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トリプトファン生合成に関連する単一また は複数の
JP 2007-515168 A 2007.6.14 (57)【要約】 本発明は、トリプトファン生合成に関連する単一また は複数の変異遺伝子を含有するトリプトファン産生大腸 菌変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）および同 菌株を使用するトリプトファンの製造方法に関する。よ り具体的には、トリプトファン産生大腸菌変異株ＣＪ２ ８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）由来の、トリプトファン 生合成に関連するａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およ びｔｙｒＲのＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を開示 し、該変異遺伝子の少なくとも１つを含有する大腸菌Ｃ Ｊ２８５をグルコース含有発酵培地中で直接培養し、こ れによりＬ−トリプトファンを培養培地中に蓄積させる ことができる。 (2) JP 2007-515168 A 2007.6.14 【特許請求の範囲】 【請求項１】 トリプトファン生合成に関連するａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲから なる変異遺伝子の少なくとも１つを含有するＬ−トリプトファン産生大腸菌変異株。 【請求項２】 大腸菌変異株が大腸菌ＣＪ２８５ ＫＣＣＭ−１０５３４である、請求項１に記載の変 異株。 【請求項３】 請求項１または請求項２の大腸菌変異株を使用するＬ−トリプトファンの製造方法。 【発明の詳細な説明】 10 【技術分野】 【０００１】 本発明は、トリプトファン生合成に関連する単一または複数の変異遺伝子を含有するト リ プ ト フ ァ ン 産 生 大 腸 菌 （ E.coli） 変 異 株 Ｃ Ｊ ２ ８ ５ （ Ｋ Ｃ Ｃ Ｍ − １ ０ ５ ３ ４ ） お よ び 同 菌株を使用するトリプトファンの製造方法に関する。より具体的には、Ｎ−メチル−Ｎ' −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（本明細書中、以後ＮＴＧと称する）を繰り返し処理 し、トリプトファン産生変異遺伝子ＣＪ２８５由来の遺伝子、例えばトリプトファンアナ ロ グ で あ る ヒ ド ロ キ サ ム 酸 ト リ プ ト フ ァ ン （ Tryptophan Hydroxamate） （ 本 明 細 書 中 、 以 後ＴＨＸと称する）に耐性のＤＡＨＰシンターゼのアイソザイムをエンコードするａｒｏ ＦおよびａｒｏＧ、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲ、トリプトファン生合成に関連するａ 20 ｒｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔｙｒＡ、ａｒ ｏＧ、およびａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質の塩基配列およびアミ ノ酸配列を見出す。その後、上記遺伝子（群）を含有する変異株をグルコース含有培地中 で発酵させ、Ｌ−トリプトファンを製造する。 【背景技術】 【０００２】 トリプトファンは必須アミノ酸の１つであり、多岐にわたる分野で広く使用されている 。前記分野には、飼料添加物、医療用物質、例えば睡眠薬または精神安定薬またはリンガ ー溶液、および健康食品用物質が含まれる。トリプトファンの典型的な製造方法は、化学 合成、酵素反応、および微生物を使用する発酵である。化学合成の場合、高温および高圧 30 空間で製造が行われ、Ｄ−トリプトファンおよびＬ−トリプトファンがともに生産される ため、所望のトリプトファンを取得するために追加の精製工程が必要とされる。酵素反応 、 例 え ば Matsui Doatsuiに 付 与 さ れ た 日 本 特 許 （ 韓 国 特 許 公 開 第 ９ ０ − ０ ０ ５ ７ ７ ３ 号 ） の場合、反応の基質として使用されるインドールおよびセリンが非常に高価であり、また 酵素自体が安全ではない。 【０００３】 一 方 、 微 生 物 を 使 用 す る 発 酵 で は 、 多 様 な 微 生 物 、 例 え ば 大 腸 菌 （ E.coli） お よ び コ リ ネ バ ク テ リ ウ ム （ Corynebacterium） の 栄 養 要 求 株 お よ び 調 節 変 異 株 を 使 用 す る 。 １ ９ ８ ０年代の遺伝子組換え分野における急速な技術の進歩により、代謝およびその制御メカニ ズムに関する大量の情報が提供されている。多数の研究者らが注目すべき成功を収め、遺 40 伝 子 操 作 に よ っ て 優 れ た 組 換 え 株 を 開 発 し 、 生 産 性 を 向 上 さ せ た （ Matsui et al, 1988） 。また韓国では、直接発酵に関連するいくつかのトリプトファン製造技術が開示された。 これらの技術は、トリプトファン耐性または栄養要求性変異株（韓国特許公開第８７−１ ８１３号、第９０−８２５１号、および第９２−７４０５号）または組換え株（韓国特許 公開第９０−５７７２号および第９１−５６２７号）の使用に基づくものである。主に、 これらのトリプトファンアナログ耐性株はトリプトファン生合成時の酵素のフィードバッ ク阻害を克服するためのものであり、また、組換え株はトリプトファン生合成時の酵素の クローニングに使用された。実際に、前記研究は注目すべき成功を収めた。例えば、大腸 菌の人工変異体を使用する従来のＬ−トリプトファン製造の最大の利点は、Ｌ−トリプト ファンの製造に安価な培養基質を使用することであった。しかし、生産性すなわちトリプ 50 (3) JP 2007-515168 A 2007.6.14 トファン収率（量）は非常に低かった。したがって、遺伝子組換えに基づくトリプトファ ン収率を最大にするために、親株として優れている人工変異体を確保し、調節が解除され ている遺伝子を取得する必要性が存在する。 【０００４】 したがって、本発明は上記問題を考慮して達成されており、本発明の目的は、ホスホエ ノ ー ル ピ ル ビ ン 酸 お よ び エ リ ト ロ ー ス （ Erythorse） ４ − リ ン 酸 か ら の 、 大 腸 菌 変 異 株 Ｃ Ｊ２８５由来のトリプトファン生合成時の芳香族アミノ酸の第一前駆体である３−デオキ シ ア ラ ビ オ ノ ヘ プ ツ ロ ソ ン 酸 ７ − リ ン 酸 （ 3-deoxyarabionohep-tulosonate 7-phosphate ）（本明細書中、以後ＤＡＨＰと称する）の合成において使用される酵素であるａｒｏＦ およびａｒｏＧ、およびトリプトファン合成に関連する遺伝子の調節転写に関するｔｒｐ 10 ＲおよびｔｙｒＲをエンコードする変異遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を同定する ことである。 【０００５】 本発明の別の目的は、単一または複数の上記変異遺伝子を含有するＬ−トリプトファン 産生大腸菌変異株を提供することである。 【０００６】 本発明のさらに別の目的は、該変異体をグルコース含有発酵培地中で直接培養すること に基づく、高濃度および高収率（量）のＬ−トリプトファンの製造方法を提供することで ある。 【発明の開示】 20 【発明が解決しようとする課題】 【０００７】 本発明の一側面では、トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変 異株を提供することによって上記および他の目的を達成することができ、この場合、トリ プトファン産生親株である大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）中でＮＴＧを繰り返 し処理して変異を誘発し、該変異体（ＣＪ２８５）を、トリプトファンアナログであるＴ ＨＸに耐性にし、これにより該変異株のトリプトファン生産を親株と比べて著しく向上さ せることができる。また、ＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を解析するために、トリプ トファン生合成時の芳香族アミノ酸の第一前駆体ＤＡＨＰの合成に関する酵素であるａｒ ｏＦおよびａｒｏＧ、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲタンパク質、トリプトファン生合成 30 に関連するａｒｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔ ｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質をエンコードす る遺伝子をクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較する。 この様式で、遺伝子変異の位置を決定することが可能になる。その後、ａｒｏＦ、ａｒｏ Ｇ、ｔｒｐＲおよびｔｙｒＲの少なくとも１つを含有するＣＪ２８５株をグルコース含有 発酵培地中で直接培養する。親株と比較して、ＣＪ２８５ははるかに大量のトリプトファ ンを生産した。 【０００８】 換言すると、大腸菌ＣＪ２８５株は遺伝子組換え技術によってトリプトファン収率を最 大にするのに役立ち、決して開示されていない新規株である。 40 【課題を解決するための手段】 【０００９】 本発明は、Ｌ−トリプトファンの製造方法であって、下記段階を含む方法を提供する： ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子のプライマーを増幅し、この場合、該遺 伝子は３−デオキシアラビオノヘプツロソン酸７−リン酸（ＤＡＨＰ）の合成に関与する 酵素、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲタンパク質、トリプトファン生合成に関連するａｒ ｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔｙｒＡ、ａｒｏ Ｇ、およびａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質をエンコードするもので あり、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターによって該遺伝子をクローニングして、予想サイ ズのバンドと反応するプラスミドクローンを検索する段階；双方向塩基配列解析に基づい 50 (4) JP 2007-515168 A 2007.6.14 てａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲ遺伝子の塩基配列を決定し、この場合 、鋳型として上記４遺伝子を含有するプラスミドクローンを使用し、該塩基配列からアミ ノ酸配列を決定し、ならびに該遺伝子の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較して変 異の位置を決定する段階；および変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙ ｒＲの１つまたはそれ以上を含有する大腸菌変異株ＣＪ２８５をグルコース含有発酵培地 中で発酵させて、Ｌ−トリプトファンを製造する段階。 【００１０】 本 発 明 で 使 用 さ れ る 遺 伝 子 操 作 は Molecular Cloning Laboratory Manual（ T. Maniatis E.F., Flitch, J. Sambrook） に し た が う 。 【００１１】 10 トリプトファン産生親株大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を、トリプトファン アナログである０．３ｇ／ｌのＴＨＸを含有するプレート最少培地中、恒温下で５日間培 養した。成長速度を増加させ、ＴＨＸに対するＣＪ１８１の感受性を解除するために、変 異誘発物質である５００μｇ／ｍｌのＮＴＧを培地中に加えた。０．３ｇ／ｌのＴＨＸを 含有する最少培地中で生育した任意の菌株を一次選択し、０．５ｇ／ｌのＴＨＸを含有す る最少培地中でこれらの選択株を再度培養した。最後に、高度にＴＨＸ耐性である菌株を 選 択 し 、 Ｃ Ｊ ２ ８ ５ と 命 名 し た 。 最 少 培 地 の 成 分 を 下 記 表 1に 示 す 。 そ れ ぞ れ １ ０ ０ ｍ ｇ ／ｌの栄養要求性アミノ酸を培地に加えた。 【００１２】 大腸菌最少培地（Ｍ９培地）の組成 20 【表１】 30 【００１３】 本発明の変異株ＣＪ２８５を３７℃のＬＢ培地中での１２時間振盪培養に付した。ＬＢ 培地（ｐＨ＝７．４）は、１％のバクトトリプトン、０．５％のバクトイーストエクスト ラ ク ト 、 お よ び １ ％ の Ｎ ａ Ｃ ｌ を 含 有 し た 。 培 地 か ら ミ コ ビ オ ン ト （ mycobiont） を 収 集 し 、 Quiagen染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ 単 離 キ ッ ト を 用 い て 染 色 体 Ｄ Ｎ Ａ を 取 得 し た 。 こ う し て 得 ら れ た染色体ＤＮＡをエタノールに浸し、乾燥して精製した。鋳型であるこの精製済み染色体 Ｄ Ｎ Ａ を Ｐ Ｃ Ｒ に 付 し た 。 Quiagenゲ ル 抽 出 キ ッ ト を 用 い て 、 約 １ ． ３ ｋ ｂ 、 ２ ｋ ｂ 、 ５ 40 ３０ｂｐ、および１．９ｋｂのａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲ変異遺伝 子を１％のアガロースゲルからそれぞれ分離し、その遺伝子断片を精製して、クローニン グ 用 の 遺 伝 子 リ ソ ー ス と し て 使 用 し た 。 Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト （ Invitrogen Compa ny製 ） を 用 い て 、 Ｃ Ｊ ２ ８ ５ 株 由 来 の 前 記 変 異 遺 伝 子 断 片 を ｐ Ｃ Ｒ ２ ． １ − Ｔ Ｏ Ｔ Ｏ ベ ク ターにクローニングし、その結果、該遺伝子を含有するクローンを同定した。 【００１４】 ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲタンパク質をエンコードする遺伝子の 塩基配列およびアミノ酸配列を決定するために、変異遺伝子（群）を含有するプラスミド を単離および精製し、プロモーターに続く配列、遺伝暗号領域、タンパク質合成終結コド ンを含む遺伝子配列全体を決定した。本発明の遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定するために 50 (5) JP 2007-515168 A 2007.6.14 、前記単離精製済みプラスミドＤＮＡをシークエンシングプライマーおよびポリメラーゼ と混合し、ＰＣＲによって増幅した。こうして増幅されたプラスミドＤＮＡをエタノール に浸して精製し、Ｈｉ−Ｄｉ溶液と混合した。結果として、プラスミドＤＮＡを、一本鎖 を 含 有 す る ｄ ｓ Ｄ Ｎ Ａ に 変 換 し 、 塩 基 配 列 解 析 装 置 ABI 3100（ Applied Biosystem製 ） を 用 い て Ｄ Ｎ Ａ 塩 基 配 列 の 解 析 を 行 っ た 。 Ｄ Ｎ Ａ 塩 基 配 列 の 解 析 は 、 U.S. NCBI（ National Center for Biotechnology Information） ウ ェ ブ サ イ ト の BLAST（ http://www.ncbi.nlm.n ih.gov/BLAST/） 検 索 プ ロ グ ラ ム お よ び ExPasyウ ェ ブ サ イ ト の Tools PROGRAM（ http://us. expasy.org/tools/dna.html） に 基 づ い て 実 施 し た 。 そ の 後 、 こ う し て 決 定 さ れ た 遺 伝 子 の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較して、何らかの変異が存在するかどうかを調 べ、翻訳によって変異アミノ酸を同定した。 10 【００１５】 変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲの少なくとも１つを含有す るＣＪ２８５変異株をグルコース含有発酵培地中で直接発酵させ、Ｌ−トリプトファンを 生産させた。より具体的には、好気性条件（２００−３００ｒｐｍのフラスコ振盪または ４００−１０００ｒｐｍの発酵槽、および気流の量＝０．５−１．５ｖｖｍ）、発酵温度 ＝３０℃およびｐＨ＝６．０∼８．０の条件下で前記変異株を培養し、生じたＬ−トリプ トファンを培養培地中に蓄積させた。フラスコを使用する場合、３０℃および２２０ｒｐ ｍで４８−６０時間、変異株を培養し、生じたＬ−トリプトファンを培養培地中に蓄積さ せ た 。 発 酵 槽 を 使 用 す る 場 合 は 流 加 培 養 法 （ fed batch cultivation） を 使 用 す る 。 そ し てグルコースを複数回追加供給して、Ｌ−トリプトファンを製造した。発酵培地の成分を 20 下記表２に挙げる。 【００１６】 発酵培地の組成 【表２】 30 【００１７】 培養培地のミコビオントの成長速度を調べるために、６００ｎｍで吸光度を測定した。 ま た 、 ベ ル ト ラ ン （ Bertrand） 法 に 基 づ い て 糖 分 析 を 実 施 し た 。 同 時 に 、 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ （ 高 性 能液体クロマトグラフィー）を用いてＬ−トリプトファンの量を分析した。 40 【００１８】 本発明の好ましい実施態様を例証のために開示してきたが、特許請求の範囲に開示され る本発明の範囲および思想から逸脱することなく種々の修飾、付加および置換が可能であ ることが当業者には認識されよう。 【発明の効果】 【００１９】 本発明では、大腸菌ＣＪ１８１においてＮＴＧを繰り返し処理することによって新規大 腸菌変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）を開発する。この菌株は、トリプトファ ンアナログであるヒドロキサム酸トリプトファンに耐性である。トリプトファン生合成に 関連する変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲのＤＮＡ塩基配列お 50 (6) JP 2007-515168 A 2007.6.14 よびアミノ酸を解析することによって、重要な変異を同定することができ、組換え株の開 発において使用するのに適した変異遺伝子を取得することができる。さらに、親株ＣＪ１ ８１と比較して、該変異遺伝子の少なくとも１つを含有するその変異株ＣＪ２８５は多量 （約１０％増）のトリプトファンを生産する能力を有する。したがって本発明のＣＪ２８ ５は、組換え株の開発用の適切な母株として、ならびにアミノ酸発酵産業および医薬品製 造に関して非常に有益に使用することができる。 【発明を実施するための最良の形態】 【００２０】 【実施例１】 【００２１】 10 実施例１：ＴＨＸ耐性変異株ＣＪ２８５の選択 トリプトファン産生親株大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を３７℃のＬＢ培地 中での１２時間振盪培養に付し、滅菌生理食塩水溶液中で２回すすいだ。この場合、ＬＢ 培 地 （ ｐ Ｈ ＝ ７ ． ４ ） は 、 １ ％ の バ ク ト ト リ プ ト ン （ Bacto-Trypton） 、 ０ ． ５ ％ の バ ク ト イ ー ス ト エ ク ス ト ラ ク ト （ Bacto-yeast extract） 、 お よ び １ ％ の Ｎ ａ Ｃ ｌ を 含 有 し た 。このＣＪ１８１を０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）中で希釈し、最 終的にＯＤ＝１．０にした。０．３ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地（表１を参照のこ と）中で５日間、ＣＪ１８１を培養した。成長速度を増加させ、ＴＨＸ耐性ＣＪ１８１を 作成するために、変異誘発物質である５００μｇ／ｍｌのＮＴＧを培地中に加えた。溶液 を３７℃恒温槽に入れて３０分間反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）中で 20 ３回すすいだ。次いで、０．５ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地（表１を参照のこと） 中で５日間、ＣＪ１８１を培養し、その結果、約１００コロニーを取得した。こうして得 られた変異株および元の親株をフラスコ中のトリプトファン発酵試験の対象とした。結果 的に、元の大腸菌親株ＣＪ１８１より優れたトリプトファン生産能力を特徴とする大腸菌 ＣＪ２８５を選択することができた。該菌株からＬ−トリプトファン生産用の最良の菌株 を単離し、三角フラスコに入れた。フラスコ中の菌株に関してトリプトファン生産試験を 実施した後、下記実施例６に記載のように５Ｌ発酵槽中で発酵実験を実施した。 【００２２】 新規開発の人工変異株についてのフラスコ中での実験結果 【表３】 30 【００２３】 表３に見られるように、大腸菌変異株ＣＪ２８５から生産されるＬ−トリプトファンの 濃度は元の親株大腸菌ＫＦＣＣ１０９０２より高濃度であった。ＣＪ２８５は、２００３ 年 １ １ 月 ２ ８ 日 付 け で Ｋ Ｃ Ｃ Ｍ （ Korean Culture Center of Microorganisms） に 寄 託 さ れ、番号ＫＣＣＭ−１０５３４を付与された。 40 【実施例２】 【００２４】 実施例２：変異株ＣＪ２８５のａｒｏＦ遺伝子クローニングおよび配列解析 ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってａｒｏＦ 遺 伝 子 を 増 幅 す る た め に 、 下 記 プ ラ イ マ ー （ ２ １ 量 体 ） を 使 用 し た 。 5'-GTATTTACCCCGTTA TTGTC-3'を セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し 、 5'-CACTTCAGCAACCAGTTCCAG-3'を ア ン チ セ ン スプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび ２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび反応バッファーを 含 有 す る Accupower PCR HL-Premixに 加 え 、 終 濃 度 を ２ ０ μ ｌ に し た 。 Ｐ Ｃ Ｒ プ ロ グ ラ ム を２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始され、その後３５秒、５５℃ 50 (7) JP 2007-515168 A 2007.6.14 で４０秒間、および７２℃で９０秒間であった。最後に、最終伸長を７２℃で７分間実施 した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって検査した。 【００２５】 遺 伝 子 断 片 を ｐ Ｃ Ｒ ２ ． １ − Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 Quiagenゲ ル抽出キットを用いて約１．３ｋｂ（ａｒｏＦ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子 断片を１％アガロースゲルから単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し 、 ク ロ ー ニ ン グ 用 の 遺 伝 子 リ ソ ー ス と し て 使 用 し た 。 Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト （ Invi trogen Company製 ） を 使 用 す る こ と に よ っ て 、 Ｃ Ｊ ２ ８ ５ 株 か ら 得 ら れ た 変 異 遺 伝 子 断 片 をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター溶液と１：４の割合で混合した。その後、１μｌの生 理食塩水溶液を混合物に加え、室温で２０分間反応を継続した。この反応溶液を、キット 10 に含まれる４０μｌのＴＯＰ１０コンピテント細胞と混合し、氷中に２０分間置いた。以 後、４２℃で３０秒間熱ショックを適用し、すぐに、再度氷中に２分間溶液を入れた。２ ５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間変異遺伝子を培養した。５０μｇ／ｍｌの アンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に１００μｌの培養培地を塗布し、３７℃で約１ ２時間、変異遺伝子を培養した。白色コロニーのみを選択し、５０μｇ／ｍｌのアンピシ リンを含有するＬＢ液体培地中で再度約１２時間培養した。プラスミドを単離し、Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素で２時間処理し、１％アガロースゲル電気泳動によって展開した。ＵＶイル ミネーターを使用して、変異遺伝子（群）を含有するクローンを同定した。 【００２６】 遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定するために、前記同定クローンからプラスミドを単離し 20 、精製した。その単離精製済みプラスミドを下記物質と混合した：相補的水素結合によっ て ａ ｒ ｏ Ｆ 遺 伝 子 と 結 合 で き る ２ ｐ ｍ ｏ ｌ の 配 列 解 析 用 プ ラ イ マ ー 、 ２ μ ｌ の Big dye含 有ポリメラーゼ、および１μｌのプラスミドＤＮＡ（約２００ｎｇ）。次いで、はじめに ９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間で、２５回、ＰＣＲを実行 した。プラスミドＤＮＡをエタノールに浸して精製し、１０μｌのＨｉ−Ｄｉ溶液と混合 した。結果として、プラスミドＤＮＡを、一本鎖を含有するｄｓＤＮＡに変換し、塩基配 列 解 析 装 置 ABI 3100（ Applied Biosystem製 ） を 用 い て Ｄ Ｎ Ａ 塩 基 配 列 の 解 析 を 実 施 し た 。 Ｄ Ｎ Ａ 塩 基 配 列 の 解 析 は 、 U.S. NCBI（ National Center for Biotechnology Informati on） ウ ェ ブ サ イ ト の BLAST（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） 検 索 プ ロ グ ラ ム お よ び ExPasyウ ェ ブ サ イ ト の Tools PROGRAM（ http://us.expasy.org/tools/dna.html） に 基 づ 30 いて実施した。その後、こうして決定された遺伝子の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列 と比較して、何らかの変異が存在するかどうかを調べ、翻訳によって変異アミノ酸を同定 した。 【実施例３】 【００２７】 実施例３：変異株ＣＪ２８５のａｒｏＧ遺伝子クローニングおよび配列解析 ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってａｒｏＧ 遺 伝 子 を 増 幅 す る た め に 、 下 記 プ ラ イ マ ー （ ２ １ 量 体 ） を 使 用 し た 。 5'-GTATTTACCCCGTTA TTGTC-3'（ 配 列 番 号 ５ ） を セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し 、 5'-ACTCCGCCGGAAGTGACTAA-3' （配列番号６）をアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣ 40 Ｊ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ Ｔ Ｐ お よ び 反 応 バ ッ フ ァ ー を 含 有 す る Accupower PCR HL-Premixに 加 え 、 終 濃 度 を ２ ０ μ ｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始 され、その後３５秒、５５℃で４０秒間、および７２℃で２分２０秒間であった。最後に 、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動に よって検査した。 【００２８】 遺 伝 子 断 片 を ｐ Ｃ Ｒ ２ ． １ − Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 Quiagenゲ ル抽出キットを用いて約２ｋｂ（ａｒｏＧ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子断片 を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝子リ 50 (8) JP 2007-515168 A 2007.6.14 ソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列解析 は実施例２と同一である。 【実施例４】 【００２９】 実施例４：変異株ＣＪ２８５のｔｒｐＲ遺伝子クローニングおよび配列解析 ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってｔｒｐＲ 遺 伝 子 を 増 幅 す る た め に 、 下 記 プ ラ イ マ ー （ ２ １ 量 体 ） を 使 用 し た 。 5'-CGCCACGGAATGGGG ACGTCG-3'（ 配 列 番 号 ７ ） を セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し 、 5'-CCGCGTCTTATCATGCCTACC3'（ 配 列 番 号 ８ ） を ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し た 。 Ｐ Ｃ Ｒ で は 、 約 ３ ０ ｎ ｇ の ＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄ 10 Ｎ Ｔ Ｐ お よ び 反 応 バ ッ フ ァ ー を 含 有 す る Accupower PCR HL-Premixに 加 え 、 終 濃 度 を ２ ０ μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開 始され、その後１分、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間であった。最後に、最終 伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって 検査した。 【００３０】 遺 伝 子 断 片 を ｐ Ｃ Ｒ ２ ． １ − Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 Quiagenゲ ル抽出キットを用いて約５３０ｂｐ（ｔｒｐＲ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子 断片を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝 子リソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列 20 解析は実施例２と同一である。 【実施例５】 【００３１】 実施例５：変異株ＣＪ２８５のｔｙｒＲ遺伝子クローニングおよび配列解析 ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってｔｙｒＲ 遺 伝 子 を 増 幅 す る た め に 、 下 記 プ ラ イ マ ー （ ２ １ 量 体 ） を 使 用 し た 。 5'-GGATTGACGATGACA AACCT-3'（ 配 列 番 号 ９ ） を セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し 、 5'-CTGGTGGATGAAATCACCAC -3 '（ 配 列 番 号 １ ０ ） を ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 使 用 し た 。 Ｐ Ｃ Ｒ で は 、 約 ３ ０ ｎ ｇ のＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ お よ び 反 応 バ ッ フ ァ ー を 含 有 す る Accupower PCR HL-Premixに 加 え 、 終 濃 度 を ２ 30 ０μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で 開始され、その後１分、５３℃で３０秒間、および７２℃で２分２０秒間であった。最後 に、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動 によって検査した。 【００３２】 遺 伝 子 断 片 を ｐ Ｃ Ｒ ２ ． １ − Ｔ Ｏ Ｐ Ｏ ベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 Quiagenゲ ル抽出キットを用いて約１．９ｋｂ（ｔｙｒＲ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子 断片を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝 子リソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列 解析は実施例２と同一である。 40 【実施例６】 【００３３】 実施例６：５Ｌ発酵槽での変異株ＣＪ２８５の発酵 実施例２∼５に開示される塩基配列を有する変異遺伝子の少なくとも１つを含有する大 腸菌ＣＪ２８５、および親株ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を５Ｌ発酵槽で流加培養 した（発酵温度＝３０℃、培養ｐＨ＝６．９−７．１（ｐＨはアンモニア水によって調節 できる）、気流の量＝０．５−１．０ｖｖｍ、および撹拌速度＝５００−７００ｒｐｍ） 。ＣＪ２８５の発酵濃度は２８．２ｇ／ｌであり、親株ＣＪ１８１の発酵濃度は２５．１ ｇ／ｌであることが判明した。したがって大腸菌ＣＪ２８５の発酵時間はわずかに減少し 、Ｌ−トリプトファン生産性の毎時約１０％の増加が生じた。 50 (9) JP 2007-515168 A 2007.6.14 【００３４】 ５Ｌ発酵槽でのＣＪ２８５変異株の発酵 【表４】 【図面の簡単な説明】 【００３５】 10 上記および他の本発明の目的、特徴および他の利点は、添付の図面と併せて解釈される 下記の詳細な説明からさらに明確に理解されよう。 【００３６】 【図１】図１は、ａｒｏＦ遺伝子の内部配列中のＣＣＴが［ＴＣＴ］に変異し、その結果 、２８０番目のアミノ酸プロリンがセリンに変化している変異遺伝子（配列番号１）を示 す； 【図２】図２は、ａｒｏＧ遺伝子のプロモーター領域のＴ塩基が［Ｃ］塩基に変異し、該 遺伝子の内部配列中のＧＴＧが［ＧＣＧ］に変異し、ＴＧＣが［ＣＧＣ］に変異し、その 結果、それぞれ、５７番目のアミノ酸バリンがアラニンに変化し、６１番目のアミノ酸シ ステインがアルギニンに変化している変異遺伝子（配列番号２）を示す； 【図３】図３は、ｔｒｐＲ遺伝子の内部配列中の７０４番目のＧ塩基が欠失し、その結果 、 タ ン パ ク 質 翻 訳 時 の フ レ ー ム が 変 化 し 、 野 生 型 遺 伝 子 と 比 べ て ２ ３ ア ミ ノ 酸 [cgattgatt ttgtaggcctgataagacgtggcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccggatgcggcgtga]が 追 加 さ れ て い る 変異遺伝子（配列番号３）を示す；ならびに 【図４】図４は、ｔｙｒＲ遺伝子の内部配列中のＧＧＣが［ＧＡＣ］に変異し、ＣＴＧが ［ＣＴＡ］に変異し、その結果、２５番目アミノ酸グリシンがアスパラギン酸に変化し、 ８６番目のアミノ酸ロイシンがナンセンス変異に変化している変異遺伝子（配列番号４） を示す。 20 (10) 【図１】 【図２】 【図３】 【配列表】 2007515168000001.app 【図４】 JP 2007-515168 A 2007.6.14 (11) 【国際調査報告】 JP 2007-515168 A 2007.6.14 (12) JP 2007-515168 A 2007.6.14 (13) JP 2007-515168 A 2007.6.14 フロントページの続き (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF, CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU, CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M A,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW (72)発明者 パク，ヨン−フン 大韓民国，キョンギ−ド ４６３−７０３，ソンナム−シ，ブンダン−グ，クミ−ドン，１１１− １０２ ムジゲデリム エイピーティー． (72)発明者 リム，サン−チョ 大韓民国，キョンギ−ド ４４９−８４５，ヨンイン−シ，チュクチョン２−ドン，１０３−１６ ０２ ドンソン １チャ エーピーティー． (72)発明者 キム，ビョン−フン 大韓民国，インチョン ４０５−７４１，ナムドン−グ，マンソル−ドン，２ダンジ，２０５−１ ２０５ サムファン エーピーティー． (72)発明者 キム，ソン−ジン 大韓民国，キョンギ−ド ４４１−３９０，スゥオン−シ，クォンソン−グ，クォンソン−ドン， １２３５，３０７−１００１ プンニムシナン エーピーティー． (72)発明者 リム，ホ−スー 大韓民国，キョンギ−ド ４６７−８１２，イチョン−シ，マチャン−ミョン，ドクピョン １∼ ２−リ Ｆターム(参考) 4B024 AA03 BA75 CA03 CA09 DA06 EA04 4B064 AE34 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA41 CA43 CA44