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抗パブ2003
2.6.1 緒言 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 サイラムザ点滴静注液 100 mg サイラムザ点滴静注液 500 mg 2.6.1 緒言 日本イーライリリー株式会社 2.6.1 緒言 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 目次 2.6.1 緒言 ............................................................................................................................. 2 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.1 緒言 略語一覧 ADCC ADSC Ang AUC Biacore BLQ BSC CDC CEP CL cLEC Cmax EC50 ECFC ECL EGFR ELISA FITC Flk Flt-1 FSH GLP HE HIF-1 HRP IC50 ICH Ig Ig D3 ISR Kd KDR KLH koff kon NOAEL PBS Repeated Measures ANOVA Rmax SD T/C% t1/2 tmax TMB Vd VEGF VEGFR Vss Vz 抗体依存性細胞障害活性 脂肪由来幹細胞 アンジオポエチン 血清中又は血漿中濃度－時間曲線下面積 表面プラズモン共鳴分析法 定量限界未満 Best supportive care 補体依存性細胞障害 循環血管内皮前駆細胞 クリアランス Collecting lymphatic endothelial cell 最高血清中又は血漿中濃度 50%効果濃度 血管内皮前駆細胞 Electrochemiluminescence 上皮成長因子受容体 酵素免疫測定法 フルオレセインイソチオシアネート Fetal liver kinase Fms-like tyrosine kinase 1 卵胞刺激ホルモン 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 ヘマトキシリン・エオジン Hypoxia-inducible factor 1 Horseradish peroxidase 50%阻害濃度 日米 EU 医薬品規制調和国際会議 免疫グロブリン Immunoglobulin-like extracellular domain 3 Incurred sample reanalysis 解離定数 Kinase insert domain-containing receptor Keyhole limpet hemocyanin 解離速度定数 結合速度定数 無毒性量 リン酸緩衝生理食塩液 反復測定分散分析 最大結合量 標準偏差 対照群（C）に対する被験薬群（T）の腫瘍体積又は重量の比 消失半減期 最高血漿中濃度到達時間 Tetramethylbenzidine 分布容積 血管内皮増殖因子 血管内皮増殖因子受容体 定常状態における分布容積 終末相の分布容積 1 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.1 2.6.1 緒言 緒言 ラムシルマブは、血管内皮増殖因子受容体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2：VEGFR-2）に対する遺伝子組換えヒト免疫グロブリン G1（immunoglobulin G1： IgG1）モノクローナル抗体である。 ラムシルマブは、血管新生に重要な VEGF（VEGF-A、VEGF-C 及び VEGF-D）の VEGFR-2 への結合を阻害する（評価資料 IMC04; 参考資料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003）。 その結果、ラムシルマブは VEGFR-2 及びその下流の細胞内シグナル伝達の活性化を阻 害し、ヒト内皮細胞の増殖及び遊走を阻害する（参考資料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003; 参考資料 Miao 2006; 参考資料 Goldman 2007; 参考資料 Tvorogov 2010）。 ラムシルマブの固形癌治療における有用性を評価するための臨床開発が、用量、投与 スケジュール及び安全性を評価する第 I 相試験から開始された。臨床開発は、VEGF-A を含む各種 VEGF リガンド及び VEGFR-2 が過剰発現している腫瘍やアンメット・メデ ィカル・ニーズの高い腫瘍に重点を置いた。今回の製造販売承認申請における主要な臨 床試験は、I4T-IE-JVBE（IMCL CP12-0922、RAINBOW）試験（以下、JVBE 試験）及び I4T-IE-JVBD（IMCL CP12-0715、REGARD）試験（以下、JVBD 試験）であり、一次化 学療法の施行中又は施行後に増悪の認められた進行（転移性又は局所進行の切除不能 な）胃又は胃食道接合部腺癌患者を対象に、ラムシルマブ+パクリタキセル併用群とプ ラセボ+パクリタキセル併用群及びラムシルマブ+ best supportive care（BSC）群とプラセ ボ+ BSC 群の有効性及び安全性をそれぞれ比較した。 JVBE 試験は、国際共同無作為化二重盲検比較試験であり、統計学的に有意かつ臨床 的に意義のある有効性と忍容かつ管理可能な安全性プロファイルを示した。JVBE 試験 では、日本人 140 例を含む 665 例（未投与例 9 例）の被験者がラムシルマブ+パクリタキ セル併用群とプラセボ+パクリタキセル併用群に割付比 1:1 で無作為に割り付けられた。 治験薬の投与は、原疾患の増悪や許容できない毒性が認められるか同意が撤回されるま で、又は他の中止基準に該当するまで続けられた。 JVBE 試験は、進行胃又は胃食道接合部腺癌患者を対象とした 2 番目の無作為化第 III 相試験であった。この対象疾患に対してラムシルマブの有効性が示された最初の試験は JVBD 試験であった。JVBD 試験では、一次化学療法後に増悪の認められた進行胃又は胃 食道接合部腺癌患者を対象に、ラムシルマブ+ BSC 群とプラセボ+ BSC 群の有効性及び 安全性を比較した。JVBD 試験では、355 例（未投与例 4 例含む、日本人不参加）の被験 者がラムシルマブ+ BSC 群とプラセボ+ BSC 群に割付比 2:1 で無作為に割り付けられた。 治験薬の投与は、原疾患の増悪や許容できない毒性が認められるか同意が撤回されるま で、又は他の中止基準に該当するまで続けられた。試験の結果、統計学的に有意かつ臨 床的に意義のある有効性が示され、安全性プロファイルは忍容できるものであり、発現 した有害事象はプラセボ投与時と類似していた。 各国規制当局への申請及び承認状況（2014 年 12 月時点）について、ラムシルマブの 単独投与は、米国にて fast track に指定された後、2013 年 8 月、JVBD 試験の結果等に基 づいて、米国及び EU で一次化学療法後に増悪の認められた進行胃又は胃食道接合部腺 癌の適応にて承認申請を行った。米国では、優先審査にて 2014 年 4 月、EU では 2014 年 2 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.1 緒言 12 月にそれぞれ承認を取得した。また、ラムシルマブとパクリタキセルの併用投与につ いて、EU では 20 年 月、米国では 2014 年 5 月に JVBE 試験の結果等に基づいて、一 次化学療法後に増悪の認められた進行胃又は胃食道接合部腺癌の適応にて承認申請を行 い、EU では 2014 年 12 月、米国では 2014 年 11 月にそれぞれ承認を取得した。その他、 胃癌の単独投与及びパクリタキセルとの併用投与について、 （20 （20 年 月）、 年 9 月）、 （20 （20 年 月）、 年 月）及び （20 年 月）、 （20 年 月）、 （20 年 月）で承認申請を行っ た。なお、胃癌以外に、米国では、2014 年 6 月に非小細胞肺癌に対するドセタキセルと の併用投与の承認申請も行い、2014 年 12 月に承認を取得した。 今回、日本では、JVBD 試験、JVBE 試験の結果等に基づいて、胃癌を対象とする製造 販売承認申請を行うこととした。 日本の申請時点において、胃癌以外に、肺癌におけるドセタキセル併用投与［I4TMC-JVBA 試験（IMCL CP12-1027、REVEL）］及び直腸結腸癌における FOLFIRI（ロイ コ ボ リ ン 、 5- フ ル オ ロ ウ ラ シ ル 及 び イ リ ノ テ カ ン ） 併 用 投 与 ［ I4T-MC-JVBB 試 験 （IMCL CP12-0920、RAISE）］の第 III 相試験の結果が得られており、いずれも主要評 価項目である全生存期間が有意に延長することが認められた。一方、乳癌におけるドセ タキセル併用投与［I4T-IE-JVBC 試験（IMCL CP12-0606、ROSE）］及び肝細胞癌にお ける単独投与［I4T-IE-JVBF 試験（IMCL CP12-0919、REACH）］の第 III 相試験では主 要評価項目を達成できなかった。 3 2.6.2 薬理試験の概要文 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 サイラムザ点滴静注液 100 mg サイラムザ点滴静注液 500 mg 2.6.2 薬理試験の概要文 日本イーライリリー株式会社 2.6.2 薬理試験の概要文 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 目次 2.6.2 薬理試験の概要文 ..................................................................................................... 1 2.6.2.1 まとめ ................................................................................................................. 1 2.6.2.2 効力を裏付ける試験 ......................................................................................... 2 2.6.2.2.1 In Vitro 薬効薬理試験 ................................................................................ 2 2.6.2.2.1.1 ラムシルマブを用いた In Vitro 薬効薬理試験 ....................................... 2 2.6.2.2.1.1.1 ラムシルマブの In Vitro 結合試験 ................................................... 4 2.6.2.2.1.1.2 VEGF-C 及び-D の VEGFR-2 への結合に対するラムシルマブ の作用 ................................................................................................. 8 2.6.2.2.1.1.3 ラムシルマブの細胞機能に対する作用.......................................... 9 2.6.2.2.1.1.4 ラムシルマブによる VEGFR-2 の内在化 ..................................... 14 2.6.2.2.1.1.5 ラムシルマブのエフェクター活性 ............................................... 15 2.6.2.2.1.1.6 ラムシルマブのエピトープ ........................................................... 17 2.6.2.2.1.2 DC101 を用いた In Vitro 薬効薬理試験................................................. 18 2.6.2.2.1.2.1 DC101 の In Vitro 結合試験 ............................................................ 18 2.6.2.2.1.2.2 DC101 の細胞機能に対する作用 ................................................... 20 2.6.2.2.2 In Vivo 薬効薬理試験 .............................................................................. 21 2.6.2.2.2.1 作用機序に関する試験 ........................................................................... 21 2.6.2.2.2.2 ヒト癌のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍効果 ...... 25 2.6.2.2.2.2.1 試験方法及びデザインの概要 ....................................................... 25 2.6.2.2.2.2.2 ヒト膵臓癌マウス異種移植モデルを用いた Proof-of-Concept 試験 ................................................................................................... 25 2.6.2.2.2.2.3 ヒト胃癌のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍 効果 ................................................................................................... 27 2.6.2.2.2.2.3.1 DC101 の単独投与試験........................................................... 27 2.6.2.2.2.2.3.2 DC101 とパクリタキセルの併用投与試験 ........................... 28 2.6.2.2.2.2.4 胃癌以外のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍 効果 ................................................................................................... 30 2.6.2.3 副次的薬理試験 ............................................................................................... 30 2.6.2.4 安全性薬理試験 ............................................................................................... 30 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用 ................................................................................... 30 2.6.2.6 考察及び結論 ................................................................................................... 30 2.6.2.7 図表 ................................................................................................................... 32 2.6.2.8 参考文献 ........................................................................................................... 32 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 2.6.2.1 2.6.2 薬理試験の概要文 薬理試験の概要文 まとめ ラムシルマブはヒト血管内皮増殖因子受容体 2［vascular endothelial growth factor receptor 2：VEGFR-2（別称は kinase insert domain-containing receptor：KDR）］に対する 遺伝子組換えヒト免疫グロブリン G1（immunoglobulin G1：IgG1）モノクローナル抗体 である。ラムシルマブは 4 本のポリペプチド鎖［各々2 本の同一重鎖（446 アミノ酸）及 び軽鎖（214 アミノ酸）］から構成され、Fc 領域に 1 ヵ所、N-結合型グリコシル化部位 を有する。 ラムシルマブの薬理学的特性を明らかにする目的で、VEGFR-2 に対する結合能、選択 性及びリガンド刺激による活性化に対する阻害能を in vitro で評価した。ラムシルマブは マウス VEGFR-2 とは交差反応しないため、マウスを用いて血管新生阻害作用や抗腫瘍 効果を検討した in vivo 試験にはマウス VEGFR-2 に阻害作用を示す DC101 をサロゲート 抗体として用いた。 ラムシルマブを用いた薬効薬理試験で得られた主な成績を以下に示す。 ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に高い親和性で結合し［解離定数：0.01 nM（評価資 料 1001- ）～0.05 nM（参考資料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003）］、VEGF-A（一般 的に VEGF と呼称される）の VEGFR-2 への結合を強く阻害した［50%阻害濃度：約 0.8 nM（参考資料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003）］。 ラムシルマブは VEGFR-1 及び VEGFR-3 とは交差反応せず（評価資料 IMC01）、評 価した他の増殖因子受容体型チロシンキナーゼにも交差反応性を示さなかった（評 価資料 PT-1202）。 In vitro 試 験 に お い て 、ラ ム シ ル マ ブ は ヒ ト VEGFR-2 に 結 合 し た が 、 マ ウ ス VEGFR-2 には明らかな結合性を示さなかった（評価資料 1001- ）。ラムシルマブ は同程度の親和性でヒト及びサルの VEGFR-2 に結合した（評価資料 bTDR275）。 ラムシルマブは VEGF-C 及び VEGF-D のヒト VEGFR-2 への結合も阻害した（評価 資料 IMC04）。 ラムシルマブは VEGF 刺激による VEGFR-2 自己リン酸化を阻害し（参考資料 Lu 2003）、VEGF による血管内皮細胞増殖（参考資料 Zhu 2003）及びヒト白血病細胞 遊走を阻害した（参考資料 Zhu 2003）。 DC101 を用いた薬効薬理試験で得られた主な成績を以下に示す。 DC101 はマウス VEGFR-2 に結合したが、ヒト VEGFR-2 には結合性を示さなかった （評価資料 1001- ）。 DC101 はマウス VEGFR-2 のシグナル伝達を阻害した（参考資料 Rockwell 1995）。 DC101 の担癌マウスへの投与で腫瘍の微小血管密度の減少及び腫瘍増殖抑制が見ら れ、ラムシルマブの抗腫瘍効果における血管新生阻害作用の関与が示唆された（参 考資料 Franco 2006）。 ヒト膵臓癌マウス異種移植モデルにおいて、DC101 は 18 g/mL 以上の血清中濃度を 1 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 もたらす用量で有意な抗腫瘍効果を示した（評価資料 2212- ）。 17 種の胃癌患者由来腫瘍組織片を用いたマウス異種移植モデルのうち 7 種において、 DC101 を投与することにより統計学的に有意かつ 50%以上の腫瘍増殖抑制が見られ た（評価資料 5538- ）。 ヒト胃癌細胞株を用いたマウス異種移植モデルにおいて、DC101 又はパクリタキセ ルの単独投与で顕著な腫瘍増殖抑制が見られたが、併用投与では明らかな相加作用 は認められなかった（評価資料 5569- ）。両薬剤の用量を減量したところ、統計 学的有意差は認められなかったが、併用投与による相加作用を示唆する結果が得ら れた（評価資料 5634 ）。 DC101 は胃癌以外の癌を用いた担癌モデルにおいても有効性を示した（試験一覧を Appendix A に示す）。 ラムシルマブの安全性薬理評価で見られた主な成績を以下に示す。 サルにおける毒性試験で、安全性薬理パラメータに特記すべき所見はなかった（評 価資料 1163-110）。 以上、ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に特異的かつ高い親和性で結合し、VEGF による VEGFR-2 の活性化、シグナル伝達及び血管内皮細胞の応答を阻害することが示された。 担癌マウスを用いた検討では、DC101 の投与による血管新生阻害作用及び抗腫瘍効果が 認められた。これらの成績は、胃癌患者へのラムシルマブ投与の妥当性を支持するもの であった。 2.6.2.2 効力を裏付ける試験 ラムシルマブ及び DC101（抗げっ歯類 VEGFR-2 抗体、ラムシルマブのサロゲート抗 体として使用）の VEGFR-2 に対する結合特性及び VEGF の受容体活性化作用に対する 阻害能を各種 in vitro 試験で評価した。また、ラムシルマブの胃癌に対する有効性を裏付 ける目的で、マウス担癌モデルにおける DC101 の効果を評価した。 2.6.2.2.1 2.6.2.2.1.1 In Vitro 薬効薬理試験 ラムシルマブを用いた In Vitro 薬効薬理試験 ラムシルマブ（IMC-1121B）はヒト VEGFR-2 に対して拮抗作用を有するモノクローナ ル抗体（2C6）を親抗体とする親和性成熟を経て産生された（Lu 2002）。最初にヒト Fab フラグメントのナイーブファージディスプレイライブラリを用いた検討から、ヒト VEGFR-2 に高い親和性を示す Fab として 2C6 Fab を同定した（de Haard 1999）。次いで、 チェーンシャッフリング法を用いた親和性成熟を経て、VEGFR-2 への結合親和性が 30 倍以上高いクローン（1121 Fab）を見いだした（参考資料 Lu 2003）。完全長の IgG 抗体 （IMC-1121）を得るため、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをクローン化し、そ れぞれヒト IgG1 定常領域及びヒト κ 定常領域をコードする遺伝子配列と遺伝子融合させ た。ラムシルマブは IMC-1121 とアミノ酸配列が同一であるが、発現ベクターからイン 2 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 トロンが除去されている。ラムシルマブは安定なマウス骨髄腫細胞株（NS0）から発現 させた。 ラムシルマブを用いた in vitro 薬効薬理試験の一覧を表 2.6.2-1 に示す。これらの試験 から得られたデータにより、ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に選択的かつ高い親和性を 有し、血管新生時に重要な VEGFR-2 の活性化並びにその下流のシグナル伝達を強力に 阻害することが示唆された。 表 2.6.2-1 ラムシルマブの In Vitro 薬効薬理試験の一覧 試験目的 結合能/阻害 能の評価 受容体選択 性の評価 リガンド選 択性の評価 細胞機能の 評価 受容体内在 化の評価 評価項目 ヒト VEGFR-2 への結合能 評価系 Biacore HUVEC 資料 参考資料 Lu 2003 参考資料 Zhu 2003 評価資料 1001評価資料 1001参考資料 Lu 2003 参考資料 Zhu 2003 参考資料 Zhu 2003 ELISA 評価資料 PT-1202 ELISA Biacore 評価資料 IMC01 評価資料 bTDR275 ELISA 評価資料 IMC04 ヒトリンパ管内皮細胞 参考資料 Goldman 2007 ヒト皮膚微小血管内皮 細胞 HSaVEC を用いた in situ PLA アッセイ HUVEC 及び PAE-KDR 細胞 PAE-KDR 細胞 参考資料 Tvorogov 2010 参考資料 Miao 2006 HUVEC 参考資料 Zhu 2003 HL60 及び HEL 細胞 参考資料 Zhu 2003 PAE-KDR 細胞並びにヒ ト大動脈内皮細胞及び 皮膚微小血管内皮細胞 の初代培養細胞 評価資料 IMC02 ELISA ELISA VEGF のヒト VEGFR-2 への結合 に対する阻害能 125I-VEGF の VEGFR-2 陽性細胞 への結合に対する阻害能 他の増殖因子受容体型チロシン キナーゼへの結合能 VEGFR-1、-2、-3 への結合能 ヒト、サル、ウサギ及びイヌの VEGFR-1、-2、-3 への結合能 VEGF-C 及び-D の VEGFR-2 へ の結合に対する阻害能 VEGF-C の内皮細胞増殖に対す る阻害能 VEGF-C の内皮細胞発芽に対す る阻害能 VEGF-C の VEGFR ヘテロ二量体 形成に対する阻害能 VEGF の VEGFR-2 リン酸化に対 する阻害能 VEGF のカルシウム動員に対す る阻害能 VEGF の内皮細胞増殖に対する 阻害能 VEGF の白血病細胞遊走に対す る阻害能 VEGFR-2 のダウンモジュレーシ ョン 参考資料 Nilsson 2010 参考資料 Lu 2003 略 号 ： Biacore 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 分 析 法 、 ELISA 酵 素 免 疫 測 定 法 、 HUVEC ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞 、 HSaVEC ヒト伏在静脈内皮細胞、in situ PLA アッセイ in situ 近接ライゲーションアッセイ、PAE-KDR 細胞 ヒ ト VEGFR-2 を遺伝子導入したブタ大動脈内皮細胞 3 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2.2.1.1.1 2.6.2 薬理試験の概要文 ラムシルマブの In Vitro 結合試験 評価資料：1001- （4.2.1.1.3）、PT-1202（4.2.1.1.4）、IMC01（4.2.1.1.5）、bTDR275（4.2.1.1.6） 参考資料：Lu 2003（4.2.1.1.1）、Zhu 2003（4.2.1.1.2）、Franklin 2011（4.2.1.1.7） Biacore（表面プラズモン共鳴分析法）を用いた検討におけるラムシルマブのヒト VEGFR-2 に対する解離定数（Kd）は約 0.05 nM であった（参考資料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003）。親抗体（IMC-2C6）と比較したところ、ラムシルマブの Kd は IMC-2C6 の 約 1/4 であり、また、1121 Fab の Kd は 2C6 Fab の約 1/36 であった（参考資料 Lu 2003; 表 2.6.2-2）。Biacore を用いた別の検討におけるラムシルマブのヒト VEGFR-2 への Kd は 0.01 nM であった（評価資料 1001- ）。ELISA（酵素免疫測定法）を用いた検討でも ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に結合し、その 50%効果濃度（EC50）は 0.16 nM であっ た（評価資料 1001- ）。 表 2.6.2-2 ラムシルマブのヒト VEGFR-2 に対する結合親和性 抗体 2C6 Fab *k (104 M-1S-1) 17.1 5.7 *k (10-4 S-1) 5.5 0.76 on off *†Kd (nM) 3.6 1.7 1121 Fab 29.6 7.3 0.30 0.06 0.10 0.02 IMC-2C6 21.2 8.1 0.43 0.03 0.20 0.01 ラムシルマブ 47.9 2.4 0.25 004 0.05 0.01 略号：Kd 解離定数、kon 結合速度定数、koff 解離速度定数 † k を k で除した値を算出し、その平均値を Kd とした。 off on * データは 3 回以上の測定の平均値±標準誤差で示す。 参考資料 Lu 2003 の表 3 を転載。 ラムシルマブのヒト VEGFR-2 に対する結合能及び阻害能を ELISA で評価したところ、 50%阻害濃度（IC50）は約 0.8 nM であった（参考資料 Lu 2003; 図 2.6.2-1、参考資料 Zhu 2003）。Biacore での結果と一致し、その作用は親抗体 2C6 よりも強かった。 4 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 酵素免疫測定法での検討。縦軸は 405 又は 450 nm での吸光度を示す（平均値±標準偏差、triplicate で 3 回以上実 施）。IMC-1H4 は別の抗 VEGFR-2 抗体であり、比較対照に用いた。VEGF の VEGFR-2 への結合阻害に関する IC50 はラムシルマブ（IMC-1121）、IMC-2C6 及び IMC-1H4 でそれぞれ約 0.8、1.2 及び 6.2 nM であった。参考資料 Lu 2003 の図 4 を転載。 図 2.6.2-1 ラムシルマブ（IMC-1121）のヒト VEGFR-2 への結合能(A)及び VEGF の VEGFR-2 への結合に対する阻害能(B) ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いて、125I 標識 VEGF の VEGFR-2 への結合に 対する抗 VEGFR-2 抗体（ラムシルマブ、IMC-1C11 及び IMC-2C6）の競合阻害反応を検 討した（参考資料 Zhu 2003; 図 2.6.2-2）。いずれの抗 VEGFR-2 抗体も VEGFR-2 への 125I 標識 VEGF 結合を阻害したが、陰性対照として用いた IMC-C225［セツキシマブ、抗 ヒト上皮成長因子受容体（EGFR）抗体］は明らかな阻害を示さなかった。 5 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 125I-VEGF bound (cpm) 2000 1500 1000 IMC-1C11 IMC-2C6 IMC-1121 IMC-C225 500 0.1 1 10 Antibody concentration (nM) データは平均値±標準偏差で示す（triplicate）。種々濃度の抗 VEGFR-2 抗体を 125I 標識 VEGF と混合し、プレート 内でサブコンフルエントにまで増殖させたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に添加した。プレートを室温で 2 時間 インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）で洗浄後、細胞に結合した 125I 標識 VEGF の量を定量した。参 考資料 Zhu 2003 の図 2a を転載。 図 2.6.2-2 125I-VEGF のヒト内皮細胞発現 VEGFR-2 への結合に対するラムシルマブ （IMC-1121）の阻害能 ELISA により、ヒト VEGFR-2 に対するラムシルマブの結合能をヒト VEGFR-1、ヒト VEGFR-3、並びに他の増殖因子受容体型チロシンキナーゼに対する結合能と比較したと ころ、ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に対する高い特異性を示した（評価資料 PT-1202; 図 2.6.2-3）。抗ヒト EGFR 抗体である IMC-C225（セツキシマブ）は EGFR に結合した が、VEGFR-2 を含む他の受容体には結合しなかった。ELISA を用いた別の試験でも、ラ ムシルマブは VEGFR-2 に特異的に結合し、VEGFR-1 及び VEGFR-3 には明らかな結合性 を示さなかった（評価資料 IMC01）。 6 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 酵素免疫測定法での検討。縦軸は 450 nm での吸光度を示す。青、赤、黒のバーはそれぞれラムシルマブ（1121B）、 IMC-C225 及び PBS を示す。評価資料 PT-1202 の図 1 を転載。 図 2.6.2-3 増殖因子受容体パネルを用いたスクリーニングアッセイにおけるラムシル マブの VEGFR-2 への結合特異性 第 2.6.2.2.1.2.1 項に示すように、ラムシルマブのマウス VEGFR-2 に対する結合能は低 いこと（評価資料 1001- ）から、マウスを用いた in vivo 試験にはマウス VEGFR-2 に阻 害作用を示す DC101 をサロゲート抗体として用いる必要があった。ラムシルマブは構造 的にヒト VEGFR-2 の immunoglobulin-like extracellular domain 3（Ig D3）に結合すること が判明しており（参考資料 Franklin 2011）、エピトープも明らかにされている。図 2.6.2-4 に示すとおり、ラムシルマブのエピトープはヒトとサルの間で完全に一致してい る（Ig D3 配列での唯一の相違はアミノ酸 234 位のイソロイシンとバリンの同類置換であ るが、これはエピトープに含まれない） アミノ酸番号は NCBI リファレンス配列（NP_002244.1）に準じ、IMC-1121B Fab のエピトープを決定した文献（参 考資料 Franklin 2011）で用いた番号に対応している。ラムシルマブのエピトープ（赤）はヒトとサルの間で完全に 一致しており、Ig D3 配列での唯一の相違はアミノ酸 234 位のイソロイシンとバリンの同類置換（緑）である。 図 2.6.2-4 ヒト及びカニクイザルにおける VEGFR-2 Ig D3 のアミノ酸配列 7 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 Biacore を用いて、ヒト、カニクイザル、ウサギ及びイヌの VEGFR-2 に対するラムシ ルマブの親和性を検討したところ（評価資料 bTDR275）、ヒト及びサルの VEGFR-2 に 対するラムシルマブの親和性は同程度で、ウサギ及びイヌの VEGFR-2 に対する親和性 はより低かった（表 2.6.2-3）。なお、評価資料 bTDR275 で得られた Kd は 3.5 nM であっ たが、第 2.6.2.2.1.1.1 項に示した Kd は 0.05 あるいは 0.01 nM であった（参考資料 Lu 2003 及び評価資料 1001- ）。評価資料 bTDR275 の目的は各動物種の VEGFR-2 に対す るラムシルマブの親和性を比較することであったため、より比較に適切な試験方法を用 いた。これが評価資料 bTDR275 で得られた Kd が他の試験で得られた値と大きく異なる 結果になった原因と考えられる。 表 2.6.2-3 ラムシルマブのヒト、カニクイザル、ウサギ及びイヌの VEGFR-2 に対す る結合親和性 ラムシルマブ ヒト VEGFR-2 カニクイザル VEGFR-2 ウサギ VEGFR-2 イヌ VEGFR-2 *k on (1/Ms) *k off 2.8 0.1 x 104 4.0 0.1 x 104 4.0 0.1 x 104 5.1 0.1 x 104 (1/s) 1.0 0.1 x 10-4 0.97 0.03 x 10-4 3.6 0.1 x 10-4 1.9 0.2 x 10-2 *†Kd (nM) 3.5 0.1 2.7 0.1 9.1 0.2 370 50 略号：Kd 解離定数、kon 結合速度定数、koff 解離速度定数 † koff を kon で除した値を算出し、その平均値を Kd とした。 * データは 3 回の測定の平均値±標準誤差で示す。 評価資料 bTDR275 の表 1 を転載。 以上、ラムシルマブは VEGFR-2 に特異的かつ高い親和性で結合し、VEGF の VEGFR2 への結合を効果的に阻害することが示唆される。 2.6.2.2.1.1.2 VEGF-C 及び-D の VEGFR-2 への結合に対するラムシルマブの作用 評価資料：IMC04（4.2.1.1.8） 参考資料：Goldman 2007（4.2.1.1.9）、Tvorogov 2010（4.2.1.1.10）、Nilsson 2010（4.2.1.1.11） VEGF-A（一般的に VEGF と呼称される）は VEGFR-2 の主要リガンドであるが、N 及 び C 末端切断を受けた VEGF-C 及び VEGF-D も VEGFR-2 を活性化させる。そこで、こ れらリガンドのヒト VEGFR-2 への結合に対するラムシルマブの阻害能を in vitro で評価 した（評価資料 IMC04）。ラムシルマブは可溶性 VEGFR-2 細胞外ドメイン（VEGFR-2Fc）に対する VEGF-A、VEGF-C 及び VEGF-D の結合を濃度依存的に阻害した（図 2.6.2-5）。IC50 はそれぞれ 2.3、0.7 及び 0.3 nM で、VEGFR-2 の各リガンドに対する親和 性 の 序 列 （ VEGF-AVEGF-CVEGF-D ） と 一 致 し た 。 一 方 、 陰 性 対 照 の IMC-3C5 （VEGF-C 及び VEGF-D の主要受容体 VEGFR-3 に対し拮抗作用を示す抗体）は明らかな 作用を示さなかった。なお、本試験における VEGF-A の VEGFR-2 への結合に対するラ ムシルマブの阻害作用の IC50 は、ELISA で評価した参考資料 Lu 2003 での値（0.8 nM） の約 3 倍であるが、この差は試験法の違いを反映している可能性がある。 8 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 酵素免疫測定法での検討。縦軸は 405 nm での蛍光強度を示す。ラムシルマブ（IMC-1121B）は VEGFR-2-Fc への VEGF-A（A）、VEGF-C（B）及び VEGF-D（C）の結合を濃度依存的に阻害した。陰性対照抗体（IMC-3C5）は明 らかな作用を示さなかった（○で囲ったシンボルで示す）。各リガンド結合に対するラムシルマブの阻害能を最大 結合に対する%値として D に示した。 96 ウェルプレートに VEGFR-2-Fc を添加し、翌朝、洗浄により非結合受容体を除去した。ラムシルマブ希釈液を各 終濃度の 2 倍濃度で調製し、ブロッキング緩衝液で終濃度（0.2 g/mL）の 2 倍濃度に調製したビオチン化リガンド （VEGF-A、VEGF-C 又は VEGF-D）と混合した。VEGFR-2-Fc をコートしたプレートにラムシルマブ/リガンド混合 液を添加し 2 時間反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン－Horseradish Peroxidase（HRP）を 1 時間処理し、HRP 基質による発光により結合したビオチン化リガンドを検出した。評価資料 IMC04 の図 1 を転載。 図 2.6.2-5 VEGF-A、-C 及び-D のヒト VEGFR-2-Fc への結合に対するラムシルマブの 阻害能 その他、ラムシルマブの VEGF-C に対する作用については、VEGF-C の内皮細胞活性 化（発芽、増殖）を阻害すること（参考資料 Goldman 2007; 参考資料 Tvorogov 2010）、 VEGF-C による VEGFR-2 と VEGFR-3 のヘテロ二量体形成を阻害すること（参考資料 Nilsson 2010）も報告されている。 2.6.2.2.1.1.3 ラムシルマブの細胞機能に対する作用 参考資料：Lu 2003（4.2.1.1.1）、Zhu 2003（4.2.1.1.2）、Miao 2006（4.2.1.1.12） ラムシルマブの細胞機能に対する作用を評価した、以下に詳述する試験成績（参考資 料 Lu 2003; 参考資料 Zhu 2003; 参考資料 Miao 2006）から、ラムシルマブは血管内皮細胞 の VEGFR-2 を阻害することで血管新生を阻害することが示唆されている。 VEGF 刺激による VEGFR-2 自己リン酸化に対するラムシルマブの阻害作用を図 2.6.2-6 に示す（参考資料 Lu 2003）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）及びヒト VEGFR-2 を 遺伝子導入したブタ大動脈内皮細胞（PAE-KDR 細胞）を VEGF で刺激すると VEGFR-2 9 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 の顕著なリン酸化が見られたが、このリン酸化をラムシルマブは用量依存的に阻害した。 いずれの細胞を用いた試験においても、ラムシルマブの効力は親抗体 IMC-2C6 よりも強 力であった（5～25 倍）。 略号： HUVEC ヒト臍帯静脈内皮細胞、 PAE-KDR 細胞 ヒト VEGFR-2 を遺伝子導入したブタ大動脈内皮細胞 血清飢餓細胞にラムシルマブ及び IMC-2C6 を室温で 30 分間処理後、 VEGF で 15 分間刺激した。細胞を溶解させ、 ポリクローナル抗 VEGFR-2 抗体とプロイン A セファロースビーズを用いて VEGFR-2 を単離した。電気泳動後、抗 リン酸化チロシン抗体で免疫ブロッティングし増感化学発光でシグナルを検出した。参考資料 Lu 2003 の図 6 を転 載。 図 2.6.2-6 HUVEC 及び PAE-KDR 細胞における VEGF 刺激性 VEGFR-2 自己リン酸 化に対するラムシルマブ（IMC-1121）の阻害作用 内皮細胞を VEGF で刺激した際に見られる早期の細胞応答の 1 つに細胞内カルシウム 濃度変化がある。細胞内カルシウム濃度の上昇は VEGF 誘発性の血管透過性亢進及び内 皮細胞増殖に重要な役割を果たす。内皮細胞において VEGFR-2 の活性化は VEGF を介 したカルシウム動員に重要であり、ホスホリパーゼ C 経路による制御を受ける。 図 2.6.2-7 に示すように、PAE-KDR 細胞を VEGF で刺激すると顕著な細胞内カルシウ ム動員が生じるが、これを 1121B Fab は用量依存的に阻害した（参考資料 Miao 2006）。 各濃度の 1121B Fab で得た曲線下面積から算出した IC50 は約 7.3 nM であった。 10 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 略号： PAE-KDR 細胞 ヒト VEGFR-2 を遺伝子導入したブタ大動脈内皮細胞 縦軸は蛍光強度を示す。 PAE-KDR 細胞をプレートに播種し、 0.1% 牛血清アルブミン含有 F-12 培地で一晩培養する ことにより血清飢餓状態を導いた。 1121B Fab 及び FLIPER カルシウム色素を 37˚C で 1 時間処理した後に、室温で 20 分間冷却した。プレートを FlexStation II 蛍光光度計に載せ、各ウェルに VEGF（ 10 ng/mL）を添加した直後から 各ウェルの蛍光強度を測定しカルシウム変動を調べた。参考資料 Miao 2006 の図 3 を転載。 図 2.6.2-7 PAE-KDR 細胞における VEGF 誘発性細胞内カルシウム動員に対する 1121B Fab の阻害作用 HUVEC を用いて、VEGF による内皮細胞増殖に対するラムシルマブの阻害作用を評価 した（参考資料 Zhu 2003; 図 2.6.2-8）。評価した 3 つの抗 VEGFR-2 抗体のうちラムシル マブが VEGFR-2 に対して最も高い親和性を有するが（参考資料 Zhu 2003）、これに一 致して、ラムシルマブの増殖阻害作用は最も強く、検討した他の抗体（IMC-1C11 及び IMC-2C6）の EC50 は約 1.5 nM であったのに対し、ラムシルマブの EC50 は約 0.7 nM で あった。陰性対照として用いた IMC-C225（セツキシマブ、抗ヒト EGFR 抗体）は明ら かな作用を示さなかった。 11 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 Percent of inhibition 100 80 60 40 IMC-1C11 IMC-2C6 IMC-1121 IMC-C225 20 0 0.1 1 10 100 Antibody concentration (nM) 略号：HUVEC ヒト臍帯静脈内皮細胞 縦軸は阻害率を示す（duplicate の平均値、複数回実施した実験の代表）。増殖因子を含まない培地で培養した HUVEC に種々濃度の抗 VEGFR-2 抗体を 37˚C で 1 時間処理した後に、VEGF を終濃度 16 ng/mL となるように各ウ ェルに添加した。18 時間後、各ウェルに[3H]-チミジンを添加し、さらに 4 時間インキュベートした。細胞を採取し、 DNA に取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで計測した。参考資料 Zhu 2003 の図 2b を転載。 図 2.6.2-8 HUVEC における VEGF 誘発性細胞増殖に対するラムシルマブ（IMC-1121） の阻害作用 ヒト白血病細胞株 HL60、HEL 及び U937 は VEGF 刺激に反応し遊走することが知られ ている。図 2.6.2-9 のとおり、ラムシルマブ及び他の抗 VEGFR-2 抗体（IMC-1C11、IMC2C6）は、VEGFR-2 を発現する HL60 細胞及び HEL 細胞に対しては VEGF 誘発性の遊走 を用量依存的に阻害した（参考資料 Zhu 2003; それぞれ図 2.6.2-9、A 及び B）が、 VEGFR-2 を発現しない U937 細胞の遊走は阻害しなかった（図 2.6.2-9、C）。一方、抗 VEGFR-1 抗体の MAB612 は HEL 細胞と U937 細胞の VEGF 誘発性遊走を阻害した（そ れぞれ図 2.6.2-9、B 及び C、HL60 細胞では評価せず）。陰性対照として用いた IMCC225 は明らかな作用を示さなかった。以上のデータから、ラムシルマブは VEGF の VEGFR-1 を介した作用には影響を及ぼさず、VEGFR-2 を介した作用を選択的に抑制す ることが示唆された。 12 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 A HL60 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Control VEGF 40 10 2 .5 0 .6 Number of cells migrated B 6000 HEL IM C -1 C 1 1 IM C -2 C 6 IM C -1 1 2 1 IM C -C 2 2 5 MAB612 5000 4000 3000 2000 1000 0 Control VEGF 40 10 2 .5 0 .6 40 10 2.5 0 .6 C 5000 U 937 4000 3000 2000 1000 0 C o n tr o l VEGF A n tib o d y (n M ) 縦軸は遊走した細胞数を示す（平均値±標準偏差、triplicate）。MAB612 は HL60 細胞では評価しなかった。白血病 細胞遊走は改変ボイデンチャンバーを用いて評価した。ポリカーボネート製細胞培養インサート内で白血病細胞と 種々濃度の抗体を 37˚C、30 分間インキュベートした。その後、無血清培地を入れた 24 ウェルプレートのウェルに インサートを入れ、VEGF の存在下、37˚C で 4 時間インキュベートした。インサートの膜を透過した細胞を回収し、 自動細胞計数装置で計測した。参考資料 Zhu 2003 の図 4 を転載。 図 2.6.2-9 VEGF 刺激性ヒト白血病細胞遊走に対するラムシルマブ（IMC-1121）の阻 害作用 13 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 以上、ラムシルマブは VEGFR-2 を介して VEGF により誘発される様々な生物学的反 応を効果的に阻害することが示され、血管内皮細胞の VEGFR-2 を阻害することで血管 新生を阻害することが期待される。 2.6.2.2.1.1.4 ラムシルマブによる VEGFR-2 の内在化 評価資料： IMC02（ 4.2.1.1.13） 受容体を標的とする抗体は、リガンド結合阻害に加えて、エンドサイトーシスにより 細胞膜受容体を減少させる可能性があるが、PAE-KDR 細胞及びヒト初代培養内皮細胞 （大動脈内皮細胞及び皮膚微小血管内皮細胞）を用いた試験において、ラムシルマブは 細胞膜に発現した VEGFR-2 を減少させることが示されている（評価資料 IMC02）。最 初の検討では、VEGFR-2 を高発現する PAE-KDR 細胞が用いられた。PAE-KDR 細胞に ラムシルマブを 24 時間処理したところ、細胞膜受容体の減少が見られた（図 2.6.2-10）。 高濃度での作用は中間濃度（25～400 nM）よりも弱い傾向が見られたが、これは受容体 と架橋結合（抗体が 2 個の受容体に結合）を形成する際に受容体標的抗体はより効率的 に受容体を内在化するためと推察される。ヒト初代培養内皮細胞を用いた検討でも、ラ ムシルマブ処理により、細胞膜に発現した VEGFR-2 の減少が見られたが、PAE-KDR 細 胞での検討と同じく、高濃度で作用の減弱が見られた。以上のデータから、ラムシルマ ブは VEGF リガンドを介した VEGFR-2 シグナル伝達阻害に加えて、細胞膜受容体の内 在化により VEGFR-2 の機能を阻害する可能性があることが示唆される。 略号： PAE-KDR cell ヒト VEGFR-2 を遺伝子導入したブタ大動脈内皮細胞 縦軸は抗 keyhole limpet hemocyanin（ KLH）抗体の反応を 100%とする蛍光強度を示す。 PAE-KDR 細胞を培養したプ レートにラムシルマブ（ IMC-1121B）を規定濃度で添加し、 24 時間インキュベートした。細胞を回収し、洗浄後、 染色用培地に再懸濁した。細胞膜に発現した VEGFR-2 の検出にはラムシルマブを用いた。すなわち、ラムシルマブ 又はヒト抗 KLH 抗体で細胞を 2 時間処理し、洗浄後、フルオレセインイソチオシアネート（ FITC）標識抗ヒト IgG 抗体で染色し、ハイスループットフローサイトメーターで VEGFR-2 を検出した。評価資料 IMC02 の図 1 を転載。 図 2.6.2-10 PAE-KDR 細胞におけるラムシルマブによる VEGFR-2 の内在化 14 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2.2.1.1.5 2.6.2 薬理試験の概要文 ラムシルマブのエフェクター活性 評価資料：3.2.S.3 IgG1 あるいは IgG3 サブクラスに属する抗体は、その Fc 領域が Fc 受容体［FcRIIIa （CD16a）、FcRII（CD32）及び FcRI（CD64）］又は他の Fc 結合タンパク質［血清補 体依存性細胞障害（CDC）複合体など］と結合することにより、エフェクター活性を示 すことが知られている。そこで、ラムシルマブが補体成分 C1q 又は Fc受容体（CD64、 CD32b 及び CD16a）への作用を介してエフェクター活性を示す可能性を in vitro 結合アッ セイ及び細胞を用いた抗体依存性細胞障害活性（ADCC）アッセイにより評価した。 CD64 及び C1q への結合能は、それぞれ Horseradish Peroxidase（HRP）を結合させた F(ab)’2 特異的抗 IgG 抗体及び抗ヒト C1q 抗体を用いた ELISA で評価した。CD32、CD16 及び FcRn 受容体への結合能は Biacore で評価した。その結果、ラムシルマブは C1q 及び Fc受容体への結合能を示したが（図 2.6.2-11 及び図 2.6.2-12）、これは IgG1 抗体に予測 される結果であった。 C1q Binding 2 1.5 1 0.5 0 0.1 1 10 100 Ab Concentration (nM) o ラムシルマブ標準物質; □ プロセス C0 原薬; Δ プロセス C1 原薬 図 2.6.2-11 ラムシルマブの C1q に対する結合能 15 1000 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 o ラムシルマブ標準物質 ; □ プロセス C0 原薬 ; Δ プロセス C1 原薬 図 2.6.2-12 ラムシルマブの CD64 に対する結合能 エフェクター細胞として Jurkat-NFAT レポーター細胞、標的細胞として HT-144 細胞及 び P/K/G 細胞を用いた、ADCC レポーター遺伝子アッセイによりラムシルマブの ADCC 活性を評価した。その結果、ラムシルマブは評価した最大濃度においても明らかな ADCC 活性を示さなかった（図 2.6.2-13）。一方、HCC-827 細胞を用いた類似の試験条 件下で、抗 EGFR 抗体（陽性対照）は顕著な ADCC 活性を示した。 ラムシルマブの活性は HT-144 細胞又は P/K/G 細胞（ VEGFR-2 を遺伝子導入したブタ内皮細胞）で、抗 EGFR 抗体 の活性は HCC-827 細胞でそれぞれ評価。 図 2.6.2-13 ラムシルマブ及び抗 EGFR 抗体の ADCC 活性 16 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 ラムシルマブには Fc 結合タンパク質に対する親和性を抑制するようなアミノ酸配列の 改変は施されていないため、他の IgG1 抗体と同様に、ラムシルマブは in vitro 結合アッ セイにおいて Fc受容体及び C1q に対する結合能を示した。しかしながら、細胞を用い たアッセイでは明らかな ADCC 活性を示さなかったことから、ラムシルマブがエフェク ター活性を示す可能性は低いと結論づけた。なお、ラムシルマブは C1q に結合すること から、VEGFR-2 発現細胞（HUVEC 細胞、HT-144 細胞又は VEGFR-2 を遺伝子導入した ブタ内皮細胞）を用いて CDC 活性を評価したが、細胞表面での C1q-ラムシルマブVEGFR-2 複合体の形成は認められなかった。 2.6.2.2.1.1.6 ラムシルマブのエピトープ 評価資料：3.2.S.3 ラムシルマブの Fab フラグメントと VEGFR-2 のドメイン 3 を共結晶化し、ラムシルマ ブのエピトープを評価した。Fab フラグメントと VEGFR-2 のドメイン 3 の接触アミノ酸 残基を図 2.6.2-14 に示す。 略号：CDR = 相補性決定領域、KDR ヒト VEGFR-2、1121B ラムシルマブ 直線、点線及び赤－青色線は、それぞれ疎水性相互作用、水素結合及び電荷間相互作用を示す。 図 2.6.2-14 ラムシルマブ（Fab フラグメント）と VEGFR-2（ドメイン 3）間での 接触アミノ酸残基 17 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2.2.1.2 2.6.2 薬理試験の概要文 DC101 を用いた In Vitro 薬効薬理試験 ラムシルマブのマウス VEGFR-2 に対する結合能は低いことから、マウスを用いた in vivo 試験には DC101 をサロゲート抗体として用いる必要があった。DC101 はマウス VEGFR-2 の細胞外ドメインに結合し、VEGF-A 及び VEGF-C の VEGFR-2 への結合に強 く拮抗する。DC101 を用いた in vitro 薬効薬理試験の一覧を表 2.6.2-4 に示す。 表 2.6.2-4 DC101 の In Vitro 薬効薬理試験の一覧 試験目的 結合/阻害 能の評価 細胞機能の 評価 評価項目 マウス VEGFR-2 への結合能 マウス VEGFR-1 への結合能 VEGF-C のマウス VEGFR-3 への結合に対する阻害能 VEGF の VEGFR-2 リン酸化 に対する阻害能 VEGF-D の VEGFR-2 活性化 に対する阻害能 評価系 Biacore ELISA Flk-1 遺伝子導入 NIH 3T3 細 胞 ELISA ELISA 資料 評価資料 1001評価資料 1001参考資料 Rockwell 1995 Flk-1 遺伝子導入 NIH 3T3 細 胞 マウスリンパ管内皮細胞 参考資料 Rockwell 1995 参考資料 Luttun 2002 参考資料 Pytowski 2005 参考資料 Karnezis 2012 略号：Biacore 表面プラズモン共鳴分析法、ELISA 酵素免疫測定法、Flk-1 Fetal liver kinase 1（マウス VEGFR-2） 2.6.2.2.1.2.1 DC101 の In Vitro 結合試験 評価資料：1001- （4.2.1.1.3） 参考資料：Rockwell 1995（4.2.1.1.14）、Luttun 2002（4.2.1.1.15）、Pytowski 2005（4.2.1.1.16） ELISA 又は Biacore を用いた in vitro 試験により DC101 のマウス及びヒトの VEGFR-2 に対する結合能を評価した（評価資料 1001- ）。ELISA を用いた評価においてラムシ ルマブはヒト VEGFR-2（KDR）に結合したが（EC50：0.16 nM）、DC101 は明らかな結 合を示さなかった（図 2.6.2-15 の左図）。一方、DC101 はマウス VEGFR-2（Flk-1 Fetal liver kinase 1）に結合したが（EC50: 0.28 nM）、ラムシルマブは明らかな結合を示さなか った（図 2.6.2-15 の右図）。Biacore を用いた検討での DC101 のマウス VEGFR-2 への Kd は 0.11 nM であった（表 2.6.2-5）。 18 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 略号： KDR Kinase insert domain-containing receptor（ヒト VEGFR-2 ）、 Flk-1 Fetal liver kinase 1（マウス VEGFR-2） 縦軸は 450 nm での吸光度を示す。評価資料 1001- の図 1 及び 2 を転載。 図 2.6.2-15 DC101 及びラムシルマブ（IMC-1121）のヒト及びマウス VEGFR-2 に対 する結合能（ELISA での評価） 表 2.6.2-5 DC101 の Flk-1 に対する結合親和性（Biacore を用いた検討） 抗体 標的 DC101 Flk-1（マウス VEGFR-2） *k on 4 (10 M-1S-1) *k off (10-4 S-1) *R max *†Kd (RU) (nM) 11.0 0.12 45 0.11 略号： Flk-1 Fetal liver kinase 1（マウス VEGFR-2）、 Kd 解離定数、 kon 結合速度定数、 koff 解離速度定数、 Rmax 最大結合量、 RU レゾナンスユニット * データは 1 回の測定の値を示す。 † koff を kon で除した値を算出し、 Kd とした。 評価資料 1001- の表 1 を転載。 また、DC101 は Flk-1 遺伝子を導入した NIH 3T3 細胞（C411）に結合するが、抗 Fetal liver kinase 2（Flk-2）抗体（23H7）は明らかな結合を示さなかったことが報告されてい る（参考資料 Rockwell 1995; 図 2.6.2-16）。 略号： Flk-1 Fetal liver kinase 1（マウス VEGFR-2）、 Flk-2 Fetal liver kinase 2 縦軸は細胞数を横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。 Flk-1/Fms 遺伝子を導入した NIH 3T3 細胞（ C411）と DC101 又は 23H7（抗 Flk-2 抗体）を氷上で 60 分間インキュベートした。細胞を洗浄した後に FITC 結合ヤギ抗マウス IgG とイ ンキュベートし、洗浄後、フローサイトメトリーにて抗体結合を分析した。参考資料 Rockwell 1995 の図 1 を転載。 図 2.6.2-16 Flk-1 遺伝子導入 NIH 3T3 細胞に対する DC101 の結合能 19 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 DC101 のマウス VEGFR-2 に対する選択性も示されている。すなわち、DC101 はマウ ス VEGFR-1 には結合せず（参考資料 Luttun 2002）、マウス VEGFR-2 に対する VEGF-A 及び VEGF-C の結合を阻害するが、マウス VEGFR-3 に対する VEGF-C の結合は阻害し ないこと（参考資料 Pytowski 2005）が示されている。なお、マウス VEGF-D はマウス VEGFR-3 にのみ結合するため、VEGF-D の VEGFR-2 への結合に対する DC101 の拮抗作 用は検討していない。 2.6.2.2.1.2.2 DC101 の細胞機能に対する作用 参考資料： Rockwell 1995（4.2.1.1.14）、 Karnezis 2012（ 4.2.1.1.17） Flk-1 遺伝子を導入した NIH 3T3 細胞（C411）を用いた試験（参考資料 Rockwell 1995） において、DC101 は VEGF 刺激によるマウス VEGFR-2 の自己リン酸化を阻害した（図 2.6.2-17）。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DC101 の存在下（レーン 1～ 4）又は非存在下（レーン 5～ 8）で、 Flk-1/Fms 遺伝子を導入した NIH 3T3 細胞（ C411） を VEGF で刺激した。 DC101 のみを作用させた群を陰性対照とした（レーン 9）。参考資料 Rockwell 1995 の図 5A を転載。 図 2.6.2-17 Flk-1 遺伝子導入 NIH 3T3 細胞における VEGF 刺激性 VEGFR-2 自己リン 酸化に対する DC101 の阻害能 リンパ管内皮細胞は VEGFR-2 と VEGFR-3 を共に発現することが知られている。担癌 マウスの集合リンパ管内皮細胞（cLEC）を用いた in vitro 試験において、cLEC を VEGF- D で刺激すると VEGFR-2 のリン酸化が見られたが、DC101 の前処理により、このリン 酸化は阻害された（参考資料 Karnezis 2012）。なお、抗 VEGFR-3 抗体（mF4-31C1）の 前処理でも同様の阻害が認められたことから、cLEC では VEGF-D は主に VEGFR-2 と VEGFR-3 のヘテロ二量体を形成することが示唆される。 以上、 DC101 は VEGF のマウス VEGFR-2 への結合を効果的に阻害するが、ヒト VEGFR-2 への結合は阻害しないことが示された。DC101 は、VEGFR-2 を標的とするラ ムシルマブの薬効をヒト腫瘍移植マウスモデルで評価するのに適したサロゲート抗体で ある。 20 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2.2.2 2.6.2.2.2.1 2.6.2 薬理試験の概要文 In Vivo 薬効薬理試験 作用機序に関する試験 評価資料：IMC03（4.2.1.1.31） 参考資料：Bruns 2000（4.2.1.1.18）、Sweeney 2002（4.2.1.1.19）、Krix 2003（4.2.1.1.20）、Franco 2006（4.2.1.1.21）、Cheung 2007（4.2.1.1.22）、Jugold 2008（4.2.1.1.23）、Stantz 2011 （4.2.1.1.24）、Kiessling 2004（4.2.1.1.25）、Hansen-Algenstaedt 2000（4.2.1.1.26）、Pàez-Ribes 2009（4.2.1.1.27）、Tonra 2009（4.2.1.1.28）、Shaked 2008（4.2.1.1.29）、Casanovas 2005 （4.2.1.1.30） VEGF-A（一般的に VEGF と呼称される）は VEGFR-1 及び VEGFR-2 に結合するが、 シグナルは主に VEGFR-2 を介して伝達される。増殖能の高い腫瘍で活発に発芽してい る未熟な新生血管の内皮細胞の生存に VEGF は重要な役割を果たしている（Ferrara 1995）。抗 VEGFR-2 抗体は内皮細胞に作用し発芽の抑制やアポトーシスを誘導し、血 管密度を減少させることが予想される。血管密度の減少により腫瘍血管の血流量が減少 し低酸素状態が誘発されることにより、腫瘍細胞の増殖速度の低下及びアポトーシスが 生じ、その結果、腫瘍の増殖が抑制される。以上の仮説はマウス腫瘍モデルで DC101 の 作用を評価した以下の公表論文で支持される。 マウス転移性腫瘍異種移植モデルに DC101 を投与すると血管内皮細胞にアポトーシス が誘導され、その約 1 週間後に腫瘍細胞にもアポトーシスが誘導された（参考資料 Bruns 2000; 参考資料 Sweeney 2002）。また、担癌マウスに DC101 を投与すると腫瘍の 微小血管密度が減少した後に腫瘍増殖が抑制され、この作用は血流減少に相関すること が複数の試験で示されている。これらの試験では、超音波ドップラー法（参考資料 Krix 2003; 参考資料 Franco 2006; 参考資料 Cheung 2007; 参考資料 Jugold 2008）、ダイナミッ ク造影断層撮影法（参考資料 Cheung 2007; 参考資料 Stantz 2011）あるいはダイナミック 造影磁気共鳴画像法（参考資料 Kiessling 2004）が用いられた。図 2.6.2-18 に DC101 を投 与した際に見られた腫瘍血流減少の一例を示す（参考資料 Franco 2006）。 21 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 MDA-MB-231 細胞（ヒト乳癌）を、重症複合免疫不全の雌 CB-17 マウスの乳腺脂肪体に同所性に移植した（N10）。 試験 27 日目から、DC101（800 g/マウス）を 3 週間投与（週 2 回）した。投与期間中に週 1 回、高周波数超音波生 体顕微鏡を用いて画像分析した。A は代表的な超音波画像を示す（赤画素：検出された血流領域）。B は検出され た血流領域の腫瘍領域に対する比率を示す（オープンカラム：対照群、クローズドカラム：DC101 投与群）。いず れの測定時点でも対照群との有意な差が見られた（*p0.05; Student の t 検定）。参考資料 Franco 2006 の図 3 を転載。 図 2.6.2-18 DC101 投与による腫瘍血流の減少（高周波数超音波法での検出） 皮下移植チャンバー内で増殖させた腫瘍の酸素レベルを非侵襲性に評価した試験にお いて、DC101 は腫瘍の酸素レベルを低下させ、腫瘍血管を退縮させた（参考資料 Hansen-Algenstaedt 2000 ） 。 担 癌 マ ウ ス を 用 い た 試 験 で も 、 低 酸 素 プ ロ ー ブ （pimonidazole）を用いた検討（低酸素状態にある組織に結合した pimonidazole を免疫組 織化学的に検出）により、DC101 が腫瘍を低酸素状態にすることが示されている（参考 資料 Franco 2006; 参考資料 Pàez-Ribes 2009）。さらに、低酸素状態で安定化される転写 因子、Hypoxia-inducible factor 1（HIF-1）の発現レベルで腫瘍の低酸素状態を評価し た試験において、DC101 はマウス腫瘍モデルにおける HIF-1レベルを増加させたこと 22 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 が報告されている（参考資料 Franco 2006; 参考資料 Tonra 2009）。図 2.6.2-19 に腫瘍の酸 素状態及び HIF-1の発現に対する DC101 の作用の一例を示す（参考資料 Franco 2006）。 MDA-MB-231 細胞（ヒト乳癌）を、重症複合免疫不全の雌 CB-17 マウスの乳腺脂肪体に同所性に移植した（N）。 試験 27 日目から、DC101（800 g/マウス）を 3 週間投与（週 2 回）した。A は低酸素領域を pimonidazole で検出し た対照群（左）及び DC101 投与群（右）の代表的な染色像を示す（矢印で示した褐色領域が低酸素領域）。ヘマト キシリンで対比染色した（100 倍）。乳腺脂肪体に特徴的な脂肪細胞の存在が確認される。グラフは低酸素領域の 範囲を定量化した結果を示す（*** p0.0005; Student の t 検定）。B は PBS（左）又は DC101（右）を投与した個体 の腫瘍から調製した核タンパク質抽出物の HIF-1に対するウェスタンブロッティング像を示す（各レーンは各個体 のデータを示す）。対照には HIF-1及び-アクチンを用いた。DC101 を投与した個体の腫瘍で HIF-1レベルが増加 した。C は対照群（左）及び DC101 投与群（右）の代表的な HIF-1の免疫染色像を示す（褐色部分は HIF-1陽性 細胞）。ヘマトキシリンで対比染色した（200 倍）。参考資料 Franco 2006 の図 4 を転載。 図 2.6.2-19 腫瘍の酸素状態及び HIF-1α 発現に対する DC101 の作用 23 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 腫瘍血管は既存の血管から新たに血管分岐が伸長すると考えられてきたが、最近、骨 髄由来の循環血管内皮前駆細胞（CEP）が腫瘍に取り込まれ血管内皮細胞に分化して血 管新生に関与する別の機序が提唱されている。パクリタキセルなど特定の化学療法剤を マウスに投与すると骨髄から血中に CEP が急速に動員されるが、これを DC101 は有意 に減少させたことが報告されている（参考資料 Shaked 2008）。CEP は VEGFR-2 を発現 しているため、抗 VEGFR-2 抗体は CEP の作用を抑制することにより抗腫瘍効果を示す 可能性が示唆される。 ラムシルマブはげっ歯類の VEGFR-2 には結合せず、標準的なモデルではその血管新 生抑制作用を評価できないため、ヒト細胞を用いた in vivo 試験を実施した（評価資料 IMC03）。Matrigel 中でヒト血管内皮前駆細胞（Endothelial Colony Forming Cells：ECFC） をヒト脂肪由来幹細胞（Adipose Derived Stem Cells：ADSC）と混合し、この混合物をマ ウスの皮下に移植した。ECFC と ADSC は Matrigel マトリクス中で内皮細胞束を形成す る。Matrigel マトリクス中には赤血球の潅流が見られ、マウスの皮膚血管系と結合した 毛細血管ネットワークの形成が確認された。Matrigel 混合物を皮下移植する 5 時間前に ラムシルマブを 10 mg/kg の用量で腹腔内投与したところ、毛細血管ネットワークの形成 が阻害された（図 2.6.2-20）。 縦軸はヘモグロビン濃度を示す（平均値±標準誤差、 N10）。ラムシルマブ（ IMC1121b）はヘモグロビン濃度を 有意に低下させた（ p0.000021）。ヒト血管内皮前駆細胞及びヒト脂肪由来幹細胞を用いて脈管形成の in vivo モデ ルを作製した。 Matrigel 中で細胞を混合し雌胸腺欠損ヌードマウスに皮下投与した。投与の 5 時間前にラムシルマブ （ IMC1121b）又は対照抗体（ hIgG4）を 10 mg/kg の用量でマウスに投与した。6 日後に Matrigel プラグを採取し、 ヘモグロビン量を QuantiChrom ヘモグロビンアッセイキットで測定した。評価資料 IMC03 の図 1 を転載。 図 2.6.2-20 ヒト血管内皮前駆細胞とヒト脂肪由来幹細胞を用いたマウス血管新生モデ ルにおけるラムシルマブ（IMC1121b）の作用 以上、抗 VEGFR-2 抗体であるラムシルマブは血管新生阻害作用により腫瘍増殖を抑 制することが示唆された。 血管新生阻害薬は腫瘍に虚血を誘導するが、特定の条件下で、腫瘍の悪性度を増悪さ せる可能性が担癌マウスを用いた試験から示唆されている。これらには DC101 を用いた 24 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 公表論文での試験が含まれる。例えば、膵神経内分泌腫瘍のモデルマウスに DC101 を投 与すると腫瘍の虚血と転移の増加が認められた（参考資料 Pàez-Ribes 2009）。別の試験 では、膵島細胞腫瘍のモデルマウスに DC101 を投与すると VEGFR-2 阻害による抗腫瘍 効果に対する抵抗性や低酸素で誘導される増殖因子（VEGF-A、アンジオポイエチン及 びエフリンなど）の発現が増強されることが示されている（参考資料 Casanovas 2005）。 これらの公表論文は血管新生阻害薬による虚血により癌の悪性度が増強される可能性を 示唆するが、ラムシルマブの臨床での作用を予測する上での意義は明らかではなく、ラ ムシルマブのいずれの第 III 相臨床試験でも関連所見は報告されていない。 2.6.2.2.2.2 ヒト癌のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍効果 2.6.2.2.2.2.1 試験方法及びデザインの概要 ラムシルマブの臨床開発の妥当性を支持する目的で、様々なヒト癌細胞のマウス移植 モデルを用いて DC101 の抗腫瘍効果を評価した。これらの試験は、以下の試験方法に従 い 社で実施された（ 社で実施した胃癌移植モデル試験で用い た方法は第 2.6.2.2.2.2.3.1 項を参照）。 癌細胞の懸濁液を Matrigel と 1:1 で混合し、雌の免疫不全（胸腺欠損）マウスの左側 腹部皮下に移植した（第 2.6.2.2.2.2.3.2 項に示す胃癌移植モデル試験では Matrigel を使用 せず）。あらかじめ、細胞株ごとに増殖曲線を求め腫瘍接種に関する標準手順書を作成 した。腫瘍体積が特定の大きさ（通常 300～400 mm3）に達したときに担癌マウスを腫瘍 体積で無作為化し、各投与群に割り付けた。開発初期に実施した用量反応試験等の結果 に基づき、40 mg/kg の週 3 回腹腔内投与を標準的な投与法とした。事前に規定した時点 （病理組織学的評価に供するため、など）あるいは評価項目が満たされた時点（腫瘍増 殖が統計学的有意に阻害された、など）まで投与を継続した。試験計画書に規定した頻 度（通常週 2 回）で腫瘍体積を測径器で測定し体重を記録した。対照群（C）に対する 被験薬群（T）の腫瘍体積の比（T/C%）を求め抗腫瘍効果を評価した。腫瘍増殖及び体 重変化の群間比較（2 群又はそれ以上）には反復測定分散分析（Repeated Measures ANOVA）を用いた。なお、被験薬投与前の腫瘍体積は差し引かなかったため抗腫瘍効 果は過小評価されている。 2.6.2.2.2.2.2 ヒト膵臓癌マウス異種移植モデルを用いた Proof-of-Concept 試験 評価資料：2212- （4.2.1.1.32） ラムシルマブの臨床試験に先立ち、Proof-of-Concept 試験として、ヌードマウスを用い たヒト膵臓癌異種移植モデルにおける DC101 の有効性及び薬物動態を評価した（評価資 料 2212- ）。 雌ヌードマウスに BxPC-3（ヒト膵臓癌細胞）を皮下移植した。腫瘍体積が約 300 mm3 に達したときに担癌マウスを各投与群に腫瘍体積で無作為化した。各群に溶媒（生理食 塩液）又は DC101（4、15 又は 40 mg/kg）を週 3 回、計 17 回腹腔内投与した。試験最終 日まで腫瘍体積を測定し、最終投与の 0、3、6、24、48 及び 168 時間後に血液を採取し 血漿中 DC101 濃度を測定した。 25 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 溶媒対照群との比較で、DC101 は検討したすべての用量で腫瘍増殖を有意に阻害した （いずれも p0.0005、図 2.6.2-21）。4 mg/kg 群の腫瘍体積は 15 及び 40 mg/kg 群と比較 し有意に大きかった（p0.003）。最終測定時点（試験 36 日目）での腫瘍体積の T/C%は、 4、15 及び 40 mg/kg 群でそれぞれ 51%、42%及び 35%であった。 縦軸は腫瘍体積を示す（平均値±標準誤差、 N12）。 * p0.0005（溶媒対照群との比較）。 # p0.003（ 15 及び 40 mg/kg 投与群との比較）。評価資料 2212- の図 1 を転載。 図 2.6.2-21 BxPC-3 膵臓癌に対する DC101 の抗腫瘍効果 血漿中 DC101 濃度を表 2.6.2-6 に示す。 4 mg/kg 群の定常状態における血漿中濃度 ［AUC(0-48hr)/48］は 22 g/mL であった。最終投与前及び最終投与 48 時間後のトラフ濃 度はそれぞれ 4 及び 18 g/mL であった。DC101 の抗腫瘍効果を考慮すると、本モデルに おいて DC101 が 50%以上の腫瘍増殖阻害を示すには血漿中濃度がおよそ 18 g/mL 以上 に維持される必要があることが示唆された。 表 2.6.2-6 BxPC-3 膵臓癌異種移植マウスにおける血漿中 DC101 濃度 血漿中 DC101 濃度（g/mL） 最終投与後の時間 （時間） 4 mg/kg 15 mg/kg 40 mg/kg 0 4 120, BLQ 620, 1780 3 10, 34 375, 460 750, 850 6 12, 62 360, 420 950, 850 24 14, 22 380, 380 550, 850 48 4, 32 80, 800 BLQ, 800 168 BLQ, BLQ 10, 80 34, 76 略号： BLQ 定量限界未満 データは各個体（各群 1 又は 2 匹）の測定値。評価資料 2212- 26 の表 1 を転載。 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 以上、本試験はサロゲート抗体（DC101）を用いた評価ではあるものの、固形癌異種 移植モデルに抗 VEGFR-2 抗体を投与すると腫瘍増殖が減少することが示唆される。 2.6.2.2.2.2.3 ヒト胃癌のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍効果 2.6.2.2.2.2.3.1 DC101 の単独投与試験 評価資料：5538- 胃癌患者由来腫瘍組織片を用いたマウス異種移植モデル（ （4.2.1.1.33） モデル）における 社にて評価した（評価資料 5538- ）。 ラムシルマブ単独投与時の抗腫瘍効果を 直径 2～4 mm の腫瘍組織片を雌 BALB/c ヌードマウス（6～8 週齢、体重 18～22 g）の右 脇腹に皮下移植した。腫瘍体積が約 150 mm3（132～193 mm3）に達したとき、担癌マウ スを腫瘍体積で各投与群に無作為化した（各群 7～8 匹）。担癌マウスに陰性対照（ヒト IgG）又は DC101（40 mg/kg）を試験 21 日目まで週 3 回腹腔内投与した。体重及び腫瘍 体積を週 2 回、測定した。最終投与の 24 時間後に腫瘍重量を測定した。以下の式で腫瘍 体積（主要評価項目）及び腫瘍重量（副次的評価項目）の T/C%を算出し、抗腫瘍効果 の指標とした。 T/C % 100 × ΔT/ΔC ΔT 試験最終日での平均値 − 投与開始日での平均値（DC101 投与群） ΔC 試験最終日での平均値 − 投与開始日での平均値（陰性対照群） DC101 単独投与時の抗腫瘍効果を表 2.6.2-7 に示す。DC101 は移植した腫瘍組織片ごと に異なる抗腫瘍効果を示し、T/C%が 50%以下かつ p 値が 0.05 未満であった腫瘍組織片 は 17 種のうちの 7 種であった（腫瘍体積）。体重への明らかな影響は認められず、 DC101 の忍容性は良好であった。 従来の樹立細胞株を用いた異種移植モデルと比べ、 モデルはがん患者の病変 の組織学的特徴や遺伝子発現プロファイルをより正確に反映する可能性がある。一方で、 個々の患者から採取した腫瘍組織片を用いるモデルは遺伝的に不均質であり、抗癌剤に 対し異なる反応性を示すことがしばしば認められる。本試験でも明確な抗腫瘍効果がす べての移植モデルで認められはしなかったが、本成績は胃癌を対象とする臨床試験でラ ムシルマブの有効性を検証する妥当性を支持するものであった。 27 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 表 2.6.2-7 2.6.2 薬理試験の概要文 胃癌患者由来腫瘍組織片を用いたマウス異種移植モデルにおける DC101 の 抗腫瘍効果 投与開始時 腫瘍組織片 の腫瘍体積 (mm3) 報告書番号 腫瘍体積 匹 腫瘍重量 T/C% Pa T/C% pa LLI-FTE-C011620 .S2.3 GAM098 150 8 68 0.033* 70 0.11 LLI-FTE-C011620 .S2.5 GAM037 180 7 58 0.037* 55 0.03* LLI-FTE-C011620 .S2.6 GAM019 150 8 43 0.001* 42 0.005* LLI-FTE-C011620 .S2.7 GAM016 186 8 68 0.508 59 0.53 LLI-FTE-C011620 .S2.8 GAF087 167 8 17 <0.001* 14 0.004* LLI-FTE-C011620 .S2.9 GAM044 158 8 77 0.29 66 0.09 LLI-FTE-C011620 .S2.10 GAM046 167 8 55 0.004* 48 0.001* LLI-FTE-C011620 .S2.12 GAF055 147 8 37 0.026* 35 0.012* LLI-FTE-C011620 .S2.13 GAM110 150 8 47 0.003* 40 0.002* LLI-FTE-C011620 .S2.14 GAM060 155 8 50 0.114 53 0.39 LLI-FTE-C011620 .S2.15 GAM119 154 8 52 0.072 59 0.140 LLI-FTE-C011620 .S2.16 GAF023 155 8 94 0.99 91 0.046* LLI-FTE-C011620 .S2.17 GAF114 150 8 34 0.016* 30 <0.001* LLI-FTE-C011620 .S2.18 GAM022 152 8 25 0.029* 21 <0.001* LLI-FTE-C011620 .S2.19 GAM025 153 8 71 0.122 81 0.51 LLI-FTE-C011620 .S2.21 GAM139 193 8 49 0.005* 44 0.023* LLI-FTE-C011620 .S2.23 GAM093 132 8 57 0.067 47 0.013* 略号：T/C% 対照群（C）に対する被験薬群（T）の腫瘍体積又は重量の比 a 統計学的有意水準は p<0.05（ANOVA 後の Dunnett 検定） これらの報告書は評価資料 5538- に添付されている。 2.6.2.2.2.2.3.2 DC101 とパクリタキセルの併用投与試験 評価資料：5569- （4.2.1.1.34）、5634- （4.2.1.1.35） 参考資料：Sweeney 2002（4.2.1.1.19）、Shaked 2008（4.2.1.1.29）、Inoue 2000（4.2.1.1.36） ヒト胃癌細胞株（MKN-45）を用いたマウス異種移植モデルを用いて、DC101 をパク リタキセルと併用投与した際の抗腫瘍効果を検討した（評価資料 55695634- ; 評価資料 ）。20 mg/kg の用量で DC101（週 2 回）又はパクリタキセル（週 1 回）を単独投 与すると顕著な腫瘍増殖阻害が見られ、同用量の併用投与では明らかな相加作用は認め られなかった（評価資料 5569- ; 図 2.6.2-22）。両薬剤の用量を 10 mg/kg に減量したと ころ、単独投与時の抗腫瘍効果はいずれも減弱した（評価資料 5634- ; 図 2.6.2-22）。 同用量の併用投与による相加作用が示唆されたが、単独投与時との比較で統計学的有意 差は認められなかった（DC101 及びパクリタキセル単独投与時との比較でそれぞれ p0.076 及び 0.066）。 28 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 評価資料 5569- 評価資料 5634- 評価資料 5569- ： DC101（20 mg/kg、週 2 回）又はパクリタキセル（ 20 mg/kg、週 1 回）の単独投与により MKN45 の増殖が有意に阻害された（ * p0.001）。併用投与時にも有意な増殖抑制が見られた（ * p0.001）が、単独投与 時との統計学的有意差は認められなかった。 評価資料 5634- ： DC101 及びパクリタキセルの用量を 10 mg/kg（それぞれ週 2 回及び週 1 回）に半減させたところ、 パクリタキセルは MKN-45 の増殖を有意に阻害した（# p0.05）が、DC101 は有意な作用を示さなかった （ p0.507）。同用量で両剤を併用投与したところ、有意な増殖抑制が見られ（## p0.016）、相加作用も示唆され たが、単独投与時との比較で統計学的有意差は認められなかった（DC101 及びパクリタキセル単独投与時との比較 でそれぞれ p0.076 及び 0.066）。 図 2.6.2-22 MKN-45 胃癌異種移植マウスモデルにおける DC101 単独又はパクリタキセ ル併用投与時の抗腫瘍効果 29 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 膀胱癌、前立腺癌又は肺癌モデルを用いた公表論文において、パクリタキセルとの併 用で DC101 の抗腫瘍効果が増強することが示されている。例えば、ヌードマウスの膀胱 壁内に膀胱癌細胞株（253J B-V）を移植した、転移性ヒト移行上皮癌の同所移植マウス モデルにおいて、パクリタキセルは DC101 の抗腫瘍作用を増強させた（参考資料 Inoue 2000）。両薬剤の併用投与により、単独投与時と比較し、膀胱癌細胞のアポトーシスが 増加し、マウスの生存率が改善した。また、前立腺癌細胞（PC-3M-MM2 又は LNCaPLN3）を用いた同所性前立腺癌モデル、並びに前立腺癌骨転移モデル（PC-3M-MM2 を 用いた検討）において、パクリタキセルと併用投与すると DC101 の抗腫瘍効果が増強さ れた（参考資料 Sweeney 2002）。さらに、パクリタキセルなど特定の化学療法剤をマウ スに投与すると腫瘍血管形成に寄与する CEP が動員されるが、DC101 は Lewis 肺癌モデ ルにおける CEP 動員を阻害し、DC101 の抗腫瘍効果はパクリタキセルとの併用で増強さ れた（参考資料 Shaked 2008）。 2.6.2.2.2.2.4 胃癌以外のマウス異種移植モデルにおける DC101 の抗腫瘍効果 胃癌以外の癌を対象とした担癌モデルにおける DC101 の抗腫瘍効果が評価されている （試験一覧を Appendix A に示す）。これらの試験において、現在実施中の第 III 相臨床 試験の対象癌種（肝臓癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌）に対するラムシルマブの有効性 が示唆されている。 2.6.2.3 副次的薬理試験 副次的薬理試験は実施していない。 2.6.2.4 安全性薬理試験 評価資料：1163-110（4.2.3.2.2） ラムシルマブの独立した安全性薬理試験は実施していないが、カニクイザルにラムシ ルマブを 50 mg/kg までの用量で週 1 回静脈内持続投与した 39 週間反復投与毒性試験 （評価資料 1163-110）の一環として、安全性薬理パラメータ（一般状態、体温、血圧及 び心電図）を評価した。本試験において、ラムシルマブ投与に関連する影響は認められ なかった。呼吸系及び中枢神経系機能に関しては、別途、試験を実施しなかったが、一 般状態の観察においてこれらに対する影響は見られなかった。 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用 DC101 の 抗 腫 瘍 効 果 に 及 ぼ す パ ク リ タ キ セ ル の 影 響 を 評 価 し た 試 験 成 績 を 第 2.6.2.2.2.2.3.2 項に示した。 2.6.2.6 考察及び結論 VEGF/VEGFR-2 経路を阻害し血管新生阻害作用により抗腫瘍効果を示す抗癌剤には、 低分子のチロシンキナーゼ阻害薬や血管新生促進作用を有するサイトカイン（主に VEGF-A）を中和する高分子製剤がある。チロシンキナーゼ阻害薬（ソラフェニブ、ス 30 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 ニチニブ及びアキシチニブ）は VEGFR-2 の内因性チロシンキナーゼ活性を阻害する作 用を有しており、これらの薬剤は肝臓癌、腎臓癌や消化管間質腫瘍の治療に寄与してい る。 ラムシルマブは VEGF リガンドではなく VEGFR-2 を標的する血管新生阻害薬である。 ラムシルマブは VEGFR-2 に結合する 3 つの VEGF リガンドの作用をいずれも阻害する ことから、VEGF/VEGFR-2 経路をより強く阻害する可能性がある。また、ラムシルマブ は VEGFR-2 の内在化を引き起こすことにより VEGFR-2 経路を介したシグナル伝達を減 弱させる可能性もある。抗体製剤であるラムシルマブは VEGFR-2 に対する高い特異性 を有しており、VEGF 受容体チロシンキナーゼ阻害薬で見られるようなオフターゲット 毒性を誘発する可能性は低い。また、標準的な化学療法薬と併用した場合の相加作用も 期待される。 一連の in vitro 試験において、ラムシルマブは VEGFR-2 に対する高い親和性を示し、 VEGF の結合を阻害した。ラムシルマブは、腫瘍血管新生に重要な VEGF による VEGFR-2 の活性化、シグナル伝達及び血管内皮細胞の応答（遊走、増殖及び生存）を阻 害したことから、腫瘍血管新生阻害作用を示すことが示唆された。 血管新生阻害薬は宿主の血管系や腫瘍間質への作用を介して抗腫瘍効果を示すが、ラ ムシルマブのマウス VEGFR-2 に対する結合能は低いため、ヒト癌のマウス異種移植モ デルを用いた試験にはマウスの VEGFR-2 に作用する DC101 を用いる必要があった。In vitro 試験で DC101 は VEGF のマウス VEGFR-2 への結合や活性化を阻害し、VEGFR-2 阻 害薬に予想される腫瘍微小血管密度を減少させる作用なども報告されている。このよう な薬理学的特性から、DC101 は VEGFR-2 を標的とするラムシルマブの薬効を評価する のに適したサロゲート抗体と考えられる。 DC101 を用いて、抗 VEGFR-2 抗体（ラムシルマブ）の抗腫瘍効果をヒト膵臓癌マウ ス異種移植モデルで評価した。本試験の目的は抗腫瘍効果と有効血中濃度の関係を明ら かにし、臨床有効用量の推定を行うことであった。18 g/mL 以上の平均血清中濃度をも たらす用量で有意な抗腫瘍効果が認められたことから、臨床試験ではこの濃度を維持す ると推測される用量を選択することとした。なお、DC101 のマウス VEGFR-2 への親和 性はラムシルマブのヒト VEGFR-2 への親和性の 1/10（評価資料 1001- ）から 1/2（参 考資料 Lu 2003）であるため、ヒトでのラムシルマブの有効血中濃度は 18 g/mL よりも 低くなる可能性がある。続いて、胃癌患者由来腫瘍組織片を用いたマウス異種移植モデ ル、並びにヒト胃癌細胞株を用いたマウス異種移植モデルでの検討から、DC101 の胃癌 に対する抗腫瘍効果を確認した。さらに、現在実施中の第 III 相臨床試験の対象癌種（肝 臓癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌）に対する DC101 の有効性もマウス異種移植モデルで 示唆されている。これらの試験では、通常、DC101 は 40 mg/kg で週 3 回、腹腔内投与し た（20 年半ば以降に実施した試験では 20 mg/kg を週 2 回腹腔内投与）。DC101 を単独 投与した試験における腫瘍増殖阻害率の平均は 59%（55 試験）であり、その範囲は 27% ～78%であった。また、ヒト胃癌細胞株を用いたマウス異種移植モデルでの検討に おいて、DC101 はパクリタキセルの抗腫瘍効果を増強させる可能性が示唆された。これ 31 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 らの成績から、抗 VEGFR-2 抗体（ラムシルマブ）は胃癌に対する有効な治療薬と成り 得ることが示唆される。 サルを用いた反復毒性試験の一環として、評価した安全性薬理パラメータについて、 特記すべき所見は認められなかった。 以上、ラムシルマブはヒト VEGFR-2 に特異的かつ高い親和性で結合し、VEGF による VEGFR-2 の活性化、シグナル伝達及び血管内皮細胞の応答を阻害することが示された。 担癌マウスを用いた検討では、DC101 の投与による血管新生阻害作用及び抗腫瘍効果が 認められた。これらの成績は胃癌患者へのラムシルマブ投与の妥当性を支持するもので あった。 2.6.2.7 図表 図表は本文中の適切な箇所に記載した。 2.6.2.8 参考文献 de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al. A large nonimmunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem. 1999;274:18218-18230. Ferrara N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis. Breast Cancer Res Treat. 1995;36:127-137. Lu D, Jimenez X, Zhang H, Bohlen P, Witte L, Zhu Z. Selection of high affinity human neutralizing antibodies to VEGFR2 from a large antibody phage display library for antiangiogenesis therapy. Int J Cancer. 2002;97:393-399. 32 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 Appendix A：本承認申請で提出しなかった薬効薬理試験報告書一覧（参考） （続く） 33 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 Appendix A：本承認申請で提出しなかった薬効薬理試験報告書一覧（参考）（続き） （続く） 34 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.2 薬理試験の概要文 Appendix A：本承認申請で提出しなかった薬効薬理試験報告書一覧（参考）（続き） 35 2.6.3 薬理試験概要表 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 サイラムザ点滴静注液 100 mg サイラムザ点滴静注液 500 mg 2.6.3 薬理試験概要表 日本イーライリリー株式会社 2.6.3 薬理試験概要表 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 目次 2.6.3 薬理試験概要表 ......................................................................................................... 1 2.6.3.1 薬理試験：一覧表 ............................................................................................. 1 2.6.3.2 効力を裏付ける試験 ......................................................................................... 8 2.6.3.3 副次的薬理試験（該当せず） ......................................................................... 8 2.6.3.4 安全性薬理試験 ................................................................................................. 8 2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 ............................................................................. 8 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3 2.6.3 薬理試験概要表 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表 Type of Study Primary Pharmacodynamics In Vitro Binding/Blocking Binding to human VEGFR-2 Blocking VEGF binding to human VEGFR-2 Blocking of binding of 125I-VEGF to VEGFR2 () cells VEGFR-2 Specificity Binding to a panel of growth factor RTKs (Pan-Target Assay) Binding to VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 Binding to human, monkey, rabbit, and dog VEGFR-2 Structure Analysis Structure of ramucirumab Fab fragment bound to VEGFR-2 Ig domain 3 *は評価資料を示す Location in CTD Test System/Animal/Cell Line Route Testing Facility Document ID Biacore ImClone Systems ImClone Systems HUVEC N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Lu 2003 Zhu 2003 1001- * 1001- * Lu 2003 Zhu 2003 Zhu 2003 4.2.1.1.1 4.2.1.1.2 4.2.1.1.3 4.2.1.1.3 4.2.1.1.1 4.2.1.1.2 4.2.1.1.2 ELISA N/A PT-1202* 4.2.1.1.4 ELISA N/A IMC01* 4.2.1.1.5 Biacore N/A Eli Lilly and Company bTDR275* 4.2.1.1.6 Co-crystallization and structure determination N/A ImClone Systems Franklin 2011 4.2.1.1.7 ELISA ELISA ImClone Systems ImClone Systems ImClone Systems （続く） 1 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Primary Pharmacodynamics (Continued) In Vitro (Continued) VEGFR-2/VEGF-ligand interactions Inhibition of VEGF-A, -C and -D binding to VEGFR-2 VEGF-C-induced endothelial cell proliferation VEGF-C-induced endothelial cell sprouting Blocking VEGF-C-induced heterodimerization of VEGFR-2 and VEGFR3 Functional Assays Inhibition of VEGF-stimulated VEGFR-2 phosphorylation Inhibition of VEGF-induced calcium mobilization Inhibition of VEGF-induced endothelial cell mitogenesis Inhibition of VEGF-induced migration of leukemia cells VEGFR-2 Internalization Down-modulation of surface VEGFR-2 2.6.3 薬理試験概要表 Test System/Animal/Cell Line Route ELISA N/A Human lymphatic endothelial cells N/A Human dermal microvascular endothelial cells N/A In situ PLA assay with intact HSaVECs Testing Facility Document ID Location in CTD IMC04* 4.2.1.1.8 Goldman 2007 4.2.1.1.9 Tvorogov 2010 4.2.1.1.10 N/A École Polytechnique Fédérale de Lausanne Haartman Institute and Helsinki University Central Hospital Uppsala University Nilsson 2010 4.2.1.1.11 HUVEC PAE-KDR cells PAE-KDR cells N/A ImClone Systems Lu 2003 4.2.1.1.1 N/A ImClone Systems Miao 2006 4.2.1.1.12 HUVEC N/A ImClone Systems Zhu 2003 4.2.1.1.2 HL60 and HEL cells N/A ImClone Systems Zhu 2003 4.2.1.1.2 PAE-KDR cells, primary human aortic endothelial cells and dermal microvascular endothelial cells N/A IMC02* 4.2.1.1.13 （続く） 2 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Primary Pharmacodynamics (Continued) In Vitro (Continued) Effector Function Assay Binding to Fc binding proteins Induction of ADCC activity Epitope Analysis Contact residues between ramucirumab Fab and domain 3 of VEGFR-2 Binding/Blocking (DC101) Binding of DC101 to mouse VEGFR-2 Absence of binding of DC101 to mouse VEGFR-1 Inhibition of binding of VEGF-C to mouse VEGFR-3 Functional Assays (DC101) Inhibition of VEGF-stimulated VEGFR-2 phosphorylation Inhibition of VEGF-D-stimulated VEGFR-2 phosphorylation 2.6.3 薬理試験概要表 Test System/Animal/Cell Line Route ELISA Biacore Cell-based ADCC assay Testing Facility Document ID Location in CTD N/A N/A N/A N/A N/A N/A 3.2.S.3 3.2.S.3 3.2.S.3 Co-crystallization N/A N/A 3.2.S.3 Biacore ELISA Flk-1 transfected NIH 3T3 cells ELISA N/A N/A N/A N/A 4.2.1.1.3 4.2.1.1.3 4.2.1.1.14 4.2.1.1.15 ELISA N/A ImClone Systems Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology ImClone Systems 1001- * 1001- * Rockwell 1995 Luttun 2002 Pytowski 2005 4.2.1.1.16 Flk-1 transfected NIH 3T3 cells N/A ImClone Systems Rockwell 1995 4.2.1.1.14 Western blot of phosphorylated VEGFR-2 in mouse lymphatic cells N/A Peter MacCallum Cancer Centre Karnezis 2012 4.2.1.1.17 （続く） 3 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Primary Pharmacodynamics (Continued) In Vivo Mechanism of Action Studies (DC101) Induction of apoptosis of endothelial cells and tumor cells Anti-angiogenic mechanism of action demonstrated by: a. b. c. Reduction in tumor microvascular density Reduction in tumor vascular perfusion Induction of tumor hypoxia or a combination of above methods Test System/Animal/Cell Line Route Testing Facility Document ID Location in CTD Colorectal carcinoma liver metastases model in athymic nude mice Orthotopic prostate carcinoma models in athymic nude mice IP Bruns 2000 4.2.1.1.18 Sweeney 2002 4.2.1.1.19 Harvey ras-transformed human keratinocyte subcutaneous tumor model in athymic nude mice Orthotopic breast carcinoma model in SCID mice IP University of Texas M. D. Anderson Cancer Center The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center German Cancer Research Center Krix 2003 4.2.1.1.20 Sunnybrook and Women’s College Health Sciences Centre Sunnybrook and Women’s College Health Sciences Centre German Cancer Research Center Franco 2006 4.2.1.1.21 Cheung 2007 4.2.1.1.22 Jugold 2008 4.2.1.1.23 Purdue University Stantz 2011 4.2.1.1.24 Intradermal human melanoma xenograft model in athymic nude mice Harvey ras-transformed human keratinocyte subcutaneous tumor model in athymic nude mice Subcutaneous human breast cancer xenograft model in athymic nude mice. VEGF-over-expressing cell line. IP IP IP IP IV （続く） 4 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Primary Pharmacodynamics (Continued) In Vivo (Continued) Mechanism of Action Studies (DC101) (Continued) Anti-angiogenic mechanism of action demonstrated by: a. b. c. Reduction in tumor microvascular density Reduction in tumor vascular perfusion Induction of tumor hypoxia or a combination of above methods (Continued) Effect of DC101 on homing of circulating endothelial progenitor cells (CEP) into tumor vasculature Test System/Animal/Cell Line Route Testing Facility Document ID Location in CTD Harvey ras-transformed human keratinocyte subcutaneous tumor model in athymic nude mice Androgen-dependent male mouse mammary carcinoma (Shionogi) in a dorsal skin window of SCID mice RIP1-Tag2 transgenic model of pancreatic islet tumor. Demonstration of tumor hypoxia and increased local metastasis after anti-angiogenic therapy. Models of human pancreatic, head and neck, or colorectal tumors in athymic nude mice RIP1-Tag2 transgenic model of pancreatic islet tumor on immunodefficient (Rag1 null) background. Demonstration of drug resistance due to expression of alternate angiogenic factors. Lewis lung carcinoma (LLC) model in immunocompetent mice SC German Cancer Research Center Kiessling 2004 4.2.1.1.25 IP Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School HansenAlgenstaedt 2000 4.2.1.1.26 IP Catalan Institute of Oncology Pàez-Ribes 2009 4.2.1.1.27 IP ImClone Systems Tonra 2009 4.2.1.1.28 IP University of California Casanovas 2005 4.2.1.1.30 IP University of Toronto Shaked 2008 4.2.1.1.29 （続く） 5 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Primary Pharmacodynamics (Continued) 2.6.3 薬理試験概要表 Test System/Animal/Cell Line In Vivo (Continued) Mechanism of Action Studies (Ramucirumab) Anti-angiogenic effect Athymic nude mouse co-implanted with human endothelial progenitor cells and adipose-derived stem cells under the skin Studies in Murine Xenograft Models of Human Cancers (DC101) Determination of DC101 pharmacokinetic Subcutaneous human pancreatic tumor parameters associated with anti-tumor efficacy xenograft model in athymic nude mice (PK/PD) Gastric cancer monotherapy study Patient-derived xenograft (PDX) models of human gastric cancer in athymic BALB/c nude mice Efficacy of DC101 in combination with Subcutaneous human gastric tumor paclitaxel xenograft model in athymic nude mice Subcutaneous human gastric tumor xenograft model in athymic nude mice Efficacy of DC101 in combination with Subcutaneous model of human bladder paclitaxel cancer in athymic BALB/c nude mice Efficacy of DC101 in combination with paclitaxel Efficacy of DC101 in combination with paclitaxel or gemcitabine Orthotopic and bone metastasis prostate carcinoma models in athymic nude mice Lewis lung carcinoma (LLC) model in immunocompetent mice Route Testing Facility Document ID Location in CTD IP Eli Lilly and Company IMC03* 4.2.1.1.31 IP 2212- * 4.2.1.1.32 IP 5538- * 4.2.1.1.33 IP 5569- * 4.2.1.1.34 IP 5634- * 4.2.1.1.35 IP IP IP The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center University of Texas M. D. Anderson Cancer Center University of Toronto Inoue 2000 4.2.1.1.36 Sweeney 2002 4.2.1.1.19 Shaked 2008 4.2.1.1.29 （続く） 6 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） Type of Study Secondary Pharmacodynamics – Not Applicable Safety Pharmacology Cardiovascular assessment 2.6.3 薬理試験概要表 Test System/Animal/Cell Line Route Cynomolgus; Monkey IV (infusion) Testing Facility Document ID Location in CTD 1163-110* 4.2.3.2.2 a Pharmacodynamic Drug Interactions – Not Applicable Abbreviations: ADCC Antibody-dependent cell cytotoxicity, HSaVEC Human saphenous vein endothelial cells, HUVEC Human umbilical vein endothelial cells, In situ PLA assay In situ proximity ligation assay, IP intraperitoneal, IV intravenous, N/A not applicable, PAE- KDR cells Porcine aortic endothelial cells transfected with human VEGFR-2, RTK Receptor tyrosine kinases, SC subcutaneously. a The study was performed under a name of . The name of the testing facility changed, due to the merger. 7 LY3009806 サイラムザ点滴静注液 2.6.3.2 2.6.3 薬理試験概要表 効力を裏付ける試験 第 2.6.2 項「薬理試験の概要文」参照。 2.6.3.3 副次的薬理試験（該当せず） 2.6.3.4 安全性薬理試験 Organ Systems Species / Strain Evaluated Cardiovasculara a b Doses (mg/kg) Gender and No. Per Group IV (infusion) 0, 5, 16, 50 Once per week for 12b- or 39-weeks Male: 3 per dose group Female: 6 per dose groupb Noteworthy Findings GLP Document ID Location in CTD No compound Yes 1163-110 4.2.3.2.2 related-abnormal findings (physical examination, blood pressure, electrocardiogram, and rectal body temperature) The evaluation was conducted as a part of the 39-week repeated dose toxicity study (Study 1163-110). The electrocardiogram was measured on Study Day 268 (approximately 24 hours after dosing on Study Day 267). The blood pressure was measured on Pre-initial dose, 1 hour after dosing on Study Day 1 and 29, prior to 12-week termination (Study Day 84) for all animals, and 24 hours after the last dose (Study Day 268) for the 39-week animals. Three female animals in each dose group were sacrificed for the interim evaluation after Week 12. 2.6.3.5 Cynomolgus, Monkey Route 薬力学的薬物相互作用試験 第 2.6.2 項「薬理試験の概要文」参照。 8