本文は - 化学と生物

【解説】
乳酸発酵と D-アミノ酸生産
牟田口祐太 *1，大森勇門 *2，大島敏久 *2
近 年， 多 く の 生 物 細 胞 に さ ま ざ ま な D- ア ミ ノ 酸 が 遊 離 や 結
合 状 態 で 存 在 し， L- ア ミ ノ 酸 と は 異 な る 生 理 機 能 を 持 つ こ と
が わ か っ て き て い る． 加 え て， 多 く の 食 品 素 材 に も D- ア ミ
ノ酸が見出されており，その食品機能の解明と食品産業への
応 用 展 開 が 注 目 さ れ て い る． 本 稿 で は 食 品 中 D- ア ミ ノ 酸 の
分 析 方 法， 代 表 的 発 酵 食 品 で あ る 食 酢 中 の D- ア ミ ノ 酸 分 析
のタンパク質構成アミノ酸のうち，不斉炭素を分子内に
もたない Gly 以外はすべて L 体および D 体の鏡像異性体
をもち，Glu と同様に L-アミノ酸と D-アミノ酸は異なる
味を呈することが以前から知られている．たとえば D-ア
ラニン（D-Ala），D-フェニルアラニン（D-Phe）
，D-セリ
に よ っ て 明 ら か と な っ た 乳 酸 菌 の D- ア ミ ノ 酸 生 産 へ の 関 与，
ン（D-Ser），D-トリプトファン（D-Trp）
，D-ロイシン（D-
お よ び 乳 酸 菌 か ら 見 出 さ れ た D- ア ミ ノ 酸 代 謝 関 連 酵 素 の 酵
Leu）
，D-バリン（D-Val）などは，それらの L 型アミノ酸
素学的特徴について紹介する．
とは異なり，かなり強い甘味性をもち，D-Ala は砂糖の
3 倍，D-Phe は 5 倍，D-Trp は 35 倍甘く，カニや甘エビの
はじめに
食品に関係するアミノ酸と言えば，昆布の旨味成分で
甘さは D-Ala に由来するという報告もある (3, 4)．しかし，
タンパク質を構成するアミノ酸は L 型のアミノ酸のみで
あること，また，たとえ D-アミノ酸が存在したとして
あり化学調味料として広く利用されているグルタミン酸
も，L-アミノ酸と分別定量することが困難であったこと
（Glu, モノナトリウム塩）が一番に挙げられる．この
から，食品に関するアミノ酸研究は長年 L-アミノ酸を対
Glu には鏡像異性体（光学異性体とも言う）である L-Glu
象に行われ，D-アミノ酸はほとんど注目されてこなかっ
と D-Glu が 存 在 す る が， 旨 味 を も つ の は L-Glu で あ り，
た．このことから，栄養学，食品学などにおける基礎お
D-Glu にはほぼ呈味性がない（表 1）
．Glu を含む 20 種類
よび応用研究には膨大な成果の蓄積がある L-アミノ酸と
は対照的に，D-アミノ酸に関する研究は極めて少なく，
Lactic Fermentation and D-Amino Acid Production
Yuta MUTAGUCHI, Taketo OHMORI, Toshihisa OHSHIMA,
*1 秋田県立大学生物資源科学部応用生物科学科，*2 大阪工業大学
工学部生命工学科
18
食品や食材の呈味性，保存性，香気性などに対する D-ア
ミノ酸の役割は最近までほとんど不明であった．しか
し，近年の分析技術の進歩により，試料中の微量な D-ア
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015
表 1 ■ L-アミノ酸と D-アミノ酸の味の違い
アミノ酸
Ala
Val
Leu
Ile
Ser
Thr
Cys
Met
Phe
Trp
Tyr
Pro
Gln
Asn
Glu・Na
Asp・Na
Lys・HCl
Arg・HCl
His
L 型の味
1
甘味
苦味 or 無味
苦味
苦味
微甘
微甘（後味悪い）
苦味 or 甘味
苦味
微苦
苦味
微苦 or 無味
弱甘
弱旨味
苦味 or 無味
旨味
微苦
弱甘→苦味
微苦（後味良し）
苦味
ル）と比較して，かなり高濃度の L-アミノ酸（数百 μM
D 型の味
強甘
強甘
強甘
甘味
強甘
弱甘
甘味 or 苦味 or 酸味
甘味
甘味
強甘
甘味
微苦
甘味
弱甘
微甘 or 無味
無味
弱甘
弱甘
甘味
甘味を呈するアミノ酸をグレー色で示す．
文献 1, 2 より改変．
から mM レベル）やアミノ酸以外のさまざまな夾雑成
分が存在する．食品や食材中の D-アミノ酸の機能や動態
を解明するためには，まず高濃度存在する L-アミノ酸と
種々の D-アミノ酸を分離し，正確に定量分析することが
必要である．現在 D, L-アミノ酸の分離分析には高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）法，ガスクロマトグラ
フィー質量分析（GC-MS）法，キャピラリー電気泳動
（CEP）法，酵素法が主に利用されている．ここでは，
食品などに含まれる D-アミノ酸の分析に好都合な HPLC
法について以下に概説する．
現在，HPLC を用いた D-アミノ酸の分析には原理が異
なる 2 つの分析法が主に利用されている．一つは，試料
に蛍光誘導体化剤 -フタルアルデヒド（OPA）とキラ
ル誘導体化剤 -アシル-L-システインを加えて D および Lアミノ酸をジアステレオマー蛍光誘導化し，これを
ODS カラムによる逆相クロマトグラフィーで分離定量
する方法である (7, 8)．われわれは本法を UPLC（超高速
液体クロマトグラフィー）に応用し，分析対象となる D-
ミノ酸を L-アミノ酸と分離して分析することが容易と
アミノ酸の種類に応じて， -アシル-L-システインとして
なったことから，多くの生物細胞や食品素材にさまざま
-アセチル-L-システイン（NAC）と -ブチルオキシカ
な D-アミノ酸が遊離や結合状態で存在することが次第に
ルボニル-L-システイン（NBC）を使い分けることで，
明らかとなり，またそれらの生理機能が注目されてい
食品試料中の 16 種類の D-アミノ酸を μM レベルで定量し
る (5, 6)．私たちは D-アミノ酸の栄養素としての機能（第
ている（図 1）
．ただし，D, L-プロリンはこの方法では蛍
一次機能）に加えて，呈味性，保存性，香気性などの機
光誘導化されないため，分析はできない．加えて，D, L-
能（第二次機能）や健康維持・改善，老化防止などの機
リジンおよび D, L-システインは D 型と L 型の分離条件を
能（第三次機能）を向上した新規食品の開発・実用化へ
設定することが困難である．また，実際に食品中の D-ア
の展開を図ることを主な目的として，食品における D-ア
ミノ酸を分析する際には，食品中にアミノ酸以外に蛍光
ミノ酸の研究を行っている．そして，この目的を達成す
誘導体化される物質（第一級アミノ基をもつ物質）が存
るために，さまざまな発酵食品（飲料を含む）と発酵微
在し，溶出時間が標準の D-アミノ酸のそれに類似する偽
生物，発酵食品の素材となる穀類，野菜，果実などにお
ピークを生じることもある．そこで，われわれは市販の
ける D-アミノ酸含量と動態の解析，食品における機能の
ブタ腎臓由来の低基質特異性の D-アミノ酸酸化酵素を試
解析，D-アミノ酸の生合成や分解代謝系の解析，それら
料に加え，基質となる D-アミノ酸のピークを消失させる
に関与する酵素の生化学的機能解析と遺伝子レベルでの
ことにより偽ピークと区別している．
制御機構の解析などに取り組んでいる．その研究過程
もう一方の分析法は，浜瀬らの開発した 2 次元 HPLC
で，乳酸菌が発酵食品中の D-アミノ酸生産に大きく関
法である (9)．この方法ではまず，NBD-F（4-fluoro-7-ni-
わっていることを見いだしており，乳酸菌が関与する食
tro-2,1,3-benzoxadiazole）によって蛍光誘導体化したア
品において D-アミノ酸が新規機能をもちうるのかについ
ミノ酸を一次元目の ODS カラムを用いた逆相クロマト
て注目している．本稿では発酵食品と乳酸菌に関連する
グラフィーにて，D 型と L 型で区別せずに種類のみで分
D-アミノ酸についての最近の研究の進展について紹介す
離し，その溶出を検出器でモニターして各アミノ酸を含
る．
む画分を分取する．続いて，二次元目のキラルカラムを
用いた逆相クロマトグラフィーにて，一次元目に分離さ
D-アミノ酸の微量分析法
食品中には，一般に分析対象の D-アミノ酸（μM レベ
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015
れた特定の NBD-D, L-アミノ酸を分離定量する．また，
NBD 以外にも類似の誘導体試薬を用いる二次元分析法
がほかにも報告されている．この方法は自動化され，食
19
図 1 ■ D, L-アミノ酸のジアステレオマー蛍光誘導体化と UPLC による一斉分析
-フタルアルデヒド（OPA）と（A） -アセチル-L-Cys（NAC），または（B） -ブチルオキシカルボニル-L-Cys（NBC）を利用して D, L-アミ
ノ酸を誘導体化する．（C）OPA-NAC 誘導体化アミノ酸と（D）OPA-NBC 誘導体化アミノ酸を UPLC によって分離した際のクロマトグラ
ム．OPA-NAC を用いて分離した D および L-アミノ酸（緑枠内）と，OPA-NBC を用いて分離した D および L-アミノ酸（黒枠内）の分析結果
を照合し，合計 32 種類の D および L-アミノ酸の分析を行った．
品や生体試料中の 19 種類の D, L-アミノ酸を一度に高精
ともに反応をさせ，340 nm での吸光度の減少から測定
度に分析可能な点で優れている．しかし，OPA と -ア
する方法や (10)，われわれが開発したアスパラギン酸ラ
シル-L-システインを用いた方法と比べ，分析にかなり長
セマーゼとアスパラギン酸脱水素酵素の共役反応を利用
時間を要し，二台の HPLC の制御に複雑なコンピュータ
する分光学的分析法 (11) などが挙げられる．酵素法は特
制御を行う必要がある．2 つの HPLC による D-アミノ酸
定の D-アミノ酸であれば簡便，安価に分析できる点で優
分析法のどちらを用いるかは，分析に求められる精度や
れているが，複数の D-アミノ酸の一斉分析には適さない．
感度，時間，分析対象の試料中の D-アミノ酸の種類など
以上のような分析法を駆使し，前述したとおり，われ
を考慮する必要がある．
われは食品，特に微生物が関与するさまざまな発酵食品
また，HPLC や UPLC による分析は，食品中の多くの
中の D-アミノ酸の存在，発酵工程における生産性変化
D-アミノ酸を L-アミノ酸とともに一斉分析するには適し
（動態）や酵素レベルでの生産機構と調節機構などを解
ているが，装置が高価であり，測定も容易ではない．そ
析し，D-アミノ酸の食品における新規機能を明らかにす
こで D-アミノ酸を基質とする酵素反応を利用し，分光学
る取り組みを数年前より開始した．またその成果を基
的に測定可能な生成物に変換することで簡便に定量を行
に，D-アミノ酸による呈味，保存，保健などの食品機能
う酵素法が開発されている．たとえば D-Ser 特異的に作
の改善への応用展開を目指している．そのために，さま
用する D-セリンデヒドラターゼにより，D-Ser をピルビ
ざまな発酵食品を対象に D-アミノ酸の分析を進めてきた
ン酸に変換後，それを乳酸脱水素酵素により NADH と
が，次項では食酢の D-アミノ酸についての解析結果を紹
20
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図 2 ■ 10 種類の食酢中 D-アミノ酸の分析
結果
図 3 ■ 乳酸発酵純トマト酢の製造過程 5 段
階における試料中の D-アミノ酸分析
かった．特に乳酸発酵純トマト酢は純トマト酢よりも D-
介する．
アミノ酸濃度が顕著に高いことから，乳酸発酵が D-アミ
ノ酸の生産に関与することが示唆された．そこで，乳酸
食酢における D-アミノ酸の分析
発酵純トマト酢の生産段階のうち，どの工程において，
醸造酢は，米，麦，コーンなどの穀類，果実，野菜な
D-アミノ酸が生産されるかを分析した（図 3）
．その結
どを原料として酢酸発酵によって製造される．たとえば
果，酵母が関与する酒精発酵と酢酸菌が関与する酢酸発
米酢は，米を材料にまず麹菌によってデンプンを糖化し
酵の工程では，D-アミノ酸の濃度は低いままであった
た後，アルコール発酵（酒精発酵）が行われ，最後に酢
が，乳酸菌が関与する乳酸発酵工程の後に D-アミノ酸濃
酸発酵によりエタノールが酢酸に変換され製造される．
度が顕著に増加し，またその種類も増えることがわかっ
われわれは，原料や製造法の異なる 10 種類の食酢中の
た．これにより，D-アミノ酸の生産に乳酸菌が大きく関
16 種類の D および L-アミノ酸（合計 32 種）の分析を行っ
わることが明確になった (12)．そこで，発酵食品などか
た（図 2）．その結果，甘熟玄米黒酢
ら分離された代表的な乳酸菌 11 種類における細胞内外
熟成品と乳酸発
酵純トマト酢に，D-アミノ酸が高濃度含まれることがわ
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の D-アミノ酸濃度の分析を行った．その結果，
21
などの乳酸
における D-アミノ酸代謝関連酵素を検索した．その結
菌が，D-Ala, D-Asp, D-Glu といった D-アミノ酸を細胞内
果，アラニンラセマーゼ（AlaR），プロリンラセマーゼ
外に高濃度生産することがわかった．特に，分析したほ
（ProR），グルタミン酸ラセマーゼ（GluR）
，D-アミノ酸
とんどすべての乳酸菌が D-Ala を高濃度生産した．ま
アミノ基転移酵素（D-AAT）に相同性がある遺伝子を
た，菌体内の D-Ala の割合｛100×D-Ala 濃度／
（D-Ala 濃
乳酸菌ゲノムに見いだした．そのうち，AlaR と ProR の
度＋L-Ala 濃度）｝を見ると，
で 92.3％,
遺伝子を常法に従い大腸菌で発現させ，発現酵素タンパ
で 89.6％と非常に高値であり，L-Ala よりも
ク質をニッケルアフィニティクロマトグラフィーで高度
はるかに高濃度の D-Ala が生産されていることが明らか
に精製することに成功し，それらの触媒活性などの酵素
になった．さらに，生産される D-アミノ酸の種類や割合
化学的特徴を解析した．その結果，前者は D-Ala あるい
は乳酸菌ごとにかなり異なることが判明した．いずれに
は L-Ala のラセミ化を，後者は D-Pro あるいは L-Pro のラ
せよ，種類の異なる食酢のアミノ酸分析により，乳酸菌
セミ化をそれぞれ触媒する特異的な AlaR および ProR
が D-アミノ酸の生産に大きく関わるという重要な知見が
であることが明らかになった．次にそれぞれの酵素の特
得られた．乳酸菌は漬物，ヨーグルト，日本酒，熟れず
徴の詳細を示す．
しなど多くの発酵食品の製造や，ヒトの常在細菌として
ま ず， 乳 酸 菌
や
の ProR は 分 子 質 量
健康にも深く関わっている．それゆえに，乳酸菌が生産
150 kDa でホモ四量体構造をとり，これまで唯一構造が
する D-アミノ酸が発酵食品特有の呈味性や保存性，ヒト
知られている原生生物
の健康維持などに関与している可能性が考えられ，種々
と る 二 量 体 構 造（分 子 質 量 80 kDa） と は 異 な っ て い
の食品機能と D-アミノ酸の関係に興味がもたれる．そこ
た (13)．また，L-および D-プロリンと L-および D-ヒドロキ
で，われわれは乳酸発酵食品中の D-アミノ酸の動態や食
シプロリンを基質とし，ほかのアミノ酸には全く活性を
品機能との関連を解明するために，乳酸菌の D-アミノ酸
示さず，高い基質特異性を示した．本酵素は 45 C, pH
代謝関連酵素の研究を進めた．
6.0 で最大活性を示し，55 C で 30 分間の加熱処理後も失
由来 ProR が
活しないことから，高い安定性を有している．そして，
乳酸菌における D-アミノ酸代謝関連酵素の機能解析
乳酸菌が D-Ala, D-Asp, D-Glu といった特異的な D-アミ
ノ酸を高生産することが，どのような生理的意義をもっ
由来 ProR と同様に，本酵素も PLP 酵素の特異
的阻害剤であるヒドロキシルアミンで阻害されないこと
から，PLP 非依存性であることが予想された．
次に乳酸菌
および
ているかを知るために，われわれは D-アミノ酸の合成や
由来 AlaR の諸性質について述べる．両酵素の遺伝子の
分解に関与する D-アミノ酸代謝関連酵素の検索と機能解
塩基配列から予想されるアミノ酸配列を比較したとこ
析を進めた．これらの結果から，D-アミノ酸の生理的機
ろ，
能の解明だけでなく，D-アミノ酸の生産調節による食品
由来 AlaR のそれと 33％の低い相同性しか示さなかっ
の機能改善への応用展開が期待できる．
た．両 AlaR 遺伝子を大腸菌で発現後，精製した酵素を
乳酸菌の D-アミノ酸代謝関連酵素として，ラセマー
由来 AlaR のアミノ酸配列は
用いて基質特異性を調べた結果，
,
ゼ，アミノ基転移酵素，脱水素酵素，酸化酵素，脱水酵
由来の両酵素は Ala 以外にも Ser に対して低いラセマー
素などが予想された．そこで，①乳酸菌のゲノム情報
ゼ活性を示した．
（データベースから）と②乳酸菌の菌体抽出液中の酵素
由来 AlaR は活性の至適 pH
が 6.5, 至適温度が 30 C であり，40 C で 30 分間処理した
活性情報（活性の検出）から D-アミノ酸代謝関連酵素の
場合の残存活性は 50％であった．一方，
検索を行った．前者の場合では，推定遺伝子の大腸菌で
来 AlaR は活性の至適 pH が 8.0, 至適温度は 30 C であり，
のクローニングと発現産物の酵素化学的特徴や調節機能
50 C で 30 分間処理した場合でも約 70％の高い残存活性
の解析，後者では検出された酵素活性を指標に，培養細
を保持していたことから，
胞の抽出液から目的酵素の精製を行って機能解明を進め
熱 安 定 性 を 有 す る こ と が 示 さ れ た．
るストラテジーを取った．
AlaR の分子質量は 79.7 kDa,
由
のものよりも高い
由来
由来 AlaR の
それは 72.1 kDa であり，両酵素ともにホモ二量体構造
1. ゲノム情報から見いだした D-アミノ酸代謝関連酵素
の機能解析
既知のゲノム情報を基にデータベースを用いて乳酸菌
22
をとる．反応速度論的解析から，
および
由来 AlaR
由 来 AlaR の L-Ala に 対 す る
は，それぞれ 25.2 mM と 5.33 mM であり，
cat/
m値
m 値は
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それぞれ 8.39×103 M−1・s−1 および 6.50×104 M−1・s−1
α-ケトグルタル酸をアミノ基受容体としたときの D-Ala
と算出された．
由来
のアミノ基供与体としての相対活性を 100％とすると，
由来
D-アロイソロイシン（D-
の
m 値は既知の
AlaR（0.97 mM） や
(14, 15)
AlaR（5.01 mM）
の
m 値を含めて考えても，相対
-Ile）を供与体としたときの
活性は 104％であり，D-Ala よりも高い活性を示した．
的に大きい値と言える．両酵素活性はヒドロキシルアミ
そのほかにも，D-α-アミノ酪酸，D-Met, D-Leu, D-Val を
ンにより顕著な阻害を受けることから，PLP を補酵素と
アミノ基供与体とすることから，本酵素が特徴的なアミ
すると予想できる．さらに，両酵素とも種々の二価金属
ノ基供与体の特異性を示すことが明らかとなった．一
イオン（10 mM）添加によって阻害を受けたが，その
方，アミノ基受容体の特異性では，α-ケトグルタル酸に
阻害効果は
由 来 AlaR に お い て 特 に 顕 著 で
対する相対活性を 100％とすると，α-ケト酪酸に対して
あった．これらの乳酸菌の菌体内の D-Ala の割合｛100×
401％，グリオキシル酸に対して 222％，インドール 3-ピ
D-Ala 濃 度／
（D-Ala 濃 度＋L-Ala 濃 度）
｝ は，
ルビン酸に対して 203％の相対活性を示し，α-ケトグル
が 21.3％であるのに対して，
では 89.6％で
タル酸よりも 2∼4 倍高い活性を示した．そのほかにも
あることがわかっており，この D-Ala 生産量の違いと，
α-ケト吉草酸が 103％, 3-メチル-2-ケト酪酸が 102％, 4-ヒ
上に記載した酵素化学的特徴の違いには，どのような関
ドロキシフェニルピルビン酸が 101％の相対活性を示
連があるのかに関しては今のところ全く不明である．
し，既知の酵素と比較して，アミノ基受容体の特異性が
次に乳酸菌のゲノム情報から第 3 の D-アミノ酸代謝酵
素として，既知の
sp. 由来 D-AAT とアミノ酸配
列レベルで 35％の相同性を示す遺伝子を乳酸菌
低いことがわかった．すなわち，乳酸菌由来の本酵素の
属菌由来 D-AAT(17) とかな
基質特異性は既知の
り異なることから，新しい D-ATT であると言える．
に見いだし，この遺伝子産物の機能解析を行っ
た (16). D-AATと推定される遺伝子（UniPlotID: Q1WRM6）
このほかに，老川や吉村の 2 つの研究グループでも，
日本酒発酵の発酵工程から分離された乳酸菌（
(18)
など）
やワインの製造工程から単離された
を常法に従い大腸菌にて発現させ，ニッケルアフィニ
(19)
ティクロマトグラフィーの分離操作のみにより均一に精
乳酸菌
製した後，この精製酵素が高い D-AAT 活性をもつこと
ノ酸ラセマーゼホモログが多数同定され，上記と同様に
を確認した．本酵素の分子質量はゲルろ過クロマトグラ
大腸菌で発現させたタンパク質の機能解析から，AlaR
フィー法で約 56.5 kDa と算出され，サブユニットのそ
や GluR, アスパラギン酸ラセマーゼ，リジンラセマー
れは SDS-PAGE 法で約 31.5 kDa と算出されたことから，
ゼ，ヒスチジンラセマーゼ（HisR）が見いだされてい
この D-AAT は既知の
る．その中で，HisR はゲノム情報におけるアミノ酸配
由来 D-AAT と
などのゲノム情報を基にアミ
同様にホモ二量体構造をとることがわかった．また，
列の相同性からは AlaR と推定された遺伝子であった
PLP 酵素特異的阻害剤のヒドロキシルアミン（70 μM）
が，大腸菌での発現産物の機能解析から，実は AlaR で
やペンシラミン（100 μM）の添加によって酵素活性は
はなく，PLP を補酵素とする新規アミノ酸ラセマーゼ，
完全に失われたこと，スペクトル分析において 420 nm
HisR であることが明らかになった．
付近に現れる PLP 酵素特有のピークが水素化ホウ素ナ
トリウムを用いた還元処理によって消滅したことから，
本酵素も既知の D-AAT と同様に PLP 依存性酵素である
ことがわかった．さらに，定量解析の結果から補酵素
2. 酵素活性を指標とした D-アミノ酸代謝関連酵素の
探索と機能解析
乳酸菌
の細胞内外の D-アミノ
PLP はサブユニット 1 mol 当たりに 0.91 mol 含まれてい
酸分析を行ったところ，この菌が D-Ala, D-Asp, D-Glu に
た．
加え，他の乳酸菌とは異なり D-Leu, D-Val, D-
由来 D-AATは 60 Cで最大活性を示し，
-Ile と
40 C で 30 分間のインキュベートでは失活しないが，45 C
いった D-分岐鎖アミノ酸を顕著に生産することを見いだ
以上の高温では失活が認められた．この D-AAT 反応の
した（図 4A）．このような D-分岐鎖アミノ酸の生産とそ
至適 pH は 6.0 で，pH 5.5∼10.0 の広い pH 領域で 80％以
れに関与する酵素についてはこれまで全く知見がなかっ
上 の 残 存 活 性 を 示した． また，反応速度論的 解 析 か
たので，その解明を進めた．まず
ら，
て得た菌体を破砕し，調製した粗抽出液より分岐鎖アミ
D-AAT の 反 応 は 典 型 的 な Ping-Pong
機構で進行することを確認し，D-Ala に対する
1.05 mM, α-ケ ト グ ル タ ル 酸 に 対 す る
m 値は
m は 3.78
mM,
−1
−1
であると算出された．
max は 24.7 units・mg ・min
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015
を培養し
ノ酸ラセマーゼ（BCAA-R）活性を指標として，硫酸ア
ンモニウム分画，疎水性やイオン交換などの 4 種のカラ
ムクロマトグラフィー，調製用電気泳動を用いた段階的
23
図 4 ■（A）
JCM 15040 お
よび（B）
JCM 1115 の培養
液中 D-分岐鎖アミノ酸濃度の経時変化 (20)
な分離操作により酵素を高度に精製した．組換え体から
をとることが判明した．多くのアミノ酸ラセマーゼが一
の精製ではなかったので，酵素の精製は容易ではなかっ
量体またはホモ二量体構造をとることから，本酵素はラ
たが（精製倍率：4270 倍，収率：1.27％）
，SDS 電気泳
セミ化反応を触媒する酵素としては珍しいサブユニット
動法で確認されるタンパク質バンドが主な 2 本（分子質
構造をとることがわかった．また，PLP 酵素の特異的阻
量 90 kDa および 50 kDa 相当）になるまで精製を行っ
害剤であるヒドロキシルアミン，フェニルヒドラジン，
た．これらの 2 種類のタンパク質バンドを電気泳動後の
アミノオキシ酢酸によって著しく反応が阻害されたこと
ゲルから切り出し，N 末端アミノ酸配列をそれぞれ決定
から，本酵素が PLP を補酵素とすることを確認した．
し た 後，Protein‒Protein-BLAST を 用 い て GeneBank
本酵素は Ile, Leu, Val に加え，2-アミノ酪酸，ノルバリ
データベースから相同性の高いタンパク質を検索した．
ン，ノルロイシンなどの非極性アミノ酸に対して幅広く
その結果，90 kDa タンパク質の N 末端アミノ酸配列は，
ラセマーゼ活性を示すのに対して，Glu などの極性アミ
をはじめとする 2 つの菌株がもつ
ノ酸にはほとんど活性を示さないことから，報告例のな
X-prolyl-dipeptidylaminopeptidase と推定されるタンパ
い新規アミノ酸ラセマーゼであることが推測できた（表
ク 質 の 配 列 と 同 一 で あ る こ と が わ か っ た． 一 方，50
2）．特に本酵素反応では，L-Ile と D-
kDa タンパク質の N 末端アミノ酸配列と高い相同性を示
応に対する活性が最も高く，この点から本酵素はイソロ
す も の と し て，
イシン 2-エピメラーゼであると言える．至適 pH は L-Ile
の γ-aminobutyrate amino-
-Ile 間の異性化反
transferase（γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ，
から D-
GABA-AT）と推定されるタンパク質を見いだした．
に認められ，Pro ラセマーゼを例外とした多くのアミノ
-Ile への反応でpH 5.0, 逆反応でpH 6.0と酸性側
の精製された BCAA-R の活性は PLP 依存性を
酸ラセマーゼの最適 pH がアルカリ性側の pH 8.0 付近に
示すので，BCAA-R をコードする遺伝子は，一次構造
認められることを考えると，特徴的であると言える．本
において特徴的な PLP 結合サイトを有する推定 GABA-
酵 素 の L-Ileおよび D-
AT 遺伝子と予想し，PLP 結合サイトを有しない 90 kDa
5.00 mM と 13.2 mM で あ り，
−1
−1
-Ile に 対 す る
−1
cat/
m値はそれぞれ
m 値 は そ れ ぞ れ101
−1
タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 は 除 外 し た． ま た，
s ・mM および 71.4 s ・mM と算出された．一方，
JCM 1115 の増殖に伴う培養液中 D-分岐鎖アミノ酸の経
一般的なラセマーゼ反応の平衡定数（
時的濃度分析を行ったところ，
の式（
の場合と同
cat/
eq）は Holdane
m 値の比）では 1 となり，平衡状態では光
様に，生育とともに D-分岐鎖アミノ酸濃度の顕著な増大
学異性体が同量のラセミ体になるのに対し，イソロイシ
が認められた（図 4B）
．そこで
JCM 1115 の
ン 2-エピメラーゼのそれは
GABA-AT 推 定 遺 伝 子 を 常 法 に 従 っ て 大 腸 菌 BL21
かなり大きく，L-Ile から D-
eq＝101/71.4＝1.41 と 1 より
-Ile への反応に偏ってい
（DE3）で発現させ，その細胞抽出液から，タグ領域の
る．これらの酵素化学的解析から，本酵素は α-アミノ酸
切断を含む 2 段階のニッケルアフィニティクロマトグラ
の α-炭素における光学異性の相互置換を触媒する異性化
フィーによって均一な精製標品を得た．この酵素の分子
酵素として，多くの特徴的な性質をもつ新規酵素である
質量はゲルろ過クロマトグラフィー法で 200 kDa と算出
ことが判明した (20)．改めて，ここで見いだした新規イ
され，サブユニットの分子質量はアミノ酸配列から
ソロイシン 2-エピメラーゼのアミノ酸配列を基にデータ
49,422 Da と算出されたので，本酵素はホモ四量体構造
ベースを用いてホモログ遺伝子を検索すると，
24
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015
表 2 ■ イソロイシン 2-エピメラーゼの基質特異性 (20)
L→D
1
2
3
D→L
−1
−1
基質（L 型）
比活性（µmol・mg ・min ）
相対活性（％）
基質（D 型）
比活性（µmol・mg−1・min−1）
相対活性（％）
Ile
Nva1
Nle2
Val
Abu3
Leu
Phe
Met
-Ile
Ser
Ala
149±4
83.4±3.3
74.1±2.8
71.7±4.1
47.7±2.3
44.2±1.0
35.7±0.4
32.0±0.5
27.8±1.4
9.58±0.47
3.95±0.55
100
56
50
48
32
30
24
21
19
6
3
-Ile
Nva
Val
Nle
Met
Abu
Leu
Ile
Phe
Ser
Ala
221±0
183±4
131±7
116±3
93.7±2.6
66.3±1.9
54.8±2.1
44.5±2.0
13.6±0.5
4.91±0.07
4.43±0.13
100
83
59
52
42
30
25
20
6
2
2
Nva: ノルバリン
Nle: ノルロイシン
Abu: 2- アミノ酪酸
属や
属に GABA-AT と推定されてい
それら 3 種の D-アミノ酸が含まれる日本酒では官能評価
る相同性の高いホモログ遺伝子が多数見いだせるので，
試験において好評価が得られることを明らかにし，日本
これらの乳酸菌にイソロイシン 2-エピメラーゼの類似酵
酒 の 味 に D-ア ミ ノ 酸 が 関 係 し て い る こ と を 示 し て い
素が広く存在することが予想できる．今後，この酵素の
る (21)．さらに，この成果を踏まえた新たな動きとして，
生理的機能の解析により，乳酸菌などにおける D-アミノ
生酛から単離したこれらの 3 種の D-アミノ酸を著量生産
酸代謝の特異的な機能の解明が進むことが期待される．
する乳酸菌株を利用して，D-アミノ酸含量を増強したお
酒（商品名「にごりん」
）が菊正宗株式会社から 2012 年
おわりに
に発売されている．キリン協和フーズ株式会社からも，
乳酸発酵を利用した商品ではないが，D-アミノ酸を強化
われわれが行った種々の発酵食品における D-アミノ酸
することで，熟成によって生じる独特の旨味を再現した
分析や，多くの D-アミノ酸代謝酵素の酵素化学的特徴の
食品調味料（こく味調味料）が 2013 年に発売されてい
解析から，乳酸菌が D-アミノ酸生産に強く関与している
る．
ことが見えてきたと言える．しかし，乳酸発酵食品にお
一方，哺乳類における D-Asp と生殖機能の成熟・維持
ける味や保存性などの二次機能と D-アミノ酸の関係が明
の関係や，D-Ser と記憶に関連する精神疾患の関係など，
確になったとはいまだ言い難い状況である．今後，これ
D-アミノ酸の新しい特異的機能が次第に明らかにされお
までに見いだした D-アミノ酸代謝関連酵素の発現量や発
り，私たちが食事を通して摂取する D-アミノ酸がもつ機
現調節機構などの遺伝子レベルでの解析を行い，D-アミ
能についても，近い将来明らかになることが予想され
ノ酸代謝関連酵素の制御による D-アミノ酸の生産調節を
る．このように，D-アミノ酸研究は食品における D-アミ
可能にすることで，乳酸発酵食品における D-アミノ酸の
ノ酸の新規機能の解明や，食品添加物としての実用化と
新たな機能（二，三次機能）の開発に応用できることを
いった新たな段階に入りつつあることが伺える．
期待している．その場合，ここで取り上げた D-アミノ酸
謝辞：本稿にて紹介したわれわれの研究成果は「生研センターイノベー
ション創出事業」の助成を受けて得られたものである．
の合成反応を行うラセマーゼやアミノ基転移酵素だけで
なく，D-アミノ酸を基質とする脱水素酵素，酸化酵素，
脱水酵素などの分解系に主に機能する酵素に関しても，
分子レベルでの機能解析やその代謝産物のメタボロミク
スなどの解析が重要になると考えられる．
近年，老川らのグループは 141 種類の日本酒につい
て，D- および L-アミノ酸の濃度分析を行い，生酛，山
廃，長期熟成といった仕込み方法で醸造された日本酒に
は D-Asp, D-Ala, D-Glu が多く含有されていること，また
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015
文献
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(2013).
プロフィル
牟田口 祐太（Yuta MUTAGUCHI）
＜略歴＞2008 年岡山大学農学部総合農業
科学科卒業／2012 年日本学術振興会特別
研究員（DC2）／2013 年九州大学大学院生
物資源環境科学府博士後期課程修了／2014
年秋田県立大学生物資源科学部応用生物科
学科助教＜研究テーマと抱負＞微生物にお
ける D-アミノ酸の新規機能の解明と産業へ
の応用展開，微生物の細胞間相互作用とバ
イオフィルム・菌層変化＜趣味＞魚釣り
（海，川問わず），読書
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大森 勇門（Taketo OHMORI）
＜略歴＞2003 年京都教育大学総合科学課
程自然科学コース卒業／2005 年京都大学
大学院農学研究科応用生命科学専攻修士課
程修了／2008 年同大学大学院農学研究科
応用生命科学専攻博士後期課程指導認定退
学／同年京都大学化学研究所研究員／2009
年九州大学農学研究院学術研究員／2010
年同大学農学研究院特任助教／2012 年大
阪工業大学工学部生命工学科特任講師，現
在に至る＜研究テーマと抱負＞発酵食品に
含まれる機能性成分の分析とそれに関連す
る微生物や酵素の解析，臨床検査や食品分
析に応用可能な脱水素酵素の探索とその酵
素学的特徴の解明＜趣味＞カレー屋巡り，
講義の資料作り
大島 敏久（Toshihisa OHSHIMA）
＜略歴＞1975 年京都大学大学院農学研究
科農芸化学専攻博士課程中途退学／1975∼
1996 年京都教育大学教育学部助手，助教
授， 教 授， 名 誉 教 授／1996∼2006 年 徳 島
大 学 工 学 部 教 授， 名 誉 教 授／2006∼2013
年九州大学大学院農学研究院教授，名誉教
授／2013 年∼現在，大阪工業大学工学部
教授／1979∼1980 年ドイツ連邦共和国フ
ライブルク大学生物学部研究員／1985 年
ドイツ連邦共和国ユーリッヒ原子力研究セ
ンター・バイオテクノロジー研究所客員研
究員／2014 年∼現在，奈良先端科学技術
大学院大学バイオサイエンス研究科客員教
授＜研究テーマと抱負＞耐熱性酵素の機能
開発，D-アミノ酸の機能解析と応用，藍染
工程の分子生物学的解明，キノコの子実体
形成の分子生物学的解明，バイオセンサー
とバイオ電池の開発など＜趣味＞家庭菜
園，早朝ドライブ
Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会
化学と生物 Vol. 53, No. 1, 2015