. Ossification was confirmed after 2 weeks.
The induced bone-like tissue in vitro was thus found to have a potential of ossification after implantation in vivo.
However, this result again indicated that ossification is indispensable to the nutrition supply from the blood.
Although, CaCl2 (10mM) was added in the culture medium so that these induced bone-like tissues in vitro
demonstrated a condition which is more similar to that of bone. As a result, strong calcareous deposition was
observed by von Kossa staining and the expression of all osteoblastic marker genes was upregulated more than
in the previous experiment (without CaCl2). In addition, when these tissues were subcutaneously implanted into
the backs of SD rats, the radiopacity increased further in the micro CT observations. However, contrary to our
expectations, only further increases in the calcification level were observed and no significant ossification was
observed in the histological images. Based on this result, it is believed that even if strong calcification is
observed in vitro, it does not lead to ossification in vivo; in other words, it is believed that calcification and
ossification occur through completely different mechanisms. Consequently, it is necessary to increase the
ossification potential of cells (tissues) themselves in the future experiments in vitro.
-12-
口演 1： 未成熟筋組織を用いた組織誘導
林 達秀
愛知学院大学歯学部 歯科理工学講座
‐ 軟骨誘導から骨誘導へ ‐
組織や臓器が損傷あるいは機能不全となった際には再建術や臓器移植がこれまで行われてきた．組織工
学（Tissue Engineering）は損傷を受けた組織や臓器の形態と機能を回復させるための一つの手法であり，近
年，この手法用いた再生医療が盛んに行われている．組織工学による再生医療を成功に導く基本的概念は，
細胞，細胞の分化・増殖を制御するサイトカインおよび細胞を培養するための最適な scaffold をうまく組み合わ
せて使うことである．
われわれは in vitro で骨形成因子（BMP）を用いて未成熟筋組織から軟骨誘導を試みてきた．scaffold
と し て コ ラ ー ゲ ン 膜 ， ポ リ 乳 酸 / ポ リ グ リ コ ー ル 酸 共 重 合 体 膜 お よ び e-PTFE
(expanded-polytetrafluoroethylene) 膜を用いたが，特に e-PTFE 膜を scaffold とした際には良好な結果を得る
ことができた．従って，その後の実験では e-PTFE 膜のみを scaffold として用いている．さらにその後の実験過
程において，軟骨が誘導されている部位とは違う部位に骨芽細胞様細胞と類骨が誘導されているのを見出し
たことから，骨誘導を試みることとした．
培養終了後，誘導された組織はエックス線観察，遺伝子，元素，組織および蛋白レベルで解析した．即ち，
軟エックス線およびマイクロ CT 観察において，培養組織の一部に不透過性がやや強いか所が観察された．
また，組織観察では組織の一部に骨芽細胞様細胞と類骨が観察され，I 型コラーゲン，オステオポンチンおよ
びオステオカルシンの免疫染色ではいずれも類骨部が染色されていた．RT‐PCR ではオステオカルシンの発
現量は培養期間中終始少なかったが，I 型コラーゲンとオステオポンチンの発現量は培養期間中増加してい
た ． STEM (Scanning Transmission Electron Microscope) 観 察 後 の EDS (Energy Dispersive X-ray
Spectrometer) 分析では細胞外基質に Ca と P が確認され，その重ね合わせ像より同部位に存在することが分
かり，骨と同じリン酸カルシウム系の組織が誘導されていることが分かった．以上の結果から，未成熟筋組織か
ら誘導された組織は骨様組織であると結論づけた．
さらに，この誘導骨様組織の骨化能の有無を確認するため，SD ラット(3 週齢，雄)の背部皮下に移植した．
その結果，移植 1 週後では弱いエックス線不透過像を示し，組織観察では無数の毛細血管の侵入が観察さ
れた．移植 2 週以降のエックス線不透過性は亢進しており，組織観察では骨細胞と骨基質を確認した．従っ
て，誘導骨様組織は骨化能を有することが分かった．しかしながらこの結果は，骨化には血液からの栄養供給
が必須であることを改めて示すものであった．
しかし，誘導骨様組織が in vitro でより骨組織に近い状態にならないかと考え，培養液に CaCl2 (10mM) を
加えて培養した．その結果，各骨系遺伝子の発現量は増加し，組織観察 (von Kossa 染色)では強い石灰化
像が観察された．さらに，同組織をラット背部皮下に移植したところ，マイクロ CT 観察において不透過性はさ
らに亢進していた．しかし，組織像では予想に反して石灰化レベルが亢進した程度で顕著な骨化は観察され
なかった．このことから，in vitro において強い石灰化が確認できたとしても，それが in vivo で骨化に繋がらな
い，即ち，石灰化と骨化は全く違うメカニズムで起きていると考えられる．従って，今後 in vitro での同実験を継
続する際には，細胞（組織）自体のポテンシャルを上げることを考慮しなければいけないと考える．
【略歴】
林 達秀
愛知学院大学歯学部 歯科理工学講座
1999 年 3 月 日本大学歯学部卒業
2002 年 4 月 Loma Linda 大学医学部分子生物学遺伝子治療センター 客員研究員
2003 年 3 月 愛知学院大学歯学部大学院歯学研究科修了
2003 年 4 月 愛知学院大学歯学部歯科理工学講座 助手
2006 年 4 月 同 助教
2007 年 11 月 同 講師
現在に至る
-13-
Oral presentation #2
Brain-derived neurotrophic factor enhances periodontal tissue regeneration
Hideki Shiba, Katsuhiro Takeda, Tsuyoshi Fujita, Hidemi Kurihara
Department of Periodontal Medicine, Hiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences
Session Description:
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), cloned in 1989 as the second member of the neurotrophin family,
plays a role in the survival and differentiation of central and peripheral neurons through binding to a product of
trkB, a high affinity receptor. BDNF also binds to p75NTR , a low affinity receptor.
The ultimate goal of periodontal treatment is complete regeneration of periodontal tissues that have been lost
as a consequence of periodontal disease. The regeneration requires a functional periodontium, which is
structured with newly formed cementum, alveolar bone and connective tissue fibers inserted into these hard
tissues. The formation of cementum is a key phenomenon for establishing the functional periodontium. The
development of a reliable biological procedure to regenerate periodontal tissue is an urgent problem that
requires solving.
Various types of nonneural cells and tissue express BDNF. At the cellular level, vascular endothelial cells,
osteoblasts, periodontal ligament cells, and immune cells express BDNF. At the tissue level, BDNF is expressed
in tooth germ, bone, cartilage, heart, spleen, placenta, prostate, and kidney. We hypothesized that BDNF would
be a potential regulator of regeneration of periodontal tissue. To prove our hypothesis, we conducted both in
vitro and in vivo experiments as follows.
in vitro
To elucidate the mechanism whereby BDNF regulates cementoblast functions, the potential of BDNF on
human cementoblasts were estimated by the following steps: (1) effects of BDNF on cementoblast
differentiation and the involved signaling pathway, (2) effects of BDNF on survival of cementoblasts and the
involved signaling pathway.
Neovascularization is essential for the repair and regeneration of periodontal tissue. So, we also examined
the effect of BDNF on the proliferation and tube formation in human endothelial cells.
in vivo
A safe and low-cost device is to be used for periodontal tissue regeneration. We investigated the effect of
complex of BDNF and synthesized high molecular weight hyaluronic acid gel on the regeneration of
periodontal tissue in experimental periodontal defects in dogs.
In this presentation, we introduce periodontal tissue regeneration by BDNF and suggest that the clinical
application of BDNF as a therapeutic modality may lead to achievement of the complete regeneration.
Learning Objectives
1. Mechanism whereby BDNF regulates bone/cementum-related protein expression and cell survival in cultures
of cementoblasts
2. Angiogenic potential of BDNF
3. Potential of the combination of BDNF and high molecular weight hyaluronic acid gel on periodontal tissue
regeneration
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口演 2： 脳由来神経栄養因子による歯周組織再生促進
柴 秀樹、武田 克浩、藤田 剛、栗原 英見
広島大学大学院医歯薬学総合研究科先進医療開発科学講座歯周病態学分野
神経栄養因子の１つである脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor、BDNF)は、高親和性
受容体である TrkB に結合することによって、中枢及び末梢神経系において神経細胞の発生、生存、分化な
どの機能維持に重要な役割を果している。また、BDNF の低親和性受容体として、p75NTR がある。
歯周炎は細菌感染とそれに対する宿主応答の結果、歯周組織の破壊がおこる感染症である。歯周治療に
おいて、破壊された歯周組織の再生を促進させる歯周組織再生療法に期待が集まっている。歯周治療の最
終目標は、失われた歯周組織の再生であり、歯周靭帯線維の埋入を伴った新生歯槽骨と新生セメント質、お
よび歯周靭帯を再構築することである。このような機能的歯周組織の再構築を導くためには、象牙質表面へ
のセメント質形成が必要である。現在臨床応用されている歯周組織再生療法としては、 Guided Tissue
Regeneration 法、あるいはブタ由来のエナメルタンパク質が主成分とされる種々の因子を含んだ抽出物を塗
布するエムドゲイン法などが挙げられるが、多様な歯周組織病変に対応するためには、細胞分子レベルでの
科学的根拠に基づいた、安全性・確実性の高い、術式が容易な生物学的な再生療法の開発が望まれる。
BDNF の治療効果が運動神経障害モデル、パーキンソン病モデル、アルツハイマー病モデルなど各種疾
患モデルを用いた動物実験で検討されている。BDNF は神経細胞のみならず，骨芽細胞、免疫担当細胞など
様々な細胞の増殖，分化に関与することから、私たちは BDNF が細胞機能を積極的に制御し、歯周組織再生
に関与するという仮説をたてた。この仮説を証明するため、以下のように、in vitro および in vivo の両面から研
究を行った。
(1) in vitro
BDNF によるセメント芽細胞の機能発現機序を明らかにするために，細胞内シグナル分子に着目し、培養ヒ
トセメント芽細胞のセメント質・骨関連タンパク質 mRNA 発現および細胞生存へ及ぼす BDNF の影響を検討し
た。また、組織の再生には標的細胞の機能制御ばかりでなく、血管新生が不可欠であることから、血管内皮細
胞の機能に及ぼす BDNF の影響を調べた。
(2) in vivo
臨床応用の際、歯周組織再生のために、安全性が高く、安価な移植材が使用される必要がある。合成高分
子ヒアルロン酸(HA)は、低分子 HA と比較し吸収されにくい、高い粘性、高い生体親和性、抗炎症作用、安全
などの特徴を有する。そこで、ビーグル犬に実験的に作製した歯周組織欠損モデルにおける BDNF/合成高
分子 HA（電気化学工業株式会社）複合体の効果を検討した。
これらの研究成果を紹介し、BDNF が歯周組織再生治療薬になりうる因子であることを提案する。
学習目標
1. BDNF によるセメント芽細胞の骨・セメント質関連タンパク質発現と生存の制御メカニズム
2. BDNF の血管新生作用
3. 歯周組織再生における BDNF/高分子 HA 複合体の有用性
略歴
柴 秀樹 広島大学大学院医歯薬学総合研究科先進医療開発科学講座歯周病態学分野
平成元年 広島大学歯学部卒業
平成 5 年 広島大学大学院歯学研究科修了（歯学（博士））
平成 5 年 広島大学歯学部附属病院医員
平成 5 年 広島大学歯学部助手
平成 14 年 広島大学大学院医歯薬学総合研究科助手
平成 14 年 ルイビル大学歯学部ポストドクトラルリサーチフェロ－
平成 16 年 広島大学大学院医歯薬学総合研究科助手
平成 17 年 広島大学病院講師
平成 21 年 広島大学病院診療准教授
受賞歴
・日本歯科保存学会奨励賞 （1997 年）
・日本歯周病学会学術賞 （2006 年）
・日本歯内療法学会デンツプライ賞 （2009 年）
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Oral presentation #3
Implementation of new clinical technology using living cell: For safety and efficacy.
Ken-ichiro Hata
Japan Tissue Engineering Co., Ltd. R&D Dept.
A medical procedure by using various living cells has been a hot topic as “Regenerative Medicine”. It was an
explosive boom coupled with the fact of inquisitive mind for new technology for patients’ treatment and interest
for its industrialization. Especially, “Tissue Engineering” defined as new fabricating methods using cells,
scaffolds and signal molecules showed the potential for new era of tissue and/or organ transplant technology in
1993. In Japan, Regenerative Medicine was born from the concept of Tissue Engineering, and it got many
researcher, clinician, regulator, entrepreneur into the boom.
On the other hand, Tissue Engineering for dental treatments has various advantages compared with the other
body area. In general, a cell therapy using autologous living cells must spend much time and costs to make
enough volume of cells to transplants. It might be pious hope. However, small amount of cells are needed for
the treatment of dental region such as alveolar bone and gingival tissue. We have fabricated and transplanted
various cultured oral tissues to treat many patients who had oral tissue defects.
As the living cells become widely used for clinically, the safety of that kind of treatment was discussed in
some detail. Many points such as carcinogenesis in these cells, infective agent in culture medium,
environment of culture space should be considered. Most people want to get the medical treatment with
virtually no risk, and tend to focus on the safety of the cell treatment. There are lag behind in the
industrializations of regenerative medicine technology in EU and US nations.
In this situation, we established a venture company “Japan Tissue Engineering Co., Ltd.” to make
industrialization for autologous cultured epidermis as a tissue engineering product. Around that time, there were
few guidelines for making medical product using living cells/tissues and for its clinical trial in Japan. As we
obtained a big support (approximately 1 billion yen) from The Organization for Pharmaceutical Safety and
Research for the establishment, we strongly felt responsibility as a pioneer in the field of regenerative medicine
in Japan.
Our autologous cultured epidermis, called JACE, the first tissue-engineered product using human cells/tissues
in Japan, was approved for manufacturing and sales in 2007, and listed as item covered by the national health
insurance in January, 2009. As we have problems and troubles because of poor experiences in this field, the
business is not going well until now. With regard to autologous cultured cartilage, we hope the good business in
the near future.
In my presentation, I would like to show the treatment procedures by using cultured cells for oral region as
regenerative medicine. Especially, I will focus the clinical treatments of alveolar tissue by cultured periosteum.
Moreover, the Japanese guidelines of regenerative medicine will be shown to keep the safety of these treatments.
I hope that the audience will enjoy my presentation and catch a useful hint for cell therapy.
-16-
口演 3： 培養細胞を使った医療の実現 －安全性・有効性の確保について－
畠 賢一郎
(株)ジャパン・ティッシュエンジニアリング 研究開発部
再生医療の名のもと、生きた細胞を使った医療が話題となっている。新しい治療方法への探求心や産業化
への興味も相まって、ひとつのブームにもなってきた。とりわけ 1993 年に報告された Tissue Engineering と呼ば
れる概念は、培養細胞を用いた医療への可能性を示したものであり、このブームの火付け役になった。この
Tissue Engineering がわが国では再生医学となって、さまざまな研究者、医療従事者、規制当局、産業界のメ
ンバーを巻き込むこととなった。
一方、歯科領域は生きた細胞を使った再生医療を実施する上で、多くの長所を有している。一般に自家の
培養細胞を使った再生医療では、培養細胞の大量確保に時間とコストを要し、現実的な治療になりにくいこと
が指摘されている。その点歯科領域は、歯槽骨にせよ歯肉にせよ、少量の組織で治療目的を達することがで
きる。われわれは、1990 年はじめから口腔領域の細胞を用いた培養組織を作製し、さまざまな患者治療を行
っている。
生きた細胞を用いた医療が盛んに行われるにつれ、その治療の安全性について多くの議論がなされるように
なった。培養細胞自体が腫瘍細胞に変わっていないか、用いられる培養液は感染性物質を含んでいないか、
培養する施設は適切な環境下にあるか、など懸念事項は多い。とりわけリスクフリーの医療を求めがちなわが
国では、これら安全性に関する懸念事項が注目されるばかりで、欧米に比べて圧倒的に遅れてしまう結果を
よんだ。
このような経緯の中で、演者らは 1999 年、再生医療の普及を目的に株式会社ジャパン・ティッシュエンジニ
アリングを設立した。当時、わが国においては自家細胞を事業化するための明確なガイドラインはほとんど無
く、臨床試験におけるガイドラインも無かった。設立にあたっては医薬品機構から約 10 億円の融資を受け、わ
が国の再生医療の発展の担うものとしての責務を感じた。当社では自家培養表皮『ジェイス』を開発し、2007
年に製造販売承認を受けた後、本年 1 月に保険収載に至った。『ジェイス』は患者自身の細胞を使った再生
医療製品で、わが国で初めて製品化されたものである。患者自身の細胞を使った製品に関する経験が無い
ため、さまざまな困難に直面しており、現状においても決してスムーズに事業化できていると言えない。今は、
培養軟骨についても開発を行っており、近い将来、ともに普及していきたいと考えている。
本口演では、歯科領域における細胞を用いた再生医療の例をお示ししたい。特に骨膜細胞を用いた歯槽
骨再生など、臨床治療への応用例を示すこととする。さらに、これら細胞を用いた治療において、安全性の確
保など考慮すべき事項についてわが国のガイドラインをもとに解説したい。参加された方々の細胞治療への
興味に貢献できればと思っている。
略歴
畠 賢一郎 株式会社ジャパン・ティッシュエンジニアリング 常務取締役 研究開発部長
1964
愛知県出身
1991
広島大学歯学部卒業
1995
名古屋大学大学院医学研究科博士課程修了
1996
名城病院歯科口腔外科医員
1997
名古屋大学医学部口腔外科学講座助手
2000
名古屋大学医学部組織工学寄附講座助教授
2002
名古屋大学医学部附属病院遺伝子・再生医療センター助教授
2004
株式会社ジャパン・ティッシュエンジニアリング 取締役 研究開発部長
2009
現職
専門
再生医療、組織工学、口腔外科学（顎変形症、口唇口蓋裂等の外科治療）
口腔外科医として臨床治療に携わる傍ら、培養細胞を用いた移植医療を実施。日本組織工学会事務局長、Asian Tissue
Engineering Society (Secretary General) 等を経て再生医療の普及に努める。1999 年(株)ジャパン・ティッシュエンジニアリング
設立時に、アカデミアから協力。2004 年名古屋大学を退職後、再生医療の産業化を通じた普及を目指し、 本格的に同企業取
締役に就任。
-17-
Oral presentation #4
Isolation and characterization of dental pulp stem cells
Masaki Honda
Department of Anatomy, Nihon University School of Dentistry
Dental pulp cells maintain the homeostasis of mineralized dental tissues. Most pulp cells are in the
postmitotic stage, although some cells continue to divide and give rise to new pulp cells, and are able to
differentiate into odontoblasts and to form new dentin. Recently, multipotent stem cells derived from the dental
pulp tissues have been identified as being highly proliferative, clonogenic cells that are capable of
differentiating into various cell types, including adipocytes and odontoblasts. Adult dental pulp-derived stem
cells express MSC markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, whereas they are negative for
hematopoietic and endothelial markers, including CD14, CD31, CD34, and CD45 . These expression profiles
are commonly found among MSC populations. In contrast to BMMSCs dental pulp-derived MSCs is little
information on the molecular functions, e.g., surface markers, of dental pulp stem cells. The characterization of
dental pulp stem cells is essential for understanding the mechanism and pathways of their differentiation.
In the present study, we attempted to identify a new marker in dental pulp cells and to elucidate the functions
in MSCs. We show that the certain cell populations that migrate from dental pulp tissues inhibit osteogenic and
adipogenic differentiation in vitro.
-18-
口演 4： 歯髄幹細胞における新しい幹細胞マーカー
本田 雅規
日本大学歯学部解剖学教室Ⅱ講座
目的
われわれは成体細胞から歯を再生する方法の確立を目指しているものの、解決すべき事柄がまだ多く残さ
れている。その一つとして培養細胞からの歯の再生が困難であることが挙げられる。今までに、生後 6 ヶ月の
ブタ歯胚から取り出した歯胚細胞を担体に播種して移植すると歯の組織が再生することはすでに報告してい
る。しかし、この歯胚細胞を培養した後に移植しても歯の組織は再生しない。
歯はエナメル質、象牙質およびセメント質の 3 つの硬組織から構成され、それぞれの硬組織を形成する細
胞は異なり、歯胚にはエナメル質を形成する歯胚上皮細胞、象牙質を形成する歯髄細胞およびセメント質を
形成する歯小嚢細胞が存在する。つまり、培養細胞から歯を再生させるには、これらの細胞の組織形成能を
維持したまま培養することを可能にしなければいけない。いままでに、われわれは、エナメル質形成能および
セメント質形成能を維持しながら歯胚上皮細胞および歯小嚢細胞を培養することに成功しているものの、歯髄
細胞については未だその条件がわかっていない。そこで、現在、歯髄細胞の組織形成能を維持しながら培養
する方法を見出すことを目的に研究している。この発表では、歯髄組織から細胞表面抗原を用いて幹細胞を
取り出しその特性を解析し、これらの解析を通じて歯髄細胞の未分化の維持に関与すると思われる因子を見
出したので報告する。
材料と方法
日本大学歯学部の倫理委員会の承認および患者の同意を得た後に、抜歯した歯から無菌的に歯髄組織
を取り出し組織を小片にして 20%血清含有培地を用いて組織培養法にて歯髄細胞を培養した。培養した歯髄
細胞を回収し、fluorescent analysis cell sorting system（FACS）によって、間葉系幹細胞と造血系幹細胞のマ
ーカーを用いて培養歯髄細胞の発現パターンを解析した。次に、これらの表面抗原の多重染色法によって各
歯髄細胞群を FACS によって単離した。単離したそれぞれの歯髄細胞群の細胞増殖能と骨芽細胞と脂肪細
胞への分化能を検討した。
結果と考察
培養歯髄細胞を多重染色して FACS にて単離すると、細胞増殖が速くて、骨芽細胞および脂肪細胞への
分化が抑制されている歯髄細胞群を見出した。つまり、この因子が歯髄細胞の未分化性に関与していること
が示唆された。
略歴
本田 雅規 日本大学歯学部解剖学教室Ⅱ講座
平成元年 3 月
愛知学院大学歯学部歯学科卒業
同6月
医療法人積善会 研修医（歯科）
平成 5 年 4 月
名古屋大学医学部附属病院医員(口腔外科)
同 11 月
国立名古屋病院レジデント(口腔外科)
平成 5 年 6 月
名古屋大学医学部附属病院医員(口腔外科)
平成 8 年 1 月
愛知医科大学分子医科学研究所 研究員
平成 12 年 3 月
医学博士(名古屋大学医博 1337 号)
同4月
名古屋大学医学部附属病院医員(口腔外科)
平成 12 年 9 月
Forsyth Institute, Harvard-Forsyth Oral Biology, Boston, USA (Research Fellow)
平成 13 年 9 月
名古屋大学医学部附属病院医員(口腔外科)
平成 14 年 7 月
名古屋大学医学部附属病院医員（遺伝子再生医療センター）
平成 15 年 7 月
東京大学医科学研究所・幹細胞組織医工学・歯胚再生学・助手
平成 19 年 4 月
東京大学医科学研究所・幹細胞組織医工学 助教
平成 20 年 4 月
日本大学歯学部解剖学教室 II 講座 専任講師
現在に至る
-19-
Oral presentation #5
Observation of the interface at cell-material adhesion
Akiko Yamamoto
Biomaterials Center, National Institute for Materials Science
Objective
Cell-material adhesion is one of the important events for the materials used in biomedical devices because
they are always used adjacent to living cells. Cell adhesion onto substrate can control various cellular
functions such as cell migration and growth as well as immune response to the implanted devices. Therefore,
it is important for these devices to have optimal interface between cell and device surface. To construct
optimal cell-material interface, it is important to understand interface structure between cell and material. In
this study, we observe cell-material interface using interference reflection microscopy (IRM)during cell
detachment by applying shear force.
Methods
About 2×104 cells of human normal diploid fibroblast, IMR-90, were seeded into the 10 mL of Eagle’s
minimum essential medium (MEM) supplemented with 10 vol. % of fetal bovine serum and 20 mmol/L of
N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid (HEPES) on the glass-bottom dish and cultured for 24
or 48h at 37 ºC in a 5% CO2-incubator prior to the observation. Extracellular matrix (ECM) such as
fibronectin and laminin is occasionally coated onto the dish.
A cell adhering to the glass was detached by applying shear force using a cantilever, and cell detachment
process is observed by IRM and recorded on the videotape through a CCD camera equipped with the
microscope.
Results
Under the observation of IMR-90 by IRM, focal adhesion appears as a black region where the distance
between the glass surface and the cell membrane is 10-15 nm. Close contact appears as a gray region where
the distance between the glass surface and the cell membrane is about 30 nm. A white region is the place
where the distance between the glass surface and the cell membrane is greater than 100 nm, that is, the cell
membrane does not attach to the glass surface. Coating the glass with fibronectin increased focal adhesion
and close contact region whereas coating with laminin decreased them. These facts suggest that the kind of
extracellular matrices adsorbing onto material surface controls the condition of cell-material adhesion such as
adhesion molecules used, adhesion area, and strength.
After the detachment of IMR-90, focal adhesion remained on the glass surface where cell had attached. Most
of close contact parts also remained as well.
Immunofluorescent staining revealed that β1-integrin remained in the focal adhesion and close contact on the
glass surface after cell detachment, suggesting that cell detachment by shear force induced the fracture of
cell-material adhesion inside the cell, leaving transmembrane integrins on the material surface. Fibronectinand laminin-coating did not change the fracture point of cell-material adhesion.
Conclusion
ECM such as fibronectin and laminin controls the condition of cell-material adhesion such as adhesion
molecules, area, and strength, however, cell detachment caused by shear force results in the fracture of
cell-material adhesion inside cell even in the cases of ECM coatings.
口演 5： 細胞接着における基質―細胞間インターフェースの観察
山本 玲子
物質・材料研究機構 生体材料センター
病気や事故・老化などで失われた機能を補うために、生体内に埋入されて、あるいは生体組織と接した状
態で用いられる材料を生体材料（バイオマテリアル）と呼ぶ。これらは、必ず生体分子・組織と接した状態で使
用される点が、一般の構造材料・機能材料とは異なる。これらの材料が、求められる期間、その機能を十分に
発揮するためには、材料と生体組織・分子との界面構造（バイオインターフェース）が重要である。
例えば、材料と血液が接触すると、材料表面で即座に血液凝固反応が生じる。その結果、埋込型血液モニ
タリング装置では、センサ表面が血栓で覆われ機能できなくなり、また小口径人工血管では、血栓により血管
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が閉塞し、血流を確保できなくなる。血液に限らず、他の生体組織と接する場合でも、形成されるバイオインタ
ーフェースは重要である。例えば、カテーテルやシャントの留置部位や人工歯根などの皮膚・粘膜貫通型デ
バイスにおいて、軟組織と材料間の強固な結合が維持できず、感染が生じることがある。このようなケースを
防ぐためには、デバイスの目的にあったバイオインターフェースを構築する必要がある。
バイオインターフェースの構築には、材料と生体分子・組織が接触した際の界面構造およびその形成機構
の解明が重要である。そこで、本研究では生体組織である細胞と材料の界面に着目し、細胞接着における材
料―細胞界面の変化を、材料―細胞表面間の距離変化をナノメーターオーダーで判別可能な干渉反射顕
微鏡法（IRM）により観察し、材料―細胞間の接着界面の構造を調べることを目的とした。
細胞は、ヒト正常線維芽細胞である IMR-90 を用いた。厚さ約 0.17mm のガラスボトムディッシュ上で培養し、
我々が独自に開発した細胞剪断接着力測定装置により、カンティレバーを用いて剪断力を加えながら 1 個の
細胞をガラス表面から剥離させた。その際の材料―細胞間接着界面を IRM により観察し、顕微鏡に取り付け
た CCD カメラにより静止画および動画撮影した。
IRM では、ガラス表面と細胞表面の距離が 10-15nm 以下の場合は黒色に、30nm 前後の場合は灰色に、
100-150nm の場合は白色に観察され、黒色の部分が接着斑に相当する。接着斑では、細胞膜貫通タンパク
質であるインテグリンが細胞外マトリックス（フィブロネクチン、ラミニンなど）を介して材料表面に接着している。
また、細胞骨格の一つであるアクチンフィラメントの終端部が細胞内部に存在する接着斑会合タンパク質（ビ
ンキュリン、テーリンなど）を介してインテグリンに結合している。剥離後の IRM 像では、細胞本体は剥離により
除去されているにも拘らず、接着斑部分のほとんどがガラス表面に残存しているのが観察された。しかしなが
ら、位相差顕微鏡では、剥離時の細胞破壊は観察されていない。このことは、インテグリン等の接着斑形成タ
ンパク質と材料表面間の結合は破断せず、インテグリンや細胞内部の接着斑会合タンパク質間の結合が破断
し、膜タンパク質が細胞膜から脱離したことを示唆している。剥離後のガラス表面を FITC 標識抗 1 インテグリ
ン抗体で染色したところ、接着斑部にインテグリンが残存することが確認され、上記の仮説が支持された。位
相差顕微鏡により細胞の破壊が観察されない理由として、位相差顕微鏡ではナノオーダーの解像度が得られ
ないこと、および膜タンパク質の一部を失っても細胞膜がすぐに再構成されて細胞の形状を保つことが考えら
れる。
ガラス表面をフィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックスで被覆し、同様の実験を行った。用いた
IMR-90 は線維芽細胞であるため、フィブロネクチンへの親和性は高いが、基底膜中に存在するラミニンへの
親和性は低い。そのため、前者での被覆により優位に接着斑面積やストレスファイバー形成量を増加させた
が、後者での被覆により接着斑面積は減少し、中間径線維によると思われる細胞骨格を形成していることが観
察された。また、細胞接着力は前者での被覆により向上したが、後者での被覆により減少する傾向が認められ
た。しかし、いずれの細胞外マトリックスによる被覆でも、剪断力負荷による剥離では細胞内で材料―細胞間
接着が破壊され、ガラス表面には細胞膜インテグリンが残存する点は被覆無しの場合と同じであった。
以上より、細胞が剪断力負荷により剥離する際、剥離点は材料―細胞間界面ではなく細胞内部であることが
判明した。これまで、細胞接着性向上を目的としたバイオインターフェース設計では、細胞接着性タンパク質
の固定化を目的とした材料表面修飾が検討されてきたが、実際の剥離現象が細胞内部で発生することを考え
ると、細胞の内部構造を考慮したインターフェース構築が求められていると言える。
略歴
山本 玲子 物質・材料研究機構 生体材料センター
1993 年
国際基督教大学大学院理学研究科修士課程修了
1993 年
科学技術庁金属材料技術研究所生体材料研究チーム 研究員
1998 年
博士（工学）取得（京都大学）
2001年
独立行政法人物質・材料研究機構生体材料研究センター主任研究員
2007 年
独立行政法人物質・材料研究機構生体材料センター グループリーダー 現在に至る
2004 年～ 金沢工業大学連携大学院客員教授（兼任）
2007 年～ 岡山大学連携大学院客員教授（兼任）
2008 年～ 筑波大学連携大学院准教授（兼任）
受賞等：
1996 年 9 月
1999 年 3 月
2004 年 9 月
2004 年 11 月
1995 年度日本金属学会論文賞
インテリジェント材料フォーラム高木賞'99
2004 年度日本金属学会技術開発賞
日本バイオマテリアル学会科学奨励賞受賞
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Oral presentation #6
The role of IL-1 in the pathogenesis of periodontal disease
Yuichi Ishihara, Hidehiko Kamei, Yosuke Kamiya, Yusuke Ozawa, Hiroki Mizutani, Mariyo Suzuki,
Takaho Kuroyanagi, Norimitsu Shirozu, Toshihide Noguchi
Department of Periodontology, School of dentistry, Aichi-gakuin University Nagoya,Japan
Periodontal infections induce inflammation and promote tissue injury including bone resorption and tooth
loss. Lipopolysaccharide and capsular polysaccharide from Gram-negative bacteria induce bone resorption and
osteoclast formation in vitro and interleukin-1 related molecules (IL-1s) are important in mediating these events.
Thus, a better understanding of IL-1s may promote better periodontal disease diagnosis, treatment, and
prognosis.
Accordingly, we collected gingival crevicular fluids (GCF) from periodontitis patients categorized by
periodontal disease severity. IL-1α, β, and Ra were measured in GCF and the levels of α & β were related to
disease severity. Interestingly, the level of IL-1β was not changed with the periodontal treatment, and we reason
that the ability to better control IL-1β may be helpful in periodontal treatment.
The type 2 IL-1receptor (IL-1R2) does not have a cytoplasmic signaling domain and may serve as a decoy
receptor capable of inhibiting the biological activity of IL-1. The mechanisms regulating IL-1R2 production in
periodontal tissue may provide information relevant to periodontal treatment. Therefore, we investigated the
levels of IL-1R2 in GCF and genetic polymorphisms in the IL1R1 and IL1R2 in the IL-1 gene cluster in the
Japanese population. The sIL-1R2 levels were higher in GCF samples from Chronic periodontitis patients than
from Aggressive periodontitis (AgP) patients. Significant differences between patients with AgP and controls in
the frequency of 3 SNPs and 3 haplotypes in IL1R2 were found (p<0.05). Gingival epithelial cells (GE cells)
were used to study IL-1R2 production. The levels of IL-1R2 mRNA from GE cells cultured with IL-4 and IL-13
increased, and the levels in cells cultured with IFN-g decreased (P<0.01)). Moreover, phosphorylation of
STAT6 was essential for IL-1R2 production from GE cells, stimulated with IL-4 and IL-13.
In short, we reason that the levels of these IL-1 related molecules in GCF may be useful biomarkers
indicative of disease activity. Moreover, balancing the pro-inflammatory vs anti-inflammatory IL-1 related
molecules may be therapeutic in periodontitis.
Learning objectives
1. The relationship between the levels of IL-1s and clinical characteristics.
2. IL-1R2 genetic polymorphisms in the IL1R1 and IL1R2 in the IL-1 gene cluster in a Japanese population and
IL-1R2 production from gingival epithelial cells
3. The IL-1s as possible treatment biomarker or therapeutic agents for periodontitis.
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口演 6： 歯周病における IL-1 の働き
石原 裕一，亀井 英彦，神谷 洋介，小澤 佑介，水谷 大樹，鈴木 万里代，黒柳 隆穂，
白水 紀充，野口 俊英
愛知学院大学 歯学部 歯周病学講座
歯周病は歯周病関連細菌の感染に伴う局所の炎症性骨破壊により，歯を喪失する疾患であることが知られ
ている．そこで発表者のグループは歯周病関連細菌の内毒素（LPS）や莢膜多糖（CP）が in vitro の実験系に
おいて，骨吸収活性や破骨細胞形成能を有することを明らかにし，その一連の研究の中で LPS や CP による
骨吸収に，インターロイキンー１(IL-1)が深く関与していることを明らかとした．そこで歯周組織での IL-1 の動
態を把握できれば，診断，治療の効果および予後の予測に非常に有効になると考え，歯周病患者より歯肉溝
浸出液（GCF）を採取し，重症度や病態の違いが IL-1 ファミリーの産生量にどのような反映されるかを調べた
ところ， GCF 中において，IL-1 と IL-1 のインヒビターとして知られている IL-1 レセプターアンタゴニスト
（IL-1Ra）は歯周炎が重症になるに従い，アゴニストとしての IL-1 は増加し，IL-1Ra は減少したことを報告した．
（J. Periodont. Res., 32:524-529; 1997）しかし，歯周治療の前後で GCF 中の IL-1 と IL-1Ra を調べたところ，
IL-1βは歯肉の炎症が臨床的にコントロールされても，変化しにくい傾向が認められた．そこで Il-1βに高い
結合力を有し，IL-1Ra と同様に IL-1 の活性調節に働く IL-1 レセプタータイプⅡ（IL-1typeⅡR）に注目し研究
を進めたところしたところ，可溶性 IL-1typeⅡR は侵襲性歯周炎患者の方が慢性歯周炎患者に比べ検出され
ない場合が多かった．(J Periodontol, 79:495-500, 2007)さらに，その発症に遺伝的関与が示唆されている侵
襲性歯周炎患者の IL-1typeⅡR 遺伝子多型を健常者との間で調べたところ，アリル頻度においてもハプロタ
イプ頻度においても有意差が認められた．また歯肉上皮細胞を用いて IL-1typeⅡR の発現に関与するサイト
カインについても検討を加えたところ，IL-1typeⅡR は IL-4,IL-13 によって産生が亢進し，IFN-γによって産
生が抑制されることを明らかとした．以上のことから，最後に IL-1 ファミリーの治療におけるマーカーおよび治
療薬としての可能性についてお話しする．
学習目的
１．GCF 中の IL-1 ファミリーの産生と臨床所見との関連
２．IL-１レセプタータイプⅡ遺伝子多型と局所での産生量および歯肉上皮細胞での
IL-１レセプタータイプⅡ産生メカニズムの解析
３．IL-1Ra や IL-１レセプタータイプⅡのマーカーおよび治療薬としての可能性
略歴
石原 裕一 愛知学院大学歯学部歯周病学講座 准教授
1961 年
愛知県出身
1987 年
愛知学院大学歯学部卒業
1992 年
愛知学院大学大学院修了 博士（歯学）
1992 年
愛知学院大学歯学部 助手（歯周病学講座）
1997-1999 年 バージニア州立大学 客員研究員 （細菌・免疫学講座）
Clinical Research Center for Periodontal disease
2000 年
愛知学院大学歯学部 講師
2007 年
愛知学院大学歯学部 准教授
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Oral presentation #7
A behavior of osteoblast-like cells on microgrooved surface in vitro
Kenichi Matsuzaka
Oral Health Science Center hrc7, Department of Clinical Pahthophysiology, Tokyo Dental College
Recently dental implant therapy has been one of the useful treatment prosthedontically. Dental implant is
necessary the osseointegration, and there are many types of dental implant surface for successful of
osseointegration. If implant surface has a function of controlling osteoblasts behavior, successful of implant
therapy can be fixed. This presentation shows that microtopography affects the osteoblast behavior.
Microtopography is divided into two types, i.e. microroughness and microtexture, and microtexture.
Although it is known that microtexture can control the cell’s spread and moving, osteoblast behavior on
microtexture has not been well known. So, the aim is this study is to investigate the osteoblast behavior on
microgrooved surface in vitro. Polystyrene substrates with microgroove and ridge with width of 1, 2, 5 and 10
µm and depth of 1 µm were manufactured. Rat bone marrow (RBM) cells obtained from femur were used as
osteoblasts. For the evaluation, SEM, TEM, and CLSM with vinculin and with tetracycline assay were carried
out. In SEM findings, RBM cells on microgrooved surface spread align to the groove, but RBM cells on smooth
surface spread at random orientation. RBM cells on 1 or 2 µm wide microgrooved surface attached on the ridge,
but on 5, 10 µm wide microgroove and smooth surface attached on both ridge and groove bottom. Mineralized
extracellular matrix was also deposited align to the microgrooves. In TEM findings, RBM cells on 1 or 2 µm
wide microgroove attached on the ridge with high density area. In CLSM findings with vinculin, many positive
portions were observed in RBM cells on microgooved surface. In tetracycline assay, mineralized extracellular
matrix manufactured by RBM cells on microgrooved surface was deposited wider than smooth surface. In
conclusion, microgroove can control the osteoblast behavior and mineralized extracellular matrix deposition.
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口演 7： Microgroove による骨芽細胞動態制御に関する in vitro 的研究
松坂 賢一
東京歯科大学・口腔科学研究センターhrc7・臨床検査学研究室
近年、歯科医療の中でのインプラント治療は、一つの確立された補綴医療になってきたといっても過言では
ない。現在のインプラントは顎骨骨組織とのオッセオインテグレーションなしでは、その成功がないとも言える。
オッセオインテグレーションを獲得するために、様々なインプラント体表面の性状や形態が考案されている。ま
た、骨基質を形成する骨芽細胞をコントロールすることはインプラント治療の更なる成功へと導くものと考えら
れる。本発表では、表面微細構造が骨芽細胞に与える影響および細胞動態について紹介する。
表面微細構造は塑造面と幾何学的構造とに分けられるが、骨芽細胞の特定方向への動態をコントロールす
るために幾何学的構造を用いた。特に、微細溝として深さ１μｍで、幅が１、2、5、10μｍの microgroove を付
与したものとした。骨芽細胞として、ラット大腿骨骨髄より得られた RBM 細胞を分化誘導培地にて初代培養し
たものを microgroove 上および対照の smooth 上に播種した。評価方法は、走査電顕にて細胞の形態変化お
よび細胞が作り出した石灰化基質の状態を観察し、透過電顕にて細胞の基質接着状態を検索した。また、共
焦点レーザー顕微鏡により骨芽細胞の基質接着タンパクを観察し、テトラサイクリンアッセイを応用した石灰化
基質形成範囲を計測した。走査電顕による観察では、Microgroove 上での骨芽細胞はどのサイズのものでも、
groove に沿って伸展していたが、1 および 2μｍの幅のものでは、骨芽細胞が groove 内に入り込まず、リッジ
上で伸展していた。透過電顕による観察でも、1 および 2μｍの幅の microgroove 上での骨芽細胞はリッジ上
に密着して接着している像が観察された。また基質接着タンパクである vinculin を蛍光抗体法を応用して観察
した結果、smooth 上に比較して microgroove 上での vinculin 陽性部位の量が多いことが明らかになった。さら
に、骨芽細胞が作り出す石灰化基質の範囲を計測した結果、広い範囲で基質が沈着していた。in vitro 的に、
1－2μｍの幅を有する microgroove は骨芽細胞をの動態を積極的にコントロールすることが可能である。
略歴
松坂 賢一 東京歯科大学臨床検査学研究室准教授 東京歯科大学口腔科学研究センターhrc7
１９６５年 東京都出身
１９９０年 東京歯科大学卒業
１９９４年 同大学院博士課程修了（解剖学専攻）
１９９４年 東京歯科大学助手（病理学講座）
１９９７年 オランダ・ナイメーヘン大学 Biomaterials 学留学（1998 年まで）
１９９９年 東京歯科大学講師（病理学講座）
２００１年 東京歯科大学臨床検査学研究室へ配置換え
２００４年 東京歯科大学准（助）教授（臨床検査学研究室）
死体解剖資格認定医、口腔病理専門医、インプラント学会基礎指導医
-25-
Oral presentation #8
Amino acid derivative-mediated bone biomaterial’s multifunctionalization for bone regeneration
Masahiro Yamada
Department of Removable Prosthodontics & Gerodontology, Tokyo Dental College
Session Description:
Development of bone biomaterials such as cellular scaffolds and osteogenic growth factors has been required
to achieve morphofunctional reconstruction of massive defect and degenerative change in limb bone and
edentulous jaw. However, current bone substitutes and exogenous growth factors still have some concerns in
light of the biocompatibility or pharmacokinetics. Here, we will present an antioxidant amino-acid derivative
(AAD) that can overcome these problems and function as a multifunctional molecule contributing to bone
regeneration.
Commercially available collagenous matrix, membrane and calcium phosphate-based bone substitute induced
osteoblastic cell death and functional disorder. However, AAD-pretreatment of materials offered alleviation of
biological adverse effects on osteoblasts, as shown by reduced apoptotic incidence, increased attached cell
number, improved cellular adhesion and restored alkaline phosphatase activity on materials. These adverse
reactions of osteoblasts to materials accompanied extraordinary generation of intracellular reactive oxygen
spiecies, which was prevented by pretreatment of materials with AAD.
Additionally, we found that the AAD can function as an osteogenic enhancing molecule. AAD markedly
upregulated gene expressions of bone-related marker, particularly osteocalcin and, enhanced mineralized
extracellular matrix production up to 6-times as compared to those in osteoblastic culture without AAD-addition.
AAD-containing collagen matrix accelerated bone regeneration in the rat femoral critical size defect as
compared to the matrix without AAD. Thicker and denser trabeculae were yielded in the defect filled with
AAD-containing matrix than with collagen matrix alone. Further, AAD-containing collagen matrix achieved
bone augmentation beyond the existing rat femur cortical bone level as opposed to the matrix alone resulting in
little supracortical bone formation.
Other shows that marked increase of proinflammatory cytokine release from human osteoblasts on bone
substitute was prevented by pretreating material with AAD, indicating AAD’s anti-inflammatory potential. In
addition, AAD can ameliorate hyperproliferation of fibroblasts on collagenous matrix without cytotoxicity,
which implies AAD-mediated control of undesirable fibrous invasion into bone forming site in vivo.
Those AAD’s multiple functions favoring bone regeneration would promote the clinical application of this
unique molecule as an osteogenic enhancing factor for bone reconstructive therapies.
Learning Objectives:
Audience will learn presence of detrimental effects on osteoblasts in currently used bone biomaterials, an
association between material’s cytotoxicity and oxidative stress, AAD-mediated detoxification of the materials
and a newly found osteogenic enhancing effect of AAD. Also, participants can feel a new perspective on
biomaterial science.
-26-
口演８： アミノ酸誘導体による骨生体材料の多機能化
山田 将博
東京歯科大学有床義歯補綴学講座
セッションの解説
足場材料や骨形成促進因子のような骨生体材料の発展が、四肢の骨や無歯顎骨の大規模な欠損や退行
性変化の形態と機能の再建を達成するために求められている。しかし、現存の骨代用材や外因性成長因子
は未だその生体親和性や薬物動態の観点でいくつか懸念を有する。我々は、これら問題を克服し、骨再生に
寄与する多機能性分子として働くことができる、ある抗酸化アミノ酸誘導体(AAD)をここに紹介する。
商業用コラーゲンスポンジと膜、リン酸カルシウムベースの骨代用材は骨芽細胞死と機能不全を引き起こし
た。しかしながら、材料を AAD で前処理することで、材料上のアポトーシス発生率の減少、付着細胞数の増加、
細胞接着の改善、アルカリフォスファターゼ活性の回復で示されたように、骨芽細胞への生物学的為害作用
は減弱した。これら材料に対する骨芽細胞の有害反応は細胞内活性酸素種の異常発生を伴った。そして、そ
れは材料を AAD で前処理することで防がれた。
加えて、我々は AAD の骨形成促進因子としての機能を発見した。AAD 未添加の培養骨芽細胞と比べて、
培養液中に AAD が添加された骨芽細胞では、骨基質関連マーカー、特にオステオカルシンの遺伝子発現を
著明に上げ、また、石灰化細胞外基質産生を 6 倍以上増加させた。AAD 添加コラーゲンスポンジは、未添加
のコラーゲンスポンジと比べて、ラット大腿骨クリティカルサイズ骨欠損内の骨再生を加速させた。コラーゲンス
ポンジ単体よりも厚く、密度の高い骨梁構造が AAD 添加コラーゲンスポンジによって骨欠損内にもたらされた。
さらに、ラット大腿骨垂直的骨増生モデルにおいて、皮質骨上の骨形成をほとんど生じさせなかったコラーゲ
ンスポンジ単体とは対照的に、AAD 含有コラーゲンスポンジは既存の皮質骨レベルを越えた骨増生を達成し
た。
その他に、骨代用材上で著しく増加する骨芽細胞からの炎症性サイトカイン産出は、材料を AAD で前処理
することにより未然に防がれた。つまり、AAD は抗炎症作用を有する可能性が示唆された。さらに、AAD は細
胞毒性を発揮せずにコラーゲン材料上の線維芽細胞の過剰増殖を改善することが示された。これは、in vivo
において、AAD を介して骨形成部位における線維組織の侵入の予防が可能であることを連想させた。
これら AAD の骨再生にとって好ましい多機能性の証拠は、このユニークな分子の骨再建療法のための骨形
成促進因子としての臨床応用を推進させるであろう。
学習目的
聴衆は現在使用されている骨生体材料の骨芽細胞に対する為害作用、材料の細胞毒性と酸化ストレスとの
相関、AAD を介した骨生体材料の解毒と AAD の新たに発見された骨形成促進効果を知るだろう。また、生体
材料科学の新たな展望を感じとることができるだろう。
略歴
山田 将博 東京歯科大学有床義歯補綴学講座
[職歴]
2002 年 3 月
広島大学歯学部歯学科卒業
同年歯科医師免許取得
2006 年 3 月
東京医科歯科大学医歯薬総合研究科インプラント学分野修了
（現インプラント口腔再生医学分野）
同年、博士（歯学）の学位受領
2006 年 5 月～2009 年 3 月
UCLA 大学歯学部 Weintraub Center
Laboratory for Bone Implant Science (LBIS) 客員研究員
2009 年 4 月～
現職 (東京歯科大学有床義歯補綴学講座助教)
[学術賞歴]
2007 年 10 月 The 21 travel grants awardees
(European Association of Osseointegration)
2008 年 7 月 Pre-Prosthetic Regenerative Science Award
(the 86th general session & exhibition of the International Association for Dental Research)
2009 年 9 月 第 39 回日本口腔インプラント学会学術大会優秀研究発表賞
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Oral presentation #9
Characterization by Electron Spin Resonance Spectroscopy of Reactive Oxygen Species (ROS)
Generated by Titanium Dioxide－Role of ROS on osseointegration with titanium dental implants－
Masaichi-Chang-il Lee
Department of Clinical Care Medicine, Division of Pharmacology and ESR Laboratories, Kanagawa
Dental College
Session Description:
When implanted, titanium is subjected to complex and variable molecular events that may significantly affect
osseointegration. Changes in the local tissue pH and generation of biologically relevant molecules such as
reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) during wound healing, tissue remodeling, or
both may alter the surface oxide of the titanium. The implant surface consists of a titanium dioxide (TiO2) layer,
which forms spontaneously, onto which biomolecules are adsorbed and desorbed, possibly followed by
modification or fragmentation. The interaction between alveolar bone and ROS from the TiO2 layer would be
critical in osseointegration such as in biological fixation of the titanium dental implants. However, the role of
ROS in osseointegration is not fully understood and it remains to be determined if the generation of ROS occurs
during osseointegration with titanium dental implants in vitro or in vivo. Our laboratories have been
developing the in vitro biomedical application of electron spin resonance (ESR) for detecting ROS, such as
superoxide (O2• –), hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2), and hydroxyl radical (HO•). We presented
here that novel characterization of ROS generated from TiO2 in the presence of H2O2 using ESR spin trap
technique.
From our results of ROS characterization using ESR, we want to discuss the biocompatibility of titanium
dental implants, the generation of ROS, including O2•–, H2O2, and HO•, at the titanium surface could be
involved in creating appropriate conditions for the osseointegration of dental titanium implants into alveolar
bone tissues.
Learning Objectives:
1) Redox biology; role of ROS & RNS on osseointegration with titanium dental implants.
2) Redox biology; role of ROS & RNS on inflammatory response, including wound healing of implant
treatment.
3) Usefulness of characterization of ROS using ESR of dental materials, especially titanium implants.
-28-
口演９： 電子スピン共鳴法を用いた二酸化チタンから産生する活性酸素種の性格づけ
－チタンオッセオインテグレーションにおける活性酸素種の役割－
李 昌一
神奈川歯科大学歯学部生体管理医学講座薬理学分野•ESR 研究室
チタンインプラント治療における多様な分子レベルでの事象がオッセオインテグレーションに影響を与える。
創傷治癒における pH の変化と産生される活性酸素種(reactive oxygen species; ROS) と活性窒素種
（reactive nitrogen species; RNS)はチタン表層に変化を与えることになる。インプラント表面はおそらく変化·断
裂に続いて生体分子の吸着·非吸着により，二酸化チタン層が自然に形成される。この二酸化チタン層から産
生される ROS と歯槽骨の相互作用はチタンインプラントにオッセオインテグレーションに重要となる。しかしな
がら，オッセオインテグレーションにおける ROS の役割は充分に理解されたとはいえず，in vitro と in vivo に
おけるオッセオインテグレーションにおける ROS の検出·同定に関する研究は少ない。我々はスーパーオキシ
ド(O2• –), 過酸化水素(H2O2)，一重項酸素(1O2)，ヒドロキシルラジカル(HO•) のような ROS の検出·同定を中心
とする電子スピン共鳴（ESR）法の生物医学アプリケーションを確立してきた。今回は ESＲ spin trap 法を用い
た過酸化水素存在下の新しい二酸化チタンから産生する活性酸素種の性格づけを行った研究成果について
ご紹介したい。またこの研究成果から，チタン表層から産生される ROS がオッセオインテグレーションに適した
環境に関与しているという可能性と，チタンの生体親和性との関連について議論したい。
略歴
李 昌一 神奈川歯科大学歯学部生体管理医学講座薬理学分野•ESR 研究室 教授
’89 年 神奈川歯科大学歯学部薬理学教室助手
’98 年 長期派遣研究員として米国 Johns Hopkins 大学医学部に留学
’00 年 Johns Hopkins 大学医学部客員助教授
’02 年 神奈川歯科大学歯学部薬理学教室助教授
’06 年～現在 神奈川歯科大学歯学部生体管理医学講座薬理学分野教授
’09 年～現在 学校法人神奈川歯科大学評議員
学会活動
日本薬理学会評議員, 歯科基礎医学会評議員，日本歯科薬物療法学会評議員，日本酸化ストレス学会評議員，酸化ストレ
ス学会関東支部会世話人，日本 NO 学会評議員，高血圧関連疾患モデル学会評議員，日本結合組織学会評議員，日本抗
加齢（アンチエイジング）医学会評議員，日本抗加齢（アンチエイジング）歯科医学研究会世話人，神奈川歯科大学学会理事
研究テーマ
電子スピン共鳴(ESR)法による生物医学アプリケーション，ESR 法による薬剤•飲食料品の抗酸化能評価と新規抗酸化薬剤•飲食
料品の開発，ESR 法を用いた疾患予防診断システムの開発，電子スピン共鳴(ESR)法による歯科材料·歯科臨床
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Oral presentation #10
The degradation of titanium and its rejuvenation
Norio Hori
Division of Fixed Crown Bridge, Department of Oral and Maxillofacial Rehabilitation, Kanagawa Dental
College
Description
Titanium implants are used in dental and orthopaedic surgery. Despite the growing demand for such implant
procedures in a universally aging society, several issue directly related to the biological capability of titanium
remain unresolved. Generally, titanium material is considered that titanium forms of chemical stability, titanium
has superior resistance to corrosion and is non-cytotoxic. However, these phenomenon have not been verified.
We tested a hypothesis that protein adsorption capacity and cell attractiveness of titanium, which are critical to
the process of osseointegration, changes over time before its use. Surface chemistry, as represented by carbon
deposition, has been confirmed to change over time. The number of cells attached to the fresh surface was
2-fold greater than those attached to the 4 weeks-old surface 3 hours after seeding. Furthermore, the number of
cells attached to the 4-weeks-old titanium did not reach the levels of the fresh surface even 24 hours after
seeding. These results indicate an aging-like time-dependent degrading biological capacity of titanium.
For solution of titanium aging, we investigated whether the light treatment was effective to biological response.
Once treated with light irradiation, recovered the protein adsorption capacity to the level equivalent to the fresh
surfaces. In vivo histomorphology in the rat model revealed that new bone formation occurred extensively on
light-treated implants with virtually no intervention by soft tissue, maximizing bone-implant contact up to
nearly 100% at 4 weeks of healing.
The results raise a novel, crucial concept of biological aging of titanium and, more intriguingly, its
rejuvenation as a compelling solution for the biological aging problem. We suggested that newly and
photofunctionalization surface of titanium are bioactive materials. This technology has the possibility of
contributing to an improvement of current implant treatment.
Learning objectives:
(1) Mechanism of time-dependent degradation of titanium
(2) The effect of photofunctionalization of titanium
(3) The development of photofunctionalization implants
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口演 10： チタンのエイジング現象とその回復手段
堀 紀雄
神奈川歯科大学顎口腔機能修復科学講座クラウンブリッジ分野
概要：チタンインプラントは、歯科領域のみならず人工関節等の整形外科領域などにも広く用いられている。
インプラント治療が成功した場合、口腔機能回復や社会復帰により生活の質が向上し、患者にもたらされる利
益は非常に大きい。しかしながら、患者の高齢化、全身疾患の併発などにより、インプラント周囲に形成される
骨形成能が低下している場合や、骨吸収により十分な骨質量が得られない場合は、インプラント治療が失敗
に終わってしまう場合がある。より多くの患者に適応とするためには、チタン表面の骨形成能や伝導能を向上
させる必要があり、これまで様々な表面形態の改良とハイドロキシアパタイトのような化学的修飾により表面改
良の研究が行われてきた。この前提として、母材として用いられているチタン材料の表面効果は変わらないと
考えられている。一般にチタンは、バイオイナート（生体不活性）材料と分類されているため、チタン表面に骨
伝導能や形成能を向上させるために、表面をいかにバイオアクティブ（生体活性）表面とするかを考え研究が
なされている。
しかしながら、我々の研究チームは、チタン表面加工後からの時間経過により表面特性の変化が生じ、そ
れに伴うインプラント周囲の骨形成能が低下することを発見した。これは、チタン表面加工直後の新鮮面では、
表面エネルギーが高く、超親水性示し、骨形成能や伝導能においても有利に働く。これに対し表面加工後４
週間自然放置したチタン表面では疎水性傾向へと変化し、タンパク吸着能は、加工直後新鮮面と比較し約 3
分の 1 にまで減少することを見出した。さらに、このチタン表面のエイジング現象によりインプラント周囲に形成
される骨量にも影響を及ぼすことを確認した。現在主流であるミクロンレベルの表面荒さを持ったインプラント
において、インプラント骨接触率は約 50-60％程度であり、骨以外の部分は結合組織と報告されている。この
インプラント骨接触率がなぜ治癒を待っても理想的な 100%にならないかは未知のままであったが、加工直後
新鮮面を持ったインプラント体周囲には約 95％の骨接触率が認められ、表面加工後 4 週間経過したインプラ
ント体周囲には約 62％の骨接触率が見られた。
これらの現象から考えられることは、チタン表面は必ずしも安定ではなく、生物学的にも変化が起こりうると
いうことである。現在、チタン表面は保管する時間経過によって表面効果は変化しないとの推測の上でチタン
インプラントは使用されている。しかしながら、表面作製後、時間経過により表面特性が変化し、生物学的応
答にも変化が発見されたことから、チタン表面改良の研究以前にチタンの材料特性をより詳細に理解する必
要があり、この理解によりチタン自体の持っている能力を最大限引き出す取り扱いが今後、重要になってくると
考えられる。この現象は単に臨床的な結果に影響するだけでなく、チタン材料としての分類を再定義していく
議論が必要になるかもしれない。なぜならば、加工直後の新鮮面は生体にとってバイオアクティブ（生体活性）
材料であり、現在、生体活性材料として考えられているハイドロキシアパタイトのような生物学的特性を持つこ
ととなり、チタン科学あるいは生体材料学の歴史においても重要な変更になる可能性が考えられるためであ
る。
このエイジング現象は、現在の技術では止めることが出来ないと考えられるため、その回復方法として複合
波長による光照射処理が有効であることを見出した。これにより劣化した表面は、濡れが回復し、炭素の付着
が減少し、タンパクの吸着能などの生物学的応答も加工直後の新鮮面と同等もしくはそれ以上になることを発
見した。チタンエイジング現象と光照射処理におけるメカニズム解明は、チタン材料の本来持っている特性を
最大限引き出す使用方法につながり、ひいては、歯科、整形外科分野問わず適応症の拡大や予後成績に貢
献するものと考えられる。
学習目的：
（１）
チタンエイジング現象について理解．
（２）
エイジング解決方法として光照射処理方法の有用性．
（３）
歯科領域だけではなく，医科領域への応用．
略歴
堀 紀雄
1999年
2004年
同年
2007年
2008年
神奈川歯科大学顎口腔機能修復科学講座クラウンブリッジ分野
神奈川歯科大学歯学部卒業
同大学院歯学研究科 博士課程終了
神奈川歯科大学 歯科補綴学講座 助手
客員研究員米国 UCLA，The Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology
神奈川歯科大学顎口腔機能修復科学講座クラウンブリッジ分野 講師
現在に至る
-31-
【MEMO】
-32-
ポスター発表
Poster presentation #1
Quantitative studies on improving osteoblasts adhesion ability of TiO2-coated glass by ultraviolet
treatment
○Tomohiko Miyauchi1,4, Masahiro Yamada2, Akiko Yamamoto3, Tetsuo Suzawa4,
Ryutaro Kamijo4, Takahiro Ogawa2, Kazuyoshi Baba1
Department of 1Prosthodontics, 4Biochemistry, School of Dentistry, Showa University 2Laboratory for
Bone and Implant Sciences, The Jane and Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology,
Division of Advanced Prosthodontics, Biomaterials and Hospital Dentistry, UCLA School of Dentistry
3
Metallic Biomaterial Group, Biomaterials Center, National Institute for Materials Science
Objective
Titanium implants are widely used as a reconstructive anchor in dental and orthopedic treatments.
Characteristics of implant surface are critical for the successful establishment of bone-titanium integration and
recent studies demonstrated ultraviolet (UV) light-mediated phofunctionalization of titanium surfaces enables
rapid and complete establishment of the integration. Although the initial cell adhesion to the surfaces of
biomaterial is a key step in cell-material interaction, the effect of UV treatment on initial cell behavior and
reaction is poorly understood on a single cell base. The aims of this study were to investigate the effect of UV
light treatment of titanium surface on cell adhesive shear strength and cell-material focal contact area using
single cell based assay.
Materials and methods
Slide glasses (1.0 mm in thickness) were coated with titanium deoxide (TiO2 ; 99.99%, Kurt J. Lesker Co)
using a sputter-deposition system. Rat bone-marrow-derived osteoblastic cells were cultured on either
UV-treated [using a 15W bacterial lamp; intensity; ca. 0.1 mW / cm2 (λ=360±20nm) and 2 mW / cm2
(λ=250±20nm) for 48 hours] or non UV-treated TiO2 sputtered glass. The direct shear force and total energy
necessary to detach the osteoblasts from TiO2 sputtered glass were measured by the cantilever system, by
applying a lateral load to a single cell using a microcantilever. The cell adhesive area (focal contact area) as
determined by IRM (Interference Reflection Microscopy) was also measured by image analyzing system. The
spreading and settling behaviors of osteoblasts were evaluated by examining their morphology and
immunocytochemistry. Cell proliferation was determined using WST-1 (Tetrazolium salt) based colorimetry and
5-bromo-2’-deoxy-uridine (BrdU) incorporation assay.
Results
Results of the cell detachment experiment after 3 h and 24 h of incubation revealed that UV treatment
remarkably improved the cell adhesive strength, detachment energy, and cell rigidity. The focal contact area of
osteoblasts on the UV-treated surface was greater than that of the non UV-treated surface. The morphological
examination revealed that the cellular processes of the osteoblasts on UV-Treated surface stretched to a greater
extent than those on non UV-treated surface. Attachment cell number and cell proliferation were also higher for
the UV-treated surface.
Discussion
This study demonstrated that the UV-treatment of Ti surface enhances initial adhesion strength of a single cell
to the Ti surface and this enhancement might be due to increased cell rigidity and focal contact area. The
UV-mediated enhancement of cellular attachment and proliferation were also confirmed on the TiO2 sputtered
glass. Since the titanium sputtering is applicable to various types of material surface, these study results also
suggest that this technology can be applicable to other material than bulk titanium.
-34-
ポスター1： UV 処理を施した二酸化チタンコートガラス上における単一骨芽細胞の初期接着力定量的
評価
○宮内 知彦 1,4, 山田 将博 2, 山本 玲子 3, 須澤 徹夫 4, 上條 竜太郎 4, 小川 隆広 2,
馬場 一美 1
昭和大学歯学部 1 歯科補綴学教室、4 口腔生化学教室 2UCLA 歯学部ワイントロープセンター
3
(独)物質材料研究機構生体材料センター金属生体材料グループ
【目的】チタンは整形外科、歯科領域におけるインプラント材料として頻繁に用いられる生体材料である。従来
より、骨・インプラント界面のオッセオインテグレーションの早期獲得、周辺骨形成能促進のために様々なチタ
ン表面処理方法についての検討が行われてきた。すでに、UV 処理により in vitro において材料表面へのタン
パク質吸着量、骨芽細胞の初期接着数、細胞の拡がり、細胞の増殖・分化能の向上が確認され、さらに in
vivo においても骨－インプラント結合が飛躍的に向上することが示されている。ここで、インプラント治療にお
いて臨床上重要なのは骨―インプラント間の初期接着であるが、チタン表面に対する単一細胞レベルでの接
着力に対する UV 処理の影響は明らかではない。そこで本研究では、UV 処理チタン材料表面上の骨芽細胞
レベルにおける物理的接着力を評価する目的で、単一骨芽細胞のチタン材料に対する初期剪断接着力と接
着斑面積を定量的に解析した。
【方法】チタン試験片は二酸化チタン(TiO2)をスパッタリングによりスライドガラス表面にコーティングし作成した。
UV 処理は 15W 殺菌灯を用い強度 2mW/cm2 にて 48 時間の照射を行った。UV 処理を行った試験片ならび
に非処理試験片上で 8 週齢オス SD ラット大腿骨骨髄から調整した初代培養骨芽細胞を培養した。材料－細
胞間接着力測定装置を用い、剪断剥離時の単一骨芽細胞の接着力および細胞弾性係数を測定し、干渉反
射顕微鏡(Interference Reflection Microscopy : IRM)を用いて剥離前の接着斑面積の測定を行った。また、免
疫蛍光抗体法による細胞の形態解析、初期接着細胞測定、細胞増殖能解析（WST-1 assay および BrdU
incorporation assay）を合わせて行った。
【結果】材料―細胞間接着力測定から、播種後 3 時間、24 時間において接着力および剥離エネルギーは UV
処理群で非照射群と比較して約 2 倍、細胞弾性係数は UV 処理群で約 3 倍の高値を示した。接着斑面積に
ついても UV 処理群で顕著な亢進が認められ、細胞接着力と接着斑面積の増加の間に正の相関が得られた。
細胞形態解析から細胞の拡がりや細胞骨格形成の複雑化が UV 処理群で亢進し、また細胞初期接着数、細
胞増殖能も UV 処理群で明らかに向上することが確認された。
【考察】骨芽細胞のチタン表面への接着力がUV照射により著しく向上することが単一細胞レベルで示され、その
メカニズムとして細胞の弾性係数ならびに接着斑面積の向上が考えられた。チタンをスパッターコートした材料
に対してもチタンと同様のUV処理効果があることが確認され、チタンをコートしたあらゆる生体材料においてUV
処理効果が期待されると考えられた。
-35-
Poster presentation #2
Mesenchymal stem cell-like potential of rat periodontal ligament fibroblasts to construct vascular
cell-specific marker-positive blood vessel structure in a PI3K- dependent manner
○Naoto Okubo1, 2, Masato Tamura3, Yoshimasa Kitagawa4, Masaharu Kamo2, Seiko Kyakumoto2,
Naoyuki Chosa2, Noriko Takahashi2, Tadashi Iizuka5, and Akira Ishisaki2
1
Advanced Oral Health Science Research Center, Iwate Medical University, 2Department of Biochemistry,
Iwate Medical University of Dentistry, 3Department of Oral Biochemistry and Molecular Biology, Division
of Oral Health Science, Graduate School of Dental Medicine, Hokkaido University, 4Department of Oral
Diagnosis and Oral Medicine, Division of Oral Pathobiological Science, Graduate School of Dental
Medicine, Hokkaido University, 5Support Section for Education and Research, Graduate School of Dental
Medicine, Hokkaido University,
Objective: We have previously demonstrated the mesenchymal stem cell (MSC)-like activity of cells derived
from swine periodontal ligament (PDL) to simultaneously express osteoblast (OB) and endothelial cell (EC)
markers. However, it is not clear whether these cells can construct an EC marker-positive blood vessel structure
with a lumen. Here, we evaluated whether rat PDL fibroblasts retain the ability to differentiate into putative
vascular cells and construct a vascular cell-specific marker-positive blood vessel structure. We also evaluated
the morphological features of the structure and investigated the intracellular molecular mechanism underlying
the angiogenic activity of the cells.
Methods: Single cell-derived cultures (SCDCs) were established from rat PDL fibroblast primary culture. The
expression of ligament cell-, OB- and vascular cell-specific markers in the cells was evaluated using RT-PCR.
The ability of the cells to construct a blood vessel structure was evaluated in a three-dimensional (3-D) type I
collagen scaffold. The morphological and immunohistological characteristics of the structure were then
evaluated. In order to evaluate the effects of MAPK/MEK- and PI3K/Akt-dependent intracellular signalling on
the angiogenic activity of the cells, MEK inhibitor U0126 and PI3K inhibitor LY294002 were added to 3-D
cultures of the cells in a type I collagen scaffold.
Results: Each SCDC expressed MSC-, EC- and smooth muscle cell-specific markers in addition to ligament
cell- and OB-specific markers. SCDC2 cells, which abundantly expressed EC markers Flk-1 and Tie-2,
vigorously constructed a blood vessel structure in a PI3K-activation-dependent manner.
Conclusion: PDL fibroblasts have the potential to construct an EC marker-positive blood vessel-like structure.
Consequently, the fibroblastic lineage in PDL tissue could be a candidate precursor for construction of a
vascular system around damaged PDL tissue to facilitate its regeneration.
-36-
ポスター２： ラット歯根膜由来間葉系幹細胞様細胞による PI3K/Akt 依存的な Tie-2 陽性血管構造の
形成
○大久保 直登 1,2、田村 正人 3、北川 善政 4、加茂 政晴 2、客本 斉子 2、帖佐 直幸 2、高橋 典子 2、
飯塚 正 5、石崎 明 2
1.岩手医科大学 歯学部 先進歯科医療研究センター2.岩手医科大学 歯学部 口腔生化学講座
3.北海道大学 大学院歯学研究科 口腔健康科学講座 口腔分子生化学教室 4.北海道大学 大学院歯
学研究科 口腔病態学講座 口腔診断内科学教室 5.北海道大学 大学院歯学研究科 学術支援部
【目的】歯根膜（以下 PDL）組織中には線維芽細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞の他に、血管構成細胞（血管
内皮細胞、平滑筋細胞）や神経細胞など様々な種類の細胞が混在している。PDL 組織中には歯小嚢由来の
間葉系幹細胞（以下 MSC）が存在し、それが骨芽細胞や線維芽細胞に分化して同組織中の硬組織や線維性
軟組織を形成するという報告はあるが、この細胞が血管構成細胞に分化し、PDL 組織中の血管網の再構成
や機能維持に関与する可能性については明らかにされていない。これまでに我々は、ミニブタ PDL 由来細胞
株を樹立し、この細胞株が、MSC 様能力を有し骨芽細胞（以下 OB）マーカーと血管内皮細胞（以下 EC）マー
カーを同時に発現することを実証した。しかし、これらの細胞株が EC マーカー陽性の血管構造を構築するか
どうかは明らかではなかった。
そこで本研究では、ラット PDL 由来間葉系幹細胞様細胞が、三次元培養下に連続した管腔構造を有する
血管様構造を形成するかどうかを形態学的に調査した。次に、この血管様構造物が EC 特異的マーカー陽性
であるかどうかについて、免疫組織化学的方法により調査した。さらには、EC による血管新生の際に一般的
に 重 要 と さ れ る MEK/extracellular signal-regulated protein kinase (Erk) や phosphoinositide 3-kinase
(PI3K)/Akt を介した細胞内情報伝達系が、PDL 由来細胞による血管様構造形成能力にどのように関わるか
を調査した。
【材料と方法】ラット PDL 組織を採取後、初代培養系を確立し、限界希釈法により４つの single cell-derived
culture（以下 SCDC1-4）を確立した。そして、各 SCDC 細胞における MSC、PDL 細胞、OB、EC、平滑筋細胞
(以下 SMC)に特有の細胞マーカー発現を、RT-PCR 法を用いて確認した。この調査結果をもとに、PDL 由来
細胞でありながら、血管構築細胞としての性格をより強く示す SCDC 細胞を選別した。次に、一定数の細胞を
浮遊培養して Spheroid 体を形成させた後、これをタイプＩコラーゲンスキャホールドに包埋する in vitro 三次元
培養系を用いて、SCDC 細胞の血管様構造形成能力を評価した。また、SCDC 細胞による構造物の形態学的
調査・および免疫組織学的調査は、そのパラフィン包埋薄切切片による評価に加え、セロイジン厚切切片を
用いて行った。さらには、SCDC の血管形成能力とこの細胞内の MEK/Erk や PI3K/Akt との関わりについて、
それぞれの選択的阻害薬 U0126 と LY294002 を三次元培養系に添加することにより評価した。
【結果】SCDC1-4 は、MSC、PDL 細胞、OB、EC、SMC に特徴的な分化マーカーを発現していた。なかでも、
SCDC2 は EC 特異的マーカーである KDR および Tie-2 の著名な発現を認めた。加えて、この SCDC2 は、特
異的 EC マーカーTie-2 陽性で連続的な管腔構造を持つ血管様構造形成能力を有することが判明した。さら
に、この血管様構造形成は、PI3K/Akt 依存的である可能性が示唆された。
【結論】PDL 由来間葉系幹細胞様細胞が、PI3K 依存的に血管内皮細胞マーカー陽性の血管様構造を構築
することが明らかになった。この結果により、PDL 組織中には、同組織が損傷を受けた際の血管組織の再生や
機能維持に働く幹細胞様細胞が存在する可能性が初めて示唆された。
-37-
Poster presentation #3
The spatial and temporal analysis of the taste perception using functional MRI
- brain activations by salty and sweet in human ○Yuko Nakamuraa, Tazuko K. Gotoa, Kenji Tokumoria, Takashi Yoshiurab, Koji Kobayashic, Yasuhiko
Nakamurac, Hiroshi Hondab, Yuzo Ninomiyad, Kazunori Yoshiuraa
a
Department of Oral and Maxillofacial Radiology, Faculty of Dental Science, Kyushu University
b
Department of Clinical Radiology, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University
c
Department of Medical Technology, Kyushu University Hospital dSection of Oral Neuroscience, Graduate
School of Dental Science, Kyushu University, Fukuoka, Japan
Objective: Taste perception shows spatial and temporal dimensions in the neurophysiological data of basic
science. The purpose of this study was to investigate the spatial and temporal neural responses to salty and
sweet (prototypical basic tastes) in the awaked human brain cortex.
Experiment 1
The spatial analysis
Methods: An originally developed taste delivery system was used to perform precise functional brain mapping
of taste. It was proved that this system provided taste stimuli on dorsal and lateral surface of the tongue as wide
as possible and also prevented swallowing. Salty (0.1M sodium chloride) and sweet (0.5M sucrose) were
employed as prototypical taste stimuli and artificial saliva (25 mM KCl plus 2.5 mM NaHCO3) was used as the
control. Healthy volunteers (ten males and ten females, 19-29 yrs of age) participated in this study, and all
images were acquired with a 3.0-T MRI. The activated areas in the brain cortex by taste were detected using
two authorized models, a block design model (efficient for long lasting activation) and an event-related design
model (efficient for transient activation), using the Statistical Parametric Mapping 5 software. The Human
Experimentation Committee of Kyushu University approved all experimental procedures.
Results: The brain activations by both tastes were successfully detected in the anterior-middle insular (primary)
taste cortex (uncorrected P < 0.001). The peaks of the activated areas by sweet and salty were very close in
proximity in the 3D coordinates, and the activated areas showed considerable overlap. On the other hand, it was
revealed that salty was fitted to the event-related model and sweet was to the block design model.
Experiment 2
The temporal analysis
Considering the result of the experiment 1 and previous basic studies, it was hypothesized that there would be
temporal difference in neural responses between salty and sweet.
Methods: The system, subjects, tastants, and software were the same as in the experiment 1. For temporal
analysis, an original analyze model to estimate the rise time to the peak activation by the second was
formulated.
Results: Significantly higher activations by salty were seen during the first 0-3 sec of stimulation and those by
the sweet were detected during 2-4 sec (uncorrected P < 0.001, respectively) in the primary taste area.
Conclusion: The brain activations induced by salty and sweet did not show the spatial segregation. This
provides additional evidence that both tastes work in spatially the same way as basic tastes. On the other hand,
the possibility of taste-specific temporal change was seen in human brain activities.
-38
ポスター３： 機能的MRIを用いた味覚認知機能に関する空間的、時間的解析
-塩味、甘味によるヒトの脳活動について○中村 優子 a、後藤 多津子 a、徳森 謙二 a、吉浦 敬 b、小林 幸次 c、中村 泰彦 c、本田 浩 b、
二ノ宮 裕三 d、吉浦 一紀 a
a
九州大学大学院歯学研究院口腔画像情報科学分野 b 九州大学大学院医学研究院臨床放射線科学分
野 c 九州大学病院医療技術部 d 九州大学大学院歯学研究院口腔機能解析学分野
目 的: 大脳皮質における味覚認知システムに関しては、味質特異的に味覚認知機能の局在領域が異なるの
か、味覚情報の処理時間が異なるのか、という議論が繰り返され、未だに統一した見解はない。基礎研究にお
ける神経生理学データでも、各味質に特異的な反応領域があるとするものと、特異的な反応時間があるとするも
のの双方が報告されている。
本研究の目的は、非侵襲的に脳活動を検出することができる機能的 MRI を用いて、覚醒下のヒト大脳皮質
において、５基本味のうち生命活動に必須な栄養素の指標となる「塩味」および「甘味」による脳神経活動領
域の三次元空間的位置、ならびに脳活動の時系列変化を明らかにすることである。
実験１ 脳機能活動の空間的（領域）分離について
材料と方法: より精密な味覚の脳機能地図作製を行うため、独自に開発した味覚刺激提示システムを用いた。
この装置は、舌の背面と側面に可及的に広範囲に味覚刺激を安定供給し、かつ被験者の嚥下を防止できる
ため、データの検出力が高いことが証明されている。
典型的基本味刺激として塩味 (0.1 M NaCl) および甘味（0.5 M スクロース）を、コントロールとして人工唾
液（唾液の構成イオンの混合溶液 25 mM KCl + 2.5 mM NaHCO3）を用いた。被験者は、健常者 20 名（男性
10 名、女性 10 名、19-29 歳）とし、撮影は３テスラ MRI 装置で行った。味覚による脳機能活動領域を、画像解
析ソフトウェア SPM５を使用し検出した。今回は、公認された代表的な解析方法である Block デザインモデル
（持続的反応の解析に適する）と事象関連モデル（瞬間的反応の解析に適する）を用い、結果の比較検討も
行った。本研究は九州大学大学院歯学研究院研究倫理委員会によって承認された。
結果および考察: 私達は双方の味刺激に対する脳活動を、一次味覚野とされている島皮質の前方-中央部
に検出することに成功した (uncorrected P < 0.001)。塩味と甘味に対して最も顕著な活動を示す領域は三次
元脳座標において極めて近接しており、また、活動領域の重なりも多かった。塩味、甘みは一次味覚野にお
ける活動領域が分離されない事から、空間的には基本味として同様の認知様式を持つことが示唆された。
一方、塩味刺激に対する反応の検出には事象関連モデルが適しており、甘味刺激に対する反応には Block
デザインモデルが適していることが示された。
実験２ 脳活動の時系列変化について
実験１で用いた各モデルの特性と結果、ならびに神経生理学的先行研究の報告を考慮し、私達は、塩味と
甘味に対する神経応答には経時的な相違があるのではないかとの仮説をたてた。
材料と方法: 実験装置、被験者、溶液、および解析ソフトウェアは実験１と同様であった。
味覚による脳活動の時間的な特徴を解析するため、刺激に対して最も顕著な反応を示す時点を１秒単位で
推定できる独自の新しい解析モデルを考案し、一次味覚野における脳活動データを解析した。
結果および考察: 脳活動のピークが認められる時点は、塩味に対しては刺激開始直後から３秒の間、甘味に
対しては刺激開始後２-４秒の間 (各反応とも uncorrected P < 0.001) で統計的に高い推定結果を示した。よ
って塩味は甘味より速い時点で最も顕著な反応に達すると考えられた。
結 論: 一次味覚野において、塩味と甘味に対する脳活動は空間的領域分離を認めなかった。この結果は、
双方の味覚は、基本味として、空間的には同様の味覚認知様式を持つというエビデンスを追加した。一方、味
質特異的な脳活動の時系列変化が存在する可能性が示唆された。
-39-
Poster presentation #4
The Distribution and Partial Characterization of Neural Crest Derived Cells in Adult Periodontal
Ligament
○Masaru Kaku1,2, Yoshihiro Komatsu3, Yuji Mishina3, Ching-Chang Ko2, Katsumi Uoshima1
1
Division of Bio-Prosthodontics, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences
2
Dental Research Center, University of North Carolina at Chapel Hil l3Biologic & Materials Sciences,
School of dentistry, University of Michigan
Objective
To develop a next generation, periodontal ligament (PDL) wearing implant, PDL tissue itself is a favorable
source of stem cells for the tissue regeneration. To date, several stem cells has discovered from PDL and most of
these are characterized as mesenchymal stem cells. Besides, some recent reports indirectly suggesting that the
presence of neural crest stem cell (NCSC) in dental tissue. In fact, at the initial stage of tooth development, dental
mesenchyme is fully occupied with NC derived cells. The NCSCs have already identified and characterized from
several adult neural crest (NC) derived tissues such as intestine, hair follicle, skin, heart and cornea, and shown to
play significant roles in the respective tissues as a multipotent stem cells. Consequently, it is possible that the
NCSCs still exist in adult PDL.
In the present study, to determine the presence of NCSCs in adult PDL, we have analyzed the neural crest
derived cells using transgenic mice that can trace NC derived cells by green fluorescence protein (GFP).
Furthermore, the expression of stem cell markers among the NC derived cells were characterized.
Methods
Neural crest specific transgenic mouse lines, Wnt1-Cre and P0-Cre mice were mated with Z/EG double
reporter mice separately. Teeth with surrounding tissue were dissected from maxilla on 4 weeks old mice.
Specimens were fix, decalcified and paraffin embedded histological sections were prepared. Sections were
incubated with anti-GFP antibody and visualized by diaminobenzidine (DAB) using avidin-biotin-complex
method. The co-localization of stem cell markers (i.e. Nestin, NGFR/p75, CD57/HNK-1, SOX10, STRO-1,
CD29) among the GFP-positive NC derived cells were analyzed with immunofluoresence.
Results
GFP-positive, NC derived cells were preferentially distributed at the middle of alveolar bone and cementum
in PDL on 4 weeks old Wnt1-Cre/ZEG and P0-Cre/ZEG mice. The distribution pattern was identical between
two transgenic mouse lines analyzed. The population of GFP-positive NC derived cells was ~2% among all
PDL cells. All stem cell markers analyzed were found in GFP-positive NC derived cells except STRO-1, a
mesenchymal stem cell marker. Among the stem cell markers analyzed, NGFR/p75 and CD57/HNK-1 showed
higher expression in NC derived cells.
Conclusion
The data clearly showed the distribution of NC derived cells with preferential distribution pattern in adult
PDL. The expression of stem cell markers among NC derived cells suggesting the presence of NCSC, a new
source of stem cell for periodontal tissue regeneration from adult PDL.
-40-
ポスター４： 成体歯根膜における神経堤由来細胞の分布と幹細胞マーカーの発現
○加来 賢1, 2, 小松 義広3, 三品 裕司3, Ko Ching-Chang2, 魚島 勝美1
1
新潟大学大学院・医歯学総合研究科・生体歯科補綴学分野 2 ノースカロライナ大学・チャペルヒル
校・デンタルリサーチセンター 3 ミシガン大学・歯学部
目的
歯根膜を有する次世代人工歯根の開発に向けて、歯根/歯根膜複合体の再生が試みられているが、未だ
臨床応用には至っていない。成体の歯根膜自身が歯根/歯根膜複合体の再生のための幹細胞源として期
待される組織の一つであり、これまでに数種の幹細胞群が歯根膜から同定されているが、これらは間葉系幹
細胞として分離されたものであった。しかしながら、歯の発生初期における歯原性間葉の大部分が神経堤由
来細胞であり、近年のいくつかの研究報告では、歯周組織における神経堤幹細胞の存在が間接的に示唆さ
れている。さらに歯周組織と同様に神経堤由来である小腸、毛根、皮膚、心臓、角膜等の組織からは神経堤
由来細胞が既に同定され、これらが多能性幹細胞能を有することが明らかとされている。以上の背景より成
体歯根膜において神経堤幹細胞が存在する可能性が強く推察される。
そこで我々は成体歯根膜組織における神経堤幹細胞の存在を明らかにするため、神経堤細胞をGreen
Fluorescence Protein (GFP)にて標識、追跡可能な2系統の遺伝子改変マウスであるWnt1-Cre/ZEGならび
にP0-Cre/ZEGマウスを用い、神経堤由来細胞の分布、並びに神経堤由来細胞における幹細胞マーカー
の発現について解析を行った。
材料と方法
神経堤由来細胞特異的にCre-recombinaseを産生するプロモーター・マウスである、Wnt1-Creならびに
P0-CreマウスをZ/EGダブル・レポーター・マウスとそれぞれ交配し、Wnt1-Cre/ZEGおよびP0-Cre/ZEGマ
ウスを作製した。それぞれの４週齢マウスより臼歯を含む歯周組織を上顎骨より摘出し、4%フォルマリンにて
固定、10%EDTAにて脱灰し、通法に従いパラフィン包埋組織標本を作製した。組織切片をanti-GFP抗体に
て標識、ABC法にて増感後、DAB基質にて視覚化した。更にGFP陽性細胞における幹細胞マーカー
(Nestin, NGFR/p75, CD57/HNK-1, SOX10, STRO-1, CD29)の共発現を検索するため、anti-GFP抗体を
AlexaFluor488、幹細胞マーカーをそれぞれAlexaFluor594にて標識した。核染色(DAPI)の後、蛍光顕微鏡
下にて観察した。
結果と考察
Wnt1-Cre/ZEGおよびP0-Cre/ZEG、両マウスにおけるGFP陽性・神経堤由来細胞は歯槽骨、セメント質
に挟まれた歯根膜の中央部および根尖部の歯槽骨表面に観察された。GFP陽性細胞率はそれぞれ約4%で
あった。解析を行った両マウス系列においてGFP陽性・神経堤由来細胞の分布、陽性細胞率は同様の傾向
を示し、Wild typeマウスにおいてはGFP陽性細胞は認められなかった。GFP陽性・神経堤由来細胞における、
幹細胞マーカーは、代表的な間葉系幹細胞マーカーの一つである STRO-1以外、Nestin, NGFR/p75,
CD57/HNK-1, SOX10, CD29の全てのマーカーについて陽性細胞が認められた。この中でもNGFR/p75お
よびCD57/HNK-1が高い陽性率を示していた。
結論
以上の結果より成体歯根膜において神経堤由来細胞が部位特異的に分布することが示された。また神経
堤由来細胞は高頻度で幹細胞マーカーを発現し、歯根/歯根膜複合体の再生に向けた新しい幹細胞源とし
ての神経堤幹細胞の存在が示唆された。
-41-
Poster presentation #5
Enhanced Mineralization on Polarized Dental Enamel
○Reina Tanaka, Yo Shibata and Takashi Miyazaki
Department of Oral Biomaterials and Technology, Showa University School of Dentistry
Objective. Management of human teeth has moved from a surgical to a more conservative approach of
inhibiting or preventing lesion progression. Increasing enamel mineralization is crucial in this regard. Although
it is very hard and dense, partial penetration of certain ions and molecules through the hypomineralized enamel
structure is possible because it contains small inter-crystalline spaces, rod sheaths, enamel cracks, and other
defects. A potential difficulty is the preferential mineralization of the outermost portion of the enamel that can
prevent overall mineralization. We describe a strategy for increasing the mineralization potential of dental
enamel.
Methods. Extracted human premolar teeth enamel were exposed to a high concentration of hydrogen peroxide
with an energizing source. Samples were stored in artificial saliva at 37C for 1 wk. To further explore the
micro-structural integrity of enamel, densely sintered hydroxyapatite (HAP) discs with a 0 % pore ratio were
subjected in the equivalent experimental setting. A desktop X-ray micro-CT system was used to evaluate the
mineral density of samples.
Results. Mineral distribution was polarized between the lower and the higher mineralized portion of enamel by
charged oxygen free radicals due to activation of permeated hydrogen peroxide. The kinetics of energy
absorption in the deeper enamel region demonstrated improvement of preferential mineralization into the region
without restricting overall mineralization of the enamel. Subsequent increasing mineralization, even in the
dense mineralized outer portion of enamel, was also achieved. The overall mineral volume of HAP discs
exposed to 35% hydrogen peroxide with an energising source decreased significantly. The decreasing mineral
volume was seen in the outermost layers of the HAP discs.
Conclusion. The notable permeability of 35% hydrogen peroxide in enamel has been reported. The content and
density of minerals were reported to decrease towards the dentine–enamel junction, whereas enamel protein
increased inwardly. Hydrogen peroxide (35%) is more readily dispersed within the deeper enamel regions rather
than the outer portions due to the decrease in mineral content and density. The mineral polarization associated
with energy absorption in the deeper enamel regions of treated samples was most likely due to the charged
oxygen free radicals created by halogen lamp-activation of permeated hydrogen peroxide. Subsequent enhanced
mineralization may promote resistance to acidic deterioration of the structure. Because the sintered HAP discs
were prepared as dense and homogeneous structures, peroxidation was more activated on the outermost surface
rather than in the deeper regions of the HAP discs. The present study is one of the primary steps towards the
development of novel application in reparative and restorative dentistry.
-42-
ポスター５： 分極エナメル質の石灰化能
○田中 玲奈，柴田 陽，宮崎 隆
昭和大学歯学部歯科理工学教室
【目的】近年の歯科医療では，齲蝕の予防処置や歯を切削することのない非侵襲的なエナメル質初期齲蝕の
再生が注目されている．初期の脱灰病変はエナメル質の白斑として現れ，齲窩を形成していない．エナメル
質は連続性を有しており，病変内に細菌の侵入がなく，結晶構造そのものは損なわれていないため，理論上
は可逆的変化を達成しうると考えられている．生体組織であるエナメル質の化学的特性に対して積極的に介
入し，再石灰可能を向上させることは初期脱灰病変再生の主要な第一歩である．エナメル質の主成分である
ハイドロキシアパタイト(HAP)は，体液の pH 付近できわめて安定であり，ミネラルが深部に到達するための熱
力学的ドライビングフォースが不足している．エナメル初期脱灰病変の再石灰では，ミネラルが最表層でブロ
ックされるため，深部の回復が困難である．一方，HAP は電気化学的に分極させることが可能であり, HAP の
高密度結晶体であるエナメル小柱は分極によって深部の負電荷が向上すれば，深部のミネラル回復が期待
できる．高濃度の過酸化水素は，硬組織に対しても浸透性が極めて高く，エナメル深部にも短時間で容易に
到達することができると報告されている．
【材料及び方法】本研究では，35％の過酸化水素を抜去歯の表面に作用させ，ハロゲンランプの照射により，
浸透した過酸化水素を活性化することにで，エナメル質を分極化することが可能であるかを検討した．さらに
処理した抜去歯を人工唾液に浸漬し，エナメル質の再石灰化能をＸ線マイクロ CT で経時的に評価した．比
較対象として，市販の HAP 高密度焼結体を用いた．マイクロ CT から得られたデータをコンピュータ上で 3 次
元再構築し，任意のボリュームを 1 つの抜去歯から抜き出すことで，複数の仮想サンプルを作成した．仮想サ
ンプルは数値上全く同一形状であり，機械的に作成したものよりも精度が高く，データの信頼性や再現性も確
保することができる．
【結果および考察】過酸化水素とハロゲンランプ照射により処理したエナメル質では平均密度こそ低下したも
のの，仮想サンプル全体の体積は上昇した．処理後のエナメル質では，ミネラル濃度の比較的低い層と表面
の石灰化度の高い層にミネラル分布が分極された．また，ミネラル濃度の比較的低い層の増加は，仮想サン
プル深部に特異的にみられる．ミネラル濃度の低い層の体積が大きく増加するため，サンプル全体の体積は
処理後のサンプルで上昇するが，中間層のミネラルが減少することにより，仮想サンプル内の平均密度は低
下する．エナメル質の密度は，表面からエナメル象牙境に向かってポーラスであり，過酸化水素濃度はエナメ
ル深部のポーラスな層で相対的に上昇する．深部に貯留した過酸化水素はハロゲンランプ照射によりラジカ
ルを大量に発生し，深部での電荷が上昇することから，ミネラル分布の分極化が生じると考えられる．分極化
により，ミネラルが深部に到達するための熱力学的ドライビングフォースが上昇するため，1 週間人工唾液に浸
漬した試料では，エナメル深部の再石灰化から全体の石灰化を向上させることが可能であった．一方，HAP
高密度焼結体ではサンプルの最表層が脱灰し，仮想サンプルの密度および体積は減少した．人工の HAP 焼
結体は均一な高密度構造であり，過酸化水素が内部に浸透しないため，表面の脱灰が生じたと考えられる．
初期脱灰病変においても，脱灰の進行した病変深部に過酸化水素は浸透しやすい．過酸化水素とハロゲン
ランプ照射によるエナメル質の石灰化能促進は，ミネラル濃度が深部で低下している初期脱灰病変の再生に
も応用可能であると考えられる．
-43-
Poster presentation #6
Biological evaluation of hyaluronic acid–apatite hybrids for guided bone regeneration
○ Kenko Tanaka 1, 2, Tetsuya Goto ２, Yumi Morita 3, Toshiki Miyazaki 3, Shigeru Kobayashi 2 and Tetsu
Takahashi 1
Division of １ Oral and Maxillofacial Reconstructive Surgery, ２ Oral Anatomy, Kyushu Dental College
3
Graduate School of Life Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of Technology
Objective: Bioactive ceramics are used for bone-repairing owing to attractive features such as direct
bone-bonding in living body. Hyaluronic acid–apatite hybrids (HYB) consisting of organic polymer and the
apatite would be attractive as novel bioactive bone substitutes with bioabsorbable property. In this study, we
evaluated the proliferation and the differentiation of osteoblast-like cells on HYB in vitro, and examined the effect
of HYB on bone regeneration in rat calvalial defects in vivo as compared to terudamis (TER), which is made of
typeⅠatelocollagen.
Methods: The hydroxyl groups in side chains of the hyaluronic acid were cross-linked by divinylsulfone. The
solutions were poured into polystyrene container, and dried in a vaccum freeze drier at -80℃. They were treated
with 1 M CaCl2 aqueous solution for 24h.The specimens formed the apatite in simulated body fluid (SBF, Kokubo
solution) within 7 days. Surface structure was analyzed by scanning electron microscopic (SEM) observation,
energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX), and thin-film X-ray diffraction (TF-XRD). In vitro, MC3T3-E1
osteoblast-like cells were cultured on each sample. At 24 and 48 hours after cell seeding, they were stained with
PI or TRTIC phalloidin, and examined the number of adherent cells and the average spared-cell area using
fluorescent microscopy. At day 4 and day 7 after cell culture, alkaline phosphatase (ALP) activity and at day 14
Runx-2, Osterix, collagen type1（Col 1） and osteocalcin (OCN) mRNA expression were examined. In vivo, two
six-millimeter diameter round cranial defects were made in rats and filled up with HYB, TER, or nothing (sham
group). After 1 and 3-week healing period, histomorphometric analyses were performed to evaluate the newly
formed bone area in the rat calvalial defects. The specimens were immunostained for osteopontin to detect the
osteoblastic cell surrounding newly formed bone.
Results: On HYB, porous structure was observed by SEM and apatite formation was confirmed by EDX and
TF-XRD. The number of cells and the average spared area increased at 24 and 48 hours on both HYB and TER.
ALP activity and the expression level of OCN mRNA showed greater increases on HYB than on TER. In the rat
calvarial defects, all groups observed new bone formation surrounding osteopontin immuno stained osteoblasts at
3 weeks. After operation, HYB group showed a higher bone formation area than other groups.
Conclusion: HYB promoted greater differentiation of osteoblast-like cells compared to TER in vitro, and showed
an excellent newly bone formation in the bone defects in vivo. Therefore, HYB should be expected for the
application to the bone loss area such as socket preservation.
-44
ポスター６： ヒアルロン酸‐アパタイトハイブリッドの骨誘導に対する生物学的評価
○田中 謙光１，２、後藤 哲哉２、森田 由美３、宮崎 敏樹３、小林 繁２、高橋 哲１
九州歯科大学 形態機能再建学１、頭頚部構造解析学２ 九州工業大学 大学院生命体工学研究科３
目的：生体活性セラミックスは生体へ直接骨接合する特徴を持ち、骨再生に用いられる。
ヒアルロン酸-アパタイトハイブリッド（以下ハイブリッド）は骨と結合する生体活性と生体吸収性を併せ持った新
素材として期待されている。本研究では、in vitroにおいてハイブリッド上での骨芽細胞様細胞の動態について、
in vivoにおいてラット頭蓋骨欠損における新生骨骨形成能についてコラーゲン製材テルダーミスと比較検討し
た。
材料と方法：ヒアルロン酸ナトリウムの水酸基にジビニルスルホンにて架橋結合を行い、－80℃にて凍結乾燥さ
せて多孔質の基質を形成させた。１Mの塩化カルシウム水溶液に36.5℃で24時間浸漬し、その後、疑似体液
(SBF、Kokubo溶液)に7日間浸漬させ、ハイブリッドを形成させた。形成したハイブリッドに対して、操作型電子顕
微鏡（SEM）・エネルギー分散型X線分光分析（EDX）・薄膜X線回折装置（TF-XRD）を用いて試料表面の構造
解析を行った。In vitroにおいて、マウス骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1細胞をハイブリッド、及び比較としてテル
ダーミス上で培養した。培養24、48時間後にPI核染色、TRITCファロイジン染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察し、
細胞数、平均面積を測定した。培養4，7日目にアルカリフォスファターゼ活性を測定した。培養14日目に
RT-PCR法にてRunx-2、osterix、I型コラーゲン（Col I）、osteocalcinの発現を半定量的に測定した。In vivoにお
いて、ラット頭蓋骨に直径６mmの2つの窩洞を形成、骨欠損モデルを作成し、ハイブリッド群、テルダーミス群、
シャム群(骨除去のみ)の3群に分け、ハイブリッド群、テルダーミス群はそれぞれ材料を欠損内に充填した。1、3
週の治療期間後に、組織形態分析はラット頭蓋骨欠損における、新生骨領域の割合を測定した。さらに抗
osteopontin抗体を用いて免疫染色を行った。
結果および考察：ハイブリッドはSEMによって多孔質構造、EDX、TF-XRDによってアパタイト形成が確認された。
細胞数、平均面積はすべてのサンプルにおいて培養24，48時間後に増加した。細胞数においてはテルダーミ
スの方がハイブリッドに比べ有意に多かったが、細胞増加率についてハイブリッド上はテルダーミス上より高かっ
た。アルカリフォスファターゼ活性は培養４，７日後に、ハイブリッドがテルダーミスと比較し上昇していた。培養14
日目ではテルダーミスと比較し、osteocalcin mRNAの発現の増加が認められた。ラット頭蓋骨欠損部では、すべ
ての群において3週間が新生骨形成を観測された。ハイブリッド群は他の群より高い新生骨形成を示した。
osteopontin免疫染色にて、新生骨周囲に骨芽細胞が確認された。今回の研究により、ハイブリッドは、有害性、
細胞毒性はないことが確認され、コラーゲン製材と比較し骨芽細胞様細胞の増殖、分化が優れていることが明ら
かになった。ラット頭蓋骨埋入後3週におけるハイブリッド群の新生骨は、他群間と比較し、新生骨量の増加が認
められた事によりハイブリッドは高い新生骨形成能を持つ事が示唆された。従って、ハイブリッドは抜歯後のソケ
ットプリザベーションなど骨欠損部への応用等が期待できると考えられた。
結論：ヒアルロン酸―アパタイトハイブリッドはin vitroにおいて骨芽細胞様細胞の増殖、分化を促進し、in vivoに
おいて高い新生骨骨形成能を示した。
-45-
Poster presentation #7
TGF- strongly enhances BMP-2-induced ectopic bone formation
○Keita Tachi1,2, Masamichi Takami２, Hana Sato3, Yoshitomo Honda4, Ayako Mochizuki5, Tomio Inoue5,
Satoru Shintani3, Osamu Suzuki4, Ryutaro Kamijo２, and Kazuyoshi Baba１
1
Department of Prosthodontics, School of Dentistry, Showa University 2Department of Biochemistry,
School of Dentistry, Showa University 3Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,
Showa University 4Division of Craniofacial Function Engineering, Tohoku University Graduate school of
Dentistry, Miyagi, Japan 5Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Showa University
Objective: Decrease in alveolar bone volume results in increase of tooth mobility and makes dental
implantation difficult. Bone morphogenetic proteins (BMPs) that possess a potential to induce bone formation
have been considered to be beneficial for bone regeneration. However, high doses of BMP proteins are
necessary to regenerate enough bone mass, which requires high cost and constricts the use of BMPs in clinical
treatments. To solve this issue, we attempted to find factors that augment biological activity of BMPs.
Methods: To evaluate the efficiency of ectopic bone formation, we surgically implanted collagen sponges
containing BMP-2 with or without additional factors into dorsal muscle pouches of mice. Mice were separated
into four groups; vehicle alone, 50 ng TGF-1 alone, 5 g BMP-2 alone, and both 5 g BMP-2 and 50 ng
TGF-1. Mice were housed for 1-20 days, and bone volumes were measured by micro-computed tomography
(CT). To evaluate whether combination of BMP-2 and TGF-1 is effective for bone regeneration,
full-thickness standardized trephine defect, 4 mm in diameter, was made in the calvarium of mice, following
implantation of collagen sponges into the defects.
Results: In the BMP-2 alone group and BMP-2 plus TGF-1 group, lump-like masses appeared and grew until
7 days after surgery, though no formation of masses was observed in vehicle group and TGF-1 alone. The size
of the masses formed in BMP-2 plus TGF-1 group was apparently greater than that formed in BMP-2 alone
group. Ectopic bones were formed in these masses during 7- 14 days after the surgery. The volume of ectopic
bones isolated at 14 days after surgery in BMP-2 plus TGF-1 group was four-fold greater than those formed in
BMP-2 alone group. The histomorphometric analysis of ectopic bones revealed that bone density, osteoid
volume, and osteoblast number in BMP-2 plus TGF-1 group were 1.5-fold, 2-fold, and 3-fold greater than
those in BMP-2 alone group, respectively. In contrast, osteoclast number in BMP-2 plus TGF-1 group was
half of that in BMP-2 alone group.
Regarding the effect BMP-2 and TGF-1 for bone regeneration, the defects in the calvarium were completely
occupied with new bones in BMP-2 plus TGF-
oup but partially occupied in BMP-2 alone group at 14
days after surgery.
Discussion:
Since TGF- robustly enhanced the growth of lump-like masses in the initial stage, the total volume of
ectopic bones would be increased. In addition, increase in osteoblast number and decrease in osteoclast number
by TGF-1 would be the reason for increased bone density in ectopic bones.
Conclusion: It was suggested that clinical application of TGF-1 with BMP-2 could locally stimulate
bone-inducing activity in vivo.
-46-
ポスター７： TGF-1 は BMP-2 による異所性骨化を強力に促進する
○舘 慶太 1,2、高見 正道 2、佐藤 華 3、本田 義知４、望月 文子５、井上 富雄５、新谷 悟 3、
鈴木 治４、上條 竜太郎 2、馬場 一美 1
昭和大学歯学部 1 歯科補綴学、2 口腔生化学、3 顎口腔疾患制御外科学、4 東北大学大学院歯学研究
科 顎口腔機能創建学分野、５昭和大学歯学部口腔生理学
【目的】歯槽骨の減少は歯の動揺をきたすとともに、歯科インプラントの埋入を困難にする。そのた
め、歯槽骨を効率よく再建する方法を開発すれば、これらの問題を解決できると期待される。Bone
morphogenetic protein (BMP)は、筋組織に埋め込むと異所性の骨形成を誘導する能力を持つため、欠損
した骨を再建するのに有用と考えられてきた。しかし実際は、臨床的に必要とされる骨量を誘導する
ためには大量の BMP タンパク質を要するため、コスト面その他の問題が実用化の大きな障壁となっ
ている。そこで我々は、BMP の活性を促進する因子を探索し、Transforming growth factor (TGF)-が生
体内における BMP-2 の骨形成誘導活性を強力に促進することを見いだしたので報告する。
【方法】BMP の骨形成誘導活性を評価するため、コラーゲンスポンジに BMP や他の因子を含ませた
後、マウスの背部筋膜下に埋入し、そこに形成された異所性骨化物の大きさを Micro-computed
tomography (CT)を用いて測定した。コラーゲンスポンジはコラーゲンゲルを液体窒素で凍結し、12
時間凍結乾燥させ、円板状（直径 4 mm、厚さ 0.5 mm）に整形したものを用いた。実験に用いたマウ
スは①PBS 単独投与群（コントロール群）②BMP-2 (5 g)単独投与群（BMP-2 群）③TGF-
単独投与群(TGF-群)および④BMP-2 (5 g)・TGF-同時投与群（BMP-2 + TGF-群）に分け、
１,3,7,14,および 21 日間飼育した後、埋入部分に形成された組織塊を摘出し、その中の異所性骨化物
を組織学的に解析した。
さらに、トレフィンバーを用いてマウスの頭蓋骨に直径 4 mm の円形欠損を作製しそこに前述のコラー
ゲンスポンジを埋入し１４日後同部位を解析した。
【結果】筋膜下へのスポンジ埋入後、経時的にマウスを屠殺し埋入部分を観察した。その結果、BMP-2
群および BMP2+TGF-群で、投与後 1 日目から 7 日目にかけて急速な組織塊の形成が観察され、そ
の後増大は停止した。7 日目に摘出した組織塊の大きさは、BMP-2 群で直径約 3-4 mm、BMP-2+TGF-
群では約 6-7 mm であった。また、これらの組織塊の中で骨化物形成が 7 日目以降に認められ、14 日
目にその体積は最大に達し、その後 21 日目までは変化しなかった。コントロール群および TGF-群
では、これらの現象は認められなかった。14 日目に摘出した異所性骨化物をCT で解析したところ、
BMP-2 + TGF群の異所性骨化物の体積は BMP-2 群のそれの４倍であった。異所性骨化物の組織像
を解析した結果、BMP-2 群に比べ、BMP-2+TGF-群では骨芽細胞数が 2 倍、骨量が 1.5 倍、類骨量
が 3 倍に増加し、逆に破骨細胞数は半分以下に減少していた。また、マウスの頭蓋骨欠損部へのコラ
ーゲンスポンジの埋入実験の結果については、埋入後 14 日目の頭蓋骨を摘出したところ、BMP-2 群
では部分的な骨の再生が認められたが欠損部は完全には閉塞していなかった。一方、BMP-2 + TGF-
群では、欠損部が新生骨で完全に閉塞していた。
【考察】BMP-2 と TGF-を併用すればこれまでよりも効率よく骨再生を誘導できることが期待され
る。また、BMP-2 による骨形成を TGF-1 が促進するメカニズムとして、TGF-が初期の組織塊の増
大を促進すること、
そして骨芽細胞数を増加させる一方、
破骨細胞数を減少させることが推察される。
【結論】TGF-が BMP-2 による骨形成を強力に促進することを見いだした。この発見は歯槽骨再生
医療などへの BMP-2 の臨床応用に新たな展開をもたらすものと期待される。
-47-
Poster presentation #8
A novel anti-oxidant property of titanium induced by ultraviolet photoactivation
○Takeshi Uenoa, Masahiro Yamadaa, Norio Horia, Fuminori Iwasaa, Yoshimasa Igarashib,
Takahiro Ogawaa
a
The Weintraub center for Reconstructive Biotechnology, UCLA school of dentistry
b
Removable Prosthodontics, Tokyo Medical and Dental university
Objective: Reactive oxygen species (ROS) plays an important role in the regulation of various cell functions,
e.g., an induction of inflammatory reaction. However, cellular response on titanium in relation to ROS is
unknown. Ultraviolet (UV) treatment of titanium is known to alter physicochemical properties of titanium. We
hypothesized that UV pretreatment of titanium increase its biocompatibility by modulating ROS production in
osteoblasts. The objective of the study is to examine the intracellular ROS level and oxidative DNA damage of
osteoblastic cells cultured on UV-treated and untreated titanium surfaces.
Methods: Titanium disks with machined and acid-etched surfaces were prepared. Some disks were treated with
UV light for 48 hours. Osteoblastic cells extracted from rat bone-marrow were cultured on titanium disks for 4
and 24 hours. Some cultures were treated with hydrogen-peroxide to induce simulative cellular inflammatory
reaction. To measure ROS generation, fluorometric and confocal image analytic assays using intracellular
oxidation of DCF-DA was performed. The oxidative DNA damage was evaluated by staining 8Hydroxy
2’deoxyguasonine (8OHdG). Glutathione redox status and cell viability were also examined. Additionally, the
generation of inflammatory cytokines from human osteoblast was measured.
Results: The intracellular ROS level was approximately 1.5 times greater for the culture on the acid-etched
titanium surface than on the machined surface. The UV-pretreatment of titanium reduced the ROS level by
40-50% for both machined and acid-etched surfaces. The ROS was detected intensively and extensively in the
osteoblasts cultured on untreated titanium surfaces with hydrogen peroxide in the medium, whereas the cells on
UV-treated titanium surfaces rarely produced ROS even with hydrogen peroxide. The 8OHdG level per cell
decreased by 50% on UV-treated titanium surfaces compared to untreated titanium surfaces. The total
glutathione level was almost equal level, however oxidized glutathione (GSSG) decreased by 40% on
UV-treated titanium. There was no significant difference in cell viability between untreated and UV-treated
titanium surfaces. Inflammatory markers were reduced on UV-treated surface.
Conclusion: This study revealed that ROS was generated in osteoblasts cultured on titanium and that the
acid-etched rougher surface promoted its production and subsequent DNA damage. UV treatment of titanium
substantially reduced the ROS production regardless of the surface types. The oxidative stress generated in
osteoblasts on titanium surface may not lead to cell death, but have relevance with cell function such as cell
attachment, spread, and subsequent proliferation and differentiation. This study indicated a novel anti-oxidant
function of UV photoactivated titanium surfaces.
-48-
ポスター8： 新たに発見された紫外線照射チタンの抗酸化機能
○上野 剛史 a, 山田 将博 a, 堀 紀雄 a, 岩佐 文則 a, 五十嵐 順正 b, 小川 隆広 a
a
UCLA ワイントロープセンター生体再建研究所 b 東京医科歯科大学 部分床義歯補綴学分野
目的：
活性酸素種（ROS）は、生命維持に不可欠なものである一方、外科処置や生体材料などの侵襲による炎症性
反応の中で発生し、この量が細胞内の抗酸化酵素の処理能力を上回ると、酸化ストレスとして、細胞機能抑
制や細胞膜破壊を引き起こすことが知られている。 紫外線照射チタンは、チタン表面の物理化学的性質を
変化させることにより、細胞との親和性を向上し、未処理チタンと比較して、細胞接着を増加させ、接着後の細
胞伸張も早めることが報告されている。 本研究は、この ROS と、播種後初期における細胞機能との関係に着
目し、紫外線照射チタンが、骨芽細胞内の ROS レベルを変化させることによって、生物学的親和性を高めると
いう仮説をたて、これを検証することとした。
方法：
実験には、機械研磨処理と酸処理を施したチタンディスクを用い、それぞれの半数を紫外線照射なしのコント
ロール群とし、残りの半数は、紫外線を 48 時間照射した実験群（UV 群）とした。ラット骨髄間葉系幹細胞由来
の骨芽細胞を、それぞれのディスクに 4 時間および 24 時間培養し、細胞内 ROS を DCF-DA を用いて測定し
た。炎症状態をシミュレートするため、培養 2 時間後に 100μM の過酸化水素処理した細胞についても細胞内
ROS を測定した。さらに、酸化ストレスによる DNA 損傷の特異的マーカーである 8Hydroxy 2’deoxyguasonine
(8OHdG)を蛍光免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。また、24 時間培養した細胞について、細
胞内の主要な抗酸化成分であるグルタチオン量と、フローサイトメトリーによる細胞の生存率を測定した。その
他、ヒト間葉系幹細胞由来の骨芽細胞を 24 時間と 3 日間培養し、チタン上で発生した炎症性サイトカイン
(IL-1β, IL-6, IL-8)量の測定を行った。
結果：
コントロール群における細胞内 ROS 量は、酸処理チタンの方が機械研磨チタンよりも約 1.5 倍高くなった。そし
て、UV 群において、機械研磨、酸処理チタンともに、約 40-50％の細胞内 ROS の減少がみられた。過酸化水
素処理した細胞においても、コントロール群では、細胞内 ROS が強く広範囲に認められたのに対し、UV 群で
は、そうした炎症をシミュレートした状況においても、ROS の発生が過酸化水素処理なしのものと同程度まで
減少した。UV 群の 8OHdG レベルは、コントロール群と比較して約 50％まで減少した。総グルタチオン量は、
コントロール群、UV 群で有意差は認められなかったが、酸化型グルタチオンである GSSG 量は、コントロール
群の方が UV 群よりも約 1.5 倍高い値を示した。フローサイトメトリーにより算出した細胞生存率は、コントロール
群で約 75％、UV 群で約 80％であったが、有意差は認められなかった。また炎症性反応のマーカーである
IL-1β, IL-6, IL-8 の量は、機械研磨、酸処理チタンともに、コントロール群の方が UV 群に比べて有意に高
い値を示し、酸処理チタンの UV 群におけるマーカーの値は、通常のポリスチレンディッシュで培養した細胞
のものと同等かそれ以下のレベルであった。
考察・結論：
本研究は、チタン上の骨芽細胞に ROS が発生すること、またそれに伴う DNA 損傷がおこることを明らかにし、
細胞内 ROS の発生が、機械研磨チタンよりも、より粗面をもつ酸処理チタンで促進されることを示した。そして、
紫外線照射により、表面トポグラフィーにかかわらず、細胞内 ROS の発生を減少させられることを示した。チタ
ン上の骨芽細胞内に発生した ROS は、必ずしも細胞死を引き起こすほどのレベルではないが、細胞接着、伸
張、その次段階にある増殖、分化といった、細胞の基本的な機能の制御に深く関わっていると考えられる。本
研究は、紫外線照射されたチタンが持つ機能として、抗酸化能を新しく提示するものである。
-49-
Poster presentation #9
Establishment of human osteoblasts culture system obtained from aged donors.
○M. Aino1,, M. Saito2, T. Yoneda3 and T. Noguchi1,
1
Dept Periodont, Sch Dent, Aichi-gakuin Univ, Nagoya, 2Dept of Biological Science and Technology,
Tokyo University of Science, Noda 3Dept Mol Cell Biochem, Osaka Univ Grad Sch Dent, Osaka,
Objective
Establishment of human osteoblasts that retain bone-forming capacity is one of the prerequisites for successful
bone regeneration therapy. Since the demand for bone regeneration considerably increases in elderly, use of
osteoblasts derived from these aged individuals should significantly facilitate bone regeneration therapy.
However, isolation of osteoblasts from elderly is difficult mainly due to a limited proliferative capacity of these
osteoblasts with conventional culture techniques. Here we show a novel culture technique of human osteoblasts
isolated from jaw/alveolar bones of elderly donor.
Methods
The bones of 27-, 52-, 53- and 66-year-old donors, which were readily obtainable during the course of tooth
extraction, were sequentially digested by collagenase and primary human alveolar bone osteoblasts (HAOBs)
were isolated. We also characterized the phenotype of HAOBs in vitro and in vivo. To investigate whether
HAOBs have osteogenic activity in vitro, they are treated with rhBmp-2 and investigated by alkaline
phosphatase activity and alizarin red staining respectively. To examine bone forming capacity of HAOBs in vivo,
HAOBs at 6 PDs were subcutaneously transplanted into the dorsal skin in severe combined immunodeficiency
(SCID) mice.
Results
HAOBs from all of the individuals were successfully expanded and grow more than 35 population doublings
(PDs). HAOBs exhibited high alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation and expressed
osteoblast marker genes such as runx2, osterix, osteocalcin and bone sialoprotein upon treatment with rhBMP-2.
These characteristics of HAOBs remained unchanged until 16 PDs but were significantly lost after 29 PDs.
Histological examination revealed that the transplanted HAOBs formed bone tissues with human vimentin
expression, showing that these bones were formed by HAOBs. RT-PCR analysis also showed that these bones
expressed human bone sialoprotein and osteocalcin mRNA.
Conclusions
Our results show that the culture technique used here allows us to successfully grow human osteoblasts of aged
donors. HAOBs has an osteogenic potential as they were able to differentiate into osteoblast upon treatment
with recombinantBMP-2 in vitro and capable of forming bone tissue in vivo .They also suggest that HAOBs are
a useful cell source for future application to cell based bone regeneration therapy for local bone diseases such as
periodontal diseases.
-50-
ポスター９： 中高齢者歯槽骨由来骨芽細胞の樹立と機能解析
○相野 誠１）、斎藤 正寛２）、米田 俊之３）、野口 俊英１）
１
愛知学院大学歯学部 歯周病学講座 ２東京理科大学 基礎工学部 生物工学科
３
大阪大学大学院歯学研究科 口腔分子免疫制御学講座 生化学教室
目的
歯周炎は中高年層で急増する生活習慣病であり、同年齢層における口腔機能低下の最大の要因にな
る。
なかでも進行した歯周炎による水平性骨欠損の治療は困難を極め、歯の喪失に至るケースが多い。従っ
て歯周病の重症化の予防は、中高年齢層における QOL の維持、ADL の改善の観点から重要な要因とな
る。このようなケースに対応するための一つの試みとして、細胞移植治療よる歯槽骨再生医療の開発が考
えられる。今回我々は中高齢者の歯槽骨より骨芽細胞（human alveolar bone osteoblast、HAOB）の分離・
培養とその生物学的特性の解析を行うことにより、自家細胞移植による骨再生療法に使用できる可能性に
ついて検討した。
材料と方法
HAOB を得るためにインフォームドコンセントを得た２７歳, ５２歳, ５３歳、６６歳の患者より抜歯など口腔外
科手術時に得られる歯槽骨骨片より、コラゲナーゼによる連続酵素消化法を用いて分離培養を試みた。
次に HAOB が骨芽細胞としての機能を有しているか解析するため、rhBMP-2 を用いて分化誘導を行い、
アリザリンレッド染色、アルカリフォスファターゼ活性を定量し、HAOB の石灰化能力、骨芽細胞分化能力
を解析した。また分化誘導後の HAOB において骨マーカー遺伝子である osteocalcin, bone sialoprotein,
runx2 および osterix の発現を Realtime PCR 法にて解析した。
また、HAOB が骨形成能力を有しているかを解析するため、β-TCP をスキャホールドとして混合し、
SCID マウスの背部皮下へ移植した。移植片は移植後４週間後に回収し H.E 染色とヒトビメンチン抗体を
用いた免疫染色にて組織学的解析を行った。また同移植片から RNA を抽出し、骨マーカー遺伝子の発
現を RT-PCR 法にて解析した。
結果および考察
コラゲナーゼ連続消化法を用いることにより、中高年齢層のヒト歯槽骨骨片より数種類の HAOB の採取
に成功した。HAOB は 35population doublings 以上にわたり培養することが可能であり、生体外で増殖でき
ることが判明した。
HAOB が骨芽細胞としての機能を保持しているかを rhBMP-2 刺激に対する応答性を指標に解析したと
ころ、アリザリンレッド染色陽性の石灰化物の形成と、アルカリフォスファターゼの活性値の有意な上昇が
観察された。また、骨マーカー遺伝子の発現を観察したところ、osteocalcin, bone sialoprotein, runx2 およ
び osterix を発現していることが明らかとなった。これらの所見から HAOB は骨芽細胞の特性を有している
ことが判明した。
次に、HAOB の生体内での骨組織形成能力を解析するため、HAOB を SCID マウスの皮下へ移植した
ところ、移植片内に顕著な骨組織の形成が認められた。また同骨組織はヒトビメンチン抗体に陽性でありヒ
ト由来であることが確認できた。さらに同移植片の発現遺伝子を解析した結果、骨マーカー遺伝子の
osteocalcin, bone sialoprotein,の発現が確認された。以上の結果より HAOB は in vivo においても骨芽細
胞としての骨形成を促進できることが判明した。
結論
中高齢者の歯槽骨から生体外で増殖が可能であり、骨芽細胞の機能を有する HAOB の分離培養に成
功した。HAOB は生体内において高い骨形成能力を有しており、細胞移植による骨再生治療に有効なセ
ルソースとなることが示唆された。
-51-
Poster presentation #10
A newly developed Dextrin-TiO2 compound bone filling material
○Takafumi Asai, Tatsuhide Hayashi, Soichiro Hamajima, Yamato Sato,Masaki Asakura, Takashi Kiriyama,
Shintaro Mori and Tatsushi Kawai
Department of Dental Materials Science Aichi-Gakuin University School of Dentistry
Objective: In the procedures for reconstructing lost bone tissue, in addition to autogenous bone grafts and
allogeneic bone grafts, calcium phosphate materials, such as hydroxyapatite and tri-calcium phosphate, have
been clinically applied as bone filling materials.
It is expected that rutile-type titanium dioxide (TiO2), which is one of the materials attracting attention in
recent years, will be applied in the clinical field as it has excellent durability and thermochemical stability.
Furthermore, because TiO2 has exhibited an excellent cell compatibility in our experimental results, we
therefore considered its application as an artificial bone filling material in the place of existing bone filling
materials. However, as long as a bone filling material is a powder or granular substance, there is a concern that
the materials will easily leak out from the filled site, and because bone filling materials do not have
shape-imparting properties when used alone, it is therefore difficult to keep any such material retained in the
bone defect area for a certain period of time while maintaining an appropriate morphology. Therefore, in order
to develop a bone filling material with shape-imparting properties, we focused on low-viscosity Dextrin.
Dextrin is a generic name of an intermediate product of starch before it changes into maltose after being
degraded with enzymes, acid, or heat, and it has been used in foods, cosmetics, papers, fibers, and adhesives in
a variety of fields.
In this experiment, we envisioned cases in which Dextrin could be administered or implanted in the bone as an
implant material, and we first examined the effects of Dextrin on mouse osteoblast-like cells (MC3T3-E1).
Furthermore, we also examined the filling effects of a Dextrin-TiO2 compound for bone defect parts that were
formed on rabbit femurs.
Methods: Dextrin (M.W.=2,000) was used in this experiment. The experimental group consisted of those in
which 0.1, 1.0, and 10 mM of Dextrin had each been added to the medium, while the control group used only
the medium. The cell culture was adjusted so that MC3T3-E1 would be 1104 cells/ml, 400 µl each of which
was seeded onto a 24-well microplate. Each group was then cultured under conditions of 37C and 5% CO2
concentration over a culture periods varying from 1, 3, 5, and 7 days. The Cell Counting Kit-8 (Dojindo) was
used to measure the number of living cells (n＝5). The alkaline phosphatase (ALP) assay was evaluated using
Lab AssayTM ALP (Wako). An ALP assay was performed on days 5, 7, 9 and 11 (n＝3). Each medium was
replaced every 2 days.
The surface texture of sintered at 1400C TiO2 was observed via a scanning electron microscope (SEM). The
bone defects (diameter 2.0 mm, depth 1.0 mm) were made on 6-week-old JW rabbit’ lateral epicondyles of the
femur to evaluate the Dextrin-TiO2 complex as a bone filling material. The concentration of Dextrin mixed with
TiO2 was 10 mM. The Dextrin-TiO2 complex 5.0 mg was filled into the defect. BONE JECT® (Koken) was used
as a control. The rabbits were sacrificed and the implantation area was dissected for the histological observation
at 1 and 6 weeks after filling. The surface texture of the implantation area was then observed using an Electron
Probe Micro Analyzer (EPMA) at 6 weeks after filling.
Results: All of the experimental groups and controls underwent cell proliferation during the culture period.
MC3T3-E1 promoted the proliferative activity during the culture period as the concentration of added Dextrin
became lower, and in particular, the 0.1 and 1.0 mM addition group showed higher values than those of the
control group. In an ALP assay for MC3T3-E1, all of the respective experimental groups showed remarkably
higher values for the activity than did the control group after day 9 of culturing. From the above results, it was
revealed that the addition of a low-concentration of Dextrin in a medium promotes the cell proliferative activity,
thus promoting an ALP assay. In this experiment, the maximum culture period was 11 days, but it was surmised
that the formation of calcified nodules will occur earlier than in the control when culturing for a longer period
of time. The addition of a low-concentration of Dextrin in a medium was therefore revealed to promote the cell
proliferative activity, and thereby promoting the ALP assay.
The Dextrin-TiO2 complex level remained steady, while Dextrin concentration increased, which was regulated
at 10 mM after 1 and 6 weeks. Both Ca and P were detected in the implantation area by EPMA.
-52-
Conclusions: It was found that Dextrin has excellent cell compatibility, and when 10 mM of Dextrin was
compounded with TiO2, it had good imparting properties. Furthermore, TiO2 had similar levels of bone
conduction capability as existing bone filling materials, indicating that it may be clinically applied as a bone
filling material.
ポスター10： 新規開発デキストリン‐二酸化チタン複合骨補塡材
○ 浅井 崇文，林 達秀，濱島 聡一朗，佐藤 大和，朝倉 正紀，桐山 喬至，
森 慎太郎，河合 逹志
愛知学院大学歯学部歯科理工学講座
目的：骨の実質欠損を再建する一つの手法として，自家骨移植，他家骨移植の他に hydroxyapatite や
tri-calcium phosphate などのリン酸カルシウム系材料が骨補塡材として臨床応用されている．
近年，注目されている材料の一つであるルチル型（rutile type）二酸化チタン（TiO2）は耐久性に優れ，熱化
学的にも安定であるため，医療分野における応用も期待されている．さらに，われわれのこれまでの実験結果
において，ルチル型 TiO2 は優れた細胞適合性を有していたことから，既存の骨補塡材に代わる人工骨補塡
材として応用できないかと考えた．しかしながら，骨補塡材が粉末状あるいは顆粒状である限り補塡部位から
容易に流出することが懸念され，また，骨補塡材単独では形状付与性を有さず，任意の形態を維持したまま
一定期間骨欠損部に保持させることは困難である．そこで，形状付与性を有する骨補塡材を開発するために，
低粘性を有する Dextrin に着目した．Dextrin は澱粉が酵素，酸，熱などによって分解後，マルトースに至るま
での中間生成物の総称であり，食品，化粧品，製紙，繊維，接着剤など各分野で応用されている．
本実験では，Dextrin を移植用材料として骨内に投与あるいは移植した場合を想定して，まずは Dextrin の
マウス骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1）に対する影響について検討した．さらに，ウサギ大腿骨に形成した骨欠
損部に対する Dextrin-TiO2 複合体の補塡効果について検討した．
材料と方法：実験材料として平均分子量 2000 の Dextrin（松谷化学工業，Pine Fiber）を使用した．本実験で
は，Dextrin を 0.1，1.0，10 mM 添加した培養液を実験群とし，Control は培養液のみとした．培養は
MC3T3-E1 を 1×104 cells/ml となるように調製し，24 ウェルマイクロプレートに 400 µl ずつ播種した．各群とも
培養期間は 1，3，5，7 日間として，37˚C，CO2 濃度 5%の条件下でそれぞれ培養を行った．生細胞数の計測に
は Cell Counting Kit-8（同仁化学）を用いた（n＝5）．さらに，ラボアッセイ TMALP（和光純薬）を用いて ALP 活
性を評価した．培養方法は前述と同様とし，培養期間は 5，7，9，11 日間とした（n＝3）．各培養液は，2 日毎に
交換した．
ルチル型 TiO2 は 1400℃で焼結後，走査型電子顕微鏡（SEM）にて表面性状の観察をした．6 週齢日本白色
種ウサギ雄の大腿骨にラウンドバーで直径 2.0 mm，深さ約 1.0 mm の骨欠損部を形成し，濃度 10 mM の
Dextrin–TiO2 複合体を 5.0 mg 骨欠損部に充塡した．BONE JECT®（高研）を Control とし，同量充塡した．移
植期間は 1 および 6 週間とした（n＝6）．移植期間終了後，大腿骨を摘出し位相差顕微鏡にて組織観察を行
った（H-E 染色）．さらに，Electron Probe Microanalyzer（EPMA）を用いて移植 6 週後の補塡部位を元素分析
した．
結果および考察：in vitro において，培養液に添加する Dextrin 濃度が低濃度になるにつれて，培養期間の経
過に伴い細胞の増殖活性を促し，特に 0.1，1.0 mM 添加群は Control より高い値を示した．ALP 活性では，
培養 9 日以降では，各 0.1，1.0，10 mM 添加群すべてにおいて顕著な ALP 活性を示し，Control より有意に
高い値を示した．以上の結果から，低濃度の Dextrin の培養液への添加は細胞増殖活性を促進し，かつ，
ALP 活性も促進することが明らかとなった．本実験は，最大培養期間が 11 日間であるが，さらに長期間培養
した際には，Control よりも早い段階で石灰化結節の形成が起こると推測される．
in vivo において，移植 1 週後の組織観察は，Dextrin–TiO2 複合体および BONE JECT ともに緊密に骨補
塡されていたが，骨の再生はわずかであった．一方，移植 6 週後は両試料とも粒子間に骨組織の介在が明瞭
に観察された．さらに，EPMA 分析の重ね合わせ像より， Ca と P が TiO2 粒子間の多孔質内部にも観察され
た．本実験で試作した 10 mM Dextrin–TiO2 複合体は，骨腔あるいは骨欠損部に対して十分に形状を与え，
良好な骨伝導能を有すると考えられる．
結論：Dextrin は優れた細胞適合性を有しており，さらに 10 mM の Dextrin を TiO2 と複合化した際には良好な
形状付与性を示すことが分かった．さらに，TiO2 は既存の骨補塡材と同等の骨伝導能を有していたことから，
今後，骨補塡材として臨床応用可能であることが示唆される．
-53-
Poster presentation #11
Effect of Histone deacetylase Inhibitors on mesenchymal stem cells in osteogenic differentiation.
○Yosuke Akiba, Masaru Kaku, Katsumi Uoshima.
Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences Division of Bio-Prosthodontics
Purpose of study: Success of oral implant therapy required sufficient bone to cover implant. Bone regeneration
and alveolar ridge augmentation were effective preparations for implant installation. Histone deacetylase
inhibitors (HDACIs) were known as a new class of targeted anti-cancer agents and some of them were also
prescribed for epilepsy and bipolar disorders. In Chromatin remodeling, HDACIs controlled cell cycles by
uncoiling DNA strands from core histone protein and activated gene expressions. Previous report showed that
HDACIs regulate osteoblast differentiation by enhancing Runx2-dependent transcriptional activation in
osteoblast from calvaria and accelerate osteogenesis by increasing osteoblast marker genes in human
mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow. The objective of this study was to evaluate the effect of
HDACIs for induction to osteoblast from MSCs which were obtained from periosteum and periodontal
ligament.
Material and method: Cells: cells were obtained from 8 weeks Wister Rat. Mesenchymal stem cells were
acquired from femur bone marrow, calvaria periosteum and periodontal ligament. Osteoblast was isolated from
calvaria. Culture Medium: Proliferation medium consist of α－MEM、10％FBS、100unit/ml penicillin 100
ug/ml. Osteogenic medium composed of proliferative medium with 50 ug/ml ascorbic acid and 2 mM
B-glycerophosphate, 10 uM dexamethasone. Supplement: HDACIs (Trichostatine A (TSA), Sodium butyrate,
Valproic acid) were added to culture cells at various concentrations. Cells were incubated with HDACIs for the
first 6 days. After treated with HDACIs, cells are cultured for 0, 3, 6 and 9 days with osteogenic medium.
Culture medium was changed every 3days. Cells were maintained at 37 degree and supplemented with 5%
carbon dioxide. ALP activity assays, Mineralization assays, Immunohistochemistry staining were performed.
Result: After 3 days and 6 days treatment, TSA was able to induce significant increase of ALP activities and
mineralization in osteoblast, Bone marrow and periosteum cells. Conclusion/Discussions: These result
suggested that osteoblasts could be induced from MSCs in periosteum and periodontal ligament by HDACIs
and used for materials of bone regeneration.
-54-
ポスター1１： 間葉系幹細胞の骨形成系細胞誘導におけるヒストン脱アセチル化阻害剤の影響について
○秋葉 陽介、加来 賢、魚島 勝美
新潟大学大学院医歯学総合研究科生体歯科補綴学分野
目的：現在、インプラント治療において、その成功率と生存率を上げるためには十分な骨量が施術部位に必
要となる。そのために現行の骨造成術に加えて、更に新しい骨造成、骨新生技術の開発が求められている。
ヒストン脱アセチル化阻害剤（HDACI）は癌治療、てんかん薬などに臨床応用されている薬剤であり、HDACI
はクロマチンリモデリングにおいて、クロマチンを活性化状態に保ち、転写因子との結合を促進し、転写活性
を促進、細胞の形質発現および細胞分化方向へ誘導する。骨髄由来間葉系幹細胞の HDACI による骨形成
性細胞への誘導は知られている。本研究では、口腔領域における臨床応用において骨髄よりも侵襲が少なく
採取可能な骨膜、歯根膜由来の間葉系幹細胞の HDACI による骨形成系細胞への誘導の可能性を検討す
る。
方法：細胞：細胞の採取には 8 週齢 Wister 系ラットを用いた。大腿骨より骨髄由来間葉系幹細胞、頭蓋骨より
骨芽細胞、頭蓋骨膜より骨膜由来間葉系幹細胞、歯根より歯根膜細胞の採取を行った。培養液には増殖培
養液 として α－MEM に 10％FBS、100unit/ml penicillin 100ug/mlno 加え.石灰化培養液 としては
proliferative medium に 50ug/ml ascorbic acid and 2mM B-glycerophosphate, 10uM dexamethasone を加えた
ものを使用した。 HDACI は Trichostatine A, Sodium butyrate, Valproic acid を 骨髄由来細胞、骨膜由来細
胞、 骨芽細胞 に様々な濃度で加え、はじめの 3 日もしくは 6 日間 HDACI で処理した。HDACI で処理した
後,細胞は 0, 3, 6, 9 日間 HDACI を含まない石灰化培地で培養された。得られたサンプルに対して ALP 活
性分析, 石灰化分析, 免疫組織化学染色を行った。免疫染色には幹細胞マーカーと骨形成マーカーを用い
た。
結果：われわれの研究では歯根膜由来,骨膜由来細胞ともに既知の骨髄細胞や骨芽細胞と同様に HDACI 処
理 3 日および 6 日のサンプルにおいて HDACI 処理群ではコントロールに対して有意な ALP 活性の上昇と石
灰化組織量の増加が見られた。
結論：これらの結果は骨膜、歯根膜由来の細胞が HDACI で分化誘導することにより骨造成の材料として有用
であることの可能性を示すものであり、また HDACI を用いた分化極性付与の新規骨造成法としての可能性を
示唆するものである。
-55-
Poster presentation #12
Cytocompatibity of titanium surface immobilized with cell-adhesive proteins using a novel chemical
modification method
○Takashi kado1), Hideki Aita2), Tatsuhiro Hidaka1), Kazuhiko Endo3), Yasushi Furuichi1)
1
Department of Oral Rehabilitation Division of Periodontology & Endodontology School of Dentistry
Health Sciences University of Hokkaido2Department of Oral Rehabilitation Division of Occlusion and
Removable Prothodontics School of Dentistry Health Sciences University of Hokkaido3Department of
Oral Rehabilitation Division of Biomaterials and Bioengineering School of Dentistry Health Sciences
University of Hokkaido
Objective:
The characteristics of oral implant surface made of titanium are important for successful osseointegration and
rapid attachment of epithelium and connective tissues. Chemical modification of titanium surface with
biofunctional molecules such as proteins and growth factors is one of the promising methods for producing
implant with surface biological activity. The purpose of the present study was to establish a simple chemical
modification method to immobilize cell-adhesive proteins on titanium surface with retaining their primary
functions.
Methods:
1) Immobilization of cell-adhesive protein
The polished pure titanium disks were dipped in 1 % p-Vinylbenzoic acid solution (pH=10.83) to introduce
carboxyl groups on to titanium surface. RGDS, human plasma fibronectin (pFN) or collagen from calf skin
(Col) was subsequently immobilized on the surface through peptide bond formation by dipping titanium disk in
the protein solution containing 1.47 % 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide solution (pH=7.0).
2) Titanium surface analysis
Titanium disk dipped in only buffer solution, immobilized RGDS or adsorbed RGDS were prepared. After
washed ultrasonically in deionized water, the surface of each disk was characterized by X-ray photoelectron
spectroscopy (XPS).
3) Function of immobilized cell-adhesive protein
Periodontal ligament cells were cultured on as-polished, pFN-immobilized or Col-immobilized titanium disks
and pFN-coated or Col-coated dishes. The number of adhered cells was counted by using a hemacytometer for
each sample. Cell morphology on each titanium disk was evaluated with a confocal laser microscope.
Quantitative assessment was performed using an image analyzer (Image J).
Results:
The distinct N 1s peak was observed at around 400 eV for the RGDS-immobilized disk after ultrasonic washing.
In contrast, the N 1s peak at 400 eV for the RGDS-absorbed disk after ultrasonic washing was as small as that for
the as-polished disk. The results suggested that RGDS was covalently immobilized on the titanium disk surface by
the chemical modification method employed in this study. The number of cells attached to both pFN- and
Col-immobilized disks was twice greater than that attached to the as-polished disk. Furthermore, there was no
significant difference in the number of attached cells between the pFN-immobilized disk and the pFN-coated dish,
and between the Col-immobilized disk and the Col-coat dish, respectively. Cells were obviously larger with the
cellular processes stretched to a greater extent on the pFN- and Col-immobilized disks than on the as-polished
disk.
Conclusions:
It was demonstrated that cell-adhesive proteins were successfully immobilized on titanium disk surface with
retaining their primary functions by the chemical modification method employed in this study.
-56-
ポスター1２： 新規化学修飾法により細胞接着タンパク質を固定化したチタン表面の細胞適合性
○門 貴司 1), 會田 英紀 2), 日高 竜宏 1), 遠藤 一彦 3), 古市 保志 1)
1
北海道医療大学歯学部口腔機能修復・再建学系歯周歯内治療学分野 2 再建学系咬合再建補綴学分
野 3 再建学系生体材料工学分野
Ⅰ．目的
口腔インプラントに使用されているチタンの表面は、オッセオインテグレーションの獲得や上皮および結合
組織の付着に重要な役割を果たしている。近年、従来から行われてきた物理的な表面処理に加えて、細胞接
着タンパク質や増殖因子などをチタン表面に化学的に固定化する方法が検討されている。しかし、多くの化
学的な固定化法には、（１）操作が煩雑である、（２）特殊な装置を必要とする、（３）処理過程でタンパク質の機
能が低下するといった問題がある。そこで本研究では、チタン表面に本来の機能を保持した状態で細胞接着
タンパク質を固定化する技術を確立することを目的とした。また、口腔インプラント適応患者は高齢であること
が多く、正常幹細胞の供給という課題もある。そこで、細胞供給が比較的容易で、間葉系幹細胞様細胞の存
在が確認されているヒト歯根膜細胞群を用いて、タンパク質を固定化したチタン表面に対する細胞の応答を
調べた。
Ⅱ．材料と方法
1）化学修飾法を用いた細胞接着タンパク質の固定化
コロイダルシリカを用いて表面を鏡面に仕上げた純チタン(JIS 第 2 種）試料を、1 ％p-Vinylbenzoic Acid 溶
液（pH=10.83）に室温で 2 時間浸漬した。その後、RGDS、ヒト血漿フィブロネクチン（pFN）あるいはウシ皮膚由
来コラーゲン（Col）を加えた 1.47 ％1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 溶液（pH=7.0）に、4℃で
72 時間浸漬して、細胞接着タンパク質をチタン表面に固定化した。
2）化学修飾したチタン表面の分析
緩衝液にのみ浸漬したチタン試料をコントロールとして、RGDS を固定化した試料と RGDS を物理吸着させ
た試料を作製し、5 分間蒸留水中で超音波洗浄した後、X 線光電子分光分法（XPS）を用いて表面を分析した。
RGDS に由来する N 1s スペクトルを測定することによって、RGDS のチタン試料への結合を評価した。
3）チタン上に固定化された細胞接着タンパク質の機能の評価
研磨したチタン試料（コントロール）と pFN あるいは Col を固定化したチタン試料および市販されている pFN
あるいは Col をコートしたディッシュにヒト歯根膜細胞群（北海道医療大学歯学部倫理委員会受付番号 18）を
播種し、通法に従って培養した。各試料に対する初期付着細胞数はヘマサイトメーターで計測した。研磨した
チタン試料と pFN あるいは Col を固定化したチタン試料上の細胞に関しては、共焦点レーザー顕微鏡を用い
てアクチン骨格を観察し、Image J にて画像解析を行った。Tukey test による補正をともなった ANOVA 解析
を用いて、有意差検定を行った（P<0.05）。
Ⅲ．結果および考察
RGDS を固定化したチタン試料は、超音波洗浄後も N 1s スペクトルで 400 eV 付近に明瞭なピークが見ら
れた。しかし、RGDS を物理吸着させた後に洗浄したチタン試料では、コントロールの試料と同様に小さなピー
クしか認められなかった。この結果から、化学修飾によって RGDS がチタン表面に固定化されていることが確
認された。また、物理吸着した RGDS は超音波洗浄によって容易に脱離することがわかった。
初期付着細胞数を計測したところ、pFN および Col を固定化したチタン試料では、鏡面に研磨した試料と比
較して、2 倍以上の細胞が付着していた。また、pFN および Col を固定化したチタンの表面とそれらの接着タ
ンパク質をコートしたディッシュに付着した細胞数の間に有意な差は見られなかった。共焦点レーザー顕微鏡
でアクチン骨格を観察した結果、pFN および Col を固定化したチタン試料では鏡面に研磨したチタン試料と
比較して、アクチン骨格の面積と Feret’s の直径の値が優位に大きかった。これらの結果から、チタン試料の
表面に固定化された細胞接着タンパク質は、本来の機能をほぼ 100%保持していることが明らかとなった。
Ⅳ．結論
本研究で検討した化学修飾法によって、チタンの表面に細胞接着タンパク質をその機能を保持した状態で
固定化できることが明らかとなった。
-57-
Poster presentation #13
Differentiation Capability and Mechanical Stress Response in Dental Pulp Stem Cells
○Masaki Hata 1)，Norinaga Kojima 1)，Shogo Ozawa 1)，Yasuko Kobayashi 2)，Keiko Naruse 2)，
Tatsuaki Matsubara 2)，Yoshinobu Tanaka 1)
1
Department of Removable Prosthodontics，2Department of Internal Medicine，School of Dentistry,Aichi
Gakuin University
Objective:
Dental pulp stem cells (DPSCs) are located in dental pulp and exposed to mechanical stress. DPSCs can
differentiate into severals type of cells including odontoblasts and osteoblasts. DPSCs are relatively convenient
cell source, where those are obtained from wisdom tooth extraction or premolar extraction for orthodontic
reasons. However, a specific character of DPSCs as stem cells and its function under mechanical stimuli are not
well known. In this study, we have evaluated the differentiation capability and the response of mechanical stress
in DPSCs.
Methods:
DPSCs and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) were isolated and cultured from
6-week-old male Sprague-Dawley rats as described previously. The identification of DPSCs and MSCs were
analyzed by a fluorescence activated cell sorter (FACS) analysis. Cells were incubated with FITC–conjugated
mouse monoclonal antibodies against rat CD90, FITC-conjugated hamster anti-rat CD29 monoclonal antibody,
R-PE–conjugated mouse monoclonal antibodies against rat CD34, CD49d, and CD45 were evaluated.
Isotype-identical antibodies served as controls. In order to evaluate differentiation capability the cells were
seeded onto a 4-chanber at a density of 1×104 cells / each chamber using differentiation medium. The
adipogenic differentiation was carried out in induction medium supplemented with h-insulin, L-glutamine,
MCGS, dexamethasone, indomethasone, and IBMX. Then, it was maintained in medium supplemented with
h-insulin, L-glutamine, and MCGS. The osteogenic differentiation was carried out in osteogenic induction
medium supplemented with dexamethasone, L-glutamine, ascorbate, MCGS, and β-glycerophosphate. All
cultures were maintained for 21 days and subsequently fixed with a 4% paraformaldehyde solution prior to
staining procedures. For the adipogenic differentiation, the cells were stained with oil red O and FABP-4. For
osteogenic differentiation, the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) kit according to the
manufacturer’s protocols, and osteocalcin. The cell nuclei were stained by DAPI stain. Rate of adipogenic and
osteogenic differentiation were measured. To examine the response of mechanical stress in DPSCs, cells were
stretched by 10 % stimulus (10 round/minutes) and the phosphorylation of Akt and ERK and cell were analyzed.
The number of DPSCs were count with a hemocytometer 1-day after stretch stimulation.
Results:
The FACS analysis demonstrated that CD26(83.5%), CD34(1.4%), CD45(0.03%), CD49d(61.2%),
CD90(96.4%) in DPSCs and CD26(83.6%), CD34(3.1%), CD45(0.14%), CD49d(13.4%), CD90(94.2%) in
BM-MSCs
MSCs differentiated into adipocytes significantly higher rates than DPSCs (BM-MSCs; 33.3%, DPSCs; 9.5%).
Whereas, osteogenic differentiation of DPSCs were significantly higher than MSCs (BM-MSCs; 2.3%, DPSCs;
21.3%). Stretch stimulated the phorsphorylation of Akt and ERK in DPSCs. One hour stretch stimulation
significantly increased the growth of DPSCs by 1.3 times.
Conclusion:
DPSCs are prone to osteogenic differentiation, therefore, DPSCs may be an effective tool of bone regeneration
and stretch stimulus are thought to save cellular quantity for tissue regeneration.
-58-
ポスター1３： 歯髄幹細胞の分化能とメカニカルストレス応答に関する検討
○秦 正樹 1)，小島 規永 1)，尾澤 昌悟 1)，小林 泰子 2)，成瀬 桂子 2)，松原 達昭
愛知学院大学歯学部 1 有床義歯学講座, 2 内科学講座
2)
，田中 貴信 1)
Ⅰ．目的
有床義歯やインプラント治療において欠損部顎堤の状態は臨床的に重要であることから，顎堤吸収の著しい
症例において，骨再生が可能となれば補綴治療を行う上で非常に有益である．近年組織再生治療が注目さ
れており，その要素として細胞，増殖因子，足場が挙げられている．細胞については，多分化能を有する幹細
胞に関して様々な報告がされている．特に歯髄幹細胞は，骨，象牙質，脂肪などに分化する能力を有する細
胞で，歯の形成に重要な役割を担っているとともに，智歯の抜歯や矯正治療における便宜抜去時に採取でき
ることから，再生医療において有用な細胞として期待されている．
一方，メカニカルストレスは，骨を含む様々な組織形成に寄与していることが知られているが，口腔領域にお
いても重要な働きをしていると考えられる．メカニカルストレスは，メカノレセプターを介して細胞内シグナルが
活性化することにより各種作用を発揮するが，その歯髄幹細胞に及ぼす影響は未だ明らかではない．そこで
今回我々は，歯髄幹細胞の特異的機能の解明を目指し，その分化能およびメカニカルストレスに対する反応
について検討を加えたので報告する．
Ⅱ．材料と方法
6 週齢雄性 SD ラットの上下顎中切歯を抜歯後，酵素処理によって歯髄幹細胞（DPSCs）を，また大腿骨およ
び脛骨より骨髄を採取し，骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)を分離・培養した．培養増殖後，以下の実験を行っ
た．
① 幹細胞の同定
それぞれの培養細胞ついて，CD29，CD34，CD45，CD49d，および CD90 抗体によりフローサイトメトリーを
用いて同定した．
② 分化誘導
間葉系幹細胞用の誘導用基礎培地を用いて，脂肪細胞と骨芽細胞への分化誘導を行った．分化後，脂肪
細胞を oil-red-O 染色，FABP-4 にて免疫染色を行った．骨芽細胞については，アルカリフォスファターゼ染
色およびオステオカルシンにて免疫染色を行った．染色と同時に DAPI 染色を行い，各細胞の脂肪組織，骨
組織への分化率を測定した．
③細胞伸展刺激に対する反応
DPSCs をストレッチチャンバー(2cm×2cm)で培養し，培養細胞伸展装置(Strex Japan 社)に取り付け，10%の
伸展刺激(10 往復/分)を与えた．細胞内シグナルについて p44/p42 MAP キナーゼおよび Akt のリン酸化の
経時的変化を Western Blot 法により検討するとともに，伸展刺激後の細胞数をカウントした．
Ⅲ．結果と考察
表 面 抗 原 は ， DPSCs:CD29(83.5%) ， CD90(96.4%) ， CD49d(61.2%) ， CD34(1.4%) ， CD45(0.03%) ．
MSCs:CD29(83.6%)，CD90(94.2%)，CD49d(13.4%)，CD34(3.1%)，CD45(0.14%)であった．
分化誘導については，脂肪誘導により DPSCs では 9.5±0.4%，MSCs では 33.3±1.7%の細胞が脂肪細胞に
分化し，MSCs の脂肪細胞への分化が DPSCs に比較し有意に多かった(P<0.01)．
一方，骨誘導では，DPSCs では 21.2±1.7%，MSCs では 2.3±0.3%の細胞が骨芽細胞に分化し，DPSCs の
骨芽細胞への分化が MSCs に比較し有意に多かった(P<0.01)．
細胞伸展刺激は，経時的に p44/p42 MAP キナーゼおよび Akt をリン酸化させた．伸展刺激１日後に細胞
数をカウントしたところ，伸展刺激を加えたものでは約 1.3 倍の有意な細胞数の増加が確認され，ストレッチ刺
激が組織再生に必要な細胞量の確保に有効であると考えられた．
Ⅳ．結論
歯髄幹細胞は骨組織に分化しやすいことから、骨再生における細胞ツールの一つとして考えられる。
-59
Poster presentation #14
UV-treated titanium enhances focal adhesion and initial behaviors of osteoblasts
○F. Iwasa1), N. Hori1.2), M.Yamada1.3), T. Suzuki1), T. Ueno1), and T. Ogawa1)
1
The Jane and Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, Division of Advanced Prosthodontics
Biomaterials and Hospital Dentistry, University of California Los Angeles, USA 2Department of Oral &
Maxillofacial Rehabilitation, Kanagawa Dental College, Japan 3Department of Removable Prosthodontics,
Tokyo Dental College, Japan
Objectives: The establishment of focal adhesion is an important initial step that regulates subsequent cellular
functions during biomaterial-cell interactions. We previously reported that ultraviolet (UV) light treatment of
titanium promote bone formation around the implants and increase the strength of osseointegration. We
hypothesized the initial establishment of cell attachment and adhesion plays a key role in this enhanced
biological process. The objective of this study was to examine the potential of UV-pretreated titanium with
respect to the attachment, spreading and anchorage of osteoblastic cells, as well as their development of a focal
adhesion and cytoskeleton.
Method: Rat bone marrow-derived osteoblastic cells were cultured on acid-etched titanium disks with and
without UV light pretreatment. The number of cells attached to titanium disks was assessed by WST-1 stain.
The spread and cytoskeletal development were evaluated by confocal microscopic image-based
cytomorphometry with actin filament stain. The expression of a focal adhesion protein, vinculin, was evaluated
by western blot and immunolocalization. The anchorage of cells was evaluated by quantifying the cells retained
after trｙpsin-enzymatic treatment.
Results: After 24 h of incubation, double the number of cells attached to UV-treated surfaces compared with
untreated surfaces. The cells on UV-treated surfaces were 4 times larger with highly organized actin filaments
after 3 h. Vinculin was expressed extensively and intensively (4.2 times) in the cells on UV-treated surface. The
retention of the cells on UV-treated surfaces was approximately 3 times greater than that on untreated surfaces.
Conclusion: The UV treatment of titanium promoted the process of focal adhesion in osteoblasts, which may
have resulted in an enhanced attachment, expedited spread and cytoskeletal development, and increased
anchorage of the cells.
-60-
ポスター14： UV 処理チタンへの初期細胞接着に関する研究
○岩佐 文則 1)、堀 紀雄 1.2)、山田 将博 1.3)、鈴木 丈夫 1)、上野 剛史 1)、小川 隆広 1)
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles(UCLA) 2 神奈川歯科大学顎口腔機能修復科学講座 3 東京歯科大学有床義歯
学講座
目的：細胞と生体材料の生物学的相互作用において、接着細胞の材料表面上での接着斑形成は細胞がそ
の機能を構築する上で大変重要な初期ステップである。以前我々は、チタン表面に UV 照射を施すことにより、
インプラント周囲の骨形成を促進し、オッセオインテグレーションの強度を増加させることを報告した。今回
我々はこれらのプロセスに初期の細胞接着が重要な鍵となっていると仮説し、調査した。本研究は骨芽細胞
のチタン上への接着、伸展、接着強度（維持）を評価し、併せて接着斑形成と細胞骨格の発達を観察すること
によって UV で前処理したチタンの潜在性を検索することを目的とする。
方法：8 週例ラット骨髄由来の骨芽細胞様細胞を UV 処理、未処理の酸処理チタンディスク上で培養した。デ
ィスク上の接着細胞数は細胞播種後 3，24 時間後に WST-1 染色法により評価した。細胞の伸展及び細胞骨
格の発達は接着斑分子ビンキュリン及び細胞骨格分子アクチンフィラメントの螢光二重染色を共焦点レーザ
ー顕微鏡で撮影し確認した。また、そのイメージ画像から画像解析ソフト ImageJ にて形態測定を行った。ビン
キュリンの発現はウエスタンブロッティングと蛍光染色のイメージ画像から定量し、評価した。さらに細胞の接着
強度(維持力)をトリプシン処理および、歯科用バイブレータによる機械的振動後、ディスク上の接着及び浮遊
細胞数を定量する２つの方法で評価した。
結果：UV 処理後のディスク上では未処理と比較して接着細胞数は 24 時間後に 2 倍になっていた。また UV
処理ディスク上での細胞はアクチンフィラメントがよく発達し 3 時間後、未処理ディスクに比較しその大きさは 4
倍になっていた。さらに、接着斑マーカーであるビンキュリンは細胞辺縁部に広範囲かつ強烈に発現していた。
(3.2 倍) UV 処理ディスク上での細胞の接着強度（維持力）は未処理ディスク上と比較してトリプシン処理およ
び振動による機械的処理のいずれにおいても有意に強まっていた。
結論：チタンの UV 処理により骨芽細胞の接着が強まり、接着斑形成も促進された。その結果、細胞の伸展と
細胞骨格の発達が促され、さらにチタンへの維持力も強まった。
-61
Poster presentation #15
N-acetyl cysteine (NAC)-mediated detoxification and functionalization of Resin-modified glass
inomer cements.
○Hajime Minamikawa1), Masahiro Yamada2), Takeshi Ueno1), Fuminori Iwasa1) and Takahiro Ogawa1)
1
Laboratory for Bone and Implant Sciences (LBIS), The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive
Biotechnology, UCLA School of Dentistry 2Department of Removable Prosthodontics, Tokyo Dental
College, Japan
Objective; Resin-modified glass ionomer cements (RMGICs) have been developed as hybrid materials to
improve mechanical and physical properties compared with conventional glass ionomer cements. However, the
application of RMGICs is still limited because they have a toxic effect on dental pulp. Previous researchers
agree that such toxicity is mediated through the release of some components, non polymerized resin monomer,
from RMGICs. N-acetyle cysteine (NAC), cysteine derivative, may decrease this toxicity by inactivating the
monomer components and other components with its sulfhydryl moiety. The purpose of this study is to examine
the incorporation of an antioxidant amino acid, NAC, in RMGICs reduces the cytotoxicity and restores the
function in situ.
Material & Method; Rat dental pulp cells (RDPCs) isolated from rat incisors were cultured on RMGICs with
or without NAC incorporation. The viability and proliferation of the cells were evaluated by annexin V-based
flow cytometry and BrdU incorporation, respectively. The spreading behaviors of the RDPCs were examined
with using Confocal laser scanning microscopy after 24 hours of incubation. Image J was used to analyze
images. The function of the RDPCs was evaluated by alkaline phosphatase activity (ALP) staining, von Kossa
staining.
Result; The percentage of viable cells at 1 day culture was over 70% on RMGICs with NAC, while it was
below 40% on the untreated RMGICs. During incubation of 3h and 24h, initial attachment of cells was lower on
untreated RMGICs than on RMGICs with NAC. Confocal microscope images of DPCs 24h incubation after
seeding onto RMGICs with and without NAC revealed a distinctive contrast in cell morphology. The cells were
noticeably larger on RMGICs supplemented with NAC. RMGICs with NAC also restored ALP activity and von
Kossa positive mineralized nodule formation compared with untreated RMGICs.
Conclusion; These results show that the addition of NAC to RMGICs significantly improves its cytotoxicity to
the RDPCs and restored their odontoblast-like cell phenotype to biologically significant level.
-62-
ポスター15： N-アセチルシステイン含有レジン添加型グラスアイオノマーセメントの生物学的評価
○南川 元 1)、山田 将博 2)、上野 剛史 1)、岩佐 文則 1)、小川 隆広 1)
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles (UCLA) 2 東京歯科大学有床義歯学講座
目的；レジン添加型グラスアイオノマーセメント（RMGICs）は、従来型グラスアイオノマーセメント(CGICs)の機
械的性質を改良するために開発された歯質修復材料である。RMGICs は CGICs と比べ操作性が改良され、
歯髄接着性も強く、多くの利点があるが、有機モノマーを配合したことにより、その生体親和性は従来型と比
べ著しく低い。過去、多くの論文において、RMGICs は歯髄に対してその毒性の影響が in vivo, in vitro の両
方で指摘されてきた。Ｎ-アセチルシステイン（NAC）はグルタチオンの前駆体で抗酸化能力をもつアミノ酸とし
て知られている。我々は、NAC の能力に注目し、RMGICs の生体親和性を改善することで、RMGICs の直接歯
髄覆髄材への適応を含む新しい歯科材料としての可能性を探った。本研究では、市販レジン添加型グラスア
イオノマーセメントに NAC を添加し、in vitro においてラット切歯から分離した培養歯髄細胞（RDPCs）の細胞
生存率・増殖能・分化能を調べた。
材料と方法；6 週齢オスＳＤラットの切歯から collagenase-trypsin にて分離した歯髄細胞を用いた。レジン添加
型グラスアイオノマーセメントに 25mM の NAC を配合したものを実験群とし、レジン添加型グラスアイオノマー
セメントをコントロール群とした。実験群・コントロール群のサンプル上に播種し、ラット歯髄細胞の 24 時間後の
生存率を flow cytometry で測定した。サンプル上の接着細胞数は細胞播種後 3、24 時間後、3 日後に WST-1
染色法により評価した。細胞の進展、および、細胞骨格の発達は、細胞骨格分子アクチンフィラメントを蛍光
染色し、細胞播種後 24 時間後に共焦点レーザー顕微鏡で撮影し確認した。また、同時に活性酸素種（ROS）
の可視化検出を行った。そのイメージ画像から Image J を用い画像解析を行った。歯髄細胞の分化と石灰化
物質の形成の有無は ALP 染色・von Kossa 染色処理をして調べた。また、細胞増殖能に対する影響は BrdU
を用いて確認した。
結果および考察；培養 24 時間後に実験群の細胞生存率は、コントロール群が 40％以下であるのに比べて、
70％と高い値を示した。接着細胞数・ALP 染色・von Kossa 染色いずれにおいても、コントロール群に比べ、実
験群では優位に高い値を得られた。共焦点レーザー顕微鏡下において、実験群では正常の細胞また、ROS
の発現はコントロール群において著しく増加しているが、実験群においてこの状態が改善されているのを確認
した。
結論；以上の結果から、NAC 含有 RMGICs は RDPCs に対する毒性を著しく減らし、また、その毒性によって
影響の受けていた RDPCs の分化を回復させることがわかった。
-63-
Poster presentation #16
A tryptamine derivative, SST-VEDI-1, inhibits apoptosis and stimulates terminal osteoblast
differentiation
○Yoshikazu Mikamia,b , Masanori Someic, Minoru Takagia,b
a
Department of Anatomy, Nihon University School of Dentistry bDivision of Functional Morphology,
Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry cDivision of Pharmaceutical Sciences,
Graduate School of Natural Science and Technology, Kanazawa University
Objectives
SST-VEDI-1(VEDI-1) was synthesized from tryptamine as a novel compound as part of an effort to develop
drugs for the treatment of both erectile dysfunction and baldness. Its congeners have been isolated and
identified as natural products from the seeds of Rollinia mucosa (Annonaceae), which is widely distributed in
tropical regions of the Americas. The fruit of this plant is edible and is used in folk medicine as a therapeutic
agent. However, the biological effects of VEDI-1 have yet to be well characterized.
A recent report has demonstrated that SSH-BM-type compounds which have a similar chemical structure of
VEDI-1 can stimulate alkaline phosphatase (ALP) activity and induce osteogenic gene expressions in cultured
scales of goldfish. Thus, in this study, we examined the effects of VEDI-1 on osteoblast differentiation as well
as its effects on apoptosis, which is known to be closely related to osteoblastic differentiation.
Materials and methods
The study of the regulation of cell differentiation and apoptosis requires in vitro models utilizing
phenotypically stable cultured cell lines, in which the direct effects on individual cell types can be investigated.
Therefore, in this study, three cultured cell lines, ROB-C26, MC3T3-E1, and ROS17/2.8, were used. ROB-C26
cells are pluripotent mesenchymal progenitor-like cells. MC3T3-E1 cells and ROS17/2.8 cells are
pre-osteoblast-like and mature osteoblast-like cells respectively.
To investigate the effects of VEDI-1 on osteoblastic differentiation, we cultured the cells in the presence or
absence of VEDI-1 and then examined mineralization levels and expression levels of osteogenic marker genes
by an alizarin red S staining and a real time RT-PCR respectively. In addition, to investigate the effects of
VEDI-1 on apoptosis, we induced apoptosis in VEDI-1 treated cells and untreated cells by serum-starvation,
and then examined cell viability, DNA condensation, Caspase activity, and expression levels of related genes.
Results
We found that VEDI-1 enhanced the formation of alizarin red S positive mineralized nodules in ROS17/2.8
cells and MC3T3-E1 cells in a dose dependent manner, which was accompanied by increased expression of late
osteoblast markers, bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). However this inductive effect of VEDI-1 on
osteoblastic differentiation was not observed in ROB-C26. On the other hand, VEDI-I inhibited
starvation-induced cell death, DNA condensation, and caspase activation in the three types of cells. Furthermore,
VEDI-1 suppressed the expression of apoptosis-promoting genes (Bax, Bak and Bad), and induced that of an
apoptosis-suppressing gene (Bcl-2).
Conclusion
Our results suggest that VEDI-1 facilitate terminal differentiation of osteoblasts but failed to commit
pluripotent mesenchymal progenitor cells into osteoblasts. In addition, VEDI-1 has an inhibitory effect on
apoptosis by regulating the gene expression of Bcl-2 family.
-64-
ポスター16： トリプトアミン誘導体、SST-VEDI-1 はアポトーシスを抑制し、骨芽細胞の最終分化を促進
する
○三上 剛和 1,2、染井 正徳 3、高城 稔 1,2
1
日本大学歯学部解剖学教室第 1 講座、2 日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門、3 金沢大学
大学院自然科学研究科薬学系薬化学研究室
目的
SST-VEDI-1(VEDI-1) は,トリプタミンから新規に合成された有機化合物である。VEDI-1の同族体は、バンレ
イシ科植物の果物の種子中に天然物として存在することが報告されている。また、アメリカの熱帯地方では、そ
の種子が様々な病症に対する民間薬として活用されている。
しかしながら、VEDI-1の生理的作用については解析が行われておらず、不明である。
近年、VEDI-1と類似した化学構造をもつSSH-BM 型の化合物に、アルカリフォスファターゼの活性化レベル
を上昇させ、骨芽細胞分化関連因子の発現を誘導する作用があることが金魚の鱗を用いた実験によって報告さ
れた。そこで、本研究では、VEDI-1の新規機能を同定する目的で、骨芽細胞分化に対する影響を培養細胞を
用いて検討した。また、骨芽細胞分化と関連の深いアポトーシスに対する影響についても合わせて検討した。
方法
・骨芽細胞分化に対する影響の解析
各々の細胞系統への分化過程を詳細に解析するには、異なる分化レベルにある培養細胞株を用いる実験系
が有用な手段となる。そこで、本研究では異なる分化レベルにある3種類の培養細胞株を用いた。用いた細胞と
それぞれの特徴を以下に示す。
１．ROB-C26：ラット未分化幹細胞様
２．MC3T3-E1：マウス前骨芽細胞様
３．ROS17/2.8：ラット成熟骨芽細胞様
これらの細胞をVEDI-1添加および非添加で培養し、骨芽細胞分化に対する影響を検討した。骨芽細胞分化
の指標として次の点について解析を行った。
１．石灰化物の形成：Alizarin red S 染色、沈着カルシウムの定量
２．骨芽細胞分化関連因子の発現レベル：real time RT-PCR, Western blotting
・アポトーシスに対する影響の解析
コンフルエント状態の細胞をVEDI-1添加あるいは非添加の条件で飢餓状態に誘導した。その後、経時的に
生細胞数の計測を行い、飢餓によって誘導される細胞死に対する影響を検討した。アポトーシスの指標として、
以下の点について解析を行った。
１． クロマチン (DNA) の凝縮：DAPI 染色
２． Caspase の活性化レベル：Caspase 3/7 Glo assay kit (Promega)
３． アポトーシス関連因子の発現レベル：real time RT-PCR
結果
・骨芽細胞分化に対する影響
VEDI-1はROS17/2.8およびMC3T3-E1の石灰化を濃度依存的に促進すると共に骨芽細胞分化の指標である
BSPやOCの発現量を増加させた。しかし、ROB-C26 に対しては、このような骨芽細胞分化に対して促進的と考
えられる作用効果は認められなかった。
・アポトーシスに対する影響
VEDI-1は飢餓状態によって誘導される細胞死を抑制すると共に、それに伴うクロマチンの凝縮、caspase3/7の
活性化を抑制した。また、アポトーシス抑制因子であるBcl-2の発現量を増加させ、アポトーシス誘導因子である
Bak, BaxおよびBad の発現を抑制した。
結論
VEDI-1は未分化な細胞に対しては、骨芽細胞への分化を誘導することはできないが、骨芽細胞の最終分化
に対しては促進的に働くと考えられる。また、Bcl-2 ファミリー の発現を制御することによってアポトーシスを抑
制すると考えられる。
-65-
Poster presentation #17
Co-Culture Effect of Peripheral Blood Mononuclear Cells with and without IL-2 on Osteoblasts
○N. TSUKIMURA1,2）, K.ISHIGAMI2）and T. OGAWA1）
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles (UCLA)
2
Department of Partial Denture Prosthodontics, Nihon University School of Dentistry, Tokyo, Japan
Prosthodontic treatments, often times, involve the necessity of pre-prosthetic regenerative therapies, such as
guided bone generation (GBR) and soft tissue grafting/surgery. Among these, the importance of successful bone
regenerative therapy has been emphasized, in light of the development of favorable host sites for implant
placement. Currently available bone regenerative therapy using various bone substitute materials and
autologous bone tissue can not always be an effective tool to overcome potential problems in healing capacity
of the host site, anatomical limitation of the existing bone, and protracted healing time.
Osteoimmunology is an interdisciplinary research field combining the exciting field of Osteology and
Immunology. Osteoimmunology has been primarily underscored from the view point of bone resorption in
inflammatory bone disease, such as rheumatoid arthritis and periodontal disease (Rauner et al., 2006).
Surprisingly, the biological reaction of osteogenic cells to immune cells, however, has rarely been addressed.
We hypothesized that immune cells possess the potential to modulate the phenotype and function of
osteogenic cells.
Objective: This study was to examine the co-culture effect with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
activated or non-activated the interleukin 2 on the proliferation, differentiation and mineralizing capacity of
human mesenchymal stem cells.
Methods: Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were expanded and seeded into the
culture media with or without dexamethasone. At day 3 of culture, IL-2-activated or non-activated PBMCs were
added into the mesenchymal cell culture, and co-cultured up to day14. Cell proliferation was evaluated by cell
number measured and the osteoblastic differentiation was assessed by RT-PCR and alkaline-phosphatase (ALP)
stain at days 6 and 9.The mineralizing nodule was assessed by Von Kossa stain at day14.
Results: The number of the cells was up to 5 times greater with the PBMCs than without the PBMCs at day 6.
The ALP positive area in the day 6 osteoblastic culture was significantly increased 4 and 7 times by adding of
the non-activated PBMCs, and BMSCs with the activated PBMCs. The Von Kossa positive area of the
osteoblastic culture was increased culturing with the PBMCs, particularly when cultured with activated PBMCs.
(p<0.001, one-way ANOVA)
Conclusion: An addition of the PBMCs promoted the proliferation and differentiation of the human
mesenchymal cells in the osteogenic media. Also, PBMCs induced the osteoblastic differentiation of the human
mesenchymal stem cells under the dexamethasone-free condition. These effects seemed to be enhanced when
the PBMCs were activated by IL-2.
-66 -
ポスター17： IL-2 により活性化された末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）の骨形成原
細胞への影響
○月村 直樹 1,2）,石上 友彦 2），小川 隆広 1）
1
The Jane & Jerry Weintraub Center for Reconstructive Biotechnology, School of Dentistry, University of
California, Los Angeles (UCLA)
2
日本大学歯学部歯科補綴学教室Ⅱ講座
目的：歯科医療における再生療法の重要性、必要性は年々増しつつある。年率１５％強の増加傾向にある
インプラント治療の前処置としての骨造成、そして歯周疾患時の歯槽骨の再生がそれにあたる。しかしながら、
手術時の技術上の困難性、ホスト側の生物学的許容の限界、用いる生体材料の生体活性の限界などの問題
から、骨組織の再生には骨量、骨質の限界があり、おのずから次に施される有効な歯科治療の適応にも限界
が生じている。
一方、骨免疫学における免疫細胞と破骨細胞の関連を鑑みても、骨芽細胞に何にも影響を与えていないと
は思えず、体内の骨再生において免疫細胞は重要な役割を担っているものと考えられる。そこで、我々は免
疫細胞が骨形成原細胞の表現型と機能を調節する能力も併せ持つとの仮説を立てた。
この研究の目的は、骨形成原細胞と末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を共培養し、骨
形成原細胞の増殖、分化そして石灰化能を見ることで、免疫細胞の骨形成原細胞への影響を確認することに
より、治癒の起点などで起こる骨芽細胞に対する免疫細胞の役割を解明することである。
材料と方法：ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞を通常の培養液と分化促進する培養液とで培養し、そこにヒト
から採取した血液から末梢血単核細胞（免疫細胞）を加え共培養する。
評価方法は、まず細胞増殖能は、細胞播種後 6、9 日目に細胞を 2 回 PBS で wash した後、37℃で 15 分間,
0.1％コラゲナーゼを加えた 0.25％トリプシン－1mM-EDTA-4Na にて細胞を回収し、ヘマトサイトメータを使用
し細胞数を数える。
次に、細胞骨関連mRNAの発現解析は、各サンプル上に細胞を播種してから6、9日目に各群の細胞を回
収し、RT-PCR法を用いて骨関連遺伝子であるⅠ型コラーゲン、オステオポンチンおよびオステオカルシン
mRNAの検出を行う。PCR産物はエチジウムブロマイド染色を行い、1.5%アガロース・ゲルで電気泳動を行う。
紫外線光下で取り込んだバンドの画像を解析ソフトで数値化し、ハウスキーピング遺伝子である
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）の発現量を基準として遺伝子発現を半定量化する。
さらに、細胞増殖能および骨産生や石灰化物の有無を見るための ALP 染色および Von Kossa 染色を行い、
視覚的にその違いを把握するのと同時にコンピュータ・ソフトを用いて定量化する。
結果と考察：1．増殖については、3 日後、6 日後共に末梢血単核細胞を加えた間葉系幹細胞の群（以後
PB 群）が、細胞単体のコントロール群（以後、C 群）に比べ有意に大きく（3-4 倍）なり、さらにインターロイキン
でアクティベートした群（以後、IL 群）では、その差は大きく（5-8 倍）なった。
2．Alkaline phosphate（AIP）染色による分化能においては、分化促進培養液で培養した幹細胞は、6 日後
には PB 群が C 群に比べ 4 倍、IL 群では 7 倍になった。分化非促進培養液の幹細胞は、末梢血単核細胞を
加えないとほとんど染色されなかった。さらに、細胞自体染色したものでも同様な結果が得られた。
3．骨関連遺伝子の発現を見ると、分化非促進培養液の幹細胞はコラーゲンⅠ以外のオステオポンチン、
オステオカルシンのメッセンジャーRNA の発現レベルが PB 群では C 群に比べ上昇し、さらに 6 日後には IL
群では、2-3 倍になった。分化促進培養液で培養した幹細胞でも同様の傾向を認めた。
4．14 日後の Von Kossa 染色による石灰化能においては、分化促進、非促進にかかわらず、PB 群が C 群
に比べ顕著に染色面積は大きくなった。
間葉系幹細胞は分化促進、非促進培養液に関わらず末梢血単核細胞を加えることにより、生物学的機能
は亢進し、さらにインターロイキンをアクティベートするとその効果がより高まることがわかった。
結論：今回、免疫細胞（末梢血単核細胞）は、骨芽細胞の生物学的能力の亢進の一役を担っていること可
能性が示唆された。このことは、骨芽細胞と免疫細胞との関連を明らかにする糸口になると思われる。
-67 -
広 告・協
・日本メディカルマテリアル（株）
・（株）トクヤマデンタル
・（株）ヨシダ
・ファイテン株式会社
・メディカルサイエンス株式会社
・ナカシマメディカル株式会社
-68-
賛