Untitled

ヒトおよびマウス LPC遺伝子のク口一ニン
グと遺伝子構造解析
I
m
pe
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l
Ca
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c
crRc
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ar
c
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nd
1Me
d
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al
On
c
ol
o
g
y
De
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a
r
t
me
n
t0'
海老原充
1
目次
1
目次… …
・ .••.....
2
緒言 … …
・
・
・
・
3
ヒト LPC遺伝子のクローエングと解析……・…...
.
.
.
.
.
.
. ・一 一 .
..
.
.
.
・ .
.
.
.
.
.
..
..
.
.
.
.
.
22
・ー・… ・・…・… ・…
…・
… … ・
・
・
・
・
…
・ ー .
1
一.
.
..
.
.
.
・
.
.
..
.
.
.
・
. ・
..
...
.
.
..
.
.
..・
…
H
.
.
.
.
.
.
.・
・ ぃ …・・…
….
.
.
..
..
3
… …… ー…
.
22
3.1 はじめに..
.
23
3.2 材料および方法
3.
2.' プレ -jIポイントの同定.ー…・……・一一一……・… … ー … …
…“… .
.
2
3
u
3.2.2 プレ-jIポイントの jIローニングー … … … … 一 一 一 … … … … ・ … … ぃ 24
3.
2.
3 プレ」クポイントの解街 …・ー……・………“一………・ … ー … … … .
.
2
7
3.2.
4 LPCの同定とクローニングー ー ー … … … ー … …………・…“ 一…“一日 28
...……ー 一 一 … …。32
3.2.
5 エタ Yン ・イントロン構造の解析… … … 今 日 … .
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
・
・
3.
3 結果.
e
・
・・
・
・ ・・
e
.
.
.
.
3
6
・
.
.
.
.
.
.
...
..
.
.
.
.
.
ー
・
e o
3.
3・1 ブレークポイントの同定日・・……“...・ ・一一 一 … …・… 一 一 …ー
…・
.
3
6
E
.
.
.
.
.
.
.
.
… 37
3.3.2 プレ」タポイントのタローニングー … 一 一 一 …“…“…・…….
3・3・3 プレータポイントの解折………… 一 一 … ……・…ー …・…・…-一..
.
.
.
.38
h
……… 3
8
… …5
0
3.3.4
4
L P Cのi
認定ecD
NAのタ口ーニングー 一一 … … … … ー … …
3.3・5 エタ Yン ・イントロン様造の解折…・・・… 一 一 一 一 一 一 一 …
7
ウス LPC遺伝子の タローニングと解析....・ー...・ ・
・ ・…
4.
1
H
はじめに....
ー
. ー ー
…..・
e
.
.
.
.
5
4
・
.
.
.
.
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
・・…
・
…
.
.
.
..
.
.
..
.
.
..
.
.
. ・
・
0
4.
2 材料および方法........
.
.
.
.
.
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.
.
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.
.
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..
.
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.
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..
.
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..
…
4.2.J
.
.
.
.
.
.
. ……・ーぃ .
54
…
e
日
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
・ .
.
.
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.
5
5
・
・
'7ウス染色体 DNAのスクリーニング・一一一・……・・…………
.
.
.
.
.
.
.
.
5
5
4.2.2 欠失変異訟の作成・ 一 一 一一…・・……一……………一一一.........… .
.
5
9
4.2.3 DNAシーケンス…… … … … … … … … “ … … “
… ….....…………… 60
4.2.4 エタソン ・イ Y トロン構造の解析‘
一
一 … … … ...~...……・。… ......… ..61
4.2.5 '7ウス c
DNAの只クリーニング… .
.
.
..
. … 一 … … …… … …-… …ー・… 6
4
4.3 結果...
・・・・
・ .
.
.
.
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・
…
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.
...
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.
・
h
・
.
.
.
.
・
.
.
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.
.
.
7
0
4.3.] '7ウス染色体 DNAのスタ 5ー ニ ン グ " … … “ … … … ‘ …ーー……....
…… 7
0
4.3.2 欠失変異妹の作成 … … … ー … 一 一 … 一 一 … … … ー … .
.
.
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
..
7
5
4.3.3 DNAシーケンス ー・ーー‘一一一一一一一…“““““…・日日 …ー一…ー一一一一 … 7
7
・
ー… … 一 一 一 … … … … ー・107
4.3.4 エクンン ・イントロン構迫の解析一…… ・
4.3.5 "7クス c
DNAのλタリー=ング… …ーー・…・・
一……ー…ーー……・・…・・ー… 一 一109
5
考察 … ー
・・…
.
.
.
.
・・
.
.
.
噂
・ ・
・
…
a
…
・ …
・ … …・ ……・…・・ …
ー .
.
.
.
.
.
.
.
.1
14
5-1 LPC遺伝子とその術進
ー
・
:
r
5-2
SUsTII.lS
l
N
L
lKES l
l
I
N
EPRO'
I
'
EASE .
.
.
.
.
5・3
LPCと
紅
、l
笠の関連
5-4
今後の研究..
.
.
6
謝辞
7
参 考 文献
・ー一
….....
.
.
.
.
.
.
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.
..
.
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.
1
1
4
一一
.
.
.
..
.
.
...
.
.
.
.
.
.
..
.
.
..
.
.120
.•••.•••...•.•• .• •• .•.. •.• •.. .
..
.
.
.
.
.
.
.
.
...
.
.
.1
2
5
・ ・
・
e
一 ー
・
・ -… …
・
…
.
.
.
.
.
.
.
・ ・
.
・. ・…・・・…
M
e
…・・一
・ー …
・
・ ー
・
…
.
.
.
.
・ ・
.
.
.
.
・ ・..…・・…・…・…
H
e
2
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
..
.
.
.
...
.
.
.
.
.
.
.
.
1
2
7
・
…・・…
…
.
.
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
...…
… ・……
……・・・・・・・
128
129
2 緒言
染色体 ]I番長腕は、高い有{仁主
幹で欠失 ・転j
亙が観察されることが知られてい
る。主に創lI
j
J
包遺伝学的手法によって、さまざまな例が報告されている 。特に、
]lq222
4 の領域は、幸L
癌、J1
i
t
i組、直腸癌、悪性のメラノーマ、副神経節腫、白
血病など多くの慈性服務細胞で、欠失 ・中副獲が報告されている 。
at
a
x
i
a
t
e
l
a
n
g
i
ect
a
si
a) 関連遺伝子
また、この領域には、血管拡張性失調症 (
(
ATM) 、白血病に関与する MLLがコードされていることも知られている 。
以上のように、これらの染色体の欠失 ・転座は、白血病、リンパ媛、機々な
癌と関連していることが示唆されている 。遺伝子レベルでも、 i
伝座により新し
い融合遺伝子ができ符ることが知られている 。 あるタンパク質の N 末端と}j
j
lの
タンパク質の C 末端が融合するのである 。 あるいは、ある遺伝子の上流等に、
別の遺伝子のプロモーター ・エンハンサーなどの調節配列が転座してくる、ま
たはプ ロモーターが欠失してしまうなどの影響により、その澄伝子の発現レベ
ノレが変化することもある 。
融合タンパク質が生じる場合 、通常、それぞれのイントロン内に、 b
r
e
a
k
p
o
i
n
t
が存在している 。 mRNA に転写されたのち、 i
n
f
r
a
m
e にスプライシングされる
ことにより、融合タンパク質が生じる 。 調節配~Ij が転座してくる場合は、イム
ノグロプリンや T細胞レセプターの r
e
a
r
r
a
n
g
e
m
e
n
tが関与している例が観察され
ている 。染色体転座の研究によって、転J
査のパートナー遺伝子(融合するそれ
ぞれの遺伝子)には、かなりの特異性があることが明らかになっているが 、あ
る特定の領域が関与する転j
受のパートナー遺伝子、あるいは領域は、一つであ
るとは限らない。すなわち、ある b
r
e
a
k
p
o
in
t は、複数かつある程度の特異性を
もったパートナー遺伝子、あるいは領l
或を持っているのである 。
このような b
r
e
a
k
p
o
l
n
tの一つに染色体 l
l
q
23がある。 I
l
q
23 I
士、傑 k な白血
或内の
病細胞において転鹿が起こっていることが知られており、かつ llq23領 j
b
r
e
a
k
p
o
i
n
tも複数あることが知られている l。
3
t
(
4;
11
)
(
q
2
1;
q2
3
)は、 もっとも最初に報告された l
l
q23 が関与する転座例であ
り、急性リンパ芽球自 ，
f
J
l
病細胞 (
a
C
U
leJymphobla
s
ti
cl
euka
巴I
T
I
la
、以下 AL
L
)で
見つかったヘ Aし
し 怠者の予後は悪く、通常 、非 B細胞 、非 T細胞タイプであ
ると共に、ターミナノレデオキ シ ヌ ク レ オ チ ダ ー ゼ 活 性 プ ラ ス で あ る 。
t
(
4;
1
1)
(q21
;
q23)
タイプの転座を持つ白鼠病は、 ALL に分類されることが多く、
ea
r
r
a
nge
me
n
tが関与していることが知られてい
かっイムノグロプ リン遺伝子の r
a
c
u
temyeloi
d1
巴u
kaemia、以下
るが、例外も知られている。急性骨髄性白血病 (
AML) がその例である 。形態的に、これらの白血病細胞は、単球とリンパ球細
(
4;
l
l)
転j
坐を持つ急性白血病
胞からなっていることが示唆されている。また、 t
ea
r
r
a
ngement が起きたイムノグロプリン、およびリ
細胞を解析した結果から、 r
ンパ球と背・
髄球のマーカー遺伝子が発現していることが明らかになっている 。
I
l
q23 領域が関与，している転座を解析するにつれ、急性白血病の約 5% のケ
ースにおいて、 Ilq23転座が関与していることが明らかになってきた“。また、
I
l
q
2
3が関連する転座には 、少なくても お ものパートナー領域が存在すること
が報告されている 6. IIq23 が関与する転座を生じる白血病には、 ALL、AML、
小児、遺伝的要因によるもの 、そして他の癌に対する細胞毒性な治療法による
2次的な白血病などが含まれる 。 さらに、 I
I
q23 が関連する転座は、非常に複
雑であり、 他の複数の転座が同時に起きていることもある 。 例えば、リンパ球
p
32、 1
9p1
3
，
，
8，
9，
1
0，
5、骨髄球白血病で、は I
q21
"、2
p
2
1'2、
白血病においては 4q21、 I
1
、9p2214、 l
6q271
O
p
JI
.
、
" l
7q25、 1
9
p
1
3'6などである 。
HRX遺伝子が '
''
定されて以来、 l
l
q2
3領域とそれに関与する転座の分子生物
学的研究が飛躍的に進んだ。 IJq23領域にマップされる HRX遺伝子が成人 、子
MJ
らず、ほぼすべての白 血病に関与して いることが明らかになっ
供
、 2次的に f
たからであ る。 そのパートナー遺伝子は、綴々である口(下表) 。
4
表 1 HRX遺伝子がs!，j
l
子したI
阪 座とパー トナー遺伝子
転座型
ノぞートナ」遺伝子
関連遺伝子
t
(
4
;
1
1)
(q21;
q
2
3
)
AF4
LAF4(
humm)
1
(
9;
1
1)
(
p
2
2;
q23)
AF9
Ancl(
y
e
a
s
t
)
，
Anc1(
y
e
a
s
l)
1
(
l1
;
1
9
)(
q23
;p
1
3
.
3
)
ENL
t
(1
;
1
1
)
ω32;
q23
)
巴
巴
1
(
6;
1
1)
(
q28;
q23)
AF6
cno(
Dro
s
o
p
h
i
l
a)
p
s1
5(
mous
e
)
pa15
t
(
1
0
;
1
1)
(
pI2q23)
AF10
c
.E
l
e
g
a
ns
)
，BR1
4
0(
human)
c
e
z
f(
l
(
1
1;
1
7)
(q23;
q21)
AF17
.Elegans)
，BR140(
h
l
l
m
a
n)
c
e
z
f
(C
1
(
1
1
;
1
9
)
(q
2
3
;
p
1
3
.
I
)
ELL
p80e
l
o
n
g
a
l
i
o
nf
a
ct
o
r
l
(
1
;
1
1)
(
q
2
1;
q
2
3
)
A
F
l
c
l
q
司
<小児白血病>
さて、小児における 11q23の異常と急性白血病関与は、 1980年代始めから知
られていた。 1980年代 の後半になって 、 さらに詳しい解析がなされると、白血
病と 11q23 の異常(例えば、 t
(
4;
l
l)
、1
(
9;
1
1)
、t
(
1
1;
1
9)
、1
(
11
:
1
7
)
など)に、強い
.
1
9
，
2
0
，
2
1
.
2
2
。 しかし、 小児における l1q23
相関関係があることが明らかになった山 8
と白血病の強い相関に対して 、子供 (1
5 才くらいまで)の白血病においては、
高い相関関係が示さ れていない (
ALLで 5%、A恥1Lで 1
3%程度である) 。
小児、子供のどららの場合も 、 IIq23 の異常を伴う白 血病の予後は思わしく
ない。芽球細胞においては、イムノグロプ リンの H鎖に 1
巴a
r
r
a
n
g
e
m
e
n
lが見られ
るとともに、脅髄球特異的なマーカー泣伝子の発現も見られる 。 また、 AML
や ALLなど、すべての小児白血病の発症は 、平均して 9週から 1
6週の間と い
う報告もある 。
'は、
l
l
RX遺伝子が関与して
現在、小児の AML、ALしにおける 11q23の呉市
いることが明らかになっている白 2
九 小児の ALL96 例 を調べたところ、非1
1
J
R
包遺
伝 学的に
、 50% に llq23 の異常が観察された。しかし、 サザンハイブリダイゼ
ーションに よる解析では、引 %で HRX遺伝子の r
e
a
r
r
初 g
巴m
entが観察さ れた
。
小児 の白 血病は 、極めて短い潜伏期間 (すなわち急性)を持つが、 そのこと
5
は、子宮内ですでになんらかの異常'が起こっていることを示唆していると考え
られる。白血病の双子を詳しく調べたところ、どちらもまったく同じ HRX の
r
e
a
r
r
a
ng
巴men
t が起こっていることが明らかになって いる。また、lJ
l
l
の双子を調
べた結果から、末梢 J
包K
4
1
1胞において同じ t
(
l];
1
9
)(
q23;
p1
3.
3
)
慰の転座が起こって
いることが明らかになった。 このことは、小児の白血病における染色体異常は、
子宮内ですでに起こっていることを示唆している 。
さらに、双子でも異なる形の転艇が起こっている例が知られている 。 この場
合
、 HRXの点在が B 前駆体制l
IJ
J
包か造血系の幹細胞でおこり、それが子宮内で
他の胎児に移されたと考えることができる 。
く2次的な白血病 >
2?X的、あるいは治療によ って生じた AMLの地加が報告されている 25.26 主
に別の異常に対 し
、 化学治療を施した後に起きる可能性が高いとされている 。
骨髄異形成 (
my
巴
l
o
dy
sp
l
a
s
i
a) に関した治療を施した 9
1 例について調べたとこ
ろ、共通して染色体 5番と 7番に異常が観察された。 11q23の異常も 9例にお
いて観察されている 。 これら IIq23の異常が生じた 2 次異常例では、骨髄異形
成が再発する前に、極めて短い期 間で白血病が発症している 。1
2例の小児 AML
を調べた結果、 5例が 11q23に異常があり、そのうち 4例 AL
しか non-Hodgk
i
n'
s
リンパ腫の細胞性塞桧に対する治療歴があった。傑々な血液学的あるいは充実
性麗療に対して 巴
pipodophy
.
l
Jo
t
o
x
i
n巴
t
o
p
o
s
i
d
eや 1
巴n
i
p
o
刻化 などの化学治療を施し
た成人 ・子供を含む 37例につ いて、治療後に生じた AMしについて調べた。 そ
の結果、これらの白血病は短い潜伏期 間で起き、単球あるいは骨髄性単球が優
勢で、かっ高頻度で 11q23 が関与・した細胞遺伝学的な異常が観察された。充実
性J
l
重湯に対して治療を行った 3365 仔"1では、 1
2 例の治療による骨髄性白血病が
観察された。また 、骨髄性細胞の染色体焔'析を行った 8仰l
では、 2例で完全な
染色体 7 番の欠失 、4 例では del
(
1
6)
(
q
2
2)
を伴 う 1
(
9
;11
)
か t
(
8;
2
1
)、あるいは
d
e
l
(
1
6
)
(
q
2
2
)を伴わない 1
(
9;
1
1
)か 1
(
8
;
2
1)
が見られた。巴
p
i
p
o
d
o
p
h
y
l
1
o
t
o
x
i
nの投薬を
6
受けた 2例では lJq23の異常が見られた。このデータや他に報告されているデ
ータから考えると、
e
p
i
podophyl
l
o
l
oxi
n 投薬を受けた慰者は、アノレキレート系
の投薬と関与している 2次白血病症候群とは一線を薗する 2次白血病を生じる
t
o
p
o
s
i
d
巴とア/レキレート系の薬
危険性にさらされていることを示唆している。 e
m
の作 機作は異なるようである。アルキレー ト系の薬は DNA と架橋を作る作
用を介して働くのに対して、
e
l
opos
i
d
eはトポイソメラーゼ ロ と相互作用寸る
ことが知られている。機々な研究により 、2次白血病における l1q23の異常は、
denovoの白血病における 1
1
q2
3の異常と同織に HRX遺伝子の r
e
a
r
r
a
ngem
en
tが
関与していることが示唆されている 。 また 、 この事から 、TRX遺伝子内のトポ
坐に関与しているかどうかという疑問が生じるが 、
イソメラーゼ 日結合部位が転J
この相 ￨
潤関係は不明である 。
く HRX遺伝子のクローニング>
l
q
23領域の転座の b
r
e
a
k
poi
n
tを含む DNA断片は、 YACクローンと
さて 、 I
(
4:
l
l)
(
q
21
;
q
2
3)、 t
(
9
:1
J
)
(
p
2
2
;q23)、
し て 単 隣 さ れ た 27。 このクローンには、 t
t
(
lJ
;
1
9
)
(q
2
3
;
p
1
3)
で見られる b
r
e
a
k
p
o
i
n
tが含まれていることが、 m S
l
t
uハイブリ
ダイゼーションによって明らかにされた。 また 、この YAC クローンは、 CD3
遺伝子を含むことが明らかになり、 b
r
e
a
k
p
oi
n
tが CD3遺伝子近傍にあることが
示唆された。同時に、 b
r
e
a
k
p
o
i
n
t が CD3遺伝子近傍に位置していることは、
PFGE
(
P
u
ls
e
dF
i
e
l
dG巴1El
e
cl
T
opho
r
es
i
s
)によっても証明された。 さらに、 CD3遺伝
h
r
omos
omewal
k して得られた別の YAC クローンにも小児白血病細胞
子から c
が持つ llq23 の転座領域が含まれていることが明らかになり、転肢に 関与して
いる領域が CD3遺伝子近傍であることが再確認さ れた。
さて、iIii:i座領域にマップさ れ る遺伝子は、クローニングされる前から名前が
r
n
ix
e
dl
i
ne
a
g
el
e
lk
a
e
m
i
a
)、あるいは AL
L
l(
a
c
l
l
t
巴l
ympho
c
y
t
i
c
つけられていて、 MLL(
などと呼ばれていた。そ して
、 1
992年になって、 ALU28、H
l
l
・
x
l却、
l
e
u
k
ae
mia1
)
TR
X'
Oなどの名前で、 3カ所からクローニングが報告された。この論文では 、
HRX
7
遺伝子の名前で記述することにする。
HRX 遺伝子は、グノム上でが~ 1
0
0
k
bの大きさであり、 21のエクソンからな
る。また、 3969 アミノ酸残基、 431kDa という傾めて大きなタンパク質をコー
ドしている。幾いたことに、転座の b
r
e
はpoi
n
Lは
、 100kb の領域のうち、わず
mH 1断片内に集中していることが明らかになった。この転座によ
か 8kbの Ba
nf
r
ameの融合が起きていたのである 。
り、パートナー遺伝子との間に i
HRX遺伝子産物を解析すると、他の遺伝子 l
宝物との相同性が明らかになった。
o
p
b
il
amel加 o
g
a
s
t
e
t の発達に関与する遺伝子 L
r
i
l
ho
r
a
x
(
t
r
x
)との相同性
特に、 Dros
が高く、これが HRX 遺伝子の名前の由来でもある。もっとも相同性が高い領
域は、アミノ酸レベルで 75%であり、この領峻は Dros
op
h
i
laの Enha
n
c
e
ro
fZ
e
s
t
c
にコードされているタンパク質の C末端部分、 p
o
s
i
t
i
o
ne
f
f
e
c
tv
a
r
i
e
g
a
l
i
o
n(
PEV)
のサプレッサー、および SI
I
.(
凶r
)
3
9と G9a遺伝チとも相同性が高い。この領域
S
_u
p
p
r
e
ss
oro
fv
a
r
i巴ga
t
Jo
n、Enha
n
c
e
ro
fz
e
s旬
、
は
、 SET ドメインと呼ばれている(
工n出or似 から名付けられた)九しかし、その機能は不明である。
SET ドメイン以外にも特筆すべきドメインがある。その一つが、 HRXの中心
或は、
近くに位置するシステインリッチ領域である。このシステインリッチ領j
P
I
王D あるいは、 LAP ドメインと名付けられた Z
i
n
cf
i
n
g
巴rドメインであり、様々
なタンパク質配列に見つかっている。この LAPは DNAメチノレトランスフエラ
ーゼと中日向性があり、メチノレ化されていない DNAやメチノレ化された DNAを区
別することに関与していると考えられている。転写の活性化ドメインは、この
LAP ドメインの末端に位置している。また、転写のリプレッサードメインが しAP
ドメインの真ん中に見つかっている 。
さて、もう一つ特筆すべきドメインは、 HRX遺伝子産物の N 末端の ATブッ
或は、 出i
f
GI
(
Y)
の ATフックと相同性があるが、 Dros
op
h
i
la
クである九この償j
のt
r
x遺伝子産物内には存在しない領域である 。 ATフックは、 DNAの 2重 鎖
の惜のうち、 小 さなj
I
'
I
C(
minorgr
oov
e)
に結合することが知られている 。ただし 、
この結合によって 、直 後q
去写の活性化が行われるのではなく、何等かの因子の
8
活性を促進する働きがあると考えられている。
i
伝l
主によって、リンパ系細胞の成熟等に必要とされるなんらかの機能を持つ
TRX泣伝子が、その機能を失うことになると考えられる 。
くパートナー遺伝子のクローニング>
主によって生じた融合遺伝子の パートナー遺伝子
様々なクVレープにより、転j
(
TRX遺伝子と融合した遺伝子)のクローニングがなされてきた。
(1) t
(
4;
I
l)
(
q2.
1;
q23)
t
(
4;
1
1)
(q
2
1;
q
2
3
)における パートナー遺伝子は、 AF4あるいは FEL と呼ばれて
lt
e
m
a
t
i
ves
p
l
i
c
i
n
gにより 1
2
k
bと 1
0.
5kbの 2つの mRNA
いるヘ AF4遺伝子は、 a
に転写され、 1210アミノ酸残基からなるタンパク質になる 。ま た
、 AF4は多く
の組織で広く発現していることが知られている。
AF4は n
u
c
l
e
a
rt
a
r
g
e
t
i
n
gs
equen
c
e(
NTS)
を持ち、セリン ・プロリンリッチなタ
ンパク質である 。また 、サブトラクション cDNAライブラリーのスクリーニン
グから、 LAF4 と呼ばれる AF4 と相同性が高い遺伝子がクローニングされた。
LAF4遺伝子産物も NTS配列を持ち、核内に局在することが明らかになってい
る。
AF4、LAF4遺伝子産物は、ともに GAL4DNA結合ドメインと相互作用した
時に転写を活性化するドメインを持っていて 、かっこの領域が HRX遺伝子と
融合した後にも保持されている 。 このr，r;性化ドメインが l
巴u
kaemia の発症に関
与していることが示唆されている。
(2) t
(
9;
1J
)
(
P2
2
;
q
2
3
)と l
(I
I;
J
9
)(
q23;
p
I3
.1
)
(
1
1;
1
9
)(
q23;
p
1
3
.1
)
転艇のパートナー遺伝子は、それぞれ AF9
t
(
9;
I
l)
(p
2
2
;
q
2
3)と t
と ENL遺伝子であるヘ AF9 と ENLは、アミノ酸レベルで 56% の相向性を持
つ
。
t
(
9
;
1
1)と t
(
l
l
;1
9
)転座は、 AML と ALL の両方で見られる転J
主であり、
l
e
u
k
a
e
m
i
aと深く関与していることが考えられる 。
どちらの遺伝子産物も、 NTS ドメインと C末端に RNAポリメラーゼ E に相
9
問的な配列を持っている 。 ENL は
、 C 末端の 90 アミノ酸主主基領域に転写活性
化活性を持ち、リンパ球と骨髄車11胞の両者でその活性が観察されている 。 この
転写活性化ドメインは、 ENL、AF9 で保存されており、かっ I
IRX 遺伝子との
融合遺伝子産物でも保存されている 。 このことにより、この転写活性化ドメイ
ンが、 l
巴u
ka
emiaの発症に関与 していることが示唆される 。
一方、出芽酵母からクローニングされた抜タンパク質をコードする遺伝子
ANCI
(
a
c
t
i
n non-complem
en
t
i
n
g
)
が
、 AF9 ・ ENLと高し、相同性を保持しているこ
とが報告されている 。 この遺伝子の変異は、アクチン、細胞骨絡などの憐迭に
異常を示す。 したがって 、AF9 および ENL遺伝子も、アクチンフィラメント
の形成等に関与していることが考えられる 。
(3) t
(
6;
1
1)
(q27;
q23
)
t
(
6
:1
1)
転座におけるパー トナー遺伝子は、 AF6である 九 この遺伝子は、 1
6
12
アミノ駿残基からなり、アミノ酸レベルで Dros
o
p
h
i
l
aの cno遺伝子産物と 40%
の相向性があることが明らかにな っている。 cno遺伝子産物は、 Not
c
bカスケー
ドと他のシグナ/レ伝達経路との相互作用を仲介すると考えられているタンパ ク
質である 。特筆すべきは、 AF6、cno ともに 、モータータンパク質キネシンフ
ァミリーや、同じくモータータンパク質であるミオシンファミリーと相同性を
持っていることである 。 この杓向性を示す領域は、モータードメインではない。
相向性をもったこの領戚の機能は不明であるが、何等かのタンパ ク質との結合
に関与していることが考えられている 。 したがって、 AF6 遺伝子産物自身は、
モータードメインを持っていないが、イ可等かの分子のトランスポー トに関与し
ていることも考えられている。
また、 AF6、cnoともに DHR (
GLGF
) ド
メ インを持っており 、このことは、
細胞骨絡と細胞j
肢の接点に局在する可能性を示唆している 。
(4) 1
(
1
;1
1)
(p32;
q
2
3
)
1
1
)
転座におけるパー トナー遺伝子は、 AFIPである九この遺伝子は、 896
t
(
l;
アミノ酸残基からなるタンパク質をコードしている 。 AFIP 遺伝子産物は 、ア
1
0
ミノ酸レベノレで、マウスの epsl5遺伝子 (
ep
i
d
e
r
r
n
a
lgrowt
hf
a
c
t
o
rr
e
c
ep
t
o
rp
a
山way
5遺伝子産物は、 EGFレ
s
ubs
t
r
a
t
e1
5)と 88%の相同性を保持している 。 この eps1
I
1
I
}
包質内のターゲシトである 。 e
p
sl
5は
、 N
セプターによってリン酸化される品1
末端にリン酸化ドメイン、その C 末側にフィラメン卜の形成に関与する ミオシ
ンのドメインと似たヘリックスドメインが存在している 。 さらに、 DPF という
3アミノ酸残基からなる繰り返し配列があり、この領域が機能ドメインである
と考えられている。
(5) t
(
x;
I
I)
(q
J3
;
q
2
3
)
l)
転座のパートナー遺伝子は、 AFXl 遺伝子である九 AFX1 遺伝子は、
t
(
x
;l
f
o
rk
h
e
a
dファミリーに属する転写因子と高い相同性が見られる 。しかし、 f
o
r
k
h
e
a
d
ファミリー遺伝子と高い相同性を示す一方で、まったく相同性を持たない領域
もあるので、特異なメンバーと考えられる。
(6) t
(
10;
I
l)
(p
I2
;q2
3
)と t
(I
I;
1
7
)
(q23;
q
2
1)
(
1
1:
J7)
(
q
2
3
;
q
21
)
転座におけるパートナー遺伝子は、それ
1
(
1
0;
1
1)
(p1
2
;q
2
3
)と t
0AFIOと AF17は、ともにシステインリッチな N
ぞれ AF10 と AF17である則'
末端領域と C 末端のロイシンジッパー領域を持ち、高い相同性を示す。 これら
は、既に報告されている BR140遺伝子とも高い相同性を示すが、 BR140遺伝子
.
el
e
g
a
n
sの CEZF遺伝子も AFI
O
は、極基性領域を持つ点が異なっている。また、 C
および AF17 と同様なシステインリッチ領域とロイシンジッパーを保持してお
り、これらは種を越えて高く保存されている遺伝子であると考えられる 。
t
(1
0;
1
1)
転座は、主に背・髄性単球ないし急性単球白血病細胞において観察され
る。 1
(
10
;1 1 )転座を持つ 8 例の患者を司，~ベたところ、 AFIO のロイシンジッパー
領域に I
侭 X の N 末端が融合していることが明らかになっている 。 また、染色
0:js:に何人されている異常も報告されている
体 1
1番の長腕の一部が、染色体 1
が、これも AFIOと HRXが関与していることが示唆されている 。
リンパ腿細胞で、あり骨髄分化のモデ〉レ細胞としても使われる U937 細胞は、
HRX と関与しない t
(
I
O;
l
l)
(p
lとq
1
4
)転座を起こしている 。 この例では 、染色体
1
1
1
0番上の転l
主に関与している遺伝子は AF10であるが、染色体 1
1 格上の遺伝
1a
t
l
u
i
na
s
s
emb1y pr
ot
ei
nであることが明らかにな
子は、 CALMと呼ばれる AP3c
I
O が融合してた最初の報
っている 。 これは、 HRX遺伝子以外の遺伝子と AF-
告例である。
(7) t
(
lI
;
1
9
)
(
q2
3
;p
I3
.1
)
到底に関与してし、る遺伝子は、 ELL (
MEN とも呼ばれる)
t
(
1
1;
1
9
)
(
q
2
3
;pI
3
.1
)
Q
である 3$。 この転座は、
EN
L 遺伝子が関与する州 1
;
1
9
)
(q2
3
;p
13
.
3
)転座とは異
毒性が高いロイシンリッチなモチ」フを持ち、これは
なる 。 ELL 遺伝子は、指2
po
l
(
ADPr
i
bo
s
巴) p
o1
ym
巴r
as
e が持つ DNA 結合ドメインと相同性を示している。
ELL遺伝子は綴々な組織で発現しているが、特に末梢血リンパ細胞や骨格筋、
胎盤、:m巣などでの発現レベルが高いことが知られている。近年、 ELLは RNA
poJ
ymer
a
sereJ
ongat
ionf
a
ct
orであることが示されている 。
(8) i
(
l;
1
1)
(
q2J
;
q
2
3
)
t
(J
;
JJ
)
(
q
21;
q
2
3
)
転座に関与する遺伝子は
、 AFl
qである 390 AFJ
q遺伝子産物は、
約 9k
Da のタンパ ク質であるが、特に高い相￨吉l
性を示す他のタンパ ク質が知ら
れていない。 また、胸腺細胞で強く発現しているが、末摘リンパ組織では発現
していなし、。 ただし、白血病細胞では発現していることが知られている 。
(9) I
(
JJ
;
2
2
)
(q2
3
;
q1J
)
l)
転座に関与する遺伝子 は
、 まだ同定されていないが、 BCR遺
t
(1J
;
2
2
)
(
q
2
3
;ql
e
akpoi
n
tがあることが明らかになっている 。
伝子よりセントロメアよりに br
(10) HR
.
Xの s
e
l
ff
us
i
on
eJ
ff
us
i
onが見られることが知られているへ HRX
AML において、 HRXの s
遺伝子が直鎖上に繰り返されており、 2から 6回の繰り返し構造どなっている 。
.
Xのエクソン 2以下が
これらの繰り返し構造は、エクソン 6のあとに別の HR
n
f
r
a
me な融合である 。 したがって、一部機能
融合する形になっており 、かっ i
eJ
ff
us
i
onには、
を持った HRX遺伝子産物が発現しているのかもしれない。この s
Al
u配列が関与していると考えられている 。
1
2
トリソミー I
Iにおいては、 2本の正常な 1
1番染色体に加え、 HRXの s
eL
ff
us
i
o
n
を起こした 1
1番染色体が存在する例が複数報告されており、 トリソミー 1
1と
HRXの s
el
ff
u
s
i
onの関係が示唆されている 。
<HRX遺伝子の機能 >
op
h
i
l
aと酵母にお
正常な HRX遺伝子産物の機能は不明である 。 しかし、 Dros
ける研究から、以下のことが示唆されている 。
D
r
o
s
o
p
h
i
l
aの lrx遺伝子は、ホメオティック遺伝子の発現に必要であることが
brm) 遺伝子は、酵母の転写活性化系に関与す
示されている 。また、 brahama (
/SNFと高い相間性を持つ t
r
i
t
h
O
J以 ファミリーに属する遺伝子で、ある 。 こ
る SWI
の SWI/SNF 遺伝子産物は、クロマンチン構造を修飾することにより、転写を
促進すると考えられている 。ヒトの brm遺伝子である BRGlは、ヒトの SWl/SNF
複合体と相互作用して、 HRXとともに染色体構造を変化させるものと考えられ
る。目 立 の N 末端に存在する ATフックは、 HRXがクロマチンの構造変化と
関与していることを示唆するものである 。 というのも、同じ AT フッタを持つ
HMGタンパ ク質は、ヒストン Hl と競合する形で染色体の構造変化に関与して
いることが明らかになっているからである 。 さらに、 SWl/SNF複合体は、ヒス
トンや HMGと相互作用し、転写を活性化することが明らかになっている。HRX
遺伝子を Knoekoutしたマウス HRX(/
うでは、 A
台
児
;
1
¥
11
に致死となることがわかっ
ており、このことは、 HRXがホメオティック遺伝子の発現に関与していること
+
/
ー)マウスでは、成長遅滞、
を、間接的にサポートしていると考えられる 。HRX(
J
包の異常が観察されている。
骨格や造血系締I
HRXが関与した融合遺伝子の中には、クロマチンを修飾する因子を含んで、い
るものがある。 BR140は
、 TFIIDの TAF2
50サブユニットと高い相向性があり
また酵母の Anclは、TFIIDと TFOFのコンポーネントである 。すなわち、 HRX
融合遺伝子がクロマチン構造を修飾することによって、他の遺伝子の発現レベ
レ
ノ ・パターンを変化 させることが考えられる 。
E
玖 X が他の多くのパートナー遺伝子と融合することが、白血病の発症に関与
1
3
しているのか、またこの変興が g山 noff
u
ncuonなのか l
os
so
ff
U
Dc
t
i
onなのかは、
興味がある問題である。細胞遺伝学:および分子生物学的研究によると、融合タ
1
が HRX遺伝子、 C 末端側が他のパートナー遺伝子
ンパク質は、常に N 末端似1
であることを明らかにした。このことは、 Æ~ なことは、 HRX 泣伝子の C 末
端が失われることであることを示唆している。すなわち、 LAPf
PHDドメイン、
t
r
a
ns
a
c
r
i
v
a
t
ioo ドメイン、そして SET ドメインの欠失である。
HRX自身の sel
f
f
ls
i
on が観察されることからも、パートナー遺伝子が重要な働きをしているこ
o
u
tマウスの研究結果からも、 l
阪皮によって l
o
s
so[
とは考えにくし、。また、Knock
f
u
nc
t
ionが起こっていることが考えられる。
しかし、パートナー遺伝子が何等かの役割を持つという可能性もある。すべ
ての融合タンパク質は、 i
nf
r
ameであるからである 。単に HRX遺伝子の C末端
toff
ram
巳な融合遺伝子が見つかってもおかしくない。ま
の欠失が重要なら、 ou
た
、 ENL と AF9、AFIO と AFl7 のように、機能的に同じと考えられる遺伝子
がパートナーになっていることも、パートナー遺伝子が何等かの働きをしてい
l
I
l
病細胞には、明らかな相関
ることを示唆するものである。さらに、転座と白 I
関係があることが示されている。 HRXAFLO、HRXAF
6は
、 AMLM4 と AML
ENLは、 リンパ、骨髄性、およ
M5に見られるのに対して、 HRX-AF9 と HRX-
、 U937 白J
f
r
l病細胞
び来分化な白血病に見られるからである。さらに、 AF10 は
0 が他の遺伝子と融合していることが明らかになり、 HRX が機
において、 AF1
能を失うことが重要ではないとも考えられる。
HRXAFIO 融合遺伝子に関する研究から、転座によって HRX 遺伝子にロイ
シンジッパーが融合していることがわかっており、このことは融合タンパク質
重要な意味を持つことを示唆している。多くの白血病
がダイマーとなることがE
細胞において、正常な HRX 遺伝子も発現していることを考えると、融合タン
パク質とダイマーを形成するタンパク質は、正常な HRX 遺伝子産物なのかも
しれない。
o
sso
ff
u
n
c
t
ion、gai
noff
l
l
o
c
t
i
on
以上の知見からでは、 HRX遺伝子の変異が l
1
4
のいずれであるかの結論を導くことはできない。 さらに解析が必要である 。
<IIq23転座のメカニズム>
r
eak
p
o
i
n
t
前述のように 、IIq23にマップされる HRX遺伝子が関与した転座の b
は、極めて限られた領減 (
8
.
3kbBamH 1断片)に集中している 。 この DNA断
片はすでに鹿基配列が決定されており、イントロン 6に 4つの Alu配亨)
1
がある
?
;
il
)
が見つかっている九 10例の詳細な b
r
e
a
k
p
o
i
n
t
のを含めて、合計 8つの Alu配
の解析から、 5，
秒)
jで b
r
e
a
k
p
o
i
n
tがイントロン 6であることが明らかになった。
このことは、 Alu 配列が転座と関与していることを示唆する間接的な機拠であ
るが、一方でパートナー遺伝子の b
r
e
a
k
p
o
i
n
t近傍に A
lu配列が見つからないこ
ともわかっている 。
t
(
4;
1
1
)と t
(
9
;1
1)
転肢において、転座に関与する両方の染色体の b
r
e
a
k
p
o
i
n
t近
傍にへプタマ一一ナノマーの組換えシクeナルが見つかっているへこのことは、
V(D)
Jr
e
combinaseが転l
主に関与している可能性を示唆している 。 しかし、他の
1が見つかっていないので、すパての
転座においてはへプタマ一一ナノマ一曲目)
転座がこれと同じメカニズムであるとは考えにくし 、
(
4;
1
1)
転座を解析した研究て、は、 topolsom巴r
as
e1
1i
総合切断部位に
また、別の t
a
s
e
見られる配列が見つかっている 。 2 次白血病を予防するために、 topoisom巴r
阻害剤が有効であることが知られている 。すなわち 、少なくとも 2 次的な白血
病の発症に関しては、 ωpOls
omera
s
eが関与していることが考えられる 。 HRXの
イントロン 6を含む 8
.
3kbpBamH1断片の配列を調べたところ、 t
o
p
o
i
s
o
me
r
a
s
e[
J
結合切断普1
)
伎と I
b
pだけ違う配列が I
I箇所に見つかっている。
d巴 novoの白血病と 2次白血病では、￨司じ 8
.
3kbpの BnmHJ断片内でも統計的
にb
r
e
a
k
p
o
i
n
tが異なることが明らかになっている 。 denovoではセントロメアよ
りの半分に集中しているが、 2 次白血病ではテロメアよりの半分に集中してい
る。
くP
r
o
p
r
o
t
巴i
n c
o
n
v
e
r
t
ase>
1
5
翻訳後修飾 (
p
o
s
t
l
r
a
n
s
!
a
t
i
o
n
a
l mo
d
i
f
i
c
at
i
on) の概念は、今から 30年前のイン
シュリンのプロセッシングの発見 43に端を発し、以来様々な研究がなされてき
た。糠鎖付加、リン酸化、硫酸化などである。このようなタンパク質のプロセ
ッシングの中で、もっとも基本的なものは、タンパク質の加水分解である 。 タ
ンパク質の加水分解には、大きく分けて次の 3つの分類がある。
(
1)粗商小胞体内でのシグナルベプチダーゼによるシク令ナ/レペプチドの除去。
(
2
)細胞外に放出された後に加水分解。
(
3
)
細胞内での前駆体タンパク質 (
p
r
o
p
r
o
l
巴i
n ある いは p
r
e
じu
r
s
o
r
) のプロセッシ
ング。
以後、この論文では、分類 (
3
)に属するタンパク質の加水分解について述べる
ことにする 。
さて、多くの分泌タンパク質は、前駆{本と呼ばれる大きな不活性型タンパク
r
o
p
r
o
t
e
i
nc
o
n
v
e
r
t
a
s
e
s (以下 PCs
)
質として合成される。その後、特異的な苦1位が p
により切断されて活性型になる。多くの場合の特異的な部位とは、 2 つの連続
Arg、Lys) の N 末端側である 。
した埴基性アミノ鮫 (
このようなプロセッシングを受けるタンパク質は、ペプチドホ Jレモン ・神経
ペプチド ・成長因子 ・l
疎結合型成長因子レセプター -血液凝固因子 ・細胞後着
因子 ・ウイノレスのエンベロープの粧タンパク質などであり 、一般に調節タンパ
r
e
g
u
J
a
t
o
r
yp
r
o
l
巴i
n) と呼ばれている判へ
ク質 (
プロセッシングは、真核細胞の分自立、過程で行われる。分泌タンパク質
(
p
r
e
p
r
o
p
r
o
t
e
i
n)
が粗商小組体 (
RER;
r
oughendoplasmicr
et
iculum) で合成されると
同時にシグナ/レペプチドが切断され、
'
tじた proprotetnが、
TransG
o
l
g
iNetwork
(
TGN) においてさらにプロセッシングを受け、成熟したタンパク質となる。
p
r
o領域)の C 末端の 2甑基性
また、プロセッシングの過程で生じる中 間体 (
i
o
nされることが知られている 。
アミノ酸が切断され、カノレボキシノレ基化 amidat
さて、 インシュリンタンパク質のプロセッシングの発見以後、このプロセッ
シングに関与する酵素 に関する酵素についての報告は少なく 、唯一酵母の Kex2
1
6
遺伝子にコードされる Kexin がプロホ/レモンのプロセッシングに関与している
ことが知られているにすぎなかったへ
しかし、常に 2 境基性アミノ酸が切断書1
[
位に存在していることから、何等か
の酵素がこのプロセッシングに関与していることが示唆されてきた。 また、切
[
位に構造的な多係性がある ことから、この過程に関与する酵素は複
断される普1
数であることも予想されてきた。 切断部{
立に見られるアミノ酸配列は、 Lys-Ar
g
が約 47%、Ar
gAr
gが 22%、Lys
L
y
s • Arg
Lysが 3%、1塩基性アミノ酸のみ
が1
4%、4つ以上の甑基性アミノ殺が 9% となっている。また、 p
r
o
p
r
o
l
e
mの 2
次構造がプロセッシングに重要であることも知られている。 さらに、同じ遺伝
子産物でも、組織特異的なプロセッシングを受けるものがあることも知られて
いる。
1980年代後半ーから、酵母の Ke
x
in慌の酵素が1
1
荷乳類でも報告されるようにな
り
、 s
u
b
t
i
l
is
i
n 様セ リンプロテアーゼ ・ファミリーを形成していることが明らか
になってきた。
現在までに報告されている l
椅乳類の s
u
b
l
i
u
S
l
n
l
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
eファミリーは、 れmn、
PC1
I
3、PC2、PC4、P
C5/6、PACE4(
P
a
i
r
e
dba
si
cAmiooa
ci
dr
es
i
d
ueC
le
a
vi
ngEnzyme
4) の 6種類である 。
u
b
l
i
l
is
i
n係セリンプロテアーゼは、 f
u
r
i
nである九
最初に報告された翰乳類の s
f
u
r
i
nをコードしている f
u
r遺伝チは、務遺伝子 f
esの上流 (
f
esl
Ip
s
l
r
e
a
mr
egi
o
n)
に見つかったことからその名前がつけられた。 J
u
r遺伝子の発現パターンには組
織特異性がなく、多くの細胞で発現していることが知られている。 f
U
l遺伝子の
発現レベノレが上昇している細胞とし ては、 p
r
i
m
a
r
ynonsmalc
eJ
ll
ungca
r
c
i
n
o
m
a
s、
a
d
e
n
o
c
a
r
C
I
l
1o
mas、s
q
l
l
a
m
o
u
sc
eJ
lc
a
r
c
i
n
o
m
a
s.
"埼玉知られている。興味深いところで
は、この f
u
r遺伝子は、復数の転写開始点を持っていることである。また、組
織特異的な al
t
e
r
n
aL
ives
p
l
i
c
i
n
gも観察されている 。
49
、
f
ur
i
n が認識して切断する配列は、 Ar
g
-xLys
lArg
Arg であり、 p
r
oTGFβ1
mvの gp160'
0、pro-NGFなどが基質候補として知られている九しかし、どの
1
7
基質も I
n VJ柱
。 系で調べられたものであり、 m
VJ
VO
での基質となりうるかは明
らかになっていない。近年、 HIV の GP1
60の例では、 fmin よりもより効率的
にプロセッシングする別の鮮素の存在が示唆された 510
f
u
r
i
n遺伝子をはじめとする s
ub
t
i
li
s
I
nJ
i
k
巴pr
o
t
e
as
e
sは、日甫乳類のみならず、広
く種を越えて保存されていることが知られている 。 これまで、 a
ng
e
J
e
r
f
i
s
h、
XenopusJ
e
av
is
、Dros
oph
i
J
am巴
!
a
n
o
g
a
s
t
e
r、Caenor
ha
b
d
i
t
i
sel
e
g
ans
、Lymne
aAstagnal
i
s
、
Hydr
av
u
J
g
a
r
i
sなどで報告されている 。
これらの s
u
b
t
i
J
is
l
i
トJ
i
k
ep
r
o
t
e
お巴の基本構造は次のようになっている 。 N 末端
r
e領域(シグナノレペプチド)、 p
r
o領 域、c
a
t
a
Jy
t
i
cdomain、middledom
泊
目
から、 p
(
p domain) 、そしてそれぞれの s
u
b
t
i
l
i
s
i
l
1i
!k
ep
r
ot
e
a
s
eによって異なる C 末 端
領域である 。pr
e領域は 、分泌タンパク質などに共通に見られる配列であり、 ER
内で、シグナノレペプチダーゼ‘により切断される (
p
r
e領域が切断されたタンパ
ク質を p
r
o
p
r
o
t
e
m とl
呼ぶ) 。その後、 p
r
o
p
r
o
t
巴
I
n内の p
r
o領域が切断されて、成
熟した s
ubi
tJ
is
i
n
-1
i1
信 仰o
t
e
a
s
巴となる 。
s
u
b
t
i
l
i
s
i
n
J
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
eの c
a
t
a
l
y
t
i
cdomainは、手護問あるいは s
u
b
t
i
l
is
i
n
l
i
k
ep
r
o!ea
s
e
聞で極めてよく保存されていることが知られている 。特に、セリン、ヒスチジ
ン、アスパラギン￨酸などの 4 アミノ駿校基およびその周辺領域は相同性が高い
へ ただし、ただし、 PC
2 においては、アスパラギン駿がアスパラギンに鐙き
換えられている。 また、この c
a
t
a
!
y
t
i
cdomainは
、 s
u
b
l
ii
ls
i
nJ
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
巴間でも
っとも保存されており、酵母の k
ex とヒトの f
ur
i
n間でも 47%のアミノ酸残基
が保存されている 。 1甫乳類で長布jに見つかった f
u
ri
n と酵母 k巴
x遺伝子で 47%
のアミノ酸が保存されていることから、この c
at
a
l
y
t
i
cdomain、特によく保存
れているセリン、ヒスチジン、アスパラギン駿周辺の上院基配列を
mぃ、 d巴generate
u
b
t
i
l
is
i
nl
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
eをクローニングする試みがなさ
p
r
i
m
e
r
sを設計して車Iiしい s
れ
、 PCl"、PC2"
.
5
4、さらに PACE4
、
目 PC456."、PC5f
PC6"
.
5
9がクローニングされ
た。
m
i
d
d
l
edOl
1
1a
i
nは、酵母 k
e
xの P ドメインであり、前述の c
at
a
Jy
t
i
cdomainと比
1
8
絞すると相同性が低く、酵母とヒ卜では 31
%のアミノ酸成義が保存されている 。
P domain は
、 k巴
X においては、酵素活性を保持するために必要であることが知
られている 。
m
i
d
d
l
e domainより C末端側の領域は、 s
u
b
t
i
l
is
i
n
L
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
巴によってかなり
u
r
i
n、PACE4、PC5
f
PC6におい
異なり、ほとんど相同性が見られない。 ただ、 f
u
r
i
n と PC5
f
PC6 は
、
て は 、 シ ス テ イ ン リ ッ チ な 構 造 が 観 察 さ れ 、 また、 f
l
T
a
ns
r
n
embranedom副
日 を持っていることが明らかになっている。
浦乳類 s
u
b
t
i
l
is
i
n
l
i
k
巴p
r
o
t
e
a
s
eの基本構造を記す。
以下に l
P悶 pro
f
叩 n
c
n
l
a
J
yl
i
c
m
i
d
d
l
e
皿
・
..
臼
・
・
・
E
PAC
陀
1
/PC
3
陀
2
d
・
h
_
6
3
8
a
a
a
5
、
e
6
町 間6
E
753;
tB
1
PC4
圃置
l
r
a
n
s
m
cmb
r
叩
C
E
I
877na
図1 s
u
b
t
i
l
i
s
i
n
-I
i
keprotea~e ファミリーと椛造
これまでに報告されている哨乳類の 印刷 i
l
is
i
nl
i
k
巴p
r
o
t
e
a
s
e の発現パターンを
調べると、次のようなことがわかる。
P
C
I
/3と PC2は br
ai
n特異的な発現を示すが、 PAC
E4、f
u
r
i
nは、調べられた
e
s
t
l
s特異的である 。PC5fPC6は
、
すべての細胞で発現している 。また、 PC4は
、 t
1
9
i
n
t
ιs
tm
也、b
r
乱m、t
e
Sl
1S
、o
v
a
r
yなどで発現しているが、 p
a
n
c
r
e
a
sや k
i
dn
りでは発
現が見られない。
l
Ib
ti
Ji
s
i
nl
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
eの発現パターンを表にまとめる 。
日荷乳類の s
表2 s
u
b
t
i
l
i
s
i
nI
i
kep
r
o
t
e
a
s
eの発現
PCJ/3 PC2
P
i
t
l
l
i
t
a
r
y
+
+
Hy
p
o
th
a
Jamus
+
++
A
n
t
e
r
i
o
rl
o
b
e
++
PC
4
PC5/6A
PC5/6B
F
u
r
i
n
PACE4
++
++
+
+
I
n
t
enn
巴d
i
at
el
o
b
e +
++
P
o
s
r
e
r
i
o
rl
o
b
巴
(
ー
)
A
d
r
e
n
a
ls
+
(
ー
)
++
B
r
a
i
n
(
)
++
+
Hea
r
r
++
++
P
a
n
c
r
e
a
s
+
+
++
+
K
idney
(
+
)
L
i
v
e
r
++
Lung
+
S
p
l
e
e
n
+
I
sI
巴I
+
Ovary
++
+
+
巴s
tme
I
n
t
T
e
s
l
i
s
++
+
Muscl巴
+
++
C
+)
+
++
++
+
++
巴n
t
a
P
l
a
c
i
J
i
s
i
n
l
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
e の細胞内局在を翻ベた結果によると、これらは TGN
s
u
b
t
(
凶n
sG
o
l
g
in
e
t
w
o
r
k
) に局在することが示唆されている印。 f
u
r
i
n タンパク質の
C 末端には、 TGN t
巴r
g
巴t
i
n
gs
i
g
na
J の 存 在 が 示 唆 さ れ て い る 。 YKGL と
CPSDSEEDEG である 。 これらのシク、ナノレを欠失させると、免疫飢餓学的に検
l
l
r
i
nタンパク質の局在が変わることが報告されている 。
出さ れ る f
2
0
また 、f
u
r
i
n 遺伝子を ノ ックアウト した 7 ウスは致死になることがわかってお
!
W
J
きをしていることが示唆されている (
p
e
rs
o
n
a
l
り、発生の段階でも重要な f
口 VIVO での基質が何であるか、また
c
o
m
m
u
n
i
c
a
t
i
o
n)
o ただし、上述のように、 i
それぞれ の s
u
b
t
i
l
is
i
n
L
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
e において異なった基質特異性を持っているの
かは定かではない。合成ペプチドや
HNの GPl60 タンパク質を用いた研究で
u
b
ω
i
s
i
nl
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
eによって、基質を切 l
t
l
f
i
-る活性に差が見られることが
は、s
報告されているが 、111VIVOでどのようになっているかは定かではない。
この論文では 、non-Hodgki目、リ ンパ腫 にま れに起 こっている t
(
J1
;1
4
)
転座部
位にマップされる遺伝子のクローニング 、およびその解析を行ったので報告す
るこ こで報告する 遺伝子は、上記の s
u
b
t
i
l
i
s
i
n
l
i
k
ep
r
o
t
e
a
s
e ファミリーに属する
遺伝子 LPC (
Lymphoma P
r
o
p
r
o
t
ei
nC
o
n
v
e
r
t
a
s
e) であり 、
日商乳類で 7 番目の
s
u
b
t
i
l
i
s
i
n
l
i
k
ep
r
o
t
e
as
巴ファミリーに属する酵素である。
21
3 ヒト LPC遺伝子のクローニングと解析
3・1 はじめに
l
l
q
2
3転座は、多くの白血病細胞において観察される転j
藍である 。特に、ほぼ
すべての細胞において、 TRX泣伝子が転座に関与していることがわかっている。
しかし、リンパ極細胞においては、 l
l
q2
3転盛が関与する例はあまり知れてい
i
n'
s リンパI
J
重細胞の "
j
J リオタイプ解析の結果から
ない。 この章では、 non-Hodgk
得られた t
(
1
1;
1
4
)型の転鹿に関与する遺伝子の同定、およびクローニングを報
告する。
2
2
3-2 材料および方法
3・ 21
ブレークポイントの同 定
non
-Hodgk
.
in'
s型リンパ J
!
重細胞のカリオタイプの解析結果から、このリンパ股
患者由来の細胞には、 l
(
1
1;
1 4)(q23 ; q 32)転J~ が起こっていることが判明していた
へ14q32 には、イムノグロプ リン H 鎖がコードされており 、イムノグロプリ
ンの組換えが転座に関与していることが考えられたため 、H 鎖の各部イ
立を用い
てサザンハイブリダイゼーションを行った。
サザンハイブリダイゼーションは、以下のように行った。
0μEを 50un
i
t
sの Ba
mH 1
、EcoR1
、HindI
I
I、 Ps
t1
、Bglr
ヒト高分子量 DNA1
で消化し、 0.
7%のアガロースゲノレ (
25V、一晩)で、電気泳動した。 その後 、
.
5μg
/μlを含む 1XTBEバッフ ァーに 1
5分間浸して染
エチジウムブロマイド 0
色し、泳gy
J
を確認するとともに、スケールをあてて写真を綴った。 0.
25N HCl
溶液に 30分間、 0.4NNaOH溶液に 20分間浸した後、中和することなく 0.
4NNaOH
溶液を用いて、アノレカリトランスファーを行った。 トランスファーを 2 時間行
った後 、2XSSC溶液でメンブレンを 3ンスし風乾した。メンブレンは 、Hybond
め am
) を用いた。
N+ (
Amer
0
00
Cで 1
0分間加熱して変性させた後、ランダムプライ
プローブの標識は、 1
7
ーラベリングキッ ト (
Amer
s
ham)を用いて行った。標識には 、約 50ngの DNA
を用いた。標識後、スパンカラムにより標識主れた DNAプローブを精製した。
0
メンプレンを以下の表に示したハイ ブリダイゼーション溶液中で 65C、 l時
0
間プレハイブリグイゼーションした後、 1
0
0C、5分間加熱後氷冷した DNA プ
5Cで一晩ハイブ リダイゼーションを行った。
ロープを加 えて、 6
0
表3 ハイブリダイゼーション溶液の組成
23
1
0XOe
n
h
a
r
t
's
4XSSC
1
% SOS
I
0
0
μg
/mls
a
l
mons
permONA
ノ、ィブリダイゼーション後、次の条件でメンブレンを洗浄した。
2XSSC/0.
l
% 8DS 室混、 5分
2X8SC/0.
l
% 80S 室組、 5分
1XSSC
/O
.
I% SOS 6
5C、1
0分
0
その後、フィノレムカセット内でー70C、一晩露光させた。
0
3-2-2 ブレークポイントのクローニング
プレークポイ ン トのクローニングは、以下のように行った。
まず、 t
(
1
1;
1
4)
(q23
;q32)
転座を持つリンパ駿細胞 (
rCRF細胞サービス部によ
り樹立)、および末梢血から分離した細胞を用い、以下のようにコスミドライ
ブラリーを作製した。
9
1
0
0
n
叫の
細胞を遠心で、試験管に集め、氷冷した PBSで 2回洗 った。その後、 1
0rnMT
r
is
.CI
，p
l
l8、2
5mMEOTA，p
I
l8、0
.
5%
消化バッファー (
1
0
0O1M NaCl、1
0
!mlp
r
o
t
e
i
n
as
eK)を加え、 50Cで一晩インキュベートした。その後、
80S、0
.
1mg
等量のフェノーノレ :クロロフオノレム
イソアミノレアノレコール (
24:
2
4
:
2)で 3回
000g
抽出した。1
1
2盆の 7.
5M酢酸アンモニウムと 2{
音量のエタノーノレを:IJPえて 2，
で 5分間遠心 した後、上清を捨て 70%エタノールで洗浄した。その後、 J
m
Jの
1
1
lmg
!
mJ)
。
20に溶解さ せた(
コスミドラ イブラリー n
l
のON
Aを得るために、ライブラリーの材料となる染
24
色体 DNAの部分消化の条件設定を行った。用いたコスミドは、 l
o
r
is
t
4で‘ある 。
1
0μgの DNAをエタノーノレ沈殿させた後、 9
0J
.
L1
のH
，.Oと10μlの 10X制限酵素
バッファーを加えた。
5 本の微昆;遠心 r;s; に 1 ~5 までの番号をつけ 、
l の微量;遠
心管に 30 μ l 、 2~4 には 20 μ l 、 5 には 10 μ l の DNA 溶液を分注した 。まず 、
l の微
量遠心管に 1
5
u
n
i
ts
の制限酵素 Sau3A [
在加えた。 l
の微盆速心管から 1
0μl
を2へ
0
μl
を3の微量遠心管へ移すことを 5の微量遠心管ま
移し、 2の微量試験管から 1
で繰り返した。表 を参照。
表 4 染色体 DNAの部分消化
微量遠心管の番号
μ g)
DNA盆(
2
2
3
4
5
2
2
2
2
r
1
!
i
J
限醇素量(
I
lo
i
t
s
)
1
0 3
.3 1
.1 0.
4 0.
2
濃度(
I
lnitslμgDNA) 5 1
.
7 0
.
6 0.
2 0
.
1
5分間インキュベートした後、 0.
5% アガロースを j
羽いたゲ、 Jレ電気泳
3
70Cで 1
動を使用して適当な反応条件を決めた。反応条件が決定後、 lm
gの DNAを用い
0
m
lで行った。反応開始後、 1
3
分で、 3
.31
叫、
て制限酵素処理を行った。反応溶液は 1
1
5分で 3
.
3
m
l、 1
7分で 3.
3mlを取り、反応を停止した。フェ ノーノレ/
クロロホノレム
で抽出後、エグノーノレ沈殿により回収した。
回収した DNA在用いて、さらにシュークロース勾配によるサイズセレクショ
ンを行った。
1O ~40 % のシュークロース勾配を超遠心チューブ内に作製し、これに 65 C で5
0
分間加熱した DNAを重層した。その後、 1
50，
OOOgで24時間、20Cで超遠心 した。
0
，
ペリスタポンプを使って、チューブの底から 7
5
011
ずつ微量遠心管に分注し 、
各サンプノ
レ の中から 4
0
μl
ずつを使 って、 0
.
5%アガロースグル電気泳動により、
適当な大きさの DNAを含むものを選択した。
その後、以下の表のようにライゲーション反応を行った。
25
表5 ライゲーション反応
2
3
4
5
ベクター (IOOng
lμl
)
挿入 DNA (
2
0
n
g
l
μ1
)
2
挿入 DNA (
I0
o
g
1μ1
)
0
.
5
2
挿 入 DNA (
lnglμ1)
l
OXライゲーションバッファー
H10
ig
a
s
e
2
0
0
u
n
i
ts
l
μ 1T4J
0
.
5
0
.
5
0
.
5
0
.
5
0.
5
0
.
5
0.
5
2
2.
5
2
0
.
5
0
.
5
0
.
5
pH7.
6)1
l0mMスペノレミ
1
0Xライゲーションバッファー:660mMT
r
i
s・HCI (
ジン1
l00mMMgCI
!1
5
0mMDTT
/
2mg
/
mlBSA(
DNase/RNa
s
eフリー )
/
5mMATP
ライゲーション後、 Gig
a
p
a
c
kgol
d
(
S
t
r
a
t
a
g
e
n巴
)を用いてパッケージングした。
その後、 E
.
c
o
l
iに l
f
a
n
s
f
e
c
!した。
245X245mmのプレートに約 1X 1
0
'コロニーをプレーティングし、常法によ
り
、 Hybond N+へトランスファーし、アルカリで固定した。 アノレカリ固定は次
のようの行った。
メンブレンを 3
M Mペーパーの上に置き、最低 1
.
0分間乾燥させた。 その後、
、
.5MI
laCl 1分間
0.2NNaOWl
I
2XSSC 1分間
1.5MT
r
i
s・HCl
2XSSC
l分間
処理し、 3M Mペーパー上で乾燥させた。
その後、をプロープとして、以下のようにコロニーハイブリダイゼーション
を行った。
rsham
) を用
プローブ、の標識は、ランダムプライマーラベリングキット(ん11巴
いて行った。標識には、約 50ngの DNAを用いた。標識後、スパンカラムによ
り標識された DNAプロープを精製した。
26
0
メンブレンを以下の表に示したハイブリグイゼーション溶液中で 42C、 l時
0
0
0C、5分間加熱後氷冷した DNAプ
間プレハイブリダイゼーションした後、 1
ロープを加えて、 42Cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。
0
表6 ハイブリダイゼーション溶液の組成
50% Formamide
5XD巴n
h
a
r
t'
s
5XSSC
0.
1
% SOS
/nus
alm
o
ns
permONA
1
0
0μg
ハイブリ夕、イゼーション後、次の条件でメンブレンを洗浄した。
2XSSC/0.l% SDS 室温、 5分
2XSSC/0.
l
% SDS 室混、 5分
0.
2XSSC/O.
l
% SOS 42C、1
5分
0
0
0
.
2XSSC/O
.
l% SDS 42C、 1
5分
その後、フィルムカセット内でー70C、一晩露光させた。
0
3-2-3 ブレークポイントの解析
得られたコスミドクローンを用い、部分的な制限辞表マップを作製し
b
r
e
a
k
p
o
i
n
tを含む DNA断片、および正常な DNA断片をザ プラスミド pBl
u
巴s
c
n
p
t
SK(
ー
)にサブクローニングした。その後、これらの DNA断片の ONA シーケン
スを行った。
DNAシーケンスは、 ABI
37
3Aを使い、ダイターミネーター法により行った。
ダイターミネーター法によるシーケンス反応は、 ONATherma
JCy
c
1e
rMode
l480
2
7
(
P
e
r
k
i
n
Elme
r
)を用いて以下の条件で行った。
表7 シーケンス反応溶液
鋳型 DNA
8
μ 1(0.2~ 0 . 5μg)
ターミネータ一反応 mix 8
μl
プライマー
4
μl
反応サイクノレ
0
9
6C 5分
lサイクノレ
↓
9
6C 30秒
0
50C 1
5秒
0
2
Sサイ クノレ
nO
c 4分
3-2-4 LPCの同定とクロ ーニング
COS6クローンから単離した BamHI
f
Bg
Ir断片を、エクソントラッピンクふ
m
ベクター pSP13八サプクローニングした後、 B
u
c
k
l
e
rの方法によりエクンント
ラッピングを行ったぺ以下に、エクソントラッピングの概要を示す。 ラピ γ
ト日グロビンの タおよび 3
'スプライシング音1
1
位の問にエクソンが含まれている
と恩われる染色体 DNAを姉入し、これを
CHO細胞にトランスフコク卜する 。
その後、細胞質 mRNAを調製し、これを f
l
iし、て cDNAを合成する 。 この cDNA
には、
CHO細胞由来の遺伝子が大部分であるので、ラビットの Hグロビン遺伝
子領域にアニーリングするプライマーセットを作製して、 PCR 反応を行う 。 そ
の後、 TA-clo日i
n
gk
i
t(
T
nvi
t
r
o
g
e
n
) により、 プラスミドへクローニングを行った。
2
8
S's
p
l
ici
ngs
i
t
巴
W
側
SV4
刊O
0
3's
p
l
i
c
i
ngs
it
巴
ωω
何
β州
g
以
ω
仰
l
凶
伽
仙
0
榊
b
β-gl
o
b
i
n
一
一
一
一
一]polyA
ρν
ρ
u
pd
o
C
︽
し
nu
t
n
ρi
V
n
u
o
9u
3
0
U
lIll111曹
v
_
_
_
.
.
genomicDNA
cyt
o
p
l
a
s
m
i
cRNAi
s
ol
a
t
i
o
n
cDNAs
yn
t
be
si
s
圃圃
圃-
・
・
・t一
一
一
ー
一
一
ー
・
・
・
・
E
仁三二二コ potential巴xon
図Z エクソントラッピングの概略
得られたクローン e
t
p
l
2を則い、以下のように 、
J
u
r
k
a
t細胞から作製した cDNA
ライブラリーをスクリーニングした。 このライブラリ)は、 J
. Dunn巴博士から
供与された。
245X245mm のプレートに約
5コロニーをプレーティングし、常法によ
jXJ
0
り
、 HybondN+へトランスファーし、アノレカリで固定した。 アルカリ固定は次
のようの行った。ま た、メンブレンは、 8枚調製した。
0分間乾燥させた。 その後、
メンブレンを 3M Mペーパーの 上に置き、最低 1
29
0
.2NNa
OH/l
.
5MNaCI 1分間
1
.5MT
r
is'HC1
/
2XSSC 1分間
2XSSC
l分間
処理し、 3MMペーパー上で乾燥させた。
p
12 をプロープとして、以下のようにコロニーハイブリダイゼー
その後、巴l
ションを行った。
Ame
r
sh
am) を用
プロープの機識は、ランダムプライマーラベリングキシト C
いて行った。様識には、約 5
0
n
gの DNAを用いた。標識後 、スパンカラムによ
り標識された DNAプロ ープを精製した。
0
メンブレンを以下の表に示したハイブリダイゼーション溶液中で 42C、 1時
0
0
0C、5分間加熱後氷冷した DNAプ
間プレハイブリダイゼーションした後、 1
"cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ロープを加えて、 42
表8 ハイブリダイゼーション溶液の組成
50
)
'
もF
ormamide
h副 1'
5
5XD巴n
SXSSC
0
.
1% SDS
/
m
ls
a
lmons
p
e
rmDNA
1
0
0
μg
ハイプリダイゼーション後 、次の条件でメンブレンを洗浄した。
2XSSC/O
.
I% SDS 室温、 5分
2XSSC/0.
l
% SDS 室温、 5分
0
0.
2XSSC/0
.
l% SDS 4
2C、 1
5分
0
0
.
2XSSC
/0
.
l% SDS 42C、 1
5分
0
その後 、フィルムカセ ッ ト内 で
ー70C、ー腕露光させた。
3
0
単自f
Eされたクローンを用いて、 DNAシークンスを行った。
DNA シーケンスは、 AB1373 を使い、ダイターミネータ一法により行った。
，
l巴rModel480
ダイターミネータ一法によるシーケンス反応は、 DNATh巴rmuCyc
σ
e
r
k
i
n
E
l
m
e
r
)を用いて以下の条{牛で行った。
表 9 シーケンス反応溶液
鋳型 DNA
8
μ I(0.2~0.5μg)
ターミネータ一反応 mix 8
μl
プライマー
4μ1
反応サイクノレ
96C 5分
0
lサイクノレ
0
96C 30秒
50t 1
5秒
2
5サイクル
0
7
2C 4分
得られた c
DNA を用いて、常法によりノーザンハイブリダイゼーションを行
p
l
e
en、tbymus、p
r
o
s
t
a
旬
、 r
e
si
ts
、ova
r
y、s
m
a
l
li
n
t
es
t
i問
、
った。用いた mRNAは、ヒト s
c
ol
o
n、p
e
r
i
p
h
e
r
alb
l
o
o
dl
e
uko
c
y
t
e、マウス h
ea
r
t、b
r
剖 n
、s
p
l
e
e
n、l
u
n
g、l
i
v
町
、 s
k
巴I
ta
1
mus
c
l
e、k
e
dn
ey、t
e
s
t
i
sである。
その後、得られた c
DNA をプロープとして、次のように P
l ライブラリーを
CRF の DNA ライブラリーサービ
スクリーニングした。 Pl ライブラリーは、 I
ス部から供与されたメンブレンフィノレターを用いた。
プロ」プの標識は、ランダムプライマーラベリングキット (Amersham) を用
いて行った。標識には、約 50ngの DNAを用いた。原誠後、スパンカラムによ
り標識された DNAプロープを精製した。
3
1
メンブレンを以下の表に示したハイブリダイゼーション溶液 1ド
て
‘ 420C、 1 時
間プレハイブリダイゼーションした後、 I
O
O
O
C、5分間加熱後氷冷した DNAプ
ロープを加えて、 42 C でー I~~ハイプリダイゼーションを行った。
0
表1
0 ハイプリダイゼーション溶液の組成
50% Formamide
SXD
e
n
h
a
r
t'
s
5XSSC
0
.
1% SDS
1
0
0μg/mIs
a
Jmons
pemlDNA
ノ、イブリダイゼーション後、次の条件でメンブレンを洗浄した。
2XSSC
/0
.
l% SDS 室協、 5分
2XSSC/0.
l% SDS 室温、 5分
0
.
2XSSC/0
.
1% SDS 42C、 I
S分
0
0
0
.
2XSSC/O
.
l% SDS 42C、 I
S分
0
その後、フィノレムカセット内でー
70C、一晩露光させた。
得られた PI クローンは、 3 0 ~ SOm
Jの LB培地を用いて精義し、アノレカリ SDS
f
去により DNAを精製した。
3-2-5 エクソン・イントロン構造の解析
得られたヒト LPCcDNAの塩基配列から、 PCRプライマーを作製し、以下の
条件により PCRを行った。テンプレートは、先にクローニングされた LPC を
含む P
lクローンを朋し、た。
3
2
表 1
1 反応溶液組成
鋳型 DNA (ヒト LPCPIクローン)
1
0
.
0
μ
l
1
0XPCRバッファ-
5~ μ 1
25
n
宙I
Mg
C
I2
5.
0μ1
2mM心<T
Ps(
e
a
c
h)
プライマー 1(
20m
M)
5
.
0μl
2.5μl
プライマー 2(
20m M
)
2
.
5μI
Q
H，
1
9.
0μl
1
.0μl
l
u
/μ1
Ta
qDNAポリメラーゼ
反応サイクノレ
0
94C 5分
0
6
0C 2分
lサイク/レ
nO
c 10分
0
9
4C 1分
0
6
0
C 1分
nO
c
30サイクノレ
1分
nO
c lO分
lサイクノレ
PCR終了後
、 0
.
7および 1
.2% アガロースゲノレ亀気泳i1V
J
で羽幅産物を解析する
恒産物をアガロースグノレから切り出し、 Gene
C
l
e
a
nJ
Ik
.
it(
Bio1
0)
)に
ともに、地 1
より精製した。
精製した各 DNA断片は、 TAC
l
o
n
i
n
gk
.
i
t(
l
nvi
l
r
o
g
e
n)
により pCRIJベクターへ
クローニングした。 以下に TAC
l
oI
li
n
gの概略を示す。
3
3
PCR産 物
A
A
L
Tを付加したベヲヲー
T
T
ライゲーション
IT I
L_ _ _ _
_ JA
B
IA I
TI
l
l
図3 TAc
l
o
n
i
n
gの概略
クローニングした i
曽幅産物を含むプラスミドは、アノレカリ SDS法により精製
I3univ
e
r
s
eおよび r
e
v
e
r
s
巴プライマーを用いて DNA
した。これを鋳型として、 M
シーケンスをし、その後、必要に応じてプライマーを合成しシーケンスを行っ
た。
DNA シーケンスは、 AB臼7
3 をイ吏い、ダイタ」ミネータ一法により行った。
ダイターミネータ一法によるシーケン λ反応は、 DNAT
h
e
r
m
a
lCy
c
Je
rM
o
d
e
l4
8
0
(
P
巴
r
凶l
E
l
m
巴
r
)を用いて以下の条例ニで、行った。
表1
2 シーケンス反応溶液
鋳型 DNA
8
μ 1(0.2 ~0.5μg)
タ}ミネータ一反応 m
i
x 8
μl
プライマー
4μl
反応サイクノレ
0
9
6C 5分
lサイクノレ
3
4
0
96C 3
0秒
0
5
0
C 1
5秒
2S¥
)
イクノレ
nO
c 4分
3
S
3-3 給果
ブレークポイントの同定
3-3-1
領域をプロ}ブとして t
(
ll
;1
4
)
転座を持つ患者
ヒト ・イムグロプリン H 鎖 J
H
の腫務組繊細胞から抽出した DNA と正~1\' X;llI胞 から抽出した DNAIO μE を Eco R 1
、
6a
mH1
、HindI
l
1
、 Ps
tI
、Bglnで消化した後、常法によりサザンプロッティン
グし、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果を下図に示す。
EcoR1
samH1
TCC TC C
¥、
9‘4
k
b
ロ
1
五n
.
dI
I
I
Ps
t1
B
g
ll
I
TCCTCCTCC
"-RSkbP
¥
図4 breakpointの同定(サザンハイブリダイゼーション)
ここで T は、腿協和￨
胞から抽出した DNA、C は正常細胞から抽出した DNA
である 。
盛務品!
日
胞に特異的なバンド(矢
ヒト ・イムノグロプリン H鎖 J
Hを用いると、 l
36
印)が得られた。 どの服務細胞においても、正常細胞と同じ大きさのバンドと
腹筋細胞特異的なバンドの 2 つが観察され、かつ‘ングナノレの強さは、正常細胞
で得られたバンドの強さの半分であった。 このことは、正常細胞では、どちら
のa
l
l
e
l
eも同じ大きさのバンドを与え、』重蕩創1
1
胞では一方が正;常と同じバンド、
もう 一方が腫腐細胞特異的なバンドを与えることを示唆していると考えられる。
(
11
;1
4
)
転座の breakpoin
t をクローニングするために、ヒト ・イ
したがって、 t
ムノグロプリン 日鎖の J
H領域をプロープとすることにした。
3-3・ 2 ブレークポイントのクローニング
スクリーニングの結果、下図に示したクローン COSIO が符られた。 このク
ローンを用いて制限酵素地図を作製した。
Cbromos
om巴 I
I
4
Chromos
ome1
DMI
DXPI
同出。υ凶
門司ロ昌司
﹃出。υ叫
ヱロ話回
図5 breakpointの制限酵素地図
3
7
HZE沼田
ω国
HEEd
Z巨 時国
Z戸高田
﹄
﹄
u凶
同出o
Zロ呂 田
z
t
h何回
H 甲﹃戸口同国
-ZE“岡田
ZE岡田
u凶
︻記o
﹄
d国
EE
ω凶
﹄出。
戸田戸呂田
-ZE阿国
出。υ凶
出。υ凶
IOkbp
また、
i
333プレークポイントの解析Jで得られた結果と合わせて、 COSIO
司
内の染色体 1
1 書領域をプロ」ブとして、再度スクリーヱングを行って、転座
1祷 (
b
r
e
a
k
p
o
i
n
t に隣接した領域)を含む COS6
が起きて いない正常な染色体 1
クローンを得た(上図参照)。以下、この COS6を用いて解析した。
3-3-3 ブレークポイン卜の解析
COSIOと COS6の制限酵素地図から、 b
r
巴a
k
p
o
i
n
tを含むと考えられる DNA断
EcoR1断片)をプラスミド p
B
l
u
es
c
ri
p
tSK(
ー
)へサブクローニングし 、DNA
片 (
∞
GGAGAGAAGAGTGAGMGT C
l
II
I
略行白川竹下門C
AACMMGGAGGAGGGM
叫G
TGCTCGGTAMAACACM
印C
A
G
T
A
A
l
i
ωT1寸寸G
C
C
C
T
C
C
G
A
C
C
A
G
凡C
G
C
G
A
1
1
1
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
AGGGGAAGGGGTGGTG^GCGGG^CC~ì(;GGGCTGAGCAGAGGGG^TG"CAGAGGTCAGGGAGTGG竹寸TGGCCTCCGACC.AGACGαAGGGG，\GAGAAG叫TGAGMGT
t(
1
1:
1
.
1
)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
11
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
11 1
1
1
1
1
1
1
A邸∞ MGωGTGGTGAGCGGGGCCCTGGGGCTGAGCAGAGGGGATGCCCTGGCTG.~GGGCG
C
H1
4
図6 breakpoinlの境基配列
r
e
a
k
p
o
i
n
l 周辺の庖基配列を決定した。その結果を以 l
'
に
シーケンスを行い、 b
示す。
、 1
4需の境1
回 目I
J
である。 t
(
1
1
;
1
4)
CHll、CH14は、それぞれ正常な染色休 日 議
は、クロ ーニングされた EcoR 1断片から明らかにされた breakpo.
i
n
tの邸基配列
である。
3-3・4
L P Cの同定と cDNAのクローニング
エクソン トラッピングの結果得られたクローンの DNA シーケンスを決定し
38
た。 シーケンス解析から、ラビット日グロビン遺伝子配列が含まれていないも
p
l2を得た。 e
t
p
l2の鹿基配5'
)
1を下図に示す。
のを除いて、クローン el
T
C
A
G
C
A
G
G
A
l
百G
A
C
C
l
百G
AGATGTCAGGGCrGAAGACCCTGGAGCATGTGGCAGTGACAGTCTCCATCACTCACCCACCG
CGCGGCAGCTTGGAGCTCAAGCTG
判 明'
GCCCCACTGGCAT
G
A
T
G
T
C
C
C
T
C
A
T
C
G
G
C
G
C
C
C
C
C
C
G
C
A
G
C
A
r
r
G
G
A
C
r
C
図7 etp12の邸基配列
また、このクローンは 、コスミドクローン COS6 とハイプリダイズすること
)
を含んでいることが明らかになった(データは示さな u
、
)。
から、 COS6内の配ヂ 1
この e
t
p
l の配列を用いてデータパンクを検索したところ 、s
u
b
t
:
i
l
i
s
i
l
ls
e
r
i
ne
巴との相同性が明らかになった(後述)。
p
r
o
t
e
as
u
r
ka
t和J
I
胞から作製した cDNAライブラリ
完全長の cDNAを得るためにヒト J
M と3
'
末端を含むク
}をスクリーニングして、完全な CDSを含むクローン pc
ローン pcDおよび p
c21を得た。
データベース解析から、この遺伝子は、 f
u
r
i
n などの s
e
f
l
l
l
ep
r
o
t
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になった。そこで、この遺伝子を LymphomaP
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子)と名 付けた。以
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LPCを呼ぶことにする 。
他のファミリーとの比較は、マウス LPCの配列と共に考察の1
'
コで述べること
にする 。
ヒト LPCcDNAの塩基配列を 以下に示す。ヒ トLPCcDNAをシーケンスは、
染色 体 DNA をシー ケ ンスした時と同傑に、必要に応じて 17 ~24me l のオリコ
ヌクレオチドを合成し た
。
ほぽ同時期 に
、 他のグループから LPC (
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ーニングが報告さ れた。彼らの報文によると、ヒ トLPCcDNAは、こ こで示し
た配列より長いことが明らかになっている 。また、後に述べるマクス LPCcDNA
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および染色体 DNAのシーケンスから明らかになったエクソン l とエクンン 2
の一部が、この cDNA西
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e
uS
e
rG
l
nA
r
gA
s
nV
a
l AlaS
e
rA
s
nG
l
nV
a
l
2116 TGT AGGAGTGGA CCCTGCCACTGG CCCCATCGG AGCCGG AAA GCC
C
y
sA
r
gS
e
rG
l
yPrOC
y
s Hi
sT
r
p1
'
1
'0 H
isA
r
gS
e
rA
r
gL
y
s A]a
21
61 AAG GAG GAA GGG ACAGAG CTA GAA TCA GTG CCA CTTTGCAGCAGC
L
y
sG
l
uG
l
uG
l
yT
h
rG
.
JuL
e
uG
l
uS
e
rV
a
lP
r
oL
e
uC
y
sSeγSer
2206 AAG GAT CCA GACGAA GTG GAA ACAGAGAGC AGG GGCCCTCCCACC
L
y
sAspP
r
oA
s
pG
l
uV
a
lG
l
uT
h
l
"G
l
uS
e
rArgG
l
yP
r
oP
r
oT
h
r
2251 ACC TCTGAC CTCCTT GCCCCA GACCTG CTG GAG CAA GGG GACTGG
ThrS
e
rAs
pL
euL
e
uA
l
aP
r
oA
s
pL
e
uL
euG
l
uG
l
nG
l
yA
s
pTrp
2296 AGCCTG TCCCAG AACAAGAGCGCCCTG GAC TGCCCT CAT CAG CAC
S
e
rL
e
uS
e
rG
l
nA
s
nL
y
sS
e
rA
l
aL
e
uA
s
pC
y
sP
r
ol
Ii
sG
l
nH
i
s
2
3
4
1 CTA GAC GTA CCG CACGGG AAGGAG GAG CAG ATCTGC TGA CCTCAG
Le
uA
s
pV
a
l'
Ir
ol
Ii
sG
l
yL
y
sG
l
u Gl
uGl
nI
l
eC
y
s
2386 GGC CTG ACA GTGTGG GAC AGG CTCTTCTTT CCCAAA ATTAGG GAG
2
4
31 CTCTTG ACA GAA AGCAGT TCT GATGCT TACATCTGG AATCTG AGG
46
2476 CATCC
1
'C
TG ACTCCA CTCAAA GAG GGTGAG GGCCTTCTTAAGATA
2
5
2
1 CAA ATG GTG GAG GATTGC TGCCAGAGA AGT CTG GTCAGA GCC ACA
2566 GGG TCT GCCTCCAGCCAA ACG GGA GCTTTTGGT GAG AAG GTG 1
l
'
G
I
'
26日 山 AGGGGA TTG GCG CCC CCCTTTGGTTTG GCC TCCATCC1
C川
2656 1
'CTC
1
'T G
GG CCAAGCCAG CTG CCTAGG TCC CCCAAG CATGGG GG^
ml~m~~millm~~~rn~m~~
2746 GCG CATC
T
CAAT GGA AACATCACTGGGGTC ACT TGG GAA GAG GAC
'G
GG AGG AGCCCCTGG ACA TGCCTG TCCTGA
2791 TTCGGG GTA GAG GC1
2836 AAG CGG C1
'G C
CT CCA TTA TCCATTCCC ^AG ATG CCTGAT CAG AAA
2
8
8
1 CCAACCATG AAT GAA CCCCTG GCT CCT TCA CCA CCCCCACGA TTG
2926 GTA TGA TGC TGC CGG CACAGCTGG GATACA CACGGCTCCCCCAGG
2971 CCT GAG CTG CTTCACTAG GGA ATCσG CGGCAG GACTGCAGA GCA
'
GG GAG CCA CTG
3016 GAT GGC AGA TGCACA TGTTGG AGG AGA GAG CCT1
~l~m~m~~~rommm~~~m
3106 GGG AAA 1
'G
G CC
1
'T
C
CCGCCGG AGG CCA GCTATC1
'GCC
TG ACA GGC
3
1
5
1 TGT GACTCTT口 CTCAACCT1
'G
GC CT1
'C
TCCCC TCT 1
'
CTGAG CTA
'
1
'
1
' TTTA
AT GC1
'T
AA GAT 1
'
1
'G T
TTTTC1
'C
1
'T
T1
'
3196 GTTGGT TGA ATT 1
~l~~~rnmmillmmrn~~mmw
3286 ATA AAA ACCTTCCAA ACA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAA
ポリ A鎖付加シグナノレは、下線で示した。 また、 p
r
op
r
ot
et
nconv
e
r
t
3
s
eに保存
されている活性に関与しているアミノ般 (4アミノ酸後基)は、四角で図 って
示した。
Cat
al
yt
icdom
ai
nは下線、 mi
dd
J
edomai
nには破線で示した。
また、 LPCが成熟化する際に切断される部位は縦線で示した。
r
eakpoi
n
tを太い縦線で示した。
さらに IJq23転廃で見つかった b
47
次に、 L
PC遺伝子内の breakpointを示す。
p
hu
k
-
C
h
r
o
m
o
s
o
m
c11
空自国 Ill-
ZE何回
ZEm坦
Z
E
d
u国
Zロ呂田
ZE2出
ヱロお由
pcD
p
c
2
1
pcM
c
l
p
l
2
図 8
O
.
2
k
b
p
LPC遺伝子と breakpoint
この図から明らかなように、 L
PC遺伝子内の breakpointI
士
、 c
o
d
i
n
g領域内で
はなく 3
'n
o
n
c
o
d
i
n
g領域て・あった。他の I
I
q23が関与している転座では .
i
o
f
r
a
m
e
PC遺伝子による
な融合タンパク質ができている例のみが報告されているが、 L
I
ymphoma発症は、iJ
J
l
のメカニズムであることが考えられた。
次に、ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
図9 ノーザンハイブリダイゼーション(ヒト mRNA)
48
左から s
p
l
ee
n、t
bymus
、pr
O
Sl
a
旬
、l
e
Sl
1S
，ovar
y、s
ma
lli
n
te
st
i
n
e、col
o
n、pe
r
i
p
he
r
a
lb
.
l
oo
d
、
l
e
uk
ocyt
e
図10 ノーサーンハイブリダイゼーション(マウス mRNA)
左から、 h伺抗、b
r
a
i
n、s
p
le
en、l
u
ng、l
iv巴r
、s
k
el
ta
lmus
cl
e
、kedn旬
、 l
eS
l
JS
ヒト、
7
クスともに調べたすべての組織において発現していることが明らかに
なった。
4
9
3・3-5 ヱクソン・イントロン構造の解析
ヒ ト LPC cDNA がクローニングされていたため、:I;l[基配 ~Ij 情報を元にして
PCR用プライマ}を作製した。 これを j
明い、すでにクローニングされていたヒ
ト LPC染色体 DNAを含む 3つの Plクローンを鋳型として、 PCRにより必要
隠し、 DNAシーケンスを
な部分(エクソン ・イントロンを含む領域)のみを増 1
行った。
以下に 、PCRによって噌幅したエクソンの例を示す。
1 2 3 4 5 6 7
図I
1 エクソン j
1
J
jJ
或の増幅 (
PCR)
レーン 1 :o
X174
lHa
eJ
l
l
レーン 2 エクソン I
1
レーン 6 エクソン 1
5
50
レーン 3 エクソン 1
2
レーン 7 エクソン 1
6
レーン 4 エクンン 1
3
レーン 5 エクツン 1
4
エクソン/イン トロンのコンセサス百日Jを以下に示す。
エクソン n
イントロン n
回 叫T
G
-
エクソン n+l
C
1
f
- c
E
Bran
c
h部位
図1
2 エクソン ・イントロンのコンセンサス配列
下線は、 100%保存されている配列を示す。
以下に、ヒト LPC遺伝子のエクソン ・イントロン構造を示す。
S仕 u
c
t
u
r巴 o
fhumanLPC
1
1
一寸ー→
{
) ト4
7 89
I
k
t
1
01
1
12
t
+
t
1
3 1
4 1
5
1
6 1
7
ι十斗十Eト
ニ
山1
•
口
Codi
ngr
c
g
i
o
n
Nonc
o
d
i
ngr
cgi
on
図 1
3 ヒト LPC遺伝子のエクソン ・イントロン構造
得られた Pl クローンを上記の PCRを用いた方法で解析したところ、クロー
5
1
ン Nl と N3は、エクソン 2から 1
7までのすべてを含んで いたが、クローン N2
はエクソン 1
3以降のみを含んでいることが明らかになった。
3以降を含んだ 3'
領域のみを持ったクローン
当初 、 これは、N2がエクソン 1
であると考えたが、詳しく制ベるうちにそうではない ことがわかった。
l
エク Yン 1
7の 5
'
{
j
l
j
)
のプライマーと 3
1
'
t
f
のプライマーを汗]1，、て PCR を行った
)
.
2
k
b
pのバンドが得ら れたのに対し、 04ではまったくバ
ときに、 Al、B3では 1
7 のほぼ真ん中付近とアニーリン
ンドが得られなかった。 しか し
、 エクンン 1
グするように設計・されたプライマーと 5'
側 のプラ イマーを用い ると、 どのクロ
、
) 。 このこ
ーンも同じ大きさのバンドを得ることができた(データは示さな u
7の 3
'
領域が欠失している こ とを示唆する 。 また、 04
とは 、N2は、エクソン 1
のエクソン 1
3 より 5'
側 を調べると、エクソン 1
2以前の エクソンは存在しない
が、少なくと 20kbp以上上流まではクローニングされていることが明らかにな
った。
r
e
a
k
p
o
i
n
t の解析から得た LPC 遺伝子下流に存在する L
i
n
e
以上の知見と 、b
r
e
p
e
a
lとを合わせて考えると、以下の図のような少なくとも 2つの LPC遺伝子
3からエクソン 1
7の途中までのみを含む)が存在すること
(
一方はエクソン 1
が明らかになった。
52
I
?
2 3
4 5
S
t
r
u
c
t
u
r
eo
fhumanLPC
I
kb
6 7 89
1
01
1
1
2
1
31
41
5
1
61
7
H
t
十叶置]
一
→ー十
世
Li
n
er
c
p
e
a
t
は 41
5
1
61
7
A
l
u
I
c
凶 i
n
gr
eg
i
on
日
Non.
c
o
di
ngr
e
gi
on
図1
4 ヒト LPC遺伝子の構造
また、データは示さないが、 FISH法による詳細なマッピングによると、これ
らの 2つの LPC遺伝子は、 I
l
q
23内の憎めて近い領域に存夜することが明 らか
になっている。
5
3
4 マウス LPC遺伝子のクローニングと解析
4-1
はじめに
PC遺伝子について解析した。 この遺伝子は、リンパ腫に関与す
前章で、ヒト L
るだけでなく 、タンパク質の成熟化に関与する p
r
o
pr
o
t
e
inc
o
nv
e
r
t
as
eであること
PC
から、正常細胞において緩めて重要な役割をになっていると考えられる。 L
遺伝子の機能を角判H
ー
するうえで、マウス L
PC遺伝子をクローニングすることは
有用である 。 この章では、マクス L
PC染色体 DNAの構造と cDNAをクローヱ
ングしたので報告する。
54
4-2 材料および方法
4-2-1
マウス染色体 DNAのスクリーニング
マウス LPC染色体 DNAを得るために使用したプロ}ブは、次のように調製
した。まず、すでにクローニングされていたヒト LPCcDNAの触媒ドメインを
コードしている領域の 5'
末端に相械的な合成ヌクレオチドを作製した。
5'
-CTTCA A CG A C C C CA AGTACCC-3'
図1
S ヒト LPCプライマー (M27)
このプライマーと、ベクターのクローニング部位上流の M13プライマーを使
用して、 PCRを行った。 これにより、ヒト LPC遺伝子の p
r
e
p
r
o領域のみが地
幅された。
HumanLPCcDNA
Ca
t
al
yt
icdomain
+-
図 1
6 ヒ トLPCcDNAの prepro領域の噌l
I
i
l
i
PCRは、以下の条件 で、行った。
5
5
表1
3 反応溶液組成
鋳 型 DNA (ヒト LPCc
DNA)
J
O
.
Oμ1
I
OXPCRバ ッ フ ァ -
5~μ 1
2
5
1
1
ホi
fM
gCI
2
5
.
0
μ1
2m MdNTPs(
e
ac
h
)
プライマー 1(
2
0mM)
5.0μl
2
.
5
μl
プ ラ イ マ -2(
20mM)
2
.
5
μl
同o
l
u
/μ1TaqDNAポリメラーゼ
1
9
.
0
μl
1
.0
μl
反応サイクノレ
9
40C 5分
0
6
0C 2壬
〉
lサイクノレ
nO
c 10〉
づ
↓
0
94C 1分
0
6
0C
1分
nO
c
1分
3
0l
;
ト
イ
ク
ノ
レ
↓
n"c
1
0分
lサイクノレ
反応終了後、 0
.
8%アガロースグ";レ電気泳動を行い、目的の泊 l
焔物 (
p
r
巴p
r
o領
域)を含むアガロース片(約 6
00bp)を切り出した。 このアガロース片に、
Hp
を加えてアガロースの濃度が 0
.
4%以下になるように調製した。
このようにして地幅 ・精製された しPC p
r
e
p
r
o領域をプロープとして、マウス
染色体 DNA に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、プロープが他 の
セリンプロテアーゼ遺伝子などを認識しないことを確認した。
サザンハイブリダイゼーシヨンは 、以下のように行った。
マウス高分子量 DNA1
0μgを 5
0
u
n
i
lsの BamHT
、EcoR[
、H
i
n
d
i
l
lで消化し、
56
0.
7%のアガロースゲノレ (
25V、一腕)で、電気泳動した。 その後、エチジウム
.
5μg
/μlを含む I
XTBEバッファーに J
5分間浸して染色し、泳動
ブロマイド 0
を確認するとともに、スケーノレをあてて写真を徹った。 0
.
25NH
C
I溶液に 3
0分
.4
N Na
OH溶液に 2
0分間浸した後、中和することなく O
.
4NNa
OH溶液を
間
、 0
用いて、アルカリトランスファーを行った。 トランスファーを 2時間行った後、
2XSSC溶液でメンブレンをリンスし J
liR乾した。 メンブレンは、 Hy
b
o
n
dN+
(
Ame
r
s
ham)を用いた。
プロープの線識は、上記の増幅産物を含むアガロース片を J
O
OO
Cで 1
0分間加
Ame
r
s
ham)を用い
熱してとかした後、ランダムプライマーラベリングキット (
0
n
gの ONAを用いた。標識後、スパンカラムにより
て行った。機識には、約 5
標議された ONAプロープを精製した。
メンブレンを以下の表に示したハイブリダイゼーション溶液中で 6
50C、1時
0
0
0
C、5分間加熱後氷冷した ONAプ
間プレハイブリダイゼーションした後、 1
5Cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ロープを加えて、 6
0
4 ハイブ Yダイゼーション溶液の組成
表1
l
OXO巴n
h
a
r
t
's
4XSSC
l
，
}
も S
OS
1
0
0μg/mJs
a
Jm
ons
p
e
r
mONA
ハイブリダイゼーション後、次の条件でメンブレンを洗沖した。
2XSSC/0
.
1
% SOS 室温、 5分
2XSSC/0
.
l
'
3
も S
OS 室温、 5分
1
XSSC/O
.I
% SOS 6
50
C、1
0分
5
7
その後、フィ/レムカセット内でー700C、-1
政露光させた。
マウス LPC染色体 DNAのスクリーニングは、以下のように行った。
NM539大腸菌を LB培
地'=1"'でー l
児培養し、その I
音溶液 0.
5
0
1
1を 50mlの LB培
地 (
0.2%マノレトースと 10mMMgSO
，を含む)に殖菌し 3時間、 370
Cで振とう培
養した。この地溶液 3
mlとファージ溶液 (
2
.5x1
0
5
u;1
29マウス染色体ライブ
pf
Cで 10分間インキュベートした後、
ラリー λ2001)を混ぜ、室温で 20分間、 370
5
0
0
1
1のトップアガロースを加えてよく混ぜた後、 245X2
4
5
m
f
f
iのプレート上に
0
広げた。これを 37Cで一晩インキュベートしてプラークを得た。
0
l
3メンブレ
1時間 4Cで冷やした後、次のようにハイプリダイゼーション f
Ame
r
s
ham) を使用した。
ンを調製した。メンブレンは、 HybondN+ (
まず、プレート上にメンプレンを載せ、 l分開放置した。この時、メンブ
をつけた。メンブレンを 3M Mペーパーの上に置き、
レン上の 3個所に針で‘向1
最低 1
0分間乾燥させた。その後、
、
0.2NNa
OH/
I.
5M 1
l
a
CI l分間
1
.5M T
r
is.
HC1
/
2XSSC 1分間
2XSSC
l分間
処理し、 3M Mペーパー上で乾燥させた。
LPCpr
ep
r
o領域をプローブとして、 1
297 ウスの染色体 DNAライブラリーを
スクリーニングした。プロープの標識は、サザンハイブ リダイゼーションと同
僚に行った。
メンプレンを以下の表に示したノ、ィブリダイゼーション溶液中で 420C、 l時
間プレハイブリダイゼーションした後、 1
0
0
0
C、5分間加熱後氷冷した DNA プ
0
ロープを加えて、 42Cでー腕ハイブリグイゼーションを行った。
5
8
表1
5 ハイブリダイゼーション溶液の組成
5
0% F
o
r
m
a
n
t
i
d
e
5XD巴n
ha
r
t
's
5XSSC
0
.
1% SDS
1
0
0μglm
ls
almons
p
e
rm DNA
ハイブリダイゼーション後、次の条件でメンブレンを洗浄した。
2XSSC/O.
J% SDS 室温、 5分
2XSSC/0
.
l% SDS 室温、 5分
0
.
2XSSC/0.
l
% SDS 42C、1
5分
0
0
0
.
2XSSC/0
.門も SDS 42
C、1
5分
0
その後、フィノレムカセシト内でー70C、一晩露光させたロ
4・
2 2 欠失変異株の作成
司
l
e
ti
onk
i
t (宝酒造)を用いて次のように作成した。
欠失変異株は、 De
まず、欠失変異株取得に使用する P
la
smjdDNAを CsCI密度勾配法により調
a
s
m
idDNA 1
0gを Kpn1および S
a
lIで完全に消化した。 プエノ
製した。この pl
0
0μlの e
x
ol
11
1
cl
e
a
s
巴
ー/レ抽出 ・エタノーノレ沈殿により精製した後、 1
I
I
Ib
u
f
f
e
r
で溶解した。これを 37Cに温めた後、 e
x
on
uc
l
e
a
s
e1
日を lμl加え、 q
墜く混ぜて
0
0
7Cに戻した。 4
5秒から l分毎に 1
0μlずつを別のチューブ(あらか
すばやく 3
nn
l
l
c
le
a
s
eb
l
l
f
f
l
巴I を 1
0
0μl分注しておく)に移した。すべての溶
じめ MungB巴a
0
5Cで 5分間インキュベー卜して、 e
x
o
nu
c
l
e
a
s
e1
I
Iを失活さ
液を移し終えた後、 6
0
7Cに戻した後、 2
μ lの MungBe
a
nl11
1
c
l
e
a
seを加え経く混ぜ
せた。チューブを 3
て、 37 C で 45 ~ 60 分間イ ンキュベートした 。 フェノー/レ摘出 ・ エタノーノレ沈
0
59
殿で精製した後、 5
0μlの K
le
n
o
wb
uf
f
e
rに溶かし、 1
μlの K
le
n
o
wf
r
a
gme
n
tを
加えて、 37t
で 1
5分間インキュベー卜した。 この溶液 1
0μ1:
を
月J
Iのチューブ
0
0μl
、溶液 Bを 1
2
μl
加えて、 1
6Cで 1時
に移し、ライゲーション溶液 Aを 1
0
間インキュベー卜した。 その後、フェノール抽出 ・エタノーノレ沈殿で、精製し、
4
0
μ lの反応溶液 (
I
O
u
n
i
tsの制限酵素を含む)で 1I
時間消化した。 この溶液を
そのまま用いて、定法により大J
易菌を形質転換した。 大腸菌は Xし IB
1
ue
、あ
0個を 5
m
lの LB液体培地で 3
7C、
るいは OH5白を用いた。得られたコロニー 5
0
la
sm
i
dDNAを精製した。
一晩援とう培養して 、アノレカリ SOS法により p
4・ 2-3 DNAシーケンス
2
・2
・l
で得られたファージ ONAを X
ho1または Xba1 (
λ マルチクローニン
B
l
ue
s
c
r
i
plSK(
+
lヘサブクローニングした。 サプ
グサイト)によって断片化し、 p
クローニング後、それでも大きな断片については Hi
n
d
[
[
]で消化し再度サブクロ
ーニングを行い、
1 ~4 kbp 程度の断片とした。
さらにターゲットとなる配列を含んでいると考えられる領域、および 3
k
旬
以上の断片に関しては、欠失変異株を作成した後 DNAシーケンスを行った
(
4
2
2 欠失変異株の作成参照) 。
DNAシーケンスは、 ABl
3
7
3
Aを使い、ダイターミネータ一法により行った。
ダイターミネータ-r:去によるシーケンス反応は、ONATh
e
r
ma
l
Cy
c
le
rMo
d
e
l
48
0
を用いて以下の条件で行った。
(
P
e
r
k
i
n
E
l
m
e
r
)
6
0
表1
6 シーケンス反応溶液
鋳型 DNA
8μ1(O.2~ 0 .5μg)
ターミネータ一反応 I
ni
x 8
μl
プライマー
4
μl
反応、サイクノレ
9
60C 5分
lサイクル
↓
0
9
6C 30秒
0
5
0C 1
5秒
2
5サイクノレ
nO
c 4分
r
dと M 1
3r
巴
，v
e
r
s
巴、それに得ら
シーケンスに用いたプライマーは、 Ml3[0仰 a
れたシーケンスからさらにその下流をシーケンスするためのプライ 7 ーを調製
した。
4-2-4 ヱクソン・イント ロン構造の解析
エクソン ・イントロンの解析は、次のように行った。ま ず、得られた DNA
自己列が LPC遺伝子を含んで、いること、さらに、他のセリンプロテアーゼ遺伝子
ではないことを確認するために、 B
l
a
s
t
n プログラムを使朋して DNA データパ
ンクを検索した。
検索結果を元に、マウス染色体配夢I
J
中のエクソン領域を推定し、その領域を
含む前後 Ikb ほどの配~IJ を、 Gene F
inde
rの HSPL (
s
ea
r
c
bf
o
rp
o
t
e
n
t
I
l
us
p
l
i
c
es
i
t
e
s
l
により解析しエクンンを同定した。その後、スプライシング在日位に保存されて
いる配列、およびブランチ部位に保存されている配列を確認、した。
6
1
また、マウス しPCcDNA 配 ~IJ を決定 (4-2-5 参照)した後は、マウス LPCcDNA
配~IJ を元にして PCR プライマーを作製し、館」出 DNA としてスクリーニングし
たマクス LPC を含むファージ DNA、およびクローニングできなかった領減に
倒してはマクス染色体 DNAを使用した。 PCRは以下の条件で行った。
表1
7 反応溶液総成
鋳 型 DNA
1
0
.
0μi
1
0XPCRバッファー
5.0μ1
l
，
25m MMgC
5.
0
μ￨
ルr
dNTPs(
e
a
ch)
2m
5
.
0
μl
プライマー 1(
20mM)
2
.
5
μI
プライマー 2(
20mM
)
孔P
2
.
5
μl
I~Oμ1
i
u
/μ1TaqDNA ポリメラーゼ
1
.0
μl
反応サイクノレ
0
9
4C 5分
C
9
4C 30手
少
0
6
0C 30秒
n"
c
30サイクノレ
I ~ IO 分
反応終了後、 1
.4% アガロースゲ‘ル電気泳動にて地隠された領域にイントロン
が含まれているかどうかを機認した。
隠した PCR産物は、 G
e
n
e
c
l
e
a
nn(
BI0101)
を矧いて精製した後、 TA
また、治 l
をf
f
lいてプラスミド へクローニングし、 DNAシーケンス
C
l
on
i
ng k
i
t(
l
n
v
i
t
r
og
e
n)
を行った。 TA-c
Ion
i
ngの概略を以下の図に示す。
PCR産 物
八
A
仁
Tを付加したベヴヲ
T
T
ライゲーシヨン
L_
_ _ _ _ _
_.JT
L_
_ _ _ _ _ _
~
AI
A
T[
1
l
図1
7 TA-c
1o
n
i
n
gの概略
Taqpo
1
ymeraseを用いて PCR反応を行うと、増幅産物の 3'
末端にアデニン(
A)
が l塩基だけ付加される 。 この A と
キ
目
指I
I
的な T を付加したベクターを用いてプ
ラスミドベクターへのクロ」ニングを行うと、プラントエンド ・ライゲーショ
ンよりクローニング効率が上がることが知られている 。
PCRによるエクソン ・イントロン構造決定法の概略を以下に示す。
1
4
1
3
•
ブライマー l
ブライマ -3
ブライマ -2
PCR産物A
PCR産物日
図1
8 PCRによるエクソン ・イントロン構造の決定
3、イン トロン 1
3、そし
プライマー !と 3による増幅産物 B は、エクソン [
4 と含んでいると考えられる 。一方、プライマー l と 2 による噌
てエクソン [
6
3
幅産物 A は、エクソン 1
3のみを含んでいる 。 したがって、増幅産物 B の長さ
から増幅産物 A の長さを引くと、イン トロン 1
3 (エクソン 1
4の一部も含む)
を求めることができる 。
4-2-5 マウス cDNAのスクリーニング
マウス LPCcDNAは RACE法により取得した。
RACE法に用いた mRNAは、マウスリンパ腫細胞 EL4 (
約 l
ぴ細胞)より、
M
i
c
r
oFa
st
T
r
a
ck(
l
n
v
i
t
r
o
g
en)
を用いて調製した。
また、すでにエクソン ・イントロン構造の解析により明らかになったエクソ
ンの配列から 、 RACE法に用いる次の 2つのオリゴヌクレオチドを合成した。
MA5 5'
-CCGGGTGCTGGATGGACC
ACT
寸'
ACTGACA3
'
MA3 5
'
-GCACC
TGCAGCATGAGGGCTATC
ATTCCA
3
'
図1
9 RACE用プライマー
鋳型となる cDNAは以下のように調製した。
lμlの 1μg
lμ1mRNA と lμlの 1
0μM の c
DNA 合成プライ
，
)o
N_
，
N
3
')、3μlの
ITCTAGAATTCAGCGGCCGC(T
7
ー (
5'
-
Hpを加 えて 70Cで 2分
0
0
間イ ンキュベー卜した。 その後 、以下の試薬を加えて 42Cで l時間 30分イン
キュベー トした。
表1
8 F
i
r
s
ts
l
l
'
a
n
ds
y
n
t
h
e
s
i
sr
e
a
c
t
i
o
n
r
i
me
r
)
5
μ I mRNA溶液(含 p
2
μ I 5Xf
i
r
s
ts
t
r
a
n
db
u
針引
lμI 10mM心HPmix
l
μI 1
0
01
li
t
s
/
μ I MMLVr
e
v
e
r
s
et
r
a
n
s
c
r
i
p
t
a
s
巴
F
i
r
s
ls
t
r
a
n
dbl
1f
f
e
r:
250mMT
r
i
s(
pH
8
.
0)
/
30mMMgCI
，
J375mMKCI
0
その後、直ちに以下の試薬を加えて、 1
6Cで 1時間 30分間インキ ュベー卜
した。
表1
9 Seconds
trands
y
n
t
h
e
s
i
sr
e
a
c
t
i
o
n
1
0μI F
i
r
s
ts
t
a
r
a
n
dr
e
a
c
t
i
o
n
4
8.
4μ1 H p
e
c
o
n
ds
l
r
a
n
db
u
f
f
e
r
1
6
μ 1 5XS
1
.6
μ I 10mMdNTPmix
4μI Seconds
i
r
a
n
denzymes
5X Second s
l
r
a
nd bu仔町 ・ 500m M KCI
/
50mM (NH'
)
2
S0
/Mg
C
I:
!
0.
75mMsNAD
l
Tr
i
s(
p
H
7
.
5
)
/
0.
25mg/mlBSA
scondslrandenzymes
巴
6
u
n
i
t
s
/
μ
IE
.c
ol
iDNA p
o
l
y
m
e
r
a
s
eI
Jl
.2
1l
1i
ts
/
μ IE
.c
oi
l
DNAl
i
g
a
s
e
/
0.
2
5
u
n
i
t
s
/
μ IE
.c
ol
jRna
s
eH
0
Cで 45分間インキ
らに 2μlの 1
0
u
n
i
ts
/μIT4DNAp
ol
ymeras
eを加えて、 1
6
ュベー卜した。 その後、 4μlの 0.2MEDTN2mg/mlgl
y
c
o
g
enを加えて反応を停
止させた。 1
0
0μlのブェノーノ
レ
/クロロホルム/
イ ンアミルアルコーノレ(
25
:
2
4
:1
)で
l度、ク ロロホルム/イ ソアミノレアルコー/レ(
2
4
:.
1
)で l度、抽出した後、 40μIの
，
COON
l
む と 320μlの 99%エタノーノレを加えて室温で 20分間遠心した。
4MCH
上清を捨てた後、 8
0%エタノーノレでリンスし乾燥させてから 1
0μlの H pに溶
解させた。
6
5
cDNA末端に結合させるアダプターは、以下の配列のものを用意した。
z
エ且主旦辺阜工
一主位よ一一一
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
cDNAa
d
a
p
t
o
r
3
'CCCGTCCA-5'
APlprimer
5'-CCTAATACGACTCACTATAGGGC-3"
図20 cDNAアダプターと APlアダプター
合成した の cDNAに以下の試薬を加えて、 1
60Cで一晩インキュベー卜した。
表 20 cDNAアダプターの連結
5μ1 d
sc
DNA
2μ1 10μMcDNAア ダ プ タ 2μ1 5XDNAl
ig
a
t
i
o
nb
u
f
f
e
r
lμ1 l
u
n
i
t
/μJT4DNAl
i
g
a
s
e
0
反応後、 70Cで 5分間インキュベートし l
ig
a
s
eを失活させた。アダプターを
scDNAを用いて、以下のように 3
'
および S'
RACE反応を行った。
連結させた d
66
表21 5'
および 3'
RACE反応
5'
RACE反応
3'
RACE反応
1
0XPCRb
u
f
f
eI
5
μl
5μl
H，
O
3
6
μl
36μI
10mMdNTP
lμl
lμl
K
l
e
nTaqp
o
l
y
r
n
e
r
as
巴
1μl
lμl
d
scDNA (
1
/
5
0希釈)
5μl
5μl
APlp
r
i
m
e
r
lμI
lμl
MA3
lμl
lμl
MA5
RACE-PCR反応は、 p
e
r
k
i
n
E
l
m
e
r社の DNATherma
lC
y
c
l
e
r480を用い、以下
の条件で、行った。
9
4C
0
1分
0
9
4
C
30秒
0
1
0分
6
8C
30サイクノレ
反応、
終了後、アガロースゲノレ電気泳動で維認し、目的のバンドを切り出し、
l
e
a
nr(
BI
OlO
I)を用いて精製した。その後、 TA
C
l
o
n
i
n
gk
.
il (
[
n
v
i
t
r
og
e
n
)
Gen巴c
を用いてプラスミドヘクローニングした。 クローニングした 5
'および 3'
RACE
産物は、
ABI
373 を用いダイターミネータ一法により DNAシーケンスを行っ
た
。
得られた配列をもとに、 c
DNAの 5
'および 3
'にプライマー (
MA5-2と MA33)
を合成(下図)した。
6
7
MA5-2 GCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGACAGTAGCA
'
I
TCCGGTAAAGGGACTCGTGCC
MA
33 GGAGACCγrAC
図2
1 "7ワス LPCcDNA増 幅 J
日プライマー
すでに合成した の cDNAを鋳型に して、以 下の条件により PCRを行った。
表 22 反 応 溶 液 組 成
鋳型 DNA (
c
1scDNA)
1
0
.
0μl
1
0XPCRバ シ フ ァ -
5~ μ 1
25m MMgCI2
5
.
0μ1
1
N
TPs(
e
a
c
h
)
2mMc
5
.
0μi
プライ マ ー 1(
2
0日市1
)
2
.
5μl
プライマー 2(
2
0I
l
1M)
2
.
5μl
H20
1
9
.
0μl
lu/μ1TaqDNAポ リメラーゼ
1
.0μl
反 応 サイ クノレ
0
94C 5分
0
6
0C 2分
nO
c
lサ イ クノレ
1
0分
↓
0
9
4C 1分
0
60C 1分
30】
チイ クノ
レ
nO
c 4分
↓
nt
1
0分
lサイ ク
ノレ
68
このようにして得られた、ほぽ完全長の 7 ウス cDNA は
、 5
'および 3
'RACE
産物同様に 、 GenecJ
e
an 1
1(
BIOI
O
I) 、TACl
o
n
i
ng k
i
t (
I
nv
Il
J
.
oge
n) を利用し
てプラスミドへとクローニングしたo
得られた 7 ウス cDNAクローンは、 373A DNA シーケンサー (A
BI
) 、およ
びダイターミネーター ・サイクノレシークエンスキ ッ ト (
ABI
) を用いて DNA シ
ーケンスを行った。
シーケンスに m~ 、たプライマーは、 MI 3 f
orwar
d
と MI
3
r
e
v
e
r
s
e、それに得られたシーケンスからさらにその下流をシーケンスするため
のプライマーを調製した。 シーケンス反応は、
同様に行った。
6
9
r
4
-23 DNA シーケンス 」 と
4-3 結果
4-3-1
マウス染色体 DNAのスクリーニング
ヒト LPCcDNAの p
r
o領域を プロープにして 、サザンハイブリダイゼーショ
ンを行った結果を示す。染色体 DNAは、マウス DNAI
Oμgを EcoR1
、Hind1
口、
ヒト DN
AIOμgを EcoRr
で消化 したものを用いた。
マウス
ヒト
E
J
c
o
R1 HindT
I
I EcoR1
守
一
一
一
一
一
一 20kbp
図22 pro領域をプロープに用いたサザンハイブリダイゼーション
マウス LPC染色体 DNAを ク ロ }エングするた めに用いたライブラリーは、
7
0
I
C
R
Fが提供する DNAライブラリーサービスから供与された λ20
0
1ベクターを
使ったマウス染色体ライブラリーである。この染色体ライブラリーは、マウス
1
2
9から調製した染色体 DNAを元に作られたものである 。 λ2
0
0
1 のクローニ
r
ング部位は B
a
mH1であり、事 入 DNAは S
a
u
3
A1による部分消化によって剥製
された。
以下に λ2
0
0
1のマップを示す。
-，
PR，
.__.
T
λ+
，
q
l
PRM
・
一
一
一
一
」
T
'A
tcont刷 叫
ー
-
一一一一一-rR
r
J
1
f
1
E
M
n
~
|君 I~
S!t.吉宮署るきさ官 E重量:;:;~~若:g~
¥
¥
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/
I
O'((5川川件グ九
，
ロ 園 田 i IlEa31旧 日 I l
In
t
l
l
t
r
l llllllll
l
l山
判
石臼
E
1
5
E
E
lll内HU
=
h
'
同盟
伺
呈1
・
也
E
一
A
-
WYA
E
F3ZWM砧
.
1
1
吟
E 同
H
1
:
:
189
.
T
"
1
1 H腿
m
t
l
l
J
l
I
I
I
[
I
l
]
獲
「
片令"
μ
(州
"
ト一一
~\，
，
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一片告白司令~
PL
λ2001
-
PT岡 野 c
o PRE
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主oo:a.
主 w
H •
k
b
0
1I
(
四
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01 ~ 3 " 5 6
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¥
1
.11
"
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H I
F
l
，
J
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刷芭~k=~;.c
R，
，
'
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J
Q
f
f
i
:
:
盟
国
ー
‘
司
‘
'
司
"2 3
11
¥
'
¥
¥(
{ r
"ぺ、、m
!!
引 Z
言
語Z
言 蕊 ￨ 言 語2
2
8
-S 1
0I
I1
21
3I
唱 I
S1
6U 1819202122232 2S2S212
B233D313233J 3535373839
唱
代、
言
!~~ii~~
図2
3
!~~1~~!
λ2
0
0
1ベクター
スクリーニングに必要なクローン数は、以下のように言￨ー算した。
7
1
目的のクローンを 99%の縫率で得るためにスクリーニングしなければならな
い数 N は
、
N -旦と旦
ト言
)
I
n(
で与えられる 。 ここで、 P は目的のクローンが得られる雑率、G はマウスゲ
ノムの大きさ、 Iは λファージの平均のインサート長である。
9
、1
P=0.
9
9、G=2.7X1
0
=15Kbpとすると
N =I
n(
I
-P)=--.:!n(l-ω9) 三 7XI
O'
1， • ••
.
1
5x1
0
I
n(
1
-士) I
n(
1
一一一一τ)
(j
2
.
7x1
0'
喝
6
となる 。 したがって、約 1
X1
0
クローンをスクリーニングすればよいという
ことである 。
245X245cm プレートには、約 2
.5X 1
0'
p
f
u のファージクローンをプレーティ
ングすることができるので、最低 4枚のプレートをスクリーニングすることに
した。
しかし、 4枚のプレートをスクリーニングした結果、 l次スクリーニングで 6
クローン、 2 次スクリーニングで lクローン、高是終的に lクローンしか得られ
.3クローンを得た。
なかったため、再度 4プレ」トをスクリーエングし、合言 1
以下の表にスクリーニングの結果を示す。
72
表23 マウス染色体 DNAのスクリーニング (
5'
末端)
1次スクリーニング
同同
一
一計
口
引合
I回目
2次スクリーニング
最終スクリーニング
6
2
2
1
2
3
3
6
得られた 3 クローン (
C6、C8、C1
0) を λファージのマルチクローニング者fI
と Xho1で消化して、得られた DNA断片を pB1uescriptSK
(
ー
)
ヘ
位である Xba r
サブクローニングした。このようにして得られた DNA 断片を元に、制限酵素
地図を作製した。 とのサブクローンは、 DNAシーケンスにも用いられた。以下
に得られた 3クローンの制限酵素地図と cont
L
gマ ップを示す。
-
1kb
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
lH
i
n
d
l
l
lXbal
亡二二コ
Xbal
C10
H
i
n
d
l
l
l
C8E
E
H
i
n
d
l
l
l
目
Xbal
Xbal Xbal
H
i
n
d
l
l
l Hi
n
d
l
l
l
目
目
Xhol
Xbal Xbal
'
Xbal
C6
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
l
H
i
n
d
l
l
l
仁
コ
H
y
b
r
i
dほ e
d
w
i
t
h
humanp
r
or
e
g
i
o
n
DNA
図24 マウス LPC染色体の制限酵素地図 (
5'
領域)
上記 2回のスクリーニ ングに用いたプロープがヒ トLPCc
DN Aの 5
'末端か ら
500bpの領域であったため、得られた 3 クローンがどれも 3'
領域のみを含むク
ローンであった。そのため、マウス LPCcDNAが得られた後に、 BamH1から
73
下 流 (18683390bp) の断片をプロープとして、再度 8プレート (
4プレート ×
2回)をスク Yーングした。結果を以下の表に示す。
3
'末端)
表24 "ウス染色体 DNAのスクリーニング (
1I
火スクリーニング
l回目
2次スクリーニング
最終スクリーニング
8
2回目
1
2
3
〉、
コ 1
3
20
4
4
ぷ
1
苦
ロ
マウス LPC染色体の 3
'
領域をスクリーニングした後、サブクローニング、お
よび制限酵素地図の作成は行わず、
r
333 DNA シーケンス Jに示す方法に
より 、直接必要な部分の PCR によるクローニングおよびシー ケンスを行った
(
3
3
3 DNA シーケンス参照) 。サブクローニングしなかったのは、既にマ
クス LPCcDNAがクローニングされていたためである 。
7
4
4-3-2 欠失変異株の作成
Subcbn
E
d
.F:
r
a
g
mffi也
Xbal
Xbal
ー
ー
ー
ー
ー
ー :
D
e
l
e
t
i
o
nmutantswerepreparedusingthesefragments.
図2
5 サブクローニングした 7 ウス
LPC5'
領域の DNA断片
太線で示した断片は、シークンスのために欠失変異株を取得したことを示す。
以下に、作製した欠失変異株の 1W
t
lを示す。得られた欠失変異株をユニーク
な制限醇素で消化した後、アガロースゲノ
レ電気泳動したものである 。
7
5
図2
6 シーケンスのための欠失変異株
.
9
k
b
p (挿入 DNA の大きさが
ここで示した欠失変異株は、全体の大きさが 5
2
.
9
k
b
p、ベクターの大きささは 3
.
0
k
b
p
)のクローンである。 ほぽ全長にわたっ
て、欠失変異した株が得られたことがわかる 。
上記のクローンを用いて 2
.
9
k
b
pの挿入 DNAをシーケンスし、 c
on
t
Jg"7ツプ
を作製した。その結果を下図に示す。
欠失変異株は 2
.
9
k
b
pの挿入 DNA全体にわたって作成できたが、c
o
n
u
gマッ
プからわかるように 、2
.
9
k
b
pの中心付近ですべてのクローンのシーケンス反応
が止まってしまい、それ以上シーケンスすることができなかった。 この領域は、
樋めて G+C含量が高く、 Ta
qDNAp
o
l
y
m
e
r
a
s
eを用 いてはシーケンスできない
と考えられる。しかし、 V巴
n
tDNAp
o
l
y
m巴r
as
巴を用い、かっアニーリング温度
を上げても、この領域の シーケンスを得ることはできなかった。
この領域は、 LPCのプロモーター配列を含む領域であり、 CpGi
s
l
a
n
dである
と考えられる。
76
D
e
l
e
t
i
o
nM
u
t
a
n
t
s
4
0
0
ε
印
.
.
。
冊
1
HU
J
u
n
e
r
巴
2
0
0
2
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r
agmen
t
1
2.
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-
咽
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ー
ー
ー
マ
ー
一
一
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ト
マ
ー
ー
ー
ー
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ー
ー
ー
ー
ー
ー
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。
争
+
一
一
ー
一
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ー
→
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ー
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ー
ー
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事
惨
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‘
ー
ー
ー
ー
ー
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一
一
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』
一
一
一
一
弓.
.
.
図 27 欠失変異株によるシーケンスと c
o
n
t
i
g
これらの cont
Igマップを作製するためには、 DNASTAR[
ncの Se
qma
nプログ
ラムを用いた。
4-3-3 DNAシーケンス
r
42
-1 マウス染色体 DNAのスクリーニングJおよび r
4
-2
-5 マクス cDNA
のスクリーニング Jで得られたマウス LPC染色体 DNAとマウス LPCcDNAク
ローンは、すべて ABT社 373ADNAシーケンサー、およびダイタ」ミネーター
法により DNAシーケンスを行った。
くマクス LPC染色体 DNAシーケンス〉
77
マウス LPC 染色体 DNA の 5 '領域(エクソン l ~ エクソン 12) は、ほぽ全長に
渡って DNAシーケンスを行った。 3
'
領域については後述する。
シーケンスのためにサブクローニングした DNA断片を以下の図に示す。
Subcbn
e
:
:
1F:
r
a
g
mffi也
X
b
a
J
EcoRJ
ー 圃 園 田 園 ー
:
D
e
J
e
t
i
o
nmutantswerep
r
e
p
a
r
e
du
s
i
n
gt
h
e
s
efragments.
図28 サプクローニングしたマウス LPC5'
領域の DNA断片
これらのクロ ー ンをシーケンするとともに、必要に応じて 17 ~24mel のオリ
コヌクレオチドを合成し 、プロモーター領域を含む、マウス LPC染色体 DNA
の ア領域のシーケンスを決定した。
シーケンスの途中、 2 カ所シーケンスできなかった領域があるが、それは図
nnnnで表示した。1322、11493bpの 2カ所である 。特に、最初jの J
322bp
中では 口
からの領域は、 GC 含担;が 8 0 ~90 % と非;常に高く、欠失変異株や Vent DNA
polyme
r
a
s
e のような耐熱性がより高い酔素を使用することによって反応淑度を
あげてもシーケンスを決定することができなかった。 この領域は、LPC遺伝子
78
のプロモーター領域であり、 GpCi
s
l
a
n
dと考えられる(後述)。
また、エクソンを同定することが閥的であったため 、エクソンとその近傍以
外の領域には不確定の廠基が残っている 。
そのシーケンスを以下に示す。
7
9
マクス LPC 染色体 DNA 配列(エクジン J~ エクソン 1
2
)
CTTTARACTCACTAGGCGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCG
60
ATAAGCTTTCCTCTGCATAATGCCCACTGTGTCAGTTCCTCCAAACACCTAAGAAAGAGT
1
2
0
ATTCTGAAGGAGGGCAATAAAAGAGCCACTTCCGGCCATAAGTCCCAGTCAACACTGCCC
180
門C
TGGACAGAAATGCA
TCAGGCGCTGTCATACACATAAACATAAGGCAGACTACTTTTG'
240
GTCATTCCAAACAGACGATAATCTGATAAGAATTTTCTGAATGGTCCACATACCTACCTC
300
CATTTATTAAAGTTGACCTTTTTGGCCAAGATTCAATAATATGTTTAAATCCCTTTTGGC
360
門T
AAGTGATAGGGTTTATGTGAGGTGTTTCCA
TGTTGCAGTCAAAGCATTCTCTATTA
A
'
420
門T
TAGCCTGACAGTATTCCTTTC
AGAACAAGTCACCCCGGACCATCTCTDTGGGGTGTC
480
CTACAGATGGGAATGTCTGGTATCTGCCAACGCCCCACTAACAAGTTACCATTGAGTCAC
540
口 CAA
AGGCTACTACTCAGTTACTCCAGGGAGAAAAGGGAGATGTTGAAAAACATGGTAA
600
GTAAGGGAACCCAAGAAGACGGTTTTTTACATTTTTATTTTTAAGAGCATCTTTTTTGCT
660
GCAAAATAAAC
TCGGCCTTCTATGGTAACAAGAAAAACTAGGTGGTAAAAGTAGGATTAG
720
γrCCCATTCCTGCTTTTATTTTGACAGCATCCCATGAATAGAATATCTCTGAACCCAGAA
780
GAATGCACAAGAGCAGATACGAGTCAGGC
TGAATCAATAGTCACAGCTCAGTGCCTCAGT
840
TTCCTCTCATAAGAAAAAGCTCCTAGGTGAAAATGGGCCCTGAAACGCCATTATTGCATC
900
TCSGATGCAATCAGTCTGCCTACAATAGGGTCGAGATCATTGCCTCCAACAGGGAACAAG
960
GTCTGGGTCACCGATGCCCAGT
AAACGAAAACCTTAGGGCAAGGGTCATACGTGAAACTC 1
020
CGCAGCTAGAGCCCCAAACGAGAGGGATGGGGGGTGGGGTCGCACATCTGGCTCAAGAGC 1080
CCAGTGTGCCCAAGGGAATCCCGCAAGGCAGTGATGGTCACCAGTCAGGCGGCGACGCAG 1140
AAGGGGACAATGGGGGGAAGCTGCGCCGGGTGGTCACCGCCACTCTTCACAGGGAGCTGC 1
200
CGCTACGCTGGCCCTTGGCACTGGCCAGCGCCACCTCCACCCCTTCCCCTCCGTCCTCAC 1260
CGGCCGCCAGCTCCCGTCCCACTCCCAGGCCGGGCTCCCGCCCTGTCCCCGCCGCCCCCT 1320
附N
NN
l
可NNCGACCGCCACCGACGGCGCCCTCTGGCGGCAGGXGCGGACAGCGACCGR 1380
CNN
ACAAMGGAGCCGRTTGAGGGGACCAGCCCTKAGACCCAAGCGRAGCCCGASSAATWCGCG 1
440
T
'
門T
CTGAGGAGTTTATGGGGAAGA 1
500
GGCCAGAGAGACGGCGGCCGGATGGAGGCGAGACC
80
GTCAAGGWTATGGCAKTCCGACGGAGAAGAGC
むGCGAGGGGTGTTTAGAGTTCGGAACCG 1
5
6
0
GGATGGTCCTTACAGAGGACGCCATGAAGGACGAGGGCCCTGTAGCGGAGGGGGTCCTGT 1620
GGCGGAGGACACGAGGATTTGAGGCGCCGGAACTCCCACAGCCCTCACGGGCCTGTGACA 1
6
8
0
氾G
CCCGCTGGTCAAGAGGCCGC 1740
GAAGCCGTCGGCGGGCGTCGGCGGAGCGCCCGGAGCTC
AGGCCCAGCCGCTGATTGGC
叩C
GGCGCCGGGCGGAAGTGATGTCGCTGTCAGTGGCGCC 1800
TCCGGCTCCGGGGAAGCCGAGAGTTTCCGTAGGGTGGGGGClt
:
r
口
口r口
口r
A口rAにr
M
:
r
AI 1860 Exon1
叫
RF
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TA.
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r
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r
r
町T
GAGTCGGGAAGAAATGTAGTGGAGGCTGGACCT 1920
CGGATATACGGGGGACCATGGACCGGGGCTGGTCGGCGTCTGCGGAGGAGGTCC
げC
GCT 1980
GAGGGCACCTTGGGTCCTGGCGTGGGCGACCCCAGAGGGACCGGGTCTCCGGGTCGTAGG 2040
TTCCGGACAGCATCGGTCCTAAGGAGAGAGAGAGGCACATTGCACGGAGCAGCTGAGTCC 2100
GCGTGGGAGTGGGGGCATCAGGAAATTCACTCTGTACAGACCCTGGTTCCTGTGAGTGGG 2160
GAGACGGGGCTTGAAGGACGGTGGTTTAAGAGCAGAATCTTGAGCAGGAAAGGTGCCCGT 2220
r
TAAGATTTCTTGCTCA 2280
CTACCTTAGTTGAGGGTGATGGGAGTCTATTTTCAGAAAGTGC
GAGGTCTGAGAATAAGTGCTGCTGTGCCCCTGGACCACAGGGAGAAAAAAACAAACAAAC 2340
AAACAAAACAAAACAAAAACAAAACTCGGTTTCTCTTCCAGAAATBTCTGTTGGAACCTA 2400
CAGAGATTGTAGGAGCCTGCCTGAGTGGATGGCTGCTATCAAACCAGACTTTGGATTTAC 2460
寸G
GGCCAAATTGAAGCAGCCCCAGGG 2520
TTATATGCAGACTAGGGAAGACACCTGGGTATCT
GCAGGAAGAATGTAATAGGAAATATGCCATGGAAC
打A
AGGACA丁目 TGGCCCACACCTA 2580
TAATAACAGCAGTAAAGGGGTGGAAGCAAGAGTTCTCAGCCAACCTTTATTATATAAAGA 2640
l
I
ATGTTGGTGGCACACACCTTTGTTATCCCAGCACTCTGGAAGC 2700
AAGCTTGπTAAGCCG
GGAAGCAGGCTGGCTCTCTTGAGTTCCAGGCCAGCCTGGTATACAGAGGAAGGGGAGGTC 2760
CAAGGAGTCTTTGGTAAAACAGTCTTTCCAGAATGTTTTAAGTCGGTACCATCCAAGTGT 2820
寸G
GTAGACAGTAGTGAGTTγrAAATG 2880
ATGTCTGGACACCAAGACTGCTGCAGTGTGGGCl
AGCTCAAGACCCCACATGTGCCTTGTTCCTGCCCCCACAGTTGCTCGAAAGTTCTAATTT 291
'0
GGTGGGGTTTTTTTCCCCTTTGAGTGGTTGAAGACAGGGCTGGAGCCTGTGCCCTCACTG 3000
AAAATCCAACTTGGTGAGACGGGGCCAGCTCCTTAGTCCTTCTTGCCAGTCATTTCCTCT3060
CTCCCAGTTACCCACATGCACTTATACTACATTTTATTTCCATTATCTGGCTTTCTCCCT 3120
81
G
f
l
:
竹 G
TCCCATCTGGACTTCAAGGTGCTGGATTTCCTGGTAATGGGAGGTGCTAACAGTT 3180
AGGTCTTGCTAAGCCCTTAAAGAAGCAAATGAAAATAACATGATAGGTTAAGAAGTGGGG 3240
TATCTGGGTTCTGTATTGGTGTGGXCTTAγr
GTGATGAATGTCTCCTAGTCTGTGGCCTG 3300
TTTTAGATCCCTGGAAATGACA打 TAACACTGGTCACTGGTCAGGCCTGGCCTTCACTTT 3360
AGTTTCTGCTTTGCTGGCTTTAGTGGGACACCTTTTTGTTGTTGTTTCTGTACTTGGGGT 3420
3480 E
x
o
n2
3540
叩 CTC
附 川G
AGATAG附
I
GTAGGAAT
CCACTGGGAAAAAGACTT 3600
ATGTTGTCTGTAAATAAGARGGAGATAGAGCTGGGTGTTGATGGCTCATGCCTGTAATCC 3660
CAGGTAGACACAGGTGGATCTCAGTGAATTTGAGGCCAGCCTGATGGTCTACATAGTGAG 3720
TTCCAGGACAGCCAGAGAGAGCTACATAGTGAGATCATGTTTTTAAAAAAGAAGGAGGAA 3780
GAGAAGGAGGAGGAGGAGGAGGGGTCCTGATGTTGTCAGTCATGGGAσrGATATGTACTT 3840
GGAGTAACTGAATGAGCAGCCCAAAGCAAGCACCTGGATGATGCCAGGCTATTGGGGGCA 3900
CCAAGGGATGGGCCATTGTGCTGTAGGAGTCATCCACTGGGGTTAGCCCTGGCTCATACT 3960
CTACCTGGGGGTTAACATTTTGCTTAGGGACAAATGTACTTGGTAGGGGAGGGAAAGAGA 4020
口ATGAATATCAAGTGACTAACCACTTGAAAGAGGCGTGTTGGGCTTCCCAAGGGGAACA 4080
CC
C
T
寸rTTTTGCTGATT 41
40
CACTGATGGACC
TAGTCACTCTCTGAGTTTCCTATAGCTGCTG:
川C
A1 4200E
x
on3
CTGCTGTTCTGATGCCGAAAGGGAGGCAGAAAGTCCC
CTTGGATGCCCACCTGGGCCTGCCCATCTGCCTCTGGCTGGAATTAGCCATCTTCTTTCTI4260
GGTTCCCCAGGTCATGGGCCTATCAGAGGCAGGTGGGCTTGACATCTTGGGCACAGGGGGI4320
GCTGAGCTGGGCCGTACATCTGGACAGCCTAGAAGGTGAGAGGAAGGAAGAGAGTCTGACI4380
寸G
TGAATGCTGGGCGCATTGGAGAI4440
GCAACAGGCCGATGC
TGTGGCCCAGGCAGCAGGGCl
ACTCCAGGGGCACTACCTCTTTGTCCAGCCTACTGGGCATAGGCAAGCCATGGAGGTGGA1 4500
側 G
CTGTGTTAGCCAGACATGAAGCTGTGCGCTGGCAC
TC
GGCCATG印 刷 ACActCA
倒
O
l
iTGATCCCAAGTACCC 4620
GGAGCAAACGC
TGCTGAAGAGGGCCAAGCGCAGTATCCAC
TTCA
TCAACAGTGGCACCTGGTAAGTACAGCCTCAGATAGACAGGGCCTTCTCTAGTGTGCTn 4680
82
TGACTGAGGCTTTCTCCCACTGCCCTGTACTTATACTGAAGGGGGCATGTCTGTGGATTG 4740
GGAATATAGTTTGCTCTTAGTCCATACCTTCCCTGTCTGCTGTGAAGAGCAGGGCAGTGC 4800
TGAGGGTGTATGCACTCAACTGCAGCTAGTCTAGTGCACTCCTGTTCTAGCCTTCGACTT 4860
TGTAGCATGTACCTTTGGCTGAACTATACCCCTGTGTGCCCCAGTTGTAAAATGGAGGTT 4920
GTAGCAGTGCATATTTGATGGAGTTACTGTTAAAACAAGTAAGTGTGTATGTGAAGCATT 4980
TAGAAAAGTGTCTTACTCATGGGGGAACCCTGTYGTGTATTGGCTGATTGCAAACTTTAC 5040
TGCATAATAATTACCAATTAGCCCTAGCTACCACTTTGTGCTTGAGTTGCCTACAAGTGA 5100
GACCAAGAATCGATCGGAGGGACAGGACTCTCATGTGCCCATCTGGACTCTGTTCCCCAC 5160
TAACCTGTTGGTCTGTAGCCTCTGTTTGGCTCTTTAATAAAAGGCAAGGAAAGGGGTAGC 5220
x
o
n4
5280E
5340
5400
」一一一一一」
ACCCAACTACGTGAGTGGCCTGAAGTGAGCCCTGCTGCCACCCTGCTCCTTCCCTTTTGT 5460
TCCCTTTCCTAGAAGGCACTGAGCCA^^GCAGACAGCCTGGGAGGGGATAGTGTTCTGCC 5520
TCCTTTCTCAGTCAGCTTTCCAGACTTGC
芯G
TTAAGGCCCGGAAGTTGACTTTGGTCTAT 5580
AGCATTAATTCCTGCATCCTGTTGTTGCTGCTTTCCTGGGAGGGGAGCAGGGAATGGCCC 5640
TA 5700
TATAGGCAACTACTTTCTCTTTAGAGGTTCTGAAAACCTCTGGCTAAGGTGTGATCγr
GAAAGTCTGAAATCTTTTACCCTGGGCTCGCCCCAAGCAGCAGGCATAGTACTATACC
冶G 5
760
CCAAGAGAAAAGCTTGATTMAAACAAACAAAACMAACAACCCTGCCCTCTCAGCTTCC 5820
五GTGTCCTTGGCTCTTACCTTATAACCTTGGTTTGCTCGAGGCAGTGGGTGTGCTA 5880
CTCC
CCCTGATTTGGGAGTGGAAACTTCCAGTTCCTATTCTCCCTGATGTT
AGGAACTGACTCC 5940
れGTCCAGAGGGAAGCTI6000Exon5
ATGAα:TCAACTCTAATGACCCAGATCCCATGCCCCACCCTGATGAGGAGAATGGTAAC
むI6
060
ACCATGGGAαCGG
叩T
GCAGGAGAAAγrG
F
^
GCTGTGC
印A
A印 刷GCTTCTGTGCAG 6120
T'問'
CCTATCTCTGGGAAG 61
80
TGGGTGTGGCCTACGGGAGCCGAATAGCAGGTAACTCATGC
CTCTTGGGACACAGTGATCATTCTCTACCTTCCCCATTCTGAAGTTTCGTTTTCATACCC 6240
TCAGTGTTTGTAGCCTAAAGTGAGGAGTAAGAGCATAGCAAGTTAATTAGCTCATTGACT 6300
TTTCAGGGCTGTGGTATGTC
冶C
ATGGGCTTTTAACAACAGTATTTATTGTACAGTAGAAA 6360
ACAGGTAAGTGTGCAAAGGCTCATATTGTGGGCTATAGGTCCCAGGCTGCCCCTGCTCAA 6420
GTCTCTCTTCTGTTTCTGATCATGGCTCTGCTCACCACTGACCCACGTCACTGACsCTTC 6480
CTTCGAGTTGACTGTGCTCTGCTGCTGTTTTCATATGTTATCAAGTGCCTCCCTCATAGT 6540
TTGCCTTCCACAACTCCACATYTATGGAGGCTGCTCTCTC
冶G
CCCCACTGCTc
c
，
へGTCCC 6600
CTGCTCTCCATTCTCTTAAGAGAGCTTAGTTGTCTGGCTTTTAAGAGAGGTAGTTATATG 6660
GTTCYTCATCTCCCAGTCTTGTGGGTCAAGGGGAAAGGATGGGCACTCCTGAATCCTGGG 6720
AGCCTATGGTCTCTACAGGCTGGCTGTCACCCTGGTCTTTTCCAGCAGGGGGCCTCAGCA 6780
CTCTGCAAATCCCCATTTGTTCTTAACCTTGCACCACAGTGACCCACTCACTCCATCTTA 6840
GAAAAAGAGTTTGAGCAGCACTGGGGTAGCMAGGGGCGAATGCTATTTACTTCATTTCT 6900
江
¥AGCTGAGRGGGGATAT 6960
CTATTGTGTCAGTCACTGAGCTAGAGGTTCCACATGATGTGCC
CTTAGATTACCTACCTATATTCTAAACCCAGTGCTTTCTCACCTCTCAGGATCGTTAGAA 7020
TCTGAGTTCAAGCATGGTAGTAATAGACACTTGAAAGCTAGGCATATTCCCAGAATTTGA 7080
冶G
GATCAGGGATTCAAAATCATCTTTCTGCTATGTTGTAAGTTTAA 7140
GAAGTAGGGCCAGG
GACAAGACTATGCTGGCTi
¥
AGACTCTGTCTTTATAAATAATAAATAAATAAATGGCAGGC 7200
1
寸AATCCTAGCACTCAGAAAGCAGAAACAGGCAGATCTCTTGT 7260
TGTAGTGGCATATGCTT
TCGAGGCCAGCCTGGTCTATAACATGAGTTCTAGGAGAACCAGGACTACACAGAGAAACC 7320
CTGTCCCCAAAAAAACCCAAGTAAACAAAAACC
A
'
I
寸1
寸T
GAACTAGTAATACTTGTAGAT 7380
GGTATAAAAATCCAAAGTACAAAAGAGGGGGTTTGGTGTGTAGTTGATAAAGTGCTTGCC 7440
AGGCAAGCATGAAGACCTGAGTTCAATTCCTGGCACCCATGTAAAAAGCTAGAAACAATT 7500
冶G
AACTGAGAACACAGGGATAGATGAATCCATGGGGCTCTCT 7560
GGGTTTTCTTGTAATCCC
GGATAGCCTGCCTAACTTAATTGGGTCCCCAAGTCCCATCGAGAGGCTCTGTGTCCAAAG 7620
ACAAGTATTCTGAAGAATGCTATCCCAAGATAGACGACCACA印 CACTTACCCGACACAT 7680
ATGCATATGTACACTAATGCATTCACACCCCTACATATATAGCTATGAAXRATATGCACA 7740
CACAXAAGTGCTAAAGAACATACCACCCTACCACCTGGCACCCTACTTGGGGAATGTGC
へ
，
7800
CTATTTCTAGTTCCTTATGGGACCAGCATCAGTGAGGAGCTGGTGTAACTTCAATACCTA 7860
川 T
ATGGAGGCTGTGGCGTTCAACAAGI7920 日間n
I
G
TATCCGGGTGCTGGATGGACCACTTACTGAC
CACTATCAGATCAATGACATCTACAGCl・
GCAGGTAAGGAGGGGTGAGCTCCAGGGGAGGA 7980
GGTGAGAGACTCGAGTCTCTGGGAC
冶G
A
T
C
l
寸T
CAAAAAAAGAAAAAAGAAGCATAGGGA 8040
AACAGGCTGCCTCTAGCC
TAGCAGGGGTTCCTTGTTAGACTCAGCTAATGAGGCCATTTT 81
0
0
TCTTCATTTATCTAGTTCCGCAGCCGCTGGGTGCTGGGTCTTAGACTTGCCACAAAAAGA 8160
GTGTCCCAGCATGC
冶T
GCATTTGTTGTGTAAATTCATAATGCTCATAGAAGAAAGTGCAC 8220
TGAGTTCAGTGCCCCCCTGCAAAGATGCACTTGAAGCTTCAGGCTG門 GGTTTAGGAGTT 8280
GGATAGGAGGAGTTTAAGATGGATGG印 :CCTGTCATATTGATAGAGCCTGTTCTTCCCCT 8340
AACCAGTACGTTTC門 AAATTCTCTTTAA
TCT
CTTGTTATTTGGGGGGTGGGGGTGGTAT 8400
TGTGCTATTGTGCCAATCCCATGGTCAGAGGACAAGCCCTTTATGTGGSCCCCTGGGGTC 8460
AGTCAGTCACTCGGCγf
TCATAGCATACACCTTTACCTCC
TGAGGCATCTCACAGGCCTT 8520
GCTCAATT
寸A
AGAACCAGGAATTTGTCTGGTGTGTCAGCACACATTTTTAATCTCAGAAG 8580
GCAGAGGCAGATGGATCTCTAAATTCAAGGACAGCCTAGTCTAC
四T
GAGTTCCAGGACAG 8640
CCAGGGCTATACAGAGATACTTGTCTCAGTGACAACAA
CAACAAAAATAACCTTGGAGCT 8700
AGAGAGATGG口TGGTGGCTGAGAGCGCTTGATGCTCTTACAGAGGACC
TGGTTTCAGTT 8760
CCCAGTAACTACATGATGGTTTACATCCTTCTGTCACTCCAGTTTGAGGGAATC
fGAAAC 8820
CTGGCCTCTAGGGGTACTCCACATATGTTGAACTT
ちT
ACATACATTC
冶G
GCAAAATTCTT 8880
AGACAACATAAAATAAACTTTAATTAATAAAAAAAAAAAATCCAAAAACTGAGCAGCTTT 8940
TATCAAGCCTAGTAGTAGCTCTGTAAATCACAGGATGCCGCTGTCCCTATTCCACTACGT 9000
ATCTTCTGCTTCCCTGGGACCTGAGGCTAGATAAAGTCATTTTAAATTGGGACAT
寸T
CCA 9060
AATAAAGAAGAGCCTTAGCATATACTTGCAT
TTTCTACTTTGGAAGA^^ATGGCCCCTTG 9120
GCACCATGTATCTTTTAATCATGGGGTTCCTTGGGAGAAGAGTAAAAGCTGCAGGCAGGT 9180
GAGTGGCTCTGAAGACAAGGAGATCCTTACTCTACTCTTCCCTTTGCGAATCTCAACA
担
9240E
x
o
n7
1
TGGGGCCCAGATGATGATGGGAAGACAGTGGATGGTCCTCATCAGCTCGGAAAGGTAACT 9300
GAGGAGCATGAAGACTGGGGACCCCTTGGGACCCTCl
寸T
ACTCAGTTTTAGAAGAGTCAT 9360
CAATCAAACCCTCTTCCCATCCCGCCTTCATTATAGTGCCCAACTTACTCCAT
l
寸AGCAT 9
420
AGCTGTGCCATTCATCCTGTCAAGAAAGATTGTGTGCCTCACTTAGAATGGAGGACTGTA 9480
GGACCCTGGTGCTCAGAGAAGGAATAACTTCCAGCTTGTTTCTTTTGGATCTCACTCTGG 9540
GTTTCTGTTCCTCACCCTGCTCAGTTATCTGATAAGCAGAACATGTCTGTCAAAGACTAT 9600
TGGTTTTTTGGGGGGTTGGGGTTTACGTTTTI'TAGATTTATTGATTTTTAT
ATTCAGTGG 9660
T
A
T
T
T
l・
CCCCTGCATGTATATCTATGTGAGGGTGTCAAGATCCTCCTGGAACTAGAσrTA 9720
CAAGACAGTTGTGAGCTGTCATATGTGTTCTGAGAATTGAATTTGGCCCCTCTGAAGAAC 9780
'
1
'A
AGTCTTAGCTT 9810
AGCCAGTGTTCTTAACCGCTAAGCCATCTCTCCAGCCCAAACACTG1
1
'
1
'G
CCCAGGGCCTCACCCT 9900
TCTCCCCACTTTATGTATGTGTGTATAAATCTCTTTCCCCC
印A
CCCCCTACAATCAATCCTAGATGGTCCAGACACCTCA 9960
TGTCTTTCTTTCTAGATGCC
'
1
'
CCAGACACACTGTAGAACTTACAGCACTGATAGGCCAGCC 10020
TCCCAGACAGCCACATCA1
ATAGTCTTCAAGCAAGATCCTCGAGCTCTAGAAGCAGGAAGAGTGGATGGC
TGGTTCAAT 1
0
080
Exon8
口GGTACAGGTmTCTATTAGC
T口C1
'
1
'
中
AGTGGTAATGGGGGC GCACAATGACAA印
刷C
TATGATGGCTATGCωCTCCATC j0260
TACACTGTCACCATAGGTAGTGGTCTAGCGATTCCATGGGCATGGGGTCACCGGGTGTGG 10320
冶T
TGCTTCATTCTGTTTCTCTAAATGTGTAATCAGGATCATCTC1
0380
KTTTGTGTCTCACTGC
'
1
'T
CGAGCTCTCAGGG
1
'
1
'T
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CTGGGAC
礼T
G1
'
1
'C
A1
0440
TTGAGGAACAGTACTAGCCCAGCTC1
'
1
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ACTACCATTATGACAGGTTTGAGCTCCAC 1
0500
ACCATTTCCCAGAAATCACCTACCTGTC1
1
'
1
'
GAAGC
TGCCTC
TGGC
TTCCTTTTAACC 1
0560
TTTGGTCTCTTTCCATGACCAGGCCACTCTC
TGAATTAAGGAATTCTGTC
1
'
1
'G
CACTCα川 TTATAAAG1
'
1
'T
ATCATTTCAC
1
1
'
TTTATT 10620
'
1
'
CTTGACATCAGCCTCATTCTG 1
0680
ATTATTTGTTTACTCGACGTCCTACATAACTATAGGC1
ACTCCTTAGATCACAAGGAACTGTCCCTGCCCCTCTCTACCAC
TGCATAC
TGTGTCCTTC 1
0740
陀C
ACATGGCTCTAATATCTCATATGTATGACTCA ]
0800
CTACCCCTT
CCAGGATGTGGCC
T
li
'
CAGTAGATCTTAGTACACATTGAAGACAAGAGGCTAAGTACAGAGATGCCTGAAGCCTAT 1
0860
GGGAAGAGTGGTGTAATGCAAGAATTCCCTCTGCCATTTGAGGCTACCCGCCCACATACA 1
0920
GATGAAGCTGTGGTTATTγfTTGAGC
TC
ATCCCTTCATGATGAAGACAACTTTGGTATCA 1
0980
GCTGTGGATGAGGAGGGACGGATGCCTTTTTATGCAGAG
1
1
1
0
0
訂℃じ而 CGGAGCATTGTGAG日 CTTCTAGGACCC
TT 11160
GTCACCTT
CAGTGGTGGAGACAAG
CCCATGTGGTAGTCGGGGTGGTGGTGGGCAGGGGTAKTTCAAGACAAGGACTCACTCTGT 11220
AGCCAGCCAGGCTTGGAACTCATAATATTGTTCAAAGTGGCTTTGAATTTATTAGCCATC 11280
TTCCTGCCTTGGCCTCCATGAGTTGAGATTACAGGTGGGATATACCATACCTAATAAAAC 11340
AGCTGTTTTTTTCACCTCATTCTTTGAGAAAGGGTCTTATAACCTAGGTTGCCTCCAAGT 1
1
4
0
0
CCCCTTAGTTCCTGATCCTCCTGCATTAGTGGGGGGTTTTGG 1
1
4
6
0
CACTATGTAGCTGAGGAl・
寸T
TCGAGACAGGGTCTCTCTGTl
寸A
NNNNNNNNNNTGTTAGTAAATTGTAGAG 1
1
5
2
0
TTTTcn
TTTGGAGTTAAGCCTGGGTATGGTATTTGACCAGGTTTATAATTAAGTTCCCTGTCCCCA 11580
TTCCACAGTTGGCTTTCAAGAAGAATTGCTGAATGTTTGCTGGGGGAGGGAAACATTTTG 11640
TTCTAGTGGCCTTGCTCCTCCTGTAAATAACCCTTCATCCAAGCTCCTGTATTAACTTTA 11700
ATTAAACTTGCTGGTCCCCTAAAGAAAATAAATAAAAATTAGCTGGGCTGTGGTGGTGAA 11760
CATCTTTAATCCCAGCACTTGGAAGCAGAAGCAGGTGGATYTVTDTWTTBH¥
v
AKGCCAGM 11820
SATGXGGCCTAXTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCMAGGGCTACACAGAGAAACCCTGT 11880
CTTGAAAAACTAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAAATGGGATGGTCCAGGCCAGAGCTGGGCA 11940
GGAGCCAGATGCTTGTCAGCATTTGCCAGTGGCCAGTTGGGTTGTTCCTGAGGTTACTGG 1
2000
GAATTAAGTAGCTTCATCTTCACACAGGGTCAAGTTCATCTTACAAAATGAACTTGTTAT 12060
GCCAGAAAATGACTTCTGGTCAACACATTGTTCTGAGGCTCTGTGCCAGTTGACCCTCAC 12120
CCCAGGGAGGAGAGAGAAGGG.ATAGACT
AAAGTGAAAAGCAGAAAGTTTGCCCAAAAATT 12180
GGGGTGATACTAGCCTGTTAGAAGAACAAGTGCCTATTCCTTACCGCCTGGCAGAGTTAT 12240
GTGACCCTCGAATCCTGTCCCCTGCAAGGGACCTAACAAGGCTCTGTAσrGAAATTGTCA 12300
CTGTTGCTCTACACAGCCTAGCTTTGCCCCTTCCAACTCAACXTGGTTTCTCACCCTCAC 12360
CCCACCTTCCATCTGAACTGTAATγrGTCCAGATTTGTAAAGGGAGTTTATTCAGCCAAG 12420
竹T
GGAATGCCCTTGCCTTGGCAACCTCCTGTTGTGTGACCAGGCAGCTGCA 1
2
4
8
0
TTCCCATC
1
2540
TGGAGCTGTCTCTGAGGAGAAGGGCCAGGGGAATAGGCTTCCCAGCATCTGGCTTCTTGC.
T
l
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GCGCTGTGTGATGTGCTTGCCATTATGGGCAAGT 1
2600
CCAAGGAGCTTCCCTAGGTTTTCC
TGGCAGGCTTTGCATCTGTACTCTAGGCTATCGCTGTGTGAGGCTGTl
l
T
CCTTAACAGGA 12660
AAAAATCAATCTGTTCCCCTGGCACCAGTCAGGCTTCCTCTCTGGTGGAGACTACAACGT 12720
円
、A
CTTCTCTTG12780
GGAGTGTTTTTCCTTTTCTTTTAGGAGAGCATAGTGTCTGGGTGAAAA'
GCTGCTGCAGTAACATCTGGGATGGσr
T
GGGGGTGGAGGAAXCAATGGAGAAGGCAGCTC 1
2810
TTGGAAGAAGTTGGCACCCTGGTGTCTGACCCAGGAGAGAAGTTTGAAAGAAAAAAAAAA 12900
GTAGCCTGCACTGGCTTTATα~ACAAAGTTTAGCTGGGCAAGTCCCTGTTAACCCCTγfT
12960
寸G
ATGGGGCATGACCTTGATGCCCAMACAGATACTGTCTTCTCCCA J3020
TGATACACTTATGl
GTTTTAATGTCTC
冶T
CTGAGAGACATGGGTAGGAGAGAGGAGCTCACAGACACCCCllACC 13080
CAAGACACCACCCAGAGCAGGA^^AGCAGCTTGTCCAGTGGCCCAGTATTGCCTGGCAAG 13140
冶G
TAGGCCTTCAAGGGAAGGTTGTAATAAATAA 1
3200
ACAGTCCATGTAGATACTGAAACCTGC
川 C
TCCAGCCGGAGCCCAJ
3260
TCTTAGGGAACTTGTACCCTACATTCTCATGGTTCCTCTCCC
GTATAGCTGTAGCCACTCCCAGCTAGCTGTGTTATGTGAGTTGGGATAGAGAGTTTAGGA 1
3
3
2
0
ATGAAATGATA^^A^^TTAGAGGAGCAGGAACCAAGAAACTTATGTGTAACCCACATCCT 13380
涜G
CTGTGCCCCCAAGGTCACTCTTCAGTTTCCA 13440
CTCACATCCATTATCTCCTTTCCTTAC
及T
AAGGA 1
3500
TCATCTAGAGATGGATGGAAGGGGTAAGGGTCTCCTGTGCCTAGGCCTCTGTC
AAGTTAGAGGAGAGGGTCACCTGAGAGACTTGTTTGAGGACTGTCTCATTCCCTTCCAGT 13560
内
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13620E
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口 同 町AGCTGI
J3680
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刊 日 中 旬 CGG
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叩C
口 CACATGGCGGG川 TACAGCACA 1
3740
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礼T
CCAGGTGAGAGCTGATAACAAGTGCCCAGCCCACCCCACTC J
3800
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CATGGCTGGGCTGTCAGGAGACTC
CAGACTCAAAAAC
汁Y
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3860
TGTGTACAGCATGGGTGTGAGGACAGATCCCCAAGATGAGCTGTGGCAAGGCACTCTCAC J
3
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3
9
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0
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4
0
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0
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n1
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GTGAACCAAGGTGTTAGCCAGCAGGATACCCYG 1
4220
TATAGAAAAAACTGAGGGAAGGTACCAATGCCTAAACATCACCTGGCATTTTTATTGGTA 1
4280
CTTGACCACTTTAGGCCTTATTCTGGCTGATAGCCATCTTATCAGTGGGAAGTCGAAGTT 14340
CCCAAGTTGTTAGTAGTGTAAGGAGAACTTGATTGGACTCTGGGGCTTTCAGTGCTTCTG 1
4400
TTTTCCTTCCCTTCAGACCATGGCTGTTTCCTCTGAGTTCn‘
MCTTGTTTTTCTCAGGA 1
4
4
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0
ACATTTGGGGTACAGAAGGGACCTCAAGTGMAGAGTCTGATGATAGAAAAGCTAGAGGG 14520
TTAGACCTTAGAGAGCTTACTGAGTCTCTGCATGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAATA 14580
Exon12
AGGTCCAGGCTTGAGGCGGGTGATGGGGAAGCTAAGCTAAGCTCATCCTCCCTGCCCAGT 1
4820
TCTCCCCCTTCCTTCAGTAGCTTGAGCTGTAGCCAAACCTGTGGAGTTTTCTTTGAMCAT 14880
TTTAGGGCATGTTGCTGCTTCTGAJ
r
円
、G
GCTGGCCTCTGGCTGCl
、
TAACAAGACCTTTCT14940
CCTGAGTTCCTCATATMGAAGGAGCTGTAAGCCAATGGACTAGGAAGGCAGTGGGCTGA 1
5
0
0
0
GTGGGAGTGGGGCTTAGGGAGCCTCAGCAGGGGTTGAAAAAAGTTCCTGTGACTTTCATG 15060
CTAAGATCTTGCCAAATACCCTTTCCAGCACAGAGGCCCCAGCATGAAGGAGAGAAATGC J5120
ATGTTTGGTTCTTAATTTCCTCCAGAGAAAGCCAGATGCCATCTCTAAGGGGTGGGGCAC 15180
-A
CAGTTTCYACTGTGCTGTTGCTCTTTC
CTCTC
T1
5240
AAGCACAAGCACAGGTTCCCTGGGCI
GCTTKCCATCACAGGGTGGGTCTGTCTGTGAAGGAGTGCAGGGCACCTTCTGACCCAAGG 1
5300
GGTGTGCTCTATGTTAAACCCAGAGGTGGATACCCTCCCAAGAGAGACGGGAGGCTGGAT 15360
門T
TGGTGCTTGTGAAAAAACCCAA 1
5
4
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0
TCAGATGTTTTGTGCAGCCTGCATTGTCTTTA
T
T
G
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CCCAGC
TTCTCTATA 15480
TGCACATTTCTCAGATGTTCCTATCCTTAGT
口CATGGATCAATTTTTCAACCTTGAGAA 1
55
40
ATGTTGACAACCAGAGTTATTTGCTACTTTGTAAAAACTGAGGTGTATATGAGCGCCATG 1
5600
CTGATATCAGAACTCTGTACTTATTTTTCCTGTGTCCCTTGAAAGTGCCCAGACCAGAGA 15660
TATGAGGTCTAGAAGAATGACCAAAGAAGGGACCTTGGGTGGGAGGATAGGCCAGCCTTT 1
5
720
CTTCATGAACACTTCTCTCCCTAAGCATATCTTACTCCTGTTAGTGCCCCTATGTGTGGA 1
5780
AGGATACGAGGCCTAGGGAATGCATTTTTCCATGAACAGCATGCTGTCATAGGAAGGGTA 15840
GAAAACATCCAGGAATGTGGTTTGGGGAAGCCCCTGGCCTTTATACACTGTCTTGGGGAT 15900
TGTGGGCCTTTTGGCCTTTACTCAAGGCTGTTTTCCTCTCACTTC
TGTCAGATGAGCAAG 15960
寸G
ACCAGCTTTGTTATCCTCTGCTTCCCATTATCCAG 16020
TGAACTTCTCAGGGTCAGAGACl
89
GGAATGTGGCCCCTTAAAGTGCCCTTCCATAGGTATTGGGCAGCTGGCAACTGCCTGTTG 16080
GTCGCTAGAAAGCATTAハAGAGAAGTGTAGAGGGCAGAATACAGGGGTGGGAGTGCCAAG 16140
TTCTTGCCCTTAGTACATTCAGCCCT l6200
CAGGTCATCCATGTCAGAAGCCAGGGAAAGAGGl
CAATAGATAGAACAAAACAGAAAGAAAAGGTGAGCCTGAAAGGCTGGCTTGGCCATCAAA 16260
GGAGTGAAATTCACATGGTACAGAACTGAGCAATGCAGCCCCAGTCTAGATGCCCCACCC 16320
CCTACAATCAATCCTAGATGGTCCAGACACCTCATCCCAGACAGCCACATCATTCCAGAC 16380
ACACTGTAGAACTTACAGCACTGATAGGCCAGCCATAGTCTTCAAGCAAGATCCTCGAG 16439
90
上記の配 ~IJ から解析したマクス LPC 遺伝子のプロモーター領域は次の通りで
ある。
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r
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o
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0
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図 29 -?ウス LPCプロモーター領 j
或
プロモーター領域の角科庁から、 SPIや NFIといった hous
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的なモチーフが見つかった。この結果は、 N
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いる。また、 GR (
Gluc
o
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oni
c
o
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lor
) によって誘導される要素が見つかっ
ているが、これが機能しているかどうかは不明である。
<マクス LPCcDNA配列のシーケンス>
次に、 RACE法によりクローニングし配亨1]を決定したマウス LPCcDNAの配
列を示す。
マウス LPCcDNAをシーケンス時には、染色体 DNAをシーケンスした時と
同様に、必要に応じて 17 ~24mer のオリゴヌクレオチドを合成した。
91
マウス LPCcDNA配;7"1]とアミノ酸配列
] GCGGCGGCAGC AGCAGCAGCGACAGT AGC AACAGA GGCTGT GGG
45 TCTGCA GCT GTG TTC CCA GTCGACACT CAC TGC TCA CAG TGA AGG
90 TGA CAT CTCCCTCCA TTTTCA CAA GATGAG TGTGGT ATG GTTACC
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3
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180 ATG CCG AAA GGG AGG CAG AAA GTCCCA CACTTG GAT GCCCAC CTG
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示した。
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nには破線で示した。
化する際に切断される書1
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位は縦線で示した。
また、 LPCが成索L
以下にマウス LPCcDNAとヒ トLPCcDNAの犠基配列 を示す。
Iである 。 また、マウスおよびヒトで
上段がマウス LPC、下段がヒト LPC配ヂJ
保存されている配列は ilJで示した。一致しないお復基は、空白で示している 。
ギャップを怖入することにより、配列の alignment を最適化している 。 これ
末端の共通配亨1
1を見つけるために有効である。 3'non-coding領域の
は、特に 3'
l
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N
Aの安定性や他 の因子が結合するなど、イ可等かの役割をもっと
共通商己列は、m
考えられる 。
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1
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1
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C
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3
21
L
P
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o
d
i
n
g
領域だけで比較すると、 83%保存されている 。 アミノ酸レベノレでは、 90
弘保存
されていた。この数値は、ほぽヒトとマウスの磁の違いを反映した差と考えら
れる。
'
n
o
n
c
o
di
n
g領域を比較したところ、ヒト ・マウス聞のいくつかの領
また、 3
C
s
Iに受録されているデータを検索してと
域で高い相同性を示した。 しかし、 N
ころ、イ可等かの機能的を示唆するデータは得られなかった。
L
05
<マウス LPC
3
'
領域のシーケンス>
マウス LPC3'領域(エクソン 1 3~ J 7) のシーケンスは、エクソンとその近傍
領域のみ行った。 シーケンスにfFJ~、た D NA は、マウス LPC のエクソン 13 以降
をプロープとしてマウス染色体ライブラリーをスクリーニングして得たファー
ジ DNAおよひ令マウス染色体 DNAそのものである 。 これらの DNA を用いて、 P
C
I
l
によりイントロンを含む領域を嶋中高してシーケンスした。
3間)は、他のイントロン
ただし、イントロン 12 (エクソン 12とエクソン 1
と比べて大きく、 2回の 7 ウス染色体ライブラリーのスクリーニングにも関ら
ず、一部しかタロ}ニングするととができなかった。 また、エクソン 1
2 とエ
クソン 1
3の配列から作製したプライマーを用いて l
o
n
gr
a
n
g
e PCRを行っても
クリアなバンドを得ることはできなかった。 この結果は、ヒトのイントロン 1
2
とまったく同じであった。
1
0
6
4-3-4 エクソン・イントロン構造の解析
マクス LPC染色体構造の解析には、 2つの方法を用いた。
5
'
領域は、プラスミド八サブクローニングした DNAをシーケンスし、それを
既知のヒト LPC配列と比較することによりエクソン部分を決定した。 この時、
エクソン ・イン トロン境界領減で保存されている配列を篠認した。
3'
領域の構造を決定する前に 、マウス LPCcDNAがクローニングされ、全配
列が明らかになったため、 3
'
領域については、 PCR により必要な部分(エクソ
ン ・イントロンを含む領域)のみを増幅し、 DNAシーケンスを行った。
エクソン ・イントロンのコンセサス配列を以下に示す。
G
t
A
TJL自
工
島
l
図30 エクソン ・イントロンのコンセンサス配列
下線は、 100%保存されている配列を示す。
イン トロン構造をまとめる 。
以下に決定したマウス LPC染色体上のエクソン ・
表2
5
7
ウス L
PCのエクンン ・イントロン構造
E
x
o
n
2
3
4
5
6
7
8
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1
0
1
1
1
2
1
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4
1
5
1
6
1
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A
T
G
T
T
C
T
T
C
A
GG
T
C
T
G
T
G
C
C
A
GG
A
G
C
T
GT
G
G
A
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C
A
C
C
T
T
G
G
A
G
G
T
G
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C
A口G
A
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G
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G
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G
T
G
G
σ
r
G
A
G
T
C
G
G
G
A
1
'
A
G
G
A
A
T
G
G
C
G
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G
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G
C
C
C
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GG
G
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G
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'
I
G
A
G
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G
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A
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C
ND
A
G
G
G
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G
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C
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G
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G
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C
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C
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T
A
G
A
A
A ND
N
D
←
ヲ
8
0
0
8
5
0
2
0
0
3
0
0
N
D
表中の下線は、スプライシング領域に 1
0
0%保存されている配列を示す。
また、上記の表を模式的に表すと、以下の図のようになる。
S
t
r
l
l
c
t
u
r
eo
fmO
ls
巴L
PC
23456789
1
31
41
5
1
6 17
1
0
1
11
2
計
十
ι十-H
ト
ニ
叩時
ob
m
nc
ur
、
向
ウス LPC遺伝子のエクソン ・イントロン構造
m
7
凶加
図3
1
UM
CN
円U
・
・
一十十世 l
1
kb
マウス LPCは、平均して 2
0
0
b
pのエクソンと 1
.
5
k
b
pのイントロンを持って
2を除く) 。 ただし、 O
R
l
コが始るエクソン 3と ORFが終了
いる(イン トロン 1
する げ が他 に比べて大きく、これを除くと 、エクンンの平均の長さが 1
1
0
b
p
となる。ま た、エクソン、イン トロンを合わせた染色体上の LPC遺伝子の大き
8
k
b
pである 。
さは、約 2
A
l
t
e
r
na
t
i
v
es
p
l
i
c
i
ngが起こっているかどうかは明らかにならなかったが、別の
グ
ノ
レープによると 、より短い転写物があるとの報告もある 。
4-3-5 マウス cDNAのスク リーニング
lCRFには DNAライブラリーサービスがあり、必要なライブラ リーを提供し
PCcDNAクローンをスクリーニングするため、 ICRFの DNA
ている 。 マウス L
ライブラリーサ」ピス部より、マクス c
DNAクローンが固定されたスクリーン
グ用メンブレンフィノレターを提供してもらい、それをスクリーニングした。ス
クリーニングには、染色体 DNA をスクリーニングするときに用いたヒ卜 L
PC
のp
r
o領域を PCRにより増幅した DNAをプロープとして用いた。 スクリーン
k
b
p
グの結果、合計 4クローンが得られた。しかし、この 4クローンは、どれも l
と短く、予想されたマクス L
PCcDNA完全長 3
.
5
k
b
p と比べではるかに短かっ
た。 また、これら 4クロ ー ンを DNAシ}ケンスしたところ、
r
3・3
3 DNAシ
ーケンス」の結果で示されたマウス LPCcDNA配列とまったく同じ配列が見ら
れたが、同時にどのクローンにも明らかにイン トロンと思われる配列も見つか
った。 また、含まれて いたエクソン領域も極めてわずかな領域のみであり 、か
っ他 にマク ス cDNA ライブラリーが入手できなかったため、cDNA ライブラリ
ーの スクリーニングをあきらめた。同時に進めていた染色体 DNAのクローニ
PC遺伝子の配列の一部が明らかに
ングおよびシー ケンスの結果から、マウス L
情報を元にして、 RACE(
R
a
p
i
dampl
i
f
i
c
a
t
i
ol
1o
fcDNA
)
なって いたので、との配:71
e
n
d
s
) 法によるマウス LPCcDNAの単離を行うことにした。
以下に RACE法の概略を示す。
N
"
NAAAAA
ム
ロ
成
A
n
u
N
c
il-v
が )AmRNA
NNTTγ J
'
T
NNAAAAA
成
合
A
出
N
ι
υ
n
ll
よ曹'
mRNA/cDNA
NN
'
f
'
1
'
T
1
'
1
'
JNA^^^^
門マγ「
N
N
'
dscDNA
NNAAA^A
-
7
'
>
'
ブ'>ー付加
NNTT
'
I
'
T' 5お
よび3民ACE，
I
'
CR反応
5・
RACE
3・
RACE
NNAAAA_
NNTT
ャr
r
-
図32 5'
および 3'
RACE反応の概略
RACEr
:
去
は
、 c
DNAの一部がクローニングされた時に、後り 5
'あるいは 3
'領
'
領域を J
羽帽する場合、すで
域をクローニングするために使われる方法である。 5
にシーケンスされた配列を元に、 5
'
方向へ合成が進むようにプライマーを設計
する。また、鋳型となる cDNAには、従来オリゴ dCなど、が使われていたが、
反応ステップ数が多いうえに、付加される C の数をコントローノレすることが難
しかった。
ここでは、合成した c
DNA末端にアダプターを連結した。こ れにより、先に
合成した 5
'
方向へ合成が進むようにプライマーとアグプターに相補的なプライ
マートを使用して目的の遺伝子産物だけが RACE反応により噌幅された。
また、ここで行った RACE反応には、 2つの工夫を施 した。
1つめは、 cDNAを合成するためによ1
]いたオ リゴ dTプライマーの 3'
末端に、
N_
，
N (
N_
，
=G orA orC、N=G o
rA orC o
rT) を付加したことである。 これによ
り、必 ず mRNAのポリ A 鎖の十J-け械部分にプラ イマーが結合し、 cDNAが合
'
成されることが保証される 。 したがって、合成さ れた cDNAは、少なくとも 3
末端側に ￨
到してはまったく同じ配列を持っていることになる 。 このプライマー
を用いることにより、後の PCR 反応を行った時の起こる PCR 産物のサイズの
違いを長小限に抑えることができる 。
ポリ AmRNA
NNAAAAAAAAAAA
問
問T
1
'
1
'
1
'
1
'
N-I
N(
N-I
=
G orAo
rC N=GorAorCorす を含むプライマー
必ずポリ A鎖の付加 さ品た部分に結合する
ポリAmRNA
AAAAAAAAAAA
TT1'TT
AAAAAAAAAAA
TT
1
'
TT
AAAAAAAAAAA
TTTT
通常のオリ二おTプライマー
ポ'
)
A
鎖のどの部分に結合するかわからない
， ，
図33 N_N (
N_
=Go
rA o
rC、N=Go
rA o
rCo
rT) を
や
j
;
J
I
日したオーリゴ dTによ
る cDNAの合成
2 つめの 工夫は 、RTPCR、特に長い産物を得る H
寺に起こ りやすい非特異的な
PCR産物を厳小 限に抑 えるためにタ yチダウン PCR法を用い たことである 。
タッチダウン PCR法の特徴 は、次のようである 。まず、アダプターに相補的
1
1
1
なプライマーの Tm値より高い温度をアニーリングおよび伸長反応の温度に用
いる 。 この反応を数サイクノレ行うことで、目的の cDNAだけが蓄積する 。 その
首脳産物を得る
後、アニーリングおよび伸長反応の温度を下げて反応を行い、 L
のである 。 タ ッチダウン PCRを行うためには、目的の遺伝子に特異的なプライ
マー(ここでは MA5 と M A3
) の Tm1
庄
1 が高くなければならなし、。今回用いた
0
遺伝子特異的プライマー MA5と MA3の Tm値は、ともに 70C以上である 。
.
.
-
I
.
3k
b
p
A
P
I
Mo
u
s
eLPCc
DNA
-
.
.
恥1
A3
ー
MA5
A
P
I
2
.l
k
b
p
ー
TTTTT _
AMAA
吋A
3
3
I
MA5
2
完全長;
DNA
図34 RACE法とプライマー
図に示したように、すでに既知であった配列を元に MA5と M A3を合成した。
これらのプライマーとアダプター特異的なプライマー APl を用いて RACE反
RACEおよび 5'RACE
)。増幅産物を TA
c
l
o
n
i
n
g法によ
応を行った(下図の 3'
DNA
りプラスミドベクターにクローニング した後、 DNA シーケンスを行い、 c
の 5'
と3
'
末端に PCRプラ イマーを合成した (
MA52 と MA3-3)。 当初 、完全
'および 了末端から 30ヌクレオチドをプライマーと
長の cDNA を得るために 5
して用 いたが、非特異的なバンドが多く見られ目的の LPCcDNAが噌幅されな
'
{
J
t
J
I
のプラ イマー (
MA32) の Tm 値が低かったため 、アニーリング
かった。 3
温度を 上げられず、非特異的なバンドを消すことはできなかったと考えられる 。
1
1
2
そこで、完全長の c
DN
A を得ることをあきらめ、十分に高い Tm値を与える
'
末端に近い領域に新しいプラ
プライマーが設計できる領域のうち、もっとも 3
イマー (
M A3
3
) を設計することにした。
2 を用いることにより、下図のようにほぼ非
この新しいプライマーと MA5
F
u
l
l
leng
t
h)。このバンドは、 North
巴r
n
特異的なバンドを除去することができた (
ハイブリダイゼーションで得られたバンドよりも小さかったが、ポリ A 鎖およ
び 3
'末端から 200bpほどが含まれていないことから、目的のクローンであると
考えられた。
図3
5 RACE反応濯物
ここで得られた完全長の cDNAは
、 TAcl
o
n
i
n
gにより、プラスミドベクター
DNAシーケンス参照)。
にクローニングされた後、域基配列を決定した (
1
1
3
5考察
5-1 LPC遺伝子とその構造
LPC遺伝子は、ヒ卜では IIq23にマップされる。 この領域は、白血病細胞で
頻繁に転座が見られる領域である 。また、他の腫蕩においても転座が報告され
Iq23 の
ている 。 このことは、転座の「ホシトスポット」であるか、あるいは I
転座が腫蕩の形成に何等かの形で関与していることを示唆している。
ヒト LP
C 遺伝子とマウス LPC 遺伝子の染色体構造を解析した結果、エク ソ
ン ・イントロン構造はもとより、イントロンの長さまでほぼ閉じであること が
判明した(下図参照) 。
I
k
b
S
t
r
u
c
t
u
r
eofhumanLPC
1
1
2
3
4
5
6
7 89
ι十
I
t
t
:
コー
制i
-→
ー斗白
2 3 4 5 6 7 8 9
一十十-{] I
I
1
3 1
4 1516 1
7
101112
I III
101
1 1
2
1
3 1
4 1516 1
7
肘
十
ιH
I
二子
S
t
r
uct
u
r
eofmous
eLPC
I
Coding叫 glOn
日
Non.
c
凶川島
'
0
"
図3
6 マウスおよびヒト I
_
PC構造の比i
l
凌
しかし、他の s
l
Ib
t
i
l
is
i
n
l
i
kep
r
o
te
a
s
巴の中で既にエクソン ・イントロン構造が
6
4
決定されている f
l
l
r
i
n63や PC4
とはかなり精進が違うことが明らかになった。
f
u
r
i
nは、エクソン lが複数あると共に、プロモーターのも 2つあることが報告
lJ4
されているが、 LPCには、 a
l
t
e
r
na
t
i
ves
p
l
ici
o
g産物の存在や複数のプロモーター
の存在を示唆する証拠が見つかっていない。 また、 PC4 では、 p
r
e
p
r
o領域がエ
n
i
t
i
a
t
i
o
nc
odon
クソン lから 3までにまたがっているのに対して、 LPCでは ATGi
がエクソン 3に存在し、 p
r
e
p
r
o領域すべてがこのエクソン 3内に存在する 。他
のs
u
b
t
i
l
is
uト J
i
k
ep
r
ot
e
a
s
eとの比較は次節にて行う 。
以下に、これまでクローニングされた LPC遺伝子のアミノ鮫レベルの比較を
次のページに示す。 ただし 、
LPC:humanLPC
ル仏PC:mous
巴 LPC
RLPC:r
a
tLPC
XENOLPC:
Xenop
usLPC
である 。
u
b
t
i
l
is
i
nl
i
k
ep
r
ot
e
a
s
eの酵素活性中心であり、種
また、四角で囲んだ領域は、 s
を越えて保存されている領域である 。 Xeoopusは、ヒト ・7 ウス ・ラ y トの配
列とかなり異なる昔1分があるが 、活性中心部分は、縄めて保存されていること
u
b
t
ii
ls
i
nl
i
k
ep
r
o
l
ea
s
巴問でも 、緩め
がわかる 。後述するが、この領域は、 他の s
てよく保存されている 。
LPCのアミノ酸配列全体を比較すると、ヒトとマウス ・ラッ ト聞で約 8
8% 、
マウスとラッ ト問では 96%保存されているのに対して 、 ヒ トと Xe
nopus聞では
71
% 、マウス ・ラッ トと Xenopus間では 6
7%が保存されていた。 Xenopusおよ
びラットのエクソン ・イン トロン構造については報告がないので比 t険はできな
いが、マウスとヒトとの類似性が明らかになったため、ラット LPC遺伝子の構
造は類似 しているものと考えられる 。
115
60
L
P
C
.P
l
l
O MPKGRQKVPJ
lL
OAPLGLPTCLWLELAGL
ドL
L
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120
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e泣伝子ファミリーは、近年報告されるようになっ
S
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3、PC2、PC
4
， PACE4、P
C5/6、
た新しい遺伝子ファミリーである 。すでに、 PCl/
f
u
r
i
nの 6遺伝子が報告されており、 しPCは
、 7番目のメンバーである 。
他のメンバーと l次配列を比較すると、 LPCは他のメンバーをj
緩めて異なっ
ていることがわかる 。以下に各ドメインごとの相向性を示す。
Prepro
Middle C-terminal
C
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l
y
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c
LPC
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PC1/3
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PC2
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目
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図37 LPCと他のメンバーとの比較
もっとも保存されている c
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l
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l
y
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i
cd
o
m
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i
nでも、保存されているアミノ酸残基
が 50%に消j
たない。
yl
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g
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ct
r
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eで表すと、次のようになるべこの結果も、 LPC遺
分子進化を ph
伝子が他の s
u
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kep
r
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eとかなり異なっており、むしろ酵母の Ke
x
2遺
伝子に近いことがわかる 。 これは、 LPC 遺伝子が f
u
r
m の活性中心付近の保存
巴n
巴r
a
t
e
dPCR によっては、クローニングさ
されている嵐基配列を元にして d
e
g
れなかったことと一致している 。
MFURIN，
P町
FUAIN.
PRO
MPC
lPRO
向Pc4，PAO
DFU印 Nl
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司
MPC P
，
。
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PRO
PCl 3.
PRO
。
向
PC2.P
円PC2.
PAO
DFU問 N2
.
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MPC5P
。
問
MPC6.
P円O
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，
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APACE4，PRI
MLPCPAO
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LPC.
PRO
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eから、 LPCはかなり早い時期に他の s
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巴a
s
e
から分かれたと考えられる 。それは、真修生物の di
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s
i
t
yが大きくなった時期
と考えれれる。 また Xe
n
opu
sLPC遺伝子の染色体構造が明らかになれば、より
詳細な Phyl
og
en
e
t
i
cl
r
e
eが作成できると考えられる 。
次に、 subtilisin-likeproteaseファミリ一間で保存されている活性中心領
1を他のメンバーと比較した結果を示す。
域の配ヂ)
f
門
Jl227
凶
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A
A
A
APIAAGMIALMLQ
P
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図 1 subtilisin・
I
ikeproteaseの保存領j
成比較
122
図中の数字は、マウス LPC 配ダJ
I中のア ミノ鮫残基を示す。また、活性中心で
あるアミノ酸残基は四角で阻んだ。 この図から明らかなように、種を越えて活
性中心およびその近傍のアミノ酸配列が保存されていることがわかる 。 このこ
とは、これらの酵素の活性および基質が懐めて似ていることを示唆している 。
1
n vltro系の研究から、 furin と P^CE4の阿方が
H
J
Vの gp160タン パク質のプ
ロセッシングを行うことができることが報告されている 。 しかし、両者とも
gp160に対して、かなり低い酵素活性しか持たないことも報告されているへ こ
のことは、 [urin と P^CE1、および少なくとももう一つ別の subtilisin-like
protease が gp160 タンパク質を切断できること示唆している 。すなわち、 l
n
vitro系では基質が重なりあうことを示している。
他の subtilisin-like protease の基質の検紫もなされているが、 1n v1tro
系では基質が重なりあうため、現在 nal.
1
ve な基質を同定することは困難であ
る。
Sublilisin-like proteaseが切断する配列は、
IHK
/
R
R
、R
X
X
R
、あるい
/
K
Rである 。
はR
これまでに報告された基質は、以下通りである 。
表 26 su
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isi
n
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ikeproteaseと基質
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ただし、 subLilisin-jlkeproLease聞で基質特異性は交差するため、lIIVgp160
をプロセッシングする酵素として、 furin 以外にも PACE4、そして LPC が候補
となっている へ
gpl
60 のプロセ ッシングを阻害することにより、I-lI
V に感染した T 細胞の増
殖を阻害できることが知られており、 subtilisin-jike protease の基質特異性
の研究進展が期待されている 。
LPC 遺伝子産物は、アミノ酸の 1次配列の比較と解析から、 furln と同傑な
立体構造をとることが予想されている。 これは、 furin 同様に 6 アミノ酸残基
を認識している可能性を示唆するものである 。現在、 LPC 遺伝子産物の基質特
1i
.
cati
0
1
1
)。
異性に関しては、次の表に示したことが知られている (personalcommUI
表2
7 Furinと LPCによる基質の切断
E
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G
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K
R
+
(
ー
GHI~SKG
上記の表から、 しPC遺伝子産物は、切断書1位(示したアミノ酸配列の C末端)
，
2
，
4番目のアミノ酸菌UI
J
を認識していることがわかる。
から数えて、 1
1
24
5-3 LPCと転座の関連
緒言で述べたように、ヒ トLPC遺伝子は白血病細胞において頻繁に転座が観
察される lJq23領域にマップされる 。 また、non-Hodgkin's リンパ滋和I
J
I
包におい
てまれに見られる l
(
1
1
;
1
4
)転腹部位からクローニングされたため、転[![および
リンパ腫との関連が示唆されているヘ
LPC遺伝子が関与したリンパ脆の例は、今回の例以外に 2例のみ知られてい
' nonc
od
i
n
g領域に b
r
e
a
k
p
o
i
n
tが見
るだけであるが、どちらも、 LPC遺伝子の 3
つかっている 。 これは 、この領域の転座がある種のリンパ腫の発症にとって何
等かの役筈J
Iをになっていることを示唆する 。
白血病細胞で見られる転座と違って、融合タンパク質が発現することはない
ため、融合によってどのような変化がもたらされるかは不明である 。 しかし、
μ エンハンサーが LPC遺伝子近傍に存在
転座によって，イムノグロプリンの E
するようになることから、 LPC遺伝子の過剰発現が関与していることが与えら
れる(下図) 。
1
2
5
LPCa
n
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「..LPC
寸
AAA
卜一一一一→
AAA
AAA
AAA
-一一一一→~
AAA
AAA
AAA
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あるいは、 LPC遺伝子の 3'n
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n
c
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d
i
og領域 (
mRNA内)が欠失することによ
umo
v
e
rが短くなることも考えられる 。
り
、 LPCm則可A の安定性が変化し t
LPC と同じファミリーに属する PCl
/3と疾病に関する報告によると、 P
Cl遺
伝子の変異によって、肥満が引き起こされることが示唆されている。発症のメ
カニズムは、以下のように考えられている 。POMCは
、 PCl
/
3および PC2によ
ってプロセッシングされ、 m
e
l
a
n
o
c
o
r
ti
nが作られる。 これが、 m巴l
a
n
o
c
oni
n のリ
セプターである MC4-Rを産生している細胞へと作用する 。 しかし、 PCl/
3に変
異がおこることにより、 mel
a
nocor
t
in が産生されず、正常な刺激が届かず肥満
になると考えられる(下図参照) 。 このことは、 MC4-Rをノックアウトしたマ
ウスが肥満になることと一致 している 。
1
26
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yandPCs
/ノ
POMC
ノ内
…、
一
人
削工
、-
Me
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PCl/3，PC2
/
O
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図 40 PC1
I
3と肥満
5-4 今後の研究
しPC遺伝子産物がリンパ腫の発症に関与している可能性を調べるために、現
在
、 L
PC遺伝子を CD2遺伝子のプロモーター下に結合したプラスミドを用い
てトランスジェニックマウスを作製している 。 このベクターを用いることによ
I
胞で L
PC遺伝子過剰発現を誘導することができる 。また、 LPC遺
り、リンパ創J
伝子の機能を研究するために、 knockout マウスを作成している 。 knockout マウ
スを作製することにより、 mRN
A の安定住E
の影響を間接的に解析できると共に 、
LPCの発達との関連が調べられるものと思われる 。
6~射辞
この研究を行うにあたりご指導いただいた BryanD
.YoungI
導上に感訪れ、たし
ます。また、ヒ トLPC遺伝子の解析にあたり、 J
o
a
n
n
eMeerabux博士および Na
t
h
a
l
i
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巴博士に大変ご協力いただきました。
L
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さらに 、研 究 を 進 め る に あ た っ て ご 助 言 い ただいた英国 I
m
p
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lCance
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lOncologyの皆機に感謝 します。
R
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7参考文献
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