周辺動向調査 - 新エネルギー・産業技術総合開発機構

1
複合生物系等生物資源利用技術
周辺動向調査
株式会社ダイヤリサーチマーテック
平成14年10月16日
（株）ダイヤリサーチマーテック
2
周辺動向調査目次
• 複合生物系技術の全体像
–
–
–
–
関連技術における多様な技術要素紹介
分子生物学的手法発展の中での物質生産
関連プロジェクト紹介
遺伝資源の重要性とCBD、研究開発の重要性
• 複合生物系技術の個別技術
– 遺伝子増幅技術
– DNA直接抽出方法
（株）ダイヤリサーチマーテック
複合生物関連の多種多様な技術要素
3
複合生物系
基本的な
技術開発
再構築
分離、培養技術
遺伝子資源の蓄積が
必要
フローサイトメトリー
マイクロフルイディクス
未知微生物の探索
微生物情報
データベース
機能解析技術
微生物バンク
微生物解析・同定技術
DNA解析など
複合生物系としての利用
各種生物
ゲノム配列
情報
環境修復
有用物質生産
モニタリング
馴化
実証試験が
始められて
いる
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
農薬の分解機構
4
4種以上の微生物から構成される複合生物系
Pseudomonas
Clavibac ter
michigane se
？
sp.
strain CNI
ATZI
？
Clavibacter michiganese ATZI
AtzA
Cl
N
N
H2O
OH
HCl
N
N
N
N
N
Atrazine
塩素
AtzC
AtzB
H2O H2N
OH
N
N
N
N
N
N
HO
N
h ydr o xyac e azin e
Pseudomonas s p. strain CNT
cyanuric acid
N- e th ylamm e lide
H2O H 2N
OH
Appl. En vir o n . M ic r o bio l, (1 9 9 8 ),
6 4 (1 ), 1 7 8 - 1 8 4
Un ive r sit y o f M in n e so t a
N
HO
OH
N
N
N
N
HO
N
N
OH
AtzC
（株）ダイヤリサーチマーテック
周辺技術の流れと物質生産
ゲノム時代
1990
従来のバイオテクノロジー
遺伝子組換え技術の進展
微生物ゲノム
・Haemophilus influenzae
・Saccharomyces cｅ
revisiae
(
) ゲ ム解読
機能推定方法
・DNA配列の比較
（ホモロジー検索）
機能解析方法
・DNAチップ（US 5744305）
・酵母ツーハイブリッド
製品化
（解析スピードと
コストの競争へ）
（US 5283173）
Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 80: 726, 1983
DNAデータベース
・Gen Bank（1982）
・EMBL（1982）
・DDBJ（1984）
SNPs（東大医科研）
完全長cDNA(Helix研)
糖鎖工学、蛋白工学
ゲノム解読
(Science 269, 496, 1995）
解読スタート
（1991年）
配列決定方法の機能
向上
・PCR（特許2093730）
・精度、スピード の向
上（US5747249)
DNAレベルから
蛋白レベルの解析へ
（ゲノム創薬etc）
ヒトゲノム解析
解読終了
イネゲノム
Proc.Natl.Acad. Sci.,
USA 74:5463, 1977
2000 ポストゲノム時代
ゲノム工学の進展
ヒトゲノム解析
・国際プロジェクト
スタート
配列決定
法
（Ｓａｎｇｅｒ
5
Nature
326: 347, 1987
J. Mol. Biol.,
215: 403, 1990
バイオインフォマティクス
・ホモロジー検索 FASTA
BLAST
・モチーフ検索
プロテインインフォマティクス
・立体機能検索
ホモロジーモデリング
3D-1Dアライメント
〇
〇
二次元解析から
高次元解析へ
〇
〇
Science
253: 164, 1991
Proc.Natl.Acad. Sci.,
USA 87: 826, 1990
単一微生物による物質生産
CohenBoyer
遺伝子
組換え
US4237224
蛋白質
組み換え作物
IFN-α
GMトマト
特公平3-21150
特公昭63-61960
G-CSF
特公平4-2599
特公平3-31437
エリスロポエチン
特公平2-17156
複合生物による物質生産
抗体医薬
（ヒト化抗体）
DNA直接抽出法（メタゲノム）
Zenapax (1997)
Herceptin (1999)
有用化学物質
オリゴ糖
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（株）ダイヤリサーチマーテック
生物多様性条約（CBD:
生物多様性条約（CBD: Convention on Biological Diversity）
Diversity）
1990
1995
CBD採択
2000
第1回カルタヘナ議定書
COP1（1994/10）
バハマ
*資金メカニズム
(1992/5）
ナイロビ
地球サミット
（1992/6）
ブラジル
政府間会合 （2000/12）
フランス
*LMO (Living Modified
Organism）の安全な移送、
取扱い、利用
COP2（1995/11）
インドネシア
*遺伝資源へのアクセス
*生物多様性の保全と
持続可能な利用
日本が条約
締結・批准
（1993/5）
CBD発効
（1993/12）
ブラジル
182ヵ国が加盟
（2002/3現在）
但し、米国、タイが未締約
COP: The Conference of the Parties
6
103ヵ国が署名
（2001/9現在）
5ヵ国が批准
日本、米国、タイ、
豪州、ブラジル、
ロシアは未署名
第2回カルタヘナ議定書
政府間会合
（2001/10）
COP3（1996/11）
アルゼンチン
*農業の生物多様性
*資金メカニズム
*重要な地域・種の特定と
モニタリング、影響評価
*知的財産権
MOP1（2002/4）
第1回カルタヘナ議定書
締約国会合
オランダ
COP4（1998/5）
スロバキア
*伝統的知識、遺伝子資源の
利用から生じる利益の公正
で衡平な配分
COP6（2002/4）
オランダ
*森林の生物多様性、移入種、
利益配分
COP5（2000/5）
ケニア
*乾燥地、地中海、半乾燥
気候、草原地帯の生態
系持続
*遺伝資源へのアクセス
*ボンガイドラインの採択
COP7（2004）
マレーシア
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
CBDに関連する他機関の動き
CBDに関連する他機関の動き
1990
1 7 7 ヵ国加盟
(2 0 0 1 / 7 )
パリ 条約　（ 1 8 8 3 ）
* 内外人平等の原則
* 特許独立の原則
* 優先権制度
APPI設立
（1897）
(世界知的所有
権機関）
1 7 7 ヵ国加盟
（2001/3）
2000
WIPO外交会議でPLT 採択
（2000/6）
* 特許法条約
* 特許出願手続きの簡素化
* 国際的統一化
* 出願人のミス救済
WIPO（ 1 9 9 1 ）
特許調和条約の
基本案成立
仲裁裁判所開設
（ 1 9 9 9 / 1 2 ）
WIPO設立　（ 1 9 6 7 / 7 ）
* 知的所有権保護の国際的
促進
* 知的所有権に関する条約、
国際登録業務の管理運営
1 1 2 ヵ国加盟
（2001/9）
PCT 改革案提出
（ 2 0 0 0 / 9 ）
* 出願手続きの一層の簡素化
PC T条約発効
（ 1 9 7 8 ）
* 特許協力条約
1 4 3 ヵ国加盟
（2001/12）
(世界貿易機関）
1995
WIPO第1 回専門委員会
（1985）
* 特許ハーモナイゼーシ ョン
条約の草案作り に着手
WIPO
WTO
7
SCP委員会設置（ 2 0 0 0 / 1 1 ）
* SPLT 条約策定作業再開
（ 実体的特許法条約）
WTO設立
(1 9 9 5 / 1 )
TRIPs協定
1995/1
* 知的財産権保護の遵守
すべき最低限の保護基準
* 各国毎に段階的履行
（ 最終2 0 0 6 ）
WTO第4 回閣僚会議
（ 2 0 0 1 / 1 1 ）
* 中国、 台湾が加盟
TRIPs（ 2 0 0 0 ）
* ロシ ア、東欧と開発途上国
延べ約1 2 0 ヵ国に特許制度
施行
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
生物多様性条約への各国の対応
国　名
フィリピン
8
内　容
策定年月
独自の遺伝資源アクセス法を作成。世界初のアクセス規制（大統領令247号）
生物/遺伝資源の調査に関する実施規則および規定（省庁命令第96ｰ20号）
1995.5
1996.6
ボリビア、コロンビア、エクアドル、ペルー、ベネズェラの５カ国。遺伝資源アクセスと利益配分
アンデス協定 で地域協定締結（カルタヘナDecision391）。各国はこれをベースに国内法を整備中。
1996.7
マレーシア
国家多様性政策を制定（政策、戦略、アクションプラン）
タイ
植物品種保護法。
商業目的でその地方特有の植物品種を使用し得た利益を分配する協定締結が必要
植物品種の保全・開発者20％、集落の共同収入60％、行政機関・農民・共同組合20％分配
1999.1
独立の遺伝資源アクセス法（オスマル提案、政府案、Joequs Wagner提案）を作成中。
審議中
ブラジル
インドネシア
1999
Conserving plant seed managementに関する法律として制定された
1995
先進国
米国
CBDを批准していない。遺伝子資源はフリーアクセスが基本との考え方。（生物資源の取引で
国際的条約は不要との立場）。基盤整備の必要性を認識し、調査研究資金を献金。
欧州
基本スタンスはフリーアクセス。遺伝資源移転契約ハーモナイズ化の動きがあるが、遺伝資
源獲得契約のハーモナイズ化の動きは未だない。商業利益の配分で利益範囲の特定の問題
やロイヤリティーの設定方法に関し具体的な検討開始。
日本
「新・生物多様性国家戦略」を策定した。当面の政策目標として①種の絶滅の防止②重要地
域の適切な保全③持続可能な方法による利用、長期的目標として多様な生態系と生物種の
保全と持続可能な利用
2002.3
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
資源利用における研究技術と多額な費用の必要性
Collecting Biological Materials：Campass
Science Vol 297 p519
I READ RICHARD STONE'S PROFILE OF biologist Gary Strobel ("Biologist gets under the
skin of plants-and peers;' News Focus, 31 May, p. 1597) with great interest. I would like to
know if Strobel abides by local regulations about collection and exportation of bio-logical
materials in the many countries where he has worked. I deeply hope that Strobel does not see
Third World countries merely as raw materials providers for technological developments, for
which our people must later pay high royalties. The use of Third World (and all) natural
resources should result in mutual and equitable benefits. And, as Strobel may understand, this
is much more than simply returning a portion of the profits to the local communities. Third
World countries are under tremendous pressure to comply with patents and royalties from
developed countries (and many times these patents are derived from Third World resources);
scientists all around the world should be encouraged to comply with each country's regulations
about the collection and exportation of biological materials.
VIRGINIA ABDALA Instituto de Herpetologia, Fundacion Miguel Lillo, Miguel Lillo 251,4000
Tucuman, Argentina.
Response
I HAVE ALWAYS OBTAINED PERMISSION TO collect materials wherever I have gone. In
addition, I acquire all necessary permits from the U.S. Department of Agriculture to bring
diseasefree samples into the United States. The arrangement generally is that if an organism
proves valuable, then the supporting organization and I will discuss the disposition of financial
benefits that the local community may derive. This plan is laid out at the outset. One of the
main goals of the program is to help scientists in developing countries improve their scientific
infrastructure. This is accomplished in a multitude of ways, including giving investigators
opportunities to work in my lab for advanced training. In addition, local investigators are
invited to become involved directly in the research. This has been true with scientists from
Nepal, China, Morocco, Venezuela, Israel, Papua New Guinea, India, and Korea, to name a few
countries with which I have been involved. Many people do not understand that to find a
successful drug is difficult and expensive, and there-fore a lot of time cannot be spent
discussing matters of income where income may not ever exist. Discovery is the least expensive
of all of the steps required in drug discovery. Ultimate drug development may cost up to $300
million. Compounds fail for many technical reasons, including toxicity, availability, side effects,
and inability to reach the appropriate site. Nevertheless, it is absolutely critical to me that local
people get energized about the novel and important biological prospects that exist in the forests
around them and be encouraged to study them and learn about their promise and potential. It
is also essential that more efforts be made to save these important biological resources before
they disappear forever.
GARY STROBEL Department of Plant Sciences, 206 Ag BioSciences Building, Montana State
University, Bozeman, MT 59717, USA. E-mail: [email protected]
質問
資源国側と契約を結んで研
究しているのか
回答
当然契約は結んでいる
しかし利用するには当然高度
な研究と多額な研究開発費も
必要である。
資源を確保の視点も必要であ
る。
（株）ダイヤリサーチマーテック
9
複合生物系等生物資源利用技術開発の国外開発状況
国
省
Program名
BIOTECH-1
1996
1997
1998
年　度
1999
2000
2001
BIOTECH-1、２
2002
海外関連プロジェクト
高精度微生物自動同定と関連生態系への適用 (1.42百万ECU)
(161件　186百万
ECU,　4年)
欧州
10
IMPACT（作物の根圏における接種及び既存微生物間の相互作用） (2.33百万ECU)
解析技術
＆
機器開発
（507件　596百万
ECU　4年）
MAST-3
（456件　243百万
ECU　4年)
米国 環境省 STAR
AIMS（Automated Identification of Microbial Subpopulations）
微生物サブポピュレイションの自動同定
沈殿物中のPCB脱塩素における微生物相の動力学 （51万ドル）
(200件、１億ドル／
年）
原水及び飲料水に発生する微生物のDNAマイクロアレイによる検出(52万ドル）
国立科 MO
学財団 （350万ドル／2000年
San Pedro 海峡からの難培養性細菌Archea 及びProtistaの発見と同定　（126万ドル）
度）
非培養海洋ピコプランクトンの遺伝的多様性、遺伝子内容及び遺伝子潜在性　(129万ドル）
BE
（1.365億ドル／2001
年度）
エネル
ギー省
昆虫が植物を食するのを仲介する共生微生物の遺伝生態系的解析の統合 (220万ドル）
バイオレメディエイションにおける分解能力推定のための遺伝子プローブ法の開発 (106万ドル）
？
質量分析機によるバイオレメディエイションにおける微生物相の迅速DNA解析 (68万ドル）
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
バイオ支援機器開発の重要性
2000年日本国内市場規模
バイオテクノロジー支援
市場
ハード
DNAシークエンサー
174億円
ソフト
サービス
PCR
66億円
７２％
日本
ABS
11
ロッシュ
日本以外
Real Time PCR
30億円
宝酒造
NMR
49億円
DNAチップ関連
50億円
代表的な機器開発会社売り上げ
日本マーケット売上比率
富士経済資料を基にDRMI作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
PCRおよび
PCRおよびDNA
およびDNAシークエンサーの市場変化（日本国内）
DNAシークエンサーの市場変化（日本国内）
（億円）
（億円）
80
250
70
200
60
50
150
40
100
30
20
50
10
0
1998
PCR
1999
2000
2001
リアルタイムPCR
国内シェア（2001年）
PCR装置
2002
DNAシークエンサー
アプライド
42%
PCR試薬
2010
シークエンス用試薬
PCR試薬
その他
24%
その他
13%
バイオラッ
ド
10%
宝
39%
アプライド
50%
ロッシュ
27%
総市場 72億円
2005
リアルタイムPCR
その他
17%
宝
41%
2003
0
（年）
総市場 37億円
アプライド
37%
総市場 49億円
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
12
新規増幅法の例
TM
ICAN
ICANTM法
法
13
TM
LAMP
LAMPTM法
法
＜プライマーの構造＞
＜反応機構＞
宝酒造
キメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性を有する DNA ポリメラー
ゼ、RNaseH を用いて等温で遺伝子増幅できることが特徴である。
具体的には、キメラプライマーが鋳型と結合した後、DNA ポリメラーゼ
により相補鎖が合成される。その後、RNaseH がキメラプライマー由来の
RNA 部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸
長反応が起こる。2000 年に開発
＜特徴＞DNA を PCR 法と同等以上の感度、等温で増幅・検出が可能。
工業スケールでの物質生産に最適。
出典：http://www.takara.co.jp/news/2000/07-09/00-i-019.htm
栄研化学
６領域４種類のプライマーと鎖置換型の DNA polymerase,ターゲット
DNA を混合して等温で反応させると、いくつかのステップ経て両方の末
端でループを巻いたダンベル構造をした一本鎖が生成される。さらにこ
のダンベル構造をした一本鎖は複製される。また(9)(10)を経て相補的な
配列が交互に繰り返した構造の遺伝子増幅産物が蓄積する。
＜特徴＞DNA を PCR 法と同等以上の感度、等温で増幅・検出が可能
特異性が高い
出典： http://www.eiken.co.jp/index-j.html
（株）ダイヤリサーチマーテック
PCR発展の例
PCR発展の例
Competitive PCR(1990年)
RT(reverse transcription)-PCR
DNA・RNA定量PCR
mRNA増幅法
RNA量
目的RNA
Competitor
mRNA
鋳型DNA
①
②
14
1回目PCR
③
polyA tail
reverse transcriptaseによる逆転写
first strand cDNA
1回目の増幅産物
RNA抽出
耐熱性DNA polymeraseによるPCR
2回目PCR
逆転写酵素反応
2回目の増幅産物
PCR
① ②
ゲル電気泳動
増幅されたcDNA断片
③
スロット（DNAを入れる溝）
目的DNA由来のcDNAの増幅産物
competitorRNA由来cDNAの増幅産物
電気泳動図
Hot Start PCR（1991年）
LA (long and accurate)-PCR（1994年　Barns）
感度向上（非特異）
長いDNAを増幅可能
3'
5'
モノクローナ抗体
A
3'
耐熱性DNAポリメラーゼ
不活性型
新生DNA
5'
活性型
－＋
温
度
3'
1サイクル
2サイクル
時間
鋳型DNA
3'
3'→5'エキソヌクレアーゼ
（校正機能をもつ酵素）
活性が誤りを直す
A
A
3'
5'
誤った塩基の取り込みは
DNA合成を阻害する
A
合成の再開
新生DNA
T
A
鋳型DNA
30サイクル
秀潤社　PCR　Tipsを基に改変
（株）ダイヤリサーチマーテック
変異検出PCR
変異検出PCRの例
PCRの例
PCR-SSCP法
PCR-CFLP法
遺伝子多型による一本鎖DNAの立体構造変化
野生型
15
PCR後、ヌクレアーゼであるCleaveaseⅠにより切断した後電気泳動
多型または突然変異
野生型
多型または突然変異
PCR
PCR
変性
1本鎖DNA
非変性条件
1本鎖DNAは高次
構造を形成する
変性
2本鎖を作った
一部のDNA
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（非変性条件）
非変性条件
1本鎖DNAは高次
構造を形成する
PCR-RFLP法
PCR後制限酵素による分解性の差異
野生型
制限酵素
認識部位
消失したヘアピン
構造の位置に対応
したバンドが消失し
ている
CleaveaseⅠによる切断
多型または突然変異
PCR
切れない
変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動
制限酵素処理
アガロースゲル電気泳動
秀潤社　PCR　Tipsを基に改変
（株）ダイヤリサーチマーテック
新たな注目を集めるReal
新たな注目を集める
Real Time PCR
16
検出法
プローブが分解
Taq Manプローブ<PE　Biosystems>
R
増幅法
Q
R
ハイブリダイズ
プローブ
R
5'→3'エキソ
ヌクレアーゼ
PCR増幅産物
A
B
定量用Hybプローブ＜Roche Diagnositics
検量線
4
3
2
1
0
10 10 10 10 10 コピー
Ct値
PCR産物量
反応タイムコース
Q
Q
R
Q
R
プローブ ハイブリダイズ
プローブ
Q
PCR増幅産物
サイクル数
100
101
102
4
103 10
Molecular Beaconプローブ<Stratagene社>
ハイブリダイズ
R Q
Q
R
PCR増幅産物
プロジェクト成果
遺伝子検出手法
蛍光消光法も適応
電気泳動不要
秀潤社　PCR　Tipsを基に改変
（株）ダイヤリサーチマーテック
遺伝子資源収集法
17
純粋分離
（ 生態系の1％)
従来法
培養
機能スクリーニング
目的菌株
難培養性
新法
A
A
B
C
D
B
C
D
E
DNA mixture（全生体系）
DNA ライブラリー
機能スクリーニング
目的遺伝子
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
Diversa社の技術と特許
Diversa社の技術と特許
18
Biopanning
環境サンプル
DNAサンプル
DNA probe
Ligan d
＋
Normalized library
DNAライブラリー
A
A
B
C
3
:
A
A
1 :
2
B
C
C
1 :
1
US.6 ,0 54 ,2 67
(Biopan ning)
Target DNAs
:
1
US.5 ,7 63 ,2 3 9
US.6 ,0 01 ,5 7 4
C
US.5 ,9 58 ,6 72
US.6 ,0 30 ,7 79
(Biopan ning, c e ll-free re action )
(Mutage ne sis)
Satu ration mu tage n esis
(US.6,17 1,8 20 )
Sexu al PCR
(US.5,96 5,4 08 )
Expression
US.6 ,1 68 ,9 1 9(Liqu id phase sc ree in g)
US.6 ,1 74 ,6 7 3(Enc apsulation , FACS)
Sc re e ning
US.6 ,0 5 7,10 3
(Pre se le ction of mic roorgan isms, FACS)
(株)ダイヤリサーチマーテック作成
（株）ダイヤリサーチマーテック
Diversa社の経営状況
Diversa社の経営状況
製品例
耐熱性DNAポリメラーゼ
（ Invitrogen ） ；2 00 0 年
酵素の耐熱性向上
（ Dow Ch emical）； 19 9 9年
25倍
5000
(M $ )
収入
4000
3000
利益
1,120M$
19
(M $ )
200
運転資金
150
運転資金
100
4,016M$
2000
2,896M$
172M$
経費
2,896M$
50
1000
収入
経費
52M$
赤字3 0 M $
36M$
0
Amgen社 (7 , 7 0 0 人）
創立　1 9 8 1 年
0
Diversa社 (2 7 6 人）
創立　1 9 9 4 年
Biotechnology news, Vol. 22 No.9を基に
(株)ダイヤリサーチマーテックにて作成
（株）ダイヤリサーチマーテック