Title 渦鞭毛藻類における塩基性核タンパク質HCcと葉緑体型

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渦鞭毛藻類における塩基性核タンパク質HCcと葉緑体型
フェレドキシンの遺伝子構造に関する研究(
Dissertation_全文 )
吉川, 毅
Kyoto University (京都大学)
1997-03-24
http://dx.doi.org/10.11501/3123490
Right
Type
Textversion
Thesis or Dissertation
author
Kyoto University
(
と)
渦鞭毛藻類における塩基性核タンパク質 H
C
cと葉緑体型フェレドキシンの
遺伝子情造に関する研究
1997年
吉川毅
目次
第 1:
掌緒宮
第 2主
l
C
r
y
p
t
h
e
c
o
d
i
n
i
u
mc
o
h
n
i
i
からのヒストン糠塩基性核タンパク質 H
C
cを
コードする遺伝子のクローニングとその遺伝子構造解析
6
2
.
1 方法
7
C
r
y
p
t
h
e
c
o
d
i
n
i
u
mc
o
h
n
i
i
の培養と全DNAの抽出
P
C
Rによる H
C
c
l遺伝 Fの増幅
PCR
増中日産物のクローニングと塩基配列の決定
2
.
2
結果
10
H
C
c
1遺伝子の P
C
Rによる増幅
H
C
c
1遺伝子に存在する介在配列
H
C
c
l遺伝子周辺領域の塩基配列
2
.
3 考察
17
H
C
c
l遺伝子は multigenefamilyを形成する
H
C
c
l遺伝子に存在するイントロンの特殊性
H
C
c
l遺伝子のプロモーター領域の特殊性
第 3望
書
渦鞭毛藻類の葉緑体型フェレドキシンをコードする遺伝子の塩基配列から
2
1
見た渦鞭 毛部類の分子系統とその遺伝子構造の解析
3
.
1 方法
24
渦鞭 毛藻煩の培養
渦鞭毛藻類からの全DNAの抽出
G
o
n
y
a
u
J
a
xp
o
J
y
e
d
r
a
からの全R
NAの抽出
P
C
R、R
T
.
P
C
Rによる葉緑体型フェレドキシン遺伝子の榊幅
T
A
I
L
.
P
C
Rによる業総体型フェレドキシン遺伝子周辺領域の増幅
P
C
R増幅産物のクローニングと塩基配列の決定
葉緑体型フェレドキシンアミノ階配列のアラインメントと
系統樹の作成
葉緑体型フェレドキシントランジット配列の解析
30
3
.
2 結呆
C
R、T
A
I
L
.
P
C
Rによる増幅
葉緑体型フェレドキシン遺伝子の P
葉緑体型フェレドキシン遺伝子の塩基配列の解析
葉緑体型フェレドキシン遺伝子の塩基配列を
分子系統
mいた渦鞭毛藻類の
第 1章
業総体型フエレドキシン遺伝子のプロモーター領域の解析
緒言
葉 緑 体型フエレドキシン 遺伝子のトランジット 配列
46
3
.
3 考察
来緑体型フェレドキシンから見た渦鞭屯藻類と緑部類の類縁関係
渦鞭毛藻類は赤潮形成花や麻神性貝毒産生穏を含み 、水産増益殖業に多大な被害を及ぼ
していることから、その防除という 面で産業的に重要視されている。その一方で染色体や
県緑体型フエレドキシン遺伝 i
二プロモーターの特殊性
DNAも含めてその核構造に注目すると他の真核生物と大きく異なる特徴的な性質が数多く
業緑体型フェレドキシンのトランジット配列と渦鞭毛藻頬の
葉緑体膜構造との 関係
認められる。例えば、渦鞭毛藻煩は真核生物の中でも({(径5
.
1
1
0 μ mと比較的大きな核を
第 4京 総 括
54
S
u
m
m
a
r
y
57
持ち、その DNA拡も極めて多く、 G
o
n
y
a
u
l
a
xp
o
l
y
e
d
r
aでは 200p
g
/n
uc
1c
u
sと、ヒトの約 100
倍もの DNAを有する (
S
i
g
c
c
，1
9
8
6
)
。染色体数も施によ っては 数 100を数える (
S
h
y
a
me
ta
l
.，
1978，
H
o
l
t
e
t
a
1
.・
1
9
8
2
)
。また、核DNA中においては t
h
y
m
i
n
cの修飾庖基
h
y
d
r
o
x
y
m
c
t
h
y
lu
r
a
c
i1(HOMcUr
a
)への置換もしくは修飾が認め られ る (
R
a
e
，1
973，Raea
n
d
参考文献
58
S
t
e
e
l
e，1978，S
t
c
e
l
ca
n
dRac
，1
980，H
e
r
z
o
ga
n
dS
oy
e
r
，1
982，G
a
l
l
c
r
o
n，1984，D
a
v
i
e
se
ta
l
.，
1988，l
a
r
v
i
se
ta
1
.，1
9
9
2
)
0 HOMeUraは一部のパクテリオファージにおいてのみ存花が確
認されている極めて特異な修飾塩基で (
K
a
l
l
e
nc
ta
1
.， 1
9
6
2
)、渦鞭毛藻瀬においてはThyの
1070%が置換されていることが権認されている (
R
a
e，1
9
7
6
)。
・
しかし、渦鞭毛藻類の抜構造の特殊性がより顕著に認められるのは d
inomi
t
o
s
isと呼ばれ
る体細胞分裂に伴う核分裂機構と染色イ本J
構造である。 渦鞭毛藻類の核分裂では M期におい
H
a
l
l， 1
9
2
4
)、核外動原体微小管が核を貫通する形で分裂方
ても核膜の消失が認められず (
向に伸長し (
L
e
a
d
b
e
a
t
e
ra
n
dDodgc，1967)、その微小管は核膜を通じて染色体の動原体株構
造につながっている (
O
a
k
l
e
ya
n
dDodge
，1
974，1
9
7
6
)
。核は微小管の万向に従って分裂す
K
u
b
a
ia
n
dR
i
s，1
9
6
9
)
。
るが、染色体は核膜に付着した状態、で娘核に分配される (
また、渦鞭毛藻類の染色体は細胞周期を通じて常に凝集したままで、その高次構造は2
価の金属イオン (
H
e
r
z
o
ga
n
dS
o
y
e
r
，1
9
8
3
) と構造RNA(
S
o
y
e
r
G
o
b
i
l
l
a
r
da
n
dH
e
r
z
o
g
，1
9
8
5
)
により安定化されていることが示唆されている o 染色体を光学顕微鏡、電子顕微鏡を用い
て観察すると、頼粒状領域と繊維状領域が交互 に現れるバンドパターンが認められ、これ
は真核生物におけるヘテロクロマチンに山来するバンド構造とは異なる。染色体の高次構
造に関しては多くのモデルが提唱されたが (
H
a
a
p
a
l
aa
n
dS
oy
e
r
，1
973，S
oy
e
ra
n
dH
a
a
p
a
l
a，
1974，L
i
v
o
l
a
n
ta
n
dBoul
i
g
a
n
d，1
9
8
0
)、G
i
e
s
b
r
e
c
h
t(
1
9
6
1，1
9
6
5
)はアーチ型のヌクレオイド
p
e
c
t
o
r
梯構造を認め、渦鞭毛藻類とバクテリアの染色体構造の類似性を指摘している。 S
e
ta
1
.(
1
9
8
1
)はP
e
r
i
d
i
n
i
u
mc
i
n
c
t
u
mにおいて DNA復製途中の染色体を観察し、スーパーコイ
1
ルを形成する染色体DNAと繊維状骨格より成る渦鞭毛藻類特布のクロモネマ構造を報告し
R
a
t
t
n
e
r
，]9
77，Bodanskye
ta
l
.，1979，R
i
z
z
oa
n
dB
u
r
g
h
a
r
d
t
，1
9
8
2
)、電子顕微鏡で観察され
a
a
p
a
l
aa
n
dS
oy
e
r(
1
9
7
4
) はP
r
o
r
o
c
c
n
t
r
u
mm
i
c
a
n
s
の染色体DNAが閉環状のスー
た。 また H
る染色体断面のアーチ型のヌクレオイド様の偽造は何れも渦鞭毛藻類の染色体構造が兵妓
パーコイル構造を取ることを示している。実際の染色体構造は更なる形態学的、生化学的
odge(
1
9
6
5
)は渦鞭毛深頬
生物というよりはむしろ原核生物的であることを示している。 D
な情報の品積を待たなければならないが、渦鞭毛藻類の染色体が真核生物において示され
が示す原校生物的な性状から、渦鞭毛藻類を原校生物が点核生物へと進化を遂げる過程の
ているクロマチンのループ状ドメインにより形成される染色イ材存造と全く異なっているこ
中間に位置する生物であるとし、 mc
s
ok
a
ry
o
t
cと分類することを提唱した。また L
o
e
b
l
i
c
h
とは明らかである。
(
1
9
7
6
) は原妓生物的な性状に加えて認められる渦鞭毛深知独同の核分裂機構や染色体惜
よl.!:に特徴的なが例として、渦鞭毛藻類の核はヒストンタンパク質を欠き 、従って染色体
m
e
s
o
k
a
r
y
o
t
c
"ではなく、原核生物が真抜生物へと進化す
造に基づき、渦鞭毛藻類は単なる "
の染色体に は認められない
の日次構造の基本惟位であるヌクレオソーム構造が渦鞭毛深海1
"
1の進化を遂げた生物群であると捉え
る過程の極めて初期の段階で真核生物から分岐し独 1
ことが与さげられる (
B
o
d
a
n
s
k
ye
ta
l
.，1979，R
i
z
z
o，1981，H
e
r
z
o
gandS
o
y
e
r，1981，R
i
z
z
oa
n
d
f
こo
B
u
r
g
h
a
r
d
t
，1
980，S
h
u
p
ea
n
dR
i
z
z
o，1983)
。しかしながらその染色体は前述の通り明らかに
このような研究に対し、近年、生物の進化系統関係を i
論じる手法として、 DNAの温法配
i
t
iをイiしていることから、何らかの形でDNAのパッキングを行っていることは間違
高次行t
列に 高税された変異から 生物間の進化の道筋を般定する、いわゆる分子進化学を応用した
いない。このような観点からヒストンに代わる DNA結合タンパク質が検索され、数種の渦
研究も進められ、渦鞭毛藻類においても分子進化の指椋として信頼度の高いリボゾーム
鞭毛球類からヒストン織核タンパク質が見出された (
R
i
z
z
o a
n
d Nooden
， 1
974， R
i
z
z
o，
RNA (rRNA) をコードする遺伝子の塩基配列と、それに基づく渦鞭毛藻類の真核生物内に
1981，R
i
z
z
oc
ta
l
.，1
9
8
4
)
。しかし、その性状やアミノ酸配列、 DNAとの結合パターンなど
おける進化系統関係が示された o M
a
r
o
t
e
a
u
xe
ta
l
.(
19
8
5
) はP
.m
i
c
a
n
sとCr
y
p
t
h
e
c
o
d
i
n
iUD1
から渦鞭宅藻類の DNA
パッキングはヒストンによるヌクレオソーム構造、さらにより高次
c
o
J
m
ii
の5
.
8
S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列から渦鞭毛藻類が真核生物の中でも極
の構造であるヒストン H1によるクロマチン構造の形成とは全く異なるものであることが
めて初期の段階に分岐したことを示す分子系統樹を符・た。しかし、 18S rRNAの塩基配列
示唆された。
から作成された分子系統樹からはむしろ渦鞭毛謀績が兵核生物の中でも比較的最近分岐し
f
これら渦鞭毛深頬の核僻造と核分裂様式、染色体機造の特殊性は渦鞭毛藻類のたどって
た生物群で、しかもアピコンブレクサや繊毛虫矧と類縁関係を持つことが指摘された
きた進化の道筋を考察する上で興味深い。原核生物は、其核生物へと至 る進化の過程にお
(
G
a
j
a
d
h
a
re
ta
l
.，1991，MacNallye
ta
l
.，1994，L
c
i
p
ee
ta
l
.，1994，McFaddene
ta
l
.，1
9
9
4
)。
いて細胞内区画としての核構造を獲得し、その核の娘細胞への分配システム である核分裂
C
a
v
a
l
i
e
r
'
S
m
i
t
h (1993) は生物8界説を提明した'1 1 で、 i~'b鞭毛深類とアピコンプレクサ、繊
と、それに付随する染色体の分配機構に働く紡錘体と動原体微小管を構築した o また、長
宅虫類をこれらに共通に存在するアルベオールと呼ばれる小胞に基づきアルベオラータ群
大になった染色体 DNAを効率よく核内にパッキングするために、ヒストンタンパ ク質とそ
.c
o
h
n
i
iにおいてはその細胞周期が極めて特殊であ
としている。また、渦鞭毛藻類、特に C
れに伴うヌクレオソーム構造を基本単位とする染色体榊造を構築した。一方渦鞭毛藻類
B
h
a
u
de
t
a
J
.，1
9
9
1
)
、細胞周期の制御に真核生物にお
ることから研究が進められてきたが (
は
、
J
l
校生物と f
u
J様明確な核構造を持ちながらその分裂の過程では染色体DNAが核膜に付
いて M期促進因子として機能する CDC2とサイクリン Bが関うしている可能性が指摘され、
着して娘般に分配され、その様子は原核生物の細胞分裂に纏めて酷似している上に、より
なおかつ他の真技生物との互換性が示された (
R
o
d
o
r
i
g
u
e
ze
ta
l
.，1993.Bhaude
ta
l
.，1994，
原始的とされる磁では紡錘体の形成が認められず、動原体微小管は核外に存在して染色体
B
a
r
b
i
e
re
ta
l
.，1995，VanDolahe
ta
l
.，1
9
9
5
)
。さらに兵核生物において染色体の高次構造
とは結合せず分裂方向を抱示しているのみであることなど、一般的な真校生物と比べて未
の形成に機能している核マトリックス構造が渦鞭宅保郊においても確認され、また他の兵
発注な筏分裂の機械が見て取れる。また、染色体におけるヒストン、ヌ クレオソーム構造
篠生物と同線マトリックス内にラミン様タンパク質とトポイソメラーゼ Eの存在が確認さ
6 nmとバクテリアと類似していること (
H
a
m
k
a
l
oa
n
d
の欠如、クロマチン繊維の直径が3・
M
i
n
g
u
e
ze
ta
l
.，1
9
9
4
)
。
れた (
2
3
これら rRNAの塩基配列、 CDC2やサイクリン B、核マトリックス構造の解析から示され
ついて検討すると共に、渦鞭毛藻類の進化系統関係について分子進化学の見地から解析す
やL
o
e
b
l
ic
hが提唱した、渦
た渦鞭毛藻類の性状は明らかに真核生物のものであり、 Dodge
ることを目的として、染色体構造への関与が示唆されている塩基性核タンパク質 HCc
鞭毛藻類が原核生物から真核生物への進化の過程の初期に分岐したとする仮説は支持しな
也i
s
t
o
n
e
'
l
i
k
ep
r
o
t
e
i
no
f♀r
y
p
t
h
e
c
o
d
i
n
i
u
D
1三
o
h
n
i
i
) をコードする遺伝子h
c
c
1、生物群の分子系
i
n
n
e
b
u
s
c
hc
ta
1
.(
1
9
8
1
)は渦鞭毛藻類の染色体構造の特殊性に関して、渦鞭毛藻類は
い
。 H
統関係を検討するマーカーとして用いられている葉緑体担フェレドキシンをコードする遺
本来典型的な真核生物タイフ。の染色体構造を持っていたが、進化の過程でヒス トンを失い
伝子 !
e
d
について渦鞭毛藻類からのクローニングを試み、その塩基配列を決定、解析する
独自の染色体構造をとるに至ったとしている。但し渦鞭毛藻類の複雑な染色体高次構造を
ことにより遺伝子の発現を制御するプロモーターやシス因子、イントロンといった遺伝子
ヒストンの欠如のみで説明するのは困難であると思われる。
構造について解析した。
染色体の高次構造と遺伝子の転写は互いに密接な連係を保っていることが知られてい
る。一般的な真核生物においてはヌクレオソーム構造は遺伝子の転写に阻害的に働くが、
転写因子のプロモーター領域への結合がトリガーとなってプロモーター領域におけるヌク
レオソーム構造の破壊とそれに伴う他の基本転写因子群と転写装置のプロモーター領域へ
W
o
J
f
f
e
，1
994， WaJ
lr
a
t
he
ta
1
.， 1
9
9
4
)
。また、染色体DNAはSAR
の結合が開始される (
.
r
~caffold 主.ttachment e
g
i
o
n
)を介して核内の骨格構造である核マトリックスと結合すること
によりループ構造を形成し、機能的ドメインとして働く(飯
哲夫 1996)。このループ構
I
造は遺伝子のドメイン単位での発現制御に必須であることが明らかにされている。染色体
レベルにおいても、染色体上の転写活性の高い領域においてはコアヒストンのアセチル化
によりクロマチンの凝縮度が低下し (
W
o
l
f
f
e
，1
9
9
5
)、いわゆる活性クロマチンを形成する
ことが知られている。場合によってはこういった構造の変化、もしくは染色体構造を司る
ヌクレオソーム構造や核マトリックス中の因子が積極的に遺伝子の発現を制御している可
能性があることも示唆される。しかしながら渦鞭毛藻類においてはヒストンやヌクレオ
p
e
c
t
o
re
ta
1
.(
1
9
8
1
)の報告したクロモ不マ構造といった染色体構造の
ソーム構造の欠如、 S
特殊性からこのような転写制御システムと染色体構造との相互作用は適用できな い。即
ち、渦鞭毛藻類においては、その核、染色体構造のみならず転写制御システムについても
一般的な真核生物と異なっている可能性が示唆される。渦鞭毛藻類の転写制御に機能する
.p
o
J
y
e
d
r
aではルシフェリン結合タンパク質 LBP
因子についての報告は皆無に等しいが、 G
をコードする遺伝子のプロモーター領域の塩基配列が報告されている (
L
e
ee
ta
l
.，1
9
9
3
)
。
この配列を見る限り、真核生物にユニバーサルなプロモーターコンセンサス配列が認めら
れず、渦鞭毛藻類の転写システムの特殊性を支持する結果が得-られている。
そこで本研究では、渦鞭毛藻類の核構造、染色体構造の特殊性と遺伝子構造との関連に
4
5
第 2章
Crypthecodiniumc
o
h
n
i
i
からのヒストン機塩基性核タンパク 質 HCcを コード す
る遺伝子のク口一ニングとその遺伝子情造解析
渦鞭毛藻類は、第 1章で述べたように、体細胞分裂に伴う核分裂の様式や染色体構造が
他の真核生物と比べて極めて特殊であることが知られている。なかでもヒストンタンパク
質の欠失とそれに伴うヌクレオソーム構造の欠如は特徴的である。
真核生物は進化に伴い長大化した染色体DNAを核に納めるた め、核の主要構造タンパク
質であるヒストンにより DNAをパッキングしている。一般に真核生物のヒストンは H2A、
H2B、H3、H4それぞれ2分子ずつでヒストン八量-体を形成し、ヒストンの塩基性を利用し
てDNAと結合し、クロマチン構造の基本単位であるヌクレオソームを形作る。またヒスト
ンH1がヌクレオソームの凝集を行い、いわゆる 30nmクロマチン繊維(ソレノイド)を形
成する。クロマチン繊維は核マトリックスに SARを介して結合し、ループ構造を形成する
が、細胞周期の M期前期に核マトリックスが染色体軸 (
c
h
r
o
m
o
s
o
m
a
ls
c
a
f
f
o
l
d
) を形成して
凝縮し、染色体を形作る。ヒストン、特にヒストン入量体を形成する H2A、H2B、 H3、
H4はその 機能的重要性から真核生物内においてアミノ酸配列が極めて高度に保存されて
いる。
一方、渦鞭毛藻類においても染色体構造の特殊性から DNAのパッキング機構に興味が持
たれたこともあり、そのヒストンタンパク質とヌクレオソーム構造について研究が重ねら
odge(
1
9
6
4
)はファストグリーンを用いた染色法により渦鞭毛藻類がヒス
れた。その中で D
トンタンパク質を欠いている可能性を指摘した o またクロマチンの電子顕微鏡による観察
から、渦鞭毛藻類にヌクレオソーム構造に典型的なビーズ構造が認められないこと
(
H
am
k
a
l
oa
n
dR
a
t
t
n
e
r
，1
977，B
o
d
a
n
s
k
ye
ta
1
.，1979，R
i
z
z
oa
n
dB
u
r
g
h
a
r
d
t
，1
9
8
2
)、クロマチ
n
e
1
s
o
n
i
、G
y
m
n
o
d
i
n
i
uDlb
r
e
v
e
、P
e
r
i
d
i
n
i
u
mt
r
o
c
h
o
i
d
e
u
m(
R
i
z
z
o，1
9
8
1
)、P
.m
i
c
a
n
s(
H
c
r
z
o
ga
n
d
S
o
y
e
r，1
9
8
1
) において見出された。中でもC. c
o
h
n
i
iの埴基性核タンパク質 HCc也i
s
t
o
nl
i
k
e
p
r
o
t
e
i
no
f三r
y
p
t
h
e
c
o
d
i
n
i
u
mf
o
h
n
i
j
，R
i
z
z
oa
n
dM
o
r
r
i
s，1
9
8
4
)に関しては詳細に調べられてい
4KDaで、分子閥、もしくは分子内でこ量体を形成する α、 3、 yの
るo HCcは分子量約 1
3
種の v
a
r
i
a
n
t
から成り (
V
e
r
n
e
te
ta
1
.，1
9
9
0
)、各 v
a
r
i
a
n
tは異なる遺伝子に由来することが示
R
i
z
z
oP
J，1
9
9
1
)
0 HCcはその塩基性という性質から、渦鞭毛藻類においてヒス
されている (
トンにかわり DNAのパッキングに関与しているとされた。しかし、この温基性核タンパク
質と DNAの核内におけるモル比が真核生物においては1.0以上であるのに対して C
. c
o
h
n
i
i
は0
.
0
3と非常に少ないこと (
R
i
z
z
oa
n
dN
o
o
d
e
n， 1
9
7
4
)
、 HCcの二本鎖 DNAとの親和性がヒ
V
e
r
n
e
te
ta
1
.，1
9
9
0
)、さらに HCcが被写活性の高い領域とされて
ストンに比べて低いこと (
いる染色体表面の n
u
c
l
e
o
f
i
l
a
m
e
n
t
領域と核小体の n
u
c
l
e
o
l
a
ror
g
a
n
i
z
e
rr
e
g
i
o
n(
N
O
R
) にのみ局
G
e
r
a
u
de
ta
1
.，1
9
9
1
)から 、HCcの機能はDNAのパ ッキングというよりは
在していること (
むしろ DNAの転写活性の制御因子ではないかとも考えられる。
S
a
l
a
R
o
v
i
r
ae
ta
1
.(
1
9
9
1
)はC
.c
o
h
n
i
iのcDNA発現ライプラリーから抗HCcホ・リクローナ
l
レ抗体を用いて 2種類の HCc遺伝子をクローン化したプラスミド pHClとpHC2を得た o
各々のコードするポリペプチド HCcl、HCc2のアミノ酸配列から、 HCc
が DNA
結合タンパ
ク質であることは示唆されたが、ヒストンや他の既知の DNA結合タンパク質との相向性を
示さず、その機能は明確にはされていない。また、 cDNAからの情報であるため、その遺
伝子構造に関しては言及されていない。
本章では、渦鞭毛藻類における遺伝子構造の特殊性、転写制御機械の特殊性と染色体構
造との関連について明らかにすることを目的に、 C
. c
o
h
n
i
iのゲノム DNAより HCc1をコー
c
c
1をクローニングし、その遺伝子構造について解析した o
ドする遺伝子 h
i
c
r
o
c
o
c
c
a
ln
u
c
l
e
a
s
e
処理により認められるヒストンにより保護される 200b
pのDNA断
ンの m
片が渦鞭毛藻類では認められないこと (
B
o
d
a
n
s
k
ye
ta
l
.，1979，H
e
r
z
o
ga
n
dS
o
y
e
r
，1
9
8
1
)な
2
.
1 方法
どから、渦鞭毛藻類がヌクレオソーム構造を持たないことが明らかとなった o しかしなが
ら渦鞭毛藻類は明らかに染色体構造を有する。そこでその基本単位としてのヒストン様の
塩基性タンパ ク質の存在 を仮定し、塩基性核タンパク質の S
D
S
-アクリルアミドゲル電気泳
Cr
ypt
hecod
i
ni
umcohni
i
の培養 と全 DNAの抽出
C
.c
o
h
n
i
ie30021株 (
A
m
e
r
i
c
a
nTypeC
u
l
t
u
r
eC
o
l
le
c
t
i
on
)を栄養強化海水培地 (
0.
2% y
e
a
s
t
0
動による検出が試みられた。その結果、何れのヒストンとも泳動度の異なる分子量
10，
000
程度の塩基性核 タンパク質が C
.c
o
h
n
ii(
R
i
z
z
oa
n
d Nooden
，1
9
7
4
)
、 Gy
mn
o
d
i
n
i
um
6
e
x
t
r
a
c
t
、2
.
0% g
lu
c
o
s
ei
ns
e
a
w
a
t
e
r
) に接種した後 25C、暗条件にて 5日間培養した。この
培養液(細胞密度約 1
0
1
0c
el
l
s
/
m
l、対数増殖期後期 )を 6，
000 gにて 10
分間違心すること
7
により集藻した。得られた藻体ベレットを液体窒素中で乳鉢により破砕し、 NETパツ
一一一一一一一一- rably-Nucleotide~cqu川CS
01
"p
r
i
m
e
r
sf
o
rHC
c
Ig
e
n
ea
町 l
i
f
i
.
a
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p
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m
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rs
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q
u
e
n
c
e
s
p
n
m
e
r
s
ファー (
1
5
0mMNaCl、 100mMEDTA、 10mMT
r
i
s
-HCl、pH8
.
0
)に懸濁後、終濃度で
/ml
、]
.
0 %となるようプロテナーゼK (
M
c
r
k
)
、 ドデシル硫酸ナトリウム
それぞれ1.0 mg
(
S
D
S
) を加え、 65'Cで 1時間 インキュペートし、細胞を可溶化した。この反応液を 15，
000
gにて 10
分間遠心して細胞残溢を除き、得られた上清を TEパッファー飽和フェノール、ク
ロロホルム :イソア ミルアルコ ール
(
24
:
1) にて抽出することにより除タンパク質操作を
5
'・
I
IC
C
I・A
C
c
c
r
G
C
八GATGGCCCCCAAG ATGAAGG
Cl
」一一」
P
S
I
I
八 八G
G
C
C
A
T
G
A
CG八八G
C
C
G
C
A
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G
C
T
GCAGAAGGGC
s
p
h
l
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Jp
s
s
l
C
C
G
A
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C
G
TC
G
A
C
G
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C1寸 GG
C
A
G
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GG
C
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_回一ーム白ーー
E
(
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I S
剖I
C
C
G
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G
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G
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G
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G
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T
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G
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G
G
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G
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G
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GC
八G
A
G
C
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C八T
C
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T
G
G
G
G
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」ーーピー
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I
IC
C
I
B
I
I
C
C
I
C
H
C
C
I
D
行った後、常法に従いエタノール沈殿に供した (
S
a
m
b
r
o
o
ke
ta
l
.，1989)
。沈殿商分を逮心
により回収した後TEパッファーに溶解し、終濃度で 100
μg/mlとなるよう RNase
A
(
S
i
g
m
aC
h
e
m
i
c
a
l
) を加え、 37'Cで 1時間インキュベートすることにより RNAを除いた o こ
H
C
C
IAR
I
IC
C
ID
R
の反応液を再びフェノール、クロロホルム:イソアミルアルコールにて抽出して RNaseを除
き、エタノール沈殿に供した後、得られた沈殿画分を TEバッファーに溶解し、全DNAと
して以降の実験に
p
o
s
i
t
i
o
n
so
nc
D
N
A.
3
'
6
4
8
4
1
1
5
2
1
5
3
5
8
3
3
8
∞
3
8
0
4 -
8
4
6
4
4
∞
380
i
n
k
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rS
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l l
h
e'
5l
c
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io
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T
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p
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c
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h
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D"IAo
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C
c
lg
e
n
c
.
白山
同
mいた。
また、必要に応じ、除糖操作として界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムプロミド
(CTAB) を用いた DNAの精製を行った (
R
o
g
e
r
sa
n
dB
e
n
d
i
c
h， 1988)
。全DNA溶液に 2X
CTABノてッファー (
2
.
0 %c
e
t
y
l
t
r
i
m
e
t
h
y
l
a
m
m
o
n
ium b
r
o
m
i
d
c
、 100mMT
r
i
s
.
H
C
l、pH8
.
0、
20mMEDTA、 1.
t
1M NaCl、1.0% p
o
l
y
v
i
n
y
l
p
y
r
r
o
l
i
d
o
n
e
)を等比加えて 65'Cにて 30
分間イ
レム:イソアミルアルコール (
2
4
:1
) にて抽出した o 遠心に
ンキュベートした後、クロロホ J
より有機溶媒層を分離して水層を回収した。 1/10
容量の 10
%
CTAB溶液
(
1
0
%
c
c
t
y
l
t
r
i
m
e
t
h
ylammonium b
r
o
m
i
d
e、0
.
7 M N
a
C
l
) を加えて混介した後、 CTAB沈殿バッ
ファー(1.0 % c
c
t
y
l
t
r
i
m
e
t
h
y
l
ammonium b
r
o
m
i
d
e、 50 mM T
r
i
s
'HCl、pH 8
.
0、 10 mM
EDTA)
を加え、 1時間インキュベートした。遠心により DNA沈殿凶分を回収して 1
M
NaCITEバッファー(10 mMT
r
i
s
-HCl、pH8
.
0、 1mMEDTA、1.0M 1、~aCl) に溶解した
後、常法に従いエタノール沈殿を行った o 1~} られた沈殿画分を TE バッファーに溶解し、
プラ スミドベクタ ーへの クロー ニングを日的に制限酵素認識部位を合むリンカー配列を付-
1
1
0した。
PCRは2
.
0 mM MgC12
、 200μM dNTP、1.0 μ Mプライマー、 2
5
u
n
i
t
s
/m
l Taq
DNAポリメラーゼ(クラボウ)、 50ng
/m
lC
.c
o
h
n
i
i
全 DNAの反応条件で、また温度条件
C
、 2分間のブレヒートを行った後、 9
4'Cで 1
分
、 50'
C
で 2分
、 72'
C
で 3分のサイクル
は94'
で 25回行った o
また、 i
n
v
e
r
s
ePCRに用いる鋳型 DNAは
、 C
.c
o
h
n
i
iの全DNAをH
i
n
dI
I
Iにて消化した後、
DNAライゲーションキット(宝酒造)を用い、 DNA終濃度 10 n
g
//
1
.1
の条件で自己環状化
反応 を行うことにより調製した o この鋳型に対し cDNAの温基配列の情報をもとにして設
定したプライマー HCC1-AR、 HCC1DR(
T
a
b
l
e1
)を用い、 上記 と同様の条件で PCRを行 っ
た
。
以降の実験に用いた。
PCRの増幅産物は PCR反応液を 2
.
0%アガロースゲル屯気泳動に供することにより確認
した。
PCRによる HCcl遺伝子の増幅
h
c
c
lのタンパク質コード領域の PCR(
Q
o
l
y
m
e
r
a
s
ec
_
h
a
i
n.
r
c
a
c
t
i
o
n
)による増幅 を目的に、プ
a
l
a
R
o
v
i
r
ac
ta
l
. (1991) により報告さ
ライマー HCC1.A、 HCCl.B、HCC1-C、 HCC1-DをS
れた h
c
c
1のcDNAt
塩基配列の↑育報をもとに 1没定した (
T
a
b
l
e1
)
。各プライマーの 5
'末端には
8
PCR
増幅産物のクローニングと塩基配列の決定
PCR増幅産物はベクタープラスミド pUC18もしくは pT7Blu
c(
R
)(
N
o
v
a
g
e
n，USA)、pCR1
1
9
を用いてライゲーションを行い、
B
A
pUC18をそれぞれ適当な制限醇素で消化した後に DNAライゲーションキット (宝酒造)
a
迄さ'ヒと-
(
1n
v
it
r
o
g
c
n
. USA) を用いてクローン化した。 pUC18へクローン化する際には PCR産物、
C
1
f
I
;
i
去に従い Escher
i
c
h
i
ac
o
1
iJM1
09コンピーテントセルに
形質転換し、形質転換体のスクリーニング、 アルカリ SDS
法による形質転換体からのプラ
S
a
mb
r
o
o
kc
ta
1
.，1
989)0 pT7Blu
e(
R
)
、pCR I
スミドの回収を行った (
I
へのクローン化は付
1
以)()-
属のマニュアルに従い PCR産物とのライゲーションを行った後 E
.c
o
J
i JM109、INVαF'
各
質泊0.
.
コンビーテントセルに形質転換し、 同様にプラスミドを回収した。
PCRm幅産物をクローン化したプラスミ ドはチェーンターミネーター法に基づく
-tlC乱
民)
(
)
T
O
c
s
ー唖恥
∞ー
8
∞
ー
267-
旬
DyeDeoxyTMT
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c
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dB
i
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y
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m
s
.I
n
c
.
.USA)を用いてサイ
一⋮制的山一郷一闘 制
4870-
4
旬
ーー恥CMV
切
クルシーケンシング反応に供し、全自動 DNAシーケンサー 373A(
A
p
p
l
i
e
dB
i
o
s
y
s
t
c
m
s
，I
n
c
.
.
USA)にて解析することによりその海基配列を決定した o
、
J
A
s
i
s (目立エ ンジニアリング)を用い
得られた塩基配列は DNA塩基配列解析ソフト Dr
Fig.1.A
g
a
r
o
s
eg
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C
C
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lDNAo
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hp
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C
CトARa
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dI
I
C
C
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m
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k
c
rs
ia
l
s
os
h
o
w
n
.
制
て解析し、塩基配列のアラインメントを行った。
2
.
2 結果
h
c
c
1
A
r
e
g
1
o
J
;
!
一一一一一一一一一一一一一⋮⋮⋮⋮一一一
一
一一一一一一一一一日
一
一
一
一
H
C
c
l遺伝子の PCRによる増幅
~pacer
B
C
.c
o
h
n
i
iの全DNAを鋳型とし、 hc
c
1をターゲットとしたプライマーのうち外側に設定し
たプライマーセット HCC1A、HCCl.
Dを用いて PCRを行った結果、 330bpと1030bp
の増
F
i
g
.lA)o330bpの増幅産物は PCRにおけるアニーリング温度を 60'
C
に
幅産物が得られた (
上 げると地幅されないこと、 cDNAから予怨される断片長より煩いことから、 以降の実験
においては考慮しないこととした o ~ )
JI030bpの増幅産物、 hccLはcDNA
猛基配列から予
31
t3b
p
) より約 3倍ほど長い断片長を持つことから、非特異的な附幅に由
想、される断片長 (
ATG
C
T3 ~
ES4
，
5
.
7
.
8
s
l
.s
5
a
l，a
2
.泊 .
a
4i
八TG
c
c
Lが確かに hcclに由来することを確認するため、 h
c
c
Lを鋳
来する可能性も与えられた oh
B、 HCCI-Cをm いて n
e
s
t
c
d PCRを行っ
型により内側に設定したブライマーセッ トHCCl.
た。その結果、 770bp
の単一の増幅産物 (
h
c
c
S
)が得られ (
F
i
g
.]B
)
、h
c
c
L、h
c
c
S
が共に hccl
に由来することが確認された。 しかしながら h
c
c
SもcDNAから予怨される断片長 (250 b
p
)
より長く、 hcclに介在配列が存在することが子忽された o
1
0
F
ig
.2
.S
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uc
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dHCclg
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汀 祖g
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dHCclg
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.Bolda
n
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i
g
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d
i
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e出eHC
c
1c
o
d
i
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gr
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g
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n
s
A
.Tandemlya
釦 d出es
p
a
c
e
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g
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iv
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.Genes
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f出eHCc1g
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na
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o
l
i
da
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dopenb
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x
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.Arrowsi
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eshownぉ s
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s， 組 dr
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nenzymesPstIandSasr
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i
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e
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l
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.C
.
R
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g
i
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いて hccL全長のダイレクトクローニングを行い、その結果クローン T3、4、 5、7、8を得
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来の各プラスミドクローンとクローン T3、サプクローン ES4、5、7、8の
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1のタンパク質コード領域上 1ケ所に cDNAには認められ
ない配列の挿入が見出され、イントロン様の介在配列の存在が示された (Figs. 2B、 3)。
エクソン領域ではクローン問、また各クローンと cDNA塩基配列との間では配列に述いは
認められなかったが、イントロン領域においてはクローン間で塩恭の柿人、欠失が認めら
れ (Fig. 4)、特にイントロン 1と2で配列の差異が顕著であった (Figs. 4A、 48)0 イントロ
ン3、 4においてもクローン間での塩基置換が認められた (Figs.4C、4D)。このようなイン
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また、各イントロンのエクソンとの境界領域には其核生物において共通して認められる
5
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GT-AGコンセンサス配列、またイントロンのスプライシングに機能するスプライセオソー
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の相向性は認められないものの、各イントロンのエクソンとの境界付近には di
が見出された (Table2)。
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HCc1遺伝子周辺領織の塩基配列
hcc
1の非翻訳、非転写領域も合めた周辺領域の塩必配列を決定するためにプライマー
HCC1-AR、 HCC1-DRを釧訳領域両末端に設定し (Table1
)、 invcrsePCRを行った。その結
IN V(Fig. lC) を先と同様にプラスミドベクターに組み込
果得られた 450bpの増幅産物 hcc
C
)、各々についてその右足基配列を決定した (Fig.
みプラスミドクローン h1、 h3を得 (Fig.2
14
1
5
5
)
。クローン h1、h3にはその両末端に cDNAで報告 されている非翻ぷ領域の配列が認めら
cDNA 3・
hl
h3
50
麗~
1
1
1
60
仁D
NA 3・
h1
h3
51
5
1
51
cDNA 3・
h1
h3
101
101
101
110
ーー
ーーーー
70
DNA 3・
h1
h3
201
201
201
h1
h3
260
2515 ATGE :
251 f
.
MCAT
cDNA 5・
h1
h3
!
I
I
I
I
I
園噛
.
‘-
210
170
輔翻
310
200
200
200
230
E
280
240
250
250
250
290
300
圏 圏-一一一一一 一一一一一
320
C CTTTCATACA CTAAGGGGCC
330
370
380
340
390
iii 瞥臨1 臨~~19I翻欄l 園調:
‘
.
，
410
i
E副
盤翻臨調
401
401
櫨翻
300
300
350
400
350
350
。
40
400
400
450
450
450
470
500
500
500
4
1
45
51
451
/
J
c
c
l tandem r
e
p
e
a
t
のスペーサー領域であることが示された (
F
i
g
. 2
)
。また h
c
c
1が複数コ
ピー存在することに由来すると忠われる塩基配列の差異がイントロンと同様周辺領域にお
いても認められた (
F
i
g
.5
)
。また h1とh3には J
'
i
核生物のプロモーター領域に共通して認め
られるプロモーターコンセンサスモチーフである TATAボックス、 CAATボックス、また
られなかった o
2.
3 考察
本章では、嵐基性核タンパク質 HCc1をコードする遺伝チ h
c
c
1の遺伝子構造を明らかに
c
c
lの増幅とその塩基配列の決定
するため、 PCR、inversePCRを用いて周辺領戚も含めた h
を行った。得られた塩基配列を既に報告のある h
c
c
1のcDNA塩基配列 (Sala'Rovira e
ta
l
.，
1991) と比較する ことにより、
h
c
c
1にcDNAには認められないイントロン様の介在配列が
存在することが示された o また介在配列においてその塩基配列がプラスミドクローン問で
c
lがゲノム上に複数コピー存在することが明らかとなった。更に
異なることから、 hc
l
n
v
er
se PCRにより得られた増幅産物の塩基配列から、
440
420
の原理上存在するはずの H
i
n
d
I
I
Iの認識部位がh1、h3共に見出されないことか ら、hcc
INV
mRNAの3・ぷ端にポリ (A)を付加するシグナル配列であるポリ (A)+付加シグナ J
レは共に認め
:;; 圏~~~~~~ ~~~~~1~~H ~~~~~~圏 邸調~9~ iII掴~I
360
150
150
150
180
220
圏
100
100
100
150
ー
闇盤
ー
・
T
A
460
cDNA 5
'
h1
h3
140
圏
c
c
1の周辺領域に由来することが確認された 。 しかしながらInvcrsc PCR
れることから、 h
はl
l
c
c
lの各コピーの少なくともその一部がタン デ ムにコ ー ドされているために琳幅された
100
醐翻腫翻
151
151
151
cDNA 5・
h1
h3
130
・
-b ・・
F ・
・
p ・
・
F ・. - -圃圃'
cDNA 3'
h1
h3
hl
h3
90
醇
図
画
120
160
仁
80
50
50
50
h
c
c
lの各コピーは少なくともその
一部がタンデムに並んでコードされていること、またそのスペーサー領域に真核生物に普
遍的 に認め られるプロモーターコンセンサス配列が認められないことが明らかとなった o
これらの結果から以下のことが考察できる。
(
1
)
HCcl遺伝子は mul
t
i
genef
ami
l
yを形成する
PCR、i
n
v
e
r
s
e PCRにより得た嶋幅産物の塩基配列から、
h
c
c
1はゲノム DNA上に複数コ
c
c
1の少なくとも 一部は t
andem r
e
p
e
atを形成してい
ピー存在し、また複数コピー存在する h
Fig.S.N
u
c
l
e
o
t
i
d
esequencecomparisonofnon-codingr
e
g
i
onsofh
c
c
lwitht
woc
l
o
ne
sofi
nver
s
e
PCR
a
m
p
l
i
f
i
e
dp
r
o
d
u
c
t
shcclNV.
P
r
i
merp
o
s
i
t
i
o
n
sa
r
eu
n
d
e
r
l
i
n
e
dandn
o
n
t
r
a
n
s
c
r
i
b
e
dr
e
g
i
o
ni
si
n
d
i
c
a
t
e
dbydoub
l
e
h
e
a
d
e
daηows
.
ることが示された (
F
i
g
. 2
)
。このような遺伝子構造の場合、遺伝子の転写、翻訳は以下の
16
17
いずれかのパターンで行われる。
(
1
)
各々のコピーがそれぞれプロモーターを有し、個々に転写、翻訳される。
イントロン 5・末端の (C/A)AG↓GT(A/G)AGT、U2 snRNPが認識する分岐部位の TNCTRAC
(
2)
ポリシストロニックに転写された後、各々の翻訳開始点から個々に翻訳される。
の各配列は厳密に保存されている (
T
a
b
l
e2
)
。また、これらのコンセンサス配列は snRNPの
(
3
)
最初のコピーから最後のコピーまで一気に転写、翻訳されてポリタンパク質前駆
構成成分である snRNA立
(mlluclearE
立b)上の配列と相補性があり、 snRNAがコンセン
体を合成した後、プロセシングを受けて成熟タンパク質となる。
サス配列にアニーリングすることにより各snRNPはその領域を認識する。
渦鞭毛藻類においてタンパク質をコードする遺伝子の情報はまだ少ないが、 G
.polyedraの
C
.c
o
h
n
i
iにおいても U1、U2、U5、U6 snRNAの部分配列が報告されており、ラットや
ルシフエラーゼ結合タンパク質 LBP遺伝子 (
L
c
ce
ta
l
.，1993)、Amphidiniumc
a
r
t
e
r
a
e
のクロ
ヒトと極めて高い相同性を示すことが確認されている (
R
e
d
d
ye
ta
l
.， 1983， L
i
ue
ta
1
.，
ロフィル a/c
結合タンパク質遺伝子 cab(
H
i
l
l
e
re
ta
l
.，1995)、Symb
i
o
d
i
n
ium s
p
p
.
のリプロー
1
9
8
4
)
。しかしながら C
. c
o
h
n
i
iのhc
c
1に見出されたイントロンにはsnRNAとの相補性を示
スニ リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ遺伝子 rbcA(Rowane
ta
l
.，1996)において報
すコンセンサス配列は全く認められない。その一方で、 h
c
c
lのイントロンとエクソンとの
告されている。これらは何れもコード領域がゲノム DNA上に t
a
n
d
e
m
境界領域には共通配列として AGGCモチーフが、また、この境界領域付近には 7
.
9
r
e
p
e
a
tを形成してい
b
pの
る
。 cabとrbcAは何れもポリタンパク質として翻訳された後プロセシングを受けて成熟タ
d
ir
e
c
tr
e
p
e
at
配列が認められる (
T
a
b
l
e2
)
0 snRNP
がh
c
c
lイントロンのスブライシングにお
ンパク質となるが、 LBPは個々の遺伝子が独立して転写、翻訳されていることが確認され
いてスプライセオソームとして機能するのか、また AGGCモチーフや d
ir
e
c
tr
e
p
e
a
t
がh
c
c
1イ
ている o hc
c
1の場合は各コピーに翻訳終始コドンが存在し、また cDNAライプラリーから
ントロンのスプライシングにどのように関与するのかを配列から特定するのは困難であ
スクリーニングにより得たクローンは何れも 1コピーのみを持つことから、 LBP遺伝子同
る。しかし、同じく渦鞭毛藻類である Symbiodiniums
p
p
.のrbcAに見出されたイントロンに
様各コピーがそれぞれ独立して転写、翻訳されていると思われる。
おいても snRNP認識部位の配列が保存されていない (
Rowan e
ta
1
.，1996) ことは渦鞭毛藻
類におけるイントロンスプライシング機構の特殊性を示唆する興味深い事例と考えられ
(
2
)
H
C
c
l遺伝子に存在するイントロンの特殊性
るo また、ユーグレナ植物の一種 Euglenag
r
a
c
i
l
i
sはその染色体が細胞周期を通じて凝集し
真核生物におけるスプライセオソームイントロンの構造と、そのスプラ イシング機構に
ている、体細胞分裂時に核膜が消失しないなど、核構造において渦鞭毛藻類との共通性が
ついては詳細に検討され、ほぽ明らかにされている (
Gr
e
e
n
，1
9
9
1
)
。スプライセオソーム
存在することが知られている。更にこの程においては、イントロン構造においてもリプ
イントロンは 5
'末端に GT、3・末端に AGのコンセンサス配列がほぼ例外なく認められるこ
ロース二リン酸カルボキシラーゼ小サプユニット遺伝子 rbcS
、クロロフィル a/b
結合タン
とから、 GTAGルールと呼ばれている。スプライシングにはスプライセオソームと呼ばれ
パク質遺伝子 cabに存在するイントロンにおいてスプライセオソームイントロンのコンセ
る
、 s
nRNP~mall !
!
_
u
c
l
e
a
rr
i
_
b
o
旦u
c
le
o
.
Q
.
r
ot
c
in
)により構成される RNA.タンパク質複合体が作
ンサス配列が認められない。その上エクソンとの境界領域に互いにアニールが可能な 15
用する。スプライシングはスプライセオソームの構成成分の一つである U1 snRNPのイン
b
p
前後の配列が見出される (
T
a
b
l
e2，T
e
s
s
i
e
re
ta
l
.，1995，M
u
c
h
h
a
la
n
dS
ch
w
a
r
z
b
a
c
h
.1
9
9
2
)
トロン 5
'末端領域の認識により開始される。続いて U2
snRNPが イントロンの分岐部位
など、渦鞭毛藻類との共通性がみられる o E
. g
r
a
c
i
1
i
s
のイントロンはスプライセオソーム
(
b
r
a
n
c
h
p
oi
n
t
) に結合し、これをきっかけに U1、U2、U4/U6/U5 snRNPが複合体を形成す
イントロンとは異なる未知のグループに属するイントロンであると推測されているが
ることによりイントロンの 5
'末端は切断され、それに伴い 5
'末端のグアニンは分岐部位の
(
T
e
s
s
i
e
re
ta
1
.，1995)、渦鞭毛藻類においても、少なくとも独自のスプライシング機構を有
アデニンのリボースの 2
'部位の OH
基に求核反応によりリン酸ジエステル結合を形成し、
する可能性が指摘できる。
いわゆるラリアート構造が形作られる o 最終的にイントロンの 3
'末端が切断され、エクソ
ン同士が連結される。スプライシングにおいては s
nRNPによるイントロン配列の認識が極
(
3
)
H
C
c
l遺伝子のプロモーター領域の特殊性
めて重要であり、そのためイントロン 3・末端の (
Y
)
nNYAG↓Gに加え、 U1snRNPが認識する
真核生物の遺伝子コード領域の上流には、転写因子との相互作用により転写開始に極め
18
1
9
て重要な働きをするプロモーターが存在している o ほとんどの遺伝子には転写開始点より
第 3章
19 bpないし 27 bp
上流に TATAボックスが存在する o TATAボックスには転写因子TFIID
鞭毛藻類の分子系統とその遺伝子構造の解析
渦糠毛藻類の葉緑体型フェレドキシンをコードする遺伝子の泡基配列から見た渦
が結合し、転写開始点の決定に機能する。そのほかに多くの遺伝子において CAATボック
フェレドキシンは原級生物、真核生物を問わず広い生物種に分布する低分子モノマータ
ス
、 GCボックスが存在し、特に GCボックスは TATAボックスの存在しないハウスキーピ
ング遺伝子において TATAボックスに代わり転写開始を司っていることが知られている。
ンパク質であり、様々な電子伝達系において電子の授受に機能し、酸化還元電位が 310か
h
c
c
lはタンデムに並んで multigenefamilyを形成しているが、各遺伝子は独立して転写さ
ら-455mVと比較的低いことが特徴的である (ArnonandBuchanan， 1971)。分子中にはシ
れているため、 h
c
c
lの転写開始を指示するプロモーターは遺伝子間の非転写スペーサー領
ステイン残基をリガンドとする非ヘム鉄と酸に不安定な硫黄より成る鉄-硫黄クラスター
域に存在するはずである o しかしながら h
c
c
1には真核生物のプロモーター、 TATAボック
を持ち、鉄イオンの遜移により
ス
、 CAATボックス、 GCボックスのコンセンサス配列は何れも見出されない。また、
14Fe
・
4
S
]ないしは [3Fc
・
4
S
]のクラスターを有する細前瑚フェレドキシン、 [2Fe
2
S
]のクラス
mRNAの 3・
4
ミ端にポリ (
A
)を付加するシグナルであるポリ (
A
)
+
付加シグナ l
レAATAAAも認め
ターを有する葉緑体型フェレドキシンに分類される 。
ι
H
1[-の俊受を行う。欽-硫黄クラスターの構造により、
polyedraのLBP遺伝子においても同様に TATAボックス、ポリ (
A
)
+
付加シグ
中でも葉緑体型フェレドキシンは純物や藻類の策総体、シアノバクテリアに分布し、光
ナルが認められず (
L
e
ce
ta
l
.，1993)、渦鞭毛藻類の転写制御システム、プロモーターやそ
合成における電子伝述タンパク質として機能する。光エネルギーを受けてクロロフィルよ
れに相互作JlJする転写因子の特殊性を示唆している。このシステムについては渦鞭毛諜類
り放出された電子は光化学系 Eから光化学系 Iへと伝達される際に ATPの合成を行い、最
におけるゲノム DNAからの遺伝子塩基配列情報の蓄積とプロモーター領成を欠失、塩基置
終的に葉緑体型フェレドキシンへと波され、この還元型フェレドキシンはサイクリック光
換した突然変異遺伝子における転写活性、プロモーター領域に特異的に結合する転写因子
K
n
a
f
fand Hirasawa，1991)
リン酸化、 NADP+の先還元、亜硝般還元、グルタミン酸合成 (
の検索といった、より詳細な解析を待たねばならないが、典型的なプロモーターの欠如は
、フェレドキシン ・
チオレドキシンシステム (Del
aTorree
ta
l
.，1979，Larae
ta
l
.，1980)に
逃伝子の転写制御が染色イ材持造と密接に相互作用していることを考えると極めて興味深い
おける電子供与体として機能する。
られない。
葉 緑 体 型 フ ェ レ ド キ シ ン は ア ミ ノ 般 残 基 100前後からなり、その精製も比較的容易で
事象である。
あったことから、シアノバクテリア (Matsuie
ta
l
.，1988)や紅藻類 (
H
a
s
ee
ta
l
.，1978) も含
めて 70種を越える生物種においてそのアミノ酸配列並びに DNA温基配列が報告されてい
る
(佐伯和彦、松原
央
、 1993)
。そのアミノ酸配列は比較的保存性か鳴いため、主に属
レベル以上の分子系統解析に利用され、光合成生物の進化系統関係について議論されてい
る (Uchidaeta
l
.，1988，Alonsoe
ta
l
.，1995，Duttonc
ta
l
.，1980)
。すべての葉緑体JS'
1
フェレ
X
)
4・
Cys-(X)
z
-Cys-(X)n-Cysの構造が保存されており、この 4残基のシステ
ドキシンには Cys-(
インが12Fe-2S)クラスターに配位する。また多くの地物や藻類において複数種のフェレド
D
u
t
t
o
ne
ta
l
.，1980，Takahashi e
ta
l
.，1983)
。特にダイコ
キシンの存在か鴻認されている (
ンのイソフェレドキシンはその機能的役割について詳細に検討されており
(Wada e
ta
l
.，
1989)、光合成組織と非光合成組織における機能分担を行っていることが予想されてい
遺
るo またシアノバクテリアの一種 Anabaenaではヘテロシストで特異的に発現する fdxH
20
2
1
伝子山米のイソフェレドキシンが存在し(Sch
r
a
u
t
e
r
n
c
i
c
ra
n
dB
o
h
r
n
e
，1
985， B
o
h
r
n
ea
n
d
G
u
n
d
e
r
s
o
ne
ta
l
.，1
9
8
7
.G
a
j
a
d
h
a
re
ta
l
.，1
9
9
1
.M
c
N
a
l
l
yl
'
ta
l
.
.1
9
9
4
)
。しかしながら光合成
H
a
s
c
l
k
o
r
n
. 1
9
8
8
)、笠索開定に働くニトロゲナーゼに対する電チ供与体として機能してい
生物の分チ進化の良いマーカーとされているリブロースニリン酸カルポキシラーゼ小サブ
る
。
ユニット遺伝子、伸長因子 EF1をコードする泣伝 fなどについては、渦鞭毛藻類における
'~紋体Wl フェレドキシンによる電子の授受が光合成における電子伝達に密接に関係して
遺伝 fクローニングが困難であることもあり全く検 i
i
;
Iされていない。そのため、渦鞭毛i
薬
Jわざるを符ない。そこで分子進化マー
いることもあり、葉紋体型フェレドキシンは光によりその発現が制御されることが知られ
類における分子進化学的な解析は一面的であると
ている。この発現凋節は特にフィトクローム系による転写制御に由来する (
D
o
b
r
e
se
ta
1
.，
カーの一つである葉緑体型フェレドキシン遺伝子の塩必配列、もしくはアミノ酸配列を渦
1987)。またイソフェレドキシンにおいてはその各々が特定の組織においてのみ発現す
鞭毛謀類において知ることは渦鞭毛藻類の進化系統をより多面的に捉える 一助となり符
る、いわゆる組織特異的発現も認められる (
V
o
r
s
te
ta
l
.，1
9
9
0
)
。このような発現制御に関
る
。
rについては葉緑体型フェレドキシン間での比較、葉緑体型フェレ ドキシン
また、渦鞭毛藻類の染色体構造の特殊性はそれらと街媛な関係にある転写制御系の特殊
と同械先による発現制御を受けるリプロース三リン酸カルポキシラーゼやクロロフィル
性を予怨させる o 渦鞭毛i
菜類ではタンパク質をコードする遺伝 fにおけるプロモーターや
a/b
結合タンバク質をコードする遺伝子の転写制御モチーフとの頬似性から検討されてい
エンハンサーといった転写制御領域に関する情報に関しては G
.p
o
l
y
e
d
r
aのルシフエラーゼ
与するシス凶
。
る(
C
a
s
p
a
ra
n
dQ
u
a
i.
l1993.V
o
r
s
te
ta
l
.
.1993.S
o
m
c
r
s
.1
9
9
0
)
結合タンパク質遺伝子 (
L
e
ee
ta
l
.，1
9
9
3
)において報告されている。また第 2章において、
長核生物の葉緑体型フェレドキシンは葉緑体内に存在するストロマタンパク質である
塩基性絞タンパク質 HCc1遺伝子 h
c
c
1のプロモーター領域について報告した。何れの場合
が、その遺伝チは校ゲノム上にコードされている。そのため核ゲノムにコードされている
も其核生物にユニバーサルなコンセンサス配列は認められず、 j
品鞭毛藻類のプロモーター
他の来総体タンバク質と同様葉緑体への移行シグナルであるトランジット配列がアミノ末
の特殊性が指摘できる。更に、光合成生物においては光による光合成関連のタンパク質、
端に付加されている。高等擁物ではトランジット配列のアミノ酸配列が多数報告され (
d
e
酵点群の発現制御系の存在が強く示唆される。よって、葉緑体型フェレドキシン遺伝子の
B
o
c
ra
n
dW
c
i
s
b
c
c
k
.1
9
9
1
)、その疎水性ブ'ロフイー J
レや予怨されるこ次構造、人為的に突
プロモーター領域の解析は、プロモーター構造の解析のみならず、渦鞭毛藻類の光発現制
然変異を導入したトランジット配列を用いた研究からその機能ドメインが推測されている
御に関与するエンハンサ一、もしくはシス困チ榊逃の、他の兵核生物との比較という意味
(
S
m
c
c
k
c
n
se
ta
/
.，]985，v
o
nH
e
i
j
n
ee
ta
1
.，1989，d
eB
o
c
ra
n
dW
c
i
s
b
e
c
k，]991，P
i
l
o
ne
ta
l
.
.
からも俺めて興味深い。
1
9
9
5
)
。また、
トランジット配列の認識と葉緑体内への輸送に来線体膜タンパク質複合体
-);、業-緑体の膜構造に着目すると、陸上高等地物はこ
i
f
i
:朕構造を有し、葉緑体が光合
が機能していること (
S
o
l
la
n
dA
l
e
f
s
e
n
，1
993，P
c
r
r
ya
n
dK
c
c
g
s
t
r
a， 1994，S
c
h
n
e
l
le
ta
l
.，
成以抜生物の共生に由来するとする、いわゆる共生説の根拠のーっとさ れている。しかし
1
9
9
1
.K
e
s
s
l
e
re
ta
1
.
.1
9
9
4
)、トランジット配列のプロセシングを行うシグナルペプチダー
ながら褐藻類、ラフィド藻類、クリプト藻類、クロララクニオ藻類においては葉緑体膜の
ゼがストロマに存在すること (
R
o
b
i
n
s
o
na
n
dE
l
l
i
s
.1984，S
ua
n
dB
o
s
c
h
e
t
t
i，1
9
9
3
)が明らか
外側に小胞体膜 ~ndoplasrnic .
r
e
t
ic
u
l
u
r
n，ER)に由来する二重膜構造の葉緑体ERが、渦鞭毛
にされている。
議煩やユーグレナ藻類では同じく 一重膜構造を持つ策総体 ERが認められる (
L
e
e
，1
9
8
9
)
。
業紋体型フェレドキシンに認められるこれらの性質は、渦鞭毛藻類の進化系統関係につ
このことは、これらの微細藻類の葉緑体の起源が原核生物ではなく真核光合成生物である
いてぷぬする仁で俺めて有用な指標となり得る。 渦鞭毛 i
業績はその絞構造、染色体構造の
とする、いわゆる多重共生に由来することを示唆している (
G
r
a
y
，1
9
8
9
)
。特にクリプト藻
特殊性から J
l
核生物内での進化系統関係について議論されてきたこともあり、 rRNAもし
類、クロララクニオ藻類においては共生生物に由来するとされる核検構造、ヌクレオモル
くはそれをコードする rRNA遺伝子を用いてその進化系統的な位置が分子進化学的見地か
フが葉緑体膜と小}]包体膜の間隙に認められ
らぷされた (
H
i
n
n
c
b
u
s
c
he
ta
l
.，1
9
8
1
.M
a
r
o
t
e
a
u
xc
ta
l
.
.1985，H
c
r
z
o
ga
n
dM
a
r
o
t
e
a
u
x
，1
986，
G
r
c
e
n
w
o
o
d， 1982)
、その 18S rRNAの塩基配列から来総体が原始紅藻に由来することが示
2
2
2
3
(
G
i
l
l
o
t
t a
n
d G
i
b
b
s
， 1
980， M
o
r
r
a
l
l a
n
d
された (
D
o
u
g
l
a
sc
ta
1
.
.1
9
9
1
.M
a
i
e
rc
ta
1
.
.1
9
9
1
)
。渦鞭毛藻額をはじめ多重共生により葉
(三光純薬)を用い、イナ属のマニュアルに従い DNA
の精製を行った。
緑体を獲得したと考えられる生物種においては、朕構造の特殊性から葉緑体タンパク質の
葉緑体内への輸送において高等植物とは異なるシステムを機能させている可能性が指摘で
きる白特に葉緑体型フェレドキシンのトランジット配列の解析はこのシステムの指標とし
G
on
y
a
u
l
a
xp
o
l
y
e
d
r
aからの全RNAの抽出
SWIIm指先l!に接種し、 20"
C
、 1
4L:10Dの明限条件で、培接した G
.p
o
l
y
e
d
r
aの培長波を培養
開始後 20n (対数増殖後期)に回収し、 5
.
0
0
0
て布用である。
以上のことから、本章では渦鞭毛藻
mの真核生物内における進化系統関係、渦鞭毛藻類
gにて 10分間違心することにより集藻し
たo 藻体ペレットを液体型素中乳鉢にてホモジナイズし、 GTC
溶液
(
4 M
g
u
a
n
i
d
i
u
m
内の系統関係を解析するための分子進化マーカーとしての有効性、プロモーター領域をは
t
h
i
o
i
s
o
c
y
a
n
a
t
e、 25 mM s
o
d
i
u
mc
i
t
r
a
t
e
) に懸濁した。懸渇液を 5
.
7M C
s
C
l溶 液 (
5
.
7M
じめとする遺伝子構造、多量共生に白米する渦鞭毛藻類の葉緑体膜構造とトランジット配
c
c
s
iumc
h
l
o
r
i
d
e、0
.
1M e
t
h
y
l
e
n
e
d
i
a
m
i
n
et
e
t
r
a
a
c
c
t
a
t
e
) に京1
¥
'
1
し
、 1X]0
5gにて 2{
1
U
年間超遠
U的に、渦鞭毛藻類より葉総体型フェレドキシン
心に供した。沈殿回分に阿収された RNAをH
20にて洗浄した後、 1
.0% SDSを合む TEパッ
をコードする逃伝子 f
e
d
Q
のクローニングとその塩基配列の決定を行い、 i
品鞭毛藻類の進化
溶液をフェノール・クロロホルム抽出に供し除タンパク質を行っ
ファーに溶解した。 RNA
系統関係の検討並びにプロモーター領域、
た 後 、 エ タ ノ ー ル 沈 殿 に よ り RNA阿 分 を 回 収 し 、 終 波 j
支1.0μg/p
.
lとなる操 TEバッ
列との相関について明らかにすることを
トランジット配列の解析を行う。
ファーに溶解した。この RNA
溶液に 1
/5容の 10
3
.
1 方法
M塩化リチウム溶液を加えて 1時間氷冷
し、沈殿画分に RNAを回収することにより RNAの精製を行った o RNAはTE
パッファーに
溶解後エタノール沈殿に供し、そのまま .
20"Cで保存した。使用の際には H20に終解し
たo
渦鞭毛藻類の培養
本市において
mいた渦鞭毛謀類は以下に示す 5穏である。
P
c
r
i
d
i
n
i
u
mb
i
p
e
s
PCR、 RT-PCRによる葉緑体型フェレドキシン遺伝子の増 幅
A
1
e
x
a
n
d
r
i
u
mt
a
m
a
r
e
n
s
cOF151株、 OF181株
P
.b
i
p
e
s
A
l
c
x
a
n
d
r
i
u
mc
a
t
e
n
e
l
l
aOFX072株
U
c
h
i
d
ae
ta
1
.(
19
8
8
)により報侍された P
.b
i
p
e
s
葉緑体捜フェレドキシンのアミノ酸配
G
o
n
y
a
u
l
a
xp
o
l
y
e
d
r
a
列をもとに d
e
g
e
n
e
r
a
t
ep
r
i
m
e
rFXDTP-1
、 FXTCV-RIをデザインし (
T
a
b
l
e3
)、 P
.b
i
p
e
s
全
P
. b
i
p
e
sは和歌山県合川ダム貯水池において発生した赤潮プルームをプランクトンネッ
トにより集藻して DNAの抽出実験に供した o 集藻した藻体は光学顕微鏡観察によりほぼ単
DNAを鋳型に PCRを行った。 PCRの条件は、サイクル数を 35同とする以外第 2章の
H
C
c
l遺伝子の増幅において用いた条件に従った o
藻であることを確認した。また当研究室において分離された A
. t
a
m
a
r
e
n
s
e OF151株、
OF181株
、 A
.c
a
t
c
n
e
l
l
a OFX072株、また道旗氏(広島大学)より分譲していただいた G
.
C
、 1
4L:10DのゆJ
I
暗条件で培養した後、対数増殖後期に
p
o
l
y
c
d
r
aはSWIIm培地に接精し 20"
達した培養液を 5
.
0
0
0gにて 10分間遠心することにより集藻し、 DNAの抽出に用いた。
A
.t
amarenseOF151株
P
.
b
i
p
e
sの PCR地 l
脂産物 PBFDDTの塩基配列をもとにプライマー P BFDCSS、
PBFDMGNRを設定し (
T
a
b
l
e3
)、全DNAを鋳型に PCRを行った。 PCRの条件は P
.b
i
p
e
s
の場合に従った。
渦純毛藻類からの全 DNAの抽出
全 DNA
の抽出は第 2章の方法に従った。また、必要に応じて DNA
抽出キット S
epaGene
24
A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eOF181株、 A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aOFX072株
2
5
A
. t
a
m
a
r
c
n
s
e OF151株の TAIL.PCR用に設計したプライマー ATFDTAIL5、 6、 7、
1R (後述)を用い、各々全 DNAを鋳砲に PCRを行った。 PCRの条件は P
. b
i
p
e
s
の場合
G
.p
o
1
y
e
d
r
a
G
.p
o
l
y
e
d
r
aからのたdQ
の地附は R
T
-PCR (
r
e
v
e
r
s
et
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
n
a
l PCR) により行 っ
たo 5
.
0 μg
の 全 RNAを70"Cで 1
0分間熱処理してランダムに形成される ー
二次情造の変
に従った。
T
a
b
l
e3
.P
r
i
m
e
rs
e
q
u
e
n
c
e
su
s
e
df
o
rPCRa
n
dTAIL-PCR
i
r
s
t s
t
r
a
n
d b
u
f
f
e
r
存在下 2
.
5 μ.
M r
andom h
e
x
a
m
e
r、 0
.
5 mM
性を行った後、 f
i
x
t
u
r
eの条件で 25"
C
、 1
0分間インキュベートすることに
d
i
t
h
i
o
t
h
r
e
i
t
o
l、 10mMdNTPm
P
r
i
m
e
r
s
P
r
i
m
e
r毘 q
u
e
n句 s(
5
'→ 3
'
)
を終波皮 10
P
e
r
i
d
i
n
i
u
mb
i
p
e
s
f
o
rPCR
FXDTP-I
FXTCV
-RI
GA(C/T)AC工CCIGA(C/T)GGlAA(A/G)Aν
工GT*
GTIGG(A/G)TAIGTIAC(A/G}CA
CCCTGGGCACTCAAA(A/G/T)(A/G)(A/G)CTTCTTC
TGAωACCTTTCCTGCGCA(A/G)CTCGA
GATC(A/G)(A/C/T}ACCCGTGAGGACCTTTC
CTCGAG(C/T}TGCGCAGGAAAGGTCCTCA
GTCCTCACGGGT(A/G/T}(C/T)GATCGACCA(A/G)
AACGGCTA(C/T)TGCCTCACCTGCGTCA
A
L
e
x
a
n
d
r
i
u
mω
m
αr
e
n
s
eOF151，OF181，
A
.c
a
l
e
n
e
l/aOFX072
PBFDCSS
TGCTC(A/G)TCCGATCAGGCATTCTTG
PBFDMGNRωTGA'ωCA(A/G)TAGCCGTT CCAT
ATFDTA工L2R
CTGGTC(A/G}ATGGA(G/T)CCGGAGAGGACC
ATFDTAIL3R
CCTGGTCAGACTGGTC(A/G)ATGGA(G/T}CC
ATFDTAIL4R
GGTGAGGCAGTAGCCGTTGCCCATC
ATFDTA
工L5
CTC(A/C/G/T)TGCCG(C/T)GC(A/G/T)GGCTC(C/T)TG(C/T)TCC
工L6
(A/G)(C/T)TGCC(A/G)TACTC(A/C/G/T)TGCCG(C/T)GC(A/G/T)GGC
ATFDTA
ATFDTAIL7
CT(C/G/T)GA(C/T)CAωC(C/G/T)GA(A/G)GAGGA(G/T)GGC
∞
TACATCC(A/T)GG(A/T)CAAGGC(C/T}GAGGAG
CTGGTC(A/G)TCGTCCAAGAATGCCTG
行った。反応液はフェノール:クロロホルム抽出することにより除タンハク質操作を
行った後エタノール沈殿に供し、合成された cDNAを沈殿回分に阿収した o これを H
20
PCRによる f
e
d
Q
の増幅は、 cDNAを鋳型に P
. b
i
p
e
s
の PCR梢州産物 PBFDDT
の塩基配
、 PBFDQAFR (
T
a
b
l
e3
) を川いて行っ
列をもとにデザインしたプライマー PBFDYIL
.b
i
p
e
s
のそれに従った。
た。 PCRの条件は P
TAIL-PCRによる葉緑体型フェレドキシン遺伝子周辺領域の増幅
TAI
し PCR(
!
.
h
e
r
m
a
l~symmetric .
i
n
t
e
r
l
a
c
e
d PCR) はL
i
ua
n
dW
h
i
t
t
i
e
r(
1
9
9
5
)、L
i
ue
ta
1
.
(
1
9
9
5
) の方法に準じた。各渦鞭毛深類に対して用いた s
p
e
c
i
f
i
cp
r
i
m
e
rの設定については以
下に示す o
P
.b
i
p
e
s
、4、5、6を設定した (Table3
)。
A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eOF151株
f
o
r
T
A
I
レPCR
GPTAIR
GPTA2R
GPTA3R
E
P
. b
i
p
e
s
のP
CR!M幅産物 PBFDDTの温基配列をもとにブライマー P
B
F
D
T
A
I
L
l、2、3
G
o
n
y
a
u
l
a
xp
o
l
y
e
d
r
a
f
o
rPCR
PBFDY工L
PBFDQAFR
u
n
i
t
s
/
μ
iとなる様加えて 42"Cで 1時間インキュペートし、逆 伝写反応を
に溶解し、 PCR
の鋳型として用いた。
f
o
rTAIl
.
rPCR
PBFDTAILl
PBFDTAIL2
PBFDTAIL3
PBFDTAIL4
PBFDTA
工L5
PBFDTAIL6
よりプライマーのアニーリングを促した o その後逆恥'ry.酵素 S
u
p
e
r
s
c
r
ip
tI
I(
G
ib
c
oBRL)
CA(A/G)ACCCTCCTCCTC(A/G)GCCTTGACC
CAGCTCGAGCAGGAGCC(A/C)GCGCGGC
GAGCC(C/T)GAGAGCACCTT(C/T)CCCGC(A/G)C
PCR増 幅 産 物 ATFDCMlの 塩 基 配 列 を も と に 5
'末 端 側 増 幅 月 ] プ ラ イ マ ー
ATFDTAIL2R，3R，4Rを設定した (
T
a
b
l
c3
)
。また、 5
'末端側の TAIL-PCRの結果得ら
れた増幅産物 ATFDTAIL2R.2、 ATFDTAIL2R.3の駈必配列をもとに 3・末端側増幅用プ
*1indicatesinosine.
T
a
b
l
e3
)。
ライマー ATFDTAIL5、 6、?を設定した (
26
27
A
.c
a
t
c
n
e
l
l
aOFX072~米
支サイクル条{午は Tablc
PCRは3段階で行った。各段階の PCR?hld
A
.t
amarenscOF151株に対して用いた 5・ぷ端側増幅用プライマー ATFDTAIL2R、 3R
、4Rを用いた。
，
1
にぷす o 1段附日の
PCRは全DNAを鈎型に 2.0 m~l MgCI2、 200 1
1
^
1dNTP l
1
li
x
t
u
r
c、0
.
2
1
1T
ls
p
c
c
i
f
i
cprimcr、
1
.0 μ Marbitrarydcgcncratcprimcr(
L
i
uc
ta
l
.
.1
9
9
5
)、 25unitぉ/ml TaqDNAポリメラーゼ
(
P
c
r
k
i
n Elmcr)、0.5μg/ml全 DNAの以!必条件で行った。 2段
￨情 1の PCRは鋳明としてその
G
.p
o
l
y
e
d
r
a
反応液祉の ]/20日を 1段階日の PCR以!必液から取り、 1段階 HのPCRと同条{午で行った o 3
RT
-PCR増幅産物 GPFDRTYQ160の温基配列をもとに 5・末端側増幅用プライマー
段階目も [új 織に 2 段階日の増幅産物を UH1'~に PCR を行った。科られた哨幅産物は1. 5 %アガ
ロースゲ jレ沼会t
i
永
良b
により確認した。
GPTAIR，2R、 3Rを設定した (Tablc3
)。
PCR増幅産物のクロ ーニ ングと塩基配列の決定
Tab
l
e4
.Thermalc
y
c
l
es
e
t
t
i
n
g
susedfo
rTAI
L
rPCR
r
e
a
c
t
l
o
n
t
h
e
r
m
a
ls
e
t
t
i
n
g
s
pnmary
C(
1min
)，
95.C(
1m
i
n
)
93・
PCR増幅産物のプラスミドベクターへのクローニングは T ACloning Kit (
I
n
v
i
t
r
o
g
c
n
)を
c
y
c
lenumber
用いた。すべての持作は付属のマニュアルに従った o
PCR増幅産物をクローン化したプラスミドの塩基配列の決定は第 2章の HCc1J
引ム
rの
場合と r
u
J級に行った。
94.C(
1min
)，
62.C(
1min)
，
72.C(
2.
5min)
5
25.C(
3m
i
n
)，
r
ampingt
o72.Cove
r3min，
94.C(
1min)，
72.C(
2
.
5min
)
94・
C(30s
e
c
)，
68・
C(
lmin)
，
72・
C(
3min)
94・
C(30s
e
c
)，
68・
C(
1min)，
72・
C(
3min)
94・
C(30s
e
c
)，
44.C(
lmin)，
72・
C(
3min)
葉緑体型 フェレ ドキシンアミノ酸配列のアラインメン卜 と系統樹の作成
アミノ隊配列の多重整列(マルチプルアラインメント)は J
I
igginsによるツリーベース
15
行った。多
C(
7min)
72・
secondary
i
f
(放 列 か ら の 遺 伝 距 離 の 7
1
1
1
1、 遺 伝 距 離 か ら の 系 統 樹 の 構 築 は そ れ ぞ れ
Kimura(1980)の )
j法
、 Sai
t
o
uand N
c
i(
1987) の近隣結合法に必づくコンピュータープロ
94・
C(30s
e
c
)，
64.C(
1mi
n)
，
72・
C(
3min)
94・
C(30s
e
c
)，
64.C(
1min)
，
72・
C(
3min)
94・
C(30s
e
c
)，
44・
C(
lmin)，
72・
C(
3min)
12
グラムパッケージ PHYL
lP Version 3.5c1の PROTDIST， NEIGIIBOUR、 DRAWTREEにより
こ
。
行っ f
C(
7min)
72・
t
I
ary
t
er
法に基づくコンヒュータープログラム ClustalW Version ].5(Thornpsonc
ta
l
.，]99りにて
葉緑体型 フェレ ドキシン トランジ ッ ト配列の解析
C(30s
e
c
)，
64・
C(
1min)，
72・
C(
3min
)
94・
94・
C(30s
e
c
)，
64.C(
1min)
，
72・
C(
3min
)
94・
C(30s
e
c
)，
44.C(
1mi
n
)，
72.C(
3min
)
10
トランジット配列の疎水性プロフィールは Kyteand Doolittlc (1982) の J
JWに従い DNA
境基配列解析ソフト DNAsis (
fI)/.エンジニアリング)を)I
Jいて批測した。シグナル配列
1[-メー Jレサーバ ([email protected]) により McGcoch (1985)
のプロセシング部位は PSORTn
72.C(
7min)
1F
e
l
s
e
n
s
t
e
i
n:
JPHYLIP(PhylogcnyInIercncePackage)vcrsion3.5c.Distributcdbythc
author
.Departmcnto
(Genctics，Univcrsityo
fWashington，S
c
a
t
t
l
c(1993)
2
8
2
9
とvonI
!c
l
j
n
c(1983)の)ji
ょに従い J
作測した。
幅
l
h
陥
I
s
股
)
j
E
物 PBFDTAI
凡
L、
払
3 向掠に約 700bp
の3
'
1
官
1
i
リ
川
j
J
川
1
可
I
d
辺i
官
飢
江
引
'
U
J
l
域
免増
I
骨
￨
州
h
何
陥
h
品
;
川
ω
d
t
¥
1
戸
)
6
B
)
0
3
.
2
結果
葉緑体型フェレドキシン遺伝子の PCR
、T
AIL-PCRによる増幅
A
2
B
1 2
C
2
P
.b
i
p
c
s
'
f
'
tDNAを鈴型にフライマ -FXDTp.
I
、 FXTCV'
R
IをJll
いて PCRを行った結決、 22.
1
bpのI
R
t
I
隔応.
物 PBFDDTを何た(Fi
g
. 6A)0 また、その周辺領域の j
盆碁配列情報を得るた
め
、 5
'側
)
，
v
JJ
!
l領域川に PsFDTAILl、2、3を
、 3・
側1
M辺領域用に PBFDTAIL4、 5、 6を
n
設定し TAIL.
PCRを行った紡来、何れも 3
段I
W
f の PCRより約 700 bpの 5'
1
f
!
1
J
周辺領域 J村
A
B
12
2
3
4
4
・
4
E
>
-
・
4
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Lan
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2， ATFDTA
lL2R.2 and ATFDTAI
L2R.
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4
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7.
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a
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e
rmarker;land-PBFDTAIlJ;lane3，PBFDTAIL6.
∞
30
P.bipcsr11 米の PCR産物 PBFDDTの邸)t~配列をもとに設計したプライマー PBFDCSS、
PBFD
.
ffGNRを用いて全DNAを鈴砲に PCRを行い、 99 bpの地幅産物 ATFDCMlを待た
(
F
i
g
. 7A)
。また、 ATFDCMlの周辺飢域の塩基配ダ1
1を決定するた め
、 ATFDCMlのj
L
〔
3
1
五年配列をもとに 5・末端側周辺領域
mブフイマー ATFDTAIL2R，3R， lRをデザインし
TAIL-PCRをf
fった結果、約 550
.
4
.
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c
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c
J
J
aOFX072t*
bp
の片山1
0
m物 ATFDTAIL2R.2、
A. t
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I
Ia
]
'
(
'
I
1
S
C OF151株 の TAILPCR)IJプライマー ATFDTAIL5、 1Rを)fJいて全 DNA
ATFDTAIL2R.3を刊た (
F
i
g
. 78)
。民に 5・ぷ端側の TAIL.PCR1{1J~ílî 版物の塩基配列から
を鋳別に PCRを行い、]19 bpの 1
¥
1J~IJ~ J
}
'
(
:
_物 OFX072.5 I
を{!?た(Fi
g
. 9A)。また、この 5・
3
'*
y
f
t
J側川フライマー ATFDTAIL5、 6、 7をデザイ ン して TAIL-PCRを行い 、 321 bp
の
側周辺 1
J
i域を 1
i
1J~，6 するため、[，，'J じく A. t
amar
C
l
1S
C OF151株 の TAIL-PCRJ
I
Jブヲイマー
!{71~Íî1産物 ATFDTA5 '
1
.7.350を得た
ATFDTAIL2R、 3R、 4Rをj
日いて T AI
L.PCRを行った紡米-、 I26
bp、 ]050
(
Fi
g
.
7C)
。なお、 ATFDTAIL2R.2、
ATFDTAIL2R.3の出必配列に関しては 3・ぶ端側のそれぞれ 579旬
、 51
4 bpについての
bpの 1
N
$
i，
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>
'
(
:物
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7.
'
150を符た (
F
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.98)
。
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R.3R・1
み決定した o
A
B
2
2
1
¥
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c
ns
eOF181
株
A. t
alJJarcnsc OF151株 のTAIL-PCR)IJブラ イマー ATFDTAIL7、 '
IRを用 い て 令 DNA
を鋳瑚に PCRを行い、 156 bpの明郎産物 OF181
.74を、またフライマー ATFDTAIL6
・
mいて]27bpの増幅産物OF181.G1を得た(Fig.8)0
と IRを
・
・
2 3
4
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A.p
OFX072.5
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.
7.
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.
7.
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∞
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益 物 PBFDDTの品
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PCRをf
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、 ]38 bpの I地幹削Jpu~
山凶
u~j陀可存摂;::!物
l助刻GP FDR TYQ 160 を f引:} た
伊
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F
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g
.
1ωOA
刈)0 また 、 GPFDRTYQ160 の 5・木端側周辺領域を!r: J~i，\するた め 、 GP FDR TYQ 1 60 の
坦 基 配 列 を も と に プ ラ イ マ ー GPFDTA1R， 2R、 3Rを1没定し、全 DNAをS
J
y
}
引に TAIL.
l
.
7
Rを符-た(Fi
g
. 108)
。な
PCRを行った。その結果、約]100 bpの附幅産物 GPTA3Rt
3
2
3
3
お
、 GPTA3R 1.7R のr~)た配列は 3 ・ぷ端側の 609 bpについてのみ決定した o
い相向性を示し、 PCR、TAIL-PCR増幅必物がフェレドキシン遺伝子に由来することが確
認された。また、この アミノ酸配列の比較から来紋体型フェレドキシン成熟タンパク質の
A
B
2
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p
e
s
、A
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r
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s
eOF151株からは成熟タンパク質全長を合む
コード領域を決定し、 P
2
領域が、 A
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t
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e
l
l
aOFX072株
、 G.p
o
l
y
c
d
r
aからは 5
'末端側周辺領域を含む部分配列が、
また A.t
a
m
a
r
e
n
s
eOF181株か らは成熟タンパク質中央部の部分配列が得られていることが
確かめられた。
また、 トランジット配列領域の決定は、 高等純物において報告されているトランジット
・
4
E
ク質コード領域の上流 にi
n f
l
a
m
eで
、
存在す るMetAlaを検索す ること に より 行い 、その結
果P
.b
i
p
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、A
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r
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s
cOF151株
、 A
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n
e
l
l
aOF072株
、 G
.p
o
l
y
c
d
r
aにおいてそれぞれ
6に確認された。よって、塩基喜子号 lを鰯訳開始点とし、ここから成熟タンパク
塩基昏号 1
・
4
P
i
l
o
nc
ta
l
.，1995)ことを参考に、成熟タンパ
配列のアミノ末端が常に Met-Ala-で始まる (
質コード領域アミノ末端まで、それぞれ 77、 80、 83，79アミノ酸により構成される領域
E
をトランジット配列とした。
i
g
. 11から F
i
g
. 15にまとめた。尚、 f
e
d
Q
中には介伝配列の存在は認めら
以上の結呆は F
れなかった。
F
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，1
0
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e2，GPTA3R
・4
.7R(
訂r
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)
.
∞
葉緑体型フェレドキシン遺伝子の塩基配列の解析
PCR、TAIL-PCRにより f
!
rたI
首脳旅物はプラスミドベクター pCR 1
1にクローニングした
後そのJ
弘法配列を決定した。その紡来、最終的に P
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p
c
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からは 922 旬
、 A. t
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c
OF151株からは 80，
1bp、 A
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c
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s
cOF18J株からは 156旬
、 A
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c
J
J
a OFX072株か
'
180bp
、G
.p
o
l
y
c
d
r
aからは 673bpの塩基配ダtl 情報が符られた。この rrut~~配列からアミ
らは-
ノ般配列を推測し、 Uchidac
ta
l
.(
19
88) により報告された P
.b
i
p
c
s
のアミノ酸配ダJ
Iや 1
高等
柏物の来総体型フェレドキシンのアミノ酸配列と比較したところ、そのfUIれとも械めてお
3
4
35
・2
20
5・
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.
ム
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仁A
TCAGT TGT CGA TCATTT CAA GTC GCATTA GTC AACAGGCGG GTCATG -166
TTTAT
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GATA
仁CCG
AT CCC CACATTTCA CTTCCC AGT CTG CGA CGTAGC TTAAGCTTC ACACAT -112
TTC TGTGCC ATTTGG GTA TTG TGC GCC GCT AGC TCC ATCATGGCG TCC AGC ACG
M A 5 5 T
15
AGG G
T
GCTCCCAG了TATTCTTG
T
GGTAACG CTG GGTGCTATG TTCTTGCGCAGC
69
5・AGGACC TTT CCTGCG CAG CTC GAG AAGCCACTAGCACGG CATAAG CCG ACA GAG
CCAC
G
TTTAGC AGG AAG TCG GCC GGG TGTGTG GGC AGG CAA CTCAGG GGA TGC GTTGCG
-58
GC
R VL P VI L V VTL GAMFL RS
ATG TGGTAC AAGCCC CCTTTT TGAAAG GCTGNC ACAATC TTGATTTGC AAG CCT
-4
GC仁 ATGGCG TCCAAGAGC ATTCTG GCC CCAACT CTG CTC GTGGCGGCG CTC GGC
50
TTC CTGATG CCA GGC CAC ATCAATGATGC仁 GCCTTCACC ATA TCAAAG CTTGCA 123
104
ACG CAC TCA GTT CAC CAC GGCTGC CGA CCAGTG CAAAGC TCC AGAGCA CTC CTT 177
T H 5 V H H G C R P V Q 5 5 R A L L
158
GCC CAGGGG GGTTTG T仁
仁 G
CA GTTGTA AAT GGG GTACCTGCC CGC CAG GGTGTT 231
212
GCG GCG CACTTCAAG GTG A仁G TTG GAGACC CCT GATGGC ACACAG GAG TTTGAG 285
A A H F K V T L E T P 0 G T Q E F E
CAA GGA GTC GCA GCA CAC TTC AAAGTG ACTTTG GA
仁A
仁仁仁仁G GA
仁G
GCAAG AAG
Q G VA A HF K V T L 0 T P 0 G K K
266
TGC CCC GAG GATGTG TATATC CTC GAC CAG GCCGAAGAG GAGGGC CTTGAG 仁TG 339
C P E 0 V Y 1 L 0 Q A E E E G L E L
TCCTTC GAGTGC CCA GGG GAC TC仁 TACATC CTC GACGAG GCG GAG GAG GAG GGC
5 F E C P G 0 5 Y 1 L 0 E A E E E G
320
CCA TAC TCT TGC CGT GCT GGC TCTTGCTCC AGCTGT GCT GGAAAGGTC CTC TCC 393
P Y 5 C R A G 5 C 5 5 C A G K V L 5
仁TGGAG CTG CCG TATTCG TGC C
GC G仁A GGC TCG TGC TCGAGCTGC GCA GGAAAG
374
GGA TCC ATC GAC CAG TCTGA
仁 CAGGCC TTC TTG GA
仁 GATGAT CAG ATG GGT GAT 447
G 5 1 0 Q 5 0 Q A F L 0 0 0 Q M G 0
GT
仁仁T仁 ACGGGT G
TG ATC GAC CAGTCCGATCAAGCA TT
仁 TTGGAC G
AC GACCAG
V L T G V 1 0 Q 5 0 Q A F L 0 0 0 Q
428
GGC TAC TGC CTC ACATGC GTC ACG TAT GCC ACC TCT GAT GTTACC ATT AAG A仁T 501
G Y C L T C V T Y A T 5 0 V T 1 K T
ATG GGC AACGGC TATTGC CTCACC TGC GTC ACC TAC 仁CCA仁A TCC GAC GTG A仁G
M G N G Y C L T C V T Y P T 5 0 V T
482
CAC TGTGAG GATGAG CTGTGA GTG GGTGCG GTTCTC CATTTC CTTGGC ATTCGA 555
H C E 0 E L
AT
仁A
TGACACAC TGC GAGAGC GAACTT TGA GCG GGG GTG GCGCGTCCG GAGGGA
1 M T H C E 5 E L
536
GATCTTTGC TAC AGC CGA TGTGAG GTATAC GCTCAG TCATGC GTA CGTACC GG仁 609
GAA ATAAAT TCTATG A了TGCGGCC 仁AAAAAATATAT ATAAAA TACAGAACATTT
590
TGG GGG GCTTGT T仁A A仁ATTT TGAATTATTGAC CAAGAT CCTTCC ATATTC ACC
644
M A 5 K 5 I L A P T L L VA A L G
A仁T GTT CTC CTC CGC CGCT仁
仁 A
TG CTGGCG CCG ACC TTC ATTGCA CCT CAC TCA
T VL L RRSML A P TFIA PHS
AGCAGC ACTTTG AGT CTA CA
仁仁AGG
GC TGC GTT CAT GTG GCT GGC GGC GGC GAC
55 T L 5 L H Q G C V H VA G G G 0
AC仁 GCCACC CTTGCC GGT GCT GTG CCGGCG ATC GTG AGC AGC GTG CCTACG CGA
TA TL A GA VPA 1 V5 5 VP TR
L
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F L M P G H I N 0 A A F T I 5 K L A
A Q G G L 5 A V V N G V P A R Q G V
・
仁 ACACAT CGA CAT GCA CGG GCG TAAATG 3
'
GTG CGC ACAAA
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37
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5・CTTGAC CAGG仁
仁 GAA G
AG GAG GGC CTTGAG CTG CCGTAC TCT TGC CGT GCG GGC
L 0 Q A E E E G L E L P Y S C R A G
CAA CAG CAG CGT 仁AGCAC CAGCACCAG GAA CGAACA CAA TAACAA CAC CAACAG -130
T仁T TGC T仁CAGC TGT GCT GGCAAG GTC CTC TCC GGT TCGATT GAC CAGTCTGAC
C S S C A G K V L S G S 1 0 Q S 0
仁AAC
GC CAG CAC CAA CAA CAA CAC CAAAAT CAA 仁ATCAA CAC CAACAC CAA GAA -76
s
仁AAC
AC CAATCC GTA GC仁 ATTTTG GCT CAAGGT TCAAGC CCA GCA GCAGGGAAA ・22
仁AGG
CC TTC CTG GAC GATGATCAGATG GG仁 AACGGCTACTGC CTCACC3
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3125 0.3362 0.
4213 0.
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0
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0.
5397 0.
3125 0.2740 0.
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3525 0.3362 0.
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3761 0.
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F
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， chromophyl出，巾吋ophytω，anddinofJ
a
gelJa凶
Cyano
a
r
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asCya，Cht
，Eug.
Chr
，Rho，andOlno，陀~山、 cly.
多重整列の結果から、 Kimura (1980
) の方法に従い各生物種間での遺伝距離を算出し
(
T
a
b
l
e5
)、更に得られた遺伝距離から近隣結合法 (
S
a
it
o
u and N
e
i，1987) により分子系統
樹を作成した (
F
i
g
.1
7
)。浩干の例外はあるものの 、各生物群はそれぞれクラスターを形成
まず各生物犯のアミノ酸配列について Higginsによるツリーベース法に基づき多重幣列
40
した。特に、渦鞭毛藻類は単独でクラスターを形成すること、渦鞭毛深穿l
はMarchantia
41
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aとシスターグループを形成すること、!Jfに渦鞭毛藻煩.
M. p
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ブは緑色植物の一部、特に C
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a、
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aといった緑藻類とシスターグループを形成することが明らかとなった。
業総体型フェレドキシンから見た渦鞭毛深鎮の M
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p
h
aや緑藻類との近縁関係は、
緑藻類以外との遺伝距離が0.48-0.55 であるのに対し、紋~菜類とは 0.30・ 0 .4 5 と低い値をぶ
していることからも支持された (
T
a
b
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e5
)
。
葉緑体型フェレドキシ ン遺伝子のプロ モータ ー領織の解析
P
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、A
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eOFl51株、 G
.p
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1
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aでは 5・末端側の非翻訳領域の塩基配列が符
られていることから、プロモーターコンセンサス配列の検索を試みた。その結果、転写装
置の転写￨井j
始点認識に関与する配列であるプロモーターコンセンサス配列、 TATAボック
ス
、 CAATボックスは何れの種からも見出されなかった o 一点、ハウスキーピング泣伝子
においてしばしば見出され、 TATA
ボックスにかわり機能していると考えられている GC
ボッ クス織の配列がP
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sとA
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eOF151株において認められた (Figs.11、 12)。
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GATA
(
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unknown
また、葉緑体型フェレドキシンはその転写が一般的 に光により制御され ることが知られ
ている (
D
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se
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1
.，1987) ことから、陸上高等純物の葉緑体型フェレドキシン遺伝チの
プロモーター領域に見出されている光発現制御シス囚 !
Gボックス、 Iボックス、 GATA
ボックス (
T
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1
.，1990.S
omcrsc
ta
l
.
.]
990)について検索 を試みた結果、P.
b
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sにおいて Gボックスと Iボックス様配列が、また A. t
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e OF151株からは GATA
43
ボックスが見出された(Fi
g
s
.1
1、 1
2
)
。また、陀上高等植物の葉緑体型フェレドキシン遺
伝子に共通して見出されるモチーフ配列である CCACボックス、 ARL(
T
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e 6，Somers e
t
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J
.，1990，CasparandQ
u
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l，1993) についても検索した結果、 P
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からは CCACボック
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.
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U 2.00
∞ 1 .ω
舶
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29ω
ス線モチーフが、また A
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e OF151株からは ARL
機配列が認められた(Fi
g
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. 11、
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1
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)
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aからは何れのモチーフも見出されなかったが、特徴的な配列として .240
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.
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泌
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bpから .70bpに梅めて A
C
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hな領域が認められた (
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1
1
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AMINOACIDSNUル田 ER
5
.鈎
葉緑体型フェレドキシン遺伝子のトランジット配列
今川島正法配列を決定した渦鞭毛藻類のうち、翻訳領 j
或のアミノ末端まで情報の得られて
いる P
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r
aに関して、葉緑体
摺フェレドキシンのトランジット配列を陸上高等植物のそれと比較した (Fi
g
.1
8
)
。高等植
物のトランジット配列が50・55アミノ酸で構成され、一次構造の保存性がある程度認めら
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3
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4ω
5
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ー-1.00
記2
.ω
Q -3.00
主
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れる(Fi
g
. 18A) のに対し、渦鞭毛藻類は高等柏物との相向性がほとんど認められず、ま
2
1
AMINOACIDSNUMBER
主4 ω
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56
AMINOACIDSNUMBER
た80アミノ酸前後と向等航物と比較して長いトランジット配列を持つことが示された
(
Fi
g
.18B)
。
5
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芝主込M
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MATVLGSPRAPAFFFSSSSlぷAA~APTAV-'~PAAKV-GIMGRSASSRR--R~Q
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c
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1a
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u
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c
er
e
g
i
o
n
sa
r
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m
i
t
t
e
d
.
トランジット配列の機能を予怨することを目的に、渦鞭毛藻類の各トランジット配列を
発現を司るプロモーター構造が他の真級生物と異なり特殊であること、光発現制御に機能
シグナル配列予測プログラム PSORTを用いて解析した。その結果、渦鞭毛藻類のトラン
するシス因子が認められること、また葉緑体への移行シグナルであるトランジット配列に
ジット配列のアミノ末端に小胞体膜の通過を指示するシグナル配列が見出 された
(
F
i
g
.
1
8
B
)。このシグナル配列様領域にはシグナル配列の特徴で あるアミノ末端付近の電荷を持
渦鞭毛藻類の葉緑体膜構造を反映したシグナル配列の付加が認められることが明らかと
なった o 各々について以下に考察する。
つアミノ酸、カルボキシ末端付近の非荷電の極性側鎖を持っ たアミノ酸、中央の高い疎水
G
i
e
r
a
s
c
h，1
9
8
9
)が認められ、またシグナル配列のプロセシング部位に優先
性を示す領域 (
(
1)葉緑体型フェレドキシンから見た渦鞭毛藻類と緑藻類の類縁関係
的に認められる 3部位の v
a
l
i
n
e、1部位の a
la
n
i
n
e(
v
o
nH
e
i
jn
c
，1
983，1
9
8
6
)が渦鞭毛藻類の
渦鞭毛藻類はその核構造、染色体構造が他の真核生物と極めて異なった性質を有してい
シグナル配列様領域においても存在することから、一般的なシグナル配列との共通性が確
ることから、その進化系統関係について議論され、原核生物から真核生物への進化の途上
認された。
e
s
o
k
a
r
y
o
t
e
が提唱された
の段階にとどまっている生物群として m
(
D
o
d
g
e
， 1
9
6
9
)
。近年で
葉緑体型フェレドキシンのトランジット配列では疎水性プロフイールが保存されている
は
、 DNAの塩基配列に蓄積される変異から生物問の進化系統を解析する 手法、いわゆる分
P
i
l
o
ne
ta
l
.，1
9
9
5
)
。また、 トランジット配列はアミノ酸組成、疎水
ことが知られている (
子進化学の確立に伴い、渦鞭毛藻類においても分子進化の指標としての信頼度が高い
性プロフイール、二次構造予測などからアミノ末端ドメイン、中央ドメイン、カルポキシ
rRNAの塩基配列が決定され、その分子進化系統に関する考察が成されている (
H
i
n
n
e
b
u
s
c
h
v
o
nH
e
i
jn
ee
ta
l
.，
末端ドメインの 3ドメインの存在とその機能的分担が予想されている (
e
ta
1 1981，Marot
e
a
u
xe
ta
l
.，1985，H
e
r
z
o
ga
n
dM
a
r
o
t
e
a
u
x
，1
986，G
u
n
d
e
r
s
o
ne
ta
1
.，1987，
1989，d
eB
o
e
ra
n
dW
e
i
s
b
e
e
k
，1
9
9
1
)
。渦鞭毛藻類のトランジット配列についても、推測さ
G
a
j
a
d
h
a
re
ta
1
.，1
9
9
1
.M
c
N
a
l
l
ye
ta
1
.，1
9
9
4
)
。現在では 18SrRNAの塩基配列から構築した
れるシグナ lレ配列の領域を解析から除いた上でこれらの点を検討した。高等植物ではアミ
分子系統樹をもとに、渦鞭毛藻類は繊毛虫類やアピコンブレクサとシスターグループを形
残基ほどの疎水性領域が保存されており(Fi
g
.19E)、また疎水性領域と親水性領
ノ末端 10
成するごく最近分岐した生物群と考えられており (
G
u
n
d
e
r
s
o
ne
ta
人 1987
，G
a
ja
d
h
a
re
ta
1
.，
域のサイクルが機能的に重要であることが指摘されているが (
P
i
l
o
ne
ta
l
.，1
9
9
5
)、渦鞭毛
1
9
9
1
)
、細胞膜直下の特徴的な小胞(アルペオー J
レ)を共有している点をもとにして、こ
藻類のトランジット配列(シグナル配列領域は除く)においてはその何れも明瞭には認め
C
a
v
a
l
i
e
r
S
m
i
t
h
.1
9
9
3
)。
の3生物群をアルベオラータと総称している (
リ
られなかった (
F
i
g
s
. 19A1
9
D
)
。一方、ドメイン構造に関しては、中央付近にハイドロキ
しかしながら渦鞭毛藻類の特殊な核構造、染色体構造はこの分類体系からは説明できな
シアミノ酸が比較的多く認められる点、ヘリックス構造の分断に機能するとされるプロリ
い。繊毛虫類、アピコンブレクサ何れもその核構造、染色体構造、遺伝子構造には渦鞭毛
ン残基が渦鞭毛藻類内で保存されている点、プロセシング部位モチーフとされる
藻類に見られる特殊性は認められず、典型的な真核生物と同様の性状を示している。この
日l
e
/
V
a
l
)
-X
(
A
l
a
/
C
y
s
) が渦鞭毛藻類のカ jレボキシ末端にも認められる点で高等植物のトラ
事実は rRNAによる渦鞭毛藻類の分子進化系統学的な位置づけが一面的であることを示唆
F
i
g
.1
8
'
)。
ンジット配列との共通性が認められた (
しており、渦鞭毛藻類の進化の道筋を議論するためにはより広範囲の分子進化マーカーを
用いての検討が必要と考えられる o
3
_
3 考察
本章では、渦鞭毛藻類の真核生物内での進化系統関係について検討するための分子進化
マーカーとして葉緑体型フェレドキシンのアミノ酸配列を用いた。 一般的に分子進化マー
本章では、渦鞭毛藻類数種から葉緑体型フェレドキシン遺伝子 fedQをクローニングし、
a
r
a
t
e
カーとして用いられる rRNA、伸長因子 EF1、m
d
e
h
y
d
r
o
g
e
n
a
s
e
(MDH)、l
a
c
t
a
t
e
その塩基配列を決定した。その塩基配列、もしくは塩基配列から予想されるアミノ酸配列
d
e
h
y
d
r
o
g
e
n
a
s
e(
L
D
H
) などの遺伝子はその起源が核ゲノム DNAに由来するとされている。
o
l
y
m
o
r
p
h
aと緑藻類に近縁であること、遺伝子の
より、渦鞭毛藻類が分子系統学的にM. p
一方、葉緑体内で機能するリボゾームや光化学系、炭酸国定回路を構成する葉緑体タンパ
4
6
47
ク質の多くも核ゲノム DNAにコードされているが、これらの遺伝子はシアノバクテリアが
くい近隣結合法を用いていることから、比較的信頼度の高い樹形が得られていると思われ
共生した後宿主の光合成、炭酸回定装置として特化し葉緑体へとその立場 を変えていく過
る
。
程で宿主の核ゲノムに移行した葉緑体ゲノム DNAに由来す るo 従ってリプロース 二 リン酸
得られた !edのアミノ駿配列に基づく系統樹の樹形は従来考えられていた渦鞭毛藻類の
、クロロフィル a
/b結合タンパク質遺伝子 cab
カルボキシラーゼ小サプユニット遺伝子 rbcS
分類学的な位置関係とは異なる結果を示した o 葉緑体の色素組成に基づく光合成生物の分
、葉緑体型フェレドキシン遺伝子 fedに代表されるこれらの遺伝子の塩基 配列、もしくは
類体系では、緑藻類はクロロフィ J
レaとbを持つのに対し渦鞭毛藻類は褐色植物と 同様クロ
アミノ酸配列を分子進化の指標として進化系統を議論する際には注意を要する。一般に葉
ロフィル aとCを持つことから、渦鞭毛藻類は褐色縞物門と近縁であるとされていた 。しか
緑体DNAの進化速度は核ゲノム DNAに比べて遅いことが知られており、生物種により遺
しながら [edから得た分子系統樹からは褐色植物との類縁性は認められず、むしろ 一部の
伝子の葉緑体から核への移行時期に差があ る場合や、種によって核への移行が認められな
g
l
e
s
i
a
s'
P
r
i
e
t
oeta
1
.
緑色植物、特に緑藻類や M.polymorphaとの近縁関係が示された。また I
い遺伝子を分子進化の指標として用いる際には進化速度の差異を考慮に入れなければなら
(1993) はクロロフィル a
/c
-キサントフィルタンパク質複合体の免疫学的解析を行い、渦鞭
ない。また、葉緑体の多重共生が指摘されている褐藻類、ラフィド藻類、クリプト諜類、
毛深植物と褐色横物は異なる性状を示すことを報告している。これらの結果から渦鞭毛藻
クロララクニオ藻類、ユーグレナ藻類や渦鞭毛藻類では、葉緑体DNA上にコードされてい
植物と褐色植物との近縁関係については疑わしい。また、渦鞭毛藻類と幾つかの点で共通
た遺伝子群が核ゲノム DNAへ移行する際にたどった経路、即ち、真核光合成生物が共生し
品鞭毛藻類とユーグレナ藻類との
の性状を示す藻類としてユーグレナ藻類が注目される。 j
た後、その葉-緑体にコードされていた遺伝子は一旦共生者の核ゲノム DNAに移行した後に
近縁関係は 18S rRNAや fedからは示されていないが、ユーグレナ藻類はその染色体が細胞
宿主の核へ移ったのか、もしくは直接宿主の核へ移行したのかという点について把握して
周期の間期においても凝集したままで、細胞分裂の際に核膜が消失しないといった染色体
おくことは、これらの遺伝子を用いて分子進化を議論する際に極めて重要である。この問
1のイントロン構造などの点で渦鞭毛藻
構造、核分裂上の特徴、さらに前輩で考察した hcc
題点は葉緑体ゲノム DNA、宿主の核ゲノム DNA、共生者の核ゲノム DNAにコードされて
類に酷似している。ユーグレナ藻類の進化系統的な位置付けは、遺伝子の塩基配列情報が
いる遺伝子を用いて分子系統学的に解析し、その結果を比較検討することで、遺伝子の移
a
t
i
oが極端に偏っており、系統樹の樹形の信頼性に乏
十分でないこと、 18S rRNAのGC r
行に由来する影響について知ることが出来る。しかしながら現段階では共生者の核として
しいことから未だに混乱している o そのため、渦鞭毛藻類とユーグレナ藻類の系統関係に
存在が確認されているのはクリプト藻類とクロララクニオ藻類のヌクレオモ jレフを除いて
ついての議論は現段階では困難である o しかしながら染色体構造や核分裂の機構、イント
なく、またヌクレオモルフのゲノム DNAに関しても 18S rRNAを除いて遺伝子の塩基配列
ロン構造は渦鞭毛藻類の進化系統を考察する指標のひとつとして興味深い。ここで示した
に関する情報は得られていない。渦鞭毛藻類においても共生者であることが予想される光
幾つかの分子進化の指標に加え、より多くの遺伝子やタンパク質、転写、翻訳装置や DNA
合成真核生物の核もしくはその名残と思われる構造は確認されておらず、また葉緑体ゲノ
複製機構などについてその進化系統関係が渦鞭毛藻類も含む生物種において明らかにされ
ムDNAに関する境基配列情報についても全く報告されていない。ただし今回分子進化の指
ることにより、渦鞭毛藻類の進化系統的な位置が更に明確に示されることが期待される 。
標として用いた !edに関しては、核に移行せずに葉緑体にコードされたまま維持されてい
る生物種が現段階では確認されていないことから、おそらく光合成生物が共生した極めて
(
2
)
葉緑体型フェレドキ シン遺伝子プロモーター の特殊性
初期の段階で fedは核に移行したと考-えられる。そのため fed
で示される系統関係は葉緑体
fedQにおいても、 C
. cohnjjの hccl、G
. polyedraのLBP遺伝子と同様真核生物のプロモー
というよりはむしろ核 DNA、即ちその生物種自体の進化系統を反映していると考えられ
ターコンセンサス配列である TATAボックス、 CAATボックスは認められない。しかしな
る。よって葉緑体ゲノム DNA、核ゲノム DNAにおける進化速度の差異による影響は生物
がらハウスキーピング遺伝子において TATAボックスにかわり機能している GCボックス
種間で比較的小さいものと判断され、更に系統樹の構築法として進化速度の影響を受けに
様配列がP
.bipesとA. tamarenseOF151株において確認された o GCボックスは G
. poJyedra
48
49
の LBP遺伝子・においても認められている (
L
e
ee
ta
1
.
. 1993)
。しかしながら G
. poJyedraの
れている可能性は高く、これらのモチーフいずれかがその凋節に関与している可能性が予
fedQ
やC
. cohniJのhcclでは確認されず、渦鞭毛藻類にユニバーサルに存在するモチーフで
想される。欠失突然変異遺伝子を用いた転写制御領域の予測、各領域と相互作用するトラ
はない。このことは hcc
1同様渦鞭毛藻類の転写開始システムが他の真核生物とは異なる可
ンス凶子の検索、光による転写、発現パターンの変化についての詳細な解析によりこれら
能性を示唆している。 GCボックスが実際にプロモーターとして機能しているのか、また
のシス因子モチーフの関与について明らかにされることが期待される。
GCボックスを持たない遺伝チにおいてどのようなプロモーターが機能しているのか、今
(
3)
葉緑体型フェレドキシンのトラン ジッ ト配列 と渦線毛藻類の葉緑体膜構造 との関係
後の解析が待たれる。
一般に来総体型フェレドキシン遺伝子の転写制御に闘うするシス困子に関しては、その
葉緑体は自身のゲノム構成がより単純化するのに伴い、 fedを含むその遺伝子の一部を
発現が光により調節されることから、光合成装置をコードする他の遺伝子と問機比較的詳
核ゲノムに移行し、その発現に関わる転写、初訳はすべて細胞質、即ち宿主の装置を利用
細な研究が成されている。葉緑体型フェレドキシン遺伝チの l伝写はリプロース二リン酸 カ
するようになった。しかしながらそのために核ゲノムにその遺伝子が移行した葉緑体タン
j
レボキシラーゼ遺伝 j
勺bcやクロロフィ jレa/b
結合タンパク質泣伝子 cabと同様、光レセプ
パク質を何らかの形で葉緑体内に輸送する必要に迫られた。そのシステムとして業総体タ
ターであるフィトクロームにより制御される (
D
o
b
r
c
s ct a
l
.
. 1987)
。光制御に関与するシ
ンパク質のアミノ末端には葉緑体への輸送を指示するタグであるトランジット配列が付加
ス凶チについては rbc
や cabにおいて詳しく調べられ、 GT-1ボックス (
G
r
e
e
neta
l
.
. 1987)
、
されている。トランジット配列は葉緑体膜上の朕タンパク質抜合体中のレセプタータンパ
Gボックス、 I
ボックス (
G
i
u
l
i
a
n
o et a
l
.， 1988)
、GATAボックス (
D
o
n
a
l
d an
d Cashmore
，
ク質に認識された後、複合体中の主にチャンネルタンパク質の働きにより前駆体は葉緑体
1
9
9
0
) などが報告されており、各々のシス因子に結合する転写制御タンパク質、 トランス
内へと輸送される(Sc
h
n
e
l
l eta
J
.， 1994)
。トランジット配列はストロマに存在するシグナ
因子も同定されている o 陸上高等植物の葉緑体型フェレドキシン遺伝子においても Gボッ
ルペプチダーゼ (
R
o
b
i
n
s
o
na
n
dE
l
l
i
s，1984，S
ua
n
dB
o
s
c
h
c
t
t
i，1
9
9
3
)によるプロセシングを
クス、 I
ボックス、 GATAボックスが見出されている (
V
o
r
討
e
ta
1
.
. 1
990，S
om
e
r
s et a
J
.，
1
9
9
0
)
。また陸上純物内での葉緑体型フェレドキシン遺伝子上流領域の比較から、共通し
て見出されるモチーフとして CCACボックス (
(
C
/A)
s
-TTT-(C/A
)
8
・S
omer
set a1
.， 1990)、
ARL 込~!.1 ch
L
c
a
d
c
r
， ACAAAA
，C
a
s
p
a
ra
n
dQ
u
a
i
l， 1
9
9
3
) が報告されている。また、
受けて除去され、成熟タンパク質が形成される。このようにトランジット配列は葉緑体タ
ンパク質を正確に葉緑体内へとソーテイングする極めて重要な役割を担っている o
今回渦鞭毛深類の葉緑体型フェレドキシンにおいても付加されているトランジット配列
と考えられる DNA塩基配列が明らかとなり、渦鞭毛深煩内ではその一次構造の相向性があ
Arabidopsist
h
a
l
i
a
n
aのfedAで、はその発現が転写後レベルでも制御されており (
V
or
s
teta1
.
，
る程度認められた。その一方で、渦鞭毛 t
菜類と陀上高等植物問での一次構造の相向性は全
1993)、緑色組織特異的な発現も認められている (
V
o
r
s
tcta
1
.，1990)。
く見られず、なおかつ渦鞭毛藻類のトランジット配列は高等植物に比べて 20・
25アミノ酸
渦鞭毛深績の葉緑体型フェレドキシン遺伝子においてこれらのシス因子のモチーフ配列
ほど長いことが明らかとなった o これは渦鞭毛深類のトランジット配列のアミノ末端に小
を検索した結果、 A. ta01arense OF151から GATAボックスと ARL、また P
. bi
pes
からは G
胞体朕通過シグナル配列が付加されていることによる。このようなトランジット配列中に
ボックス、 I
ボックス、 CCACボックス、 ARLとそれぞれ相向性を示す領域が見出された o
複数のシグナル配列が含まれる事象は高等柄物のチラコイド膜中の膜タンパク質やチラコ
また G
. po1
yed
r
aからはこれらのボックスのモチーフ配列は見出きれなかったが、その一方
イドルーメン内に存在するタンパク質でも認められる (
d
eB
o
e
ra
n
dW
e
i
s
b
e
e
k
，1
9
9
1
)
。例
で
・ 240-・
70 b
pに極めて A
C
r
i
c
hな領域が見出された。これらのシス因子様モチーフが実
えば、プラストシアニンやチトクローム fでは、
際に fedQ
の，岳写調節に機能しているか否かについては確認できていない。しかし、渦鞭毛
ラコイド膜通過シグナル配列が付加されている (
V
o
r
s
tc
ta
l
.，1
988，W
i
l
l
e
ye
ta
1
.，1984)
。
藻類においても葉緑体型フェレドキシンが光合成における電子伝達系における電子受容、
トランジット配列とチラコイド膜通過シグナルは、それぞれチラコイドタンパク質が葉緑
供与体として機能していることはおそらく間違いない。そのため光による転写調節が行わ
体!民、チラコイド膜を通過する際に機能しているとされている (
H
a
g
c
m
a
n et a
l
.， 1986，
50
5
1
トランジット配列のカルポキシ末端にチ
Jamesc
ta
J
.，1989，KoandCashmore，1989，KirwlI1 c
ta
l
.，1988，Smcckense
ta
J
.，1
9
8
6
)
。こ
極めて重要であることが指摘されている (Pilon c
ta
l
.， 1995)。渦鞭毛藻類のトランジット
れらのす~:たから類推すると、渦鞭毛藻類のトランジット配列におけるシグナル配列の付加
配列において以上の点を検討した結果、中央部のハイドロキシアミノ酸、プロリン残基の
が渦鞭毛深鎖の葉緑体朕俄造に関連している可能性が指摘できる。渦鞭毛藻類の葉緑体の
保イ子性、プロセシング部位モチーフに関しては陸上高等他物と同様認められた。しかしな
起源は、多 i
f
(共，
l
:
l説に基づき兵核光合成生物であると推測されているが、その根拠のひと
がら、アミノ末端付近の疎水性領域、トランジット配列のニ次構造に関わると予想される
つとして準げられるのが業総体の膜構造である。渦鞭毛藻類においては 2重膜構造を持つ
プロリン残基のトランジット配列上での位置といった点に関しては陸上植物との明瞭な類
葉紋体朕の外側によ~舷藻頒の食作用 (phagocyto s
is
) による取り込みと、その共生に由来す
似性は確認出来ない。また、葉緑体型フェレドキシンのトランジット配列間である程度保
るとされる来総体ERと呼ばれる小胞体様の膜構造が認められる。従って渦鞭毛藻類の葉
存されている疎水性プロフィールに関しても、陸上向等柏物と渦鞭毛 i
菜類の間で相向性は
緑体タンパク質は、~紋体へ輸送される際に葉緑体朕に加えて葉緑体ER を通過しなけれ
認められない。葉緑体型フェレドキシンのトランジット配列自体の情報も乏しく、捉・明さ
ばならない。渦鞭宅保知.のトランジット配列に認められるシグナル配列はおそらくこの葉
れているドメイン構造の性状に関しての信頼性に疑問が残ること、また渦鞭毛i
菜類の来総
緑 体ERの通過に関与していることと考えられる。同械に業総体ERが認められる珪藻類や
体!段上の輸送装置や朕構造、膜タンパク質に関する研究は皆無に等しいことから、現段階
ユーグレナ泳煩からもフコキサンチン-クロロフィル a/c
結合タンパク質 FCPやポルフォピ
で渦鞭毛猿類のトランジット配列についての議論を行うのは困難ではあるが、少なくとも
リノーゲンデアミナーゼ PBGDのトランジット配列にシグナル配列が存在することが示さ
渦鞭毛藻類のトランジット配列が高等植物と比べて特異であることは指摘できる。この特
れ、実際に来総体ERの通過に機能していることが示されている
異性が渦鞭毛藻類の葉緑体膜構造に由来するのか否か、渦鞭毛藻類の葉緑体の起源を考え
(Bhaya and Grossman，
1991，Kroth・
Pancic， 1995，Shashidharae
ta
l
.，1
9
9
2
)
。また、渦鞭毛藻 S
y
m
b
i
o
d
i
n
i
u
ms
p
.の
るとで興味深い。
ベリデイニンクロロフィ l
レa結合タンパク質 PCPで報告されているトランジット配列
(
N
o
r
r
i
sand M
i
l
l
c
r
，1
991) においても、 PSORTによる解析からシグナル配列の存在が予想
される。以とのことから、
トランジット配列へのシグナル配列の付加は、葉緑体ERを持
つ生物群に共通するトランジット配列構造と考えられる。
葉緑体型フェレドキシンのトランジット配列は、板性アミノ酸の分布や疎水性プロ
フィール、予怨される三次構造について検討することにより、そのドメイン構造が示され
ている (vonHcijncc
ta
J
.，1989，deBoerandWeisbeek，1991)。アミノ末端ドメインは極性
アミノ般の出現頻度が低く、高い疎水性を示す。中央ドメインはハイドロキシアミノ酸に
富み、ヘリックス構造を分断するとされるプロリン残基が保存されていることが特徴的で
ある。またカルポキシぷ端ドメインは β-strand構造を取る傾向にあり、またプロセシング
部位には(Ile/Val)X (Ala/Cys) のモチーフが認められる。人為的にトランジット配列領域
に欠失もしくは絡位突然変異を導入した突然変異前駆体タンパク質を用いた解析から、ア
ミノぷ端ドメインは葉緑体へのターゲティングと葉緑体膜上のレセプターとの結合に、中
央ドメインは来総体内への輸送に、またカ l
レボキシ末端ドメインはトランジット配列のプ
ロセシングに関与していることが示され、これらのドメインがトランジット配列の機能上
5
2
53
の分子系統とその遺伝子構造の解析
第 4章 総 括
渦鞭毛藻 Peridinium bipes、 AlexandriuD1 tamaJ'ensc OF151株
、 OF181株
、 Alexandrium
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品鞭毛凍頬は赤潮形成種や麻痔性員毒産生種を含むことから、その防除 という面で産業
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、 Gonyaulaxpolyedraのゲノム DNAから PCR、TAIL-PCRにより葉緑体
的に i
f
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型フェレドキシン遺伝子 fedQをその周辺領成も合めてクローニングし、その塩基配列を決
認められない抜分裂級式や染色体構造 を有することから、その系統学的、進化的位置付け
定した。 [cdQの温基配列から予惣されるアミノ般配列を用いて渦鞭毛藻類と他の真核生物
が議論されてきた。近年渦鞭毛藻類においてリポソーム RNAの塩基配列が報告され、分子
との分チ系統を解析した結果、従来の色ぷ組成に法づく分類体系やリボゾーム RNAを用い
進化学的凡地からその進化系統関係を構築する試みがなされている。しかしながら 、機能
物、特にある種の緑藻類と M
. polymorpha
た分子系統樹とは異なり、渦鞭毛藻類の緑色村i
タンパク賀、もしくは構造タンパク質をコードする遺伝子の温法配列についての報告は極
との近縁関係が示された。また、 5・末端側非翻訳領域にはプロモーターコンセンサスモ
めて乏しい。特に染色体の高次精進が極めて特異であることを#え合わせると、遺伝子の
チーフとして GCボックスは認められたが、 TATAボックス、 CAATボックスは確認され
発現制御に大きく関わっていると考えられるイントロンやプロモータ}、エンハンサーと
ず、プロモーター構造の特殊性が予想された。転写制御を司るシス因子を検索した結果、
いった遺伝 f榊近も他の真核生物とは異なっている可能性もあり、緩めて興味深い。本研
フェレドキシンに共通して見出される ARL、CCACボックスに加えて光発現制御に機能す
究では、渦鞭毛探知の点核生物内における進化系統関係を明らかにするとともに、 その遺
るシス因子Gボックスと I
ボックスが確認され、渦鞭毛j
i
長類のフェレドキシンも光によりそ
伝子構造の特徴について解析す ることを目的に、渦鞭毛藻類数種より塩基性核タンパク質
の発現が制御されていることが示唆された。業総体への移行シグナルであるトランジット
HCcをコードする i
l
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伝j
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1と葉緑体型フェレドキシンをコードする遺伝子 fcdQ
各領域の
配列が渦鞭毛藻類のフェレドキシンにおいても認め られ、それに加えてそのアミノ末端に
塩基配列を決定した。以下にその概要を示す。
シグナル配列の付加が予想され、渦鞭毛藻類の葉緑体多量共生に由来する葉緑体膜構造と
の関述が示唆された。
Crypthecodiniumc
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からの ヒストン様塩基性核タンパク質ト{
Ccを コードする遺伝子
以ヒ、機能タンパク質のアミノ酸配列から見た渦鞭毛藻類の分子系統、遺伝子構造から
のクローニングとその遺伝子情造解析
既に報告されている Crypthecodin
ium cohnii
のヒストン機核タンパク質 HCc1をコードす
c
1と[edQを指標に解析した o 葉緑体型フェレドキシン
見た渦鞭毛藻類の特殊性について hc
る遺伝 j
こh
cclのcDNA
塩法配列をもとにプライマーを設定し、 PCR、 i
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を指標にした分子系統関係の解析は従来から行われてきたが、そのアミノ酸配列の保存性
ノム DNA から)~辺領域を合む hcc1 の増幅とその塩基配列の決定を行った o その結果、 hcc1
が極めて高いことから比較的近縁な生物群の 1-0の系統関係について表現し得ない可能性が
はゲノム上に波数コピー存在し、その各々がタンデムに~þ.んだ multigenc
ある。渦鞭毛藻類のたどった進化の道筋をより明確に示すために、より多くの分子進化
f
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yを形成す
mいた解析が期待される。また、遺伝子併進に関しては、本研究も合め
箇所にイントロンの挿入が認められることが示された。イントロンには真核生
ること、 1
マーカー遺伝子を
物のスプライセオソームイントロンに認められるエクソンとの境界領域や b
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c
1のイントロンスプライシング機
モーターコンセンサス配列か存在しないことから、 hc
渦鞭毛謀類と近縁であると指摘されているアピコンプレクサや繊毛虫類には認められな
構、転写開始システムの特殊性が指摘された o
い。むしろ渦鞭毛i
菜類はユーグレナ藻類に類似の特性を示している。渦鞭毛藻類の遺伝子
榊造についてその特殊性を結論づけるにはより多くの機能タンパク質、構造タンパク質を
渦純毛藻類の葉緑体型フェレドキシンをコードする遺伝子の塩基配列から見た渦鞭毛藻類
54
コードする遺伝子の塩基配列情報の蓄積とその解析が待たれるが、少なくとも渦鞭毛藻類
55
の系統関係については その校榊造
、 遺伝子構 造も含めてよ り多面的な解析が必要であり、
また そのf
拝析 を進 めることによって渦鞭毛謀知の特殊性がより明確に指摘出来る可能性が
ある。
Summary
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. 153.168、点京科
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.153'160、秀潤社
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細胞工学別冊拙物細胞工学シリーズ 5、植物のゲノ
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著者関連文献)
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謝辞
本研究を行うに当たり、終始ご懇切なご指導とご鞭捷を賜りました京都大学農学研究科
海洋微生物学講座
内田
有恒教授に心から感謝申し上げます。また、絶えずご懇切なご
指導とともに、暖かいご激励をいただいた京都大学名誉教授石田
祐三郎先生に感謝の
意を表します。更に、研究を展開するにあたって適切、有益なご助言をいただいた、海洋
微 生 物 学 講 座 左 子 芳 彦 助 教 授 、 背 永 有S
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生助手、並びに、貴重な藻体試料を提供して
くださった、鹿児島大学水産学部前田
広人講師に感謝の意を表します。
最後に、実験に熱心に協力していただいた大学院生
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滝下
清貴氏に感謝いたします。